CHƯƠNG 9

GiỚI THIỆU VỀ PHƯƠNG

PHÁP SẮC KÝ
(Choromatography)
 Milestones in Chromatography
1903: Tswett - plant pigments (chlorophyll, carotenes, and xanthophylls)
separated on chalk columns
1931: Lederer & Kuhn - LC of carotenoids
1938: TLC and ion exchange
1950: Reverse phase LC
1954: Martin & Synge (Nobel Prize)
1959: Gel permeation
1965: Instrumental LC (Waters)
1960s: HPLC was developed as an analyticaltool
1974: LC/MS (fully developed in 1990s)
2000s: Development of new packing material and detector: chiral stuff,
micro/nano LC
Look at this video
Chromatography operates on the same principle as extraction, but one phase is
held in place while the other moves past it. Figure below shows a solution
containing solutes A and B placed on top of a column packed with solid particles
and filled with solvent. When the outlet is opened, solutes A and B flow down into
the column.
Fresh solvent is then applied to the
top of the column and the mixture is
washed down the column by
continuous solvent flow. If solute A is
more strongly adsorbed than solute B
on the solid particles, then solute A
spends a smaller fraction of the time
free in solution. Solute A moves down
the column more slowly than solute B
and emerges at the bottom after
solute B. We have just separated a
mixture into its components by
chromatography.
3
The mobile phase (the solvent moving through the column) in
chromatography is either a liquid or a gas.

The stationary phase (the one that stays in place inside the column) is most
commonly a viscous liquid chemically bonded to the inside of a capillary
tube or onto the surface of solid particles packed in the column.

Fluid entering the column is called eluent. Fluid emerging from the end of
the column is called eluate.

The process of passing liquid or gas through a chromatography column is

called elution.
 Analytical - determine chemical
composition of a sample

 Preparative - purify and collect one or

more components of a sample
 Dựa trên tương tác giữa pha tĩnh và pha động (Attactive forces)

 Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng hay khí. Chất
tan được hấp phụ trên bề mặt của các hạt rắn. Các chất tan được hấp phụ
càng mạnh thì nó càng di chuyển chậm ở trong cột.

Sắc ký phân bố: Pha tĩnh là chất lỏng được liên kết với bề mặt rắn, thường là
SiO2. Pha động thường là chất khí. Cân bằng phân bố của chất tan giữa với
pha tĩnh và pha động được thiết lập trong sắc ký khí.

6
 Sắc ký trao đổi ion: Các loại nhựa trao đổi ion, ví dụ nhựa trao đổi
anion -SO3-, hay nhựa trao đổi cation –N(CH3)3+ được liên kết với pha
tĩnh bằng liên kết cộng hóa trị. Pha động là các chất lỏng chứa các ion
chất tan có điện tích trái dấu được liên kết với pha tĩnh bởi lực tĩnh
điện.

7
 Sắc ký loại cỡ phân tử: Còn được gọi là sắc ký lọc gel hay sắc ký thẩm
thấu gel. Kỹ thuật sắc ký này cho phép tách các phân tử dựa trên kích
thước của nó. Các chất tan có kích thước lớn hơn sẽ đi qua cột nhanh
chóng. Trong trường hợp lý tưởng của sắc ký loại cỡ phân tử, sẽ không có
tương tác giữa pha động và chất tan. Pha động là chất khí hay lỏng sẽ đi
qua gel xốp. Các lỗ xốp là đủ nhỏ để loại các phân tử chất tan có kích
thước lớn. Các phân tử lớn không cần thâm nhập vào các lỗ xốp. Do vậy,
các phân tử nhỏ sẽ cần nhiều thời gian hơn để đi qua cột.

8
Sắc ký ái lực: Đây là loại sắc ký có độ chọn lọc cao nhất sử dụng sự
tương tác chọn lọc giữa phân tử chất tan và một phân tử thứ hai, phân
tử gắn với pha tĩnh nhờ liên kết cộng hóa trị. Ví dụ, các phân tử bất
động có thể là một kháng thể với một loại protein cụ thể. Khi có một
hỗn hợp chứa hàng nghìn protein đi qua cột, chỉ có một protein là phản
ứng với kháng thể liên kết của cột. Tất cả các chất tan khác được rửa
sạch từ cột, protein cần tách sẽ được tách ra bằng cách thay đổi độ pH
hoặc cường độ ion.

9
Dựa trên tính chất của pha động (Mobile phase)

Khí- Rắn (Stationary phase is solid)

Sắc ký khí: (Gas, GC)
Khí- Lỏng (Stationary phase is Liquid)

Mẫu phân tích cần bay hơi ỏ nhiệt độ thấp hơn 350 oC

Column (CLC, gravity flow)

Sắc ký lỏng (Liquid, LC) High performance (HPLC, pressure flow)

Thin layer (TLC, adsorption)

Sắc ký dòng tới hạn (supercritical fluid, SCFC)

 Sắc ký đồ

Sơ đồ sắc ký khí ái lực theo thời gian lưu.

11
Sắc ký đồ̀ phân tích mẫu nước tiểu của một người có
methamphetamin (MA) ở tr = 9,96 phút

12
 Các đại lượng đặc trưng

Thời gian lưu (Retention time, tr ) của mỗi cấu tử là thời gian cần thiết để
cấu tử tiếp cận được với detector kể từ lúc nó được bơm vào cột.

Thể tích lưu (Retention volume, Vr) là thể tích của pha động cần thiết để
rửa giải một chất tan ra khỏi cột.

Thời gian pha động chuyển động dọc theo cột khi không có chất tan (Tm).

Thời gian lưu hiệu chỉnh (Adjusted retention time, t’r) của một chất tan là
thời gian cần thiết để chất tan di chuyển theo chiều dài cột trừ đi thời gian
cần thiết để dung môi đi qua cột.

t’r = tr – tm (9-1)

Trong sắc ký khí, tm thường được lấy là thời gian cần thiết để CH4 chuyển
động qua cột.

13
Sự lưu tương đối (Relative retetion, α) với hai cấu tử bất kỳ 1 và 2
là tỉ số giữa thời gian lưu hiệu chỉnh của chúng.

(9-2)

Sự lưu tương đối càng lớn, khả năng tách giữa hai cấu tử ra khỏi
nhau càng lớn. Sự lưu tương đối không phụ thuộc vào tốc độ
chảy và vì vậy có thể được sử dụng để xác định pic khi tốc độ
chảy thay đổi.

14
Thừa số dung tích (Capacity factor, k’) được định nghĩa:

(9-3)

Các cấu tử được lưu lại trong cột lâu hơn nếu thừa số dung tích
càng lớn. Để theo dõi hiệu suất của cột sắc ký, tốt nhất là kiểm
tra và đo thừa số dung tích, số đĩa và tính đối xứng của pic. Việc
thay đổi các tham số này chỉ ra sự giảm hiệu suất của cột.

15
16
  Mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ số phân bố
Thừa số dung tích ở phương trình 9-3 là tương đương với:
(9-4)

Cs là nồng độ chất tan trong pha tĩnh, Vs là thể tích của pha tĩnh.
Cm là nồng độ của chất tan trong pha động, Vm là thể tích của pha động.
Tỉ số Cs/Cm là tỉ số nồng độ của chất tan trong pha tĩnh và pha động.
Nếu cột được chuyển động đủ chậm để đạt cân bằng, tỉ số Cs/Cm là hệ số
phân bố, K, được giới thiệu trong chương chiết. Do đó, chúng ta có thể biểu
diễn phương trình 9-4 dưới dạng:

(9-5)

17
Do , sự lưu tương đối có thể diễn đạt:
(9-6)

Sự lưu tương đối của hai chất tan tỉ lệ với tỉ số của hệ số phân bố của
chúng. Mối liên hệ này là cơ sở vật lý của phương pháp sắc ký.
Thể tích lưu (Vr) , là thể tích của pha động cần thiết để rửa giải một chất
tan cụ thể ra khỏi cột:
Vr = tr×uv (9-7)
uv là tốc độ chảy của pha động (thể tích trên đơn vị thời gian). Thể tích
lưu của một chất tan cụ thể là không đổi trong một phạm vi của tốc độ
chảy.

19
 Độ phân giải
Các chất tan chuyển động qua cột sắc ký có xu hướng phân bố như
đường cong Gauxơ với độ lệch chuẩn σ. Thời gian một chất tan đi qua cột
càng dài, thì pic sắc ký càng tù. Thông thường người ta đo độ rộng ở độ
cao bằng một nửa chiều cao pic w1/2. Từ phương trình đường cong
Gauxơ:

w1/2 = 2.35σ và w = 4σ.

Đường cong Gauxơ lý tưởng để đo w và w1/2. Các giá trị của w là thu được bằng
cách ngoại suy các tiếp tuyến với các điểm uốn xuống đường cơ sở.

20
Độ phân giải của hai pic với nhau:

Δtr hay ΔVr là sự tách giữa hai pics (đơn vị thời gian hay thể tích) và wav là
độ rộng trung bình của hai pic, w1/2av chiều rộng tại nửa chiều cao của đỉnh
đường cong Gauxơ. Đối với phân tích định lượng, độ phân giải là > 1,5 là
điều trong đợi.

Độ phân giải của các pic

Gauxơ có diện tích và
biên độ bằng nhau.
Đường nét đứt cho thấy
các pic riêng biệt và các
dòng liền là tổng của hai
đỉnh pic. Phần chồng sắc
ký đồ là phần bóng mờ.

21
  Sự khuếch tán

Sự mở rộng của pic khi di chuyển qua cột sắc ký

Khi chuyển động qua cột, lý tưởng nhất là pic sắc ký có dạng
hình Gauxơ, theo chiều dài của cột thì pic có độ rộng càng lớn
Ít lý tưởng hơn, pic sắc ký sẽ có dạng không đối xứng.

23
• Một trong những nguyên nhân chính của sự nở pic là sự khuếch tán. Hệ
số khuếch tán đo sự di chuyển ngẫu nhiên từ nơi có nồng độ cao đến nơi
có nồng độ thấp.

• Sự khuếch tán tự phát của chất tan qua một mặt phẳng với một gradien
nồng độ dc/dx. Số mol chất tan đi qua một mét vuông trong một giây gọi
là thông lượng ( J) tỉ lệ thuận với gradien nồng độ:

(9-8)

24
Hệ số khuếch tán ở 298 K
 sự khuếch tán của chất lỏng là chậm hơn 104 lần so với sự khuếch tán
trong pha khí.

 Các phân tử có khối lượng mol lớn như ribonuclease và albumin

khuếch tán chậm hơn từ 10 đến 100 lần so với các phân tử nhỏ.

 Giả sử chất tan di chuyển qua cột với m mol trên một đơn vị diện tích
cắt ngang của cột, thì sự nở của đường cong Gauxơ được mô tả bằng:

26
 Chiều cao đĩa
Phương trình 9-11chỉ ra rằng độ lệch chuẩn của sự nở pic là . Nếu chất
tan di chuyển một khoảng là x với tốc độ chảy là ux (m/s) thì thời gian cần
thiết để di chuyển là t = x/ux . Do vậy,

 Chiều cao đĩa là hằng số tỉ lệ với phương sai (σ2) của đám và khoảng
cách nó vừa đi qua (x).

 Chiều cao đĩa càng nhỏ, độ rộng của pic sắc ký càng hẹp.

 Chiều cao đĩa là ~0,1 tới 1 mm trong sắc ký khí, ~10μm trong sắc ký lỏng
hiệu năng cao và trong mao mạch điện di.

27
Nếu chúng ta sử dụng độ rộng ứng với nửa chiều cao của pic thay vì độ rộng
của chân pic chúng ta nhận được:

28
29
  Phương trình chiều cao đĩa

Chiều cao đĩa, H, tỉ lệ với phương sai

của pic sắc ký (phương trình 9-13):
Chiều cao đĩa càng nhỏ thì pic càng
hẹp. Phương trình Van Deemter chỉ
ra cho chúng ta ảnh hưởng của cột
và lưu lượng tới chiều cao của đĩa:

Trong đó A, B, C là các hằng số đối

với một cột và pha tĩnh cụ thể, ux là
Ứng dụng phương trình Van
tốc độ chảy (m/s). Deemter vào sắc ký khí, A =
1,65mm, B = 25,8 mm.ml/phút; C
= 0,0236 mm. Phút/ml

30
 Hằng số A liên quan đến tác dụng của khuếch tán xoáy, mà khuếch
tán xoáy lại phụ thuộc kích thước hạt hấp phụ và mật độ nhồi cột.

 Hằng số B liên quan đến hệ số khuếch tán của phân tử trong pha
động và có chịu ảnh hưởng của khuếch tán dọc cột.

 Hằng số C đặc trưng cho quá trình hấp phụ và giải hấp, quá trình
chuyển khối và một số yếu tố khác.

 Thay đổi cột và pha tĩnh dẫn đến sự thay đổi A, B và C. Đối với cột
nhồi (packed columns) A, B, C ≠ 0 cả ba yếu tố trên ảnh hưởng đến sự
nở của pic. Đối với cột mao quản (open tubular columns), A = 0 do vậy
độ rộng pic giảm và độ phân giải tăng. Trong điện di mao quản
(capillary electrophoresis) cả A và C đều bằng 0, bởi thế chiều cao đĩa
giảm tới cỡ micro do đó hiệu quả tách tăng cực kỳ lớn.

31
32
 Phân tích định tính
Sắc ký được sử dụng rộng rãi để nhận diện sự có mặt hay vắng
mặt của các cấu tử trong hỗn hợp. Ví dụ, hơn 30 amino axit
trong protein hydrolysate có thể được phát hiện với sắc ký đồ.
Ngoài ra, dựa vào thời gian lưu người ta có thể phân tích định
tính khi các chất cần xác định có sắc ký đồ chuẩn.

Khi các cột sắc ký được kết nối với detector UV, hồng ngoại hay
khối phổ, người ta có thể dễ dàng hơn hơn khi phân tích định
tính.
Sắc ký đồ phân tích
mẫu mẫu máu không
có chất ma túy

Sắc ký đồ phân tích mẫu

máu có thêm chuẩn:
MA, MDMA, MDA-d5 (tr
của MA-TFA là 9,99 phút;
tr của MDMA-TFA là 14,89
phút; tr của MDA-d5TFA là
13,05 phút).

34
1. Chuẩn hoá diện tích pic: Coi tỷ lệ % diện tích pic hoặc chiều cao pic
tương ứng với tỷ lệ % khối lượng chất.

2. Ngoại chuẩn: Đường ngoại chuẩn 1 điểm hoặc nhiều điểm. Xây dựng
đường ngoại chuẩn dựa trên mối tương quan giữa diện tích píc hoặc
chiều cao pic với nồng độ chất.

3. Nội chuẩn: Đường chuẩn nội được xây dựng dựa vào mối tương
quan giữa nồng độ chất và tỷ lệ diện tích pic của chất chuẩn với chất nội
chuẩn.

4. Thêm chuẩn: Chất chuẩn được thêm vào mẫu thử.

35
Đồ thị tương quan tuyên tính giữa tỷ lệ diện tích pic và tỉ lệ lượng chất
của MA/MDA-d5 trong mẫu máu

36
Câu 1. Nêu khái niệm và ứng dụng của các phương pháp sắc ký trong phân tích.
Câu 2. Nêu cách phân loại sắc ký theo tương tác giữa pha động và pha tĩnh, và theo bản chất của
pha động.
Câu 3. Thế nào là thời gian lưu, thể tích lưu, ý nghĩa của thời gian lưu trong phương pháp sắc ký.
Câu 4. Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải và chiều cao đĩa lý thuyết trong sắc ký.
Câu 5. Nêu cách phân tích định lượng bằng phương pháp sắc ký. Hãy giải thích tại sao phương
pháp nội chuẩn có độ chính xác cao nhất.
Câu 6: Từ sắc ký đồ chúng ta thu được những thông tin gì, các thông tin đó có ý nghĩa thế nào
trong phân tích định tính và định lượng.
Câu 7. Cho một cột sắc ký có chiều dài 120cm, tiến hành phân tích hai chất A và B thu được kết
quả sau:
Chất Thời gian lưu tr(s) Độ rộng chân pic w(s)
A trA = 250 wA =15 (s)
B trB = 270 wA =17 (s)
Cho biết thời gian lưu của pha động tm = 30s. Tính
Số đĩa lý thuyết của cột tách N =?
Chiều cao đĩa lý thuyết H = ?
Độ phân giải của cột tách R = ? Hai chất A và B có tách khỏi nhau không?
Sự lưu tương đối?
Để tách hai chất hoàn toàn ra khỏi nhau thì cột sắc ký phải có chiều dài tối thiểu bằng bao nhiêu?

37