Antic - Hromatografija U Analizi Hrane

UNIVERZITET U BEOGRADU
POLJOPRIVREDNI FAKULTET
Institut za prehrambenu tehnologiju i biohemiju
Vesna V. Antić Mališa P. Antić
Komunalna Piroliza
otpadna voda,
Ahen, Nemačka
Interni
Relativna obilnost
standard
Relativna obilnost
NVP
Industrijska
otpadna voda,
NVP Pančevo, Srbija
m/z
Vreme, min.
Beograd, 2014.
Odlukom Odbora za izdavačku delatnost Poljoprivrednog fakulteta u Zemunu,
br. 45-II-2/4 od 30.06.2014. godine, odobreno je izdavanje udžbenika Hromatografija u
analizi hrane – I izdanje.
Autori
Dr Vesna Antić i Dr Mališa Antić
HROMATOGRAFIJA U ANALIZI HRANE
I izdanje
Recenzenti:
Dr Biljana Vucelić-Radović, redovni profesor Poljoprivrednog fakulteta

Univerziteta u Beogradu
Dr Ljiljana Damjanović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju

Dr Ljubiša Ignjatović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju

Izdavač:
Univerzitet u Beogradu – Poljoprivredni fakultet
Nemanjina 6, Zemun
Za izdavača:
Prof. Dr Dušan Radivojević
Naslovna strana:
Dr Vesna Antić
Tiraž: 100 primeraka
ISBN 978-86-7834-200-4
Predgovor
Udžbenik Hromatografija u analizi hrane namenjen je studentima diplomskih,

specijalističkih i doktorskih akademskih studija Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu,
kao i svima koji se bave analitikom organskih jedinjenja, a naročito analitikom
jedinjenja iz prehrambenih proizvoda. Tekst udžbenika se zasniva na nastavnom
programu predmeta Hromatografske metode u analitici hrane (diplomske akademske
studije), a pokriva i delove drugih predmeta različitih nivo studija, kao što su: Hemija i
analitika hrane (diplomske akademske studije); Spektroskopske i hromatografske
metode u analitici hrane, Analitičke metode u mikrobiologiji hrane i Hemijska
kontaminacija hrane (specijalističke akademske studije); Instrumentalne metode analiza
i Hemijske i biohemijske transformacije proizvoda biljnog porekla (doktorske akademske
studije).
U okviru Udžbenika su najpre dati teorijski osnovi hromatografije, a zatim su

detaljno opisane sledeće hromatografske tehnike: planarna hromatografija, apsorpciona
hromatografija u koloni, gasna hromatografija i tečna hromatografija visokih
performansi. Na kraju svakog od Poglavlja u kojima su opisane pojedinačne
hromatografske tehnike, dati su brojni primeri njihove primene u analizi hrane. S
obzirom da je Udžbenik namenjen višim nivoima studija, pretpostavlja se da je čitalac
upoznat sa osnovama organske hemije i fizičke hemije.
Zahvaljujemo se recenzentima na pažljivom čitanju rukopisa i korisnim

napomenama i sugestijama, koje su doprinele da se tekst značajno poboljša i unapredi.
Recenzentima smo takođe zahvalni na mišljenju da se Udžbenik može preporučiti i
studentima drugih fakulteta Univerziteta u Beogradu, kao što su studenti fizičke hemije,
hemije, farmacije, tehnologije i drugih nauka kojima je hromatografija komplementarna
naučna disciplina, kao i svima onima koji se bave hromatografijom u stručnom,
istraživačkom i svakodnevnom radu.
Budući da je ovo prvo izdanje ovog Udžbenika, autori će biti vrlo zahvalni svima
koji u njemu uoče propuste i greške bilo koje vrste, i daju nam usmene ili pismene
sugestije za njegovo ispravljanje.
Autori
SADRŽAJ
1. Principi i podela hromatografije ........................................................................................... 1

1.1. Uvod ..................................................................................................................................................... 1
1.2. Osnovi hromatografije ................................................................................................................ 2
1.2.1. Osnovni pojmovi u hromatografiji ...................................................................................... 3
1.2.1.1. Hromatogram ........................................................................................................................... 3
1.2.1.2. Gausov profil pika ................................................................................................................... 4
1.2.1.3. Koeficijent raspodele ............................................................................................................ 4
1.2.1.4. Teorijski podovi ...................................................................................................................... 4
1.2.1.5. Retencioni parametri ............................................................................................................ 5
1.2.1.6. Selektivnost i razdvajanje 6
1.2.2. Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima ....................... 7
1.2.2.1. Disperzione sile ....................................................................................................................... 7
1.2.2.2. Polarne sile ................................................................................................................................ 7
1.2.2.3. Jonske sile .................................................................................................................................. 8
1.2.2.4. Hidrofobne i hidrofilne interakcije ................................................................................. 8
1.3. Podela hromatografskih metoda ............................................................................................. 9
1.3.1. Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada ................................................. 9
1.3.2. Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja ........................ 10
1.3.3. Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge ...... 11
1.3.4. Podela hromatografskih metoda prema fizičkom stanju mobilne i
stacionarne faze ........................................................................................................................... 12
2. Planarna hromatografija ............................................................................................................ 14

2.1. Hromatografija na papiru ........................................................................................................... 14
2.1.1. Hromatografski papir ............................................................................................................... 14
2.1.2. Priprema i nanošenje uzorka ................................................................................................ 15
2.1.3. Mobilna faza .................................................................................................................................. 18
2.1.4. Razvijanje hromatograma ...................................................................................................... 19
2.1.5. Određivanje položaja zona na hromatogramu ............................................................. 22
2.1.6. Kvantitativna analiza ................................................................................................................ 23
2.2. Hromatografija na tankom sloju ............................................................................................. 23
2.2.1. Stacionarna faza .......................................................................................................................... 23
2.2.2. Priprema i nanošenje uzorka ................................................................................................ 24
2.2.3. Mobilna faza................................................................................................................................... 25
2.2.4. Razvijanje hromatograma ...................................................................................................... 26
2.2.5. Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči ................................................ 27
2.2.6. Kvantitativna analiza ................................................................................................................ 28
2.2.7. Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju ......................................... 28
2.2.8. Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane ................................................. 29
3. Adsorpciona hromatografija u koloni ................................................................................ 31

3.1. Stacionarna faza .............................................................................................................................. 31
3.1.1. Adsorbensi ..................................................................................................................................... 32
3.1.1.1. Silika-gel ..................................................................................................................................... 32
3.1.1.2. Aluminijum-oksid ................................................................................................................... 33
3.1.1.3. Aktivni ugalj .............................................................................................................................. 33
3.1.1.4. Magnezijum-oksid .................................................................................................................. 34
3.2. Mobilna faza ..................................................................................................................................... 34
3.3. Tehnika rada ................................................................................................................................... 34
4. Gasna hromatografija ................................................................................................................... 37

4.1. Uvod ..................................................................................................................................................... 37
4.2. Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji ......................................... 39
4.3. Teorija o gasnoj hromatografiji ............................................................................................... 42
4.4. Gasni hromatograf ......................................................................................................................... 43
4.4.1. Noseći gas ...................................................................................................................................... 44
4.4.2. Unošenje uzorka - isparivači (injektori) .......................................................................... 44
4.4.2.1. Unošenje uzoraka gasa ........................................................................................................ 48
4.4.2.2. Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim
supstancama bez rastvarača ................................................................................................ 49
4.4.2.2.1. Statički Headspace .............................................................................................................. 49
4.4.2.2.2. Dinamički Headspace ........................................................................................................ 50
4.4.2.2.3. Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction – SPME) ... 50
4.4.3. Gasnohromatografske kolone ............................................................................................... 52
4.4.3.1. Pakovane kolone ..................................................................................................................... 53
4.4.3.2. Kapilarne kolone ..................................................................................................................... 54
4.4.3.3. Stacionarne faze ...................................................................................................................... 56
4.4.3.3.1. Čvrste stacionarne faze .................................................................................................... 57
4.4.3.3.2. Tečne stacionarne faze ..................................................................................................... 58
4.4.3.3.3. Selektivnost stacionarne faze ........................................................................................ 60
4.4.3. Detektori u gasnoj hromatografiji ....................................................................................... 64
4.4.3.1. Termoprovodljivi detektor ................................................................................................. 66
4.4.3.2. Plameno-jonizacioni detektor ........................................................................................... 68
4.4.3.3. Detektor sa zahvatom elektrona ...................................................................................... 69
4.4.3.4. Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor................................. 71
4.4.3.5. Plameno fotometrijski detektor........................................................................................ 72
4.4.3.6. Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi ............. 73
4.4.4. Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji .................................................................. 77
4.4.4.1. Temperatura kolone .............................................................................................................. 77
4.4.4.2. Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze ..... 79
4.4.5. Kvalitativna gasnohromatografska analiza ..................................................................... 80
4.4.6. Kvantitativna gasnohromatografska analiza .................................................................. 81
4.4.6.1. Metoda normalizacije površina ........................................................................................ 81
4.4.6.2. Metoda internog standarda ................................................................................................ 81
4.4.6.3. Metoda standardnog dodatka ........................................................................................... 83
4.4.7. Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji ............................................................ 83
4.5. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i
prehrambenih proizvoda ............................................................................................................. 86
5. Tečna hromatografija visokih performansi – HPLC ................................................... 89

5.1. Uvod u HPLC ..................................................................................................................................... 89
5.2. Tehnike tečne hromatografije .................................................................................................. 90
5.3. Šta je HPLC? ...................................................................................................................................... 93
5.4. Princip rada tečne hromatografije visokih performansi ............................................... 94
5.5. Osnovni delovi HPLC sistema ................................................................................................... 94
5.5.1. Injektor ........................................................................................................................................... 95
5.5.2. Stacionarna faza – kolona ....................................................................................................... 96
5.5.3. Mobilna faza .................................................................................................................................. 98
5.5.4. Pumpa .............................................................................................................................................. 99
5.5.5. Detektor .......................................................................................................................................... 99
5.6. Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om ...................................................................... 101
5.7. Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om ................................. 104
5.8. Izokratsko i gadijentno eluiranje ............................................................................................ 105
5.9. Analitički, preparativni i industrijski HPLC ........................................................................ 107
5.10. Performanse hromatografskog razdvajanja .................................................................... 109
5.10.1 Rezolucija ..................................................................................................................................... 109
5.10.2. Sposobnost mehaničkog razdvajanja – efikasnost .................................................... 109
5.10.3. Sposobnost hemijskog razdvajanja – selektivnost ................................................... 110
5.11. Režimi HPLC razdvajanja ......................................................................................................... 111
5.11.1. Razdvajanje na osnovu polarnosti ................................................................................... 111
5.11.1.1. HPLC normalnih faza .......................................................................................................... 113
5.11.1.2. HPLC reverznih faza ........................................................................................................... 114
5.11.1.3. Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija ........................................................ 115
5.11.1.4. Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija ..................................................... 115
5.11.2. Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena ........................................... 115
5.11.3. Afinitetna hromatografija .................................................................................................... 118
5.11.4. Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija ..... 120
5.11.4.1. Gelhromatograf ..................................................................................................................... 122
5.11.4.2. Materijal za pakovanje kolone – nosač stacionarne faze .................................... 123
5.11.4.3. Mobilna faza ........................................................................................................................... 123
5.11.4.4. Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom ............................. 124
5.11.4.5. Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom raspodelom molskih masa . 125
5.11.4.6. Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa ... 128
5.11.4.7. Univerzalna kalibracija ...................................................................................................... 128
5.12. Primena HPLC tehnike u analizi hrane .............................................................................. 130
6. Literatura ............................................................................................................................................ 135

1. Principi i podela hromatografije
Cilj poglavlja
Upoznavanje sa osnovnim principima hromatografskih metoda. Definisanje

pojmova koji se koriste u literaturi posvećenoj hromatografskim metodama:
hromatogram, pik, koeficijent raspodele, teorijski pod, međumolekulske sile i interakcije.
Definisanje kriterijuma za podelu hromatografskih metoda i podela hromatografskih
metoda.
1.1. Uvod
Hromatografske metode su danas najčešće korišćene metode za razdvajanje i

određivanje supstanci. Hromatografija je metoda za analitičko razdvajanje supstanci,
mada se može koristiti i u preparativne svrhe, posebno za izolovanje malih količina
supstance, koje se ne mogu drugim metodama izolovati i/ili prečistiti. Hromatografija se
može definisati kao skup analitičkih metoda kojima se razdvajaju supstance na osnovu
različitih raspodela između pokretne i nepokretne faze.
Prvi naučnik koji je opisao metodu razdvajanja, koja se danas može nazvati
hromatografskom, jeste ruski botaničar M. Cvet (rus. M. Цвет, engl. M. Tswett). Cvet je
tehniku opisao još početkom dvadesetog veka, 1903. godine. On je ekstrakt pigmenata iz
listova biljaka propuštao kroz kolonu ispunjenu kalcijum-karbonatom i eluiranjem
pomoću smeše petroletar/etanol razdvojio više zelenih i žutih pigmenata. Tehniku je
nazvao hromatografija (od grčkih reči χρώμα: chroma – boja i γραφειν: grafein – pisati).
Bez obzira na naziv, on je pretpostavio da se tehnika može koristiti i za razdvajanje bezbojnih
supstanci i preporučio je za razdvajanje složenih smeša. Međutim, ova tehnika je bila
skoro zaboravljena više od dvadeset godina, sve do 1930. godine, kada su Kuhn,
Winterstein i Lederer na koloni punjenoj istim adsorbensom razdvojili komponente
žumanca jajeta i identifikovali lutein i zeaksantin. Početkom pedesetih godina prošlog
veka Martin i Synge razdvajaju acetil derivate amino kiselina na koloni punjenoj silika
gelom na kome je adsorbovana voda nepokretna faza a rastvarač za eluiranje
hloroformom, odnosno pokretna faza. Ovo je početak tečno-tečne hromatografije ili
apsorpcione (podeone) hromatografije, engl. “partition column chromatography”.
Martin i Synge su zahvaljujući svojim istraživanjima dobili Nobelovu nagradu za hemiju
1952. godine. Kasnije, Martin u saradnji sa Consden-om i Gordon-om razvija
hromatografiju na papiru, gde je voda bila nepokretna faza a 1-butanol pokretna faza.
Ruski farmaceuti Izmailov i Schreiber postavljaju osnove hromatografije na tankom
sloju 1938. godine, kada kao nepokretnu fazu koriste vodu adsorbovanu na tankom
sloju silika gela koji je nanet na staklenu ploču. Ovu tehniku dalje razvija i unapređuje
Principi i podela hromatografije
nemački hemičar Stahl šezdesetih godina prošlog veka. U periodu od 1950. do 1965.
godine, naglo raste broj naučnih radova vezanih za hromatografiju i postavljaju se osnove
za razvoj savremenih hromatografskih metoda: gasnu hromatografiju (GC), visokoefikasnu
tečnu hromatografiju (HPLC), jonsku hromatografiju, itd.
Uvođenjem masenog spektrometra kao detektora za gasnu hromatografiju od
strane James-a i Martin-a, 1952. godine, odnosno kao detektora za tečnu hromatografiju
od strane Tal’roze-a i Karpov-a, 1968. godine, i kasnijim razvojem masene
spektrometrije i računara počinje nova era u razvoju gasne i tečne hromatografije.
Danas možemo, korišćenjem GC/MS i LC/MS metoda, kvalitativno i kvantitativno
određivati i najsloženije smeše organskih jedinjenja, kao i izuzetno male količine
supstanci (reda veličnine ppm) u složenim smešama. Vreme trajanja analiza na
savremenim GC/MS i LC/MS aparatima je kratko (od nekoliko minuta do jednog sata),
rad sa njima je jednostavan, moderni softveri omogućavaju laku intrepetaciju rezultata,
sve su manjih dimenzija i, zahvaljući velikom broju proizvođača, cena im je sve niža.
Moderne hemijske laboratorije za analizu prehrambenih i poljoprivrednih proizvoda,
lekova, uzoraka iz životne sredine, nafte i naftnih derivata i mnogih drugih uzoraka je
danas teško zamisliti bez ovih aparata.
1.2. Osnovi hromatografije
Osnovni cilj hromatografije je razdvajanje različitih supstanci koje čine smešu.

Primene se kreću od jednostavnog određivanja čistoće nekog jedinjenja do identifikacije
i kvantitativnog određivanja komponenti neke smeše. Hromatografski sistem sastoji se
od nepokretne, tj. stacionarne faze, koja može biti čvrsta ili tečna, i pokretne, tj. mobilne
faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno prolazi kroz (preko) stacionarnu
fazu. Faze se biraju tako da komponente smeše na različit način interaguju sa nepokretnom
fazom, ako se radi o čvrstoj stacionarnoj fazi, odnosno da imaju različitu rastvorljivost u
tečnoj stacionarnoj fazi i mobilnoj tečnoj ili gasovitoj fazi. Analizirana smeša se u
hromatografski sistem uvodi preko mobilne faze. Različiti afiniteti komponenti smeše
prema stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje. Svaka
komponenta se zadržava u različitom stepenu na/u stacionarnoj fazi u zavisnosti od
afiniteta/rastvorljivosti, odnosno kreće se različitom brzinom kroz stacionarnu fazu u
zavisnosti od rastvorljivosti u mobilnoj fazi.
Interakcije između komponenti uzorka i stacionarne faze se mogu klasifikovati
kao procesi adsorpcije ili apsorpcije. Kod adsorpcije uzorak interaguje sa površinom faze, i to
obično sa površinom čvrste supstance stacionarne faze. Sa druge strane, kod apsorpcije
uzorak difunduje u unutrašnjost stacionarne faze. Većina hromatografskih razdvajanja
su kombinacija adsorpcionih i apsorpcionih procesa.
2
Kada se šmeša uvede kao rastvor na stacionarnu fazu, mobilna faza nosi komponente
kroz nju. Svaka komponenta smeše je u ravnoteži između faza na drugačiji način, pre svega
zbog različitog afiniteta prema stacionarnoj fazi. Iz tog razloga, svaka od komponenti ima
specifičnu ravnotežnu konstantu i kreće se različitom brzinom, odnosno za različito vreme
prolazi kroz stacionarnu fazu. Kao rezultat analize, hromatografski sistem će prvo
napustiti komponenta koja se najkraće zadržava na stacionarnoj fazi, a poslednja ona koja se
najduže zadržava, odnosno sve komponente smeše će biti razdvojene.
1.2.1. Osnovni pojmovi u hromatografiji
1.2.1.1. Hromatogram
Hromatogram je krajnji rezultat hromatografskog postupka. Svakoj supstanci

odgovara zona na hromatogramu, odnosno određeni pik. Zone su razdvojene
komponente smeše raspoređene u stacionarnoj fazi. Hromatografski maksimum ili pik
je grafički prikaz odziva detektora (koncentracije komponente u eluatu ili neke druge
veličine srazmerne koncentraciji) u funkciji vremena ili zapremine eluata.
U zavisnosti od tipa hromatografije razlikujemo unutrašnje i spoljašnje
hromatograme. Kod unutrašnjih hromatograma komponente smeše prelaze različita
rastojanja za isto vreme i detektuju se na stacionarnoj fazi, tj. podlozi (Slika 1.1).
Unutrašnje hromatograme susrećemo kod planarne hromatografije. Spoljašnji
hromatogrami su rezultat hromatografije u koloni, kada komponente smeše prelaze isti
put za različito vreme i detektuju se van stacionarne faze. Spoljašnji hromatogrami
mogu biti diferencijalni i integralni. Ako detektor beleži promenu koncentracije
komponente u mobilnoj fazi u funkciji vremena eluiranja onda je to diferencijalni
hromatogram (Slika 1.2). Kod integralnog hromatograma detektor beleži ukupnu
količinu izeluiranih sastojaka u vremenu. Spoljašnji hromatogram predstavlja grafički
prikaz hromatografskog razdvajanja. Veličina merenog signala (hromatografskog
maksimuma ili pika) se prikazuje u funkciji vremena zadržavanja komponente smeše u
koloni ili funkciji zapremine mobilne faze koja je potrebna da eluira (spere)
komponentu iz kolone.
Slika 1.1. Unutrašnji Slika 1.2. Spoljašnji diferencijalni

hromatogram hromatogram
3
1.2.1.2. Gausov profil pika
Svi molekuli jedne komponente se ne kreću istom brzinom kroz hromatografsku

kolonu, već se jedni kreću brže a drugi sporije. Brzina kretanja na zidu kolone je
približno jednaka nuli, dok je brzina kretanja u centru kolone maksimalna. Dalje, postoje
i varijacije u broju sorpcija i desorpcija molekula, razlike u koncentraciji u zoni
ubrizgavanja, itd. Zbog različite brzine kretanja molekula iste komponente kroz kolonu,
molekuli u različito vreme dolaze na detektor, tako da se dobija signal koji, u idealnom
slučaju, izgleda kao Gausova kriva raspodele. Realni pikovi vrlo često ne izgledaju kao
idealna Gausova kriva, već imaju manja ili veća odstupanja iz već pomenutih razloga.
Postoje dva osnovna oblika asimetričnih pikova. Kada je kolona prezasićena komponentom,
onda je uzlazni deo pika strmiji od silaznog. U slučaju kada se komponenta jako vezuje
za stacionarnu fazu (provodi više vremena na stacionarnoj fazi), onda je silazni deo pika
strmiji od uzlaznog. Da bi ovaj nedostatak izbegli ili sveli na najmanju moguću meru,
proizvođači daju kapacitet kolone koji je izražen u ng/jedinjenju, i koji omogućava
procenu optimalne količine supstance za analizu.
1.2.1.3. Koeficijent raspodele
Osnovni fizičko-hemijski parametar hromatografije je ravnotežna konstanta K,

koja se naziva koeficijent raspodele i koja kvantifikuje odnos koncentracija svakog
jedinjenja unutar dve faze. Vrednost koeficijenta raspodele nekog jedinjenja x može se
prikazati kao:
Kx = [X]S / [X]M
gde je
[X]S – koncentracija jedinjenja u stacionarnoj fazi i
[X]M – koncentracija jedinjenja u mobilnoj fazi
Vrednosti K su vrlo promenljive, jer one mogu biti veoma velike (npr. 1000), kada je mobilna
faza gas ili male (npr. 2) kada su i stacionarna i mobilna faza u tečnom stanju. Svako
jedinjenje zauzima samo ograničen prostor na koloni, uz promenljive koncentracije na
svakom mestu, dakle prave vrednosti [X]S i [X]M variraju u koloni, ali njihov odnos je
konstantan. Koeficijent raspodele zavisi od prirode supstance, stacionarne i mobilne
faze i temperature, dok je nezavistan je od koncentracije supstance.
1.2.1.4. Teorijski podovi
Teorijski pod (ili plato) je onaj zamišljeni deo kolone u kome je uspostavljena
ravnotežna raspodela koncentracija nekog jedinjenja između stacionarne i mobilne faze.
Model teorijskih podova pretpostavlja da se kolona sastoji od serije podova. Raspodela
4
neke komponente između mobilne i stacionarne faze se javlja na svakom podu. Iz tog
razloga, veći broj podova, znači bolje razdvajanje supstanci jer se dešava više ciklusa
sorpcije-desorpcije.
Broj teorijskih podova (N) je kvantitativna mera efikasnosti kolone i može se
dobiti direktno iz hromatograma:
N = 16(tr/tw)2
U jednačini tw je širina osnove pika (širina pika na baznoj liniji), izražena istom
jedinicom kao i retenciono vreme, tr, tj. vreme koje protekne od unošenja uzorka u
kolonu do pojave maksimuma njegovog pika. N ima približno iste vrednosti za različite
pikove nastale pod istim hromatografskim uslovima. To znači da se sa povećanjem
retencionog vremena povećava i širina pika što za posledicu ima da pik koji se eluira
poslednji ima malu visinu a veoma često ne može da se razlikuje od bazne linije.
Vrednost N proporcionalna je dužini kolone pa, ako su ostali faktori konstantni, duža
kolona vodi ka povećanju N, odnosno, boljem razdvajanju.
Efikasnost kolone se najčešće izražava preko broja teorijskih podova:
H = L/N
H - vrednost je visina ekvivalentna jednom teorijskom podu (engl. Height Equivalent to a

Theoretical Plate - HETP), L je dužina kolone. Iz jednačine se vidi da što je H – vrednost
manja, to je efikasnost kolone veća, odnosno širenje hromatografskih pikova je manje.
1.2.1.5. Retencioni parametri
Retencioni parametri su parametri koji definišu brzinu kojom komponetna

prolazi kroz hromatografski sistem, odnosno zapreminu mobilne faze koja je potrebna
da se komponenta eluira ili dužinu puta koji komponenta pređe za određeno vreme.
Retencioni parametri su: retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tM),
relativno retenciono vreme (t'r), retenciona zapremina (Vr), “Hold-up” zapremina ili
mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost.
Retenciono vreme (tr) je vreme koje protekne od unošenja uzorka u kolonu do
pojave maksimuma pika (slika 1.2).
Redukovano retenciono vreme (tM) je vreme koje supstanca provede u
stacionarnoj fazi.
Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog vremena posmatrane
komponente i referentne komponente (najčešće mobilne faze). Umesto relativnog
retencionog vremena se često koristi korigovano retenciono vreme koje predstavlja
razliku između retencionog vremena komponente i retencionog vremena mobilne faze
(t0) (hold-up time ili dead time).
5
Retenciona zapremina (Vr) je zapremina mobilne faze koja je potrebna da

komponenta pređe put od početka kolone do detektora.
“Hold-up” zapremina ili mrtva zapremina (VM) je zapremina mobilne faze
koja se nalazi u koloni.
Retencioni faktor (k) predstavlja meru zadržavanja komponente u koloni. Kada
se jedinjenje ukupne mase m unese na kolonu, razdvaja se na dva dela: jedan deo je u
mobilnoj fazi, mM - masa u mobilnoj fazi, a drugi deo u stacionarnoj fazi, mS - masa u
stacionarnoj fazi. Tokom migracije jedinjena kroz kolonu, ove dve mase ostaju
konstantne. Njihov odnos, koji se zove retencioni faktor, je konstantan i nezavisan od
ukupne mase jedinjena unete na kolonu (m):
k = mS/mM = CS/CM • VS/VM = K • VS/VM
Ovaj parametar uzima u obzir sposobnost kolone (njene stacionarne faze) da

zadrži jedinjenje. U idealnom slučaju vrednosti bi trebalo da se kreću od 1 do 5, ali ne
više jer bi se u tom slučaju komponenta previše zadržavala na koloni i time
neopravdano produžilo vreme analize, odnosno ne manje od jedan jer bi se tada
supstanca eluirala sa pikom mobilne faze.
Rf vrednost se definiše kao odnos pređenog puta komponente (dA) i pređenog
puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dM):
Rf = dA/ dM
Na Slici 1.1, na kojoj je prikazan unutrašnji hromatogram, Rf vrednost bi bila

jednaka b/a.
1.2.1.6. Selektivnost i razdvajanje
Selektivnost je sposobnost hromatografskog sistema da napravi razliku između

dve komponente na osnovu njihove različite raspodele između mobilne i stacionarne
faze. Mera selektivnosti je faktor selektivnosti (α) koji predstavlja meru razdvojenosti
dve komponente i smatra se da je za α >> 1 postignuto zadovoljavajuće razdvajanje
ispitivanih komponenti. Vrednost α se izračunava iz jednačine:
α = kA/kB
Faktor selektivnosti se, takodje, zove i relativno zadržavanje. Što je vrednost α veća, to
su dve komponente bolje razdvojene. Jedini način da se modifikuje ovaj parametar jeste
da se promeni jedna ili obe faze.
Rezolucija je stepen razdvajanja između dve komponente. Faktor rezolucije R
se može izračunati iz sledećeg izraza:
6
R = 2Δt/(WA-WB)
gde je :
Δt – razlika u retencionim vremenima komponente A i B (tA – tB)
WA – širina pika komponente A
WB - širina pika komponente B
Faktor rezolucije treba da ima vrednost veću od 1,2. Rezolucija zavisi od

efikasnosti kolone (broja teorijskih podova), selektivnosti i kapaciteta kolone.
1.2.2. Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima
Sve međumolekulske (intermolekulske) sile su po prirodi električne. Postoje tri

različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione, polarne i jonske sile.
Međumolekulske interakcije proizilaze iz međumolekulskih sila.
1.2.2.1. Disperzione sile
Disperzione sile nastaju zbog oscilacija naelektrisanja kroz molekul, kao rezultat
vibracija elektroni - jezgro. Elektroni u interakciji sa jezgrom daju dipole koji se brzo
menjaju i ako se posmatraju kroz veliki broj konfiguracija u molekulu, njihova
rezultanta je nula. Međutim, oni su u svakom trenutku u mogućnosti da interaguju sa
dipolom iz drugog molekula i na taj način dovedu do interakcije između molekula.
Dominantan faktor koji kontroliše jačinu disperzione sile je polarizabilnost. Dakle,
disperzione interakcije nisu rezultat lokalizovanih dipola u bilo kom delu molekula, već
promenljivi dipoli jednog molekula mogu da u bilo kom trenutku stupe u intrakciju sa
promenljivim dipolima drugog molekula. Disperzione interakcije su slabe interakcije,
koje se, zbog toga sto se javljaju kod nepolarnih jedinjenja koja se ne rastvaraju u vodi,
zovu još i hidrofobne interakcije.
1.2.2.2. Polarne sile
Polarne interakcije nastaju kao posledica električnih sila (Van der Waals – ovih
sila) između lokalizovanih naelektrisanja koja su rezultat stalnih ili indukovanih dipola.
One se ne pojavljuju izolovano, već zajedno sa disperzionim interakcijama i u nekim
slučajevima mogu da se kombinuju i sa jonskim interakcijama. Polarne interakcije su
znatno jače od disperzionih interakcija, koje se mogu smatrati i indukovani dipol –
indukovani dipol interakcijama i uključuju dva tipa interakcija: dipol – dipol interakcije,
dipol – indukovani dipol interakcije.
Dipol – dipol interakcije se javljaju između polarnih molekula i najače su od
svih Van der Waals – ovih interakcija. Pozitivan kraj jednog dipola se orijentiše ka
negativnom kraju drugog dipola i na taj način se međusobno privlače. Ako u molekulu
imamo vezan vodonik za neki izrazito elektronegativan atom koji sadrži bar jedan
7
slobodan elektronski par, kao što su kiseonik i azot, onda nastaju veoma jake
međumolekulske interakcije poznate pod imenom vodonične veze. Vodonične veze su
karakteristične za jedinjenja koja sadrže hidroksilnu ili amino grupu: alkoholi,
karboksilne kiseline, amini, amidi, itd. Dipol – dipol sile se mogu javljati između
istovrsnih molekula ali i između različitih polarnih molekula, odnosno, polarni molekuli
mogu stupiti u interakciju međusobno ili, ako se nalaze u polarnoj sredini (npr. polarna
stacionarna ili mobilna faza) mogu interagovati sa dipolima iz te sredine.
Dipol – indukovani dipol interakcije su karakteristične za polarizabilne molekule,
kao što su molekuli aromatičnih jedinjenja, odnosno, molekuli sa delokalizovanim π
elektronima. Kada se takvi molekuli nađu u blizini molekula koji ima stalni dipol,
električno polje dipola indukuje dipol u polarizabilnom molekulu. Ovaj, novonastali
dipol, tj. indukovani dipol, se ponaša na isti način kao i stalni dipol i dalje indukuje dalje
stvaranje dipola, odnosno gradi dipol-dipol interakcije. Ove interakcije su takođe praćene
disperzionim interakcijama i slabije su u od interakcija između stalnih dipola.
1.2.2.3. Jonske sile
Jonske interakcije su interakcije između suprotno naelektrisanih jona. Joni su prisutni

u vodenim rastvorima i ovakve interakcije su karakteristične za tečnu hromatografiju. Jonske
interakcije su najjače od ranije pomenutih i mogu biti kombinovane sa disperzionim
interakcijama, polarnim interakcijama i jon - dipol interakcijama. Praktično, jonske
interakcije se koriste u jonizmenjivačkoj hromatografiji.
1.2.2.4. Hidrofobne i hidrofilne interakcije
U jednom istom molekulu može biti delova koji se razlikuju po polarnosti (npr.
masne kiseline), odnosno mogu imati polarni i nepolarni deo. “Veliki molekuli” kao što
su proteini, nukleinske kiseline i polisaharidi, mogu imati na stotine različitih interaktivnih
delova širom molekula (polarnih i nepolarnih). Interakcije molekula, kako inter- i
intramolekulske, tako i sa mobilnom i stacionarnom fazom, određuju ukupni efekat koji
može biti hidrofobni ili hidrofilni. Ako dominiraju nepolarni delovi (disperziona mesta)
onda molekul interaguje disperzionim silama i takve molekule svrstavamo u
hidrofobne, odnosno liofobne. Ako dominiraju dipolne i polarizabilne grupe, imamo
polarne molekule ili hidrofilne, odnosno liofilne molekule.
Termin “hidrofobnost” bukvalno znači “strah od vode” i podrazumeva neki oblik
odbijanja nepolarnih molekula od molekula vode, koji je nemoguć izvan Van der Waals-
ovih poluprečnika. Hidrofobnost se može objasniti na primeru mešanja nekog
nepolarnog disperzionog rastvarača, kao što je heptan sa veoma polarnim rastvaračem,
kao što je voda. Heptan i voda su nemešljivi jer su privlačne sile između dva molekula
heptana (disperzione sile) i dva molekula vode (vodonične veze) mnogo jače od
privlačnih sila između molekula heptana i vode. Voda se u maloj meri ipak rastvara u
8
heptanu, kao i heptan u vodi. Iako su interakcije voda-voda i heptan-heptan mnogo jače
od interakcije voda-heptan, interakcije voda-heptan postoje i dovoljno su jake da
omoguće rastvorljivost u maloj meri.
Termin “hidrofilnost” bukvalno znači “voli vodu” i podrazumeva interakcije polarnih
molekula i molekula vode. Polarni i hidrofilni su ekvivalentni termini, jer polarne supstance
jako interaguju sa vodom i drugim polarnim rastvaračima. Hidrofobnost i hidrofilnost
su termini koji se intenzivno koriste u biotehnologiji radi opisivanja interakcija molekula kao
celine, posebno kod biomakromolekula. Na primer polipeptidi sadrže veliki broj amino-
kiselina od kojih svaka ima grupe različitih polarnosti, od nepolarnih do izrazito
polarnih, a isto tako sadrže veliki broj peptidnih veza koje su izrazito polarne, tako da
imamo delove različitih polarnosti duž polipeptidnog lanca. Da bi lakše opisali ukupan
efekat svih prisutnih interakcija, inter- i intramolekulskih, koriste se termini hidrofobnost i
hidrofilnost, iako su oni u osnovi alternativni termini kojima se opisuju disperzione i
polarne interakcije.
1.3. Podela hromatografskih metoda
Hromatografske metode možemo podeliti na osnovu: primenjene tehnike rada,

fizičkog stanja mobilne i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske
podloge.
1.3.1. Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada
Metoda frontalne analize se sastoji u tome da se rastvor ispitivane smeše

kontinuirano propušta kroz kolonu. Ako smeša sadrži komponente A, B i C sa redosledom
koeficijenata raspodele KA > KB > KC, iz kolone prvo izlazi čista komponenta C, jer se
najslabije adsorbuje. Zatim izlazi smeša komponenata B i C i na kraju eluat koji sadrži
komponente A, B i C u istom odnosu u kome su unete u kolonu. Ovom metodom može se
dobiti samo deo čiste komponente C, odnosno komponente koja se najbrže kreće kroz
kolonu i iz tog razloga nema veći analitički značaj i retko se koristi.
Metoda istiskivanja se izvodi tako što se smeša, koja sadrži komponente A, B i C,
nanese na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano propušta rastvor komponente D,
koja se mnogo jače vezuje za adsorbens od komponenata analizirane smeše. Komponenta D
potiskuje komponente smeše, koje obrazuju zone. Zbog stalnog dejstva komponente D,
komponente smeše se ne mogu potpuno razdvojiti, već se zone međusobno dodiruju. Do
izlaska iz kolone, sve tri zone se kreću istom brzinom, koja zavisi od brzine kretanja
komponente D kroz kolonu.
Metoda eluiranja je praktično jedina metoda koja se koristi za razdvajanje u
analitičke svrhe, jer se pomoću nje komponente smeše mogu potpuno razdvojiti. Mala
količina analizirane smeše, koja sadrži komponente A, B i C, sa redosledom koeficijenata
raspodele KA > KB > KC, nanese se na vrh kolone. Zatim se kroz kolonu kontinuirano
9
propušta mobilna faza, tzv. eluent, odnosno vrši eluiranje. Ako su razlike u vrednostima
koeficijenata raspodele komponenti dovoljno velike, postižu se potpuna razdvajanja, pri
čemu iz kolone prvo izlazi komponenta C, koja se najslabije vezuje za stacionarnu fazu.
1.3.2. Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja
Adsorpciona hromatografija se zasniva na razlici između adsorpcionih afiniteta

komponenti uzorka prema aktivnoj površini čvrste, odnosno, stacionarne faze (IUPAC
definicija). Takođe se još naziva tečno-čvrsta hromatografija. Adsorbenti su uglavnom
aktivne, porozne čvrste supstance sa velikom površinom, kao što su silika-gel,
aluminijum-oksid, magnezijum-silikat, aktivni ugalj itd. Adsorbensom može biti
napunjena kolona, može biti nanesen na neku podlugu u obliku tankog sloja a takođe
adsorbensom može biti impregniran i porozni papir. Aktivni delovi stacionarne faze
interaguju sa funkcionalnim grupama komponenti smeše koja se razdvaja i zahvaljujući
tome mogu se razdvojiti različite klase jedinjenja. Na primer, silika-gel jako interaguje
sa polarnim funkcionalnim grupama, a slabo sa nepolarnim grupama i na taj način se
mogu odvojiti polarna od nepolarnih jedinjenja (npr. alkoholi od ugljovodonika).
Podeona (particiona) hromatografija se zasniva na različitoj rastvorljivosti
komponenti uzorka u stacionarnoj fazi (gasna hromatografija) ili na različitoj
rastvorljivosti komponenti u mobilnoj i stacionarnoj fazi (tečna hromatografija) (IUPAC
definicija). Kod tečne hromatografije komponente uzorka se, prema rastvorljivosti,
raspoređuju između dve faze koje se međusobno ne mešaju. Tečna stacionarana faza je
ravnomerno raspoređena na čvrstom inertnom nosaču i različite je polarnosti od tečne
mobilne faze, da bi se izbeglo mešanje ove dve faze. Obično je stacionarna faza polarna a
mobilna nepolarna i u tom slučaju se radi o hromatografiji normalnih faza. U obrnutom
slučaju kada je stacionarna faza nepolarana a mobilna faza polarna onda je to tečna
hromatografija obrnutih ili reverznih faza.
Jonoizmenjivačka hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih
vrsta u rastvoru, prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje poseduju neki adsorbensi.
Takvi adsorbensi mogu biti neorganskog i organskog porekla, sintetički i prirodni. Prema
tome da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone, dele se na katjonske i
anjonske izmenjivače. Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje
elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i aktinida), odvajanje jonskih od
nejonskih vrsta, razdvajanje jona, razdvajanje katjona od anjona, koncentrisanje jona
metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje koncentracije jona.
Najčešće se kao jonski izmenjivači koriste visokopolimerne smole koje sadrže
aktivne kiselinske ili bazne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora. Katjonski
izmenjivači sadrže kiselinske grupe, kao što su –SO3H i –COOH, a anjonski izmenjivači
sadrže bazne grupe, kao što su –OH ili amino –NH2, –NHR i –NR2 grupe. Pomoću
katjonskih izmenjivača razdvajaju se aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza
10
koje su rastvorne u vodi. Anjonski izmenjivači se koriste za razdvajanje alkaloida,

hlorofenola, hemoglobina, aldehida, ketona, organskih kiselina male molarne mase i
drugih jedinjenja.
Gel hromatografija ili gel filtracija (engl. Exclusion Chromatography) se zasniva
na razlikama u veličini molekula i/ili oblika ili naelektrisanja. Kada se razdvajanje zasniva na
veličini molekula, u engleskom jeziku se takođe koristi naziv Size-Exclusion Chromatography.
Termini gel filtracija i gel-propusna hromatografija (GPC) su korišćeni ranije da se opiše
ovaj proces kada je stacionarna faza u obliku nabubrelog gela. Engleski naziv Ion-Exclusion
Chromatography se specifično koristi za razdvajanje jona u vodenoj fazi (IUPAC definicija).
Razdvajanje gel hromatografijom se razlikuje od razdvajanja drugim
hromatografskim metodama po tome što se zasniva na veličini molekula, a ne na
hemijskim i fizičko-hemijskim fenomenima. Stacionarna faza je hemijski inertna i dolazi
do selektivne difuzije molekula uzorka iz mobilne faze u pore stacionarne faze, koja
može biti gel ili porozna neorganska čvrsta supstanca. Stepen zadržavanja zavisi od
veličine molekula uzorka u odnosu na veličinu pora. Manji molekuli će prodirati u sve
pore, molekuli srednje veličine će prodirati samo u neke pore, dok će veliki molekuli
prolaziti kroz kolonu bez zadržavanja. Ova metoda se najčešće koristi za međusobno
razdvajanje (frakcionisanje) polimera i biopolimera, odnosno, molekula velikih molskih
masa, kao i za razdvajanje (prečišćavanje) velikih molekula od malih molekula.
Afinitetna hromatografija se zasniva na različitom afinitetu komponenti smeše,
najčešće proteina, prema specifičnim hemijskim grupama – ligandima. Ligandi su vezani
za čvrsti nosač i predstavljaju stacionarnu fazu, dok je mobilna faza najčešće neki pufer.
Interakcije između liganada i proteina su vrlo specifične i selektivne, tako da se
određeni proteini vezuju samo za određene ligande, odnosno ligand može biti specifičan
samo za jedan protein iz uzorka biološkog materijala. Iz tog razloga se interakcije
protein – ligand, još zovu i ključ – brava interakcije. Najčešće protein – ligand interakcije
su: enzim-inhibitor, hormon-receptor, antitelo-antigen, protein-ugljeni hidrat, enzim-
koenzim i metaloprotein-jon metala.
1.3.3. Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge
Hromatografija u koloni je tehnika razdvajanja kod koje se stacionarna faza

nalazi u koloni (cevi). Stacionarnu fazu čine čestice čvrste supstance ili čestice čvrste
supstance obložene tankim „kapilarnim“ slojem tečnosti kojima je ispunjena kolona
(pakovana kolona) ili stacionarnom fazom može biti obložen unutrašnji zid kolone
(tubularna kolona). Mobilna faza se kreće kroz stacionarnu fazu ili duž stacionarne faze.
Hromatografske kolone mogu biti otvorene i kroz njih se moblna faza kreće pod
dejstvom sile Zemljine teže. To su najčešće staklene cevi ispunjene stacionarnom fazom,
na čiji vrh se nanosi uzorak i dodaje rastvarač (eluent) ili više rastvarača koji sa sobom
nosi komponente uzorka. Kod zatvorenih hromatografskih kolona mobilna faza se kroz
kolonu kreće pod pritiskom (pritisak gasa ili pumpa). U zavisnosti od jačine interakcija
11
komponenti uzoraka sa stacionarnom fazom one kroz kolonu putuju različitim

brzinama i na taj način se razdvajaju.
Planarna hromatografija je tehnika razdvajanja u kojoj je stacionarna faza ravan ili
se nalazi na ravni. Stacionarna faza može biti papir, tačnije voda vezana za papir, ili papir
impregniran stacionarnom fazom i ta vrsta hromatografije se zove hromatografija na
papiru. Takođe, stacionarna faza može biti tanki sloj čvrstih čestica nanetih na ravnu
površinu, najčešće staklenu, kada se radi o hromatografiji na tankom sloju. Ova
hromatografija se još naziva i hromatografija u „otvorenoj koloni“.
Kod hromatografije na papiru stacionarna faza je voda kojom je zasićena celuloza, dok
je mobilna faza neki organski rastvarač ili smeša rastvarača. Tehnika se izvodi tako što
se na papir nanese uzorak i papir postavlja u sud tako da rastvarač kroz papir prolazi
horizontalno, nadole ili nagore. Prema načinu na koji mobilna faza prolazi kroz papir
razlikuju se: horizontalna (kružna) hromatografija, silazna i uzlazna hromatografija na
papiru.
Kod hromatografije na tankom sloju stacionarnu fazu čini tanak sloj nekog
adsorbensa nanet na ravnu podlogu – staklenu ploču. Izbor adsorbensa zavisi od
prirode supstanci koje se razdvajaju. Najčešće se koriste: silikagel, aluminijum-oksid,
celulozni prah, magnezijum-oksid, itd. Danas se koriste i komercijalne ploče sa nekom
od ovih podloga ili sa podlogom koja sadrži specifične aditive. Kao i kod hromatografije
na papiru i kod ove tehnike se, u zavisnosti od načina prolaska mobilne faze kroz
stacionarnu, razlikuju tri tehnike: horizontalna, uzlazna i silazna.
1.3.4. Podela hromatografskih metoda prema fizičkom

stanju mobilne i stacionarne faze
Mobilna faza može biti gas ili tečnost, a stacionarna faza može biti čvrsta ili tečna.
Prema fizičkom stanju mobilne i stacionarne faze sve hromatografske metode možemo
podeliti na: gasno (mobilna faza) – tečnu (stacionarna faza), gasno – čvrstu, tečno –
tečnu i tečno – čvrstu hromatografiju. U zavisnosti od korišćene tehnike, vrste
stacionarne faze i podloge, ove hromatografske tehnike se mogu svrstati u neku od već
pomenutih podela.
Rezime poglavlja
Hromatografski sistem sastoji se od nepokretne, stacionarne faze, koja može biti

čvrsta ili tečna, i pokretne, mobilne faze, koja može biti tečna ili gasovita i koja neprekidno
prolazi kroz (preko) stacionarnu fazu. Različiti afiniteti komponenti smeše prema
stacionarnoj i mobilnoj fazi određuju njihovo međusobno razdvajanje.
Osnovni pojmovi u hromatografiji su: hromatogram, pik, koeficijent raspodele,
teorijski pod, retenciono vreme (tr), redukovano retenciono vreme (tM), relativno
12
retenciono vreme (t'r), korigovano retenciono vreme, retenciona zapremina(V r), “hold-up”
zapremina ili mrtva zapremina (VM), retencioni faktor (k) i Rf vrednost.
Međumolekulske interakcije u hromatografskim sistemima proizilaze iz
međumolekulskih sila. Postoje tri različita tipa međumolekulskih sila i to su disperzione,
polarne i jonske sile.
Hromatografske se dele na osnovu: primenjene tehnike rada, fizičkog stanja mobilne
i stacionarne faze, mehanizma razdvajanja ili oblika hromatografske podloge.
Pitanja za proveru znanja ili diskusiju

1. Definisati pojmove: hromatogram, koeficijent raspodele, teorijski pod, retencioni
faktor i Rf vrednost.
2. Definisati retencione parametre.
3. Objasnite međumolekulske interakcije izazvane polarnim silama.
4. Šta su to hidrofobne i hidrofilne interakcije?
5. Kako se dele hromatografske metode prema mehanizmu razdvajanja? Objasniti
mehanizme razdvajanja.
Literatura
1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380,

1910.
2. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, 1941.
3. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod

za produktivnost rada I informativne sisteme, Beograd, 1985.
4. S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu,

Hemijski fakultet, Beograd, 1994.
5. Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for

publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp 819-872, 1993.
6. A. Braithwaite, F. J. Smith, Chromatographic Methods, 5th Edition, Kluwer Academic

Publishers, Dordrecht, 1999.
7. Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold-

Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G.
Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography,
Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp. 969–
992, 2001.
8. R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series –

Book 1, Library4science, 2003.
13
2. Planarna hromatografija
Cilj poglavlja
Upoznavanje sa metodama planarne hromatografije: hromatografija na papiru i

tankoslojna hromatografija. Definisanje i opis: stacionarne faze (hromatografski papir,
silika-gel, Al2O3, itd.), pripreme i nanošenja uzorka, mobilne faze, razvijanja i izazivanja
hromatograma, kvalitativne i kvantitativna analize.
2.1. Hromatografija na papiru
Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije i veoma je intenzivno

korišćena u prošlosti. Prvo hromatografsko razdvajanje na papiru uradili su Consden, Gordon
i Martin 1943. godine, oni su razdvajali amino-kiseline na trakama papira. Danas je papirna
hromatografija zamenjena tankoslojnom hromatografijom za većinu aplikacija ali se i dalje
koristi. Glavne prednosti ove metode su: jednostavnost, niske cene, nema komplikovanih
operacija, kvantitativno određivanje se pože postići bez upotrebe instrumenata itd.
2.1.1. Hromatografski papir
Papir koji se koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a

stacionarna faza je voda adsorbovana na molekulima celuloze. Dakle, hromatografija na
papiru je podeona, tečno – tečna, hromatografija. Mnogobrojne hidroksilne grupe u molekulu
celuloze čine njenu površinu hidrofilnom odakle potiče njen afinitet prema molekulima
polarnih rastvarača. Međutim, ne sme se zanemariti adsorpcija komponenata mobilne
faze i analizirane smeše na molekule celuloze, kao i jonska izmena. Adsorpcija i jonska izmena
se mogu kontrolisati podešavanjem eksperimentalnih uslova, ukoliko se želi da se uticaj
ovih faktora svede na najmanju moguću meru, onda se rastvarači koji čine mobilnu fazu
prethodno zasite vodom.
Za hromatografiju na papiru najčešće se koristi nemodifikovana pamučna celuloza,
koju karakteriše vlaknasta struktura. Papir se sastoji od velikog broja celuloznih
vlakana koja obrazuju trodimenzionalnu mrežu u čijoj strukturi se nalazi slobodan
prostor. Stacionarna faza se adsorbuje na površini vlakana, dok mobilna faza protiče
preko ove površine i adsorbovanog sloja i puni slobodne prostore. Ako su vlakna na
manjem rastojanju slobodan prostor je redukovan i brzina proticanja mobilne faze se
smanjuje. Brzina protoka mobilne faze zavisi od njenog viskoziteta, a za datu smešu
rastvarača brzina zavisi od fizičke prirode hartije. Proizvodi se papir različite gustine i
14
Planarna hromatografija
debljine. Deblja hartija iste gustine povećava brzinu protoka, pod kojim se podrazumeva
pomeranje fronta rastvarača a ne zapremina tečnosti koja protiče u jedinici vremena.
Danas postoje veoma raznovrsne vrste papira napravljene od nemodifikovane
celuloze:
- papiri male gustine, koji omogućavaju brži protok mobilne faze
- glatki papiri veće gustine
- papiri isprani kiselinom
- papiri bez rastvorljivih supstanci u lipidima
- papiri za preparativnu hromatografiju, itd.
Pored pomenutih proizvode se i papiri od modifikovane celuloze koji su pogodni

za hromatografisanje polarnih, nepolarnih ili jonskih supstanci. Za razdvajane polarnih
supstanci u molekul celuloze se uvode polarne grupe. Na primer celuloza sa povećanim
sadržajem karboksilnih grupa je pogodna za odvajanje polarnih jedinjenja kao što su
amini, amino-kiseline i katjoni. Papir koji sadrži jonoizmenjivačke smole pogodan je za
razdvajanje jonskom izmenom. Za razdvajanje hidrofobnih jedinjenja koristi se papir
impregniran suspenzijom dijatomejske zemlje ili papir napravljen od celuloznih estara,
na primer, acetilovani papir. Takođe, papir može biti impregniran „silikonskim uljem“ –
smešom cikličnih i acikličnih oligomera polisiloksana, može da sadrži adsorbente poput
glinice ili silika-gela itd. Za razdvajanje smeša koje sadrže korozivne supstance koriste
se papiri sa staklenim vlaknima, kod njih su i adsorpcioni efekti minimizirani i za analizu je
potrebno značajno manje vremena.
2.1.2. Priprema i nanošenje uzorka
Čvrsti uzorci moraju biti rastvoreni u lako isparljivom rastvaraču, kao što su
etanol i aceton, odnosno uz primenu odgovarajućih mera bezbednosti i hloroform
(trihlormetan) i metilen hlorid (dihlormetan). Količina uzorka koja se nanosi zavisi od
mogućnosti njegove detekcije i mora se voditi računa da se ne preoptereti sistem,
odnosno da se ne nanese velika količina uzorka. Poželjno je da se nanese oko 10 μl
rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u obliku kružne mrlje koja sadrži od 1 – 1000 µg uzorka.
Ako je koncentracija uzorka u rastvoru niska, ona se može povećati na jedan od sledećih
načina:
- ekstrakcijom uzorka iz rastvora i koncentrovanjem novog rastvora
- nanošenje rastvora uzorka više puta na papir u malim porcijama
- jonske supstance iz bioloških materijala mogu se koncentrovati
korišćenjem jonoizmenjivačkih papira.
Uzorci koji sadrže velike količine supstanci koje nisu od interesa za analizu moraju se
pre hromatografisanja prečistiti. Na primer uzorci koji se koriste za praćenje zagađenja
zemljišta ili vode, uzorci hrane, uzorci hrane za životinje, uzorci bioloških materijala itd.
15
Informacija o rastvorljivosti supstance koja se analizira, kao i o rastvorljivosti pratećih

supstanci je od velikog interesa. Ako je je analizirana supstanca rastvorna u nekom
rastvaraču, a prateće nisu, onda je ekstrakcija odgovarajućim rastvaračem dovoljna za
prečišćavanje i koncentrovanje. Neorganske supstance se mogu ukloniti korišćenjem
rastvarača koji selektivno rastvara komponente od interesa ili jonoizmenjivačke smole.
Proteini se mogu ukloniti taloženjem sa volframovom kiselinom, koagulacijom na
povišenoj temperaturi, koagulacijom u prisustvu metanola ili acetona. Lipidi se mogu ukloniti
ekstrakcijom sa nepolarnim (lipofilnim) rastvaračem. alternativno, hromatogram može
biti razvijen sa lipofilnim rastvaračem za uklanjanje lipida iz uzorka gde se određuju
supstance koje nisu lipofilne. Analit se zatim hromatografiše odgovarajućim rastvaračem.
Kod nekih uzoraka je pre hromatografisanja potrebno da jednu ili više komponenti
uzorka hemijskom reakcijom prevedemo u odgovarajući derivat. Uobičajeni načini
derivatizacije za uvođenje hromofora su dati u Tabeli 2.1.
Tabela 2.1. Uobičajeni načini derivatizacije za uvođenje hromofora
Jedinjenje Reagens Derivat
Derivatizacija je pogodna iz sledećih razloga:
- Bolja je detekcija analiziranih komponenti

- Smanjuje se isparljivost analiziranih komponenti
- Uklanjaju se supstance koje nisu od interesa za analizu
- Poboljšava se razdvajanje analiziranih komponenti.
16
Izbor reagensa za derivatizaciju zavisi od prisustva i reaktivnosti funkcionalnih grupa

u analiziranoj supstanci. U idealnom slučaju reakcija derivatizacije treba da bude brza,
kvantitativna, bez ili sa minimumom sporednih proizvoda. Pošto se za detekciju najčešće
koristi UV spektrometar, cilj derivatizacije je da se poveća UV apsorbanca jedinjenja od
interesa, vezivanjem hromofore sa visokim molarnim koeficijentom ekstincije. Reakcija
sa specifičnom funkcionalnom grupom ne samo da daje željeni derivat, već smanjuje i
polarnost i često derivat ima bolja hromatografska svojstva od polazne supstance.
Derivatizuju se najčešće jedinjenja koja sadrže amino-, karboksilnu- ili hidroksilnu
grupu. U Tabeli 2.1 su pokazani najčešći reagensi za uvođenje hromofora odnosno
povećanje UV apsorbcije, a u Tabeli 2.2 reagensi za dobijanje derivata sa većom
fluorescencijom. Treba napomenuti da se derivatizacija izvodi samo ako je neophodno, jer taj
postupak produžava vreme analize i zahteva pažljivo izvođenje da ne bi došlo do
gubitaka. Reakcije derivatizacije se mogu koristiti i za bolju detekciju zona nakon
razvijanja hromatograma (vidi deo Detekcija).
Tabela 2.2. Uobičajeni načini derivatizacije za povećanje fluorescencije
Jedinjenje Reagens Derivat
17
2.1.3. Mobilna faza
Mobilna faza je rastvarač ili smeša rastvarača zasićena vodom. Koristi se veliki
broj mobilnih faza u zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju (hidrofilne,
umereno polarne, hidrofobne). U Tabeli 3. su prikazani najčešće korišćeni rastvarači u
papirnoj hromatografiji. Osim rastvarača u mobilnu fazu se dodaju i različite supstance,
kao što su kiseline, baze, kompleksirajući agensi, sa ciljem da se poveća ili smanji
rastvorljivost pojedinih supstanci u analiziranoj smeši.
Tabela 2.3. Najčešće korišćeni rastvarači u papirnoj hromatografiji
Mešljiv sa vodom u svim odnosima Nepotpuno mešljiv sa vodom

Formamid 2-metil-2-propanol (t-butanol)
Metanol 1-butanol
Sirćetna kiselina 1-pentanol (amil alkohol)
Etanol Etil-acetat
2-propanol (Izopropanol) Dietil etar
Aceton Toluen
1-propanol Petrol etar
Razdvajanje supstanci hromatografijom na papiru se zasniva na raspodeli između

celuloze, za koju je vezana voda, i pokretnog rastvarača koji je zasićen vodom. S obzirom
da se na celulozi nalazi sloj molekula vode, vezanih za nju vodoničnim vezama i da
stacionarna faza adsorbuje molekule supstance iz mobilne faze, praktično ne postoji
dodirna površina rastvarač-rastvarač, već postepena promena sastava rastvarača u
pravcu suprotnom od površine celuloze i to od najpolarnijeg rastvarača (vode) do manje
polarnog organskog rastvarača. Dok mobilna faza prolazi kroz vlakna papira, celuloza
teži da adsorbuje više vode iz nje, tako da što rastvarač više napreduje sadrži manje vode, pa
sastav mobilne faze nije konstantan duž hromatografske hartije, odnosno, postoji „suvi“
i „mokri“ front rastvarača.
Za razdvajanje hidrofilnih supstanci najčešće se koriste mobilne faze koje se sastoje
od: 1-butanola/sirćetne kiseline/vode ili 2-propanola/amonjaka/vode. Za razdvajanje
umereno polarnih supstanci kao osnovni rastvarač se koristi formamid kombinovan sa
polarizabilnim organskim rastvaračima: formamid/hloroform, formamid/toluen. U
toluen i hloroform se često dodaju različite količine cikloheksana za poboljšavanje
razdvajanja. Kada se koristi „formamidna“ mobilna faza, hromatografski papir se impregnira
40 % rastvorom formamida u etanolu u koji se mogu dodati (do 5 %) amonijum-
formijat ili mravlja kiselina za zakišeljavanje stacionarne faze. Za razdvajanje hidrofobnih
supstanci najčešće se koriste dve smeše rastvarača: dimetilformamid/cikloheksan (za
impregnaciju papira koristi se 50 % DMF u etanolu) i parafinsko
ulje/dimetilformamid/metanol/voda (za impregnaciju papira koristi se 10 % rastvor
parafinskog ulja u nekom aromatičnom ugljovodoniku).
18
2.1.4. Razvijanje hromatograma
Podeona hromatografija na hartiji izvodi se u staklenoj posudi (hromatografskoj

kadi) sa poklopcem koji dobro zatvara. Atmosfera posude mora biti zasićena parama
rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa hartije. Širina zone izdvojene
komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Pomoću
kalibrisane kapilare ili mikropipete nanese se rastvor uzorka na nekoliko centimetara
od kraja trake od hartije, koja se nalazi u horizontalnom položaju.Uzorak se nanosi u
obliku zone, koja ne treba da ima prečnik veći od 5 mm, ili u obliku što tanje crte.
Hartija sa nanetom zonom uzorka može se postaviti u sud tako da rastvarač kroz
hartiju prolazi horizontalno, nadole ili nagore. Prema tome, razlikuju se: horizontalna
(kružna), silazna i uzlazna hromatografija na papiru.
Horizontalna ili kružna hromatografija na papiru izvodi se tako što se hartija kružnog
oblika stavi u komoru zasićenu parama mobilne faze i uzorak nanese u centar kružne
hartije. Pre toga se od ivice ka centru kruga iseče uzana traka i savije normalno na ravan
hartije. Kraj trake se uroni u rastvarač, koji kroz traku dospeva do centra hartije i
radijalno se širi. Na taj način formiraju se odvojene zone komponenti smeše u obliku
koncentričnih krugova (Slika 2.1).
Slika 2.1. Kružna hromatografija na papiru
Silazna hromatografija na papiru izvodi se tako što se kraj trake na koji je nanet
uzorak pričvrsti za dno rezervoara sa rastvaračem, koji se nalazi na vrhu posude (Slika
2.2). Protok rastvarača kroz hartiju ostvaruje se pomoću kapilarnog pritiska, dok front
rastvarača ne pređe zid rezervoara. Dalje se rastvarač kreće i pod uticajem sile
gravitacije, pomerajući zonu uzorka, koji je nanet izvan rezervoara, naniže. Ova tehnika
se koristi za razdvajanje komponenata koje imaju male ili vrlo bliske Rf vrednosti.
Rastojanje koje prelazi front rastvarača reguliše se dužinom hartije i visinom posude.
19
Slika 2.2. Silazna hromatografija na papiru
Dvodimenzionalna hromatografija na papiru se koristi kod supstanci sa bliskim Rf

vrednostima. Kad se završi razdvajanje silaznom tehnikom, traka se osuši, okrene za 90°
i protok rastvarača, najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog
rastvarača (Slika 2.3). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno
razdvojile. Da bi dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni
rastvarač potpuno ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač.
I razvijanje II razvijanje
rastvarač 1 rastvarač 2
smer
Slika 2.3. Dvodimenzionalna hromatografija na papiru
Uzlazna hromatografija na papiru je tehnika koja se najviše koristi, a izbegava se

samo kad su Rf vrednosti komponenata suviše bliske. Ovde se rastvarač sipa na dno
suda, a hartija postavi tako da donji deo hartije bude potopljen u rastvarač (Slika 2.4).
Mesto nanošenja uzorka mora biti dovoljno udaljeno od donjeg kraja i mora biti iznad
nivoa rastvarača, u kome bi se inače uzorak rastvorio. Pošto rastvarač kod ove tehnike
prodire kroz hartiju pod dejstvom kapilarnih sila, zbog suprotnog dejstva gravitacije
dolazi do zaustavljanja protoka rastvarača na određenoj visini.
20
Slika 2.4. Uzlazna hromatografija na papiru
Parametar kojim se izražava ponašanje analizirane supstance kod hromatografije na

ravnim površinama jeste brzina kretanja ili faktor zadržavanja, Rf vrednost. U
Poglavlju 1 je već definisana Rf vrednost kao odnos pređenog puta komponente (dA) i
pređenog puta rastvarača, odnosno mobilne faze (dM):
Rf = dA/ dM
Kod hromatografije na ravnim površinama merenje puteva vrši se od središta

zone nanetog uzorka (analizirane smeše), koje se zove startna linija, do središta zone
komponente, odnosno do fronta rastvarača (Slika 2.5). Najveću Rf vrednost imaće
komponenta koja se najbolje rastvara u organskom rastvaraču (mobilnoj fazi), jer se
brže kreće od komponente koja se bolje rastvara u stacionarnoj fazi. Smatra se da su
komponente dobro razdvojene ako je ΔRf > 0,05. Rf vrednost je karakteristična za svaku
komponentu u definisanom hromatografskom sistemu i služi za identifikaciju
komponente u analiziranoj smeši, što nije uvek sigurno s obzirom na veliki broj faktora
koji utiču na ovaj parametar. To je u prvom redu sastav rastvarača, čija i najmanja
promena može da dovede do znatnih razlika u Rf vrednostima, zatim temperatura, koja
utiče na podeone koeficijente i viskozitet mobilne faze, samim tim i na brzinu protoka i
ravnotežu u sistemu. Pored toga na Rf vrednosti utiču i kvalitet hromatografskog papira,
veličina posude u kojoj se razvijanje vrši, kao i priroda analizirane smeše. Za
identifikaciju je najpouzdanije istovremeno hromatografisanje analiziranog uzorka i
standarnog rastvora pod potpuno istim uslovima na jednom hromatografskom papiru.
21
Slika 2.5. Određivanje Rf vrednosti kod uzlazne hromatografije na papiru
2.1.5. Određivanje položaja zona na hromatogramu
Kada se završi razvijanje hromatograma, papir se uklanja iz hromatografske

kade, obeležava front rastvarača i suši. Ako su analizirane supstance obojene onda su
one vidljive i zone se lako mogu obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance
bezbojne (nevidljive), koriste se fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona.
Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne
(supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje
radioktivnosti. Hemijskim metode se sastoje od reakcije supstance sa reagensom koji
daje obojeni proizvod. Na primer, H2S sa metalnim jonima daje obojene sulfide, amino
kiseline daju obojeni kompleks sa ninhidrinom, dok AgNO3 sa redukujućim
supstancama kao što su šećeri daje srebrno ogledalo. U Tabeli 2.4. su prikazani neki
selektivni reagensi koji se u obliku spreja nanose na hromatogram i daju odgovarajuće
obojene proizvode.
Tabela 2.4. Selektivni “sprej” reagensi
Reagens Boja zone Primena

Pare joda Braon Nezasićena organska
jedinjenja
2’, 7’ - Dihlorofluororescein Žuto-zelena ispod UV Veliki broj organskih
svetlosti na 254 nm jedinjenja
0,1 - 0,5 % Bromkrezol zeleno Žuta Karboksilne kiseline
50 % SbCl3 u CH3COOH Različite boje Steroidi, karotenoidi,
aliciklični vitamini
0,3 % Ninhidrin u 1-butanolu sa Roze-ljubičasta Amino kiseline
3% CH3COOH
22
2.1.6. Kvantitativna analiza
Kvantitativna analiza komponenata može se uraditi na dva načina: direktnim

određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom supstance iz zone pogodnim
rastvaračem. Supstance se određuju u izdvojenim zonama direktno na papiru (in situ),
pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere transparenciju,
refleksiju ili fluorescenciju. U tu svrhu se koriste denzitometri i spektrofotometri.
Denzitometri su podešeni tako da direktno “skeniraju” hromatografske trake: svetlosni
zrak prolazi kroz prorez preko površine hartije i u zavisnosti od koncentracije supstabce
dolazi do različitog propuštanja svetlosti što se registruje na detektoru kao kriva koja
odgovara Gausovoj krivoj. Površina ispod krive srazmerna je koncentraciji analizirane
supstance.
Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u
rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom količinom
rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski,
spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom.
2.2. Hromatografija na tankom sloju
Hromatografija na tankom sloju se, zajedno sa hromatografijom na papiru, zove

još hromatografija u “otvorenoj koloni”. Izvodi se na tankom sloju stacionarne faze
kojom je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala (staklo, aluminijum ili polietilen).
Ideju za tankoslojnu hromatografiju dali su ruski naučnici Izmailov i Schreiber 1938.
godine, kada su upotrebili adsorbens u obliku tankog sloja nanetog na inertan nosač.
Bilo je potrebno još dvadesetak godina da ova metoda postane praktična tehnika,
odnosno do opisa metoda, adsorbenasa i opreme za pripremanje hromatografskih ploča
(Stahl, 1951. godine). Danas je hromatografija na tankom sloju veoma zastupljena
metoda za analizu i razdvajanje velikog broja različitih supstanci. Koristi se za
kvalitativne, semikvantitativne i kvantitativne analize u hemijskim i farmaceutskim
laboratorijama, kao i u laboratorijama za analizu hrane i sirovina za pripremanje
prehrambenih proizvoda. Razlozi za široku upotrebu ove tehnike su: kratko vreme
analize, dobro razdvajanje komponenti iz relativno male količine uzorka, kvalitativna i
kvantitativna analiza, niska cena, mogućnost razdvajanja hidrofobnih sipstanci,
mogućnost preparativnog razdvajanja, mogu se koristiti agresivniji reagensi za bojenje
zona (H2SO4) itd.
2.2.1. Stacionarna faza
U tankoslojnoj hromatografiji se koristi veliki broj različitih stacionarnih faza.

Kod klasične hromatografije na tankom sloju stacionarna faza je silika gel i smatra se da
je to adsorpciona hromatografija. Međutim, razdvajanje se ne dešava samo zbog
23
adsorpcije na silika gelu, zbog toga što su uvek u silika gelu prisutne male količine vode
pa imamo i podeonu hromatografiju. Pored toga i rastvarači iz mobilne faze se
adsorbuju na silika gel tokom razvijanja hromatogrma i na taj način imamo još jedan
mehanizam razdvajanja.
Zahvaljujući različitim materijalima koji se koriste za oblaganje ploča mogući su
sledeći mehanizmi razdvajanja:
- Adsorpciona hromatografija, gde se kao adsorbensi koriste: silika-gel, glinica
(Al2O3), kizelgur (dijatomejska zemlja),
- Podeona hromatografija, gde se najčešće koristi celuloza, zatim kizelgur i silika-
gel,
- Jonoizmenjivačka hromatografija, kod koje se koristi derivatizovana celuloza:
celuloza-fosfat, polietilenimin-celuloza, DEAE-celuloza,
- Gel filtracija, gde se koriste umreženi polisaharidi – dekstrani sa različitim
dimenzijama pora, koji su komercijalno dostupni pod imenom “Sephadex”
(SEParation PHArmacia DEXtran).
- Korišćeni su i različiti poliamidi za razdvajanje tanina, kumarina i flavon
glukozida. Tačan mehanizam razdvajanja ovih jedinjenja nije definisan i
pretpostavlja se da do razdvajanja dolazi na osnovu istog, odnosno, različitog broja
hidrofilnih funkcionalnih grupa. Najčešće korišćeni poliamidi su: polikaprolaktam,
acetilovani polikaprolaktam i poliakrilonitril.
2.2.2. Priprema i nanošenje uzorka
Priprema uzorka podrazumeva koncentrovanje supstanci koje su analiziraju i

odvajanje supstanci iz uzorka koje mogu da ometaju analizu. Naročito je važna priprema
uzoraka bioloških materijala kada se u njima analiziraju tragovi nekih supstanci.
Praktično zadatak analitičara je da odstrani najveći broj kompononenti, a da pri tome
nema gubitaka supstanci koje analizira. Cilj je dobiti što čistije analizirane supstance u
koncentraciji koja se može detektovati.
Sledeći postupci se najčešće koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka:

- Taloženje neželjenih komponenti
- Tečno-čvrste ekstrakcije
- Tečno-tečna ekstrakcija
- Ultrafiltracija
- Ekstrakcija jonskom izmenom
- Derivatizacija
- Formiranje kompleksa
- Zamrzavanje - sušenje
- Ekstrakcija na čvrstoj fazi u koloni
24
- Ekstrakcija na specijalizovanim kolonama - kertridžima

- Prekoncentracija
Danas su komercijalno dostupne male kolone (kertridži) ispunjene različitim
adsorbensima koje se koriste za prečišćavanje i koncentrovanje uzoraka za hromatografsku
analizu.
Hromatografija na tankom sloju se može koristiti i za prečišćavanje i
koncentrovanje uzoraka za druge osetljivije hromatografske metode analize. Takođe,
tankoslojna hromatografija se koristi i za preparativno razdvajanje supstanci. Za
preparativne svrhe se koriste ploče sa debljim slojem stacionarne faze (> 250 µm) i
uzorak se nanosi u obliku crte.
Uzorak za hromatografisanje na tankom sloju se rastvori u rastvaraču koji se
može lako upariti i 10-100 µl rastvora nanese na 1,5-2 cm od kraja ploče, tako da
obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm. Količina uzorka koji se nanosi
na ploču zavisi od mogućnosti za detekciju. Pre razvijanja hromatograma neophodno je
osušiti zonu, odnosno upariti rastvarač u kome je rastvoren uzorak.
2.2.3. Mobilna faza
Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan. U
zavisnosti od vrste tankoslojne hromatografije, najčešće se koriste smeše rastvarača
navedene u nastavku teksta.
Adsorpciona hromatografija na tankom sloju:

- heksan/etar
- heksan/etar/sirćetna kiselina
- hloroform/metanol
- toluen/aceton.
Podeona hromatografija na tankom sloju:

- 1-butanol/sirćetna kiselina/voda
- 1-butanol/aceton/dietiamin/voda
- 2-propanol/mravlja kiselina/voda
Jonoizmenjivačka hromatografija na tankom sloju:

- 0,001 – 1 mol/dm3 HCl
- 0,001 – 1 mol/dm3 NaOH
- 0,001 – 1 mol/dm3 NaCl
Reverzno-fazna hromatografija na tankom sloju:

- acetonitril/sirćetna kiselina
- aceton/voda
- hloroform/metanol/voda
25
Tankoslojna hromatografija na poliamidima:

- etanol/voda
- aceton/voda
- voda/etanol/sirćetna kiselina/dimetilformamid
Tankoslojna hromatografija na gelovima od dekstrana (Sephadex):

- 0,01 – 0,1 mol/dm3 sirćetna kiselina
- 0,01 – 0,1 mol/dm3 amonijak
- 0,01 – 0,1 mol/dm3 natrijum-fosfatni pufer
2.2.4. Razvijanje hromatograma
Hromatografija na tankom sloju se može izvesti horizontalnom, silaznom i uzlaznom

tehnikom, slično kao i hromatografija na papiru (Poglavlje 2.1.4.). Za razliku od
hromatografije na papiru gde je najzastupljenija silazna tehnika, kod hromatografije na
tankom sloju najčešće se koristi uzlazna tehnika. Obično su Rf vrednosti od 10 do 15 cm.
Hromatografska ploča se razvija u staklenoj komori (hromatografskoj kadi) koja
je opremljena poklopcem koji dobro zatvara (Slika 2.8, levo). Atmosfera posude mora
biti zasićena parama rastvarača, čime se sprečava njegovo isparavanje sa ploče. Da bi se
dobila ravnomerna zasićenost parom u svim delovima komore, unutrašnji zidovi se
oblažu filter papirom natopljenim rastvaračem, koji služi kao mobilna faza. Širina zone
izdvojene komponente zavisi od širine početne zone uzorka i koncentracije uzorka. Rf
vrednosti se izračunavaju za svaku komponentu posebno i na osnovu njih može se
izvršiti preeliminarna identifikacija jedinjenja poređenjem sa odgovarajućim
standardima (Slika 2.8, desno). Ponekad je poželjno da se koristi komora koja nije
zasićena rastvaračima zbog boljeg razdvajanja. Bolje razdvajanje se postiže zbog dužeg
vremena razvijanja hromatograma i smanjenog efekta adsorbovanog rastvarača na
ploči. Međutim, u ovom slučaju reproduktivnost Rf vrednosti može predstavljati
problem. Tankoslojna hromatografija se obično izvodi na sobnoj temperaturi, međutim,
razdvajanje komponenti se može poboljšati razvijanjem hromatograma na višoj ili nižoj
temperaturi od sobne u zavisnosti od rastvarača koji čine mobilnu fazu.
Da bi se povećala efikasnost razdvajanja komponenti, hromatografska ploča se
može razvijati na više načina:
- više puta u istom pravcu sa istim rastvaračem,

- uz stalnu promenu rastvarača, za razdvajanje jedinjenja koja se znatno razlikuju
po svojim osobinama, odnosno po brzini kretanja kroz stacionarnu fazu,
- sa dva rastvarača u istom ili u dva pravca (dvodimenzionalna hromatografska
tehnika).
26
Tanki sloj
Pare eluenta
Eluent
Uzorak
Slika 2.8. Razvijanje hromatograma i izračunavanje Rf vrednosti
Dvodimenzionalna tehnika je poseban vid tehnike i koristi se kod supstanci sa bliskim

Rf vrednostima. Kad se završi razdvajanje, ploča se okrene za 90° i protok rastvarača,
najčešće nekog drugog, usmeri normalno na pravac kretanja prvog rastvarača (Slika
2.9). Na taj način razdvajaju se komponente koje se nisu prvobitno razdvojile. Da bi
dvodimenzionalno razdvajanje uspelo, potrebno je da prethodni rastvarač potpuno
ispari ili da bude hemijski inertan u odnosu na drugi rastvarač.
Start Front B
Slika 2.9. Dvodimenzionalna tankoslojna hromatografija
2.2.5. Određivanje položaja zona na hromatografskoj ploči
Ako su analizirane supstance obojene onda su one vidljive i zone se lako mogu
obeležiti i izračunati Rf vrednosti. Ukoliko su supstance bezbojne (nevidljive), koriste se
fizičke i hemijske metode za određivanje položaja zona.
Fluorescentne supstance mogu se detektovati pomoću UV lampe, radioaktivne
(supstance obeležene radioaktivnim izotopom) se određuju uređajem za merenje
27
radioktivnosti. Kada se za određivanje položaja zona jedinjenja koja ne fluoresciraju

koristi UV lampa u adsorbens kojim se oblaže ploča se dodaje fluorescentni indikator
(kao što je smeša cink i kadmijum sulfida). Dodavanjem fluorescentnog indikatora se
postiže da cela ploča fluorescira, a zone se detektuju kao tamne mrlje na ploči.
Za bojenje zona koriste se različite hemijske supstance koje se pomoću raspršivača
nanose na ploču. Najčešće korišćeni hemijski reagens je jod. Pare joda reaguju sa
velikim brojem organskih jedinjenja (ne reaguju sa zasićenim ugljovodonicima i
halogenalkanima) i grade komplekse od žute do braon boje. Zone moraju biti odmah
označene, jer jod posle nekog vremena sublimuje i mrlje blede i mogu se izgubiti. Često
se koristi i koncentrovana sumporna kiselina koja većinu organskih supstanci oksiduje i
nakon zagrevanja ploče zone se detektuju kao tamne mrlje. Za određivanje
aminokiselina i amina koristi se ninhidrin. Za određivanje steroida i karotenoida se
koristi rastvor antimon-hlorida. Indikator bromkrezol zeleno se koristi za detekciju
zona koje potiču od karboksilnih kiselina. Za fenole se koristi rastvor gvožđe(III)-
hlorida, 2,4-dinitrofenilhidrazin se koristi za detekciju aldehida i ketona itd.
2.2.6. Kvantitativna analiza
Kao i kod hromatografije na papiru, kvantitativna analiza komponenata može se

uraditi na dva načina: direktnim određivanjem količine supstance u zoni ili ekstrakcijom
supstance iz zone pogodnim rastvaračem. Supstance se određuju direktno u izdvojenim
zonama na ploči pomoću instrumenata koji mogu da budu tako adaptirani da mere
transparenciju, refleksiju ili fluorescenciju. Treba napomenuti da merenje
propustljivosti može da se koristi samo za vidljivu svetlost, za merenje UV moraju da se
koriste kvarcne ploče, jer staklene ploče apsorbuju UV zrake.
Drugi način se odnosi na hemijsko i fizičkohemijsko određivanje količine supstance u
rastvoru dobijenog ekstrakta. Supstancu je poželjno ekstrahovati sa što manjom
količinom rastvarača. Količina supstance u ekstraktu se određuje kolorimetrijski,
spektrofotometrijski ili nekom drugom tehnikom.
2.2.7. Osnovne karakteristike hromatografije na tankom sloju
- Tankoslojna hromatografija predstavlja ravnotežni sistem tri faze: čvrste

(stacionarne), tečne (mobilne) i gasne faze.
- Stacionarna faza je samo delimično u ravnoteži sa tečnom fazom pre migracije
komponenti analizirane smeše. U zavisnosti od načina razvijanja hromatograma,
mobilna faza može biti u ravnoteži sa gasnom fazom ili ne.
- Fenomen adsorpcije na čvrstoj fazi je znatno smanjen jer je deo mobilne faze
adsorbovan na stacionarnoj fazi. Kao rezultat toga Rf vrednost čistog jedinjenja se
neznatno razlikuje od Rf vrednosti istog jedinjenja u smeši.
28
2.2.8. Primena tankoslojne hromatografije u analizi hrane
U zavisnosti od prirode supstanci koje se razdvajaju koriste se različite mobilne

faze, odnosno stacionarne faze. Tako na primer za razdvajanje amino kiselina se koriste
«neutralne mobilne faze» kao što su etanol/voda, propanol/voda ili fenol voda,
međutim u takvim mobilnim fazama arginin i lizin migriraju znatno sporije od ostalih
amino kiselina. Ako su u mobilnu fazu doda slaba baza (amonijum-hidroksid) ili slaba
kiselina (sirćetna kiselina) bolje se razdvajaju kisele odnosno bazne amino kiseline.
Dalje, neki vodorastvorni vitamini se bolje razdvajaju na aluminijum oksidu, a ne
razdvajaju se na silika gelu, na primer vitamini B1 i B2. Praktično za analizu svake
smeše treba odabrati odgovarajuću mobilnu, odnosno stacionarnu fazu u zavisnosti od
prirode supstanci koje se analiziraju.
U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu hromatografije na
tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu se analizirati
prirodne komponente hrane, degradacioni proizvodi koji postaju tokom prerade,
pripreme, skladištenja, pakovanja i transporta hrane. Zatim, mogu se analizirati aditivi,
tragovi veterinarskih lekova, pesticida itd. Na primer u medu su određivani
antibakterijski sastojci, ugljovodonici, polifenoli itd. U raži su određivane karboksilne
kiseline i estri hidroksicimetne kiseline u listovima raži. U bademu je određivana
hlorogena kiselina, a njeni derivati u bambusu. U voćnim sokovima su određivani
ekstrakti iz kore citrusa. U različitim prehrambenim proizvodima su određivana etarska ulja.
U bezalkoholnim pićima određivani su ne nutritivni zaslađivači. Fenoli su određivani u
čaju, bosiljku, maslinovom ulju. U prehrambenim aditivima određivani su fitosteroli,
polifenoli itd. U sojinom ulju, ulju od sezama određivani su triacil gliceridi. U životinjskim
tkivima (jetri i mišićima) određuju se sulfonamidi. Tankoslojna hromatografija je brza i
jeftina metoda za utvrđivanje aflatoksina i drugih mikotoksina u mleku, mlečnim
proizvodima, kukuruzu, kikirikiju i proizvodima od kikirikija, kokosu, kakau u zrnu,
jajima itd. Ovo su samo neki od mnogobrojnih primera korišćenja tankoslojne
hromatografije u analizi prehrambenih proizvoda. Takođe, preparativna tankoslojna
hromatografija se koristi za prečišćavanje uzoraka koji se dalje analiziraju i određuju
drugim metodama, najčešće instrumentalnim.
Rezime poglavlja
Hromatografija na papiru je najednostavniji tip hromatografije. Papir koji se

koristi u hromatografiji se smatra nosačem stacionarne faze, a stacionarna faza je voda
adsorbovana na molekulima celuloze. Količina uzorka za analizu koja se nanosi zavisi od
mogućnosti njegove detekcije. Obično se nanosi oko 10 μl rastvora uzorka (0,1 do 1 %) u
obliku kružne mrlje koja sadrži od 1 – 1000 µg uzorka. Mobilna faza je rastvarač ili smeša
rastvarača zasićena vodom. Hromatogram se razvija u hromatografskoj kadi. U zavisnosti
29
od načina prolaska mobilne faze kroz hartiju, razlikuju se: horizontalna (kružna), silazna i
uzlazna hromatografija na papiru. Hromatogram se izaziva prskanjem hartije nekim
reagensom koji daje obojeno jedinjenja ili jedinjenje koje fluorescira u reakciji sa analitom.
Hromatografija na tankom sloju izvodi se na tankom sloju stacionarne faze kojom
je obložena ravna ploča od nekog inertnog materijala. Uzorak za hromatografisanje se
rastvori u rastvaraču koji se može lako upariti a zatim se 10-100 µl rastvora nanese na
1,5-2 cm od kraja ploče, tako da obrazuje vlažnu zonu kružnog oblika, prečnika 2-5 mm.
Izbor mobilne faze zavisi od stacionarne faze i uzorka koji će biti hromatografisan.
Najčešće se mobilna faza sastoji od dva ili više rastvarača. Hromatogram se razvija u
hromatografskoj kadi na više načina i mogu se dobiti jedno- i dvodimenzionalni
hromatogrami. U literaturi je opisan veliki broj primera koji se odnose na primenu
hromatografije na tankom sloju za analizu hrane. Tankoslojnom hromatografijom mogu
se analizirati prirodne komponente hrane, aditivi, tragovi veterinarskih lekova, pesticida,
itd.
1. Od čega zavisi brzina protoka mobilne faze u planarnoj hromatografiji i kako se

može menjati?
2. Šta je stacionarna faza kod hromatografije na papiru? Navesti koje vrste
međumolekulskih interakcija postoje između stacionarne faze, mobilne faze i
analiziranih jedinjenja.
3. Kada i zašto se radi derivatizacija uzorka pre hromatografisanja? Šta se postiže
derivatizacijom? Navesti bar tri reagensa za derivatizaciju.
4. Definisati Rf vrednost.
Literatura


3. C. F. Poole, The Essence of Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 2003.
4. S. Ahuja, Chromatography and Separation Science, Academic Press, Elsevier Science,

San Diego, 2003.
5. E. Heftmann (Ed.), Chromatography 6th edition, Fundamentals and Applications of

Chromatography and Related Differential Migration Methods. Part A:
Fundamentals and Techniques, Journal of Chromatography Library – Volume 69A,
Elsevier, Amsterdam, 2004.
30
3. Adsorpciona hromatografija u koloni
Cilj poglavlja
Upoznavanje sa tečno-čvrstom adsorpcionom hromatografijom. Definisanje fizičke

i hemijske adsorpcije. Karakterizacija adsorbenasa. Opis tehnike rada i mogućnosti
razdvajanja.
Tečno - čvrsta adsorpciona hromatografija podrazumeva kolonu pakovanu nekim

adsorbentom – stacionarna faza, a naneti uzorak se eluira sa nepolarnim rastvaračem –mobilna
faza, koji pod dejstvom sile gravitacije teče kroz kolonu. Razdvajanje komponenata iz smeše
adsorpcionom hromatografijom vrši se na osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito
adsorbuje komponente smeše. Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstance – adsorbensi –
koje su porozne i imaju veliku aktivnu površinu, a samim tim i površinsku energiju koju teže
da smanje, tako što privlačnim silama vezuju molekule ili jone iz gasova ili tečnih rastvora.
Pri adsorpciji komponenata iz smeše razlikuju se fizička i hemijska adsorpcija. Fizička
adsorpcija se zasniva na uspostavljanju elektrostatičkih (dipol-dipol, Van der Waalsovih) i
vodoničnih veza izmeĎu stacionarne faze i komponenti, a pri hemijskoj adsorpciji dolazi do
stvaranja hemijskih veza usled čega se na površini adsorbensa obrazuje monomolekulski sloj
adsorbovane supstance.
Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini izmeĎu dve faze menja
koncentracija date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju
izmeĎu čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju
uz čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Adsorpcija na čvrstim površinama je složen
proces, jer zavisi od mnogo faktora kao što su heterogena priroda čvrste supstance koja se
menja od aktivnih do manje aktivnih površina, orijentacija adsorbovanih molekula na čvrstoj
površini, konkurencija izmeĎu molekula rastvarača i supstance za vezivanje za aktivne centre
na površini čvrstih čestica itd.
3.1. Stacionarna faza
Čvrsta supstanca (adsorbens), koja predstavlja stacionarnu fazu, kod ove vrste
hromatografije, je supstanca koja ima osobinu da na svojoj površini adsorbuje rastvoreni
uzorak. Koncentracija adsorbovane supstance na površini adsorbensa je u ravnoteži sa
koncentrcijom supstance koja se nalazi u rastvaraču – mobilnoj fazi.
31
Adsorpciona hromatografija u koloni
Strukturu adsorbensa sačinjava konglomerat mikro – čestica uglavnom sferičnog oblika.

Osnovne fizičke karakteristike adsorbensa su specifična površina i zapremina pora.
Specifična površina adsorbensa je funkcija veličine čestica, odnosno njihovog prečnika. Pore
se stvaraju izmeĎu dodirnih tačaka čestica ili dodirnih ivica i površina pojedinih sastavnih jedinica
adsorbensa. Zbog toga pore mogu biti različitog oblika ali najčešće preovlaĎuju pore jednog
oblika. Adsorbensi nemaju pore istog prečnika, kod svakog adsorbensa postoji distribucija
prečnika pora u obliku Gausove krive. Struktura i zapremina pora utiču na brzinu uspostavljanja
adsorpcione ravnoteže izmeĎu koncentracije supstance u stacionarnoj i mobilnoj fazi.
Adsorbens treba da sadrži što je moguće manje pora malog prečnika, s obzirom da molekuli
supstance teže difunduju u njih.
Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri na kojima dolazi do adsorpcije i
potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih centara. Drugim rečima, adsorpcione
sile zavise od hemijskih osobina adsorbensa, kao i od osobina supstanci koje se adsorbuju, i
one predstavljaju površinski afinitet koji izražava adsorpcioni potencijal jednog sistema.
Površinski afinitet se u velikoj meri gubi kada je adsorbent pokriven monomolekulskim
slojem adsorbovane supstance. Kada rastvor teče preko površine adsorbensa postiže se
ravnoteža izmeĎu adsorpcije i desorpcije prisutnih supstanci. Komponente smeše se
selektivno adsorbuju na adsorbensu. Jednu komponentu adsorbens više adsorbuje (onu koja
ima veći koeficijent raspodele), a drugu manje (onu koja ima manji koeficijent raspodele).
Ako je u pitanju adsorpciona hromatografija na koloni, komponenta koju adorbens više
adsorbuje nalaziće se pri vrhu kolone, dok će se komponenta za koju adsorbens ima manju
moć adsorpcije spustiti dublje u kolonu. Ako se vrednosti koeficijenata raspodele ispitivanih
komponenata dovoljno razlikuju, može se postići njihovo potpuno razdvajanje i pri procesu
eluiranja iz kolone prvo izlazi komponenta koja se slabije vezuje za adsorbens.
3.1.1. Adsorbensi
Dobar adsorbent treba da ima veliku površinu sa velikim brojem aktivnih centara. Kao što
je već rečeno, adsorpciona moć materijala zavisi od raspoložive površine, hemijske prirode
površine i od prethodne pripreme adsorbensa. Najčešće upotrebljavani adsorbensi su
aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe, i silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih,
upotrebljavaju se još i aktivni ugalj, poli(stiren-divinilbenzen) kopolimer, skrob, celuloza, kalcijum-
karbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijum-fosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijum-
silikat i drugi.
3.1.1.1. Silika-gel
Silikagel (SiO2 x nH2O) je jedan od najčešće upotrebljavanih adsorbenasa u hromatografiji.

Osnovnu strukturu ovog adsorbensa čine tetraedri silicijuma i kiseonika čiji polimeri obrazuju
poroznu strukturu karakterističnu za njegovu unutrašnju površinu. Specifična površina iznosi
32
oko 800 m2/g. Za adsorpciju su od značaja hidroksilne grupe vezane za silicijum koji gradi
adsorpcionu površinu. Adsorpcija se najčešće ostvaruje preko vodonične veze izmeĎu atoma
vodonika iz silika-gela i atoma kiseonika (ili nekog drugog elektronegativnog elementa) iz
uzorka (Slika 3.1).
Tok mobilne faze
Komponenta A
Površina silika-gela
Slika 3.1. Adsorpcija na silika-gelu
3.1.1.2. Aluminijum-oksid
Specifična površina aluminijum-oksida iznosi oko 200 m2/g. Površina adsorbensa se

sastoji od kiseonikovih jona u gornjem sloju i katjona Al3+ u donjem sloju. Pod normalnim
uslovima voda ne stvara hidroksilne grupe na površini adsorbensa ali je prisutna u stanju
hemisorpcije. Povećanjem temperature dolazi do delimične desorpcije vode a delimično do
obrazovanja hidroksilnih grupa na površini adsorbensa.
Joni kiseonika i aluminijuma na površini obrazuju jako elektrostatičko polje koje
stvara tri tipa aktivnih centara. Aktivni centri kiselog karaktera stvaraju jako pozitivno polje,
centri baznog tipa imaju karakter akceptora protona, dok se treća grupa sastoji od centara
akceptora elektrona. Elektrostatičko polje na površini aluminijum-oksida prouzrokuje
osnovni mehanizam adsorpcije – indukciju površinskog sloja. Aktivitet adsorbensa povećava
se sa povećanjem temperature aktiviranja.
3.1.1.3. Aktivni ugalj
Aktivni ugalj spada u grupu nepolarnih adsorbenata, njegova površina sastoji se

uglavnom od ugljenika i do adsorpcije dolazi zahvaljujući disperzionim silama. Iako je osnovna
komponenta ugljenik, aktivni ugalj je delimično polarni adsorbens jer se na površini mogu
naći oksidi, karbonilne i hidroksilne grupe. Unutrašnja površina aktivnog uglja je izrazito
diferencirana sa neravnomernim rasporedom prečnika pora i iznosi od 300-1000 m2/g.
33
3.1.1.4. Magnezijum-oksid
Magnezijum-oksid je adsorbent koji je visoko selektivan za dvostruke veze ugljenik-

ugljenik. Pokazuje slabo alkalne osobine i sličan je aluminijum-oksidu. Sa povećanjem
temperature od 100 – 500 °C povećava se adsorpcioni aktivitet, zatim sa daljim povećanjem
temperature opada i najzad nestaje na temperaturi od 1000 °C.
3.2. Mobilna faza
Izbor rastvarača za mobilnu fazu je podjednako važan kao i izbor stacionarne faze.
Tečna mobilna faza sastoji se od jednog ili više rastvarača i ona je, sa jedne strane, “nosač”
uzorka kroz adsorbens, a sa druge strane, jedna od dve faze izmeĎu kojih dolazi do raspodele
komponenti uzorka na osnovu koeficijenata raspodele. Dodatno, osim relativne rastvorljivosti
komponenti u eluirajućem rastvaraču, treba voditi računa i o konkurenciji izmeĎu rastvorene
supstance i rastvarača za adsorpciju na aktivnim centrima na površini stacionarne faze.
Rastvarači koji brzo eluiraju supstance sa adsorbensa neće dobro razdvojiti komponente, sa
druge strane, ako je eluiranje isuviše sporo, dolazi do širenja zona i nepotrebnog
razblaživanja uzorka.
Rastvarač ili smeša rastvarača za eluiranje se bira na osnovu osobina komponenti
smeše uzorka koji se analizira i osobina stacionarne faze. Mobilna faza treba da rastvara
analizirane supstance, kao i da interaguje sa stacionarnom fazom. Ne postoje opšta pravila za
izbor mobilne i stacionarne faze, već se na osnovu osobina uzoraka koji se analiziraju biraju
odgovarajući adsorbens i rastvarač. Najčešće se kao mobilna faza koriste sledeći rastvarači:
petrol-etar, ugljen-tetrahlorid, izopropil-etar, toluen, hloroform, dietil-etar, metil-etil keton,
aceton, etil-acetat, dioksan, acetonitril, etanol, metanol, voda. Rastvarači su poreĎani po
jačini interakcije sa polarnim stacionarnim fazama (aluminijum-oksid i silika gel).
3.3. Tehnika rada
Za adsorpcionu hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih

dimenzija. U zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom
adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom. Najčešće se
puni suspenzijom adsorbensa jer se na taj način omogućava efikasno izdvajanje gasova iz
adsorbensa. Osnovno je da kolona bude ravnomerno napunjena, bez mehurica vazduha ili
kanala kroz koje može da neefikasno prolazi velika količina mobilne faze.
Za unošenje uzorka koriste se tri metode: nanošenje uzorka na vrh sloja adsorbensa,
ispod mobilne faze i unošenje uzorka u sloj adsorbensa. Kod prve metode, rastvor uzorka se
pažljivo sipa na vrh kolone, posle čega se dodaje mala količina mobilne faze koja prodire
kroz sloj adsorbensa zajedno sa uzorkom. Drugom metodom uzorak se unosi u mobilnu fazu
iznad površine adsorbensa, ova metoda primenjuje se ako se površina adsorbensa može lako
34
poremetiti. Kod punjenja kolona suvim adsorbensom, uzorak se stavlja na vrh kolone napunjene
suvim adsorbensom a zatim se prekriva drugim slojem adsorbensa.
Uzorak se sa kolone može eluirati na više načina: običnim eluiranjem, postepenim ili
frakcionim eluiranjem i gradijentnim eluiranjem.
Obično eluiranje je kontinuirano propuštanje mobilne faze kroz kolonu čime se postiže
razdvajanje komponenata. Razdvajanje komponenata neke smeše postupkom eluiranja
prikazano je na Slici 3.2. Kada se razdvajanje komponenata u adsorpcionoj koloni završi,
njihove zone se mogu odvojiti jedna od druge rezanjem delova kolone koja je prethodno
pažljivo izvaĎena iz cevi. Nakon ovoga komponente se mogu ekstrahovati iz adsorbensa
pogodnim rastvaračem, a zatim analizirati pogodnim fizičkohemijskim metodama kvalitativne i
kvantitativne analize. Još jednostavniji način njihovog razdvajanja je da se eluiranje nastavi
do izlaska svih komponenata iz kolone, a sve pojedinačne frakcije istih zapremina se
sakupljaju pomoću tzv, frakcionog kolektora i posle toga analiziraju. Postepeno ili frakciono
eluiranje podrazumeva korišćenje više rastvarača različitih polarnosti kao eluenata. Eluiranje
počinje sa rastvaračem najmanje polarnosti, a završava sa rastvaračem najveće polarnosti od
upotrebljenih rastvarača.
Slika 3.2. Razdvajanje komponenata smeše postupkom eluiranja
Gradijentno eluiranje se sastoji u kontinuiranoj promeni sastava mobilne faze što

dovodi do promene polarnosti, jonske sile ili pH. Na primer, ako se kao polazni rastvarač za
odvajanje na koloni upotrebi etanol, a potrebno je eluirati polarnu supstancu koja se bolje
rastvara u vodi (voda je jače eluciono sredstvo), onda je potrebno etanolu dodavati vodu pri
čemu se eluciona moć mobilne faze povećava. Kao posledica ovog postepenog povećavanja
elucione moći rastvarača dolazi do uzastopnog eluiranja jače adsorbovanih supstanci.
35
Rezime poglavlja
Razdvajanje komponenata iz smeše adsorpcionom hromatografijom vrši se na

osnovu sposobnosti stacionarne faze da različito adsorbuje prisutna jedinjenja u smeši.
Adsorpcija je pojava pri kojoj se na graničnoj površini između dve faze menja koncentracija
date komponente. Kod adsorpcione hromatografije, gde se komponente raspodeljuju između
čvrste i tečne faze, koncentracija rastvorene komponente biće veća u graničnom sloju uz
čvrstu fazu, nego u unutrašnjosti rastvora. Na površini adsorbensa nalaze se aktivni centri
na kojima dolazi do adsorpcije i potencijal adsorpcije zavisi od hemijskog karaktera ovih
centara. Komponente smeše se selektivno adsorbuju na adsorbensu.
Najčešće upotrebljavani adsorbensi su aluminijum-oksid, koji sadrži bazne grupe i
silika-gel, koji sadrži kisele grupe. Osim njih, koriste se još i aktivni ugalj, polistiren-
divinilbenzen kopolimer, skrob, celuloza, kalcijum-karbonat, kalcijum-hidroksid, kalcijum-
fosfat, magnezijum-oksid, magnezijum-silikat, aluminijum-silikat i drugi. Za adsorpcionu
hromatografiju u koloni najčešće se koriste staklene kolone različitih dimenzija. U
zavisnosti od tipa adsorbensa kolona se puni na jedan od tri načina: suspenzijom
adsorbensa, adsorbensom koji je navlažen rastvaračem i suvim adsorbensom.
1. Objasniti razdvajanje supstanci iz smeše adsorpcionom hromatografijom.

2. Od čega zavisi adsorpcija na čvrstim površinama?
3. Koje su osnovne fizičke karakteristike adsorbensa?
4. Od čega zavise adsorpcione sile i šta one predstavljaju?
5. Nabrojati tehnike za punjenje kolone, nanošenje uzorka i eluiranje.
Literatura


3. J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier,

Amsterdam, 1997.

5. J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley &
Sons, Inc., New Jersey, 2005.
36
4. Gasna hromatografija
Cilj poglavlja
Upoznavanje sa osnovnim principima gasne hromatografije, komponentama

gasnog hromatografa, kvalitativnom i kvantitativnom gasnohromatografskom analizom.
Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda.
4.1. Uvod
U gasnoj hromatografiji mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta ili tečna.
Stacionarne faze koje su hemijski vezane za zid kolone se takođe često koriste. Kada se
tečna faza koristi kao stacionarna faza ili kada čvrsta faza kojom je obložena
unutrašnjost kolone postane tečna na radnoj temperaturi, tada se tehnika zove gasno-
tečna hromatografija (engl. Gas-Liquid Chromatography). Ako je stacionarna faza
čvrsta, ova tehnika se zove gasno–čvrsta hromatografija (engl. Gas-Solid
Chromatography). Obe ove tehnike se često jednostavno nazivaju gasna hromatografija,
GC (engl. Gas Chromatography).
Gasna hromatografija je prvi put primenjena 1952. godine, i opisana u radovima
James-a i Martin-a. Tehnika je bila zasnovana na studiji koju su objavili 11 godina ranije
Martin i Synge i koja se odnosi na particionu hromatografiju, za koju oni su oni dobili
Nobelovu nagradu za hemiju 1952. godine. Kao što je ranije pomenuto, stacionarna faza
može da bude čvrsta supstanca ili tečnost imobilisana na čvrstoj supstanci. Razdvajanje
u gasnoj hromatografiji se zasniva na relativnim pritiscima para komponenti uzorka i
njihovom afinitetu za stacionarnu fazu. Praktično, osnova gasnohromatografskog
razdvajanja je distribucija analita između dve faze. Jedna od ovih faza je stacionarna
faza, a druga faza inertni gas koji zajedno sa parama uzorka čini mobilnu fazu koja se
. Prvi gasni hromatograf
konstruisan je krajem 1954. godine u kompaniji Griffin and George (London, UK). Na
Slici 4.1 prikazan je jedan od najstarijih gasnih hromatografa, koji je izložen u Muzeju
hemije na Univerzitetu Sapienza u Rimu, Italija. Na Slici 4.2 prikazan je moderni gasni
hromatograf sa automatskim unošenjem uzorka (engl. autosampler).
Osetljivost, brzina, tačnost i jednostavnost primene metode gasne hromatografije
za separaciju, identifikaciju i kvantifikaciju isparljivih jedinjenja, doveli su do izuzetno
brzog razvoja ove tehnike. Danas je gasna hromatografija verovatno najrasprostranjenija
37
Gasna hromatografija
instrumentalna tehnika na svetu. Godišnji rast proizvodnje gasnih hromatografa je

iznad prosečnog rasta proizvodnje svih ostalih analitičkih instrumenata.
Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih derivata,
pesticida i ostataka pesticida, farmaceutskih proizvoda, u ,
kliničkoj hemiji i brojnim drugim oblastima.
Slika 4.2. Moderni gasni hromatograf sa

Slika 4.1. Gasni hromatograf izložen u autosemplerom
Muzeju hemije na Univerzitetu Sapienza u
Rimu, Italija
Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su:

- Visoka rezolucija - na kapilarnoj koloni dužine 50 m može se lako generisati 100.000
teorijskih podova i time razdvojiti složene smeše bolje nego bilo kojim drugim, danas
dostupnim, tehnikama razdvajanja.
- Brzina - najveći broj gasno-hromatografskih analiza može se završiti u vremenu od 1

do 30 minuta. Neke jednostavnije analize mogu se završiti i za nekoliko desetina sekundi.
- Osetljivost - korišćenjem plameno jonizujućeg detektora, moguće je merenje milionitih

delova (ppm) skoro svih isparljivih organskih jedinjenja. Kada se koristite selektivni
detektori kao što su detektori sa zahvatom elektrona i azot-fosforni detektori mogu se
rutinski meriti i milijarditi delovi (ppb).
- Preciznost i tačnost - g
kvantitativnu analizu precizno pod različitim uslovima. Automatizacija i računarska
kontrola svih kritičnih hromatografskih parametara je proizvela nivo preciznosti i
tačnosti koji je bio nezamisliv pre samo desetak godina.
38
4.2. Definicije i termini koji se koriste u gasnoj hromatografiji
U literaturi koja se bavi gasnom hromatografijom koristi se veliki broj definicija,

termina i simbola koji su, najčešće, kombinacija onih koji se koriste široko i rutinski i
onih koje preporučuje Međunarodna unija za čistu i primenjenu hemiju - IUPAC.
Koeficijent raspodele ili podeoni koeficijent (K) predstavlja odnos koncentracija uzorka
u stacionarnoj (CS) i mobilnoj fazi (CM):
K = CS / CM
Retenciona zapremina (VR) se definiše na sledeći način:
VR = tR x Fc = VM + K x VS
gde je:
tR – retenciono vreme
Fc – protok nosećeg gasa na izlasku iz kolone
VM – zapremina mobilne faze
VS – zapremina stacionarne faze
K – koeficijent raspodele.
Zapremina mobilne faze ili mrtva zapremina (VM) izražava se kao:
VM = tM x Fc
Korigovana retenciona zapremina (V’R):
V’R = VR - VM = tR x Fc – tM x Fc = (tR – tM) x Fc =t’R x Fc =K x VS
gde je t’R – korigovano retenciono vreme
Faktor kapaciteta kolone (k’) je mera sposobnosti kolone da zadrži uzorak:
k’ = (tR – tM) / tM = t’R / tM
Retencioni odnos (R):

R = tM / t’R
Normalna distribucija pretpostavlja da će pikovi u hromatogramima biti simetrični i u

obliku krive jednačine Gausove raspodele:
y = yM exp [- (t – tR)2 / (2F2)]
39
Signal y zavisi od retencionog vremena i ima maksimalnu vrednost (yM) kada je t = tR.
Standardna devijacija Gausove krive je opisana kvadratom F. Ova dva parametra se
koriste da se opiše hromatografska širina pika. Za normalnu raspodelu, širina bazne
linije, W, ima vrednost 4F, širina na 60,7 % od visine pika je 2F, a širina na polovini
visine pika, koja se često izražava kao W1/2, je 2,354 F.
Asimetrija pika. Postoje mnogi faktori koji mogu da dovedu do asimetrije pika. U
velikom broju slučajeva, pikovi snimljeni sa gasnim hromatografom nemaju oblik
Gausova krive. Korišćeno je nekoliko načina za opisivanje
(As) koji se d
:
As = BC / AB
gde su AB i BC dva segmenta mereni na 10 % od maksimalne visine, kao što je
prikazano na slici X. Za simetrični pik, vrednosti As je 1.
1, respektivno (Slika 4.3).
Slika 4.3. Asimetričan hromatografski pik
Relativno zadržavanje ili selektivnost kolone, α, se definiše kao odnos korigovanih

retencionih vremena ili zapremina dve komponente pod identičnim uslovima.
α = t’R1 / t’R2 = V’R2 / V’R1 = k’2 /k’1
Kao što je definisano prethodnom 1, što znači da

se jedinjenje 2 zadržava duže na koloni od jedinjenja 1. Na vrednost α utiče priroda
stacionarne faze i temperatura. Za datu kolonu, α je funkcija temperature.
40
Rezolucija :
R1,2 = 2 (t’R2 – t’R1) / (W1 + W2) = 2d / (W1 + W2)
gde je d rastojanje između maksimuma dva pika a W je širina svakog pika na osnovi.
Velika vrednost R1,2, ukazuje na bolje razdvajanje pikova. Za potpuno odvajanje
potrebno je da vrednost rezolucije iznosi više od 1,5. Kada se rezolucija smanjuje ispod
1, interferencija između dva pika postaje jača, a “dolina” između dva pika čak nestaje na
R = 0,5.
Retencioni indeks. Postoje dve vrste retencionih indeksa, odnosno izotermni retencioni
indeks i indeks linearno programirane temperature. Oba indeksa izražavaju karakteristike
zadržavanja hemijskog jedinjenja analiziranog na gasnom hromatografu u odnosu na
zadržavanje homologne serije normalnih alifatičnih ugljovodonika analiziranih pod
istim uslovima. Kod oba sistema retencionih indeksa, analizirano hemijsko jedinjenje je
između dva uzastopna alifatična ugljovodonika čije vrednosti retencionih indeksa
odgovaraju broju atoma ugljenika u molekulu ugljovodonika pomnoženim sa 100.
Izotermni retencioni indeks (RII) je definisan kao logaritamska interpolacija između dva
uzastopna alifatična ugljovodonika eluirana neposredno pre i neposredno posle
jedinjenja A pod izotermskim gasno-hromatografskim uslovima, i izračunava se za
jedinjenje A na sledeći način:
RII = 100 x (logV’A – logV’Z) / (logV’Z+1 – logV’Z) + 100 x Z

gde je:
V’A – korigovana retenciona zapremina jedinjenja A
V’Z – korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z eluiranog neposredno pre jedinjenja A
V’Z+1 – korigovana retenciona zapremina ugljovodonika Z + 1 eluiranog neposredno posle jedinjenja A
Z – broj ugljenikovih atoma u ugljovodoniku Z
Eksperimentalno se izotermni retencioni indeks (RII) određuje na osnovu sledeće

jednačine:
RII = 100 x [log(tA – tCH4) - log(tZ – tCH4)] / [log(tZ+1 – tCH4) - log(tZ – tCH4)] + 100 x Z
gde su tA, tZ i tZ+1 retenciona vremena jedinjenja A, ugljovodonika Z i Z+1, respektivno.
Retencioni indeks linearno programirane temperature se određuje jednačinom:
RIP = 100 x (tA – tZ) / (tZ+1 – tZ) + 100 x Z
Retencioni indeksi se koriste za identifikaciju analiziranih jedinjenja.
41
4.3. Teorija o gasnoj hromatografiji
Koncept teorijskih podova (ili platoa) je odigrao veliku ulogu u razvoju

hromatografije. On je prvobitno predložen za merenje performansi procesa destilacije.
Koncept se zasniva na pretpostavci da je kolona podeljena u više zona koje se nazivaju
teorijski podovi, koji su tretirani kao da postoji savršena ravnoteža između gasa i tečne
faze u okviru svakog poda. Ova pretpostavka podrazumeva da koeficijent distribucije
ostaje isti od jednog poda na drugi pod i ne zavisi od drugih komponenti uzorka, i da je
izoterma distribucije linearna. Međutim, eksperimentalni dokazi pokazuju da to nije
tačno. Koncept teorijskih podova zanemaruje da je hromatografija dinamičan proces
transfera mase. U principu, nakon injektovanja uzorka, on ulazi u kolonu kao uska zona
molekula. Na koloni se zona širi usled interakcija komponenti sa stacionarnom fazom
koja neke komponente zadržava više od drugih. Konstantno kretanje mobilne faze
obezbeđuje brže razmene molekula analita između mobilne i stacionarne faze i tako
smanjuje mogućnost uspostavljanja ravnotežnih koncentracija analita između dve faze.
Kao posledica toga, u prednjem delu zone u kojoj je para, preovlađuje prelazak molekula
u tečnu fazu, a u zadnjem delu dolazi do suprotnog procesa – desorpcije. Na taj način,
jedinjenje se pomera kroz kolonu brzinom koja najviše zavisi od njegove rastvorljivosti
u tečnoj fazi. Slabije rastvorna jedinjenja provode kraće vreme u koloni od bolje
rastvornih jedinjenja.
Postoje tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u
koloni: uspostavljanje ravnoteže, longitudialna difuzija i vrtložna difuzija. Širenje
hromatografske zone usled sporog uspostavljanja ravnoteže prilikom prelaska molekula
iz jedne u drugu fazu, pre svega, zavisi od brzine mobilne faze. Brzina kretanja mobilne
faze utiče na brzinu kojom molekuli analita mogu da pređu dodirnu površinu faza, a ta
brzina zavisi i od kinetike sorpcije, odnosno desorpcije. Zadržavanje supstance u
stacionarnoj fazi ne zavisi samo od brzine mobilne faze već i od vremena koje je
potrebno da jedan srednji molekul difunduje na površinu mobilne faze iz bilo koje tačke
stacionarne faze. Longitudialna difuzija predstavlja difuziju rastvorene supstance u
stacionarnu fazu, što takođe dovodi do širenja zone. Longitudialna difuzija je obrnuto
proporcionalna brzini protoka mobilne faze. Do vrtložne difuzije dolazi u mobilnoj fazi i
ona je posledica različitih dužina puteva kojima molekul može da prođe kroz kolonu. U
jednoj hromatografskoj koloni postoji bezbroj puteva kojima molekul može da prođe i
oni nisu svi jednake dužine. Zbog toga je nekim molekulima potrebno duže, a nekim
kraće vreme da dođu do kraja kolone pa se hromatografska zona širi.
Van Demter (van Deemter) je polazeći od ovih faktora izveo kinetičku jednačinu
za gasnu hromatografiju:
h = A + B/μ +C x μ
42
gde je:
h – dužina kolone podeljena brojem teorijskih podova.
A – konstanta koja zavisi od vrtložne difuzije (vrtložna difuzija zavisi od: veličine i oblika čestica
čvrste faze, načina pakovanja kolone i prečnika kolone).
B – konstanta koja zavisi od difuzije u nosećem gasu.
C – konstanta koja je merilo otpora prenosu mase u tečnoj fazi i najviše zavisi od debljine tečnog
filma i njegovog viskoziteta.
μ – linearna brzina kretanja gasa (protok).
Grafički prikaz van Demterove kinetičke jednačine dat je na Slici 4.4.
Molekulska
difuzija
Otpor prenosu mase
Vrtložna difuzija
Slika 4.4. Grafički prikaz van Demterove (van Deemter) kinetičke jednačine
4.4. Gasni hromatograf
Osnovne komponente većine gasnih hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom,

regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona,
termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač. Na Slici 4.5 su prikazane
osnovne komponente gasnog hromatografa.
PEĆ
KOLONA
KONTROLA INJEKTOR DETEKTOR OBRADA
PROTOKA PODATAKA
ELUENTI
Slika 4.5. Šema gasnog hromatografa
43
4.4.1. Noseći gas
Cilindar p i gas se koristi kao izvor nosećeg

gasa. Teorijski
i gas. Međutim, neka ograničenja moraju biti postavljena kod izbor
. Prvo, i gas mora biti inertan, ne treba da reaguje sa analitima i sa
bilo kojim komponentama gasnohromatografskog sistema. Drugo, od vrste
veoma zavisi osetljivost detekcije. Konačno, i gas da
nije otrovan. Najčešće se koriste: helijum, argon, vodonik i azot. Obično, da bi se
obezbedio visok kvalitet gasnohromatografske analize, pre injektora se postavlja cev sa
adsorbensom (trap), da bi se uklonili trag
.
Pritisak na početku kolone (nekoliko desetina do nekoliko stotina kPa) se
stabilizuje ili mehanički ili putem elektronske kontrole pritiska (EPC) u cilju da protok
ostaje konstantan na optimalnoj vrednosti. Ovaj uređaj je izuzetno važan jer ako se
analiza vrši sa temperaturnim programiranjem, viskoznost stacionarne faze s
podešeno da
bi se eliminisao ovaj efekat. Rezultat je brža analiza i duži životni vek kolone.
4.4.2. Unošenje uzorka – isparivači (injektori)
Uloga isparivača (injektora) je da uzorak trenutno prevede u parno stanje.

Isparivači su izrađeni od metala. Za jedinjenja koja se razlažu u dodiru sa vrelim
metalom u isparivač se ubacuje stakleni umetak, ili se u njega uvlači početak kolone.
Tečni uzorci i rastvori čvrstih uzoraka se unose pomoću mikrošpriceva zapremine od 1
– 100 µl (Slika 4.6) a gasovi pomoću šprica ili specijalnog sistema slavina.
Slika.4.6. Gasnohromatografski špricevi za injektovanje uzoraka
44
Za analize većeg broja sličnih uzoraka koriste se uređaji za automatsko

injektovanje – autosempleri (Slika 4.7).
Slika 4.7. Uređaji za automatsko injektovanje - autosampleri
Isparivač praktično predstavlja ulaz u hromatograf. Kao što je već rečeno uloga
isparivača je da se u njemu uzorak ispari, pomeša sa nosećim gasom i dovede do
početka kolone. Karakteristike isparivača i način injektovanja se razlikuju u zavisnosti
od tipa kolone. Isparivač, tj. injektor prikazan je na Slici 4.8.
Za pakovane i “530” kolone (vidi Odeljak 4.4.3.), kod kojih se obično koristi
protok od 10 ml/min, direktno isparavanje je najjednostavniji način da se unese uzorak.
Kao isparivač koristi se metalna cev sa staklenim umetkom (engl. liner) koja se zagreva
na nešto višu temperaturu od prosečne tačke ključanja komponenti koje se analiziraju.
Često se temperatura injektora podešava tako da bude za oko 50 °C viša od temperature
kolone. Na jednom kraju isparivača nalazi se zaptivač (septum) od termootporne gume,
danas se najčeće koriste silikonske gume, kroz koju se pomoću mikro-šprica unosi
uzorak. Drugi kraj isparivača direktno je povezan sa kolonom. Kada se injektuje tečnost,
ona isparava, meša se sa nosećim gasom i odlazi na kolonu u roku od nekoliko sekundi.
Kapilarne kolone imaju mnogo manji kapacitet od pakovanih i za unošenje
uzorka u takve kolone je neophodan i poseban razdeljivač protoka (engl. splitter) koji se
postavlja između isparivača i kolone. Razdeljivač protoka može da radi u dva režima, sa
razdvajanjem ili bez razdvajanja protoka (engl. split ili splitless).
Kod režima sa razdvajanjem protoka, noseći gas ulazi u komoru u isparivač gde
se meša sa parama isparenog uzorka. Protok nosećeg gasa je regulisan na 50 – 100
ml/min. Nakon ulaska u isparivač i mešanja sa uzorkom, jedan deo nosećeg gasa izlazi
kroz razdelni (split) ventil, a drugi ulazi u kolonu. Od veličine zazora na razdelnom
ventilu zavisi koja će količina nosećeg gasa (i uzorka) otići na kolonu, a koja kroz
razdelni ventil van aparata. Ovaj odnos: količina gasa koja ulazi u kolonu/količina gasa
koja izlazi kroz split ventil, obično varira od 1:20 do 1:500.
45
Razdelni (split) odnos se može izračunati na osnovu jednačine:
Split odnos = (protok kroz kolonu + protok kroz split ventil) / protok kroz kolonu
Gumeni
septum
Noseći gas
Uložak
Kolona
Slika 4.8. Uređaj za isparavanje uzorka – isparivač (injektor)
Povećavanjem split odnosa postiže se: bolji izgled pika, smanjuje se opterećenje
kolone, snižava se analitička osetljivost, smanjuje se ulazno vreme analita u kolonu i
time smanjuje mogućnost termičke degradacije. Osnovne prednosti split režima su:
jednostavno korišćenje, uske analitičke zone na koloni, kratko trajanje analize, pogodan
za termolabilne uzorke zbog krakog zadržavanja uzorka u zagrejanom injektoru, štiti
kolonu od neisparljivih komponenti uzorka i lak je za automatizaciju. Najveći
nedostatak ovakvog načina injektovanja je nemogućnost analize tragova supstanci.
Danas se većina parametara, kao što su protok nosećeg gasa, split odnos, vreme trajanja
split režima itd., automatski određuje uz pomoć odgovarajućih softvera.
Split režim (Slika 4.9) se koristi za uzorke koji su prilično koncentrovani -
generalno, jedinjenja od interesa su u koncentracijama im od 100 mg/ml. Split ventil
je otvoren tokom cele analize. Temperatura injektora bi trebalo da bude dovoljno visoka
da ispari sve analite. Početna temperatura kolone treba da bude ispod temperature na
kojoj se prvo jedinjenje eluira.
Splitless režim (Slika 4.10) je još jedan način da se koristi split/splitless injektor.
U ovom režimu, uzorak se ubrizgava dok je split ventil zatvoren. Nakon određenog
46
vremena split ventil se otvara kako bi se odstranio višak rastvarača iz injektora.

Komponente uzorka se deponuju na početku kolone i najveći deo lako isparljivog
rastvarača se odstranjuje. Zbog toga mogu da se injektuju velike količine uzorka i
splitless ubrizgavanje se koristi za analizu tragova. Da bi se sprečili gubici lako
isparljivih jedinjenja od interesa, tačka ključanja rastvarača treba da bude najmanje 20
°C ispod tačke ključanja komponente uzorka sa najnižom tačkom ključanja.
Slika.4.9. Split/splitlles injektor u Slika.4.10. Split/splitlles injektor u

split režimu rada splitlles režimu rada
Kod injektovanja u splitless režimu, temperatura injektora bi trebalo da bude

dovoljno visoka da ispari sve analite, a početna temperatura kolone treba da bude -
.
Koncentrovanje rastvarača, zatim isparavanje sa porastom temperature kolone, je
poznato kao fokusiranje rastvarača (solvent focusing). Otvaranje split ventila je obično
oko 0,5-1,0 minuta posle injektovanja, međutim, ovo vreme treba eksperimentalno
optimizovati. Ako se split ventil otvori prerano, dolazi do gubitka komponenti od
interesa, ako se split ventil otvori prekasno, “repovi” pika rastvarača prekrivaju komponente
koje se najbrže eluiraju.
Jedan od glavnih problema splitless režima injektovanja sa zagrejanim
injektorom je diskriminacija jedinjenja po molekulskim masama. To znači da ako uzorak
sadrži jedinjenja sa širokim spektrom tačaka ključanja, manje količine jedinjenja sa
višim tačkama otići u kolonu, u odnosu na isparljivija jedinjenja koja su u
47
uzorku. Još jedna mana splitless injekcije je da je vreme boravka u toplom injektoru
relativno dugo i termolabilna jedinjenja imaju tendenciju da se raspadaju. Zbog ovih
nedostataka, splitless ubrizgavanje se preporučuje za analizu uzoraka u tragovima kod
kojih su tačke ključanja komponenti u prilično uskom opsegu i koji ne sadrže komponente
koje su termički labilne.
Osim pomenutih injektora, danas su upotrebi i injektori koji se mogu zagrevati i
hladiti, takozvani PTV injektori (Programmable-temperature vaporizing injectors). Za
hlađenje se obično koriste tečni azot ili tečni CO2. Praktično se programiranjem
temperature zagrevanja, odnosno, hlađenja injektora eliminišu nedostaci klasičnog
split/splitless injektovanja, kao što su diskriminacija jedinjenja po molekulskim
masama i slično. Dalje, programiranjem temperature injektovanja omogućava se da se
već na početku kolone formira više uskih zona komponenti sličnih tačaka ključanja i na
taj način obezbedi njihovo bolje razdvajanje, odnosno da se dobiju uži i oštriji pikovi.
4.4.2.1. Unošenje uzoraka gasa
Uzorci gasa za gasno-hromatografsku analizu mogu se uneti iz nekoliko različitih

izvora: rezervoari gasa, kontejneri za sakupljanje uzoraka gasa, “headspace”, trapovi i
zamke za hvatanje gasova.
Vakumski špricevi mogu da se koriste
split/splitless u oba režima. Količina uzorka obično varira od 100 μl do 2 ml
ili više. Injektovanje vakumskim špricem može da se automatizuje. Špric od 100 μl se
može instalirati u nekim autosamplerima koji su dizajnirani za injektovanje tečnih
uzoraka. Takođe, postoje neki automatizovani sistemi koji koriste vakumske špriceve
koji se mogu zagrevati da bi se sprečila kondenzacija analita u uzorku gasa.
Za uzorkovanje gasova često se koriste specijalni ventili sa petljom koja služi da
uvede uzorak u kolonu (Slika 4.11). Ventil za uzorkovanje gasova je instaliran na vrhu
gasnog hromatografa, obično u svojoj odvojenoj peći sa kontrolom zagrevanja. Čak i
kada se sistem stalno koristi za analizu gasova, zagrevanje ventila je poželjno da se spreči
kondenzacija vode. Petlja za uzorkovanje gasa je dostupna u različitim veličinama, ali za
uvođenje uzorka u gasni hromatograf su tipične zapremine: 0,5 ml, 1 ml i 2 ml.
Slika.4.11. Ventil za uvođenje gasova sa četiri otvora i petljom
48
koriste se ventili sa 4-10 otvora. Ventili za uzorkovanje gasova su

obično zagrevaju i oni su dizajnirani da rade u određenom temperaturnom opsegu.
Dostupni su u širokom spektru veličina za različite veličine kolona, izrađeni su od
materijala različite inertnosti. Oni rade ili ručno okretanjem ručice ventila koji rotira
jezgro ili automatski sa pogonom koji pravovremeno rotira jezgro tokom analize. Oni
mogu biti instalirani u gasni hromatograf i koristiti se umesto injektora za uzorke gasa
ili mogu biti eksterni deo uređaja.
4.4.2.2. Određivanje isparljivih jedinjenja u tečnostima i čvrstim

supstancama bez rastvarača
4.4.2.2.1. Statički Headspace
Headspace je metod pripreme uzorka za određivanje isparljivih jedinjenja u

čvrstim i tečnim uzorcima. Tehnika se koristi od kasnih 1950-ih do danas. Veoma je
popularna tehnika u gasnohromatografskoj analizi zbog svoje jednostavnosti i činjenice
da je veoma čist metod uvođenja nepostojanih analita u gasni hromatograf. Sistem za
injektovanje i kolona ne zahtevaju praktično nikakvo održavanje. Headspace tehnikom
iz
uzorka u otvor ventila ili kolonu.
Tečni uzorak koji treba da se analizira headspace tehnikom se čuva u
termostatiranom kontejneru ili frižideru u dobro zatvorenoj posudi kako se ne bi
izgubile lako isparljive supstance. Pre analize, tečni ili čvrsti uzorak se stavlja u ampulu
na sobnoj temperaturi, o
fazi iznad uzorka dok se ne postigne stanje ravnoteže. U ravnoteži, odnos koncentracije
analita u gasovitoj fazi i u tečnoj ili čvrstoj fazi je konstanta. Konstanta se definiše kao
koeficijent podele, K:
K = CS / CG
gde je CS koncentracija analita u uzorku nakon ravnoteže i CG koncentracija analita u

gasovitoj fazi posle uspostavljanja ravnoteže. Koeficijent podele se smanjuje sa
porastom temperature i takođe varira sa promenama u matriksu. Na primer, kada su
organske supstance rastvorene u vodi, dodavanje soli smanjuje K.
Kada se dostigne ravnoteža, alikvot gasne faze uzorka se uklanja iz headspace
ampule sa vakumskim špricem ili ventilima za uzorkovanje gasova i uzorak se uvodi u
gasni hromatograf.
Iz gornje jednačine, može se videti da supstance sa veoma visokim podeonim
koeficijentom imaju tendenciju da ostanu u fazi uzorka, dok one sa niskim koeficijentom
podele imaju tendenciju da se akumuliraju u gasnoj fazi. Dakle, granica detekcije
49
Headspace za supstancu kompatibilnu uzorku

(manja osetljivost) nego za supstancu nekompatibilnu uzorku (toluen u vodi).
Korišćenjem konvencionalne headspace tehnike, koncentracije analita se kreću u
opsegu od ppb do %.
Headspace tehnika se koristi za određivanje alkohola u krvi, zaostalih rastvarača
u farmaceutskim proizvodima i aditiva za poboljšavanje ukusa u hrani.
4.4.2.2.2. Dinamički Headspace
Ova tehnika se drugačija naziva “očisti i uhvati” (engl. purge-and-trap) tehnika.

I ak i isparljive supstance se prenose na
adsorbent (trap, zamku). Adsorptivni materijal je obično Tenax®, sintetički polimer koji
ne reaguje sa analiziranim supstancama ali ih efikasno vezuje pod ambijentalnim uslovima i
oslobađa ih na povišenoj temperaturi, bez hemijske modifikacije. Kao adsorptivni
materijali koriste se još i silika gel, aktivni ugalj i ugljenična molekulska sita. Adsorbens
se zagreva i isparljive supstance se oslobađaju ili desorbuju i prebacuju u gasni
hromatograf. Posle desorpcije, adsorbens
a tokom desorpcije kako bi se uklonili zaostali analiti i vlaga i sistem je spreman
za drugo uzorkovanje. Trapovi pakovani sa adsorbensima za specifične primene su
komercijalno dostupni.
Dinamički headspace generalno omog statičkog
headspace, jer ovom tehnikom teoretski treba da se uklone svi analiti iz matriksa, a kod
statičkog je ograničeno na uklanjanje jednog alikvota gasovite faze iznad uzorka.
Sistemi za dinamički headspace zahtevaju više održavanja od statičkog
headspace i podložni su problemima poput penušanja uzorka. U Sjedinjenim Američkim
Državama, dinamički headspace je standardni metod za određivanje isparljivih
organskih jedinjenja u vodi, dok se u mnogim evropskim zemljama za ovu primenu
koristi statički headspace. Druge primene ove tehnike uključuju analizu aroma u hrani i
toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima.
4.4.2.2.3. Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase microextraction – SPME)
Metodu mikroekstrakcije na čvrstoj fazi (SPME) je razvio Pavlicin (Pawliszyn) sa

saradnicima na Univerzitetu Waterloo u Ontariju, u Kanadi. To je termalna tehnika
adsorbcije-desorpcije za određivanje isparljivih supstanci u Headspace iznad vodenih i
čvrstih uzoraka ili određivanje “semiisparljivih” supstanci direktno u vodenim
uzorcima. Supelco Analytical (a division of Sigma-Aldrich Co.) je vlasnik Pavlicinovog
patenta i kontroliše distribuciju materijala koji se koriste za SPME .
Kod ove tehnike koristi se kratka, tanka šipka od topljenog silicijum-dioksida
(obično dužine 1 cm i prečnika 0,11 μm) obložena polimerom koji ima ulogu
50
adsorbensa. Polimerom obložena šipka silicijum-dioksida (SPME vlakno) je vezana za

metalnu iglu i one zajedno čine sklop SPME vlakana, kao što je prikazano na Slici 4.12.
Obojeni šraf
Opruga pod naponom
Septum
Prsten
Igla za probijanje septuma
Metalna igla
SPME vlakno
Slika.4.12. Uređaj za mikroekstrakciju na čvrstoj fazi
SPME vlakna su dostupna sa različitim polimerima i različitih debljina premaza.

Neka vlakna su obložena smešom adsorbujućih polimera i adsorbujućih jedinjenja
vezanih za aktivni ugalj. adsorbujućih polimera su polisiloksani koji se koriste
kao stacionarne faze u kapilarnim gasno-hromatografskim kolonama.
Sklop SPME vlakana se može koristiti za oko 100 injektovanja. SPME vlakna su
instalirana u modifikovanom špricu. U pasivnom položaju, vlakna se nalaze u
unutrašnjosti igle. Kod uzorkovanja, vodeni uzorak koji sadrži organska jedinjenja ili
čvrsta supstanca koja sadrži isparljiva organska jedinjenja se stavlja u headspace bočicu
koja je zatvorena poklopcem sa septumom. Septum se probija iglom i nakon toga se
vlakna, uz pomoć klipa, uranjaju direktno u uzorak ili prostor između poklopca i
površine uzorka. Organska jedinjenja iz uzorka se apsorbuju na vlaknima. Posle
određenog vremenskog intervala, koji se određuje tokom faze razvoja metode za
određenu analizu, vlakna se klipom vraćaju u iglu i igla izvlači iz bočice. Odmah nakon
toga, iglom se probija septum GC injektora, klip se gura nadole, a vlakna se ubacuju u
injektor gde se analiti termalno desorbuju i prebacuju na GC kolonu. Desorpcija obično
traje od 1-2 minuta, posle toga se vlakna uvlače u iglu i igla izvlači iz GC injektora. Na
slici 4.13 je šematski prikazan ovaj proces.
51
Izlaganje SPME Probijanje

Probijanje Uvlačenje
vlakna uzorku – septuma GC
septuma uzorka vlakna Uvlačenje vlakna
ekstrakcija injektora Desorpcija
(uklanjanje) - uklanjanje
analita analita
Slika.4.13. Mikroekstrakcija i injektovanje uzorka pomoću uređaja za SPME
ih injektora su pogodni za uvođenje SPME uzorka. Injektor treba da

bude opremljen staklenom oblogom (liner-om). SPME uzorci daju uske hromatografske
pikove, nema naglog povećanja zapremine uzorka izazvanog isparavanjem jer nema
rastvarača, odnosno nema potrebe da se uvodi velika zapremina gasa u injektor. Kao
statički headspace i SPME tehnika je zasnovana na ravnoteži i ekstrakcija nije potpuna,
međutim, rezultati su precizni i u skladu sa drugim analitičkim metodama, i objavljene
su niske granice detekcije, reda veličine ppt (part-per-trillion). U literaturi su opisane
brojne primene ove tehnike. Neke od tih primena su utvrđivanje aroma
, pesticida i isparljivih jedinjenja u ekološkim uzorcima i analiza droge i
toksičnih jedinjenja u biološkim tečnostima.
4.4.3. Gasnohromatografske kolone
(pokretna faza) i dovode do stacionarne faze gde na različit način

interaguj
4-20 °C/min.
Postoje dve vrste kolona: pakovane kolone (Slika 4.14) i kapilarne kolone (Slika
4.15). Kod pakovanih kolona stacionarna faza je deponovana ili hemijski vezana na
poroznom nosaču. Kod kapilarnih kolona unutrašnji zid kolone je obložen tankim slojem
stacionarne faze. Stacionarna faza može biti i hemijski vezana za unutrašnji zid kolone.
52
Slika.4.14. Metalne pakovane gasnohromatografske kolone
Slika.4.15. Kapilarne hromatografske kolone
4.4.3.1. Pakovane kolone
Ove kolone, danas se ređe koriste, imaju prečnik 1/8 ili 1/4 inča (3,18 i 6,35 mm)
i dugačke su između 1–3 m. Proizvode se od čelika ili stakla, unutrašnji zid cevi se
tretira da se izbegnu katalitički efekti sa uzorkom. One mogu da izdrže protok
gasa u opsegu 10-40 ml/min. One su punjene inertnim i stabilnim poroznim nosačem na
kome stacionarna faza može biti impregnirana ili hemijski vezana (između 3 i 20 %).
Potrebno je da čvrsti nosač zadovolji neke zahteve od kojih su najvažniji sledeći:
- velika specifična površina od 2 – 8 m2/g,
- da se sastoji od sfernih čestica ujednačene veličine i prečnika, najčešće 0,2 mm,
- ujednačena veličina pora po površini čestica (prečnik pore ≤ 10 μm)
- inertnost, minimalna hemijska i adsorptivna interakcija sa uzorkom,
- mehanička jačina, ne sme da se mrvi prilkom punjenja kolone.
Najveći broj čvrstih nosača se dobija od takozvane dijatomejske zemlje ili kizelgura.
To je skelet dijatoma, monoćelijske alge, koji se sastoji najvećim delom iz mikro-
amorfnog hidratisanog silikata (sadrži oko 90 % SiO2). Ostatak čine metalni oksidi:
53
Al2O3, Fe2O3, TiO2, CaO i MgO. Ovaj materijal je veoma porozan i ima veliku aktivnu
površinu. Čvrsti nosači koji se dobijaju od dijatomejske zemlje, ima ih više tipova,
komercijalno su poznati pod imenom Chromosorb®. Razvijeni su i drugi sintetički materijali
na bazi SiO2, kao što je Spherosil®, koji se sastoji od sitnih perli silicijum-dioksida.
Postoje i čvrste faze napravljene od umreženih kopolimera stirena i
divinilbenzena, kod kojih veličina pora zavisi od odnosa stiren/divinilbenzen i oni su
komercijalno dostupni pod nazivima Chromosorb 101-108 i Porapak Q, R S, N i T. Kod
njih veličina šupljina između polimernih lanaca zavisi od odnosa stiren/divinil benzen,
što je udeo divinil benzena veći, prečnik pora je manji. Veličina pora kod ovih nosača se
kreće od 0,01 do 0,35 μm, a aktivna površina iznosi od 50 – 400 m2/g. Ovakvi čvrsti nosači
mogu da se koriste i kao stacionarne faze. Da bi im se povećala polarnost u njih se
ugrađuju polarni vinil-monomeri, koji se dodaju pre polimerizacije. Za ovu svrhu se
koriste: akrilonitril, akrilatni estri, vinil-pirolidon i etilen-glikol-dimetil-akrilat.
Pakovane kolone se najčešće koriste za analizu gasova. Kolone pakovane sa
poroznim polimerima, sa i bez stacionarne faze, se preporučuju za analizu vodenih
rastvora polarnih organskih jedinjenja koja mogu da grade vodonične veze, kao što su
amini, alkoholi, glikoli i slobodne kiseline.
4.4.3.2. Kapilarne kolone
Kapilarna GC kolona se sastoji od dva glavna dela: cevi i stacionarne faze.

Unutrašnji zid cevi malog prečnika (0,05 do 0,53 mm) je obložen tankim filmom (0,1 do
10,0 μm) termički stabilnog polimera velike molekulske mase. Ovaj polimerni premaz
predstavlja stacionarnu fazu. Dužine kapilarnih kolona kreću se od 10 do 120 m. Poprečni
presek kapilarne hromatografske kolone prikazan je na Slici 4.16.
Kolone su obično napravljene od stopljenog silicijum-dioksida najviše č e,
dobijenog sagorevanjem tetrahlorosilana (SiCl4) u atmosferi bogatoj kiseonikom.
Stopljeni silicijum-dioksid je lako lomljiv i teško se savija. Fleksibilnost kolona se postiže
tako što se spoljašnji zid kolone oblaže poliamidom, termički stabilnim polimerom koji
podnosi temperature do 370 °C ili tankim aluminijumskim filmom.
a) b)
Slika.4.16. Poprečni presek kapilarne hromatografske kolone a) bez stacionarne faze i

b) sa stacionarnom fazom
54
Kolone se namotavaju oko metalnog nosača koji sprečava da dodje do njihovog

mehaničkog oštenja tokom namotavanja (vidi sliku 4.15.). Neki proizvođači nude kolone
napravljene od metala (aluminijum, nikl ili čelik) koje mogu da se koriste na visokim
radnim temperaturama reda veličine 450 °C, pod uslovom da je stacionarna faza
dovoljno stabilna. Unutrašnja površina kolone se obično tretira da se omogući vezivanje
sa stacionarnom fazom. Tretman može biti hemijski (HCl na 350 °C), ili podloga od
tankog sloja glinice ili silika gela u zavisnosti od tehnike koja se koristi za nanošenje
stacionarne faze. Debljina sloja glinice ili silika gela može da varira između 0,05 i 5 μ. Na
osnovu načina oblaganja untrašnjeg zida kolone one se mogu podeliti na:
- otvorene kolone sa zidom obloženim tečnom stacionarnom fazom (Wall-coated
open tubular – WCOT)
- otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem koji obložen tečnom
stacionarnom fazom (Support-coated open tubular - SCOT)
- otvorene kolone sa zidom obloženim poroznim nosačem (Porous-layer open
tubular - PLOT). Slika.4.17.
Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona dat je na Slici 4.17.
Kovalentno vezivanje građenjem Si - O - S -
da se vežu na površinu silika gela.
zid kolone
tečna stacionarna faza
porozni nosač
porozni nosač obložen stacionarnom
fazom
Slika.4.17. Šematski prikaz WCOT, PLOT i SCOT kapilarnih kolona
Poseban tip kapilarnih kolona su kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,53 mm

(530 μm – kolone) i dužinom od 5 do 50 m. Poprečni presek kapilarne kolone prikazan
je na Slici 4.18. Te kolone su, u zavisnosti od proizvođača i njihovih glavnih karakteristika
poznate po k
5 ml/min do 15 ml/min, približno protoku
koji se koristi u pakovanim kolonama. Međutim, rezolucija i performanse ovih kolona su
55
slabije od kapilarnih
starijim hromatografima zamene sa 530 μm kolonama, uz korišćenje istih injektora,
detektora i protoka. Njihova glavna prednost nad pakovanim kolonoma je što kod njih
ne dolazi do progresivnog gubitka stacionarne faze sa vremenom. Ove kolone mogu i da
se pakuju ali se to radi vrlo retko.
Poliimidna prevlaka
Staklo
dC, Unutrašnji
prečnik kolone
df, Debljina filma
Stacionarna faza
Slika.4.18. Poprečni presek kapilarne kolone
4.4.3.3. Stacionarne faze
U literaturi je za pakovane kolone, za koje su tehnike impregnacije vrlo jednostavne,

predloženo preko 100 stacionarnih faza različitih tipova. S druge strane, za vezanu fazu
na kapilarnim kolonama izbor stacionarne faze je ograničen zbog toga što nanošenje
filma na unutrašnju površinu kolone zahteva različit princip od impregnacije. Najveći
broj stacionarnih faza koje se danas koriste su polisiloksani i polietilenglikoli, koji su
manje ili više hemijski i strukturno modifikovani. Za proučavanje optički aktivnih jedinjenja
(razdvajanje enantiomera), se koriste posebne faze koje sadrže sadrže ciklodekstrine.
Svaka od ovih faza može da se koristi između minimalne temperature ispod koje
se ravnotežna koncentracija suviše sporo uspostavlja i maksimalne temperature iznad
koje dolazi do degradacije polimera. Maksimalna temperatura na kojoj kolona može da
se koristi zavisi od prirode polimera i debljine filma. Svaka stacionarna faza ima
preporučeni opseg radnih temperatura. Ispod minimalne temperature, viskoznost faze
je velika i difuzija analita između stacionarne i mobilne faze je otežana. Kad se kolone
zagrevaju, one počinju da “cure”, to jest, deo faze se gubi iz kolone (Slika 4.19). To može
biti gubitak hemijski nepromenjene faze ili dolazi do razgradnje lanca polimera koja čini
stacionarnu fazu (Slika 4.20). Razgradnjom polimera nastaju isparljiva jedinjenja
sastavljena od tri, četiri, pet ili više monomernih jedinica. Ova jedinjenja daju neželjene
pikove na hromatogramu. Prisustvo kiseonika i vode u koloni može pospešiti
razgradnju polimera. Iznad maksimalne temperature, curenje kolone postaje intenzivno
56
i to uje radni vek kolone i daje veliki broj neželjenih pikova. Kolone sa polarnim
stacionarnim fazama imaju tendenciju da cure više nego kolone sa nepolarnim
stacionarnim fazama.
Poliimid Poliimid Poliimid
Film Oštećenje filma Oštećenje filma
Staklo Staklo Aktivna površina

Staklo
Slika.4.19. Šematski prikaz preseka kapilarne kolone bez i sa oštećenjima
Slika 4.20. Degradacija polsiloksanske stacionarne faze
Debljina stacionarne faze je takođe važna za izbor radne temperature kolone. U

principu, tanka stacionarna faza (~0,2 μm ) je poželjna za rad jer kolona manje curi.
Tanak film stacionarne faze je dobar za razdvajanje jedinjenja sa visokim tačkama
ključanja ali za za razdvajanje jedinjenja sa niskim tačkama ključanja, potreban je deblji
film stacionarne faze (1,0 μm) da se obezbedi dovoljno zadržavanje jedinjenja koja se
razdvajaju.
4.4.3.3.1. Čvrste stacionarne faze
Čvrste stacionarne faze se prave od razl : silicijum-

dioksida ili aluminijum-oksida, deaktiviranih mineralnim solima, molekulskih sita,
poroznog stakla, grafita (Chromosorb® 100, Porapak®), kao i čvrste faze napravljene
od umreženih kopolimera stirena i divinilbenzena (Chromosorb® 101-108 i Porapak®
Q, R S, N i T). Kapilarne kolone napravljene taloženjem ovih materijala u obliku finog
poroznog sloja nazivaju se PLOT (Slika 4.17). One se koriste za razdvajanje gasovitih ili
nestabilnih uzoraka. Kolone koje sadrže grafit su razvijene za analizu N2, CO, CO2 i
gasovitih ugljovodonika. Efikasnost ovih kolona je veoma visoka.
57
4.4.3.3.2. Tečne stacionarne faze
Čvrsti nosač obložen tečnom fazom je jednostavan primer tečne stacionarne faze.
Priprema se tako što se napravi rastvor tečne faze u isparljivom rastvaraču, zatim doda
čvrsti nosač u rastvor, dobro izmeša, a zatim se rastvarač ukloni isparavanjem. Ovi
materijali izgledaju suvo čak i sa relativno visokim udelom tečne faze, i mogu lako da se
pakuju u kolonu. Punjenja sa niskim udelom tečne faze daju visoku efikasnost i koriste
se za jedinjenja sa visokim tačkama ključanja, dok se punjenja sa visokim udelom tečne
faze koriste za lako isparljiva jedinjenja i gasove.
Dobra stacionarna faza u gasno-tečnoj hromatografiji
karakteristike:
- zanemarljiv napon pare na radnoj temperaturi,
- dobru stabilnost na radnoj temperaturi,
- uzorci treba da imaju umerenu rastvorljivost u stacionarnoj fazi,
- komponente uzorka treba da pokazuju različite koeficijente distribucije.
Jedna od velikih prednosti gasne hromatografije je da se supstance sa istim ili
sličnim naponom pare mogu dobro razdvojiti stacionare faze.
Raznovrsnost i selektivnost gasne hromatografije leži u širokom izboru stacionarnih
faza. Stacionarne faze pokrivaju širok spektar, od nepolarnih dimetil-polisiloksanado
visoko polarnih polisiloksana i polihidroksilnih jedinjenja kao što je polietilen-glikol
(Carbowax 20M).
Polisiloksani (takođe poznati kao silikoni, silikonska ulja ili silikonske gume) su
polimeri kod kojih lanci izgrađeni od alternirajućih veza silicijuma i kiseonika, -Si-O-, i
gde se na svakom atomu silicijuma nalaze po dve alkil, aril ili neke druge funkcionalne
grupe. Najčešće su to kopolimeri polidimetilsiloksana i nekog drugog dialkil- diaril- ili
alkil/aril-polisiloksana. Postoji oko 20 različitih kombinacija alkil i aril supstituenata
(najčešće su to metil i fenil) na koje se mogu dalje ugraditi funkcionalne grupe (npr.
cijanopropil, trifluropropil itd.). Monomeri kombinovani u promenljivim molskim
odnosima dovode do promena u osobinama stacionarnih faza (polaritet, interval
stabilnosti, odnosno radne temperature, koji se npr. menja od -50 do 300/325 °C).
Strukture najčešće korišćenih polisiloksanskih polimera i kopolimera prikazane su u
Tabeli 4.1. Zbog njihovog veoma širokog opsega radnih temperatura ove faze su
najrasprostranjenije u gasnoj hromatografiji.
Slika 4.21. Struktura polisiloksanskog kopolimera
58
Polietileneglikoli (PEG) se koriste za dobijanje polarnih stacionarnih faza.

Najpoznatiji predstavnik ove grupe polimera je Carbowax®. Ovi polarni polimeri (npr.
Mr = 1500 do 20 000 - za Carbowax 20M) mogu se koristiti za nanošenje, impregnaciju
ili kao vezana faza. Njihove radne temperature su niže od polsiloksana i iznose od 40 °C
do 260 °C, u zavisnosti od prečnika kolone i debljine filma. Struktura i osobine najčešće
korišćenih polietilenglikola prikazani su u Tabeli 4.1.
Tabela 4.1. Struktura i svojstva tečnih faza u gasnoj hromatografiji
Struktura tečne faze Sastav Polarnost Maksimalna Komercijalna imena

kopolimera temperatura*1 kolona
nepolarna 340/360 °C OPTIMA(1/1MS),
PERMABOND®SE30, OV1,
DB‑1, SE‑30,HP‑1,SPB‑1,
CP-Sil 5 CB, Rtx®-1,
007‑1, BP1, MDN-1, AT™-
1, ZB-1, OV-101
m = 5% slabo – 340/360 °C OPTIMA 5, PERMABOND®
SE-52, SE-54, SE‑52, DB‑5,
n = 95% polarna
HP-5, SPB-5, CP‑Sil 8,
Rtx®‑5, 007-5, BP5,
MDN‑5, AT™‑5, ZB-5
m = 5% slabo – 340/360 °C OPTIMA(5MS), DB-5MS,

HP-5MS, Ultra-2, Equity™-
n = 95% polarna
5, CP-Sil8CB low
bleed/MS, Rtx®-5SIL-MS,
Rtx®-5MS, 007-5MS,
BPX5, MDN-5S, AT™-5MS,
VF-5MS, DB-XLB, Rtx®-
m +n = 5% slabo – 340/360 °C
XLB, MDN-12, VF-XMS.
o = 95% polarna
m = 6% polarna 300/320 °C OPTIMA(1301/624) HP-

1301, DB-1301, SPB‑1301,
n = 94%
Rtx®1301, CP-1301, 007-
1301 HP-624, HPVOC, DB-
624, DB-VRX, SPB-624, CP-
624, Rtx®-624, Rtx®-
Volatiles, 007-624, BP624,
VOCOL
m = 14% polarna 300/320 °C OPTIMA 1701, OV-
1701, DB-1701, CP‑Sil 19
n = 86%
CB, HP-1701, Rtx®-
1701, SPB-1701, 007-
1701, BP10, ZB-1701
m+n= 35% polarna 360/370 °C OPTIMA 35MS, DB-35 MS,
HP-35, SPB-35, Rtx-35,
o = 65%
007-35, BPX-35, MDN-35,
AT-35 MS, ZB-35, OV-11,
VF-35 MS
59
Tabela 4.1. nastavak

Struktura tečne faze Sastav Polarnost Maksimalna Komercijalna imena
kopolimera temperatura*1 kolona
polarna 320/340 °C OPTIMA 17, OV-17, DB-17,
HP‑50+, HP-17,
SPB‑50, SP-2250,
Rtx®-50, CP-Sil 24 CB,
007-17, ZB‑50
jako – 260/280 °C OPTIMA 210, OV-210,
DB-210, Rtx®-200,
polarna
007‑210
jako – 260/280 °C OPTIMA 225, DB-225,

HP-225, OV-225, Rtx®-
polarna
225, CP-Sil 43, 007-225,
BP225
m = 33% jako – 260/280 °C OPTIMA 240

n = 67% polarna
jako – 250/260 °C OPTIMA WAX, DB-

Wax, HP‑Wax,
polarna
Supelcowax™, ,
Rtx®‑Wax,CP-Wax 52 CB,
Stabilwax, 007-CW, BP20,
AT™-Wax, ZB-Wax
jako – 250/260 °C OPTIMA FFAP,
PERMABOND® FFAP, DB-
polarna
FFAP, HP FFAP, CP-SIL 58
CB, 007-FFAP, CP-
FFAP CB, Nukol
*1 – prva temperatura je za izotermalne programe
4.4.3.3.3. Selektivnost stacionarne faze
Za pravilan izbor stacionarne faze potrebno je dobro poznavanje hemijskih i

fizičkih osobina komponenti uzorka koji se analizira. Takođe su potrebni literaturni
podaci o sličnim uzorcima i podaci dobijeni u eksperimentalnom radu. S
:
- Treba dobro da rastvara komponente uzorka, jer će se komponente sa slabom
rastvorljivošću brzo eluirati.
- Neophodno je da dobro razdvaja komponente uzorka, a razdvajanje zavisi od
njihovih podeonih koeficijenata.
- Treba da ima dobru termičku stabilnost – termičku nestabilnost može izazvati
katalitički uticaj čvrstog nosača pri visokim temperaturama.
60
- Treba da pokazuje slabu isparljivost, odnosno stacionarna faza treba da bude

neisparljiva i njen napon pare na radnoj temperaturi treba da bude od 0,01 do 0,1 mm.
- Treba da bude hemijski inertna u odnosu na komponente uzorka na radnoj
temperaturi.
Kao što je već rečeno, važno je poznavanje hemijske prirode komponenti uzorka.
Ako ova informacija nije dostupna, neophodno je da se uzorak analizira na kolonama
različite polarnosti, jednoj nepolarnoj i najmanje dve polarne od kojih jedna sadrži
stacionarnu fazu sa elektron – donorskim, a druga stacionarnu fazu sa elektron –
akceptorskim svojstvima, kako bi se osiguralo da sve komponente budu eluirane i
detektovane. Tako dobijeni hromatogrami mogu da pruže dosta informacija o prirodi
komponenti i da posluže kao polazna osnova za izbor kolone sa odgovarajućom tečnom
fazom. Osnovni princip je da se pokuša da se klasifikuje uzorak u jednu od pet grupa, na
osnovu polarnosti njegovih komponenti.
1. Jako polarna jedinjenja. U ovu grupu spadaju voda i polifunkcionalna
jedinjenja koja u svom molekulu sadrže više aktivnih vodonikovih atoma i koja su
sposobna da grade više vodoničnih veza. Takva jedinjenja su: voda, glicerol, amino
alkoholi, hidroksi kiseline, dikarboksilne kiseline i polifenoli.
2. Polarna jedinjenja. Ovu grupu čine jedinjenja koja sadrže aktivni vodonikov
atom i jako elektronegativni atom sa slobodnim elektronskim parom (O, N ili F). Najveći
broj ovih jedinjenja, takođe može da gradi vodonične veze. Takva jedinjenja su: alkoholi,
fenoli, masne kiseline, primarni i sekundarni amini, nitro jedinjenja sa α – vodonikovim
atomom i nitrili sa α – vodonikovim atomom.
3. Umereno polarna jedinjenja. Ova jedinjenja sadrže jako elektronegativni
atom sa slobodnim elektronskim parom ali ne sadrže aktivne vodonikove atome. Takva
jedinjenja su: aldehidi, ketoni, etri, estri, tercijarni amini, nitro jedinjenja bez α –
vodonikovog atoma i nitrili bez α – vodonikovog atoma.
4. Slabo polarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja sa slabo aktivnim vodonikovim
atomima ali bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovu
grupu spadaju: halogenovani ugljovodonici, aromatični ugljovodonici i alkeni.
5. Nepolarna jedinjenja. Ovo su jedinjenja bez aktivnog vodonikovog atoma i
bez jako elektronegativnog atoma sa slobodnim elektronskim parom. U ovi grupu
spadaju: zasićeni ugljovodonici, merkaptani, sulfidi i potpuno halogenovani
ugljovodonici, kao CCl4.
Nije lako kvantifikovati polarnost stacionarne faze u gasnoj hromatografiji.
Pojam polarnosti tečne faze se, na neki način, razlikuje od klasične definicije polarnosti
izražene preko dipolnih momenata i on obuhvata sumu više efekata od kojih zavise
retenciona vremena. Polarnost je određena i međumolekulskim interakcijama, koje su
veoma složene prirode i često ih je teško predvideti u hromatografskom sistemu.
Intermolekulske interakcije mogu da igraju značajnu ulogu u gasnoj hromatografiji
61
(detaljno su opisane u Poglavlju 1.2.2.). Na primer, kod tečnih faza koje sadrže slobodne
hidroksilne grupe, polarnost zavisi, kako od dipolnih momenata, tako i od mogućnosti
građenja vodoničnih veza sa komponentama uzorka. Prema polarnosti, tečne
stacionarne faze u gasnoj hromatografiji se dele na više načina. Jedna od podela
prikazana je u Tabeli 4.1., a po drugoj dele se na:
- Polarne – sadrže veliki broj polarnih grupa (npr. polietilen-glikol).
- Nepolarne – ne sadrže polarne grupe (polidimetilsiloksan).
- Srednje polarne – po broju polarnih i polarizabilnih grupa se nalaze između
polarnih i nepolarnih.
Razdvajanje na gasnohromatografskoj koloni zavisi od vrste i jačine
međumolekulskih interakcija između komponenti uzorka i tečne stacionarne faze, kao i
od tačaka ključanja komponenti uzorka. Zbog toga, što su međumolekulske interakcije najače
između molekula sličnih po strukturi, sledi pravilo da se najbolja gasnohromatografska
odvajanja postižu na tečnim fazama koje su po polarnosti slične komponentama uzorka.
Pri izboru tečne faze neophodno je da se vodi računa da ona ne interaguje suviše jako sa
komponentama smeše, što bi kao posledicu imalo suviše duga retenciona vremena ili
trajno zadržavanje komponente na koloni. Svako građenje adicionog jedinjenja sa
tečnom fazom je nepoželjno zbog nepovratne adsorpcije datog jedinjenja i, samim tim,
nepovratnog oštećenja kolone. Zbog toga, ako je neka od komponenti bazna, tečna faza
mora imati takođe bazna (elektron-donorska) svojstva. Kada se razdvajaju kisela
jedinjenja preporučuju se tečne faze sličnog (elektron-akceptorskog) karaktera ili one
koje nisu isuviše bazne.
Na Slici 4.22 su prikazani hromatogrami smeše jedinjenja koja se sastoji, po
prethodno navedenoj podeli, od nepolarnih alkana (1, 2, 8, 9, 10), umereno polarnih
estara (6,7), umereno polarnog ali jako baznog dimetilanilina (4) i polarnih (po
funkcionalnoj grupi) alkohola i primarnog amina (3, 5). Decilamin i 1-oktanol sadrže
izrazito polarne funkcionalne grupe sa aktivnim vodonikovim atomom i elektron
donorskim atomom azota, odnosno kiseonika, ali je zbog veličine molekula doprinos
ovih grupa ukupnoj polarnosti molekula mala i ti molekuli se ponašaju kao slabo
polarni.
Sa Slike 4.22 se vidi da je raspored pikova alkana, bez obzira na stacionarnu fazu,
uvek identičan i da se oni eluiraju po rastućim molekulskim masama, odnosno tačkama
ključanja. Najbrže se eluiraju na polarnim kolonama, a najveća retenciona vremena
imaju na nepolarnoj koloni, što je u potpunosti očekivano na osnovu njihovih i osobina
stacionarne faze.
Alkohol i primarni amin su polarniji od alkana i iz tog razloga, na polarnim
kolonama, imaju veća retenciona vremena od komponenti 1 i 2, ali manja od alkana 8, 9
i 10, zbog mnogo manjih molekulskih masa. Takođe na svim kolonama jedinjenja 3 i 5
imaju manja retenciona vremena od estara 6 i 7, bez obzira na veću polaranost u odnosu
62
na njih. Ovo je očigledan primer kompleksnosti razdvajanja na gasnohromatografskoj

koloni i uticaja različitih faktora. U zavisnosti od veličine molekula i polarnosti
jedinjenja imamo različita retenciona vremena na različitim stacionarnim fazama.
Hromatogram *1, *2 Stacionarna faza Opis S.F. Polarnost
m = 33%
n = 67%
m = 14%
n = 86%
m = 5%
n = 95%
*1-Uzorak: 1. Undekan - C11H24; 2. Dodekan - C12H26; 3. Oktanol - C8H17OH; 4. Dimetilamin - C6H5N(CH3)2;

5. Decilamin - C10H21NH2; 6. Metildekanoat - C9H19CO2CH3; 7. Metilundekanoat - C10H21CO2CH3;
8. Heneikozan - C21H44; 9. Dokozan - C22H46; 10. Trikozan - C23H48
*2 - Svi hromatogrami su snimljeni pod istim uslovima: sve kolone su imale istu debljinu filma stacionarne
faze, istu dužinu i isti prečnik, injektovana je uvek ista količina uzorka u istom režimu (split 1:50), pritisak
nosećeg gasa je bio isti za sve kolone, korišćen je uvek plameno jonizacioni detektor i rađeno je u
izotermalnom režimu.
Slika 4.22. Poređenje selektivnosti različitih stacionarnih faza

pod istim hromatografskim uslovima
63
Posebno je zanimljivo ponašanje dimetilanilina, odnosno njegova retenciona

vremena na različitim stacionarnim fazama. Na dve najpolarnije kolone dimetilanilin
ima najveća retenciona vremena u odnosu na ostale komponente (8, 9 i 10 imaju mnogo
veće molekulske mase). Na sledeće tri po polarnosti ima manja retenciona vremena od
estara jer ovde dominiraju molekulske mase u odnosu na polarnost ali još uvek se
međumolekulske interakcije dovoljno jake da ima veće retenciono vreme u odnosu na
primarni amin veće molekulske mase. Na slabo polarnoj i nepolarnoj koloni imamo,
očekivani, redosled po molekulskim masama jer su tu interakcije između jedinjenja iz
smeše i stacionarne faze zanemarljive i utiču samo na apsolutni iznos retencionih
vremena. Interesantno je poređenje retencionog vremena dimetilanilina na stacionarnoj
fazi od poli(trifluoropropilmetilsiloksana) i stacionarnoj fazi od poli(metilfenil-
siloksana). Na manje polarnoj ali hemijski sličnoj poli(metilfenil-siloksanskoj) fazi
(prisustvo aromatičnog jezgra), dimetilanilin ima veće retenciono vreme.
Kao što je već rečeno, za dobro razdvajanje i uspešnu analizu smeše neophodno
je poznavanje fizičko-hemijskih osobina jedinjenja u smeši, kao i osobina tečnih
stacionarnih faza u kolonoma. Važno je napomenuti da se danas proizvode kolone sa
stacionarnim fazama koje su hemijski modifikovane, aktivirane ili dezaktivirane, i da je
danas dostupno preko 200 različitih tipova kolona. Proizvođači u katalozima daju
mnoštvo informacija o osobinama tih kolona, na osnovu kojih se možemo odlučiti za
izbor odgovarajuće kolone.
4.4.3. Detektori u gasnoj hromatografiji
Detektor je direktno povezan sa izlazom kolone, tako da sve što je sa nje eluirano
prolazi kroz njega. U gasnoj hromatografiji se koristi veći broj različitih detektora,
mnogi od ovih detektora, osim termoprovodljivog detektora, su posebno razvijeni za
gasnu hromatografiju. Uglavnom se primenjuju takozvani diferencijalni detektori čiji se
princip rada zasniva na neprekidnom merenju nekog fizičkog svojstva nosećeg gasa koje
je u direktnoj vezi sa koncentracijom ili masom pare u njemu. Neki od ovih detektora su
navedeni u Tabeli 4.2. U principu, oni se mogu klasifikovati na osnovu toga da li se mogu
koristiti za sve klase jedinjenja ili da li su selektivni za datu klasu jedinjenja.
Tabela 4.2. Primena komercijalno dostupnih detektora za gasnu hromatografiju

Detektor Primena
Termoprovodljivi detektor (TCD) Univerzalni
Plameno jonizacioni detektor (FID) Sagorljiva organska jedinjenja
Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) Halogenovana jedinjenja
Fotojonizacioni detektor (PID) Aromatična jedinjenja
Detektor sa alkalnim plamenom (NPD) N-, P-, i halogena organska jedinjenja
Plameno fotometrijski detektor (FPD) S- i P-, organska jedinjenja
Maseni spektrometar (MSD) Univerzalni
64
Osnovne karakteristike tri detektora su sledeće:

- Termoprovodljivi detektor (Thermal conductivity detector - TCD) - može se smatrati
univerzalnim detektorom koji reaguje na koncentraciju i opšte osobine, nije
destruktivan.
- Plameno-jonizacioni detektor (Flame ionization detector - FID) - je selektivan za
ugljenična jedinjenja, reaguje na protok mase i specifične osobine, destruktivan je.
- Detektor sa zahvatom elektrona (Electron capture detector - ECD) - je selektivan za
halogena jedinjenja, reaguje na opšte osobine, nije destruktivan.
Granica detekcije je ona količina supstance na koju detektor reaguje dajući pik
čija je visina najmanje dva puta veća od visine bazne linije. Za granicu detekcije se u
literaturi koriste sledeći termini: minimalna detektovana količina (engl. minimal
amount detected - MAD), minimalna granica detekcije (Minimum limit of detection -
MLD) ili limit detekcije (Limit of detection - LOD). U principu, poželjno je da se vrednost
granice detekcije utvrdi eksperimentalno. U daljem tekstu će termin “povećanje granice
detekcije” podrazumevati veću osetljivost detektora, odnosno, sposobnost detektora da
registruje manju količinu supstance.
Termoprovodljivi detektori mogu da detektuju količinu analizirane supstance do
reda veličine 100 ppm. To je praktično univerzalni detektor koji radi na merenju razlike
u električnoj provodljivosti nosećeg gasa sa uzorkom i čistog nosećeg gasa.
Plameno-jonizacioni detektor može detektovati male količine, reda veličine ppm,
. Uzorak na izlasku iz kolone se uvodi u plamen koji izaziva
jonizaciju uvedenog jedinjenja i zatim se meri električna provodljivost nosećeg gasa,
koja je direktno proprcionalna broju jona. Ovaj tip detektora daje slab odgovor na neka
jedinjenja, kao što su na primer heterociklična jedinjenja azota.
Posebni detektori, kao što su detektori sa zahvatom elektrona, mogu detekovati
izuzetno male količine, reda veličine ppb, odgovarajućih halogenih jedinjenja. Granice
detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji su date na Slici 4.32.
Slika 4.23. Granice detekcije najčešće korišćenih detektora u gasnoj hromatografiji
65
4.4.3.1. Termoprovodljivi detektor
Kao što je već pomenuto, termoprovodljivi

dnosu
na toplotnu provodljivost . Detekcija se zasniva na činjenici da brzina
prelaska toplote sa zagrejanog tela na okolni gas zavisi od sastava gasa. Najveći deo
toplote odvodi se procesom termičke provodljivosti koji zavisi od broja sudara molekula
gasa, u jedinici vremena, sa zagrejanim telom, to jest od pokretljivosti molekula gasa.
Zbog toga najveću toplotnu provodljivost pokazuju gasovi sa najmanjim, samim tim
najpokretljivijim molekulima, kao što su vodonik i helijum.
Detektor se sastoji od metalnog bloka u kome se nalaze četiri ćelije. Presek ćelije
prikazan je na Slici 4.24.
Blok
detektora
Slika 4.24. Blok termoprovodljivog detektora sa četiri ćelije
Dve ćelije su merne i kroz njih protiče gas sa gasnohromatografske kolone

(noseći gas i pare uzorka), a dve referentne i kroz njih protiče čist noseći gas. U svakoj
od njih se nalazi po jedan vlaknast otpornik od materijala koji ima veliki temperaturni
koeficijent otpora. Za ovu svrhu koriste se platina, volfram, volframove legure i nikal.
Takođe se koriste i sinterovane smeše oksida nikla, mangana, i kobalta. Ove smeše su
poznate pod imenom termistori i njihova upotreba je ograničena na niske temperature,
pošto im osetljivost opada sa porastom temperature. Šema termoprovodljivog
detektora prikazana je na Slici 4.25.
Sva četiri otpornika povezana su u Vitstonov (Wheatstone) most. Kako kroz
otpornike neprekidno protiče struja, jačine I, oni se nalaze na višoj temperaturi od
temperature bloka koji se zagreva posebnim grejačem. Temperatura vlakna otpornika
određena je ravnotežom između prispele električne energije (I2R) i toplote odvedene,
toplotnim provođenjem, preko nosećeg gasa. Kada kroz obe ćelije protiče čist noseći gas
konstantnom brzinom, temperature svih otpornika su konstantne. Pod tim uslovima
66
Vitstonov most je uravnotežen i ΔE = 0. Kada sa kolone naiđu molekuli analiziranog

jedinjenja, menja se sastav gasa u mernim ćelijama, što izaziva promenu temperature
otpornika u mernim ćelijama. Posledica toga je pojava napona između mernih tačaka
Wheatstone-ovog mosta i ΔE ≠ 0. Ovaj električni signal se pojačava i registruje kao
gasnohromatografski pik. Površina ispod pika (P) proporcionalna je ukupnoj masi
eluirane komponente (M), a obrnuto proporcionalna brzini protoka nosećeg gasa (F):
P = ki x M / F
Konstanta proporcionalnosti ki zavisi od razlike između toplotnih provodljivosti

nosećeg gasa i pare eluiranog jedinjenja. Što je ova razlika veća, to je i konstanta
proporcionalnosti veća, a samim tim veća je i površina ispod pika, odnosno granica
detekcije. Činjenica da Ki zavisi i od toplotne provodljivosti pare analiziranog jedinjenja,
dovodi do toga da ovaj detektor nema istu osetljivost za različita jedinjenja. Osetljivost
termoprovodljivog detektora proporcionalna je i kvadratu jačine struje koja protiče
kroz vlakna otpornika, otporu vlakna, kao i razlici između temperatura otpornika i
bloka. Povećanje osetljivosti povećanjem jačine struje kroz vlakna, čime se menjaju i sve
pomenute veličine, ograničeno je termičkom izdržljivošću vlakna. Kada se pređe
određena temperatura vlakno može da pregori. Smanjivanjem temperature bloka
takođe može da se poveća osetljivost detektora ali, istovremeno, može doći do
kondezacije i deponovanja teže isparljivih jedinjenja u bloku detektora.
Slika 4.25. Šema termoprovodljivog detektora
Ranije je već rečeno da je osetljivost termoprovodljivog detektora manja od

osetljivosti drugih detektora. Njegove glavne prednosti su što nije destruktivan i što
67
omogućava detekciju jedinjenja koja ne mogu da se detektuju jonizacionim detektorima

kao što su: neorganski gasovi, voda, ugljen-disulfid i mnoga druga.
4.4.3.2. Plameno-jonizacioni detektor
Plameno-jonizacioni detektor (FID gasnoj

hromatografiji. Na izlazu iz kolone eluirane pare ispitivanih jedinjenja spaljuju u malom
plamenu, dobijenim sagorevanjem vodonika u kiseoniku, da bi se proizveli joni. Kada se
prikupe, joni proizvode malu struju koja se meri kao signal. Kada uzorak nije zapaljiv,
treba da postoji minimalna jonizacija i na taj način se dobija bazna linija.
Tipičan plameno-jonizacioni detektor (FID) je prikazan na Slici 4.26. Eluent sa
kolone se meša sa vodonikom i dovodi do malog gorionika gde sagoreva u atmosferi
vazduha koji se neprekidno dovodi sa visokim protokom. Pošto se u toku sagorevanja
uvek dobija voda, potrebno je da detektor bude zagrejan kako bi se sprečila
kondenzacija vode. U plamenu se proizvode joni i oni provode struju od gorionika, koji
služi kao jedna elektroda, do kolektorske elektrode postavljene iznad ili oko plamena
koje su pod naponom od oko 300 V (Slika 4.26.). Kada sa kolone izlazi čist noseći gas,
između elektroda protiče konstantna jednosmerna struja koja ide dalje kroz merni
otpornik, a rezultujući pad apona se pojačava elektrometrom i detektuje kao bazna
linija. Visina bazne linije podešava se kompenzovanjem ove struje strujom suprotnog
smera. Kada u prostor između gorionika i kolektorske elektrode dospeju joni nastali u
plamenu od jedinjenja eluiranog sa kolone, nihovo prisustvo smanjuje otpor između
elektroda. Na taj način se pojačava struja, odnosno pad napona na mernom otporniku.
Nastali signal se pojačava i registruje kao hromatografski pik. Površina pika direktno je
proporcionalna ukupnoj masi eluirane supstance i ne zavisi od protoka nosećeg gasa.
Zamenljivi kolektor
Držač kolektora
Izolator
Oklop kolektora
Vazduh
Plamen
Usmerivač mlaza
Vodonik
Zid gorionika
Kolona - izlaz
Slika. 4.26. Presek plameno-jonizacionog detektora
68
Granica detekcije ovog detektora znatno je veća od od granice detekcije

termoprovodljivog detektora (Slika 4.23.). Pomoću plameno-jonizacionog detektora ne
mogu da se detektuju: voda, neorganski gasovi, metanska kiselina, freoni, odnosna sva
jedinjenja koja ne mogu da gore. Granica detekcije organskih jedinjenja raste sa
porastom procenta ugljenika u njima, tako da se za iste količine različitih jedinjenja
dobijaju pikovi različitih površina. Granica detekcije ovog detektora zavisi i od brzina
protoka vodonika i vazduha. Povećanje protoka vodonika iznad optimalne vrednosti
smanjuje granicu detekcije.
4.4.3.3. Detektor sa zahvatom elektrona
Detektor sa zahvatom elektrona (ECD) je selektivan za jedinjenja sa

elektronegativnim elementima, posebno sa hlorom, bromom ili fluorom. To je veoma
osetljiv detektor za neke od ovih jedinjenja i u ppt opsegu. Za rad sa ECD detektorom
kao noseći gas neophodan je azot ili argon. ECD detektor se sastoji od kontejnera od
u kome se nalazi ona količina radioaktivnog 63Ni čija je radioaktivnost
5 mCu (1,85 x 1011 Bq). Kontejner sa radioktivnim niklom se nalazi u peći koja se može
termostatski kontrolisati od sobne temperature do 380 oC. U nekim detektorima se
unesto nikla koristi 3H kao β emiter ali je njegova upotreba ograničena na niske
temperature.
Radioaktivni 63Ni se nalazi dobro zatvoren unutar ECD detektora i emituje
elektrone (β čestice) koji se sudaraju sa molekulima nosećeg gasa i jonizuju ih. Ovom
jonizacijom formira se stabilni oblak sporih elektrona u . Primenom
periodičnih impulsa na anodu i katodu održava se konstantna struja elektronskog
oblaka (Slika 4.27). Vrednost stalne struje bira operater, a trenutna vrednost stalne
struje predstavlja broj impulsa kroz . Ako je trenutna vrednost stalne struje
elektronika detektora održavati konstantnu struju od 0,3
nanoampera . Ako vrednost padne ispod zadate vrednosti stalne struje,
broj impulsa u sekundi za održavanje stalne struje (Slika 4.28).
Slika 4.27. Impulsi koji zadaje detektor da se održi stalna struja
Slika. 4.28. Povećani broj impulsa u prisustvu halogenog jedinjenja

da se održi stalna struja
69
Kada jedinjenje sa elektronegativnim atomom, tačnije sa atomom koji ima veliki

afinitet prema elektronu, iz kolone detektora sa zahvatom elektrona, odmah
vezuje neki od slobodnih elektrona i na taj način smanjuje broj slobodnih elektrona u
oblaku. Kada je smanjen broj elektrona se broj impulsa u jedinici vremena za
održavanje konstantne struje jednake zadatoj stalnoj struji. Taj povećani broj impulsa se
konvertuje na analogni izlaz kao signal. Za razliku od drugih detektora koji mere
signala u odgovoru detektora, elektronika detektora sa zahvatom elektrona
meri puls potreban da se održi zadata konstantna struja. Detektor sa zahvatom
elektrona šematski je prikazan na Slici 4.29.
Izolator
Anoda
Radioaktivni emiter
Noseći Noseći
U otpad Sa GC kolone gas- ulaz gas- izlaz
Katoda -Emiter
+ Elektroda - Elektroda
Izolator
Slika. 4.29. Šematski prikazi detektora sa zahvatom elektrona
Površina pika kod detektora sa zahvatom elektrona zavisi od količine eluiranog

jedinjenja. Površina pika takođe zavisi i od afiniteta jedinjenja prema elektronima. Zbog
toga je ovaj detektor izuzetno osetljiv na halogenalkane koji, zahvaljujući halogenu,
imaju veliki afinitet prema elektronima. Takođe, pokazuje i veliku osetljivost, mada
znatno manju nego u odnosu na halogenide, prema konjugovanim karbonilnim
jedinjenjima, nitrilima, nitratima i organometalnim jedinjenjima. Praktično je potpuno
neosetljiv na ugljovodonike, alkohole, ketone i ostala jedinjenja čiji je afinitet prema
elektronima slab. Zbog navedenih osobina vrlo je pogodan za analizu tragova
halogenovanih jedinjenja. Od velike je važnosti za analizu tragova pesticida u
poljoprivrednim proizvodima (ratarskim i povrtarskim) i prehrambenim proizvodima.
70
4.4.3.4. Detektor sa alkalnim plamenom ili azot - fosforni detektor
Azot - fosforni detektor (engl. Nitrogen Phosphorus Detector - NPD), koji se

ponekad naziva i termoelektronski detektor, je veoma osetljiv, specifičan detektor za
jedinjenja koja sadrže azot i/ili fosfor. Iako je njegova konstrukcija veoma slična
plameno jonizacionom detektoru, on radi na potpuno drugačijem principu. Šematski je
azot - fosforni detektor prikazan na Slici 4.30.
Anoda
Kuglica od rubidijuma
ili cezijuma
Konektori
kalema
Plamen
Grejni
kalem
Vazduh
Vodonik
Noseći gas -
helijum
Slika 4.30. Šematski prikaz azot-fosfornog detektora
Senzor azot-fosfornog detektora se razlikuje od onog u plameno jonizacionom

detektoru po tome što sadrži kuglicu (perlu), od rubidijum ili cezijum hlorida, koja se
nalazi unutar grejnog kalema neposredno iznad otvora mlaznice kroz koju prolazi
smeša nosećeg gasa i vodonika. Struja vodonika i vazduha stvara plazmu vodonika oko
zagrejane perle. Zagrejana alkalna kuglica emituje elektrone koji se prikupljaju na anodi
i daju osnovnu struju kroz sistem elektroda. Kada molekuli koji sadrže azot ili fosfor
dospeju u plazmu iz kolone kroz otvor mlaznice dolazi do katalitičke reakcije na površini
perle i dodatne emisije elektrona, samim tim se povećava broj elektrona koji dolazi do
anode, odnosno struja. NPD ima veoma visoku granicu detekcije, 1x10-12 g/ml za fosfor i
1x10-11 g/ml za azot. On je osetljiv i na ugljovodonike ali je granica detekcije za njih oko
100.000 puta manja od granice detekcije za fosforna i azotna jedinjenja.
Osnovni nedostatak ovog detektora je da se njegove performanse pogoršavaju sa
vremenom. Sagorevanjem vodonika stvara se vodena para. Na normalnoj radnoj
71
temperaturi kuglica od alkalnih soli trpi značajan pritisak vodene pare i samim tim,
dolazi do kontinuiranog gubitka rubidijuma ili cezijuma tokom rada detektora. Ovo je
problem sa svih NPD detektora i kod rada sa njima treba redovno menjati perle sa
alkalnim solima.
Azot-fosforni detektor je, kao i plameno jonizacioni, relativno neosetljiv na
pritisak, brzinu protoka i promene temperature, ali se obično termostatira na 260 oC ili
više. Specifičan odgovor NPD na azot i fosfor, zajedno sa ,
čini ovaj detektor posebno korisnim za analizu mnogih farmaceutskih uzoraka, a naročito
uzoraka iz životne sredine koji sadrže herbicide i pesticide
sisteme kolona lako se mogu odrediti tragovi herbicida na nivou 500 pg. Iz pomenutih
razloga, ovaj detektor se često koristi za analizu tragova pesticida i herbicida, koji
sadrže fosfor, u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima.
4.4.3.5. Plameno fotometrijski detektor
Plameno fotometrijski detektor (engl. Flame Photometric Detector - FPD) je jedan

od na detektora u gasnoj hromatografiji. Plameno
fotometrijski detektor analizira svetlost redukcionog plamena koji nastaje
sagorevanjem (zagrevanjem) neke hemiluminiscentne molekulske vrste u struji
vodonika i vazduha. Hemiluminiscencija je optička emisija koja se javlja kada se
ekscitovani molekuli vraćaju u osnovno stanje. Zbog toga što svetlost potiče od
molekularne emisije, trake dobijene na ovaj način su šire i složenije nego trake dobijene
emisijom atoma. Molekuli emituju svetlost karakteristične talasne dužine koja se
propušta kroz odgovarajući filter. Izabrana talasna dužina određuje koji će jedinjenje
biti detektovano. Filtrirana svetlost se meri i pomoću fotomultiplikatora prevodi u
signal.
Plameno fotometrijski detektor je sličan plameno jonizacionom detektoru po
tome što uzorak izlazi iz kolone i ulazi u difuzioni vodonični plamen. Za razliku od
plameno jonizacionog detektora koji meri struju jona proizvodenih od organskih
jedinjenja tokom sagorevanja, plameno fotometrijski detektor analizira spektar svetlosti
koju emituju hemiluminiscentna jedinjenja u plamenu. Komora u kojoj se nalazi
detektor ne sme da propušta svetlost, tako da samo svetlost iz plamena može, kroz
filter, doći do fotomultiplikatora. Kod FPD se koristi drugi protok vodonika koji služi da
očisti optički put između fotomultiplikatora i difuzionog plamena vodonika. Kod PFD se
takođe koristi i drugi protok vazduha usmeren preko staklene površine
fotomultiplikatora koja je okrenuta prema plamenu (“lice” fotomultiplikatora) da spreči
helijum i/ili molekule vodonika da prodiru kroz stakleni prozor fotomultiplikatora i
izazivaju kvar. Plameno fotometrijski detektor šematski je prikazan na Slici 4.31.
72
Slika 4.31. Šematski prikaz plameno fotometrijskog detektora
Filteri mogu biti izabrani za mnoga različita jedinjenja e se koriste za

selektivnu detekciju sumpornih i fosfornih jedinjenja u kompleksnim smešama. Sumporna
jedinjenja se detektuju pomoću emisije ekscitovanog S2. Talasna dužina na kojoj je
maksimalna emisija (Lambda max) S2 je 394 nm. Fosforna jedinjenja se detektuju preko
ekscitovanih molekula HPO (Lambda max = dublet 510-526 nm). Iako nije u potpunosti
selektivan, FPD je oko 100.000 puta osetljiviji na sumporna i fosforna jedinjenja nego na
ugljovodonike. Jedinjenja sumpora kao što su H2S ili SO2 se mogu detektovati u
koncentracijama oko 200 ppb, a fosforna jedinjenja u koncentracijama oko 10 ppb.
Gasna hromatografija sa plameno fotometrijskim detektorom se u analizi hrane
koristi za detekciju neželjenih ukusa (engl. off-flavors) koji nastaju kao rezultat
oslobađanja isparljivih sumpornih jedinjenja. Takođe se koristi i za detekciju pesticida
koji sadrže fosfor i sumpor u poljoprivrednim i prehrambenim proizvodima. U oblasti
životne sredine se koristi za otkrivanje organofosfornih pesticida i herbicida. Nekoliko
EPA metoda za detekciju pestic
. Takođe se koristi za istovremeno otkrivanje sumpora i fosfora u
hemijskim bojnim otrovima. Može se koristiti i za detekciju sumpora u sirovoj nafti i
sumpornih kontaminanata u prirodnom gasu.
4.4.3.6. Maseni spektrometar kao detektor u gasnohromatografskoj analizi
Maseni spektrometar, svakako, ne može da se posmatra kao običan detektor.

Kombinacija gasne hromatografije i masene spektrometrije predstavlja najmoćniju
metodu za razdvajanje i kvalitativnu i kvantitativnu analizu isparljivih organskih
jedinjenja. Detaljan opis ove metode zahteva mnogo prostora i u mnogome prevazilazi
73
obim i namenu ovog rukopisa. Međutim, zbog velikog značaja i široke upotrebe, ovde će
ukratko biti opisani osnovni principi i mogućnosti koje pruža ova metoda.
Gasna hromatografija/masena spektrometrija (GC/MS) je najzastupljenija
analitička tehnika za identifikaciju i kvantifikaciju organskih jedinjenja u složenim
uzorcima. Kombinacija gasnog hromatografa i masenog spektrometra danas je
neophodna u oblasti ekologije, forenzike, zdravstvene zaštite, medicinskih i bioloških
istraživanja, zdravlja i bezbednosti, industrije aroma i poboljšivača ukusa i mirisa,
bezbednosti hrane, pakovanja hrane, i mnogim drugim oblastima.
. Gasni
hromatograf razdvaja komponente smeše u vremenu, a maseni spektrometar pruža
informacije koje pomažu u strukturnoj identifikaciji svake komponente. Ova
kombinacija ima nekoliko prednosti. Prvo, odvaja komponente kompleksne smeše tako
da se dobijaju maseni spektri pojedinačnih jedinjenja za kvalitativne svrhe; drugo, može
da obezbedi kvantitativne informacije o ovim istim jedinjenja. Jonizacione tehnike
masene spektrometrije koje zahtevaju analite u gasnoj fazi su idealne za GC/MS, jer je
isparljivost uzorka uslov za gasnu hromatografiju.
GC/MS može da obezbedi kompletan maseni spektar ako je sadržaj analita u
uzorku oko 1 x 10-10 g. Ovaj spektar daje molekulski jon i fragmentacione jone ili
"hemijski" otisak prsta koji se može koristiti kao osnova za identifikaciju zajedno sa
retencionim vremenima dobijenih gasnohromatografskim razdvajanjem.
Metoda GC/MS je ograničena na analite koji, osim što treba da budu isparljivi,
takođe treba da budu stabilni u gasnohromatografskoj koloni u uslovima razdvajanja
(temperatura kolone, interakcije sa stacionarnom fazom, injektovanje, itd.). Čak i sa
ovim ograničenjem, postoje mnoga jedinjenja koja mogu da budu odvojena i
identifikovana i /MS.
Maseni spektrometar u sistemu GC/MS ima dvostruku ulogu, služi kao detektor i
snima masene spektre eluiranih jedinjenja. Neprekidnim merenjem ukupne jonske
struje (Total Ion Current - TIC), odnosno sume svih jona koji se stvore u jonskom izvoru
za vreme hromatografisanja, dobija se gasni hromatogram. Dobijeni gasni hromatogram
je po izgledu isti kao i gasni hromatogrami dobijeni pomoću nekog od standardnih
gasnohromatografskih detektora. Maseni spektar se dobija merenjem struja koje potiču
od jona razdvojenih prema masa/naelektrisanje (m/z) vrednostima. Maseni spektar
predstavlja zavisnost jačine jonske struje od m/z vrednosti. Intenziteti jonskih struja
(obilnosti jona) u masenom spektru izražavaju (u %) u odnosnu na intenzitet
najobilnijeg jona, koji se zove osnovni jon i njegov intenzitet je 100 %.
Maseni spektrometar se sastoji od sledećih osnovnih delova:

- Jonskog izvora gde se stvaraju joni od analiziranih molekula.
- Masenog analizatora ili filtera masa gde dolazi do razdvajanja jona nastalih u jonskom
izvoru u zavisnosti od odnosa m/z ili m/e.
- Detektora i sistema za obradu podataka.
74
U jonskom izvoru ili jonizacionoj komori dolazi do stvaranja jona od analiziranih

molekula. Do jonizacije molekula, u zavisnosti od konstrukcije jonskog izvora, može doći
na više načina. U GC/MS sistemima najčešće se koriste bombardovanje elektronima sa
visokim sadržajem energije i hemijska jonizacija. Osim ovih načina u masenoj
spektrometriji koriste se još i bombardovanje brzim atomima (Fast Atom Bombardment
- FAB), jonizacija u plazmi (Plasma Desorption Ionisation - PDI), elektrosprej jonizacija
(Electrospray Ionisation - ESI), jon sprej jonizacija (Ion Spray Ionisation - ISI) i laserska
jonizacija (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation - MALDI).
Jonizacija molekula elektronskim bombardovanjem (engl. Electron Impact -EI)
izvodi se u komori koja je smeštena između dva magneta. Elektroni se emitiju sa usijane
katode, koja je napravljena od volframa ili rutenijuma, i imaju energiju od E = 70 eV. Za
jonizaciju molekula dovoljno je 13 eV. Elektroni se na putu prema anodi sudaraju sa
molekulima analita i prilikom sudara im izbijaju jedan elektron i tako nastaju pozitivni
molekulski joni. Nastali joni su nestabilni i dalje se fragmentišu i daju nove jone. Joni
nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka analizatoru masa. Fragmetacija molekulskih
jona je specifična za svako jedinjenje i predstavlja “otisak prsta” jedinjenja. Na slici 4.32
šematski je dat prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima.
M + e- → M+ + 2e-
Odbijač
Filament
(W ili Ru)
Magnet
Magnet
Trap
Fokus
MS
Slika 4.32. Šematski prikaz komore za jonizaciju molekula sudarom sa elektronima
Komora za hemijsku jonizaciju je slična opisanoj komori. Razlika je u tome što se

u ovu komoru uvodi takozvani reagens gas - metan, amonijak, izobutan, u
koncentracijama i 1000 puta većim od koncentracije analita. Elektroni se sudaraju sa
molekulima reagens gasa i jonizuju ih:
75
2 CH4 + 2e- CH4+ + CH3+ +H + 4e-
CH4+ + CH4 CH5+ + CH3
CH3+ + CH4 C2H5+ + H2

Joni nastali jonizacijom molekula reagens gasa su nestabilni i reaguju sa
molekulima analizirane supstance i daju nove jone:
M + CH5+ MH+ + CH4
M + C2H5+ MH+ + C2H4

Proizvod nove jonizacije su takozvani kvazimolekulski joni MH+ čija je
molekulska masa za 1 veća od molekulske mase jedinjenja. Ovi joni su stabilniji od jona
koji se dobijaju elektronskim bombardovanjem i samo se delimično fragmentišu.
Joni nastali u jonskom izvoru se usmeravaju ka masenim analizatorima -
filterima, gde se razdvajaju po masama. Za razdvajanje jona po masama u sistemima
gasni hromatograf / maseni spektrometar najčešće se koriste magnetni analizator
(magnetno polje) i kvadrupolni maseni analizator. Osim ovih načina u masenoj
spektrometriji koriste se i sledeći analizatori masa: analizator koji meri vreme
preletanja jona (engl. time-of-flight, TOF) i jonski trap (engl. ion trap analyser).
Joni razdvojeni u masenom analizatoru dolaze do detektora gde se registruju u
obliku signala. Što ima više jona sa određenim odmosom m/z dobija se intenzivniji
signal. Jon koji daje najintenzivniji signal zove se osnovni jon i uzima se da je intenzitet
tog signala 100%. Intenziteti ostalih signala se daju kao procenti od osnovnog signala.
Svaki molekul se fragmentiše (raspada) na jone na isti način pod istim uslovima.
Grafički prikaz zavisnosti intenziteta signala od odnosa m/z zove se maseni spektar.
Maseni spektar je karakterističan za svako jedinjenje i zove se još i “otisak prsta”.
Intenzitet pika je direktno proporcionalan vremenu života jona. Stabilan jon traje duže i
daje intenzivniji pik. Visokoenergetski joni su nestabilni i kratkoživući, pa ne “traju”
dovoljno dugo da stignu do detektora. Šematski prikaz sistema gasni
hromatograf/maseni spektrometar dat je na Slici 4.33.
Slika 4.33. Šematski prikaz sistema gasni hromatograf/maseni spektrometar
76
4.4.4. Izbor radnih uslova u gasnoj hromatografiji
Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za

što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i
dobru razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od niza činilaca od kojih su
najvažniji:
- Hemijska i fizička svojstva jedinjenja koja se razdvajaju, u prvom redu, njihova

polarnost i napon pare;
- Hemijska i fizička svojstva stacionarne faze - polarnost, viskozitet i termička stabilnost;
- Brzina protoka nosećeg gasa;
- Temperatura kolone i
- Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze.
Činioci koji se odnose na hemijska i fizička svojstva analita i stacionarne faze, kao
i brzinu protoka nosećeg gasa, su detaljno razmatrani u prethodnim poglavljima (1.2.2.;
4.4.1. i 4.4.3.). U ovom poglavlju će biti razmatran uticaj temperaturnog režima i
karakteristika kolone na gasno-hromatografsku analizu.
4.4.4.1. Temperatura kolone
Izbor temperature kolone zavisi od termičke stabilnosti njene tečne stacionarne

faze i od osobina jedinjenja koja se razdvajaju. Minimalnu i maksimalnu temperaturu na
kojoj se može koristiti kolona daje proizvođač i u ovom opsegu temperatura kolona ima
optimalne karakteristike. Zagrevanje preko maksimalne temperature dovodi do
termičke degradacije polimera stacionarne faze, isparavanja i eluiranja stacionarne faze
- curenja kolone. Rad na nižoj temperaturi od minimalne preporučene temperature,
znatno smanjuje efikasnost kolone, zbog toga što su viskoziteti tečnih faza na tim
temperaturama veliki, neke mogu preći i u čvrsto agregatno stanje. Postoje dve vrste
temperaturnih režima: izotermalni - konstantna temperatura kolone i programirani -
temperatura se linearno podiže.
Raspodela analiziranog jedinjenja između tečne i gasovite faze veoma zavisi i od
temperature. Koeficijent raspodele se porastom temperature kolone za 30 °C smanjuje
za polovinu u najvećem broju slučajeva. Kao posledica povećanja temperature dolazi do
bržeg eluiranja supstanci sa kolone, smanjivanja njihovih retencionih vremena i
smanjivanja širine bazne linije pika, što je prikazano na Slici 4.34. Sa povećanjem
temperature smanjuje se i razlika u retencionim vremenima, odnosno opada i stepen
razdvajanja i potrebno je za svaku analiziranu smešu odabrati kompromisnu
temperaturu koja će obezbediti dobro razdvajanje, sa uskim pikovima za kratko vreme.
77
Optimalna radna temperatura kolone zavisi od niza faktora od kojih su najvažniji: tačke
ključanja analiziranih komponenti, njihova polarnost, polarnost tečne faze, debljina
filma tečne faze i dužina kolone.
a) T = 100 °C, izotermalno, širina pika(2) 1,4 minuta b) T = 130 °C, izotermalno,
širina pika(2) 0,5 minuta
Slika 4.34. Hromatogrami smeše hromatografisane pod istim uslovima na dve različite
temperature pri izotermalnom režimu
Izotermalni temperaturni režim se primenjuje na smeše jedinjenja čije se tačke

ključanja i polarnosti nalaze u relativno uzanim opsezima. Kod razdvajanja smeša u
kojima postoji širok opseg tačak ključanja, pod izotermalnim uslovima će najisparljivija
jedinjenja da se eluiraju isuviše brzo, a najmanje isparljiva suviše sporo.
Programirani temperaturni režim podrazumeva linerano povećavanje temperature
kolone nakon ubrizgavanja uzorka. Najčešće se primenjuje linearno programiranje
temperature. Temperatura se od početne postepeno povećava do zadate temperature
određenom brzinom, na primer 5 °C / min. Primenjuje se i multilinearno programiranje,
temperatura se od početne do prve zadate temperature linearno povećava određenom
brzinom, na toj temperaturi kolona ostaje određeno vreme, a zatim linearno povećava
do druge zadate temperature brzinom koja može biti ista ili različita sa prvom brzinom.
Primena programiranja temperature ima mnogo prednosti u odnosu na izotermalni
režim od kojih su najvažnije sledeće:
- Znatno kraće vreme analize;
- Podjednako dobro razdvajanje komponenti sa niskim i visokim tačkama ključanja;
- Ujednačene širine osnova pikova i
- Minimalno zaostajanje komponenti sa visokim tačkama ključanja na koloni.
78
4.4.4.2. Karakteristike kolone - dužina, prečnik i debljina sloja stacionarne faze
Dužina kolone je direktno proporcionalna efikasnosti, odnosno broju teorijskih

podova. Hromatografisanje na dužim kolonama daje bolju rezoluciju, međutim, udvostručena
1,4, dok su troškovi i vreme analize
proporcionalni dužini kolone. Uticaj dužine kolone na rezoluciju i retenciono vreme
prikazan je na Slici 4.35. Rutinska razdvajanja e sa kolonama dužine 25
ili 30 m, dok se za razdvajanja složenih smeša koriste duže kolone 50 ili 60 m.
Kapilarne kolone se proizvode sa unutrašnjim prečnicima od 0,1 do 0,530 mm.
Što je manji prečnik kolone veći je broj teorijskih podova po metru kolone ali je manji
kapacitet. Uticaj unutrašnjeg prečnika kolone na rezoluciju prikazan je na Slici 4.36.
Najčešće se koriste kolone sa unutrašnjim prečnikom od 0,25 mm. Kolone sa većim
prečnicima od 0,32 i 0,53 mm se koriste za rutinske analize jednostavnijih smeša i lako
isparljivih jedinjenja, kao i koncentrovanijih uzoraka jer imaju veći kapacitet.
r = 0,53 mm r = 0,32 mm
Slika 4.36. Uticaj unutrašnjeg prečnika

Slika 4.35. Uticaj dužine kolone na
kolone na rezoluciju
rezoluciju i retenciono vreme
Debljina filma u GC kapilarnim kolonama se kreće od 0,1 do 5,0 µm. Standardna

debljina filma je 0,25 µm. Tanki filmovi (0,1 - 0,2 µm) su veoma pogodni za razdvajanje
jedinjenja sa visokim tačkama ključanja ili nestabilnih jedinjenja, za razdvajanje
supstanci sa vrlo sličnim osobinama (sa bliskim retencionim vremenima) i brza
razdvajanja. Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne
faze prikazana je na Slici 4.37. Sa p anjem debljine filma se ava kapacitet
kolone, povećavaju se retenciona vremena jedinjenja sa niskim tačkama ključanja i
poboljšava inertnost. Veća debljina filma takođe znači više stacionarne faze u koloni, a
samim tim i e curenje. Ovo rezultira nižim maksimalnim radnim temperaturama za
kolone sa debljim filmovima.
79
Debljina filma
0,25 µm
Debljina filma
1,00 µm
Slika 4.37. Zavisnost rezolucije i retencionih vremena od debljine filma stacionarne faze
4.4.5. Kvalitativna gasnohromatografska analiza
Danas se kvalitativna gasnohromatografska analiza radi najčešće korišćenjem

GC/MS metode gde gasni hromatograf služi da razdvoji komponente smeše, a maseni
spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti. Poređenjem masenih
spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih jedinjenja vrši se
identifikacija nepoznatih komponenti smeše. Svi sistemi gasni hromatograf - maseni
spektrometar danas se isporučuju sa bibliotekom masenih spektara velikog broja
jedinjenja u elektronskom obliku. Osim toga, komercijalno su dostupne biblioteke
masenih spektara u elektronskom obliku, kao i programi za njihovo korišćenje,
odnosno brzu pretragu i poređenje. U slučaju analize jednostavnijih smeša i dobrog
preklapanja dobijenih masenih spektara sa literaturnim, maseni spektar je dovoljan za
identifikaciju jedinjenja prisutnih u smeši.
Međutim, kod analiza složenih smeša koje sadrže komponente sa sličnim
retencionim vremenima i gde nije postignuta najbolja rezolucija, dobijeni maseni spektri
mogu biti značajno različiti od literaturnih i onda je neophodno koristiti i retencione
parametre za identifikaciju komponenti smeše. Svi retencioni parametri su detaljno
opisani u Poglavljima 1.2.1 i 4.1. Retenciono vreme nekog jedinjenja zavisi od njegovih
fizičko - hemijskih osobina i uslova hromatografisanja i, ako su uslovi hromatografisanja
identični, predstavlja karakterističnu veličinu za neko jedinjenje. Kako retenciono
vreme zavisi od velikog broja spoljašnjih faktora, uslova hromatografisanja, koje jako
teško kontrolisati, koriste se podešeno retenciono vreme, korigovano retenciono vreme
i relativno retenciono vreme. Relativno retenciono vreme (t'r) je odnos retencionog
vremena posmatrane komponente i retencionog vremena standarda:
t'rk = trk / trs
gde je trk - retenciono vreme komponente, a trs - retenciono vreme standarda.
80
Kao standard se obično koristi sastojak smeše sa najmanjim retencionim

vremenom. Na relativno retenciono vreme, od spoljašnjih činilaca, utiču samo
temperatura kolone i vrsta tečne stacionarne faze. Zbog jednostavnog određivanja i
visoke reproduktivnosti, relativno retenciono vreme se najčešće koristi u kvalitativnoj
analizi. Kombinacijom podataka o retencionim parametrima i literaturnih masenih
spektara dolazi se do nedvosmislene identifikacije nepoznatog jedinjenja.
4.4.6. Kvantitativna gasnohromatografska analiza
Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet

gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog
jedinjenja. Najednostavniji način za određivanje koncentracije datog jedinjenja bio bi merenje
površine pika i deljenjem te površine sa zbirom površina svih pikova. Međutim, ovakav
način određivanja koncentracije je povezan sa mnogim ograničenjima od kojih su
najčešća:
- Različite osetljivosti detektora na različita jedinjenja.
- Smanjenje intenziteta ili potpuno odsustvo pika usled trajnog zadržavanja pojedinih
jedinjenja na koloni ili termičkog razlaganja u isparivaču ili koloni.
- Način uzimanja uzorka i način injektovanja.
4.4.6.1. Metoda normalizacije površina
Metoda normalizacije površina je najbrža i najednostavnija metoda za

određivanje procentnog sastava analizirane smeše. Danas se hromatografi prodaju sa
računarima koji služe za obradu podataka. Ovi računari su snabdeveni programima za
izračunavanje površina pikova i izračunavanje procenata svake površine pika u smeši.
Greške do kojih može doći zbog različitih osetljivosti detektora na različita jedinjenja
mogu biti svedene na minimum korišćenjem računarskih programa sa korekcionim
faktorima koji su komercijalno dostupni i isporučuju se sa aparatom. Ovi programi
omogućavaju i eliminciju pikova koji potiču od rastvarača (znatno veći od ostalih
pikova) i eventualno prisutnih nečistoća (priprema uzorka, curenje kolone i slično).
4.4.6.2. Metoda internog standarda
Metoda internog standarda je najpreciznija metoda za kvantitativnu analizu i

podrazumeva prethodnu pripremu kalibracionih krivih za svako jedinjenje čija se
koncentracija određuje. Kalibraciona kriva se pravi hromatografisanjem standardnih
rastvora koji sadrže različite masene odnose jedinjenja koje se određuje i standarda.
Obično se rastvori prave tako što se odmerava ista masa standarda za sve rastvore i
81
različite mase ispitivane supstance. Standardni rastvori se hromatografišu pod istim

uslovima, određuju se površine pikova PA i PS, a kalibraciona kriva (za jedinjenje A)
konstruiše se nanošenjem količnika PA / PS u zavisnosti od mA (Slika 4.38).
Jedinjenje koje se koristi kao interni standard mora da zadovolji sledeće uslove:
- Da se dobro rastvara u analiziranoj smeši i da bude hemijski slično komponentama
koje se određuju;
- Da bude hemijski inertno u odnosu na sastojke smeše i stacionarnu fazu kolone;
- Njegov pik ne sme da se preklapa ni sa jednim iz analizirane smeše, ali je poželjno da
ima retenciono vreme blisko retencionim vremenima komponenti;
- Mora da postoji pouzdan podatak da to jedinjenje ne može da se pojavi u prirodnom
uzorku (kod analize metil estra masnih kiselina kao interni standard se uzima metil
estar masne kiseline sa neparnim brojem ugljenikovih atoma, zbog toga što se
biosintezom uvek dobijaju masne kiseline sa parnim brojem ugljenikovih atoma).
Slika 4.38. Kalibraciona kriva za jedinjenje A
Posle konstruisanja kalibracione krive, u uzorak se dodaje odmerena količina

standarda, ista kao u standardnim rastvorima za pravljenje kalibracione krive. Uzorak
se zatim hromatografiše na isti način kao i standardni rastvori. Mere se površine pikova
standarda i jedinjenja koje se određuje i na osnovu njihovog količnika određuje masa
supstance jedinjenja koje se određuje - crvena linija na slici 4.38. Kalibraciona kriva se
pravi za svako jedinjenje čija se koncentracija određuje. Dobra strana metode je što
promena uslova hromatografisanja (temperatura kolone, detektora i injektora, kao i
protok nosećeg gasa) ne utiču bitno na tačnost rezultata, odnosno na sličan način utiču i
na standard i na analizirano jedinjenje. Metoda je veoma tačna i nije neophodno da se u
gasni hromatograf uvek injektuju iste zapremine.
Ako se ova metoda koristi za određivanje malih koncentracija, kao što su tragovi
pesticida u hrani, tragovi veterinskih lekova u animalnim proizvodima, biomedicinske
analize itd., potrebno je prethodno prečišćavanje uzorka. Prethodno prečišćavanje
uzorka podrazumeva nekoliko koraka: ekstrakciju, hromatografiju na koloni ili
82
tankoslojnu hromatografiju i derivatizaciju. Kod svakog od ovih koraka može doći do

gubitaka supstance koja se određuje. Da bi se ovi gubici kompenzovali, interni standard
se dodaje u smešu koja se analizira pre prečišćavanja. Na taj način su praktično
približno jednaki gubici i internog standarda i analizirane supstance, tako da se njihov
maseni odnos praktično ne menja.
4.4.6.3. Metoda standardnog dodatka
Za analizu malih koncentracija supstanci bez prethodnog prečišćavanja uzorka,

na primer alkohola u krvi, koristi se metoda standardnog dodatka. Vrlo je često da se
pik primese čija se koncentracija određuje nalazi na repu signala glavne komponente.
Kod ove metode, tačno odmerena, uvek ista zapremina uzorka se više puta
hromatografiše pod istim uslovima i odredi srednja visina pika jedinjenja koje se
određuje (h1). Zatim se u uzorak doda tačno odmerena količina supstance koja se
određuje (najbolje približno jednaka količini supstance u uzorku) i ponovo više puta
hromatografišu iste zapremine pod istim uslovima i odredi srednja visina pika (h2). Na
osnovu razlike u visini pikova h2 i h1, dobija se visina (h) koja je proporcionalna količini
dodatog standarda i na osnovu te visine se određuje količina supstance:
a = h1 x b / h
gde je:
a - količina supstance koja se određuje
b - odmerena količina supstance koja se određuje.
4.4.7. Reakcije derivatizacije u gasnoj hromatografiji
Cilj ovih reakcija je prevođenje neisparljivih jedinjenja u stabilne isparljive

derivate pogodne za hromatografisanje, kao i za snimanje masenih spektara. Pored toga,
promena retencionog vremena izazvana derivatizacijom, često omogućava i identifikaciju
funkcionalnih grupa u nepoznatom jedinjenju. Svaka hemijska reakcija koja se koristi za
derivatizaciju mora da zadovolji sledeće uslove:
- Velika brzina reakcije;
- Kvantitativan prinos reakcije;
- Blagi reakcioni uslovi;
- Minimum sporednih proizvoda;
- Termička stabilnost nagrađenog derivata i
- Jednostavna obrada reakcione smeše pre hromatografisanja.
Najčešće se derivatizuju jedinjenja koja sadrže aktivne vodonikove atome vezane
za azot ili kiseonik, kao što su: karboksilne kiseline, alkoholi, fenoli, ugljeni hidrati,
83
amini i amino kiseline. Osim njih derivatizuju se i jedinjenja velike molekulske mase sa
polarnim grupama, kao što su amidi i steroidi.
Danas je komercijalno dostupan veliki broj reagenasa za brzu derivatizaciju
glavnih funkcionalnih grupa. Ovi reagensi su dostupni kao pojedinačni ili kao kompleti
za derivatizaciju više funkcionalnih grupa ili više reagenasa za derivatizaciju jedne
funkcionalne grupe (na primer kit-ovi za derivatizaciju masnih kiselina). U Tabeli 4.3. su
prikazane najčešće metode za derivatizaciju funkcionalnih grupa, nagrađeni derivati i
komercijalni nazivi reagenasa. Strukture i imena reagenasa za derivatizaciju nalaze se u
Tabeli 4.4.
Tabela 4.3. Derivatizacija funkcionalnih grupa
Klasa jedinjenja Metod Derivat Komercijalni reagensi
Alkoholi Sililovanje RO – TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TSIM, SILYL‑2110,

SILYL-21, SILYL-1139
Fenoli Acilovanje RO – CO – R TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA

Alkilovanje RO – R TMSH
Sililovanje RO – TMS TSIM, BSTFA, SILYL-991
Amini (prim. i Sililovanje R–NR’– TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, SILYL-991
sekundarni) Acilovanje R–NR’–CO– R TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA
Hidrohloridi Sililovanje R – NR’ –TMS MSTFA
Amidi Acilovanje R’–CO–NH-CO – R TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA
Amino kiseline Sililovanje BSA, BSTFA, MSTFA, MSHFBA
Alkilovanje MeOH/TMCS, TMSH

Acilovanje TFAA, HFBA, MBTFA, MBHFBA
Sililovanje R–CO–O –TMS BSA, MSTFA, MSHFBA, TMCS, TSIM,
Masne kiseline SILYL-2110, SILYL-21
Alkilovanje R’ – CO – O – R DMF-DMA, MeOH/TMCS, TMSH
Soli masnih k. Sililovanje R–CO–O – TMS TMCS
Ugljeni hidrati Sililovanje - MSTFA, TSIM, HMDS, SILYL-1139

Acilovanje TFAA, MBTFA
Steroidi Sililovanje - BSA, TSIM
Acilovanje TFAA, MBTFA, HFBA, MBHFBA
84
Tabela 4.4. Reagensi za derivatizaciju
Komercijalno ime Formula Hemijsko ime

BSA N,O-bis(trimetilsilil)acetamid
MSTFA N-Metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamid
MSHFBA N-Metil-N-trimetilsililheptafluorobutilamid
TSIM N-Trimetilsilil-imidazol
SILYL-2110 Heksametildisilazan (HMDS) –

trimetilhlorsilan(TMCS) – piridin 2:1:10
HMDS
TCMS
SILYL-21 Heksametildisilazan (HMDS) –
trimetilhlorsilan(TMCS) 2:1
SILYL-1139 N-Trimetilsilil-imidazol (TSIM) – piridin 11:39
SILYL-991 N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid(BSTFA)–
trimetilhlorosilan (TMCS) 99:1
BSFTA N,O-bis-trimetilsilil-trifluoroacetamid
TFAA Anhidrid trifluorosirćetne kiseline
HFBA Anhidrid heptafluorobutanske kiseline
MBTFA N-Metil-bis(trifluoroacetamid)
MBHFBA N-metil-bis(heptafluorobutilamid)
TMSH Trimetilsulfonijum-hidroksid
TMCS Trimetilhlorosilan
DMF-DMA 1,1-Dimetoksi-N,N-dimetilmetilamin
85
4.5. Primena gasne hromatografije u analizi poljoprivrednih

i prehrambenih proizvoda
Gasna hromatografija ima veoma široku primenu u analizi hrane. Veliki broj
gasnohromatografskih metoda je standardizovan i rutinski se koristi u analizi hrane.
Spisak standarnih gasnohromatografskih metoda koji se koriste u analizi hrane je
veoma dugačak i prevazilazi okvire ovog rukopisa. Gasna hromatografije se koristi za
analizu, kako osnovnih sastojaka hrane, tako i za analizu kontaminanata koji u hranu
dospevaju na različite načine. Značajnu primenu gasna hromatografija ima i u analizi
aromatskih kopleksa pojedinih prehrambenih proizvoda kao što su: sir, vino, pivo, neki
proizvodi od mesa kojima se dokazuje autentičnost, odnosno geografsko poreklo ovih
proizvoda. O primeni ove metode bilo je reči i u prethodnim poglavljima koja se odnose
na kolone i detektore.
Gasnohromatografske metode u analizi hrane možemo podeliti u dve osnovne
grupe: metode za određivanje prirodnih sastojaka hrane i metode za određivanje
toksičnih supstanci u hrani dospelih zagađivanjem hrane.
U prvu grupu spadaju metode za određivanje masnih kiselina, koje se pre određivanja
prevode u odgovarajuće derivate, vidi Tabelu 4.3. U ovu grupu spadaju i metode za
određivanje aromatičnih materija u hrani, kao i materija koje utiču na ukus hrane.
U drugu grupu spadaju metode za određivanje toksičnih materija koje na
različite načine mogu da dospeju u hranu. Sigurno su najvažnije metode za određivanje
pesticida u hrani, polihlorovanih bifenila (PCB), polihlorovanih dibenzo-p-dioksina i
dibenzofurana, policikličnih aromatičnih ugljovodonika (PAH), akrilamida, ftalata,
estara adipinske kiseline itd. Veliki broj toksina se pre određivanja prevodi u
odgovarajuće derivate, kao na primer: veterinarski lekovi, mikotoksini, hloropropanoli,
heterociklični amini, epoksi jedinjenja itd.
Danas se sve više unapređuju osobine gasnohromatografskih kolona, pomeraju
granice osetljivosti detektora, razvijaju i koriste metode kuplovanih tehnika kao što su
GC/GC/MS, GC/MS/MS itd. Sve ovo omogućava razdvajanje i određivanje velikog broja
supstanci iz najrazličitijih supstrata u veoma niskim koncentracijama. Oblast primene
gasne hromatografije u analizi hrane i, uopšte, u analitičkoj hemiji se svakodnevno
proširuje.
Rezime poglavlja
U gasnoj hromatografiji (GC) mobilna faza je gas a stacionarna faza je čvrsta (GSC)
ili tečna (GLC). Gasna hromatografija je u širokoj upotrebi u analizi hrane, naftnih
derivata,
, kliničkoj hemiji i
86
brojnim drugim oblastima. Glavne prednosti moderne gasne hromatografije su: visoka
rezolucija, brzina, osetljivost, preciznost i tačnost.
Osnovne komponente gasnog hromatografa su: cilindar sa nosećim gasom,
regulator pritiska gasa, merač protoka gasa, injektor, gasnohromatografska kolona,
termostati, detektor, računar za obradu podataka i štampač.
Cilj svake gasno-hromatografske analize je da se postigne što bolje razdvajanje za
što kraće vreme. To podrazumeva kratka retenciona vremena, uzane i pravilne pikove i dobru
razdvojenost svih pikova. Navedeni faktori zavise od: hemijskih i fizičkih svojstava analita
i stacionarne faze, temperature i karakteristika kolone.
Kvalitativna gasnohromatografska analiza se radi najčešće korišćenjem metode
gasna hromatografija - masena spektrometrija, gde gasni hromatograf služi da razdvoji
komponente smeše, a maseni spektrometar da snimi masene spektre izolovanih komponenti.
Poređenjem masenih spektara izolovanih komponenti sa masenim spektrima čistih
jedinjenja vrši se identifikacija nepoznatih komponenti smeše.
Kvantitativna gasnohromatografska analiza se zasniva na činjenici da je intenzitet
gasnohromatografskog signala - površina pika, proporcionalan količini analiziranog
jedinjenja. Površina pika, osim od koncentracije, zavisi i od mnogih drugih faktora. Iz tog
razloga koncetracije analiziranih supstanci se određuju: metodom normalizacije površina,
metodom internog standarda i metodom standardnog dodatka.
1. Koja su tri osnovna faktora koji dovode do širenja hromatografskih zona u

koloni? Objasniti kako dolazi do širenja zona.
2. Objasniti split i splitless režim injektovanja. Koje su prednosti, a koji nedostaci
ovih načina injektovanja? U kojim slučajevima se koristi split, odnosno splitless
režim?
3. Šta je statični, a šta dinamični headspace?
4. Koji su najvažniji zahtevi koje čvrsti nosač treba da zadovolji kod pakovanih
kolona?
5. Koje kriterijume treba da zadovolji stacionarna faza?
Literatura


87
3. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry

– A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, 1996.
4. S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication®, Aspen

Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, 1998.
5. R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 2, Library4science,

2003.
6. R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 4,

Library4science, 2003.

San Diego, 2003.

10. F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and

Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2007.
11. R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry,

John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2008.
12. S. Ötles (Ed.)¸ Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis
Group, Boca Raton - New York, 2009.
13. O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass

Spectrometry – A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, 2011.
14. Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA, 2014.
88
5. Tečna hromatografija visokih performansi – HPLC
Cilj poglavlja
Upoznavanje sa principom rada tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i

osnovnim delovima HPLC sistema. Upoznavanje sa kvalitativnim i kvantitativnim
određivanjem jedinjenja primenom HPLC tehnike, kao i sa različitim režimima
razdvajanja - na osnovu polarnosti, naelektrisanja i veličine molekula. Opis afinitetne
hromatografije kao najspecifičnijeg oblika visokoefikasne tečne hromatografije. Prikaz
primene HPLC tehnike u analizi prehrambenih proizvoda.
5.1. Uvod u HPLC
Tečna hromatografija (engl. Liquid Chromatography, LC), je tehnika

hromatografskog razdvajanja kod koje je mobilna faza tečnost. Tečna hromatografija
može biti planarna (hromatografija na papiru ili tankom sloju) ili hromatografija u
koloni. Moderna tečna hromatografija, kod koje se koriste manje čestice za pakovanje
kolona i veći pritisci u koloni naziva se tečnom hromatografijom visokih performansi. Za
tečnu hromatografiju visokih performansi, koja se ranije označavala kao tečna
hromatografija pod visokim pritiskom, odomaćena je skraćenica HPLC, koja predstavlja
akronim od High-Performance (pressure) Liquid Chromatography (engl.). Od 2004.
godine, tečna hromatografija ultra performansi, UPLC (engl. Ultra-Performance Liquid
Chromatography), dramatično je podigla mogućnosti tečne hromatografije na još viši
nivo.
Kao što je već pomenuto, tehniku tečne hromatografije je definisao ruski
botaničar Mihail Cvet početkom dvadesetog veka, kada je razdvojio pigmente iz listova
biljaka, nanoseći ekstrakt na kolonu pakovanu kalcijum-karbonatom i zatim
propuštajući rastvarač, što je dovelo do pojave traka različitih boja, usled različite
brzine kretanja komponenti ekstrakta kroz kolonu, Slika 5.1. Cvet je povezao te
razdvojene, obojene trake sa različitim jedinjenjima koja su bila prisutna u ekstraktu
pigmenata. Analitičko razdvajanje pigmenata zasnivalo se na različitoj jačini vezivanja
svakog pojedinačnog jedinjenja za čestice pakovane kolone. Jedinjenja koja su bila jače
vezana kretala su se sporije, dok su se jedinjenja koja su bila slabije vezana kretala brže
kroz kolonu. Ovaj proces se može opisati na sledeći način: jedinjenja koja sadrži uzorak
raspodeljuju se između rastvarača koji se kreće, i označava se kao mobilna faza, i čestica
kojima je punjena (tj. pakovana) kolona, i koje se označavaju kao stacionarna faza. Ovo
omogućava da se svako pojedinačno jedinjenje kreće različitom brzinom, što vodi
razdvajanju jedinjenja određene smeše. Kovanicu hromatografija predložio je Cvet
(hroma – boja i graphein – pisati), da bi opisao svoj eksperiment. Zanimljivo, prezime
89
Tečna hromatografijavisokih performansi - HPLC
ovog naučnika, Cvet (рус. Цвет), na ruskom znači boja. U današnje vreme, tečna
hromatografija, u svojim različitim oblicima, je postala jedna od najmoćnijih metoda u
analitičkoj hemiji.
Ekstrakt
biljaka
Slika 5.1. Eksperiment M. Cvet-a
5.2. Tehnike tečne hromatografije
Tečna hromatografija može biti planarna (hromatografija na tankom sloju ili na

papiru) ili hromatografija na koloni. Kod svih ovih tehnika, uzorak se najpre mora
rastvoriti a zatim naneti na/u uređaj za hromatografisanje. Na primeru razdvajanja
smeše FD&C boja, koje se koriste u prehrambenoj industriji, prikazan je dalje u tekstu
princip hromatografije na tankom sloju, papiru i u koloni.
Kod hromatografije na tankom sloju (engl. thin-layer chromatography, TLC)
uzorak se kreće kroz tanki sloj čestica (stacionarna faza) koje su fiksirane na površini
staklene ploče (Slika 5.2). Donja ivica ploče je smeštena u rastvarač. Do protoka
rastvarača dolazi zahvaljujući kapilarnim silama, kada rastvarač (mobilna faza)
difunduje u tanki sloj suvih čestica i “penje se” uz staklenu ploču. Obratite pažnju da je
crni uzorak (Slika 5.2, levo) smeša FD&C žute, crvene i plave boje koje se koriste u
industriji hrane i koja se hromatografski razdvaja (Slika 5.2, desno).
Kod hromatografije na papiru, uzorak se nanosi na papir (nosač stacionarne
faze), a rastvarač se zatim nanosi na centar mrlje (tj. uzorka), da bi se postigao spoljašnji
radijalni protok. Ovo je jedan od oblika hromatografije na papiru. Klasična papirna
hromatografija se izvodi na način sličan opisanoj hromatografiji na tankom sloju, sa
90
linearnim tokom tečnosti. Na Slici 5.3 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C
boja papirnom hromatografijom.
Kadica za
analizu
Rastvarač Rastvarač
Nulto vreme Posle 10 minuta
Slika 5.2. Tankoslojna hromatografija – razdvajanje FD&C boja za industriju hrane
Očigledna je razlika u moći razdvajanja ove vrste papirne hromatografije i

hromatografije na tankom sloju. Zeleni prsten ukazuje da se ovom tehnikom ne mogu
razdvojiti žuta i plava boja jedna od druge, ali se ove boje mogu odvojiti od crvenih boja
(vrh Slike 5.3). Na dnu Slike 5.3, zeleni uzorak, koji čine žuta i plava boja, nanesen je na
papir. Kao što se može videti, ove dve boje se ne mogu razdvojiti primenjenom
tehnikom. U sredini Slike 5.3, ljubičasti uzorak, koji čine crvena i plava boja, nanesen je
na papir. Očigledno je da se ove boje mogu razdvojiti primenjenom tehnikom
hromatografije na papiru.
Žuta 5
Plava 1 / Žuta 5
Crvena
Crvena 3
40
Crvena 40
Plava 1
Opaska: ovaj papir ne

može da razdvoji plavu
Plava 1 / Žuta 5 od žute boje, pa se one
pojavljuju kao zelena!
Slika 5.3. Hromatografija na papiru – razdvajanje FD&C boja za industriju hrane
91
Kod hromatografije u koloni uzorak prolazi kroz kolonu (ili kertridž – engl.
cartridge), koja sadrži odgovarajuče čestice (stacionarna faza). Te čestice se još nazivaju
materijal za pakovanje hromatografske kolone. Rastvarač (mobilna faza) teče, tj. kreće
se kroz kolonu i pri tome struja rastvarača nosi uzorak kroz kolonu. Kao i u Cvet-ovom
eksperimentu, jedinjenja iz uzorka se razdvajaju zahvaljujući različitim brzinama
putovanja kroz kolonu. Na Slici 5.4 prikazana je analiza već pomenutog uzorka FD&C
boja primenom ekstrakcije čvrstom fazom (engl. Solid-Phase Extraction, SPE). U tehnici
ekstrakcije čvrstom fazom koristi se uređaj za hromatografisanje koji se zove kertridž,
obično uz protok rastvarača pod dejstvom sniženog pritiska. Ekstrakcija čvrstom fazom
koristi se da bi se analizirale ili prečistile veoma kompleksne smeše pre njihovog daljeg
ispitivanja. Kao što je prikazano na Slici 5.4, različiti rastvarači su korišćeni u svakom
pojedinačnom koraku da bi se postiglo razdvajanje smeše FD&C boja.
Kada se koristi oblik kertridža, postoji nekoliko načina da se postigne
odgovarajući protok rastvarača. Gravitacija ili vakuum se koriste za kolone koje nisu
dizajnirane da izdrže povišeni pritisak. Čestice su u tom slučaju većeg promera (> 50
mikrona), tako da pružaju manji otpor proticanju rastvarača. Za prečišćavanje i
pripremu uzoraka takođe mogu da se koriste i male plastične kolone, koje imaju oblik
šprica, i koje su napunjene odgovarajućim materijalom za pakovanje.
Čestice manjih dimenzija (<10 mikrona) su potrebne da bi se povećala moć
razdvajanja. Međutim, manje čestice daju veći otpor protoku tečne faze, pa su potrebni
viši pritisci da bi se dobila odgovarajuća brzina proticanja rastvarača. Tada su potrebne
pumpe i kolone dizajnirane tako da mogu da proizvedu i izdrže visok pritisak. Ako se
primenjuju umereno visoki do visokih pritisaka da bi rastvarač tekao kroz
hromatografsku kolonu, tada se hromatografska tehnika naziva HPLC.
Eluiranje Eluiranje Eluiranje
Nanošenje Stupanj 1 Stupanj 2 Stupanj 3
uzorka
Opaska: plava boja se

može eluirati smešom
izopropilalkohol/voda
Jedan kertridž može da razdvoji sve tri boje
Slika 5.4. Hromatografija na koloni (ekstrakcija čvrstom fazom) – razdvajanje FD&C

boja za prehrambenu industriju
92
5.3. Šta je HPLC?
Akronim HPLC, predložen od strane prof. Horváth-a 1970. godine, pre svega je
ukazivao na činjenicu da se u tečnoj hromatografiji, kada se primenjuju pakovane
kolone, koristi visok pritisak da bi se omogućio protok rastvarača. U početku, pumpe su
imale sposobnost da proizvedu pritisak od 500 psi (35 bar). Takva tehnika je označena
kao tečna hromatografija pod visokim pritiskom, HPLC (engl. High-Pressure Liquid
Chromatography). Početkom 1970. godine dolazi do ogromnog tehnološkog napretka,
pa su novi HPLC instrumenti mogli da razviju pritisak do 6000 psi (400 bar) i uključivali
su unapređene i poboljšane injektore, detektore i kolone. Sa daljim poboljšanjem
performansi instrumenata (manje čestice za pakovanje kolona, još viši pritisci), akronim
HPLC ostaje isti, ali se naziv menja u tečna hromatografija visokih performansi (engl.
High-Performance Liquid Chromatography).
Tečna hromatografija visokih performansi je danas jedna od najmoćnijih tehnika
u analitičkoj hemiji. Ona pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog
određivanja jedinjenja koja su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u
tečnosti. Danas, jedinjenja u tragovima, čija je koncentracija reda veličine parts per
trillion (ppt), mogu lako da se identifikuju uz pomoć tečne hromatografije visokih
performansi. HPLC može da se primeni na skoro svaki uzorak, kao što su lekovi,
prehrambeni proizvodi, kozmetika, uzorci iz životne sredine, forenzički uzorci i
industrijske hemikalije.
HPLC je brza tehnika kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska;
zatim veoma efikasna tehnika za razdvajanje, zahvaljujući česticama malih dimenzija kojima
se pune kolone, a koje imaju veliku specifičnu površinu za interakcije između stacionarne
faze i molekula koji se razdvajaju; i takođe osetljiva tehnika kod koje se detektuju
veoma male koncentracije analita.
Značajna karakteristika HPLC metode jeste ta da je često pogodna za analizu
organskih jedinjenja koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasno-
hromatograsku analizu bez prethodne derivatizacije. Broj publikovanih HPLC metoda je
danas toliko veliki da se pretraživanjem literature mogu pronaći hromatografski uslovi
za skoro bilo koju vrstu jedinjenja. U analizi hrane, HPLC se primenjuje za nekoliko
kategorija jedinjenja: ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive, sintetičke boje, prirodne
pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide), aminokiseline i druga jedinjenja.
Od 2004. godine dalji napredak u tehnologiji izrade instrumenata i kolona doveli
su do značajnog povećanja rezolucije, brzine i osetljivosti tečne hromatografije. Kolone
sa još manjim česticama (1,7 mikrona) i instrumenti dizajnirani za rad na pritiscima od
15000 psi (1000 bar) potrebni su da se postigne novi nivo mogućnosti u tzv. tečnoj
hromatografiji ultra performansi (engl. Ultra-Performance Liquid Chromatography,
UPLC).
Osnovna istraživanja se danas izvode i sa kolonama koje sadrže čestice koje su
prečnika manjeg od 1 mikrona, i instrumentim sposobnim da rade na pritiscima od
93
100000 psi (6800 bar). Ovi podaci nam pružaju dovoljno informacija o onome što
možemo očekivati u budućnosti.
5.4. Princip rada tečne hromatografije visokih performansi
Pod principom rada HPLC-a podrazumeva se forsiranje prolaska analizirane

supstance (ili smeše) kroz kolonu, odnosno cev napunjenu materijalom sitnih čestica, a
time i velike površine, pri čemu se tečnost (mobilna faza) pumpa pod visokim pritiskom
kroz kolonu. Unosi se mala zapremina uzorka u tok mobilne faze i na osnovu specifičnih
hemijskih i fizičkih interakcija, dolazi do različitog zadržavanja komponenata smeše na
koloni. Vreme zadržavanja zavisi od prirode supstance koja se analizira, stacionarne
faze i sastava mobilne faze. Vreme za koje se supstanca eluira, tj. dođe do kraja kolone
(drugim rečima vreme koje provede u stacionarnoj fazi) naziva se redukovano
retenciono vreme i ono je karakteristično za određenu supstancu (Poglavlje 1.2.).
Korišćenje visokog pritiska povećava linearnu brzinu i daje jedinjenjima manje vremena
za zadržavanje na koloni, što poboljšava rezoluciju hromatograma. Koriste se uobičajeni
rastvarači, čisti ili kao smeše (npr. voda, metanol, organski rastvarači, itd). Voda može
sadržavati i neki pufer, kako bi se poboljšalo razdvajanje. Moguće je koristiti i
gradijentno eluiranje, što podrazumeva promenu sastava mobilne faze u toku eluiranja.
5.5. Osnovni delovi HPLC sistema
Osnovni delovi HPLC sistema su prikazani na Slici 5.5. U rezervoaru se nalazi

rastvarač, tj. mobilna faza. Pumpa za proizvodnju visokog pritiska (sistem za “isporuku”,
tj. “raznošenje” rastvarača) se koristi za generisanje i održavanje specifičnog protoka
mobilne faze, koji je obično reda veličine mililitar po minuti. Injektor (sistem za
upravljanje uzorcima) služi za uvođenje, tj. injektovanje (engl. inject) uzorka u
kontinualni tok mobilne faze koja ga nosi u HPLC kolonu. Kolona je napunjena česticama
hromatografskog materijala, koji je neophodan da bi došlo do razdvajanja komponenti
unetog uzorka. Materijal kojim je pakovana kolona se naziva stacionarnom fazom.
Kolona je smeštena u termostatu koji održava temperaturu kolone konstantnom u toku
analize, što je veoma značajno jer promena temperature utiče na raspodelu ispitivanog
jedinjenja između stacionarne i mobilne faze, kao i na njegovu rastvorljivost i viskoznost
mobilne faze.
Detektor je neophodan da se vide trake razdvojenih jedinjenja nakon što se ona
eluiraju sa HPLC kolone. Mobilna faza zatim napušta detektor i može biti poslata u
otpad, ili po želji prečišćavana.
Cevi i ostali delovi opreme koja se koristi za povezivanje pumpe, injektora,
kolone i detektora, da bi se omogućio nesmetani protok mobilne faze i uzorka, izrađeni
su od materijala koji može da podnese visok pritisak.
94
Slika 5.5. Schema sistema za tečnu hromatografiju visokih performansi - tečnog

hromatografa
Legenda : (1) Rezervoari rastvarača, (2) Uređaj za degaziranje rastvarača, (3) Gradijentni ventil,
(4) Posuda za mešanje i isporuku mobilne faze, (5) Pumpa za proizvodnju visokog pritiska, (6)
Injekcioni ventil u poziciji za injektovanje, (6') Injekcioni ventil u poziciji za “punjenje” (engl.
load position), (7) Petlja za injektovanje uzorka, (8) Pretkolona, (9) Analitička kolona, (10)
Detektor, (11) Kompjuter - obrada podataka, (12) Kolektor za otpad ili frakcioni kolektor.
Detektor je povezan sa kompjuterom koji obrađuje dobijene podatke. Detektor

beleži i obrađuje električni signal potreban za generisanje hromatograma na ekranu.
Hromatogram omogućava identifikaciju i kvantitativno određivanje koncentracije
pojedinačnih jedinjenja u analiziranoj smeši (Slika 5.5).
5.5.1. Injektor
Injektor predstavlja deo HPLC sistema putem koga se uzorak uvodi u kolonu.
Injektovanje je jedan od kritičnih momenata HPLC analize. Ako se injektovanje ne izvodi
pažljivo, čak i najbolja kolona može da da loše rezultate razdvajanja. U teoriji, veoma
mala zapremina uzorka treba da se uvede u centar vrha kolone, vodeći računa da se
spreči ulaženje vazduha u isto vreme.
Postoji više načina da se uzorak injektuje: pomoću šprica i septuma, pomoću
injekcionog ventila sa petljom ili pomoću automatskog sistema za injektovanje, tj.
autosemplera (engl. autosampler). Mada je injektovanje kroz septum na vrh kolone
najdirektniji način nanošenja uzorka, koji daje najmanje moguće širenje hromatografskih
traka, takav način nije pogodan za HPLC. Injektovanje kroz septum je jedino prihvatljivo
pri pritiscima nižim od 100 bar, mada uvek postoji opasnost od zapušenja igle česticama
septuma, a osim toga septum mora da bude hemijski stabilan preme različitim
mobilnim fazama koje se koriste za hromatografisanje.
95
Najčešće se injektovanje izvodi putem petlje, u koju se se uzorak unosi

mikrolitarskim špricem, tako što se iglom probode zaptivena guma na ulazu u petlju.
Prebacivanjem injekcionog ventila iz položaja za punjenje u položaj za injektovanje,
mobilna faza se usmerava kroz petlju, povlači uzorak sa sobom i unosi ga u kolonu
(Slika 5.5). Petlje su dizajnirane tako da se specifična zapremina injektuje u kolonu i
dostupne su u veličinama od 5 do 2000 µL. One se lako vezuju za ventil i lako menjaju.
Manje zapremine uzoraka, koje su potrebne kod rada sa mikrokolonama, najbolje je
injektovati koristeći specijalan ventil sa petljom kapaciteta od 0,5 do 5 µL. Nedostatak
ovakvog manuelnog injektora je što se svaki uzorak mora posebno injektovati.
Autosempler omogućava da se automatski injektuje jedan uzorak za drugim, čime se
obezbeđuje da se bez prisustva analitičara uradi sto i više analiza.
5.5.2. Stacionarna faza – kolona
Stacionarna faza tj. kolona predstavlja najvažniji deo HPLC sistema, mesto svih
hromatografskih dešavanja. Stacionarne faze pakovane su u kolone od nerđajućeg čelika
ili stakla i njihov izbor zavisi od prirode supstanci koje se ispituju. Kolone mogu biti
različite dužine, najčešće od 2,5 do 25 cm (i više), sa različitim unutrašnjim prečnikom
(najčešće 2,0-4,6 mm) i različitim dijametrom čestica (od 2 do 50 µm). Uobičajeni
materijali za pakovanje HPLC kolona su sledeći: silika-gel, kopolimeri na bazi stirena i
divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje. Hemijska struktura silikagela
prikazana je na Slici 5.6.
Slobodni Siloksan Geminalni Vodonično Kiseli silanol

silanol silanoli vezani blizu Me+
silanoli
Slika 6. Hemijska struktura silika-gela
Silika-gel može hemijski da se modifikuje na različite načine, što je prikazano na

Slici 5.7, pa se tako dobija veliki broj materijala koji se koriste za punjenje HPLC kolona,
tj. kao stacionarne faze (Tabela 5.1). Izbor vrste kolone zavisi od vrste analize, tj. od
primene.
96
Anhidrovani uslovi
Anhidrovani uslovi
= Silika-gel
Slika 5.7. Hemijske modifikacije silika-gela
Veliki broj HPLC razdvajanja izvodi se na sobnoj temperaturi. U slučajevima kada

temperaturu kolone treba promeniti, to može da se učini pomoću odgovarajućeg
vodenog kupatila ili peći za zagrevanje kolone. Ako se HPLC kolonama rukuje na
pravilan način, one mogu da imaju dug vek trajanja. Kolone mogu često da se regenerišu
propuštanjem serije rastvarača u kojoj se povećava sposobnost eluiranja, što je zatim
praćeno propuštanjem rastvarača obrnutog redosleda u pogledu sposobnosti eluiranja
(npr. heksan-metilenhlorid, metanol- metilenhlorid-heksan). Zapremina svakog od
upotrebljenih rastvarača za ispiranje treba da bude oko 20 zapremina kolone, i
propušta se pri veoma visokom protoku.
Najvažniji koraci koji mogu da se preduzmu za zaštitu HPLC kolone su filtracija
rastvarača, filtracija rastvorenog uzorka, upotreba dodatnih filtera i/ili pretkolona
(engl. guard column), pažljivo rukovanje, održavanje priključaka čistim i izbegavanje
preteranog zatezanja, i čuvanje dobro zatvorne kolone u odgovarajućem rastvaraču
kada je van upotrebe.
97
Tabela 5.1. Funkcionalne grupe u hemijski modifikovanom silika-gelu
Grupa Formula Grupa Formula
Triakontil Difenil
Dimetil-
Dokosil
amino
Oktadecil Amino
Oktil Nitro
Nitrilna
Heksil
(Cijano)
Oksipropan-
Trimetilsilil
nitril
vic-Hidroksil
Alkil-
(diol)
karbamat
Cikloheksil Fluoralkil
Poli(kapro-
Fenil
laktam)
5.5.3. Mobilna faza
Mobilna faza za HPLC analizu treba da se bira tako da pre svega dobro rastvara
sve komponente ispitivane smeše. Drugim rečima, ako se analiziraju nepolarna
jedinjenja, tada biramo nepolarne rastvarače, i obrnuto - pri analizi polarnih jedinjenja
kao mobilna faza se biraju polarni rastvarači. Polarnost mobilne faze može da se varira
98
od puferovanih vodenih rastvora do ugljovodonika. Rastvarači koji se koriste kao

mobilna faza moraju biti odgovarajuće čistoće, bez stranih primesa organskog i
neorganskog porekla. HPLC rastvarači su komercijalno dostupni i treba ih uvek koristiti.
Takođe, mobilna faza mora biti oslobođena mehurića gasova. Zbog toga se pre upotrebe
mobilna faza filtrira i degazira. Degaziranje može biti postignuto na različite načine:
primenom toplote, sniženog pritiska ili ultrazvuka, ili produvavanjem inertog gasa kao
što je helijum. Poslednji način je najpogodniji, s obzirom da omogućava kontinualno
degaziranje tokom izvođenja eksperimenta. Neki od problema koje rastvarači mogu da
prouzrokuju ako nisu degazirani su: nastajanje mehurova vazduha u pumpi, što vodi
gubitku protoka rastvarača; formiranje mehurića na izlazu iz kolone, gde nastaje visok
pritisak koji vodi ozbiljnom narušavanju hromatograma i pomeranje bazne linije zbog
rastvorenog vazduha.
Mobilna faza ne sme da menja karakteristike kolone i mora da bude kompatibilna sa
detektorom. Viskoznost, temperatura, pH vrednost mobilne faze i protok biraju se u
zavisnosti kako od primenjene stacionarne faze, tako i od prirode analizirane supstance.
5.5.4. Pumpa
Pumpe koje se koriste za HPLC sisteme moraju biti izrađene od materijala koji je
otporan na rastvarče koji se koriste kao mobilna faza. Takođe moraju biti sposobne da
proizvedu i izdrže pritiske do 6000 psi, i da obezbede protoke od 1 do 10 pL/min, pa sve
do 0,5 do 10 mL/min. Kako se efikasnost razdvajanja povećava sa opadanjem protoka
mobilne faze, generalno je poželjan nizak protok. Pumpe su elektronski kontrolisane da
regulišu pritisak i protok mobilne faze u veoma uskom opsegu. Programator se obično
koristi za regulisanje isporuke rastvarača ili smeše rastvarača konstantnog (izokratski
način) ili promenljivog sastava (gradijentni način eluiranja). Veoma je važno da se
pumpa redovno održava, da bi protok rastvarača tokom hromatografisanja bio
konstantan. Promena u protoku rastvarača će uticati na retenciona vremena
analiziranih jedinjenja, i zbog toga može doći do grešaka u identifikaciji uzorka.
Reproduktivnost hromatograma, kako standarda, tako i uzoraka, je od suštinskog
značaja. Pritisak koji obezbeđuje pumpa zavisi od dimenzija kolone i veličine čestica
kojima je pakovana, a isto tako i od protoka i viskoznosti mobilne faze koja se koristi.
5.5.5. Detektor
Detektor je vezan na izlaz HPLC kolone i njegova uloga je da “prati” rastvor koji
se eluira sa kolone u realnom vremenu. Detektor je uglavnom najsofisticiraniji i
najskuplji deo HPLC opreme. Kako karakteristike jedinjenja prisutnih u uzorku mogu
biti veoma različite, razvijeno je nekoliko tipova detektora. Postoje selektivni detektori,
koji daju različite odgovore u zavisnosti od strukture analiziranog uzorka, i tzv.
univerzalniji detektori, kod kojih je odgovor sličan za većinu jedinjenja. Na primer, ako
99
jedinjenje apsorbuje ultraljubičastu ili vidljivu svetlost, koristi se UV-Vis apsorbujući

detektor (engl. ultraviolet-visible detector). Ako jedinjenje ima sposobnost fluorescencije,
koristi se fluorescentni detektor. Oba tipa detektora su selektivni detektori. Ako
analizirano jedinjenje nema ni jednu od pomenutih karakteristika, koristi se
univerzalniji tip detektora, kao što je RI detektor, tj. detektor koji radi na principu
prelamanja svetlosti (engl. refractive index detector), ili ELSD detector, tj. detektor koji
radi na principu isparavanja i rasipanja svetlosti (engl. evaporative-light-scattering
detector). Najbolji pristup je korišćenje više serijski vezanih detektora. Recimo, UV-Vis
i/ili ELSD detektor mogu da se koriste u kombinaciji sa masenim spektrometrom (MS),
da bi se analizirali rezultati HPLC razdvajanja. To omogućava sveobuhvatnije informacije o
ispitivanom uzorku (analitu), na osnovu samo jednog HPLC injektovanja. Kuplovanje
HPLC sistema sa masenim spektrometrom se u praksi zove LC/MS.
UV-Vis detektor je selektivniji i osetljiviji od RI detektora. Dok je UV-Vis detektor
u stanju da detektuje količinu supstance od 10-10 g/ml, osetljivost RI detektora je u
oblasti od 10-7 g/ml. Osetljivost fluorescentnih detektora je u oblasti od 10-13 g/ml za
izabrana jedinjenja. Osetljivost detektora se definiše kao odnos odgovora detektora
prema koncentraciji uzorka.
HPLC detektori mogu da apsorbuju u tri različite optičke apsorpcione oblasti:
ultraljubičastoj (190-400 nm), vidljivoj (400-700 nm) i infracrvenoj oblasti (IR – engl.
infrared, 2,5-25 µm). Postoje tri glavne klase optičkih apsorpcionih detektora: a)
detektori koji rade na fiksnoj talasnoj dužini u UV oblasti, gde je obično talasna dužina
fiksirana na 254 ili/i 280 nm; b) UV-Vis detektori sa promenljivom talasnom dužinom; i
c) IR apsorpcioni detektori.
Najmanje se koriste IR detektori, koji imaju ograničenu osetljivost i kod kojih se
kao problem javljaju značajne smetnje zbog uticaja rastvarača. Njihova glavna upotreba
je u okviru ekskluzione hromatografije.
Veoma bitna karakteristika pri izboru detektora je i da li je on destruktivan
prema ispitivanom uzorku ili ne. Uobičajeno korišćeni optički detektori nisu
destruktivni, pa je nakon hromatografisanja moguće prečistiti analizirano jedinjenje i
koristiti ga u daljim koracima za karakterizaciju.
Gradijentno eluiranje zahteva detektor koji će biti neosetljiv na promenu sastava
rastvarača. UV-Vis i fluorescentni detektori zadovoljavaju ovaj zahtev, za razliku RI
detektora, koji se veoma retko koristi za gradijentno eluiranje,
Očigledno je, da kao i kod drugih tehnika za hromatografisanje, ne postoji
univerzalni detektor za HPLC. UV-Vis, fluorescentni i elektrohemijski detektori su
bazirani na specifičnoj prirodi supstance koja se analizira. Na primer, jedinjenje koje
hromatografišemo apsorbuje svetlost određene frekvence, dok sistem rastvarača u
kome se analiza izvodi tu istu svetlost ne apsorbuje. S druge strane, RI detektori reaguju
na promenu indeksa prelamanja, koji je karakteristično svojstvo rastvora. Promena
100
indeksa prelamanja je direktni rezultat eluiranja rastvorenog hemijskog jedinjenja koje

se hromatografiše.
U nekim slučajevima, potrebno je modifikovati eluat da bi uzorak mogao da se
detektuje. Ti slučajevi se odnose na detektore koji zahtevaju isparavanje rastvarača koji
se koristi za eluiranje, pre detekcije jedinjenja koje se analizira. Ovo uključuje FID i
masene detektore (videti Poglavlje 3 o gasnoj hromatografiji).
Mogućnost detekcije nekih jedinjenja može se poboljšati hemijskom
derivatizacijom pre HPLC analize, ili posle hromatografskog razdvajanja a pre detekcije
(tzv. derivatizacija posle kolone). Postoje raznovrsne komercijalno dostupne
mogućnosti, od strane nekoliko proizvođača, da se drugi način, tj. derivatizacija posle
kolone automatizuje.
U rutinskoj analizi prehrambenih proizvoda, 90 % analiza se vrši uz upotrebu
UV-Vis ili RI detektora. Fluorescentni detektor se koristi u 8-9 % slučajeva, dok se
detektori koji rade na principu amperometrijske provodljivosti koriste u 1-2 %
slučajeva.
5.6. Razdvajanje i detekcija jedinjenja HPLC-om
Jednostavan način da se razume kako dolazi do razdvajanja jedinjenja nekog

uzorka u HPLC koloni je prikazan na Slici 5.8.
Traka injektovanog uzorka - pojavljuje se kao crna boja

(smeša plave, crvene i žute )
Nulto vreme
Mobilna faza
Trake analita
Nulto vreme + 10 minuta

Mobilna faza
Slika 5.8. Hromatografske trake - ilustracija rada hromatografske kolone
Mobilna faza ulazi u kolonu sa leve strane, prolazi kroz čestice kojima je napunjena
kolona i izlazi sa desne strane. Smer protoka mobilne faze je predstavljen zelenim
strelicama. Gornji deo Slike 8 predstavlja kolonu u nultom vremenu (trenutak kada se
injektuje uzorak), kada uzorak ulazi na kolonu i počinje da formira traku. Ispitivani
uzorak, koji je smeša jedinjenja žute, crvene i plave boje, javlja se na ulasku u kolonu kao
jedna crna traka. U stvarnosti, ovaj uzorak može biti bilo šta što se može rastvoriti u
101
rastvaraču. Tipično jedinjenje će biti bezbojno a zid kolone neproziran, tako da bi bio
neophodan detektor da se “vide” razdvojena jedinjenja nakon što se eluiraju sa kolone.
Nakon nekoliko minuta (donji deo Slike 5.8), tokom kojih mobilna faza teče
kontinualno i stalno prolazi kroz čestice materijala kojim je napunjena kolona, možemo
da vidimo da su se jedinjenja premestila u odvojene trake, što znači da su se kretala
različitim brzinama kroz kolonu. Razlog ovakvom ponašanju je postojanje konkurencije
između mobilne i stacionarne faze za privlačenje svakog od jedinjenja, tj. analita. Može
se primetiti da se traka žute boje kreće najbrže i samo što nije izašla iz kolone.
Jedinjenje žute boje je vezano za mobilnu fazu jače od jedinjenja dugih boja i zbog toga
se kreće većom brzinom, koja je bliska brzini kretanja mobilne faze. Jedinjenje plave
boja više “voli” materijal za pakovanje kolone nego mobilnu fazu. Ono je jako vezana za
čestice stacionarne faze, što prouzrokuje da se značajno sporije kreće kroz kolonu.
Drugim rečima, jedinjenje plave boje se najduže zadržava na koloni od svih komponenti
ispitivane smeše. Traka crvene boje kreće se srednjom brzinom kroz kolonu, odnosno
jedinjenje crvene boje vezano je srednjom jačinom za mobilnu fazu. Kako se svaka od
traka kreće različitom brzinom, ova tri jedinjenja je moguće hromatografski razdvojiti.
Detektor –
HPLC kolona protočna ćelija
Injektovanje
Start
Bazna linija
Slika 5.9. Hromatogram kao rezultat obrade električnog signala u kompjuteru

vezanom za HPLC hromatograf
Čim razdvojene trake analizirane smeše napuste kolonu, odmah prelaze na

detektor. Detektor ima protočnu ćeliju koja “vidi”, tj. detektuje svaku pojedinačnu traku,
tj. jedinjenje. Odgovarajući detektor ima sposobnost da “oseti” prisustvo određenog
jedinjenja i da pošalje odgovarajući električni signal kompjuteru za obradu podataka.
Izbor se vrši između mnogo različitih tipova već pomenutih detektora, a u zavisnosti od
osobina i koncentracije jedinjenja koja treba da se razdvoje i analiziraju. Idealan
detektor bi trebalo da je visoko osetljiv, odnosno utoliko je bolji ukoliko daje veći signal
pri niskoj koncentraciji analizirane supstance. Zatim, detektor treba da bude pogodan za
102
sva jedinjenja u ispitivanoj smeši i da se njegov odgovor ne menja sa promenama u

sastavu mobilne faze i temperature. Detektor treba da daje brz odgovor proporcionalan
koncentraciji, tj. da ima širok opseg linearnosti i mali šum na baznoj liniji. Najzad,
odgovor detektora treba da bude nezavistan od mobilne faze, inertan prema dejstvu
mobilne faze i treba da bude lak i jednostavan za upotrebu. Danas su najčešće u
upotrebi UV/VIS, fluorescentni, infracrveni, maseni, elektrohemijski, kao i detektori
bazirani na indeksu refrakcije.
Kao rezultat obrade električnog signala koji je poslat detektoru, dobija se HPLC
hromatogram. Hromatogram je grafički prikaz razdvajanja koje se odigralo u HPLC
sistemu. Serija pikova koji se “izdižu” iznad bazne linije nacrtana je na vremenskoj osi.
Svaki pik predstavlja odgovor detektora na različito hemijsko jedinjenje (Slika 5.9).
Žuta traka na Slici 5.9 je potpuno prošla kroz protočnu ćeliju detektora i generisani
električni signal je poslat kompjuteru za obradu podataka. Rezultujući hromatogram se
pojavljuje na ekranu. Hromatogram u stvari počinje kada se uzorak injektuje, i to kao
prava linija pri dnu ekrana, koja se naziva baznom linijom. Bazna linija predstavlja čistu
mobilnu fazu koja prolazi kroz protočnu ćeliju detektora tokom vremena. Kako traka
žutog jedinjenja prolazi kroz protočnu ćeliju, sve jači signal se šalje kompjuteru.
Površina ispod krive linije, koja je najpre uzlazna, a zatim silazna, proporcionalna je
koncentraciji jedinjenja žute boje u uzorku. Na ovaj način kreira se pik u
hromatogramu. Nakon što žuta traka potpuno izađe iz ćelije detektora, nivo signala se
vraća na baznu liniju. Kroz detektor sada ponovo prolazi samo čista mobilna faza. Kako
se žuta traka kreće najbrže, eluirajući se najbrže sa kolone, to je prvi pik koji se javlja u
hromatogramu.
Malo kasnije, crvena traka stiže do protočne ćelije detektora. Signal se ponovo
“diže” sa osnovne linije kako crvena traka ulazi u detektor, i pik koji predstavlja crvenu
traku počinje da se pojavljuje na ekranu. Na Slici 5.9 crvena traka još uvek nije potpuno
prošla kroz protočnu ćeliju detektora. Slika pokazuje kako bi crveni pik izgledao ako bi
u ovom trenutku zaustavili proces hromatografisanja. S obzirom da je veći deo crvene
trake prošao kroz ćeliju, veći deo pika je nacrtan, kao što pokazuje puna linija na Slici
5.9. Kada bi proces hromatografisanja restartovali, crvena traka bi potpuno prošla kroz
ćeliju detektora i crveni pik bi bio potpun (isprekidana linija). Plava traka, koja se
najduže zadržala na koloni, odnosno koja putuje najmanjom brzinom, eluira se sa kolone
posle crvene trake. Isprekidana linija pokazuje kako bi izgledao potpuni hromatogram,
ako bismo pustili proces hromatografisanja do kraja. Zanimljivo je primetiti da bi širina
plavog pika bila najveća, zbog toga što se plava traka kreće najsporije kroz pakovanu
kolonu i zahteva više vremena i veću zapreminu mobilne faze da bi se potpuno eluirala.
Pošto mobilna faze teče konstantnom brzinom, plava traka se širi i razblažuje. Kako
detektor reaguje proporcionalno koncentraciji trake, to za posledicu ima da je plavi pik
manji po visini ali veće širine u poređenju sa prethodna dva pika.
103
5.7. Identifikacija i kvantitativno određivanje jedinjenja HPLC-om
Na Slici 5.9 su tri obojena jedinjenja su predstavljena sa tri pika na hromatogramu,

koja su razdvojena u vremenu. Svaki se pojavljuje u posebnom vremenskom trenutku,
odnosno na posebnom retencionom vremenu (tr), koje se meri od momenta kada se
uzorak injektuje (nulto vreme) do trenutka kada se javlja maksimalna vrednost, tj. vrh
pika. Poređenjem retencionih vremena svakog pojedinačnog pika sa retencionim
vremenima odgovarajućih referentnih standarda, koji se pod istim uslovima hromatografišu
(ista mobilna i stacionarna faza, protok i temperatura), nepoznata jedinjenja se mogu
identifikovati.
Na Slici 5.10 vidi se da će, pod određenim uslovima za hromatografisanje, analit,
u ovom slučaju akrilamid, imati retenciono vreme od 2,85 minuta (Uzorak A). Kada se
novi uzorak, koji sadrži akrilamid, injektuje u HPLC sistem pod istim hromatografskim
uslovima, njegov pik će se takođe pojaviti na 2,85 minuta (Uzorak B).
Kada je jedinjenje idetifikovano, sledeći važan korak je ustanoviti količinu, tj.
koncentraciju jedinjenja u ispitivanom uzorku. Hromatogram i odgovarajući podaci sa
detektora omogućavavaju da se koncentracija prisutnog jedinjenja izračuna. Kako
detektor reaguje na koncentraciju jedinjenja, veća koncentracija će davati veći signal,
što će se u hromatogramu videti kao viši pik iznad iznad bazne linije.
Na Slici 5.10, hromatogrami uzoraka A i B su prikazani na istoj vremenskoj skali,
jedan iznad drugog. Ista zapremina uzorka je injektovana u oba slučaja, i oba
hromatograma pokazuju pikove na retencionom vremenu od 2,85 minuta, što ukazuje
da svaki od uzoraka sadrži akrilamid. Međutim, uzorak A pokazuje mnogo veći pik
akrilamida. Površina ispod pika je mera koncentracije prisutnog jedinjenja. Vrednost
površine se integrali i računa automatski od strane kompjutera vezanog na HPLC
uređaj. U slučaju sa Slike 5.10, pik za akrilamid u uzorku A ima 10 puta veću površinu od
pika u uzorku B.
Nepoznata koncentracija uzorka, u ovom slučaju akrilamida, može se odrediti
metodom normalizacije pikova, metodom eksternog standarda ili metodom internog
standarda. Metoda internog standarda, koja se smatra najpouzdanijom, zasniva se na
dodatku odabrane supstance (interni standard) rastvorima akrilamida poznatih
koncentracija i rastvoru uzorka nepoznate koncentracije, u potpuno istoj koncentraciji.
Pik izabranog internog standarda mora biti dobro razdvojen od pika analiziranog
jedinjenja, ali ne i previše udaljen od njega. Takođe je potrebno da bude slične hemijske
strukture kao i ispitivano jedinjenje, kako bi se izbegle razlike u odgovoru detektora, a i
da bi se mogla koristiti ista kolona za hromatografisanje. Dobar interni standard za
određivanje nepoznate koncentracije akrilamida HPLC-om je npr. metakrilamid, i ova
metoda se koristi prilikom određivanja akrilamida u suncokretovom ulju za pripremu
hrane. Precizno pripremljeni standardni rastvori se zatim injektuju u HPLC sistem i
nakon hromatografisanja se izračunava odnos površine pika supstance koja se analizira
104
i internog standarda. Kalibraciona kriva se konstruiše koristeći odnose površine pika

standarda i internog standarda u funkciji od koncentacije standardnih rastvora. Na opisani
način može se izračunati da Uzorak A sadrži 10 pikograma akrilamida, što je deset puta
više od količine akrilamida u uzorku B (1 pikogram). U hromatogramima uzoraka A i B
može se takođe uočiti još jedan neidentifikovani pik na retencionom vremenu od 1,8
minuta. Kako je površina ovog pika u oba uzorka otprilike ista, to nepoznato jedinjenje
može imati istu koncentraciju u oba uzorka.
Akrilamid
Uzorak B
1 pg
Injektovanje
t R= 2:85
Akrilamid
Uzorak A 10 pg Površina
ispod pika
tR Retenciono vreme – identifikacija uzorka

pg Površina ispod pika –
kvantitativno odreĎivanje
Injektovanje
t R= 2:85
Slika 5.10. Identifikacija i kvantitativno određivanje HPLC metodom
5.8. Izokratsko i gadijentno eluiranje
U HPLC-u se koriste dva osnovna načina eluiranja. Prvi je izokratsko eluiranje,

kod koga sastav mobilne faze, bilo da se radi o čistom rastvaraču ili o smeši rastvarača,
ostaje isti tokom hromatografisanja. Tipičan izokratski sistem eluiranja je prikazan na
Slici 5.11.
Drugi način eluiranja je gradijentno eluiranje, kada se, kao što samo ime ukazuje,
sastav mobilne faze menja tokom HPLC razdvajanja. Ovaj način je koristan za uzorke
koji sadrže jedinjenja u širokom opsegu polarnosti, kada izokratsko eluiranje ne dovodi
do zadovoljavajućeg razdvajanja komponenti ispitivane smeše. Naime, na početku
eksperimenta mobilna faza može eluirati neke komponente smeše ali je previše “slaba”
da bi eluirala ostale komponente. Dakle “snaga”, odnosno sposobnost eluiranja mobilne
faze će se tokom eksperimenta povećavati, da bi se da bi se eluirala jedinjenja koja su
jače vezana za stacionarnu fazu. U najjednostavnijem slučaju, u okviru HPLC sistema,
105
kada se koristi gradijentno eluiranje, postoje dve boce sa rastvaračem i dve pumpe
(Slika 5.12).
Slika 5.11. Izokratski sistem eluiranja pod visokim pritiskom
Brzina svake pumpe se kontroliše, da bi se isporučilo manje ili više rastvarača

tokom razdvajanja. Dve struje rastvarača se mešaju u mešaču (mikseru) da bi se dobio
stvarni sastav mobilne faze koja se isporučuje koloni tokom vremena. Na početku
eksperimenta, mobilna faza sadrži veći udeo rastvarača koji eluira jedinjenja slabije
vezana za stacionarnu fazu (rastvarač A, Slika 5.12). Tokom vremena, udeo rastvarača
koji eluira jedinjenja jače vezana za stacionarnu fazu se povećava (rastvarač B, Slika
5.12), prema određenom režimu.
HPLC kolona Hromatogram
Injektor
Rastvarač B
Mikser Kompjuterska obrada
podataka
Uzorak
Rastvarač A Detektor
Pumpe
Otpad
Slika 5.12. Gradijentni sistem eluiranja pod visokim pritiskom
106
Na Slici 5.13 uređaj za mešanje rastvarača se nalazi posle pumpi, tako da se

gradijent stvara pod visokim pritiskom. Drugi HPLC sistemi su dizajnirani da mešaju
više struja rastvarača pod niskim pritiskom, ispred jedne pumpe, kao što je prikazano
na Slici 5.13. Ventil za formiranje gradijenta “bira” udeo svakog od rastvarača iz četiri
boce, menjajući na taj način “jačinu”, tj. sposobnost eluiranja mobilne faze.
Rastvarač D
HPLC kolona Hromatogram
Rastvarač B
Injektor
Rastvarač C
Kompjuterska
Rastvarač A obrada podataka
Uzorak
Ventil za
formiranje Pumpa Detektor
Gradijenta
Otpad
Slika 13. Gradijentni HPLC sistem pod niskim pritiskom
5.9. Analitički, preparativni i industrijski HPLC
Do sada je pokazano kako HPLC analiza obezbeđuje podatke koji mogu biti
korišćeni kako za idektifikaciju, tako i za kvantitativno određivanje jedinjenja prisutnih
u analiziranom uzorku (analitički HPLC). Međutim, HPLC takođe može da se koristi za
prečišćavanje i “sakupljanje” željene količine svakog od analiziranih jedinjenja, uz
primenu frakcionog kolektora, koji se montira iza protočne ćelije detektora. Ovaj proces
se naziva preparativnom hromatografijom, tj. preparativni HPLC. U preparativnoj
hromatografiji je moguće “prikupiti” individualna jedinjenja, tj. analite, po redosledu
kako se ona eluiraju, odnosno izlaze sa kolone. Frakcioni kolektor selektivno sakuplja
eluat u određenom vremenskom periodu, pri čemu sakupljeni eluat sada sadrži
prečišćeni analit. Prihvatni sudovi kolektora se pomeraju, tako da svaki sakuplja samo
jedno jedinjenje, tj. jedan eluirani pik. Analitičar koji je odgovoran za HPLC eksperiment
utvrđuje koji nivo čistoće i koju količinu analita želi da dobije kao rezultat. Postavljeni
ciljevi u pogledu čistoće i količine analita koji želi da se dobije, zajedno sa informacijama
107
o prirodi i složenosti uzorka, sa druge strane određuju veličinu uzorka za hromatografisanje i

potreban kapacitet kolone. U principu, kako se količina uzorka povećava, neophodna je i
veća HPLC kolona. Određivanje kapaciteta HPLC sistema naziva se izbor HPLC skale. U
Tabeli 5.2 prikazane su različite HPLC skale i njihovi hromatografski ciljevi.
Tabela 5.2. Različite HPLC skale
Skala Hromatografski cilj

Analitička Informacije - identifikacija jedinjenja i koncentracija
Semi-preparativna Podaci i mala količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g)
Preparativna Veća količina prečišćenog jedinjenja ( 0,5 g)
Industrijska Proizvodne količine prečišćenog jedinjenja ( g – kg)
Maksimalno povećanje selektivnosti sa određenom kombinacijom stacionarne i

mobilne faze, postizanjem najboljeg mogućeg razdvajanja između dve komponente
analiziranog uzorka, je kritični momenat u određivanju zahteva za skaliranje
hromatografskog razdvajanja. Kapacitet HPLC sistema tada postaje pitanje skaliranja
zapremine kolone (Vc) prema količini uzorka koji će se injektovati, kao i izbora
odgovarajuće veličine čestica, što određuje pritisak u koloni i efikasnost kolone.
Zapremina kolone, koja zavisi od njene dužine (L) i unutrašnjeg prečnika (r), određuje
količinu materijala za pakovanje (čestica) koju kolona treba da sadrži.
Generalno, HPLC kolone su dužine od 2 do 50 cm, i unutrašnjeg prečnika 1 do
100 mm (Slika 5.14). Kako se hromatografska skala povećava, tako se povećavaju i
dimenzije kolone, naročito njihov prečnik (Tabela 5.3).
Analitičke Preparativne
Dužina
Unutrašnji prečnik 2 – 50 cm
1 mm – 50 mm
Slika 5.14. Dimenzije HPLC kolona
108
Da bi se optimizovao protok, on se mora povećati u srazmeri sa površinom

poprečnog preseka kolone. Ako je poželjna manja veličina čestica za veću moć
razdvajanja, tada pumpa mora biti dizajnirana da održi visok protok mobilne faze pri
visokom povratnom pritisku. Tabela 5.3 prikazuje jednostavne smernice za izbor kolone
odgovarajućeg unutrašnjeg prečnika koji se preporučuje za svaku skalu hromatografije.
Tabela 5.3. Hromatografska skala prema unutrašnjem prečniku kolone i

prečniku čestica za pakovanje kolone
Skala Prečnik Prečnik Prečnik Prečnik Veličina

kolone, kolone, kolone, kolone, čestica,
1-8 mm 10-40 mm 50-100 100 mm m
mm
Analitička x 1,7-10
Semi-preparativna x 5-15
Preparativna x 15-100
Industrijska x 100 +
Na primer, za primenu u okviru preparativne skale koristila bi se kolona unutrašnjeg

prečnika 50-100 mm, koja sadrži čestice veličine 15-100 mikrona. Optimalna dužina
kolone tada može da se izračuna na osnovu količine prečišćenog jedinjenja koja želi da
se obradi u svakom eksperimentu i na osnovu zahtevane moći razdvajanja.
5.10. Performanse hromatografskog razdvajanja
5.10.1 Rezolucija
Stepen do koga su jedinjenja razdvojena naziva se hromatografskom

rezolucijom. Dva glavna faktora koji određuju moć razdvajanja ili rezoluciju koja se
može postići HPLC kolonom su: sposobnost mehaničkog razdvajanja, koja je određena
dužinom kolone, veličinom čestica i uniformnošću pakovanja i sposobnost hemijskog
razdvajanja, koja je određena fizičko-hemijskim “takmičenjem” za jedinjenja, između
stacionarne i mobilne faze. Efikasnost kolone je mera mehaničke sposobnosti
razdvajanja, dok je njena selektivnost mera hemijske sposobnosti razdvajanja.
5.10.2. Sposobnost mehaničkog razdvajanja – efikasnost
Ako je kolona stabilna i uniformno pakovana, sposobnost mehaničkog razdvajanja je

određena njenom dužinom i veličinom čestica kojima je napunjena. Sposobnost mehaničkog
razdvajanja, koja se zove efikasnost kolone, se često meri i predstavlja brojem podova
109
(N). Kolone punjene manjim česticama imaju veću efikasnost i viši povratni pritisak. Za
određenu veličinu čestica dobija se veća sposobnost mehaničkog razdvajanja sa
povećanjem dužine kolone. Međutim, povećanje dužine kolone vodi dužim vremenima
potrebnim za hromatografisanje, većoj potrošnji rastvarača i većim povratnim
pritiscima. Kraće kolone minimiziraju sve prethodno navedeno, ali takođe imaju manju
efikasnost, kao što je prikazano na Slici 5.15.A.
A)
50 mm 100 mm
B)
50 mm 50 mm
5 m 1,7 m
Slika 5.15. A) Dužina kolone i sposobnost mehaničkog razdvajanja (pri istoj veličini
čestica) i B) Veličina čestica i sposobnost mehaničkog razdvajanja pri istoj dužini kolone
Pri određenoj hemijskoj strukturi čestica za punjenje kolone, određenoj mobilnoj

fazi i protoku, kolona iste dužine i unutrašnjeg prečnika, ali punjena manjim česticama,
imaće veću sposobnost mehaničkog razdvajanja (Slika 5.15.B). Međutim, njen povratni
pritisak će biti mnogo veći nego u koloni za čije punjenje su korišćene čestice većih
dimenzija.
5.10.3. Sposobnost hemijskog razdvajanja – selektivnost
Izbor kombinacije vrste stacionarne faze (hemijske strukture čestica) i sastava

mobilne faze, odnosno izbor sistema za razdvajanje, određuje stepen hemijskog razdvajanja,
tj. selektivnost. Optimizacija selektivnosti je najefikasniji način za postizanje
razdvajanja, koji može otklaniti nepovoljne eksperimentalne uslove neophodne kod
najvećih mogućih mehaničkih efikasnosti. Da bi se postiglo razdvajanje bilo koja dva
jedinjenja, analitičar može da bira kako između velikog broja kombinacija stacionarne i
mobilne faze, tako i retencionih mehanizama, odnosno načina za hromatografisanje. O
tome će biti reči u sledećem Poglavlju.
110
5.11. Režimi HPLC razdvajanja
U principu, tri osnovne karakteristike hemijskih jedinjenja mogu da se koriste da

bi se postiglo HPLC razdvajanje: polarnost, naelektrisanje i veličina molekula. Prvo će
biti razmatrana polarnost i dva osnovna načina razdvajanja koji se zasnivaju na ovoj
karakteristici: hromatografija normalnih faza i hromatografija reverznih faza.
Na osnovu polarnosti stacionarne i mobilne faze, HPLC se deli na dve različite
podklase. Režim ili tehnika kod koje je stacionarna faza polarnija od mobilne faze (npr.
toluen kao mobilna faza a silika-gel kao stacionarna faza), naziva se hromatografijom
normalnih faza (engl. normal phase liquid chromatography, NPLC). Suprotno, kada je
mobilna faza polarnija od stacionarne faze (npr. voda-metanol kao mobilna faza i
oktadecilsilil- modifikovani silika-gel kao stacionarna faza, C18), takva tehnika se naziva
hromatografijom reverznih faza (engl. reversed phase liquid chromatography, RPLC).
Ironija je da hromatografija “normalnih faza” ima znatno manju primenu od
hromatografije reverznih faza, koja se znatno više koristi.
5.11.1. Razdvajanje na osnovu polarnosti
Struktura molekula i njegove fizičko-hemijske karakteristike su određeni

rasporedom njegovih konstitutivnih atoma i vrstama veza između njih. Specifični
raspored određenih atoma, koji je odgovoran za specijalna svojstva i predvidive
hemijske reakcije molekula, naziva se funkcionalna grupa. Funkcionalna grupa često
određuje da li je molekul polaran ili nepolaran.
Organska jedinjenja su klasifikovana prema funkcionalnim grupama koje sadrže.
Kada se razdvajanje zasniva na polarnosti jedinjenja, relativno hromatografsko zadržavanje
različitih vrsta molekula u velikoj meri zavisi od prirode i položaja funkcionalnih grupa.
Kao što je prikazano na Slici 5.16, klase organskih jedinjenja mogu se poređeti u niz, od
veoma polarnih do veoma nepolarnih.
Polarni Nepolarni
molekul molekul
Aromatični
Soli Alkoholi Etri ugljovodonici Fluoralkani
Kiseline Ketoni Halogenalkani Alifatični

ugljovodonici
Slika 5.16. Niz hromatografske polarnosti prema funkcionalnoj gupi analita
111
Voda, mali molekul sa velikim dipolnim momentom, je polarno jedinjenje.

Benzen, aromatični ugljovodonik, je nepolarno jedinjenje. Molekuli sa sličnom
polarnošću imaju tendenciju da se međusobno privlače, dok se oni sa različitom
polarnošću ili mnogo slabije privlače, ili čak odbijaju. Pravilo “slično privlači slično”
postaje osnova za hromatografske režime razdvajanja koji se zasnivaju na različitoj
polarnosti.
Da bi se dobio efikasan sistem za hromatografsko razdvajanje, biraju se mobilna i
stacionarna faza različitih polarnosti. Jedinjenja iz uzorka koja su slične polarnosti sa
stacionarnom fazom (tj. sa materijalom za pakovanje kolone), će se mnogo sporije
kretati kroz kolonu, zato što su jače vezana za čestice stacionarne faze. S druge strane,
jedinjenja slične polarnosti sa mobilnom fazom kretaće se brže. Na osnovu ovih razlika
u relativnom vezivanju jedinjenja za stacionarnu/mobilnu fazu dolazi do njihovog
razdvajanja, i to zahvaljujući različitoj brzini kretanja svakog pojedinačnog jedinjenja
kroz kolonu.
Slike 5.17 i 5.18 prikazuju tipične opsege polarnosti za mobilne i stacionarne faze. Niz
koji je prikazan na Slici 5.17, na kome su neki uobičajeni rastvarači poređeni po
relativnoj polarnosti, naziva se eluotropnom serijom. Molekuli mobilne faze, koji se
takmiče sa molekulima analita za pogodna mesta vezivanja za stacionarnu fazu, pomeraju
analite, prouzrokujući njihovo brže kretanje kroz kolonu, tj. manje zadržavanje. Voda je
polarni kraj ovog niza mobilnih faza, tj. rastvarača, dok je heksan, alifatični ugljovdonik,
nepolarni kraj. Između se nalaze pojedinačni rastvarači, kao i smeše rastvarača (sa
odnosom rastvarača pogodnim za određeno hromatografsko razdvajanje), koji su
poređani po eluacionoj sposobnosti. Koji kraj ovog niza predstavlja “najjaču” mobilnu
fazu, zavisi od prirode površine stacionarne faze gde se odigrava “takmičenje” za molekule
analita.
Polarni Nepolarni
molekul molekul
Mobilne faze
Voda Alkohol Acetonitril THF Heksan
Slika 5.17. Niz mobilnih faza (rastvarača) različite polarnosti
Površina silika-gela je hidrofilna površina koja sadrži kisele silanolne grupe.

Zbog toga se silika-gel nalazi na polarnom kraju niza stacionarnih faza, što je prikazano
na Slici 5.18. Polarnost ili aktivnost površine silika-gela može biti modifikovana
hemijskim vezivanjem manje polarnih grupa (engl. bonded phase). Primeri koji su
prikazani na Slici 18, redosledom opadajuće polarnosti, obuhvataju cijanopropilsilil-
112
(CN), n-oktilsilil- (C8) i n-oktadecilsilil (C18, ODS) grupe na silika-gelu. Modifikacija

silika-gela n-oktadecilsilil- grupama daje veoma nepolarne, hidrofobne stacionarne faze.
Polarni Nepolarni
molekul molekul
Stacionarne faze
Silika-gel CN C8 C18
(ODS)
Slika 5.18. Niz stacionarnih faza različite polarnosti
Za datu stacionarnu fazu analitičar mora da izabere odgovarajuću mobilnu fazu,

odnosno najbolju kombinaciju faza suprotnih polarnosti. Hromatografsko pravilo “slično
privlači slično” određuje koji će se od analita kretati sporije a koji brže kroz kolonu.
Između rastvarača sličnih polarnosti, razmatra se koji od njih, u kombinaciji sa datom
stacionarnom fazom, može najbolje iskoristiti suptilne razlike u polarnosti i
rastvorljivosti različitih analita iz uzorka, i na taj način maksimalno povećati
selektivnost hromatografskog sistema. Razdvajanje na bazi polarnosti podrazumeva
dobro poznavanje uzorka i iskustvo sa različitim analitima i režimima razdvajanja.
5.11.1.1. HPLC normalnih faza
Prilikom razdvajanja ekstrakta dobijenog iz listova biljaka, Cvet je koristio

polarnu stacionarnu fazu (kalcijum-karbonat u staklenoj cevi, Slika 5.1), u kombinaciji
sa mnogo manje polarnom, tj. nepolarnom mobilnom fazom. Ovaj klasični način
hromatografisanja je postao poznat kao hromatografija normalnih faza.
Polarna stacionarna faza –

silika -gel
Nepolarna mobilna faza –
heksan
Razdvajanje komponenti
uzorka
Uzorak
Slika 5.19. Hromatografija normalnih faza
Slika 5.19 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja test smeše koju čine
tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima normalnih faza.
113
Stacionarna faza je polarna (silika-gel) i najjače zadržava polarno žuto obojeno

jedinjenje. Nepolarno plavo obojeno jedinjenje se eluira brzo, zahvaljujući najboljoj
rastvorljivosti u mobilnoj fazi (heksan). Kako je plavo obojeno jedinjenje slično mobilnoj
fazi (oboje su nepolarni), ono se kreće najbrže. Crveno jedinjenje je po polarnosti
između žutog i plavog, pa se zbog toga kreće brzinom koja je veća od brzine kretanja
žutog a manja od brzine kretanja plavog jedinjenja. Opisano ponašanje je tipično za
hromatografiju normalnih faza.
5.11.1.2. HPLC reverznih faza
Hromatografija reverznih faza opisuje način razdvajanja koji je upravo obrnut od

hromatografije normalnih faza, naime koristi se nepolarna (hidrofobna) stacionarna
faza i polarna mobilna faza. Slika 5.20 predstavlja prikaz hromatografskog razdvajanja
test smeše koju čine tri obojena jedinjenja (žute, crvene i plave boje), primenom režima
reverznih faza.
Sada je za stacionarnu fazu najjače vezano nepolarno plavo obojeno jedinjenje i
ono se najduže zadržava na nepolarnoj stacionarnoj fazi. Polarno žuto jedinjenje, koje je
najslabije vezano, kreće se najbrže kroz čestice stacionarne faze, i zbog toga eluira
najranije sa kolone.
Nepolarna stacionarna faza

– C18
Polarna mobilna faza –
vodeni rastvor
Razdvajanje komponenti
uzorka
Uzorak
Slika 5.20. hromatografija reverznih faza
U današnje vreme, zbog veće reproduktivnosti i širokog opsega primene,

reverzno-fazna hromatografija se koristi u otprilike 75 % svih HPLC metoda. Mnoge od
reverzno-faznih metoda koriste kao mobilnu fazu smešu vode i nekog polarnog
organskog rastvarača, kao što je acetonitril ili metanol. Ovakav sastav mobilne faze
obezbeđuje odgovarajuću interakciju analita sa površinom nepolarnih, hidrofobnih
čestica stacionarne faze. Nepolarna kolona koja je punjena modifikovanim C18 silika-
gelom (ODS kolona, tj. n-oktadecilsilil- modifikovani silika-gel) je najpopularnija i
najčešće korišćena vrsta reverzno-fazne kolone.
114
5.11.1.3. Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija
Razdvajanje na osnovu hidrofilnih interakcija je jedna od varijanti

hromatografije normalnih faza. U hromatografiji normalnih faza, mobilna faza je 100 %
organski rastvarač. Jedino tragovi vode mogu biti prisutni u mobilnoj fazi i u porama
materijala kojim je pakovana HPLC kolona. Polarni molekuli se vezuju veoma čvrsto za
stacionarnu fazu i ponekad ne mogu da se eluiraju. Dodavanjem izvesne količine vode
(< 20 %) organskoj mobilnoj fazi, koja je obično aprotični rastvarač kao npr. acetonitril,
omogućeno je razdvajanje i eluiranje polarnih jedinjenja koja su čvrsto vezana za
stacionarnu fazu u hromatografskom režimu normalnih faza. Voda, kao veoma polarni
rastvarač, efikasno se takmiči sa polarnim analitima u vezivanju za stacionarnu fazu.
Razdvajanje na bazi hidrofilnih interakcija može da se izvodi primenom bilo
izokratskog, bilo gradijentnog načina za eluiranje. Polarna jedinjenja, koja su inicijalno
vezana za čestice polarnog materijala kojim je pakovana kolona, mogu se eluirati sa
povećanjem polarnosti mobilne faze, tj. sa povećanjem udela vode u smeši sa organskim
rastvaračem. Analiti se tada eluiraju redosledom u kome se povećava njihova
hidrofilnost, odnosno polarnost izražena relativno prema vodi. Puferi ili soli se takođe
mogu dodati mobilnoj fazi da bi se analiti koji mogu da jonizuju zadržali u nejonizovanom
obliku.
5.11.1.4. Razdvajanje na osnovu hidrofobnih interakcija
Razdvajanje na osnovu hidrofobnih reakcija je jedna od varijanti hromatografije

reverznih faza, koja se koristi za razdvajanje velikih biomolekula, kao što su proteini.
Poželjno je da ovi molekuli ne menjaju strukturu, odnosno da ostanu intaktni u vodenim
rastvorima, izbegavajući kontakt sa organskim rastvaračima ili supstancama koje mogu
da ih denaturišu. Hromatografsko razdvajanje zasnovano na hidrofobnim intereakcijama
velikih molekula sa umereno hidrofobnim stacionarnim fazama, na primer sa češće
korišćenim butilsilil-modifikovanim silika-gelom (C4 kolone), nego oktadecilsilil-
modifikovanim silika-gelom (C18 kolone). Početno veća koncentracija soli u vodi će
“podstaći” proteine da se da se zadrže na česticama kojima je pakovana kolona (tzv.
“isoljavanje”). Stepen razdvajanja se uobičajeno postiže smanjenjem koncentracije soli.
Na ovaj način, biomolekuli se eluiraju redosledom u kome se povećava njihova hidrofobnost.
5.11.2. Razdvajanje na osnovu naelektrisanja: jonska izmena
Pokazano je da za razdvajanje na bazi polarnosti važi hromatografsko pravilo

“slično privlači slično”. U hromatografiji koja se zasniva na izmeni jona, i naziva se jonska
hromatografija (engl. ion-exchange chromatography), kao i u drugim metodama
razdvajanja koje se zasnivaju na naelektrisanju, ovo pravilo je obrnuto. Kod ovih metoda
“slično i slično se odbijaju”, dok se suprotnosti privlače.
115
Jonska hromatografija se zasniva na razlikama u afinitetu jonskih vrsta u

rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa koje imaju neki adsorbensi. Adsorbensi
mogu biti sintetički i prirodni, a takođe neorganskog i organskog porekla, i nazivaju se
jonskim izmenjivačima. Jonski izmenjivači se dele na katjonske i anjonske, u zavisnosti
od toga da li u aktivnim grupama sadrže mobilne katjone ili anjone i koriste se kao
stacionarne faze u jonskoj hromatografiji. Katjonski izmenjivači se koriste za
“zadržavanje” i razdvajanje pozitivno naelektrisanih jona, tj. katjona, na negativno
naelektrisanoj površini. Obrnuto, anjonski izmenjivači se koriste za “zadržavanje” i
razdvajanje negativno naelektrisanih jona, tj. anjona, na pozitivno naelektrisanoj
površini (Slika 5.21). U praksi se uglavnom koriste polimeri na bazi polistirena koji je
umrežen divinilbenzenom, koji se nazivaju jonoizmenjivačke smole. Smole sadrže
aktivne kisele ili bazne funkcionalne grupe, čiji se joni izmenjuju sa jonima iz rastvora.
Katjonski izmenjivači sadrže kisele grupe, kao što su sulfonske kiseline (–SO3H) i
karboksilne kiseline (–COOH), a anjonski izmenjivači sadrže bazne grupe, kao što su
hidroksilne (–OH) ili amino grupe (–NH2, –NHR, –NR2).
Negativno naelektrisani Pozitivno naelektrisani

analit (anjon) analit (katjon)
vezan za pozitivno vezan za negativno
naelektrisanu površinu naelektrisanu površinu
+
+
+ +
- -- - -
+ + + + - -- - - - -
+ Čestica + - - - Čestica - -
+ +
+ stacionarne faze
+ - - stacionarne faze - -
- - - jonoizmenjivač) - - -
(anjonski (katjonski
+ jonoizmenjivač) +
+ + + - -- - -- --
+ + + - - - - - -
+ +
+ + + -- - - - -
- -
Slika 5.21. Principi hromatografije zasnovane na izmeni jona
U jonskoj hromatografiji mobilna vaza je obično vodeni rastvor, koji sadrži

konkurentne jone istog naelektrisanja kao i analiti koji se razdvajaju. Kada je potrebno,
mobilnoj fazi se dodaje mala količina metanola ili acetona.
Jonoizmenjivači tipa jakih baza ili jakih kiselina (npr. kvaternerni amini ili
sulfonska kiselina) imaju funkcionalne grupe koje su uvek u jonizovanom obliku.
Tipična primena takvih jonoizmenjivača je za razdvajanje jona koji mogu biti eluirani
116
“istiskivanjem”, pomoću mobilne faze koja sadrži jone koji se mogu jače vezati za
stacionarnu fazu. Alternativno, joni analita mogu zaostati na koloni, a zatim biti
neutralizovani promenom pH vrednosti mobilne faze in situ, što dovodi do njihovog
naknadnog eluiranja.
Jonoizmenjivači tipa slabih baza i slabih kiselina (npr. sa sekundarnim amino ili
sa karboksilnim funkcionalnim grupama), mogu biti neutralizovani iznad ili ispod
određene pH vrednosti, pri čemu gube sposobnost “zadržavanja” jona. Slabi
jonoizmenjivači se za razdvajanje jona koriste u jonizovanom obliku. Ako se joni analita,
vezani za jonoizmenjivač, ne mogu eluirati “istiskivanjem”, tada se mesta za izmenu,
odnosno joni izmenjivača, moraju neutralizovati. Neutralizacija vodi onemogućavanju
privlačenja jona analita od strane stacionarne faze i dozvoljava njihovo eluiranje.
Kada se slabi jonoizmenjivači neutralizuju, oni mogu “zadržavati” i razdvajati
analite na osnovu hidrofobnih (reverzno fazno razdvajanje) ili hidrofilnih interakcija
(razdvajanje na principu normalnih faza). U ovim slučajevima, sposobnost eluiranja je
određena polarnošću mobilne faze (Slika 5.17), pa tako slabi jonoizmenjivači mogu da
se koriste za razdvajanje analita koje je zasnovano i na njihovoj polarnosti i na
naelektrisanju.
U Tabeli 5.4. prikazane su glavne smernice za primenu jonske hromatografije. Na
primer, da bi se “zadržao” veoma bazni analit (pozitivno naelektrisan) na stacionarnoj
fazi, koristiće se slabi katjonski izmenjivač pri pH > 7, što obezbeđuje negativno
naelektrisanu površinu stacionarne faze. Da bi se eluirala jaka baza, pH vrednost
mobilne faze mora biti niža od 3, što dovodi do neutralizovanja naelektrisanja na
površini stacionarne faze i onemogućava dalju razmenu i zadržavanje jona.
Ne treba koristiti jake katjonske izmenjivače za hromatografisanje jakih baza – to
će rezultovati jakim privlačenjem analita i stacionarne faze koji će ostati naelektrisani,
te će biti gotovo nemoguće eluirati bazu sa kolone. Tada se baza jedino može ukloniti
istiskivanjem sa konkurentnom bazom koja pokazuje još jače vezivanje za jone
stacionarne faze. Ovaj pristup retko ima praktičnu primenu, zbog toga što je opasno
raditi sa veoma jakim bazama i kiselinama u HPLC tehnici. Veoma jake kiseline i baze
takođe mogu biti korozivne prema materijalima koji se koriste za izradu HPLC kolona i
ostalih delova instrumenta.
Primena jonskih izmenjivača u analitičke svrhe je različita: razdvajanje katjona
od anjona, koncentrisanje jona metala iz vrlo razblaženih rastvora i određivanje
koncentracije jona, razdvajanje elemenata sličnog hemijskog ponašanja (npr. lantanida i
aktinida), odvajanje jonskih od nejonskih vrsta, itd. Pomoću katjonskih izmenjivača se
mogu razdvojiti aminokiseline, masne kiseline i kiseline od baza. Anjonski izmenjivači
se koriste za razdvajanje alkaloida, hlorofenola, aldehida, ketona, organskih kiselina
male molske mase, itd. Nitriti u povrću, fluoridi u pastama za zube, organske kiseline u
pićima, amonijum, kalijum, nitrati i fosfati u zemljištu i veštačkim đubrivima su samo
neki od specifičnih primera primene jonske hromatografije.
117
Tabela 5.4. Smernice za jonsku hromatografiju
5.11.3. Afinitetna hromatografija
Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije.

Kod afinitetne hromatografije specifičan molekul iz smeše vezuje se za “kompatibilan”
molekul koji je kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz
kolonu bez zadržavanja, kao što je to prikazano na Slici 5.22. Najveći broj interakcija na
kojima se zasniva afinitetna hromatografija su po prirodi biohemijske interakcije, npr.
antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor.
Visoko specifična priroda ovih interakcija leži u činjenici da dva jedinjenja koja
učestvuju u njima idealno odgovaraju jedno drugom, kako u prostornom, tako i u
elektrostatičkom pogledu. Jedno jedinjenje (ligand) je vezano za nosač (stacionarna
faza), dok se drugo jedinjenje (uzorak) nalazi u odgovarajućem rastvaraču (mobilna
faza). Proces vezivanja uzorka za ligand je reverzibilan. Uzorak se zadržava na
stacionarnoj fazi, dok se drugi molekuli, koji ne mogu da se specifično vežu za
stacionarnu fazu, eluiraju iz kolone mobilnom fazom. Uzorak se na taj način oslobađa
pratećih nečistoća, a sa stacionarne faze se naknadno uklanjanja eluiranjem rastvorom
koji sadrži neko jedinjenje sa još većim afinitetom prema ligandu ili promenom pH
vrednosti ili jonske jačine mobilne faze. Kako bilo koja biohemijska interakcija može da
se odigrava samo u jednoj, specifično definisanoj sredini, jasno je da promena pH ili
koncentracije mogu raskinuti te specifične interakcije. Afinitetna hromatografija se
razlikuje od drugih hromatografskih metoda po tome što pogodna stacionarna faza
118
“hvata” ili pojedinačnu komponentu ili eventualno nekoliko komponenti iz smeše

jedinjenja, zahvaljujući nastajanju (bio)specifičnih veza. Zatim sledi pogodan proces
eluiranja, koji obezbeđuje čisto jedinjenje, odnosno čisti željeni analit.
Slika 5.22. Princip afinitetne hromatografije
U afinitetnoj hromatografiji se obično koriste kolone veoma malih dimenzija.

Stacionarne faze za afinitetnu hromatografiju, koje mogu da se koriste za veoma različite
procese razdvajanja, u današnje vreme su komercijalno dostupne. Mnoge od njih sadrže
dugolančanu grupu, tzv. spejser (engl. spacer) između nosača na bazi silika-gela i
liganda, da bi se obezbedio potpuno slobodan, nesmetani pristup molekula uzorka
mestu za vezivanje, koje se nalazi na ligandu (Slika 5.23). Osim opisanim načinima koji
uključuju uspostavljanje neke vrste gradijenta (pH, jonska jačina ili konkurentni
uzorak), vezani uzorak se može eluirati i primenom sredstava koja menjaju strukturu
analita, što uslovljava raskidanje interakcija između analita i liganda (npr. urea ili
guanidin-hlorovodonik menjaju strukturu proteina). Ovu tehniku ipak treba izbegavati
kad kod je to moguće, jer se može desiti, ako se npr. eluira protein, da dođe do njegove
denaturacije.
Stacionarna
faza Spejser
A280 Ligand A280
Biomolekul
Neefikasno vezivanje Efikasno vezivanje
Ligand je vezan direktno za stacionarnu fazu Ligand je vezan za stacionarnu fazu preko spejsera
Slika 5.23. Primer boljeg vezivanja biomolekula za ligand i boljeg eluiranja u prisustvu
spejsera između liganda i stacionarne faze
119
5.11.4. Razdvajanje na osnovu veličine molekula: gel-propusna hromatografija
Pedesetih godina prošlog veka, Porath i Flodin su otkrili da biomolekuli mogu da

se razdvoje na osnovu njihove veličine, putem prolaženja ili filtriranja kroz hidrofilni
polimer na bazi dekstrana, koji je imao kontrolisanu poroznost. Ovaj proces je označen
kao gel filtriranje. Kasnije je analogna metoda primenjena za razdvajanje sintetičkih
organskih oligomera i polimera. Za pakovanje kolona su korišćeni takođe organski
polimeri sa specifičnim opsegom veličine pora. Ovaj proces je označen kao gel-propusna
hromatograija (engl. Gel- Permeateon Chromatography, GPC). Slična razdvajanja su
postignuta korišćenjem silika-gela kontrolisane poroznosti kao materijala za pakovanje
kolona, pri čemu je takav proces označen kao ekskluziona hromatografija na osnovu
veličine molekula (engl. Size-Exclusion Chromatography, SEC). Prvi komercijalni HPLC
instrument, koji je plasiran na tržište 1963. godine od strane kompanije Waters (SAD),
bio je upravo dizajniran za GPC primenu.
Čestice umreženog polimera, koji se koristi za pakovanje kolone, u rastvaraču
prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje gela. Raspodela veličina pora gela mora biti u opsegu koji
dozvoljava polimernim molekulima (makromolekulima) da uđu u pore ili da, manje ili
više, budu “istisnuti” iz zapremine pora. Gel-propusna hromatografija predstavlja
specifični oblik tečno-tečne hromatografije, koji se zasniva na tom fenomenu. Dakle,
kada rastvor polimera, koji sadrži makromolekule različitih veličina, dovedemo u
kontakt sa gelom, iz rastvora će u gel moći da difunduju samo makromolekuli sa
određenom hidrodinamičkom zapreminom, odnosno makromolekuli čiji je prečnik u
rastvoru manji od prečnika pora gela (Slika 5.24). U rastvoru ostaju oni makromolekuli
čiji je prečnik veći od prečnika pora gela.
Slika 5.24. Mehanizam razdvajanja makromolekula po veličini

hidrodinamičke zapremine prilikom kretanja kroz GPC kolonu
(Strelica označava smer kretanja rastvarača)
120
Razdvajanje makromolekula po veličini se izvodi tako što se kroz kolonu, u kojoj

se nalazi gel umreženog polimera, propušta rastvor polimera koji se analizira. Na Slici
5.25. prikazano je razdvajanje polimera koji se sastoji od dve frakcije makromolekula
različitih po veličini, tj. molskoj masi.
Protok
rastvarača
Čestica
umreženog,
Uzorak polimera
poroznog
polimera
Detektor
Hromatogram
Retenciono
vreme
Slika 5.25. Razdvajanje makromolekula po veličini prilikom prolaska kroz GPC kolonu
Granica faza gel/rastvarač, odnosno aktivna površina, je veoma velika, što vodi
relativno kratkom vremenu koje je potrebno za uspostavljanje difuzione ravnoteže,
odnosno raspodele makromolekula između rastvarača koji se kreće kroz kolonu
(mobilna faza) i rastvarača koji miruje u porama čestica gela (stacionarna faza). Kod
tehnike gel-propusne hromatografije, materijal kojim je pakovana kolona predstavlja
nosač stacionarne faze. Slobodna zapremina između sfernih čestica gela omogućava
neometan prolaz rastvarača i rastvorenih makromolekula kroz kolonu. Da bi
mehanizam razdvajanja bio jasan, analizirani polimer na Slici 5.25 sastoji samo se od
dve frakcije makromolekula, koji su prikazani u obliku kugli sa značajno različitim
prečnicima. Manji makromolekuli mogu da difunduju u pore čestica gela, dok veliki
makromolekuli ne mogu da difunduju i oni se kreću bez zadržavanja, zajedno sa
rastvaračem, između čestica gela. Kretanje manjih molekula kroz kolonu se usporava
usled difuzije u pore gela. Što je makromolekul manji, on se duže zadržava u koloni,
usled dubljeg prodiranja u čestice pora gela. Zapremina rastvarača koja je neophodna da
bi se makromolekul eluirao iz kolone je obrnuto proporcionalna njegovoj veličini – što
121
je makromolekul manji, potrebna je veća zapremina rastvarača za njegovo eluiranje i

obrnuto. Dakle, prilikom propuštanja rastvora polimera kroz GPC kolonu, kolonu će
prvo napustiti veliki makromolekuli, a zatim manji, upravo kao što je prikazano na Slici
5.25. Očigledno je da postoji veza između molske mase molekula (M) i zapremine
rastvarača koja je potrebna za njegovo eluiranje (zapremina eluata ili eluaciona zapremina,
Ve), koja se može iskoristiti za eksperimantalno određivanje molskih masa polimera:
M = f(Ve)
Ova funkcija zavisi od više faktora: hemijske strukture gela kojim je napunjena kolona,
hemijske strukture polimera koji se analizira i njegove koncentracije, vrste mobilne faze
i brzine njenog proticanja kroz kolonu, kao i od temperature i dimenzija kolone. Za
određenu vrstu gela i određeni rastvarač, pri konstantnoj temperaturi i konstantnoj
brzini proticanja rastvarača, pri istim dimenzijama kolone, makromolekuli iste molske
mase će napuštati kolonu posle tačno određene zapremine eluata koja protekne kroz kolonu.
Danas je GPC jedna od najmoćnijih analitičkih tehnika za razumevanje i
predviđanje svojstava polimera. Ona je takođe najpogodnija tehnika za karakterizaciju
kompletne raspodele molskih masa polimera.
5.11.4.1. Gelhromatograf
Danas na tržištu postoji veliki broj gelhromatografa, potpuno automatizovanih

aparata, kojima je moguće veoma brzo i jednostavno odrediti molsku masu i raspodelu
molskih masa polimera. Gelhromatograf se sastoji od sledećih delova:
- Injektora sa petljom
- Jedne ili više kolona koje služe za razdvajanje uzorka po hidrodinamičkim zapreminama,
odnosno molskim masama makromolekula
- Pumpe za proizvodnju visokog pritiska, kojom se podešava brzina proticanja
mobilne faze
- Detektora
- Sistema za obradu podataka.
Različiti polimeri daju rastvore različitih viskoznosti. Pumpa mora da obezbedi istu
brzinu proticanja rastvora, nezavisno od razlike u viskoznosti. Takođe su neki detektori
veoma osetljivi na preciznost protoka mobilne faze. Zbog toga konstantan protok mora
biti suštinska karakteristika pouzdanog gelhromatografa.
Kolone moraju da daju reproduktivne rezultate u dužem vremenskom periodu.
Visoko efikasne kolone obezbeđuju maksimalnu sposobnost razdvajanja i brze analize.
Detektori moraju da budu osetljivi i da pokazuju širok opseg linearnosti, kako bi
mogli da reaguju na tragove analita, kao i na velike koncentracije, ako je potrebno. Kako
sva jedinjenja prelamaju svetlost, diferencijalni refraktometar (RI) se koristi kao
122
univerzalni detektor. On je najčešće korišćeni detektor za praćenje raspodele molskih

masa. Indeks prelamanja polimera je konstantan iznad molske mase od 1000, pa zbog
toga detektor reaguje proporcionalno koncentraciji. Pored informacija o srednjim
vrednostima molskih masa i raspodeli molskih masa polimera, koje se dobijaju sa RI
detektorom, korišćenje UV apsorbujućih detektora može obezbediti informacije o
sastavu polimera, dok detektori na bazi rasipanja svetlosti, u sprezi sa viskozimetrima
daju informacije o strukturi polimera.
5.11.4.2. Materijal za pakovanje kolone – nosač stacionarne faze
Kao nosač stacionarne faze najčešće se primenjuju gelovi dobijeni bubrenjem

umreženih polimera u rastvaraču u kome je rastvoren i polimer kome se određuje raspodela
molarnih masa. Čestice gela treba da budu sfernog oblika, iste po veličini i što je moguće
manje. Ove uslove je neophodno ispuniti da bi se uspostavila brza difuziona ravnoteža,
odnosno raspodela makromolekula između mobilne i stacionarne faze. Kao materijali za
punjenje kolona za GPC najčešće se koriste umreženi polistiren, polimetilmetakrilat i
polivinilacetat.
S obzirom da na uspešnost razdvajanja nema uticaja priroda nosača stacionarne faze,
već veličina i raspodela pora po veličini, kao nosači stacionarne faze koriste se i porozno
staklo i silica-gel. Ovi nosači stacionarnih faza primenjuju se kod određivanja raspodele
molskih masa poliolefina, koji su rastvorni u ograničenom broju rastvarača, kao što su npr.
trihlorbenzen i m-krezol, i to na povišenoj temperature iznad 110 C. Na temperaturama
iznad 100 C umreženi sintetički polimeri su uglavnom nestabilni, pa ne mogu da se koriste
kao nosači stacionarne faze.
Umreženi dekstrani, umreženi poliakrilamid i porozni silika-gel koriste se kao
nosači stacionarnih faza prilikom karakterisanja vodorastvornih polimera. Ovi nosači
bubre u vodi ili se dobro kvase vodom.
5.11.4.3. Mobilna faza
Mobina faza treba da bude dobar rastvarač za analite koji se hromatografišu i,

takođe, mora da onemogućava bilo koju vrstu interakcije (na bazi polarnosti ili
naelektrisanja) između analita i površine stacionarne faze, koje postoje kod
konvencionalne HPLC tehnike. Ako se obezbede eksperimentalni uslovi bez interakcija
analita sa materijalom za pakovanje kolone, biće omogućeno da se najveći molekuli
eluiraju prvi, dok će manji putovati sporije i eluiraće se kasnije (ulaze/izlaze u veliki
broj pora gela). Razdvajanje makromolekula je bazirano na njihovoj veličini u rastvoru i
zbog toga uzorak mora da bude rastvoren u pogodnom rastvaraču.
123
Pri analizi sintetičkih polimera nerastvornih u vodi, kao rastvarači se mogu

koristiti svi organski rastvarači u kojima dobro bubri umreženi polimer i dobro se rastvara
polimer koji se ispituje. Najčešće se u praksi koriste tetrahidrofuran, hloroform i toluen.
Koncentracija uzorka polimera u rastvoru zavisi od njegove molske mase, pa je
npr. za vrednosti molskih masa od ~100000 uobičajeno se radi sa koncentracijama od
0,10 % (m/V).
5.11.4.4. Karakterizacija polimera gel-propusnom hromatografijom
GPC tehnikom može da odredi nekoliko parametara koji su važni za

karakterizaciju polimera. To su molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti, molska
masa srednja po masenoj zastupljenosti, srednja z vrednost molske mase i najosnovnija
karakteristika polimera – kriva raspodele molskih masa, koja je, zajedno sa označenim
srednjim vrednostima (momentima krive raspodele), prikazana na Slici 5.26. Ovi
parametri su veoma važni, s obzirom da utiču na mnoga karakteristična fizička svojstva
polimera. Kriva raspodele molskih masa polimera predstavlja matematičku funkciju
koja povezuje zastupljenost svake pojedine “vrste” makromolekula (wi na Slici 5.26) i
njegovu molsku masu.
Mi
Slika 5.26. Diferencijalna kriva raspodele molskih masa polimera
Legenda: – molska masa srednja po brojnoj zastupljenosti; - molska masa srednja po

masenoj zastupljenosti; - srednja z vrednost i – srednja viskozimetrijska vrednost
molske mase.
Niskomolekulske supstance se sastoje od molekula istog hemijskog sastava i iste

molske mase, pa su zbog toga monodisperzne. Monomeri, kao što su etilen, stiren, vinil-
hlorid i drugi, su monodisperzni. Ovo ne važi za polimere, zato što se oni sastoje od
124
makromolekula istog hemijskog sastava ali različite veličine, odnosno različitih molskih
masa. Polimeri su polidisperzni u odnosu na veličinu makromolekula, odnosno molsku
masu. Zbog toga se za polimere koriste srednje vrednosti molskih masa, od kojih najveći
značaj upravo imaju , i . Izuzetak su veoma retki slučajevi polimera koji mogu
biti monodisperzni, tačnije veoma blizu monodisperznom uzorku, i koji se dobijaju
specijalni tehnikama anjonske polimerizacije, a koriste se kao standardi za kalibraciju
GPC instrumenata. Širina GPC pika odražava širinu raspodele veličina molekula za
određeni uzorak polimera. Širi pik znači da uzorak ima širu raspodelu molskih masa, i
obrnuto. Širina raspodele molskih masa izražava se indeksom polidisperznosti
(polimolekularnosti), koji predstavlja odnos vrednosti molske mase polimera po
masenoj zastupljenosti i vrednosti molske mase po brojnoj zastupljenosti, / .
Ukoliko je polimer polidisperzniji utoliko su razlike u vrednostima i veće, pa je i
njihov odnos veći. Ako je polimer monodisperzan, indeks polidisperznosti iznosi 1.
Kada se dobije kriva raspodele molskih masa uzorka polimera, potreban je dalje
način da se ona kvantifikuje. Srednje vrednosti molskih masa su statističke veličine. Da
bi se srednje vrednosti mogle izračunati, instrument mora da se kalibriše. Za kalibraciju,
tj. eksperimentalno određivanje funkcije M = f(Vi), koriste se tri načina:
- Konstruisanje kalibracione krive na osnovu standardnih uzoraka ispitivanog
polimera, koji imaju poznate molske mase i veoma usku raspodelu ( / < 1,10),
- Primena uzorka ispitivanog polimera sa širokom, ali poznatom raspodelom molskih
masa i
- Metoda univerzalne kalibracije.
5.11.4.5. Kalibracija primenom standarda sa veoma uskom

raspodelom molskih masa
Kada se za kalibraciju koriste standardni uzorci koji imaju različite molske mase i
veoma usku raspodelu, potrebno je da se za seriju uzoraka (obično desetak) ispitivanog
polimera, odrede eluacione krive i sa njih očita vrednost eluacionih zapremina, Ve, koje
odgovaraju maksimumu na krivoj (Slika 5.27). Ekperimentalno je pokazano da je
zavisnost logaritamskih vrednosti poznatih molskih masa polimera, Mi, od
odgovarajućih očitanih vrednosti Ve, za veliki broj polimera pravolinijska, i to u širokom
opsegu molskih masa. S obzirom da makromolekuli različitih polimera, iste molske
mase, imaju različite hidrodinamičke zapremine (zbog različite hemijske strukture i
interakcija sa rastvaračem), to praktično znači da se za svaki polimer mora konstruisati
posebna kalibraciona kriva. Na tržištu se mogu nabaviti standardi polistirena,
polimetilmetakrilata, poliizoprena, polietilenoksida, polietilenglikola, dekstrana i
pululana, uskih raspodela molskih masa, koji se koriste za GPC kalibraciju. Molske mase
standarda određuju se nekom od apsolutnih metoda, na primer:
125
- može da se dobije membranskom osmometrijom ili analizom završnih grupa

(titracija, NMR),
- može da se dobije metodom rasipanja svetlosti,
- vrednost može da se dobije ultracentrifugiranjem.
Polidisperzni
uzorak
Signal
detektora
Monodisperzni
standardi
Isključeni
makromolekuli
Molekuli koji delimično
prodiru u gel
logMi
Mi
Molekuli koji potpuno
prodiru u gel
Vi
Ve
Slika 5.27. Konstruisanje kalibracione krive logMi – Ve,

za određivanje molske mase nepoznatog uzorka polimera
Kada se izvrši kalibracija GPC instrumenta, sve ove srednje vrednosti mogu da se
dobiju na osnovu samo jednog injektovanja.
Izračunavanje raspodele molskih masa iz podataka dobijenih GPC metodom
zasniva se na činjenici da je odgovor detektora proporcionalan koncentraciji polimera u
rastvoru koji protiče kroz kolonu, pa je zbog toga i površina ograničena baznom linijom
i krivom, koja prikazuje promenu odgovora detektora sa eluacionom zapreminom,
proporcionalna ukupnoj masi uzorka polimera koji je hromatografisan (Slika 5.28). Kod
difrakcionog refraktometra kao detektora, odgovor detektora predstavlja razliku u
indeksima prelamanja ( n) čistog rastvarača (eluent) i rastvora makromolekula (eluat),
koja se kontinualno meri.
126
Da bi se dobio maseni udeo pojedinih frakcija polimera, površina treba da se

podeli na odgovarajući broj intervala (Slika 5.28), pri čemu je visina, hi, koja odgovara
sredini intervala, proporcionalna masi frakcije, čija je molska masa Mi. Maseni udeo
frakcije, wi, sada može da se izračuna iz izraza:
Molska masa frakcije Mi se očitava sa kalibracione krive, za odgovarajuću

eluacionu zapreminu Ve,i . Koristeći određene vrednosti za wi i Mi, za sve frakcije, može
se konstruisati kriva raspodele molskih masa hromatografisanog polimera. Srednje
vrednosti molskih masa mogu se izračunati prema sledećim jednačinama:
Svi gelhromatografi su su automatizovani i povezani sa sistemom za obradu

podataka, tj. kompjuterom, koji je povezan sa detektorom, a isto tako i sa meračem
zapremine rastvora koja istekne iz kolone. U memoriju kompjutera ubace se podaci za
kalibracionu krivu i program po kome se rezultati obrađuju. Kao rezultat
hromatografisanja uzorka polimera dobijamo izračunatu krivu njegove raspodele
molskih masa i sve srednje vrednosti.
Normalizovana
površina
wi = 1
wi
Eluaciona zapremina Vi
Slika 5.28. Idealizovani hromatogram uzorka polimera i podela na intervale

koji odgovaraju određenim molskim masama
127
5.11.4.6. Kalibracija primenom standarda sa širokom raspodelom molskih masa
Gelhromatograf se takođe može kalibrisati korišćenjem standarda koji ima široku

raspodelu molskih masa i istu hemijsku strukturu kao i ispitivani uzorak polimera
nepoznate raspodele molskih masa. Standardi sa širokom raspodelom molskih masa,
dobro okarakterisani u pogledu , i , mogu se kupiti od različitih
proizvođača. Srednje vrednosti molskih masa ovih standarda određene su drugim
metodama kao što su na primer membranska osmometrija, rasipanje svetlosti i
ultracentrifugiranje. Alternativno, i aktuelnom uzorku za analizu (ako ga ima u
dovoljnoj količini) mogu se odrediti molske mase pomenutim tehnikama.
Srednje vrednosti molskih masa se unose u softver kompjutera i standard sa
širokom raspodelom molskih masa se zatim hromatografiše na uobičajeni način, pod
istim uslovima pod kojima će se hromatografisati i nepoznati uzorak. Softver zatim
“fituje” široki oblik hromatografskog pika prema datim srednjim vrednostima molskih
masa. Rezultujuća kalibraciona kriva sadrži tačke za svaku srednju vrednost. Ako su
poznate samo i vrednosti, kalibraciona kriva će se sastojati od te dve tačke i od
tačke koja odgovara molskoj masi vrha hromatografskog pika, odnosno kriva će imati
ukupno tri tačke.
Preporučuje se da se za kalibraciju koriste dva “široka” standarda različitih
molskih masa, da bi se povećao opseg molskih masa kalibracione krive. Tada se dobija
kalibraciona kriva sa šest tačaka, što i dalje predstavlja mali broj tačaka, ali je ovakva
kriva ipak zadovoljavajuća za svakodnevnu, rutinsku analizu polimera koji ima molske
mase u istom opsegu kao i “široki” standardi korišćeni za kalibraciju.
5.11.4.7. Univerzalna kalibracija
Kako se GPC tehnikom makromolekuli razdvajaju prema veličini hidrodinamičke

zapremine u rastvoru, a ne prema hemijskom sastavu, veliki broj istraživača je pokušao
da iskoristi ovu činjenicu i da postavi univerzalnu kalibracionu krivu. Najviše uspeha u
konstruisanju univerzalne kalibracione krive imao je Benoit, koji krenuo od poznate
jednačine Flory-Fox-a:
[ ]M = r(< r2 >)3/2
Benoit je konstatovao da je za jedan rastvarač, bez obzira na hemijsku strukturu

polimera, proizvod graničnog viskozitetnog broja, [ ], i molske mase polimera, M,
proporcionalan trećem stepenu poluprečnika inercije, r3. Pošto je r konstanta,
proizvod [ ]M se može uzeti kao mera hidrodinamičke zapremine, odnosno mera
veličine makromolekula u rastvoru. Eksperimentalno je pokazano da za veliki broj
polimera u istom rastvaraču važi da je:
128
log([ ]M) = A - bVe
gde su A i b konstante.
Kada se za čitav niz različitih polimera eksperimantalno odrede vrednosti [ ]M i

Ve u istom rastvaraču i unesu u koordinatni sistem log([ ]M) - Ve, tada sve tačke leže na
jednoj krivoj, koja se može smatrati univerzalnom kalibracionom krivom (Slika 5.29).
PS (polistiren)
PS u obliku češlja
PS u obliku zvezde
Hetero-kalemljeni kopolimer
PMMA (polimetilmetakrilat)
PVC polivinilhlorid
Kalemljeni kopolimer PS/PMMA
Polifenilsiloksan
Polibutadien
Eksponencijalna kriva
Eluaciona zapremina (5 ml, rastvarač THF)
Slika 5.29. Tipična univerzalna kalibraciona kriva
5.12. Primena HPLC tehnike u analizi hrane
Veoma veliki broj metoda koje se odnose na primenu HPLC tehnike za analizu
hrane je do sada opisan u literaturi. Pored primera koji su već dati u Poglavlju 5, ovde će
biti dat pregled još nekih tipičnih primera primene HPLC metoda u analizi
prehrambenih proizvoda. Sve velike kompanije za proizvodnju HPLC instrumenata
(Waters, Agilent) publikovale su svoje kataloge u kojima su opisani brojni
standardizovani postupci i metode koje se primenjuju u analizi hrane.
129
U Tabeli 5.5. prikazan je samo mali broj jedinjenja koja su značajna za

prehrambenu industriju, a koja se mogu analizirati primenom HPLC metoda. Skoro svi
osnovni sastojci namirnica, kao što su proteini, lipidi, ugljeni hidrati i vitamini su
pogodni za analizu tečnom hromatografijom. Primena različitih vrsta kolona i detektora
za ove analize odražava prilagodljivost ove tehnike različitim analitima.
Tabela 5.5. Primeri jedinjenja značajnih za prehrambenu industriju,

koja se mogu analizirati HPLC metodama
Analit Proizvod koji se Kolona i detektor

analizira
Bezalkoholna pića; Kolona - silika-gel sa amino-nitrilnim
Askorbinska kiselina hrana za bebe; mleko u grupama ; izokratsko eluiranje; mobilna
prahu; krompir i ljuske faza – sirćetna kiselina/metanol (75/25);
od krompira. UV detektor (248 nm).
Kolona – silika-gel sa oktadecil- grupama
(ODS); izokratsko eluiranje; mobilna faza
Kofein; teobromin Kakao; čokolada, – methanol/voda/sirćetna kiselina
čokoladni premazi i (20/79/1); UV detektor (272 nm).
likeri od čokolade.
ODS kolona; mobilna faza –
kalijumdihidrogen-ortofosfat, tetrabutil-
Saharin; acesulfam-K Pića na bazi amonijumhidrogen-sulfat, methanol,
pomorandže; čokolada hlorovodonična kiselina, voda, konačni
za dijabetičare. pH = 4; UV detektor (212 nm za saharin i
227 nm za acesulfam-K).
Benzoeva kiselina; Kolona – silika-gel sa oktil- grupama
sorbinska kiselina; Jogurt; sir; bezalkoholna (C8); mobilna faza – methanol/0,01mol
metil-, etil- i propil-p- pića; vino. dm-3 amonijum acetat (40/60), pH = 4,5;
hidroksibenzoat UV detektor (240 nm).
ODS kolona; mobilna faza –
Stiren Sve vrste prehrambenih methanol/voda (7/3); UV detektor (254
proizvoda. nm.
Jonska hromatografska kolona; pulsni
amperometrijski detector sa Au
elektrodom; mobilna faza – 150 mmol
Šećeri Meso; cerealije; voće; dm-3 natrijum-hidroksida + 0,30 mmol
voćni sokovi i sirupi. dm-3 zink acetata (analiza od sukroze do
maltose)
ili
Pakovana GPC kolona; RI detektor;
mobilna faza – voda.
ODS kolona; mobilna faza – heptan/
Slobodni tokoferoli i Životnjska i biljna ulja i heptan zasićen vodom/2-propanol
tokotrienoli masti. (49,55/49,55/0,9);
Fluorescentni detektor (pobuđivanje na
290 nm i emisija na 330 nm).
130
Skoro svaka vrsta prehrambenog proizvoda može da se ekstrahuje u cilju

identifikacije i kvantitativnog određivanja tragova analita. U cilju upoznavanja sa vrstom
pripreme uzorka koja je neophodna i informacijama koje daje HPLC metoda, može se na
primer opisati analiza organskih kiselina u voćnim sokovima.
Voćni sokovi se veoma često analiziraju da bi se ispitalo da li je proizvod
neovlašćeno izmenjen i/ili da li je pokvaren. Analitičar koji vrši ispitivanje proizvoda
pretražuje spisak standardnih HPLC metoda i utvrđuje da li postoji pogodna metoda za
tip jedinjenja koje treba da se analizira. Kada se takva metoda pronađe, ona može da se
primeni na uzorak bez izmena ili neznatno modifikovana, u zavisnosti od supstrata
donetog na analizu. Pri ispitivanju voćnih sokova metoda obuhvata analizu organskih
kiselina kao što su askorbinska, maleinska i ćilibarna. Režim HPLC razdvajanja koji se u
ovom slučaju primenjuje je jonska hromatografija i to reverzno-fazno razdvajanje na
osnovu hidrofobnih reakcija, kada je slabi jonoizmenjvač neutralizovan (engl.
hydrophobic ion suppression). Kiseli pufer se koristi da bi se smanjila pH vrednost
mobilne faze i na taj način suzbila jonizacija organskih kiselina. To takođe omogućava
zadržavanje kiselina na koloni. Komponente uzorka se eluiraju i razdvajaju na reverzno-
faznoj koloni (C18) i detektuju UV-detektorom podešenim na 220 nm. Koncentracija
kiselina se određuje pomoću eksternog standarda (u ovom slučaju su korišćene i
jabučna i fumarna kiselina). Mobilna faza je 2 % vodeni rastvor kalijum-hidrogen-
fosfata (KH2PO4), podešen na pH 3,2 pomoću fosforne kiseline. Brzina proticanja
mobilne faze je 0,5 ml/min.
Oblast primene GPC metode, osim za određivanje molskih masa i raspodele
molskih masa polimera, obuhvata razdvajanje kompleksnih smeša u cilju prečišćavanja
uzoraka. Primeri su uklanjanje soli i drugih niskomolekularnih jedinjenja iz biološkog
materijala i uklanjanje plastifikatora iz sintezičkih polimera. Polimeri su takođe veoma
važni za prehrambenu industriju, pošto se mnogi od njih koriste kao materijali za
pakovanje hrane.
Gel-propusnom hromatografijom mogu da se razdvoje smeše polimera i drugih
jedinjenja na, na primer, frakcije polimera, oligomera, monomera i aditiva. Jedan od
prvih GPC eksperimenata od strane kompanije Waters bio je analiza gume za žvakanje.
Guma za žvakanje je smeša sintetičkog polimera sa aditivima kao što arome,
stabilizatori, omekšivači, itd. Na Slici 5.30. prikazan je GPC hromatogram gume za
žvakanje, gde su komponente smeše razdvojene uz upotrebu nekoliko serijski vezanih
kolona. Polimer, tj. guma u ovom slučaju se eluira prva, zato što je najveći molekul u
smeši, a zatim se ređaju aditivi opadajućim redosledom u pogledu veličine molekula.
131
guma
za žvakanje GPC
omekšivač stabilizator aroma

polimer
komponente
Slika 5.30. Razdvajanje komponenata gume za žvakanje GPC tehnikom
Primenom GPC metode se mogu određivati različite arome u prehrambenim

proizvodima, a takođe se mogu analizirati uzorci biološkog porekla, npr. izolovati
proteini.
Rezime poglavlja
U tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) mobilna faza je tečnost a

stacionarna faza je čvrsta. HPLC je jedna od najmoćnijih tehnika u analitičkoj hemiji koja
pruža mogućnosti razdvajanja, identifikacije i kvantitativnog određivanja jedinjenja koja
su prisutna u bilo kom uzorku koji se može rastvoriti u tečnosti. HPLC je veoma efikasna
tehnika za razdvajanje, kod koje se rastvarač kreće pod dejstvom visokog pritiska kroz
kolone punjene česticama malih dimenzija a velike specifične površine za interakciju sa
molekulima koji se razdvajaju. HPLC metoda je pogodna za analizu organskih jedinjenja
koja su suviše nestabilna, ili nedovoljno isparljiva za gasnohromatograsku analizu bez
prethodne derivatizacije. Osnovni delovi HPLC instrumenta su injektor, kolona, pumpa za
proizvodnju visokog pritiska, detektor i sistem za obradu podataka. Za pakovanje HPLC
kolona najčešće se koriste: silika-gel i različite vrste hemijski modifikovanog silika-gela,
kopolimeri na bazi stirena i divinilbenzena, polisaharidi ili dijatomejske zemlje.
Razdvajanje u HPLC tehnici može da se postigne na osnovu polarnosti,
naelektrisanja i veličine molekula.
132
Dva osnovna načina razdvajanja zasnovana su na polarnosti: hromatografija

normalnih faza i hromatografija reverznih faza. Kada je stacionarna faza polarnija od
mobilne faze, radi se o režimu normalnih faza Suprotno, kada je mobilna faza polarnija od
stacionarne faze, takva tehnika se naziva hromatografijom reverznih faza.
Ako se razdvajanje zasniva na naelektrisanju, odnosno na razlikama u afinitetu
jonskih vrsta u rastvoru prema izmeni sa jonima aktivnih grupa nekih adsorbenasa, tada
se tehnika razdvajanja naziva jonska hromatografija.
Tehnika razdvajanja na osnovu veličine molekula je gel-propusna hromatografija
(GPC). GPC se najčešće koristi za razdvajanje prirodnih i sintetičkih makromolekula.
Kolone koje se koriste za GPC su punjene umreženim polimerima sa specifičnim opsegom
veličine pora. Čestice umreženog polimera u rastvaraču prelaze u nabubrelo stanje, tj. stanje
gela. Raspodela veličina pora gela je u opsegu koji dozvoljava analiziranim
makromolekulima da uđu u pore ili da, manje ili više, budu “istisnuti” iz zapremine pora,
što vodi njihovom razdvajanju po veličini, odnosno molskoj masi.
Afinitetna hromatografija je najspecifičniji oblik visokoefikasne tečne hromatografije
kod koje se specifičan molekul iz smeše vezuje se za “kompatibilan” molekul koji je
kovalentno vezan za stacionarnu fazu. Ostali molekuli prolaze kroz kolonu bez
zadržavanja. Najveći broj interakcija na kojima se zasniva afinitetna hromatografija su
biohemijske interakcije, npr. antigen-antitelo, enzim-inhibitor ili hormon-receptor.
U analizi hrane, HPLC se primenjuje za ugljene hidrate, lipide, vitamine, aditive,
sintetičke boje, prirodne pigmente, zagađivače (produkte degradacije, pesticide),
aminokiseline i druga jedinjenja.
1. Objasniti princip rada tečne hromatografije visokih performansi.

2. Navesti i opisati osnovne delove HPLC sistema.
3. Opisati dva osnovna režima HPLC razdvajanja koji su zasnovani na polarnosti:
hromatografiju normalnih faza i hromatografiju reverznih faza.
4. Objasniti princip rada jonske hromatografije.
5. Opisati tehniku gel-propusne hromatografije.
6. Objasniti princip rada afinitetne hromatografije.
Literatura
1. L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion – Revised and Expanded,
Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, 2000.
2. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 3,

133
3. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 5,

4. V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John

Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 2004.
5. S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu,

Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2004.
6. S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-

metalurški fakultet, Beograd, 2007.
7. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid

Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2010.
8. L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis
9. S. Fanali, P. R. Haddad, C. F. Poole, P. Schoenmakers, D. Lloyd, Liquid Chromatography:

Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.
134
6. LITERATURA
1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380,

1910.
2. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, 1941.


5. Nomenclature for Chromatography, IUPAC Recommendations 1993, Prepared for

publication by L. S. Ettre, Pure Appl. Chem., Vol. 65, No. 4, pp 819-872, 1993.
6. F. G. Kitson, B. S. Larsen, C. N. McEwen, Gas Chromatography and Mass Spectrometry

– A Practical Guide, Academic Press, San Diego, London, 1996.
7. J. R. J. Paré, J. M. R. Bélanger (Ed.), Instrumental Methods in Food Analysis, Elsevier,

Amsterdam, 1997.
8. S. S. Nieisen (Ed.), Food Analysis, 2nd Edition, AnAspen Publication®, Aspen

Publishers, Inc. Gaithersburg, Maryland, 1998.

10. L. M. L. Nollet (Ed.), Food Analysis by HPLC, 2nd Edidtion – Revised and Expanded,
Marcel Dekker, Inc., New York-Basel, 2000.
11. Retention Parameters in Chromatography, IUPAC Recommendations 2001 (Part A. Hold-

Up Volume Concept in Column Chromatography, Prepared for publication by J. A. G.
Dominguez, J. C. Diez-Masa and Part B. Retention Parameters in Gas Chromatography,
Prepared for publication by V. A. Davankov), Pure Appl. Chem., Vol. 73, No. 6, pp. 969–
992, 2001.
12. R. P. W. Scott, Principles and Practice of Chromatography, Chrom-Ed Book Series –

Book 1, Library4science, 2003.
13. R. P. W. Scott, Gas Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 2, Library4science,

2003.
14. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography, Chrom-Ed Book Series–Book 3,

15. R. P. W. Scott, Gas Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 4,

16. R. P. W. Scott, Liquid Chromatography Detectors, Chrom-Ed Book Series–Book 5,

135
Literatura
San Diego, 2003.

20. V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4th Edition, John

Wiley & Sons, Ltd, Chichester, 2004.
21. S. M. Jovanović, J. Đonlagić, Hemija Makromolekula, Univerzitet u Beogradu,

Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, 2004.
22. J. M. Miller, Chromatography - Concepts and Contrasts, 2nd Edition, John Wiley &
Sons, Inc., New Jersey, 2005.
23. F. Rouessac, A. Rouessac, Chemical Analysis - Modern Instrumentation Methods and

Techniques, 2nd Edition, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2007.
24. S. Jovanović, K. Jeremić, Karakterisanje Polimera, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-

metalurški fakultet, Beograd, 2007.
25. R. K. Boyd, C. Basic, R. A. Bethem, Trace Quantitative Analysis by Mass Spectrometry,

John Wiley & Sons Ltd, Chichester, 2008.
26. S. Ötles (Ed.)¸ Handbook of Food Analysis Instruments, CRC Press, Taylor & Francis
27. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, J. W. Dolan (Ed.), Introduction to Modern Liquid

Chromatography, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Jersey, 2010.
28. O. D. Sparkman, Z. E. Penton, F. G. Kitson, Gas Chromatography and Mass

Spectrometry – A Practical Guide, 2nd Edition, Elsevier Inc., Oxford, 2011.
29. L. M. L. Nollet, F. Toldrá (Ed.), Food Analysis by HPLC, CRC Press, Taylor & Francis

Fundamentals and Instrumentation, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.

Applications, Elsevier, Oxford-Amsterdam, 2013.
32. Xinghua Guo (Ed.), Advances in Gas Chromatography, Published by AvE4EvA, 2014.
136
---------------------------------------------------
CIP - Каталогизација у публикацији
Народна библиотека Србије, Београд
543.544(075.8)(0.034.2)
АНТИЋ, Весна В., 1967-

Hromatografija u analizi hrane
[Elektronski izvor] / Vesna V. Antić, Mališa
P. Antić. - 1. izd. - Zemun : Poljoprivredni
fakultet, 2014 (Zemun : Poljoprivredni
fakultet). - 1 elektronski optički disk
(CD-ROM) ; 12 cm
Sistemski zahtevi: Nisu navedeni. - Nasl. sa

naslovnog ekrana. - Tiraž 100. - Sadrži
bibliografiju.
ISBN 978-86-7834-200-4
1. Антић, Малиша П., 1965- [аутор]
a) Хроматографија
COBISS.SR-ID 208752140
---------------------------------------------------

Antic - Hromatografija U Analizi Hrane

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Antic - Hromatografija U Analizi Hrane

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERZITET U BEOGRADU

Vesna V. Antić Mališa P. Antić

Dr Vesna Antić i Dr Mališa Antić

HROMATOGRAFIJA U ANALIZI HRANE

Dr Biljana Vucelić-Radović, redovni profesor Poljoprivrednog fakulteta

Dr Ljiljana Damjanović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju

Dr Ljubiša Ignjatović, vanredni profesor Fakulteta za fizičku hemiju

Tiraž: 100 primeraka

Udžbenik Hromatografija u analizi hrane namenjen je studentima diplomskih,

U okviru Udžbenika su najpre dati teorijski osnovi hromatografije, a zatim su

Zahvaljujemo se recenzentima na pažljivom čitanju rukopisa i korisnim

1. Principi i podela hromatografije ........................................................................................... 1

2. Planarna hromatografija ............................................................................................................ 14

3. Adsorpciona hromatografija u koloni ................................................................................ 31

4. Gasna hromatografija ................................................................................................................... 37

5. Tečna hromatografija visokih performansi – HPLC ................................................... 89

6. Literatura ............................................................................................................................................ 135

Upoznavanje sa osnovnim principima hromatografskih metoda. Definisanje

Hromatografske metode su danas najčešće korišćene metode za razdvajanje i

1.2. Osnovi hromatografije

Osnovni cilj hromatografije je razdvajanje različitih supstanci koje čine smešu.

1.2.1. Osnovni pojmovi u hromatografiji

Hromatogram je krajnji rezultat hromatografskog postupka. Svakoj supstanci

Slika 1.1. Unutrašnji Slika 1.2. Spoljašnji diferencijalni

1.2.1.2. Gausov profil pika

Svi molekuli jedne komponente se ne kreću istom brzinom kroz hromatografsku

1.2.1.3. Koeficijent raspodele

Osnovni fizičko-hemijski parametar hromatografije je ravnotežna konstanta K,

1.2.1.4. Teorijski podovi

H - vrednost je visina ekvivalentna jednom teorijskom podu (engl. Height Equivalent to a

1.2.1.5. Retencioni parametri

Retencioni parametri su parametri koji definišu brzinu kojom komponetna

Retenciona zapremina (Vr) je zapremina mobilne faze koja je potrebna da

k = mS/mM = CS/CM • VS/VM = K • VS/VM

Ovaj parametar uzima u obzir sposobnost kolone (njene stacionarne faze) da

Na Slici 1.1, na kojoj je prikazan unutrašnji hromatogram, Rf vrednost bi bila

1.2.1.6. Selektivnost i razdvajanje

Selektivnost je sposobnost hromatografskog sistema da napravi razliku između

Faktor rezolucije treba da ima vrednost veću od 1,2. Rezolucija zavisi od

1.2.2. Međumolekulske sile i interakcije u hromatografskim sistemima

Sve međumolekulske (intermolekulske) sile su po prirodi električne. Postoje tri

1.2.2.1. Disperzione sile

1.2.2.2. Polarne sile

1.2.2.3. Jonske sile

Jonske interakcije su interakcije između suprotno naelektrisanih jona. Joni su prisutni

1.2.2.4. Hidrofobne i hidrofilne interakcije

1.3. Podela hromatografskih metoda

Hromatografske metode možemo podeliti na osnovu: primenjene tehnike rada,

1.3.1. Podela hromatografskih metoda prema tehnici rada

Metoda frontalne analize se sastoji u tome da se rastvor ispitivane smeše

1.3.2. Podela hromatografskih metoda prema mehanizmu razdvajanja

Adsorpciona hromatografija se zasniva na razlici između adsorpcionih afiniteta

koje su rastvorne u vodi. Anjonski izmenjivači se koriste za razdvajanje alkaloida,

1.3.3. Podela hromatografskih metoda prema obliku hromatografske podloge

Hromatografija u koloni je tehnika razdvajanja kod koje se stacionarna faza

komponenti uzoraka sa stacionarnom fazom one kroz kolonu putuju različitim

1.3.4. Podela hromatografskih metoda prema fizičkom

Hromatografski sistem sastoji se od nepokretne, stacionarne faze, koja može biti

Pitanja za proveru znanja ili diskusiju

1. M. S. Tswett, Khromfilli v Rastitel'nom i Zhivotnom Mire, Izd. Karbasnikov, Warsaw, 380,

2. A. J. P. Martin, R. L. M. Synge, Biochem J. 35, p. 1358, 1941.

3. G. Milovanović, Hromatografske Metode Odvajanja, Izdavač: PMF-Beograd, Jug. Zavod

4. S. M. Milosavljević, Strukturne Instrumentalne Metode, Univerzitet u Beogradu,