Phần I : Cơ sở lý thuyết

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh
của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance
Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký
lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát
triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay
phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao
nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích
.Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm
đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm Thuốc . Và nó
hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần
cho phép định tính và định lượng .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
1 - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách
trong đó pha động là châït lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã
được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất
mang rắn ,hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với
các nhóm chức hữu cơ .Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) .
2- Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột :
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký
và lọai sắc ký .
Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận
hoặc pha đảo .
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion .
Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần
có một pha động .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân
tích A,B,C .. Vào cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra
khỏi nhau sau khi đi qua cột .Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở
đây là tổng hợp các tương tác .

Cháút phán têch A +B+C

F1 F2
F3 Pha âäüng
Pha ténh
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Tổng của 03 tương tác này sẽ quyết định chất nào được
rửa rải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ
nhất ( F1) .và ngược lại .
Đối với mỗi chất ,sự lưu giữ được qui định bởi 03 lực
F1,F2,F3 .Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định .còn F3
là yếu tố ảnh hưởng không lớn .
Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột .F2 là lực kéo
của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột .
Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác
nhau ,Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột
với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột .
( như hình dưới đây )
 Phần I : Cơ sở lý thuyết :
Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong
cột tách sắc ký

Pha động

Thời gian A B
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
3 - Phân loại sắc ký :
Theo cơ chế tách sắc ký người ta phân loaüi như sau :
3.1 Sắc ký hấp phụ :
Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh ,yếu khác nhau của pha tĩnh
đối với các chất tan và sự rửa giải ( phản hấp phụ ) của pha động để kéo
chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động
học của chất hấp phụ . Trong trường loại này có 02 loại hấp phụ :
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động
không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha
động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách các hỗn hợp các
chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân
cực yếu hay trung bình như các Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau ....
Hiện nay chúng ta đang sử dụng chỉ có loại sắc ký này mà thôi.
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Chủ yếu hiện nay chúng ta sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha
đảo ( RP )
Trong dược điển USP khi chúng ta tra cứu cột có giá trị
tương ứng như sau :

L1 : RP 18 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m

L7 : RP 8 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m
L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ 5 - 10 m
Và còn một số loại cột khác như cột Diol , Cột NH2,CN . . vv
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4 - Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Kết quả của quá trinh tách các chất được Detector phát hiện
ghi thành sắc ký đồ như hình trên
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
To : Thời gian lưu chết
tr2
t’r1 : Thời gian lưu thực chất A
t’r2 : Thời gian lưu thực chất B
tr1
tr1 : Thời gian lưu chất A
tr2 : Thời gian lưu chất B

t’r1

to t’r2
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Từ các thông số của các peak trên đây ,nhiều đại lượng đặc trưng
về lý thuyết được đưa ra để dánh giá một quá trình sắc ký .Dưới
đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi
các đại lượng này có lơiü cho quá trình phân tích sắc ký.
4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột
cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời
gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn .Vì vậy
thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất.
Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất ,thành phần,tốc độ của pha động
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
+ Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của
pha động .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém ,còn nếu tr quá
lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của Peak rất kém ,thời gian phân tích
rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoá
chất, độ chính xác của phép phân tích kém.
Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày .
4.2 Hệ số dung lượng K’ : Capacity Factor
Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó
trong hai pha cộng với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong
pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng .
K’ = ( tR - t0)/ t0
Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém . Nếu K’ lớn thì
Peak bị doãng . Trong thực tế K’ từ 1- 5 là tối ưu .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.3 - Độ chọn lọc  :
Độ chọn lọc  cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký ,khi
02 chất A ,B có K’A và K’B khác nhau thì mới có khả năng
tách .,mức độ tách biểu thị ở Độ chọn lọc  .

 = K’B / K’A Với điều kiện K’B > K’A

với  càng khác 1 thì khả năng tách càng rõ ràng

= 1.02 = 1.16 = 1.20

 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều
kiện sắc ký nhất định .Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là
một lớp pha tĩnh có chiều cao là H ,Tất nhiên lớp này có tính chất động tức
là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng nhiệt động
học được thiết lập giữa nồìng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh
và pha động .
Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố :
+ Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh
+ Tốc độ và độ nhớt ( độ phân cực )của pha động
+ Hệ số khuyếch tán của các chất trong cột .
Vì vậy với một điều kiên sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng
định đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được
xác định.
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.2 Số đĩa lý thuyết N:
Số đĩa lý thuyết N được tính theo công thức sau :

N = 5,54 ( tR / W0,5)2

Trong đó : tR : Thời gian lưu của chất phân tích .

W0,5 : Độ rộng tại điểm 1/2 của Peak .
Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của 02 Peak cạnh nhau phải
được tính theo công thức sau :
R= 2( t’RB - t’RA)/ (wa + wB)

Trong thực tế nếu các Peak cân đối ( Gass) thì độ phân giải tối thiểu
để 02 Peak tách là R =1.0 .Trong phép định lượng R=1,5 là phù hợp
+ Nếu R nhỏ thì các Peak chưa tách hẳn ,việc tính toán diện tích Peak sẽ
không chính xác ,lúc này phải tìm cách tăng R theo 03 cách sau:
* Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rửa giải của pha động (
Thay đổi độ phân cực nếu là RP - HPLC ,thay đôíi cường độ ion nếu là
IE - HPLC ....)
* Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc
cột có kích thước nhỏ hơn .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.3 Độ phân giải R : ( Resolution )
* Làm tăng độ chọn lọc  bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với
quá trình tách hoặc thay đổi thành phần pha động .
+ Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu,tốn nhiều pha động ,độ
nhạy sẽ kém. Để khắc phục ta có thể thay đổi hệ pha động hay dùng
chương trình Gradient dung môi . Tuy nhiên trong quá trình chạy sắc ký
dùng chương trình dung môi thì một số pha động có tỷ lệ thay đổi sẽ kéo
theo sự thay đổi đường nền làm ảnh hưởng rất lớn đến thời gian lưu và
diện tích của các Peak ta phân tích .
Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi
mà chủ yếu là chúng ta phải tìm được hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp
ứng các yêu cầu trong quá trình phân tích .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.4 Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Peak trên
sắc ký đồ thu được .
T được tính bằng tỷ số độ rộng của 02 nửa Peak tại điểm 1/10 chiều
cao Peak :

T = a/b
a b

Peak dạng đôïi xứng hình Gauss trên thực tế khó đạt được vì vậy phải quan
tâm đến hệ số không đối xứng T,
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
4.4Hệ số không đối xứng T : ( Tailing factor)
* Khi T  2.5 thì phép định lượng được chấp nhận
* Khi T > 2.5 thì điểm cuối của Peak rất khó xác định
,vì vậy phép định lượng cần phải thay đổi các điều kiện sắc
ký để làm cho Peack cân đối hơn theo các cách sau :
+ Làm giảm thể tích chết tức là đoaün nối từ cột đêïn
Detector .
+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa
giải tăng lên
+ Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột bằng cách pha loãng
mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu .
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
5 Phân loại sắc ký và ứng dụng :
+ Theo cơ chế chia tách của sắc ký ,người ta phân ra các loại sau đây :
Sắc ký hấp phụ ( NP - HPLC và RP - HPLC); sắc ký phân bố - sắc ký chiết
( LLC); sắc ký trao đổi ion ( IE - HPLC) ; sắc ký rây phân tử - sắc ký
gel ( IG - HPLC) .Nhưng thực tế hiên nay chúng ta hiện chỉ đang ứng
dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu .

5.1 Sắc ký hấp phụ :

* Quá trình sắc ký dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh
đối với các chất tan và sự rửa giải (phản hấp phụ) cuả pha động để kéo
chất tan ra khỏi cột .Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động
học của chất hấp phụ .Trong loại này có 02 kiểu hấp phụ:
 Phần I : Cơ sở lý thuyết
+ Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh
phân cực ,pha động không phân cực .
+ Sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC): Pha tĩnh
không phân cực pha động phân cực .
Loại sắc ký này được áp dụng rất rộng rãi ,thành
công để tách các hỗn hợp các chất có tính chất gần tương
tự nhau và thuộc loại không phân cực ,phân cực yếu hay
trung bình như các Vitamin, các thuốc hạ hiệt giảm đau
.......
 Phần II : Hệ thống HPLC
I- Máy HP:C gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt trên sơ đồ sau :

Column

Degasse Pump

Tiím
mẫu

Detector
 Phần II: Hệ thống HPLC
Trong đó :
1- Bình chứa dung môi pha độüng
2- Bộ phận khử khí
3- Bơm cao áp
4-Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample)
5-Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngòai môi trường hay trong bộ điều nhiệt )
6- Detector ( nhận tín hiệu )
7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận,tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều
khiển hệ thống HPLC.
8- In dữ liệu .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.1 - Bình đựng dung môi
- Hiện tại máy HPLC thường có 04 đường dung môi
vào đầu bơm cao áp .Cho phép chúng ta sử dụng 04 bình chứa
dung môi cùng 1 lần để rưaó giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng
tỷ lệ dung môi của 04 đường là 100 % .
Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì chúng ta ít khi sử dụng
04 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chi sử dụng tối
đa là 03và 02 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn
đồng nhất hơn,hệ pha độüng đơn giản hơn để quá trình rửa giải
ổn định .
Hiện 04 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa
giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu
chuẩn .
 Phần II: Hệ thống HPLC
Lưu ý : - Tất cả các dung môi dùng cho
HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có
ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC Hay dung
môi tinh khiết phân tích .
- Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và
pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất
tinh khiết phân tích .
Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay
nhiễu đường nền,tạo ra các Peak tạp trong quá
trình phân tích .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.2 Bộ khử khí Degasse :
Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn
sót lại trong dung môi pha động .
Nêïu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha
động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không
đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi .
- Trong trường hợp bọt quá nhiều Bộ khử khí không thể
loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi
(Bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt
động .
Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân
tích sai .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.3- Pump Cao áp :
- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia
tách sắc ký .Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-
6000 PSI hoặc 250 at đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar) và pump
phải tạo dòng liên tục .Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999
ml/phút .(hiện nay đã có nhiều loại Pump có áp suất rất cao
lên đến 1200 bar)
- Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất
tôïi đa 412 Bar. Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút .
- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt .
Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi
liên tục .
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection):
ĐêØ đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp
không ngừng dòng chảy . Với dung tích của loop là 5 -
100l .
Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ
công( tiêm bằng tay ) và tiêm mẫu tự động( Autosample) .
II.5 Cột sắc ký :
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc
ký lỏng hiệu năng cao .
- Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ ,chiều
dài cột khoảng 10 -30cm ,đường kính trong 1-10mm ,hạt chất
nhồi cỡ  = 5-10 m.(ngoài ra còn có một số trường hợp đặc
biệt về kích thước và kích cỡ hạt....)
 Phần II: Hệ thống HPLC
-Với chất nhồi cột cỡ  = 1.8 -5 m có thể dùng cột ngắn
( 3-10 cm ) và nhỏ ( đường kính trong 1-4.6 mm)loại cột naỳ
có hiệu năng tách cao.
- Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký ( trong
các dược điển USP 23 ,24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột )
- Thông thường chất nhồi cột là Silicagel (pha thuận)
hoặc là Silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp
mỏng hữu cơ ( pha đảo ) ,ngoài ra người ta còng dùng các
loại hạt khác như :Nhôm Oxit,Polyme xốp ,chất trao đổi ion.
* Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt
độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong
bộ phận điều nhiệt (Oven column)
 Phần II: Hệ thống HPLC
II.6 - Detector :
- Là bộ phận Phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và
cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định
lượng .Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà
người ta sử dụng loaüi Detector thích hợp và phải thoả mãn
điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân
tích
A=k.C
Trong : A là tín hiệu đo được
C Nồng độ chất phân tích
k là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn
Tín hiệu này có thể là : độ hấp thụ quang ; Cường độ phát xạ
,cường độ điện thế ,độ dẫn điện ;độ dẫn nhiệt ;chiết suất ..
 Phần II: Hệ thống HPLC
Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau :
+ Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV
+ Detector quang phổ tử ngoại khả kiến ( UV - VIS): 190 -
900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang .đây là loại thông
dụng nhất
+Detector huỳnh quang đêí phát hiện các chất hữu cơ phát
huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang
.Là loại Detector có độ chọn lọc cao nhất .
+Loại hiện đại đại hơn có Detector Diod Array ,ELSD
(Detector tán xạ bay hơi ) các Detector này có khả năng quét
chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của
các chất .
 Phần II: Hệ thống HPLC
- Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là :
+ Detector điện hóa : Đo dòng ,cực phổ ,độ dẫn ,điện
lượng ..)
+ DetectorChiết suất vi sai : Detector khúc xạ ( thông
thường dùng cho đo các chất đường )
+ Detector đo độ dẫn nhiệt ,hiệu ứng nhiệt ..
II.6 - Bộ phận ghi tín hiệu
- Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang .
+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản
có thể vẽ sắc ký đồ,thời gian lưu,diện tích của Peak ,chiều
cao ..
 Phần II: Hệ thống HPLC
+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên
máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số,phổ đồ và các
thông số của Peak như tính đối xứng,hệ số phân giải .... trong
quá trình phân tích đồng thời sử lý ,tính toán các thông số
theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng độ,RSD, ...
II.7 In kết quả :
+ Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do
phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ .
 Phần III : CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
Muốn có một kết quả táh tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện
sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu ; Các điều kiện đó bao
gồm :

Pha tĩnh : - Loại pha tĩnh

- Kích thước cột
Pha động : Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ...
Nếu là chương trình rửa giải Isocratic
Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ
và chương trình dung môi ... Nếu là chương trình rửa giải
Gradient.
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Hệ thống trang bị:

- Loại Detector:
- Van tiêm mẫu,thể tích tiêm
- Hệ đường dẫn
Các yếu tố khác : nhiệt độ ,độ nhạy của detector bước sóng
phân tích
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh

- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất
của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn cột sắc ký phù
hợp có thể là cột pha thuận, cột pha đảo hay các loại cột khác
nhau ...
Chúng ta thông thường dùng 02 loại cột pha thuận ( NP)
và cột pha đảo ( RP)
Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột CN
,cột NH2 ,....
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Cột pha thuận ( NP): Silicagel trung tính

Pha tĩnh :Cột này là loại cột dùng để tách các chất không phân
cực hay ít phân cực .Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các
nhóm OH phân cực ưa nước .
Ví dụ cột Lichrosorb Si 40,Si 60... Cấu tạo cột như sau :
OH OH OH
- O - Si - O - Si - O - Si - O -
OH OH OH
Pha động : dùng cho loaüi này là các dung môi không phân cực
hay ít phân cực như : Methanol,Benzen,Acetonitril,Chlorofoc ...
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.1 : Lựa chọn pha tĩnh

Cột pha đảo ( RP) : ( Silicagel đã Alkyl hóa )
Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất
phân cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH
đã bị Alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch
Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP 8 hay RP 18) hay
các mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl )
vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít .
Ví dụ như cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS , Cột
Nucleosil C18........
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

Pha Động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có
phân cực như :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch
đệm ,hỗn hợp của các dung môi-đệm .
Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó
được ứng dụng chủ yếu trong phân tích Dược phẩm . Hiện nay
chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu .
Hiện nay pha tĩnh trên nền Silicagel đã có hàng trăm chất
khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H ,ngoài ra còn
có các lọai pha tĩnh trên nền Oxid Nhôm,trên nền chất hữu cơ cao
phân tử,trên nền mạch các bon......
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

III.2 : Lựa chọn pha động

- Dựa vào các tài liệu ,Dược điển ,thành phần và tính chất
của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn pha động phù
hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong
mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng
thời phải có thời gian phân tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được
dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt
động của thiết bị .
- Pha động có thể làm thay đổi :
+ Độ chọn lọc 
+ Thời gian lưu
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Pha động có thể làm thay đổi :

+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha
động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt
nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích . Chính vì vậy pha
động cần có cầu yêu cầu sau :
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm
cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH <8.5)
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới
rửa giải được chúng.( đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động
phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có
trong cột ,hay pha động có sẵn trong cột vd : đệm phosphat rưả
ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên column)
+ Pha động phải bền vững theo thời gian : càng bền lâu
càng tốt nhưng ít nhất là chúng là pha động không bị phân hủy
trong suốt thời gia phân tích mẫu ).
+ Phải có độ tinh khiết cao : dung môi cho HPLC, hoá
chất tinh khiết phân tích .
+Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Phải phù hợp với loại Detector : vd UV - VIS thì dung

môi không được hấp thụ quang (vd acid acetic ở bước sáng thấp < 220 nm) . Detector
huỳnh quang thì dung môi không được phát quang.
+ Phải kinh tế ,không quá hiếm và đắt
Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP - HPLC) pha động là dung
môi phân cực là : Nước,ACN,MeOH ,acid hay Base hữu cơ và
một vài Amin hay Aminoacid ..
+ Do sự thêm nước vào dung môi hữu cơ tạo thành một
pha động phân cực hơn chất hữu cơ nguyên một mình nó .Vd
thêm nước vào ACN hay MeOH .. Sẽ tạo được pha động phân
cực hơn nó . Tất nhiên độ phân cực phụ thuộc vào tỷ lệ nước
được thêm vào.
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

+ Ngòai các dung môi chính thì trong thành phần pha
động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn
hợp đệm pH để ổn định pH.Chất tạo phức,tạo cặp ion để tạo ra sự
rửa giải tốt nhất .
+ Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa rải E của
dung môi theo bảng sau:
BẢNG ĐỘ PHÂN CỰC CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
01- n Hexan 0.1 04 - Methanol 5.11
02-Tetra Chloro Carbon 1.6 05- Actenitril 5.8
03- Toluen 2.4 06- Nước cất 10.20
 Phần III : Chọn Ðiều kiện sắc ký

- Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần
thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký . Chỉ khi lựa
chọn điều kiên sắc ký tốt,phù hợp thì chúng ta mới có thể định
tính,định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách
nhanh chóng và hiệu quả cao .
- Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương
pháp chọn điều kiện sắc ký tuy nhiên để chọn được chương trình
sắc ký tốt đồi hỏi phải có thời gian ,tài liệu và một phần kinh
nghiệm của những người làm sắc ký
 Phần IV : Tiến hănh sắc ký
- IV -1 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc :
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo
đảm máy họat động tốt cho kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp
lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi ,tốc đô dòng,năng lượng đèn ü
....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra .
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý
thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa
đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký :
vd : Với sắc ký pha thuận NP-HPLC : rửa bằng MeOH
Không rưẳ bằng Nước
Với sắc ký pha đảo RP-HPLC : Khi chạy pha động có
các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch muối ,sau đó rửa
 Phần IV : Tiến hănh sắc ký
-Tỷ lệ ACN hay MeOH : Nước ( 50 : 50 ) cho sạch hết
các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị
Mốc khi để lâu . Tuyệt đối tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau
đoú để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc
,hỏng không thể dùng được . Xin lưu ý nếu rưẳ cột không tốt thì
kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân
tích .
4.2 - Chuẩn bị dung môi pha động :
Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
Các hóa chất dùng phải là loạûi PA
Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu ,để
ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu
.Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 m ,Siêu âm đuổi bọt khí
 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-4.3 Chuẩn bị mẫu đo HPLC :

+ Mẫu Thử : Sử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui
trình theo nguyên tắc :
- Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động
,trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu
- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc
không rưẳ giải được bằng cách lọc hay chiết ..
-Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2 - 0.45 m
- Nồng độ mẫu ở mức vừa phải,không vượt quá khả năng
tách của cột.Có thể gây ra nghẽn cột.
 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

-Mẫu chuẩn :
Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử
trong cùng dung môi ,riêng về nồng độ các thành phần giôïng
như mẫu thử là tốt nhất ,ngoài ra có thể dùng nồng độ khác
nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng
thành phần.
4.4 Cách đo HPLC :
Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuôcü vào
hãng sản xuất ,phần mền sắc ký . Tuy nhiên cách vận hành luôn
phải theo nguyên tăïc sau :
+ chạy máy với dung môi pha động để đuỏi hết bọt khí có
trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột.
 Phần VI : Kỹ Thuật tiến hănh sắc ký

+ Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như :

* Cấu hình máy
* Tỷ lệ các dung môi pha động
* Bước sóng,thành phần mẫu, các thông số
của quá trình phân tích yêu cầu .
 Phần V
Hệ thống sắc ký Merck - Hitachi
vă phần mềm diều khiển
D7000 – Multi HSM manager
(Sẽ bổ sung sau)

Người viết
KS Phan Hiền Lương
Mail : luonghoak8@ymail.com