‫דברים שאפשר להכין מראש ויש לוודא שבנמצא לקראת ‪western blot‬‬

‫♥הכנת הג'ל התחתון‬

‫‪ 2 o‬זכוכיות תואמות בגודל‪ -‬זכוכית אחורית וקדמית (יש לנקות ולייבש היטב)‪ ,‬ספוג שנכנס מתחת למתקן הנושא (הכנסת‬
‫שתי הזכוכיות בצורה ישרה וסגירה עם קליפס) את הזכוכיות ומתקן המחזיק את המתקן הנושא‪.‬‬
‫‪ o‬בדיקת דליפה‪ -‬עם מים‪ .‬ממלאים בין ‪ 2‬הזכוכיות מים עד הסוף ובודקים אם המפלס יורד‪ .‬במילוי בין הזכוכיות יש להצמיד‬
‫את פתח הטיפ לגב הזכוכית האחורית ובכך למנוע נזילה מבחוץ‪.‬‬
‫‪ o‬מרוקנים את המים ומשאירים את המכשיר הפוך לייבוש‪.‬‬
‫‪ o‬הכנת הג'ל התחתון בביקר (עם סטירר על פלטה)‪:‬‬
‫אחוז האקריל אמיד בג'ל קובע את צמיגותו ולכן קובע אילו חלבונים ניתן יהיה להפריד בעזרתו‪:‬‬
‫עבור הפרדת חלבון ‪ PPAR‬נכין ג'ל תחתון של ‪ 10%‬אקריל אמיד‪.‬‬
‫‪Acrylamide %‬‬ ‫‪M.W Range‬‬
‫‪7%‬‬ ‫‪50 kDa-500 kDa‬‬
‫‪10%‬‬ ‫‪20 kDa-300 kDa‬‬
‫‪12%‬‬ ‫‪10 kDa-200 kDa‬‬
‫‪15%‬‬ ‫‪3 kDa-100 kDa‬‬
‫ג'ל תחתון (כמות לג'ל אחד)‪-‬‬
‫לאחר הוספת המים להציב את הביקר על פלטה מגנטית עם סטירר‪.‬‬
‫‪6%‬‬ ‫‪7.5%‬‬ ‫‪10%‬‬ ‫‪12.5%‬‬ ‫‪15%‬‬
‫‪ml‬‬ ‫במקרר )‪40% acrylamide (ml‬‬ ‫‪1.5‬‬ ‫‪1.875‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪3.75‬‬
‫)‪Tris 1.5M 8.8 (ml‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪2.5‬‬
‫‪µl‬‬ ‫לחמם קצת )‪20% SDS (ul‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪50‬‬
‫‪ml‬‬ ‫)‪DDW (ml‬‬ ‫‪5.9‬‬ ‫‪5.625‬‬ ‫‪4.9‬‬ ‫‪4.25‬‬ ‫‪3.75‬‬
‫‪µl‬‬ ‫בפריזר )‪10% APS (ul‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪60‬‬
‫במקרר )‪TEMED (ul‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪10‬‬
‫אקריל אמיד‪ -‬פולימר המקנה את חוזק הג'ל‪ -APS .‬אמוניום פר‪-‬סולפט ו‪ -TEMED-‬גורמים ליצירת רדיקלים חופשיים ובעקבות זאת לתגובת‬
‫הפולימריזציה (גודל החורים בג'ל)‪ -SDS .‬דטרגנט‪ .‬כדי ליצור ג'ל דנטורטיבי‪ ,‬תפקיד כמו בהפקת חלבון‪ ,‬הוא הנקשר לפפטידים למניעת יצירת‬
‫קשרים בין מולקולארים ביניהם‪ ,‬ומקנה לחלבונים מעטפת של מטען חשמלי שלילי‪ ,‬המאפשרת לו לנוע בהתאם למתח החשמלי המושרה משני צידי‬
‫הג'ל (הפרדה לפי גודל בלבד‪ ,‬ולא לפי מטען)‪.‬‬
‫מילוי המרווח בין הזכוכיות עם הג'ל‪ ,‬עד לקו הירוק התחתון‪( .‬הצמדת קצה הטיפ לגב הזכוכית האחורית להימנע מנזילה)‪.‬‬ ‫‪o‬‬
‫יחסית מהר כדי שהג'ל לא יתקרש בביקר‪( .‬פיפטור חשמלי)‬
‫הוספת מים באיטיות וזהירות מעל הג'ל על מנת ליישר אותו‪ ,‬בערך עד לקו הירוק העליון‪( .‬שלא יתערבבו עם הג'ל)‪ -‬עם טיפ‬ ‫‪o‬‬
‫דק פיפטור של ‪ 100‬מיקורליטר‪.‬‬
‫המתנת הג'ל בחוץ לקרישתו‪.‬‬ ‫‪o‬‬
‫כעבור ‪ 30‬דק' נתחיל בהכנת הג'ל העליון‪.‬‬ ‫‪o‬‬

‫♥הכנת הג'ל העליון‬

‫‪ o‬הכנת הג'ל העליון בביקר (עם סטירר על פלטה)‪:‬‬
‫‪ o‬ג'ל עליון (‪ -)5%‬ג'ל רך‪ ,‬גורם לכל החלבונים לנוע ביחד ו"עוצר" את הגליצרול (שמקורו מה‪ .)sample buffer-‬בג'ל אחד יש‬
‫‪ 10‬באריות‪ -TEMED( .‬קטליזטור לפולימריזציה)‬
‫‪ 2‬ג'לים ג'ל אחד‬ ‫‪ 3‬ג'לים‬
‫‪ml‬‬ ‫‪40% acrylamide‬‬ ‫‪0.625‬‬ ‫‪1.25‬‬ ‫‪1.875‬‬
‫‪Tris 1.5M 6.8‬‬ ‫‪1.25‬‬ ‫‪2.5‬‬ ‫‪3.75‬‬
‫‪µl‬‬ ‫)‪20% SDS (ul‬‬ ‫‪25‬‬ ‫‪50‬‬ ‫‪75‬‬
‫‪ml‬‬ ‫‪DDW‬‬ ‫‪3‬‬ ‫‪6‬‬ ‫‪9‬‬
‫‪µl‬‬ ‫)‪10% ASP (ul‬‬ ‫‪30‬‬ ‫‪60‬‬ ‫‪90‬‬
‫)‪TEMED (ul‬‬ ‫‪10‬‬ ‫‪20‬‬ ‫‪30‬‬
‫מס' גרגירים‬ ‫כדי שנראה יפה את הבאריות כשהג'ל יתמצק ‪‬ברומופנול בלו‬
‫‪ o‬שופכים את המים שהוספנו מעל הג'ל תחתון‪.‬‬
‫‪ o‬שופכים את הגל העליון מעל הג'ל התחתון‪ ,‬עד למעלה‪ -‬בלי בועות (שיקטינו את גודל הבארית)!‬
‫‪ o‬מכניסים את המסרק עד הסוף (הקו הבולט פונה אלינו)‪ -‬זהירות‪ ,‬משפריץ‪.‬‬
‫‪ o‬ממתינים חצי שעה לקרישת הג'ל העליון‪.‬‬
‫הכנסה למקרר עד לביצוע ה‪( WB-‬עד יום)‪.‬‬ ‫‪o‬‬
 ‫(אפשר לשמור בחוץ לכמה חודשים‪ .‬מילוי בין הג'לים‪ ,‬מספיק לכמה פעמים)‬ ‫♥הכנת ‪running buffer‬‬
‫‪DDW‬‬ ‫‪900 ml‬‬
‫‪Tank buffer 10x‬‬ ‫‪100 ml‬‬
‫‪SDS 10%‬‬ ‫‪10 ml‬‬
‫♥הכנת ‪( tank buffer 10x‬במידה ואין סטוק מוכן במקרר) (להוציא יום לפני מהמקרר במידה ויש גבישים‪ .‬בגלל הגליצין נשמר במקרר‪).‬‬
‫‪Tris‬‬ ‫‪30.27 gr‬‬
‫‪Glycin 144.13 gr‬‬
‫‪DDW‬‬ ‫השלמה ל‪ 1-‬ליטר‬
‫♥הכנת ‪:transfer blot‬‬
‫‪Tank buffer x10 100 ml‬‬
‫מתנול ‪100%‬‬ ‫‪200 ml‬‬
‫‪DDW‬‬ ‫השלמה ל‪ 1-‬ל'‬
‫♥הכנת ‪:T-BST‬‬
‫‪TBS*10‬‬ ‫‪100 ml‬‬
‫לשים לב שהתמוסס עד שנעלם לגמרי ‪Tween‬‬ ‫‪1 ml‬‬
‫צריך לחתוך את הטיפ כדי לקחת מהחומר‪.‬‬
‫‪DDW‬‬ ‫השלמה ל‪ 1-‬ל'‬
‫הכנת ‪:TBST x10‬‬

‫‪NaCl‬‬ ‫‪80 gr‬‬

‫‪KCl‬‬ ‫‪2 gr‬‬
‫‪1M tris-HCl buffer pH 7.5 250ml‬‬
‫‪DDW‬‬ ‫השלמה ל‪ 1-‬ל'‬
‫הוראות הכנה‪ :‬נוסיף לבקבוק התמיסה תחילה חלק מכמות המים‪ ,‬בערך ‪ 400‬מ"ל‪ ,‬עליהם נוסיף כל פעם את אחת האבקות‪,‬‬
‫נמיס ונוסיף את הבאה ונמיס‪ ,‬על זה נוסיף את הבופר‪ ,‬נכייל ‪ pH‬ל‪ 7.5-‬ואחרי כל זה נשלים עם המים לליטר‪.‬‬

‫♥הכנת ‪ TBST‬חלב ‪:)Blocking( 5%‬‬

‫במקרר ‪Milk powder‬‬ ‫‪2.5 gr‬‬
‫‪TBS-T‬‬ ‫השלמה ל‪50ml-‬‬

‫(אם מכינים מאבקת חלב עדיף כמה שעות לפני‪/‬יום מראש שהגרגירים ימסו טוב‪ ,‬ניתן לשמור במקרר עד שבוע‪ .‬על מטלטל או עם סטירר בהכנה)‬

‫*** אם אין אבקת חלב ניתן להשתמש בחלב ‪ 5 :1%‬מ"ל חלב ‪ 95+1%‬מ"ל ‪ .TBST‬הזמנים בפרוטוקול הם זמני מינימום‪.‬‬