ISPIT – II deo

(elektrohemija i separacija)

Elektrohemija: Separacija:

15 pitanja 5 pitanja
Maks.: 25 bodova Maks.: 10 bodova
Min.: 13 bodova Min.: 6 bodova

Završni ispit

Maks.: 25 + 10 = 35
Min: 13 + 6 = 18

Instrumentalne
metode 1
SEPARACIONE METODE

dr.Nataša Pejić, vanr.prof.

2
 PLAN PREDAVANJA

 Uvod u separacione instrumentalne metode

 Principi razdvajanja
 Elektroforeza (princip i podela)
 Hromatografija (princip i podela)

3
 LITERATURA

1. M. Medenica, D. Malešev, “Eksperimentalna

fizička hemija“
www.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne
metode (5MRF20INM)/Udžbenik: M. Medenica, D.
Malešev: Eksperimentalna fizička hemija
2. M. Medenica, Skripta: Instrumentalne metode,
deo C

4
 Optičke
(spektroskopske i
nespektroskopske) Elektroanalitičke
(refrakcija, rotacija, (Q, U, I, )
Separacione

√ √
apsorpcija, emisija,
difrakcija, rasipanje)

VEĆ STE NAUČILIIM

5
 SEPARACIONE METODE
Destilacija, ekstrakcija, itd.
Kvalitativna analiza:
Boja, rastvorljivost, Tm, Tk,
indeks refrakcije, itd.
Kvantitativna analiza:
Gravimetrijska i titrametrijska merenja
Instrumentalne
Hromatografija,
elektroforeza, itd.
Kvalitativna analiza:
tR, VR, oblik pika
Kvantitativna analiza:
Merljive fizičko-hemijske osobine
(provodljivost, potencijal,
apsorbancija, fluorescencija, itd.)
 CENTRIFUGA MASENA
( (veličini, obliku)) SPEKTROMETRIJA
( m/e)

√ √

U analitičke i preparativne svrhe

7
 HROMATOGRAFIJA

Gasna Tečna Fluidna hromatografija pri

√
hromatografija hromatografija superkritičnim uslovima
(GC) (LC i HPLC) √ (SFC)

ELEKTROFOREZA

Planarna √ Kapilarna √
8
 Osobine molekulaosnova za separaciju

VELIČINA (MASA) NAELEKTRISANJE

 Ultrafiltracija  Elektroforeza √
 Ultracentrifugiranje  Jonoizmenjivačka hromatografija
 Hromatografija isključenjem  Masena spektrometrija

OBLIK
POLARNOST
 Afinitetna hromatografija
 Tečna hromatografija √  Imunohemijske metode
 Gasna hromatografija
√  Enzimske metode

9
 ELEKTROFOREZA

Elektrokinetička pojava

Kretanje koloidnih i drugih naelektrisanih čestica kroz neku sredinu

(rastvor, gel i sl.) uslovljeno prisustvom i delovanjem homogenog
električnog polja

Metoda

Separaciona metoda  razdvajanje komponenata smeše

(naelektrisanih čestica istog, ili  predznaka) u polju jednosmernog
električnog napona

10
 elektroforeza
Istorija
Arne Tiselius
19021971

Problemi:
Zbog toga ZONSKA
Princip RAZDVAJANJE KOMPONENATA SMEŠE
NA OSNOVU:

 PREDZNAKA  POKRETLJIVOSTI
NAELEKTRISANJA
(KATJONI KA KATODI ČESTICE ISTOG PREDZNAKA
ANJONI KA ANODI)

ZAVISI OD:
 KOLIČINE naelektrisanja
 veličine i oblika čestice
 jačine električnog polja
 T, karakteristika potporne sredine

na osnovu različitih M proteina

(SDSPAGE)

12
 Podela
ELEKTROFOREZA
Prema načinu izvođenja
Elektroforetske tehnike:

Slobodna Zonska Izotahoforeza

Izoelektrično
(u rastvoru) (na čvrstoj podlozi) ( elek.
fokusiranje
(pokretljivost) pokretljivost)
Pokretne granice ( pI)
pHLpHT)
pH=const. pH  const.

papir, gel
kapilara

u kapilari

Zonska elektroforeza je slična hromatografiji,

osim što je migracija uslovljena dejstvom električnog polja, 13
umesto mobilnom fazom
 Podela
ZONSKA ELEKTROFOREZA
Prema obliku podloge
1 2
Planarna Kapilarna

Podloga: papir, celuloza-acetat, polimerni gel kapilara (L: 40100 cm, R: 2575 m)
(L: 210 cm) kvarc koji sadrži sinanolne grupe
potopljena u pufer
jednostavna kompleksna
spora brza
ne može se automatizovati može se automatizovati
loša kvantifikacija dobra za kvantitivnu analizu
potrebne velike količine uzorka (L) potrebne male količine uzorka (nL)

14
 VEĆ STE NAUČILIFH

HROMATOGRAFIJA

PROCES

U kome dolazi do razdvajanja komponenata smeše tako da komponente u

većoj (ili manjoj) meri prelaze u drugu fazu sa kojom je smeša dovedena u
dodir

METOD
Razdvajanje
u preparativne svrhe
Izolovanje
Identifikaciju kvalitativna
Određivanje
kvantitativna

Razdvajanje komponenata smeše između DVE FAZE različite pokretljivosti

(stacionarne i mobilne) faze
15
 hromatografija
Istorija

Mikhail Tswett
(18721919)

16
 VEĆ STE NAUČILIFH
PRINCIP
 Rastvor analizirane smeše u MOBILNOJ fazi propušta se kroz
STACIONARNU fazu
 Raspodela komponenata uzorka (rastvorljive u mobilnoj fazi) između
faza uzrokovana je fizičko-hemijskim procesima:
ADSORPCIJA
PODELA IZMEĐU DVA RASTVARAČA (RASTVORLJIVOST), ili
JONSKA IZMENA
POSLEDICA
Komponente smeše se raspodeljuju  između faza i pod uticajem mobilne
faze kreću se kroz stacionarnu fazu  brzinama

Prelazak komponente između faza dešava se sve dok odnos cs i cm

(NERNSTOV KOEFICIJENT RASPODELE) ne dostigne const. vrednost
cs
K  K = f (prirode komponenti, osobina faza, T i afiniteta komp. prema
cm fazama)
17
 Podsetiti se:
Teorijski principi i tehnike izvođenja adsorpcione, particione i
jonoizmenjivačke hromatografije

1. M. Medenica, D. Malešev, “Eksperimentalna fizička hemija“

www.pharmacy.bg.ac.rs/predmeti/instrumentalne
metode (5MRF20INM)/udžbenik.pdf

M. Aleksić, “Hromatografija-teorijski principi“

www.pharmacy.bg.ac.yu/predmeti/fizička_hemija/predavanja_2007-
08/Hromatografija skripta. pdf

18
 VEĆ STE NAUČILIFH

Faze (stacionarna i mobilna) u hromatografiji:

ne mešaju se

imaju  pokretljivosti

MOBILNA FAZA STACIONARNA FAZA

 gas  čvrsto telo ( porozno ili granulisano)
 tečnost  sloj tečnosti adsorbovan na
čvrstom telu
 jonoizmenjivač

19
 Podela

Adsorpciona Podeona(particiona) Jonoizmenjivačka

 adsorpcioni  koeficijenti  afinitetu sastojaka
koeficijenti rastvorljivosti prema jonskoj izmeni

u koloni U koloni u koloni

Na hartiji i na tankom sloju

20
 Adsorpciona hromatografija

Razdvajanje zasnovano na razlici u afinitetu adsorpcije sastojaka uzorka

prema površini čvrste faze
(razdvajanje na osnovu  adsorpcionih koeficijenata)

Podeona hromatografija
Ovde je delimično zastupljen i proces adsorpcije
Razdvajanje bazirano na razlici u rastvorljivosti sastojaka uzorka
 Gasna hromatografija  razlike u rastvorljivosti sastojaka uzorka u
nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi
 Tečna hromatografija  razlika u rastvorljivosti sastojaka uzorka u
pokretnoj (MOBILNOJ) i nepokretnoj (STACIONARNOJ) fazi

Jonoizmenjivačka hromatografija

Razdvajanje bazirano na razlici u afinitetu sastojaka uzorka prema

jonskoj izmeni
21
 Podela

Gasna (mobilna) Tečna (mobilna)

 Gasno  tečna  Tečno  tečna

 Gasno  čvrsta  Tečno  čvrsta

22
 Podela

Planarna U koloni
(hromatografija otvorene podloge) (kapilara i punjena kolona)

Stacionarna: Stacionarna:
Kristalna voda H2O kojom je natopljena
inkorporirana u silika-gel Kapilara: film tečnosti
traka filter-papira ili čvrsti adsorbens
Punjena kolona: čvrsti
zrnasti materijal

Mobilna: tečnost koja se kreće pod dejstvom Mobilna: tečnost koja se kreće pod
kapilarnih sila, ili zemljine teže dejstvom sile zemljine teže i /ili p
 Podela
Prema primenjenoj radnoj tehnici

ELUIRANJE
FRONTALNA ISTISKIVANJE
ANALIZA
Na stacionarnu
Uzorak se unosi u
Na stacionarnu fazu fazu se nanosi kolonu, jedan kraj
se const. dodaje rastvor uzorka, a papira, ili tankog
RASTVOR UZORKA onda supstancija sloja čvrste stac.
i samo komponenta koja istiskuje faze i
koja se najbrže komponente ISPIRA MOBILNOM
kreće dobija se u uzorka i tako ubrzava FAZOM (ELUENTOM)
čistom stanju njihovo kretanje

RETKO SE KORISTI SAMO KVALITATIVNA

KVALITATIVNA I
KVANTITATIVNA

24
 ELUIRANJE
(ispiranje; RAZVIJANJE!!!)
 glavna tehnika razdvajanja kod hromatografije u koloni
 podrazumeva ispiranje prisutnih molekulskih vrsta kroz
kolonu stalnim dodavanjem čistog rastvarača
 proces može biti zaustavljen dok su svi sastojci uzorka
još na podlozi, ili se može nastaviti dok svi sastojci ne
napuste hromatografsku podlogu

ELUENT  MOBILNA FAZA ELUAT RASTVOR koji IZLAZI

kojom se vrši ispiranje iz kolone

1) izokratsko: uvek ista mobilna faza

2) gradijentno: sastav mobilne faze se menja za vreme eluiranja
(npr. 50% metanol (5 min), 60% metanol (drugih 5 min), 70%
metanol (trećih 5 min), itd.)

25
ELUIRANJE

DETEKCIJA

Na kraj kolone postavi se detektor koji

reaguje na prisustvo analita: signal
detektora u funkciji vremena daje
dijagram sa nizom pikova 
HROMATOGRAM

DETEKTORuređaj koji meri promene

u sastavu eluata merenjem nekih
fizičko-hemijskih osobina 26
HROMATOGRAFIJE U KOLONI

√
Gasna hromatografija (GC)

Tečna hromatografija pod visokim

pritiskom (HPLC) √

27
 HROMATOGRAFIJA

OSNOVNI ZAJEDNIČKI POJMOVI

28
 HROMATOGRAF

Uređaj kojim se vrši hromatografsko razdvajanje komponenata smeše

GC(HP)
LC(HP)

HPLC(HP) 29
 HROMATOGRAM

Zone (razdvojene komponente)

raspoređene u stacionarnoj fazi
(u planarnoj hromatografiji: papir,
ili tanki sloj na kome su zone)

unutrašnji

Grafički prikaz odziva detektora

(koncentracije analita u eluatu ili neke
druge veličine (srazmerne koncentraciji))
u funkciji vremena ili zapremine eluata
OD = f(t), tj. c = f(t)
OD = f(V), tj. c = f(t)

spoljašnji 30
 Tipovi hromatograma i kod elektroforeze

1 2
UNUTRAŠNJI SPOLJAŠNJI

sastojci analize: sastojci analize:

prelaze  udaljenosti prelaze isti put u  vremenu
na podlozi za isto vreme detektuju se van podloge
detektuju se na
samoj podlozi

hromatografija u koloni

planarna hromatografija

31
 2 SPOLJAŠNJI HROMATOGRAM

A B
Diferencijalni Integralni

c = f(t) Ukupna količina = f(t)

detektor beleži promenu  detektor beleži ukupnu

koncentracije komponente količinu izeluiranih
(u mobilnoj fazi) u sastojaka u vremenu
funkciji vremena eluiranja

OD OD
-3
c/mmolcm

c/mmol
t t

32
Diferencijalni i integralni hromatogram

33
 HROMATOGRAM

Grafički prikaz (zapis) hromatografskog razdvajanja

Veličina merenog signala (OD) u

funkciji vremena zadržavanja
komponente smeše u koloni

ili
t

Veličina merenog signala (OD) u

funkciji zapremine mobilne faze
koja je potrebna da eluira
komponentu iz kolone
V
34
 KARAKTERISTIKE HROMATOGRAMA
(hromatografskog pika)
Pik = hromatografska kriva  deo diferencijalnog hromatograma koji beleži
detektor pri eluiranju jednog sastojka iz kolone

1 ″mrtvo vreme″

2 retenciono vreme (nekorigovano i korigovano)

3 retenciona zapremina (nekorigovana i korigovana)

4 retencioni faktor

35
 Retencija (zadržavanje)
Komponente se razdvajaju jer se zadržavaju u stacionarnoj fazi različito vreme

1 ″mrtvo vreme″– vreme od momenta unošenja uzorka

Retenciono vreme do pojave pika mobilne faze

2 Nekorigovano  rastojanje od starta do pika date kom.

Retenciono vreme

Korigovano  rastojanje od pika prazne zapremine

do pika date komponente

3
Retenciona zapremina ─││─

36
 Karakteristike hromatograma

Definicije
OD t0  “mrtvo vreme“(retenciono
vreme u mobilnoj fazi)
tR  ukupno vreme zadržavanja,
od trenutka ubacivanja
uzorka do max. pika
t0 t R korigovano retenciono
vreme (retenciono vreme
u stacionarnoj fazi)
h  visina pika ( rastojanje
između osnovne linije i vrha
pika )
W  širina pika
W0,5  širina pika na ½ h

t/min

Vazdušni pik (kod GC)

Prazna zapremina 37
 RETENCIONO VREME
,
t R  t  t0
R

REDUKOVANO (KORIGOVANO) RETENCIONO VREME

t  tR  t0
,
R

t0  vreme od momenta unošenja uzorka do pojave pika mobilne

faze

38
 Karakteristike hromatograma

OD
VR Definicije
VR, V0  “prazna zapremina“
(zapremina mobilne faze koja
bez zadržavanja stiže do
detektora)
V0
VR  zapremina mobilne faze
potrebne da se data
komponenta eluira iz kolone
V R  korigovana retenciona
zapremina

V/mL

Prazna zapremina
39
 RETENCIONA ZAPREMINA
,
VR  V  V0R

VR  t R  u
u  brzina protoka mobilne faze (cm3 s1)

REDUKOVANA (KORIGOVANA) RETENCIONA ZAPREMINA

VR,  VR  V0
, ,
V  t u
R r

40
 4 RETENCIONI FAKTOR (k')

Def. Mera zadržavanja komponente u koloni

,
, t R  t0 t
Matematički izraz k   R
t0 t0

41
 Vrste hromatografije u zavisnosti od sistema koji se analizira

Ispitivani sistem Vrsta hromatografije

Gasovi i isparljive supstancije Gasna

Supstancije različitog hemijskog Podeona

tipa
Supstancije sličnog hemijskog tipa Adsorpciona

Neorganske i jonske supstancije Jonoizmenjivačka

Hromatografija na tankom sloju i
papiru
Jonske od nejonskih Jonoizmenjivačka i
gel hromatografija
Biološki uzorci i jedinjenja velike M Gel hromatografija

42
 HROMATOGRAFSKA ANALIZA
Važno za hromatografsku analizu:

vrsta stacionarne faze; sastav i priroda mobilne faze

sastav i priroda analiziranog uzorka

tehnika injektiranja uzorka i injektorski sistem (posebno kod GC)

T, p, brzina protoka mobilne faze

izbor detektora (osetljivost)

hromatogram

43
 PRIMENA HROMATOGRAFIJE

Kvalitativna analiza Kvantitativna analiza

identifikacija (preko tR, t'R,

VR,V 'R, oblika pika)  određivanje količine na
osnovu h = f(c), P = f(c)
tR je karakteristična vrednost
(automatski (pomoću
na T = const., protoku i
integratora) ili računski
za datu kolonu

dodatne identifikacije  kalibracija

pomoću IR, NMR ili MS

44
A HROMATOGRAM

Nesteroidni anti-inflamatorni lekovi

1. Ketoprofen
2. Naproksen
3. Fenoprofen Ca
4. Flurbiprofen
5. Ibuprofen

Uslovi:
Kolona: Kaseisorb LC ODS 2000 4.6mml.D. 250mm
Mobilna faza: CH3CN/H2O/CH3COOH
T: 25C
Brzina protoka: 1 mL/min
Detekcija: UV na 254 nm

t/min 45
 Poređenje elektroforeze i hromatografije

metoda Elektroforeza Hromatografija

Primena preparativne i analitičke svrhe 

Agens električno polje mobilna faza
Način planarna (čvsta podloga: papir, gel) planarna (otvorene podloge)
izvođenja kapilara kolona (kapilara i punjena kolona)
Separacija naelektrisanje, veličina i oblik polarnost
raspodela između 2 faze (različiti
koeficijenti raspodele)
Detekcija UV/VIS, MS, itd. spektrofotometar, fluorimetar, itd.

Zapis elektroforezogram (elektroforegram) hromatogram

razdvajanja OD = f (migraciono vreme) OD = f(vreme provedeno u koloni)
OD = f(zapremina eluata)
Kvalitativna Migraciono vreme Retenciono vreme
analiza
Analiziraju joni, koloidni rastvori, vitamini, organska jedinjenja (lako (GC) i
se lekovi, proteini, organske kiseline teško isparljiva (HPLC) 46
I
 Separacione instrumentalne metode (principi razdvajanja)
Z  Elektroforeza (šta je, princip, podela)
 Hromatografija (šta je, princip, podela)
V  Hromatogram (karakteristike, definicije i matematički izrazi za
O
karakteristične veličine)
 Poređenje elektroforeze i hromatografije
D

47