Eno- in večsubstratne reakcije

𝐀 → 𝐏 Uni Uni reakcija*

𝐀 + 𝐁 → 𝐏 Bi Uni reakcija

𝐀 → 𝐏 + 𝐐 Uni Bi reakcija

𝐀 + 𝐁 → 𝐏 + 𝐐 Bi Bi reakcija

𝐀 + 𝐁 + 𝐂 → 𝐏 + 𝐐 + 𝐑 Ter Ter reakcija

*oznake označujejo molekularnost reakcije, ne reda reakcije!

Reverzibilne reakcije

Najenostavnejši reverzibilni mehanizem je reverzibilna Michaelis-Mentenina reakcija:

dP dS
Hitrost reakcije definiramo v običajni smeri: 𝑣= =−
d𝑡 d𝑡

nastajanje P iz S nastajanje S iz P

𝑘S E S − 𝑘P E t P
t
KmS – Km za vezavo S na E
𝑣= KmP – Km za vezavo P na E
S P
1+𝐾 +𝐾
mS mP

To je splošna oblika Michaelis-Mentenine enačbe za reverzibilne sisteme.

𝑘1 𝑘2 𝑘2 𝑘−1 𝑘−2 𝑘−1
V poenostavljenem primeru na zgornji shemi velja: 𝑘S = = 𝑘P = =
𝑘−1 + 𝑘2 𝐾mS 𝑘−1 + 𝑘2 𝐾mP

V kompleksnejših primerih so izrazi za kS in kP kompleksnejši.

Reverzibilne reakcije

Minimalen realističen mehanizem je:

logično je, da sta kompleksa različna – enega tvori S, drugega pa P

Pri eksperimentih in vitro za določitev konstant merimo začetno hitrost v prisotnosti le S ali P:

𝑘S E S − 𝑘P E t P
t
𝑣=
S P
1+𝐾 +𝐾
mS mP
t=0 [S] = [S]0 [S] = 0 t=0
[P] = 0 [P] = [P]0

𝑘S E St 𝑘P E P t
𝑣= 𝑣=
S P
1+ 1+𝐾
𝐾mS mP
Triozafosfat izomeraza

Triozafosfat izomeraza (EC 5.3.1.1) je glikolitičen encim z Mehanizem delovanja TIM:

značilnim zvitjem. Katalizira reverzibilno Uni Uni reakcijo.

kislinsko-bazna kataliza

PDB 3YPI
Triozafosfat izomeraza

Potek reakcije v smeri od DHAP do G3P

V ravnotežju je razmerje
med DHAP:G3P enako 96:4

Albery & Knowles. 1976. Biochemistry. 15(25)

Triozafosfat izomeraza
Inhibicija s produktom

Je pogost fenomen pri enosubstratnih in večsubstratnih reakcijah, tako reverzibilnih kot ireverzibilnih. Minimalen mehanizem za
pojasnitev inhibicije s produktom je:

P se lahko veže na E, vendar S ne more nastati, torej P deluje kot specifičen inhibitor:

Hitrost encimsko katalizirane reakcije zapišemo z enačbo:

𝑘S E t S 𝑘cat E t S
𝑣= =
S P P
1+ + 𝐾mS 1 + + S
𝐾mS 𝐾iP 𝐾iP

Podobno lahko tako P kot S delujeta kot inhibitorja pri reverzibilnih reakcijah.
Inhibicija s produktom

Primer: fruktoza-1,6-bisfosfataza (EC 3.1.3.11) je inhibirana s fruktoza-6-fosfatom.

F1,6BP + H2 O → F6P + Pi

encim z vezanim encim z vezanim

analogom substrata produktom F6P

PDB 1FBC, 1FBP

Večsubstratne reakcije

Kateri razredi encimov katalizirajo pretežno dvo- ali večsubstratne reakcije?

1. Oksidoreduktaze – katalizirajo oksidacije in redukcije substratov

2. Transferaze – katalizirajo prenos funkcionalnih skupin z ene molekule na drugo

3. Hidrolaze – katalizirajo hidrolizo

4. Liaze – katalizirajo cepitev vezi (C-C, C-N, C-O ali drugih) na način, ki ni ne hidroliza ne oksidacija

5. Izomeraze – katalizira spremembe znotraj ene molekule

6. Ligaze – združitev dveh molekul ali delov molekule ob hkratni hidrolizi ATP ali drugega trifosfata

7. Translokaze – katalizirajo prenos ionov in drugih molekul preko membran ali njihovo ločitev znotraj membrane
Dvosubstratne reakcije

Delimo jih na:

- tiste, kjer nastane trojni kompleks

Trojni kompleks lahko nastane v:

• naključnem zaporedju

• urejenem zaporedju

- tiste, kjer trojni kompleks ne nastane

reakcije s substituiranim encimom (Ping Pong) – potekajo v urejenem zaporedju

Predstavljeni mehanizmi predstavljajo najenostavnejše primere. V resnici so lahko mehanizmi bolj kompleksni in včasih težko
določljivi ali pa se spreminjajo glede na pogoje.
Dvosubstratne reakcije – naključen sekvenčni mehanizem

Reakcijska shema po Clelandu: Reakcijska shema na primeru prenosa skupine: 𝐆𝐗 + 𝐘 ⇆ 𝐆𝐘 + 𝐗

+ A B − P Q
𝑉max 𝑉max 𝐾iA 𝐾mB = 𝐾mA 𝐾iB
𝐾iA 𝐾mB − 𝐾mP 𝐾iQ
𝑣=
A B P Q A B P Q 𝐾iP 𝐾mQ = 𝐾mP 𝐾iQ Vmax – mejne hitrosti
1+𝐾 +𝐾 +𝐾 +𝐾 +𝐾 𝐾 +𝐾 𝐾
iA iB iP iQ iA mB mP iQ KmX – Michaelisove konstante
KiX – konstante inhibicije reakcije
v nasprotni smeri
Adenilat kinaza

Adenilat kinaza (EC 2.7.4.3) je primer encima z naključnim Bi Bi mehanizmom. Poznamo sedem izooblik, ki delujejo kot senzorji
metaboličnega stanja v celici in omogoča uporabo energije β- in γ-fosforilnih skupin ATP v celici.

2 ADP ⇋ ATP + AMP

Adenilat kinaza

Kristalna struktura proste AK s superpozicijo substratov Kristalna struktura AK z vezanima obema substratoma –
do konformacijske spremembe pride, ko sta vezani obe
substratni molekuli

AMP
ATP

PDB 4AKE PDB 1ANK

Dvosubstratne reakcije – urejen sekvenčni mehanizem
Po tem mehanizmu deluje veliko dehidrogenaz, zlasti od NAD+ odvisnih.
Reakcijska shema po Clelandu: Reakcijska shema na primeru prenosa skupine: 𝐆𝐗 + 𝐘 ⇆ 𝐆𝐘 + 𝐗

Ob vezavi prvega substrata pride do

konformacijske spremembe, ki omogoči
vezavo drugega.

deluje kot inhibitor

reakcije v levo

+ A B − P Q
𝑉max 𝑉max
−
𝐾iA 𝐾mB 𝐾mP 𝐾iQ
𝑣=
A 𝐾 B 𝐾mQ P Q A B 𝐾mQ A P 𝐾 B Q P Q A B P B P Q
1 + 𝐾 + 𝐾mA𝐾 + 𝐾 𝐾 + 𝐾 + K K + 𝐾 𝐾 𝐾 + 𝐾mA𝐾 𝐾 + K K + 𝐾 𝐾 𝐾 + 𝐾 𝐾 𝐾
iA iA mB mP iQ iQ iA mB iA mP iQ iA mB iQ mP iQ iA mB iP iB mP iQ
Malat dehidrogenaza

Malat dehidrogenaza (EC 1.1.1.37) je klasičen primer encima z urejenim Bi Bi mehanizmom.

malat-aspartatni transportni sistem

citratni
ciklus
Malat dehidrogenaza

Malat dehidrogenaza je homodimer. Vsak monomer je sestavljen iz dveh domen. Aktivno mesto je med obema domenama. N-
končna domena (Rossmanovo zvitje; modra) veže NAD(H), drugi substrat pa obe.

+ NAD+ NADH
E ⇌ E NAD ⇌ Emalat ⇌ Eoksaloacetat ⇌ E NADH ⇌ E

PDB ID 5MDH
Dvosubstratne reakcije – mehanizem s substituiranim encimom
Ping Pong mehanizem - v skladu z njim deluje veliko transferaz.
Reakcijska shema po Clelandu: Reakcijska shema na primeru prenosa skupine: 𝐆𝐗 + 𝐘 ⇆ 𝐆𝐘 + 𝐗

+ A B
𝑉max − P Q
𝑉max
𝐾iA 𝐾mB − 𝐾iP 𝐾mQ
𝑣=
A 𝐾mA B P K mP Q A B A P 𝐾mA B Q P Q
+ + + + + + +
𝐾iA 𝐾iA 𝐾mB 𝐾iP 𝐾iP 𝐾mQ 𝐾iA 𝐾mB 𝐾iA 𝐾iP 𝐾iA 𝐾mB 𝐾iQ 𝐾iP 𝐾mQ
Aspartat aminotransferaza

Aspartat aminotransferaza (transaminaza; EC

2.6.1.1) je klasičen primer encima s Ping Pong Bi Bi
mehanizmom.

malat-aspartatni transportni sistem

Kot večina transaminaz za delovanje

potrebuje piridoksal fosfat (vitamin B6).
 Splošni mehanizem delovanja od PLP
Aspartat aminotransferaza odvisnih aminotransferaz.
Encim je homodimer. Vsak
monomer vsebuje dve domeni,
aktivno mesto je med obema
domenama, na običajnem mestu
domene aba sendviča. Aktivno
mesto delno ograjuje tudi zanka z
druge podenote.

modra – velika domena s

topologijo aba
PDB ID 3PDB zelena – mala domena
Dvosubstratne reakcije

Eksperimentalno parametre določamo tako, da merimo začetne hitrosti v odsotnosti produktov. Enačbe se na ta način
poenostavijo do oblik:

𝑉max A B
𝑣= za mehanizme s trojnim kompleksom
𝐾iA 𝐾mB + 𝐾mB A + 𝐾mA B + A B

Za naključno tvorbo kompleksa dodatno velja še zveza: 𝐾iA 𝐾mB = 𝐾mA 𝐾iB

𝑉max A B
𝑣= za mehanizme s substituitanim encimom
𝐾mB A + 𝐾mA B + A B

Če sistem nasičimo z enim od obeh substratov, se enačbe reducirajo na klasično MM kinetiko:

𝑉max A 𝑉max B
𝑣= 𝑣=
𝐾mA + A 𝐾mB + B

V tem primeru KmA in KmB imenujemo mejni Michaelisovi konstanti

Kompleksen mehanizem - alkohol dehidrogenaza
Od NAD odvisna alkohol dehidrogenaza (EC 1.1.1.1) katalizira oksidacijo
alkoholov do aldehidov oz. ketonov (in obratno). B:

Za alkohol dehidrogenazo so prvotno postavili t.i. Theorell-

Chance mehanizem, obliko urejenega Bi Bi mehanizma, kjer
trojni kompleks praktično ne obstaja.

modra – domena z Rossmanovim zvitjem Kasnejše študije so pokazale, da najverjetneje vezava

zelena – katalitična domena alkohol dehidrogenaz substratov lahko poteka v naključnem vrstnem redu,
rumena – analog NAD sproščanje produktov pa poteka v urejenem zaporedju.
PDB ID 1ADC kroglice - etanol