PRCTIQUES DE BIOFSICA

Grau de Medicina
Primer curs
2016-2017

PRCTICA 2
Difusi a travs de membranes: dilisi i osmosi.

Lloc: M2-011 Laboratori de Biofsica (Facultat de Medicina).

Horari dinici: 9:30 h.

Material obligatori: bata, calculadora, gui de prctiques i fulls de resultats per entregar.
Amb anterioritat a cada sessi cal haver llegit el Gui de Prctiques.
Assistncia: Obligatria pels alumnes matriculats per primera vegada. Els alumnes repetidors
tenen el dret, per no l'obligaci, de fer les prctiques.

Unitat de Biofsica
Departament de Bioqumica i de Biologia Molecular
Facultat de Medicina
Universitat Autnoma de Barcelona

INFORMACI GENERAL

Material obligatori a les prctiques que es fan al Laboratori de Biofsica (M2-011):

- Bata
- Ulleres, ja siguin graduades o b de protecci; no es poden dur lents de
contacte per qestions de seguretat.
- Calculadora
- Gui de prctiques.
Assistncia: Obligatria pels alumnes matriculats per primera vegada. Els alumnes
repetidors tenen el dret (prvia inscripci a la pgina web http://clon.uab.es/psg), per
no l'obligaci, de fer les prctiques.
Abans de comenar la srie de prctiques, cal llegir atentament les normes de seguretat:
Normes bsiques de seguretat al laboratori (vegeu pg. 2). A l'inici de les prctiques
haureu de signar i lliurar al professor un full de responsabilitat, conforme les heu
llegides, les heu enteses i assumiu la responsabilitat d'acomplir-les.
Els/les professors/es responsables us indicaran quins sn i on sn els elements de
seguretat del laboratori.
Les fitxes de seguretat qumica (FDS) dels productes que s'utilitzaran a les prctiques
restaran a la vostra disposici per qualsevol consulta que volgueu fer.
Amb anterioritat a cada sessi de prctiques cal haver llegit atentament la part
corresponent daquest Gui.
Per a qualsevol dubte o problema dirigiu-vos al professorat.

NORMES BSIQUES DE SEGURETAT AL LABORATORI

1. S'utilitzaran ulleres de seguretat en tots els treballs del laboratori, excepte en les
tasques que es facin lluny dels reactius. No es recomana l's de lents de contacte
dintre del laboratori. En cas de qu es portin, s'hauran de dur ulleres protectores que
cobreixin completament els ulls.
2. La roba apropiada al laboratori inclou una bata, sempre cordada, i calat tancat i
resistent.
3. Porteu guants de protecci quan treballeu amb materials perillosos o de risc
desconegut.
4. Guardeu els abrics, bosses i d'altres pertinences el penja-robes, mai a sobre de les
lleixes de laboratori. Deixeu els passadissos lliures d'obstacles; en particular, feu
atenci als calaixos, portes d'armaris i cadires.
5. No es perms fumar, menjar, beure o utilitzar cosmtics en el laboratori. Tampoc s
perms tenir aliments dintre del laboratori. Renteu-vos les mans abans d'abandonar el
laboratori i sempre que es consideri oport.
6. Mai pipetegeu amb la boca.
7. Mai s'ha de tocar, olorar o provar productes qumics a no ser que s'hagi de fer
especficament en un experiment controlat.
8. Rebutgeu el material de vidre que presenti el ms mnim defecte.
9. No feu experiments no autoritzats. Seguiu els procediments escrits de treball i, en cas
d'algun dubte, consulteu abans de fer res. No es permet fer flames excepte que sigui
part d'un experiment autoritzat.
10. No utilitzeu mai un equip sense conixer perfectament el seu funcionament i
assegureu-vos, abans de comenar l'experiment, que el material est en perfectes
condicions d's i que els muntatges sn correctes.
11. Cal utilitzar sempre les vitrines extractores per a manipular productes que produeixin
vapors txics o corrosius.
12. Conserveu la zona de treball neta i endreada i recolliu qualsevol vessament
immediatament, tot seguint les recomanacions del professorat.
13. Abans d'utilitzar qualsevol producte o recipient de residus, llegiu l'etiqueta amb cura.
14. Comuniqueu immediatament tots els accidents/incidents o condici de risc al
professorat.
15. Deixeu els residus al lloc indicat pel professorat. No llenceu productes qumics per la
pica sense consultar amb el professorat.

Departament de Bioqumica
I de Biologia Molecular
Unitat de Biofsica
Edifici M
08193 Bellaterra (Barcelona)
Tel.: 93 581 19 07
Fax.: 93 581 19 07

En/Na
......................................................................................................................................................
Manifesto que he rebut i que conec les Normes Especfiques de Seguretat en el laboratori de
prctiques de la Unitat de Biofsica del Departament de Bioqumica i de Biologia Molecular de la
UAB., i assumeixo que sc responsable dacomplir-les en tot moment com a part indispensable de la
meva funci.

Bellaterra,

de

de 201

Signat: ..................................

Part I: dilisi
Objectiu
Es pretn constatar la difusi d'un solut a travs d'una membrana de dilisi i comprovar
les lleis que governen la difusi.

Introducci
Les membranes de dilisi presenten permeabilitat selectiva depenent de les dimensions
de les partcules del solut. Aix, les partcules petites com l'H2O i, per exemple, els ions que
forma el dicromat de potassi, K2Cr2O7 (PM 294 Da) en soluci aquosa passen rpidament
a travs dels porus de radi aproximat 25 ; mentre que les macromolcules, com per
exemple el blau dextr, (C6H10O5)n (PM 2106 Da) sn retingudes a l'interior del sac de
dilisi. Segons la llei de Fick:
n
C
A
=- D
t
x

(1)

el nombre de mols (n) de solut que difon entre

dos punts d'una dissoluci per unitat de temps, s
directament proporcional al gradient de concentraci
(C / x), a la superfcie (A) normal a la direcci de
difusi, i al coeficient de difusi (D). En el cas
particular de la difusi a travs d'una membrana de
dilisi, el gradient de concentraci s'estableix al llarg
de cadascun dels porus de longitud x (Figura 1),
entre les concentracions de solut a l'interior i a
l'exterior:
C = C ext - C int

(2)

Tant el lquid exterior com l'interior sn homogenis

(C uniforme) grcies a que es mant l'agitaci
durant la dilisi. Ja que Cext < Cint, llavors C < 0 i
tamb C/x < 0; aix explica la presncia del signe
(-) a la frmula (1), donat que el nombre de mols
que difon per unitat de temps s sempre positiu.

Bibliografia
Nociones de Fisicoqumica R. Segura.

Realitzaci
1.- Preparaci de la dilisi
Barregeu 5 ml de la dissoluci de dicromat de potassi amb 5 ml de la dissoluci de blau
dextr. No pipetegeu mai amb la boca!!!.
Atenci: donada la toxicitat del crom (vegeu la fitxa de seguretat del dicromat de
potassi), la persona que faci la manipulaci ha de portar guants de plstic; un cop
acabades les manipulacions, els guants es treuen invertint-los (amb part contaminada
dins), i es llencen al recipient corresponent.
Preneu un sac de dilisi del vas on diu sacs de dilisi en remull, escorreu amb compte
l'aigua que l'impregna (sense assecar ni estirar la membrana) i feu un nus en un dels seus
extrems. Aneu a la pica i introduu la dissoluci de dicromat i de blau en el sac de dilisi
mitjanant un embut. Tanqueu l'extrem superior del sac amb una pina procurant que
quedi poc aire retingut a l'interior del sac. Finalment, netegeu lexterior del sac amb aigua
destillada.

2.- Mesures durant la dilisi

Introduu 250 ml d'aigua destillada en el vas de 250 ml. Poseu l'imant dins del vas, ja
enrasat, i engegueu l'agitaci magntica. Al mateix moment que introduu el sac en el vas
poseu en marxa el cronmetre: a partir d'aquest instant (temps zero) prendreu alquotes
duns 3 ml del lquid exterior de la dilisi cada 2 min durant un perode de 14 min. Recolliu
les alquotes (mostres) en tubs d'assaig numerats i anoteu cada vegada el temps
corresponent a la taula. Atenci: no cal que els volums de les alquotes siguin exactes,
sin que s ms important que siguin extretes en un temps curt, de manera que es
corresponguin amb el temps anotat.

3.- Dilisi exhaustiva

Desprs de prendre la darrera alquota, poseu-vos d'acord els diferents grups que feu la
mateixa prctica: 2-3 grups continuen la dilisi i els altres 3-2 buiden el seu vas de 250
ml, i hi deixen el sac, de manera que la dilisi queda interrompuda. Al final de la prctica,
abans de marxar, agafeu els diferents sacs i observeu la diferncia de color del contingut.
Abans de marxar deixeu-ho tot net.
Atenci: Recordeu la toxicitat del crom. Tireu qualsevol soluci contaminada al recipient
especfic corresponent.

4.- Determinaci colorimtrica de la concentraci de solut en el lquid exterior de la dilisi

Sempre shan de calibrar els aparells de mesura, o la lectura donada no t cap mena de
fiabilitat. Cal efectuar els segents ajustaments cada vegada que sengega o es canvia de
longitud dona. Les instruccions a seguir sn les segents:
Engegueu laparell i espereu 20 minuts abans dutilitzar-lo.
Premeu el bot MODE per seleccionar el mode dabsorbncia o b el mode
de % de transmitncia. En el nostre cas escollim Absorbncia, i veureu
que el mode escollit apareix en pantalla.
Amb les tecles
o escolliu la longitud d'ona a la qual voleu fer les
mesures (en el nostre cas s 350 nm). Si manteniu premuda la tecla, la
longitud dona canvia ms rpidament.
Colloqueu una cubeta amb el tamp de referncia (que en el nostre cas
ser aigua destillada) dins del portacubetes i tanqueu el compartiment.
Recordeu que la cubeta sha de collocar de manera que el feix de llum
passi a travs de les parets clares de la cubeta (hi ha una fletxa que indica
la direcci del feix de llum).
Premeu el bot ZERO per tal de portar aquesta referncia al valor zero
dabsorbncia.
Retireu la cubeta de referncia i comenceu a mesurar l'absorbncia a 350
nm de cadascuna de les alquotes. El valor dabsorbncia sortir en
pantalla. Anoteu les lectures a la taula.

5.- Clcul del flux de solut a travs de la membrana de dilisi

A partir dels valors de A350nm de cadascuna de les alquotes del lquid exterior de la dilisi i,
suposant que es compleix la llei de Lambert-Beer en aquest interval de concentracions,
A350 nm = l M = l

n
V

(3)

on: s el coeficient d'extinci molar (per al dicromat: 3060 mol-1Lcm-1); l s el

cam ptic (1 cm); M s la molaritat de la dissoluci; n s el nombre de mols de
solut; V s el volum de la dissoluci. Excepcionalment, amb la llei de LambertBeer s'utilitzen aquestes unitats i no les del S.I.
Calculeu el nombre de mols (n) que, fins al moment de treure cada alquota, havien
travessat la membrana, aplicant la llei de Lambert-Beer:
n = A350 nm

V
l

(4)

Anoteu els diferents valors de n a la taula i representeu-los grficament en funci del

temps (full de resultats).
En funci de l'aspecte de la representaci grfica de les dades experimentals, calculeu el
-1
pendent de la corba obtinguda (el flux n / t (molmin ) de solut a travs de la membrana
6

de dilisi). Anoteu el resultat.

6.- Clcul del coeficient de difusi (D) del dicromat en aigua

Calculeu D a partir de la llei de Fick (equaci 1) tenint en compte les segents dades:
C:

donat que durant els primers minuts de la dilisi la Cext s menyspreable en

comparaci amb la Cint, podem considerar que C = - Cint. Utilitzeu com a
Cint la concentraci inicial de dicromat que s'ha introdut a l'interior del sac de
dilisi: 6,4 mM.

x:

longitud de cadascun dels porus, s a dir, gruix de la membrana: 20 m.

A:

assumiu un total de 210

12

porus, cadascun d'ells de radi 25 .

Anoteu el resultat.

RESULTATS

Alquota
nm.

Temps
(min)

A350

n
(mols)

1
2
3
4
5
6

n (mols)

Temps (min)

Flux de solut a travs de

la membrana de dilisi:

n / t =

molmin

Coeficient de difusi:

D=

m s

-1

2 -1

Part II: osmosi

Objectiu
Visualitzaci de l'efecte osmtic mitjanant un osmmetre. Determinaci de la pressi
osmtica i de l'osmolaritat d'una dissoluci.

Introducci
Les membranes semipermeables deixen passar nicament l'aigua a travs dels seus
porus. Estrictament parlant, aquest comportament noms el tindria una membrana ideal;
tanmateix, la membrana d'origen animal que constitueix la bossa de l'osmmetre, presenta
un comportament fora aproximat a aquest concepte teric.
Si tenim una dissoluci de qualsevol solut a l'interior de la bossa de l'osmmetre i aigua
destillada a l'exterior, es produeix el que s'anomena efecte osmtic: l'entrada d'aigua cap
al compartiment que cont el solut. La tendncia de l'aigua a travessar la membrana
s'expressa quantitativament mitjanant la pressi osmtica () de la dissoluci, la qual,
segons la llei de van't Hoff:

=cRT

(1)

depn de l'osmolaritat (c) de la dissoluci (concentraci total de partcules dissoltes que no

poden travessar la membrana) i de la temperatura, per s independent de la naturalesa
dels soluts.
Si a l'exterior de la membrana, en comptes d'aigua destillada hi ha una dissoluci
d'osmolaritat ms baixa que la de l'interior, la tendncia de l'aigua a entrar ve donada per
la diferncia de pressions osmtiques entre les dues dissolucions:
int - ext = ( cint - cext ) R T

(2)

Pel que fa concretament al cas de l'osmmetre, l'aigua que travessa la membrana fa pujar
el nivell del lquid en el tub de mesura. bviament, per una determinada membrana, la
velocitat d'ascens de l'aigua per l'esmentat tub s proporcional a la pressi osmtica de la
dissoluci:
v~= cRT

(3)

S'arriba l'equilibri osmtic quan la tendncia de l'aigua a entrar s compensada per la

diferncia de pressi hidrosttica (p) exercida per la columna d'aigua d'altura h:
p= gh = = cRT

(4)

Aix doncs, mitjanant un osmmetre es pot determinar experimentalment l'osmolaritat

d'una dissoluci i la seva pressi osmtica de dues maneres: mesurant l'altura de la
columna de lquid en l'equilibri, o b mesurant la velocitat d'ascens del lquid pel tub
vertical.
Aplicant l'equaci (4), donat que l'altura mxima del tub de mesura de l'osmmetre s de
25 cm, tan sols podran arribar a l'equilibri en laparell dissolucions d'osmolaritat inferior a
0,0001 osM. De tota manera, la utilitzaci de dissolucions tan diludes per la realitzaci
d'aquesta prctica tindria un greu inconvenient: la velocitat d'entrada de l'aigua,
proporcional a l'osmolaritat, seria tan baixa que no es podrien efectuar mesures fiables fins
al cap d'algunes hores. Aix doncs, en aquesta prctica s'utilitzaran dissolucions
concentrades (entre 0,1 osM i 1,5 osM), que donen lloc a elevades velocitats d'ascens del
lquid pel tub de mesura. En aquest cas, per, l'inconvenient s que no es pot arribar a
l'equilibri osmtic: la columna de l'osmmetre hauria de tenir una altura entre 20 i 300 m !.

Realitzaci
1.- Disposici inicial de l'osmmetre
Aviseu el professor perqu ompli l'osmmetre amb la dissoluci de sacarosa.
Atenci: La dissoluci de sacarosa cont azida sdica per tal d'impedir el creixement de
fongs. L''azida sdica s un producte molt txic (vegeu la fitxa de seguretat). La
persona que faci la manipulaci ha de portar guants de plstic; un cop acabades les
manipulacions, els guants es treuen invertint-los (part contaminada dins), i es llencen al
recipient corresponent.
Inclineu cap a baix el tub de goma de l'osmmetre, i obriu lleugerament la pina deixant
gotejar la dissoluci problema en el mateix vas on hi ha la sacarosa, fins que el seu nivell
en el tub de mesura estigui comprs entre 0 i 30 mm (per tal que el nivell del lquid dins del
tub no vessi abans d'haver acabat les mesures). Deixeu el tub pinat.
2.- Mesura de l'efecte osmtic
Substituu la dissoluci de sacarosa (NO LA LLENCEU) per aigua destillada. Mesureu
exactament el nivell del lquid en el tub graduat i poseu en marxa el cronmetre (temps
zero) en el moment en que el saquet quedi cobert; anoteu la lectura a la taula. A partir
d'aquest moment efectueu mesures exactes del nivell del lquid i del temps cada 2 min
durant un perode de 10 min. Anoteu els resultats a la Taula. Durant el temps que duri
l'osmometria conv no modificar la posici de la bossa. Finalment torneu a posar el vas de
sacarosa amb el saquet a dins i tireu laigua.

10

3.- Clculs i representaci grfica

Representeu grficament (Figura 1) els valors de l'altura (mm) del lquid en el tub
osmomtric, en funci del temps (min).
-1

Determineu el pendent de la recta i anoteu el resultat. El pendent (mmmin ) s una

mesura de la velocitat d'entrada de l'aigua a la bossa de l'osmmetre a travs de la
membrana semipermeable, i s proporcional a la pressi osmtica de la dissoluci.
4.- Determinaci de la pressi osmtica
La mesura de la pressi osmtica d'una dissoluci d'elevada osmolaritat no s possible
per osmometria directa perqu s tcnicament impossible arribar a l'equilibri osmtic.
Tanmateix, es pot utilitzar el pendent de la recta que heu representat en el pargraf
anterior per obtenir indirectament la pressi osmtica de la dissoluci. La recta patr
pendent/pressi osmtica de la Figura 2 s'ha obtingut mitjanant l'estudi osmomtric de
diverses dissolucions de sacarosa de pressi osmtica coneguda. Interpoleu el pendent
que heu obtingut a l'experiment, a la corba de la Figura 2 i determineu aix la pressi
osmtica corresponent. Anoteu el resultat.
5.- Clcul de l'osmolaritat
La llei de van't Hoff ens permet calcular l'osmolaritat de la dissoluci una vegada
coneguda la seva pressi osmtica:
= cRT
-1
-1
on: c s l'osmolaritat; R s la constant dels gasos (0,082 atmLK osmol ); T s la
temperatura en Kelvin (en aquest cas la temperatura ambient).

Anoteu el resultat.

11

RESULTATS
TAULA
Mesura nm.

temps (min)

altura (mm)

2
3
4
5
6

Altura (mm)

FIGURA 1

Temps (min)

12

FIGURA 2

Pendent (mm min-1)

20

15

10

0
0

10

20

30

40

Pressi osmtica (atm)

mmmin -1

Pendent de la recta:
Pressi osmtica:

atm

Osmolaritat:

c=

osmolL1

13

QESTIONS
1. Si efectussim mesures de l'altura del lquid en el tub en funci del temps, fins arribar a
l'equilibri osmtic, quina forma tindria la representaci grfica altura/temps?. Per qu?
Dibuixeu-la i expliqueu-ne les diferncies respecte a la que heu obtingut vosaltres.

2. Suposeu un osmmetre hipottic amb una columna suficientment alta i una membrana
de gran resistncia. Quina altura aconseguiria el lquid a la columna en arribar a l'equilibri
osmtic? (utilitzeu les dades que heu obtingut a la prctica). Recordeu que a l'equilibri
osmtic:
P=gh==cRT
on: s la densitat del lquid (1,1310 kgm ); g s l'acceleraci de la
gravetat (9,8 ms-2); h s l'altura del lquid.
(Unitats: 1 atm = 1,013105 Pa ; 1 Pa = Nm-2 ; 1 N = mkgs-2)
3

-3

Resposta: h =

3. En el mateix cas hipottic de la qesti anterior, quina seria l'altura del lquid a l'equilibri
si canvissim el tub de mesura per un de dimetre doble? Per qu?

4. Quins efectes tindria, a una hemodilisi, la substituci de la membrana de dilisi per una
de semipermeable?

14