BÀI 5: XÁC ĐỊNH HỖN HỢP CAFFEINE VÀ PARACETAMOL TRONG

MẪU DƯỢC PHẨM BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(HPLC_UV)

1/ MỤC TIÊU CỦA BÀI THÍ NGHIỆM:

• Sinh viên cần hiểu rõ được cơ sở và các quá trình phân tách bằng phương pháp
sắc ký.
• Sinh viên cần phải nắm được cách phân loại các phương pháp sắc ký.
• Sinh viên cần phải nắm được các đại lượng cơ bản dùng trong sắc ký.
• Sinh viên cần phải nắm được cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC).
• Sinh viên thực hiện được các bước pha chế dung dịch, lọc dung dịch mẫu chuẩn
và chuẩn bị dung môi.
• Sinh viên cần giải thích được các điều kiện thiết lập cho quá trình chạy sắc ký.
• Sinh viên có khả năng đọc được kết quả phân tích và xử lý kết quả.

2/ GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC – ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ?

2.1. Sắc ký là gì?

Chúng ta có thể cũng đã quen với hình ảnh chạy sắc ký cột trong học phần Thí
nghiệm Hoá Hữu cơ. Khi đó, pha tĩnh được cho vào trong cột sắc ký; sau đó đưa mẫu
phân tích lên phía trên của pha tĩnh. Tiếp theo, ta tiến hành cho dung môi vào và các chất
phân tích trong hỗn hợp mẫu ban đầu sẽ tách dần ra khỏi nhau và rửa giải ra khỏi cột sắc
ký theo những thứ tự khác nhau. Đó là hình ảnh đơn giản và trực quan về sắc ký cột
thông thường, chúng ta có thể chế tạo các loại sắc ký cột đó trên các ống mao quản, hoặc
là các pipette Pasteur hoặc thậm chí có thể sử dụng burette trong phòng thí nghiệm để
tạo cột sắc ký.

Tuy nhiên, đối với các hệ thống sắc ký hiện đại, thì vẫn dựa trên những cơ chế tách
tương tự như vậy, và có gắn thêm các detector. Các chất sẽ đi tới detector theo những

83
thời gian khác nhau, và detector sẽ dựa trên các tính chất đặc trưng để biến đổi các tín
hiệu đó thành các tín hiệu điện; sau đó các sắc ký đồ sẽ được hiển thị lên màn hình máy
tính. Khi đó, chúng ta nhìn thấy các chất sẽ tách dần ra khỏi nhau theo các thời gian lưu
khác nhau và hiển thị thành các peak sắc ký.

Mẫu Pha động

Cột
nhồi
sắc
ký

Tín hiệu của

Detector

Thời gian

84
 Vậy sắc ký là gì? Chúng khác với các phương pháp quang phổ như thế nào?

“Dựa trên sự phân bố liên tục không ngừng của các thành phần trong mẫu phân
tích, sắc ký là một kỹ thuật giúp phân tách các thành phần chất phân tích giữa hai pha.
Pha tĩnh, hấp phụ chất phân tích, là pha đứng yên không di động. Trong khi đó, pha
động có khả năng di chuyển được qua pha tĩnh của nó. Do pha tĩnh có ái lực khác nhau
đối với từng thành phần của chất phân tích trong pha động nên chúng dần dần tách ra
khỏi nhau bằng cách di chuyển đều đặn với tốc độ khác nhau”.

Trong hoá phân tích định lượng, vấn đề về định lượng chất trong các đối tượng
phức tạp là một công việc cực kỳ khó khăn. Nếu như các phương pháp quang phổ, khi
chúng ta tiến hành định lượng một chất, ta chỉ cần dựa trên tín hiệu của detector và tính
được hàm lượng của chất đó dựa trên tín hiệu thu được. Tuy nhiên, đối với sắc ký, ngoài
việc định lượng thì còn tiến hành tách các chất ra khỏi nhau. Sắc ký sẽ tách các chất
trước sau đó mới định lượng các chất, vì vậy việc ảnh hưởng của nền mẫu sẽ không cao
bằng các phương pháp quang phổ. Đồng thời độ chính xác của phương pháp sắc ký cũng
cao hơn nhiều so với phương pháp quang phổ. Ta lấy ví dụ kết quả hiển thị của phương
pháp UV – Vis là theo dạng phổ đám, còn đối với sắc ký thì kết quả hiển thị là các peak.

2.2. Các thành phần của hệ sắc ký?

Như vậy, cấu thành nên sắc ký gồm có 3 thành phần: thứ nhất là pha tĩnh, thứ hai
là pha động (là thành phần di động, nó sẽ hoà tan chất phân tích) và chất phân tích là
thành phần thứ ba được hoà tan trong pha động, sau đó sẽ được đi qua pha tĩnh. Và chất
phân tích sẽ tương tác lên pha tĩnh – pha động với những lực tương tác khác nhau, tổng
tất cả các lực tương tác đó là tổng lực rửa giải E, với khả năng tương tác khác nhau sẽ
giúp chất phân tích di chuyển ra khỏi pha tĩnh với những thời gian khác nhau.

85
 2.3. Lịch sử ra đời của phương pháp sắc ký?

Năm 1903 tại Warsaw, một nhà thực vật học người Nga, Mikhail Tswett đã phát
minh ra sắc ký hấp phụ để tách các sắc tố thực vật, sử dụng dung môi là hydrocarbon và
bột inulin (một loại carbohydrate) làm pha tĩnh. Việc tách các dải màu đã dẫn đến thuật
ngữ sắc ký, từ tiếng Hy Lạp chromatos (“color”) và graphein (“to writing”) — “color
writing”. Tswett sau đó phát hiện ra rằng CaCO3 hoặc sucrose cũng có thể được sử dụng
làm pha tĩnh. Tuy nhiên kết quả sắc ký này đã bị lãng quên trong rất nhiều năm. Năm
1941, các nhà bác học E. Lederer và R. Kuhn ở Heidelberg; P. Karrer ở Zurich và L.
Zechmeister ở Hungary đã áp dụng phương pháp của Tswett để phân tách sinh hóa
Carotein. Trong những năm 1940, sắc ký hấp phụ đã trở thành cụ trong phân tách hóa
sinh. Đến năm 1941, người ta mới phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết
về đĩa để giải thích cho các quá trình sắc ký. Năm 1952, những máy sắc ký khí đầu tiên
ra đời và đã chứng tỏ được các lợi thế tách rất tốt, cùng với năm đó thì hai nhà khoa học
Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao tặng giải
thưởng Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố.

86
 2.4. Các ứng dụng điển hình của phương pháp sắc ký?

Phương pháp sắc ký có rất nhiều ứng dụng trong đời sống và khoa học kỹ thuật,
ta hãy lấy một vài ví dụ điển hình.

❖ Áp dụng phương pháp sắc ký để làm sạch mẫu nước tiểu

Nước tiểu của những người nghiện thuốc lá nặng chứa hoá chất gây đột biến, hoá
chất gây đột biến trong các tế bào sinh học. Các phòng thí nghiệm phân tích sinh học có
thể phân tích các mẫu nước tiểu để tìm thấy các hoá chất này, nhưng các mẫu này phải
được “làm sạch” trước khi chiết xuất bằng methylene chloride. Quy trình “làm sạch” này
sử dụng quy trình sắc ký cột hở. Các cột cao vài inch và rộng khoảng 1 inch được chuẩn
bị bằng cách đóng gói chúng bằng các hạt nhựa hấp phụ đã được xử lý bằng rượu
methylic. Các mẫu nước tiểu được đưa qua các cột này và các chất cản trở được loại bỏ
đi như là một phần của sơ đồ chuẩn bị mẫu.

❖ Áp dụng để sàng lọc thuốc bằng phương pháp TLC

Các loại thuốc lạm dụng, bao gồm thuốc phiện, amphetamine và barbiturate, có thể
được phát hiện trong nước tiểu bằng quy trình TLC. Các loại thuốc đầu tiên được loại
bỏ khỏi nước tiểu bằng quy trình chiết lỏng – lỏng. Dung môi chứa thuốc được chiết xuất
sau đó được phát triển trên tấm TLC bên cạnh chất thuốc chuẩn. Các tấm được nhúng
vào pha động trong buồng triển khai và quá trình sắc ký được thực hiện như hình vẽ.

Các vết kết quả thường không nhìn thấy được trừ khi chúng có huỳnh quang, hoặc
trừ khi chất dẫn xuất có màu của thuốc có thể dễ dàng hình thành khi tấm TLC được
phun hoá chất phản ứng. Nếu chúng không phải là huỳnh quang, chúng cũng có thể được
phát hiện bằng cách sử dụng một tấm đã được thêm hoá chất huỳnh quang vào pha tĩnh,
sao cho chúng xuất hiện dưới ánh sáng cực tím. Nếu như hệ số Rf của một điểm từ mẫu
nước tiểu phù hợp với một trong các chất chuẩn thì khi đó thuốc đã được xác định.

87
3/ CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

3.1 Giới thiệu khái quát về sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Một công cụ phân tích quan trọng để tách (phân tích) và định lượng (tính toán)
của các thành phần trong một hỗn hợp chất lỏng phức tạp đó chính là sử dụng sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC). Trong sắc ký lỏng bao gồm pha động là chất lỏng và pha
tĩnh là chất rắn. Pha tĩnh được nạp trong cột hay được phủ lên trên bề mặt chất rắn. Trong
kỹ thuật này, mẫu phân tích được pha động hòa tan, sau đó cho mẫu phân tích đi qua pha
tĩnh một cách liên tục mà không hòa lẫn với nó. Tuỳ thuộc vào sự tương tác của chúng
với pha động và pha tĩnh, các chất hoà tan khác nhau trong mẫu sẽ di chuyển với tốc độ
khác nhau đi qua pha động trong quá trình sắc ký. Kết quả là, các thành phần mẫu này
sẽ tách ra và tạo thành các dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng. Sắc ký
lỏng hiệu năng cao có thể được phân chia thành nhiều loại tùy thuộc vào cơ chế lưu giữ.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng áp suất cao để đẩy dung
môi pha động đi qua các cột kín có chứa các hạt mịn giúp phân tách có độ phân giải cao.
Chính vì thế mà nó còn được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao.

88
3.2 Sơ đồ bằng hình vẽ cấu tạo của hệ thống HPLC

Van tiêm mẫu

Bể chứa
dung
môi

Bơm kim tiêm

Thừa
thải
Cột bảo vệ

Detector Cột phân tích

Hệ thống dữ liệu

Sơ đồ hệ thống HPLC

Giá dung môi (pha động)

Bể khử khí

Bơm dung môi

Đầu tiêm (bộ lấy

mẫu tự động

Buồng điều nhiệt

Máy dò UV-Vis

89
 3.3 Phân loại sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.3.1 Sắc ký hấp phụ

Sắc ký hấp phụ dựa trên sự phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh nhờ
lực tương tác phân tử (Van Der Waals) thông qua các trung tâm hấp phụ. Pha tĩnh là chất
rắn hoặc chất lỏng có diện tích bề mặt lớn và bền vững về mặt hoá học.

Các hạt rắn với các

phân tử chất phân
tích được hấp phụ

90
 3.3.2 Sắc ký phân bố

Sắc ký phân bố lỏng – lỏng (sắc ký chiết), sự phân bố chất phân tích giữa 2 pha
lỏng (pha tĩnh và pha động) tương tự như quá trình chiết. Pha tĩnh là màng mỏng chất
lỏng, không bền vững hoá học; dễ bị trôi mất pha tĩnh và bị giảm độ lặp lại.

Mặt cắt ngang

của cột hình
ống hở

Chất tan
trong pha
lỏng liên
kết với bề
mặt cột

Sắc ký phân bố Chất mang

rắn
Màng chất lỏng mỏng

3.3.3 Sắc ký trao đổi ion

Sắc ký trao đổi ion: pha tĩnh là chất rắn có khả năng trao đổi ion với chất phân tích
trong pha động. Do đó, lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh là lực tĩnh
điện, phụ thuộc vào pH, bán kính hydrate hoá và điện tích. Pha tĩnh trao đổi cation sẽ
gọi là pha tĩnh cationit; pha tĩnh trao đổi anion sẽ gọi là pha tĩnh anionit.

91
 Các anion di động
được giữ gần các
cation liên kết cộng
hoá trị với pha tĩnh

Các phân tử nhỏ đi

xuyên vào các khe hở
của pha tĩnh

Nhựa trao đổi

anion thì chỉ có các
anion mới bị thu
hút bởi pha tĩnh
Sắc ký trao đổi ion

3.3.4 Sắc ký rây phân tử

Sắc ký rây phân tử: pha tĩnh có diện tích bề mặt lớn, có những đường đi trong lòng
chất rắn (mao quản kích thước cỡ phân tử). Các chất phân tích có thể đi vào tuỳ vào kích
thước phân tử của chúng, nên thời gian rửa giải khác nhau.
Các phân tử lớn bị giữ lại

Sắc ký rây phân tử

92
 3.4 Cách thức chuẩn bị pha động trong HPLC

Khái niệm: Pha động chính là dung môi rửa giải các chất tan ra khỏi cột tách sắc
ký. Pha động là yếu tố thứ 2 ảnh hướng đến quá trình tách.

• Ảnh hưởng tới thời gian lưu (retention time).

• Độ chọn lọc của hệ pha.
• Độ phân giải (Resolution).
• Hiệu lực của cột tách.
• Độ rộng của peak.

93
 3.4.1 Yêu cầu của pha động:

• Khi tiến hành chạy sắc ký, lựa chọn pha động phải trơ với pha tĩnh đang sử dụng.
• Trước khi rửa giải thì điều quan trọng nhất là chất phân tích trong mẫu phải hoà tan
được trong pha động.
• Khi thay đổi pha động, điều quan trọng là phải tính đến khả năng tan lẫn của các
dung môi khác nhau trong pha động khác nhau. Các pha động là dung dịch các
muối vô cơ có chức năng như dung dịch đệm để duy trì sự ổn định của pH. Tuy
nhiên những muối này có xu hướng bị kết tủa trong môi trường hữu cơ và có thể
làm tắc nghẽn cột.
• Trong quá trình phân tích mẫu, pha động phải ổn định (bền), điều này rất là quan
trọng và đặc biệt là không bị phân huỷ trong suốt thời gian đó.
• Dung môi pha động sử dụng trong HPLC phải thuộc loại thích hợp cho HPLC và
có nguồn gốc đáng tin cậy; đảm bảo pha động phải thật tinh khiết.
• Trong quá trình sắc ký, điều quan trọng là đạt được trạng thái cân bằng nhanh
chóng.
• Phải phù hợp với loại detector: đối với detector UV – Vis thì dung môi phải có UV
cutoff thấp hơn bước sóng đang làm việc. Đối với detector huỳnh quang thì dung
môi không được phát huỳnh quang. Đối với detector MS thì pha động cần phải dễ
dàng hóa hơi.
• Các dung môi pha động càng rẻ và thân thiện với môi trường càng tốt.

3.4.2 Làm sạch dung môi (Pre–filtering):

Vì yêu cầu của pha động cho HPLC cần phải có độ tinh khiết cao, không bị bụi bẩn
và không có bọt khí. Vấn đề về độ tinh khiết là của nhà sản xuất đã công bố riêng cho
HPLC và đã có giấy chứng nhận rồi nên chúng ta không thể can thiệp được nữa. Tuy
nhiên, pha động phải được lọc các bụi bẩn, các hạt có kích thước nhỏ bị lẫn và phải được
loại bỏ bọt khí trước khi đưa vào chạy cột. Bởi vì khi chúng ta đưa pha động vào trong
chạy cột sắc ký với áp suất rất là cao để đẩy dung môi, nếu như còn bọt khí hoặc các hạt

94
cặn thì sẽ ảnh hưởng làm áp suất đẩy dung môi không được ổn định, dẫn đến việc tách
không hiệu quả hoặc thậm chí là không tách được.

Trong sắc ký, thông thường sử dụng hệ thống lọc áp suất thấp để lọc pha động qua
màng lọc. Bộ lọc này thường có kích thước lỗ xốp 0,45𝜇𝑚 và có nhiều loại màng lọc
khác nhau để sử dụng:

• Chứa ít hơn 10% dung môi hữu cơ, màng lọc celluloseacetate có thể áp dụng cho
các mẫu nước. Nhưng khi thành chất phần hữu cơ tăng hơn, màng lọc sẽ bị hòa tan
và làm bẩn mẫu.
• Đối với dung môi hữu cơ chứa ít hơn 75% nước thì màng lọc Teflon là sự lựa chọn
hoàn hảo. Nếu làm việc với dung môi hữu cơ có tỷ lệ cao, tốt nhất ban đầu nên làm
ướt màng lọc bằng dung môi hữu cơ tinh khiết, sau đó là dung môi nước, rồi mới
bắt đầu quá trình lọc.
• Khi sử dụng bộ màng lọc nylon, nó rất hiệu quả cho cả dung môi nước và dung môi
hữu cơ. Tuy nhiên, không nên sử dụng với dung môi có tính acid cao hoặc kiềm
mạnh, vì điều này sẽ khiến cho màng lọc bị hỏng.
• Khi tiến hành sắc ký theo chế độ đẳng dòng đa kênh hoặc chế độ gradient, việc lọc
riêng từng loại dung môi là rất quan trọng. Ngay cả khi được pha trộn, các loại
dung môi như đệm phosphate trong môi trường hữu cơ vẫn có thể tạo ra kết tủa.
Để đảm bảo pha đúng cách, nên pha dung dịch có tỷ lệ muối đệm cao nhất (theo
chương trình gradient đã nghiên cứu) ít nhất một ngày trước đó. Nếu dung dịch
xuất hiện bình thường (trong suốt không có gì xảy ra), thì tiến hành theo chương
trình gradient đó.

3.4.3 Đuổi khí (degassing):

• Trong dung môi sau khi lọc sẽ còn khí, các bọt khí này khi vào cột sẽ ảnh hưởng
đến quá trình sắc ký.

95
 • Việc loại bỏ bọt khí ra khỏi pha động, được gọi là đuổi khí (hay khử khí), trước khi
tiến hành sắc ký là một vấn đề thường xuyên, tuy nhiên, có thể thực hiện được theo
một số cách:
▪ Phun khí Helium (khí Helium không bão hoà dung dịch bởi vì nó rất nhẹ,
với tốc độ dòng khí helium là 300 mL/phút, quá trình khử khí hoàn toàn chỉ
mất khoảng vài phút).
▪ Kích động siêu âm (trong vòng 30 phút đến 1 tiếng trong bể đánh siêu âm)
▪ Hút chân không trên bề mặt của chất lỏng.
▪ Kết hợp cả đánh siêu âm và hút chân không.
• Đuổi khí bằng cách đặt chai pha động vào bể siêu âm, điều này thật sự cần thiết
trước khi cho vào chạy cột, bởi vì các bọt khí tạo ra khi khí trộn với dung môi có
thể gây cản trở cho quá trình sắc ký. Quá trình này thường mất khoảng 15 phút (đối
với dung môi hữu cơ) và 35 phút (đối với dung môi nước).

3.4.4 Chế độ rửa giải pha động (elution):

Có hai phương pháp rửa giải pha động được sử dụng để rửa giải các thành phần
hỗn hợp khỏi pha tĩnh:

❖ Rửa giải Isocratic (Đẳng dòng – đẳng dung môi): một thành phần pha động
duy nhất được sử dụng cho toàn bộ thí nghiệm phân tách.
❖ Rửa giải Gradient (Gradient): nồng độ của từng thành phần dung môi pha
động bị thay đổi, thường là dần dần, trong suốt quá trình rửa giải. Nó tương
tự như chương trình nhiệt độ trong sắc ký khí.
❖ Ở chế độ chạy gradient thì áp suất thay đổi tuỳ theo tỷ lệ dung môi, cần có
một bộ phận trộn dung môi theo tỷ lệ thay đổi đã cài đặt trước.

96
Bốn loại tương tác khác nhau có thể xảy ra giữa các phân tử dung môi và chất phân
tích.

o Tương tác lưỡng cực khi chất phân tích và dung môi đều có moment lưỡng cực.
o Tương tác khuếch tán do lực hút giữa các phân tử ở gần nhau.
o Lực hút tĩnh điện, có lợi cho khả năng hoà tan của các loại ion trong dung môi
phân cực.
o Liên kết hydrogen giữa dung môi và chất phân tích khi có một chất tương ứng với
chất cho proton và chất kia là chất nhận proton.

97
3.4.5. Chọn lựa dung môi phù hợp và bơm mẫu vào cột

Đặc điểm của pha động HPLC

Pha động

Các thành phần pha động dung môi

hữu cơ/H2O có độ mạnh dung môi
xấp xỉ bằng nhau

Pha phân Pha phân cực

cực thường đảo

98
 Phân phối dung môi

Pha động được

Dòng chảy đẩy ra khỏi cột
Dòngchảy bị
Piston bị chặn
chặn

Dòng chảy
Dòng chảy mở
được mở

Chốt Dòng
Dòng
bơm chảy
chảy
được Dòng
Dòng chảy
chảy
mở
mở bịbịchặn
chặn

Pha động được kéo vào

từ bể chứa dung môi

Lỗ
thông
hơi
a) Nạp

Lỗ thông Lỗ thông
hơi hơi

99
 3.5. Định danh:

Thời gian lưu giúp chúng ta xác định các chất khi chúng di chuyển qua cột sắc ký.
Khi chất tan di chuyển qua cột, nó sẽ có một khoảng thời gian cụ thể để di chuyển và
thời gian này được lưu giữ không đổi trong các điều kiện sắc ký. Do đó, khi mẫu được
bơm vào cột, chất tan sẽ di chuyển dọc theo cột và sẽ có thời gian lưu giữ nhất định trong
cột sắc ký.

Việc định danh có thể được thực hiện theo hai cách khác nhau:

o Cách 1: Tiêm chuẩn hỗn hợp rồi sau đó tiêm chuẩn đơn
o Cách 2: Tiêm chuẩn hỗn hợp. Tiếp theo tiêm chuẩn hỗn hợp trong đó có một
chuẩn đã được tăng nồng độ. Sắc ký đồ cho thấy peak nào cao hơn là chất
chuẩn đã được pha loãng với nồng độ cao hơn.

3.6. Kỹ thuật tính toán:

Phương pháp tính diện tích peak khác nhau tuỳ thuộc vào kỹ thuật được sử dụng
trong sắc ký. Nồng độ chất phân tích được bơm vào cột tỷ lệ thuận với diện tích peak.
Việc xác định diện tích peak có thể được thực hiện thông qua tự động hoá phần mềm
hoặc tính toán thủ công.

3.6.1. Kỹ thuật so sánh một chuẩn đơn

Tiêm mẫu chuẩn vào máy sắc ký, tín hiệu thu được là diện tích peak (S), từ đó
suy ra nồng độ C tương ứng.

Ta có: S = K.C  K = S/C

Mẫu cần xác định nồng độ được tiêm vào máy sắc ký và có diện tích peak tương
ứng là Sx.

 Nồng độ của mẫu cần xác định là: Cx = Sx/K

100
 3.6.2. Kỹ thuật đường chuẩn (dựng một dãy chuẩn)

Dựng một dãy chuẩn, tiêm vào máy sắc ký các mẫu có diện tích peak Si tương ứng
với nồng độ C của chất phân tích trong mẫu thứ i và thiết lập mối quan hệ S = f(Ci). Thực
hiện tương tự trên mẫu, có tín hiệu Sx. Tìm giá trị nồng độ Cx bằng cách thay thế giá trị
Sx vào phương trình hồi quy tuyến tính.

4/ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HOÁ CHẤT

4.1. Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ Số Dụng cụ Số
lượng lượng

1 cân 1 bể

6 tờ 9 fiol

101
1 ống 6 ống
đong nghiệm

10
1 chày,
đầu
cối sứ
lọc

3
3 pipet
pipet
5mL
10mL

2 3
becher becher
50mL 100mL

102
 2
becher 2 erlen
250 250mL
mL

4.2. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

4.2.1 Pha tĩnh nhồi cột HPLC

4.2.1.1 Điều kiện pha tĩnh trong HPLC

o Trơ, bền với điều kiện chạy sắc ký.

o Có khả năng tách chọn lọc.
o Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng độ xốp.
o Cỡ hạt đồng nhất > 85% hạt có kích thước trung bình.
o Cân bằng động học của sự tách sắc ký xảy ra nhanh và lặp lại tốt.

4.2.1.2 Phân loại pha tĩnh trong HPLC

a/ Phân loại theo cơ chế tách

103
 Loại
Pha thường và pha đảo Phân tử

Là hợp chất không ion

Phân cực hoặc không phân cực
Hoà tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ

Phân tử

Hoà tan trong dung môi hữu cơ

Phân tử
Là hợp chất ion
Tan trong nước
Rây phân tử Phân tử

Là hợp chất không ion

Hoà tan trong nước hoặc trong dung môi hữu cơ

b/ Phân loại theo trạng thái của pha tĩnh

o Sắc ký Lỏng – Lỏng (LLC)

o Sắc ký Lỏng – Rắn (LSC)

104
 c/ Phân loại theo cấu trúc xốp của pha tĩnh

o Xốp toàn phần (toàn bộ hạt nhồi là xốp)

o Xốp bề mặt (vỏ hạt là xốp)

Nghiên cứu để tổng hợp pha tĩnh thì thường được chế tạo pha tĩnh trên nền của
các nguyên liệu:

• Pha tĩnh trên nền silica.

• Pha tĩnh trên nền oxide nhôm (Al2O3).

105
 • Pha tĩnh trên nền cao phân tử hữu cơ (polystyrene cellulose).
• Pha tĩnh trên nền mạch carbon.

Thường hay sử dụng nhiều trong kỹ thuật sắc ký là pha tĩnh trên nền sillca.

Pha tĩnh trên nền silica gồm các loại silica:

▪ Silica trung tính (silica trần).

▪ Silica đã được alkyl hoá.
▪ Silica đã được sufonic hoá hoặc nitro hoá.
▪ Silica đã được amine hoá.

106
▪ Chất độn phổ biến nhất là các hạt siêu nhỏ, hình cầu, có độ tinh khiết cao; Sr = 200
m2/g.
▪ Hầu hết silica không thể sử dụng trên pH = 8, vì nó hoà tan trong base.
▪ Silica với cầu nối ethylene, có khả năng chống lại sự thuỷ phân đến pH = 12.
▪ H2O ảnh hưởng tới bề mặt, khả năng tách, độ lặp lại  Sử dụng cho sắc ký pha
thường (NP – HPLC).
▪ Dung môi: không phân cực hoặc ít phân cực.

107
108
4.2.2. Lựa chọn cột cho HPLC

a/ Phân loại và chọn cột:

109
 b/ Các thông số cột:

4.2.3 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tên máy: Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC YL9100 Plus: đầu dò UV – Vis và bộ
tiêm mẫu thủ công.

Model: YL9100 Plus

Hãng sản xuất: Young Lin – Hàn Quốc

Xuất xứ: Hàn Quốc

Hệ thống bao gồm:

(1) Bơm dung môi 04 kênh.

(2) Bộ khử khí chân không Vacuum Degasser.
(3) Đầu dò UV – Vis với bước sóng đôi.
(4) Lò cột (trong buồng điều nhiệt).
(5) Bộ tiêm mẫu thủ công.
(6) Phần mềm điều khiển hệ thống.
(7) Các phụ kiện, thành phần hỗ trợ.

110
111
4.3 Hóa chất:

Tên Hóa Công thức Hình ảnh chụp

STT Công thức cấu tạo
chất phân tử

Chuẩn
1 C8H10O2N4
caffein

Chuẩn
2 C8H9O2N
Paracetamol

Methanol
3 CH3OH
for HPLC

Nước cất
4
hai lần

112
113
 ❖ Chuẩn bị dung môi pha động (Nhóm 1)

- Dung môi nước: Nước cất 2 lần.

- Dung môi hữu cơ: Methanol chuyên dùng cho HPLC.

- Sau khi chuẩn bị 2 dung môi trên, ta tiến hành lọc dung môi: dùng màng lọc có
lỗ xốp 0,45 μm kết hợp lọc áp suất kém.

- Sau khi lọc, ta tiến hành Degass khí trong bể siêu âm: Đặt 2 bình chứa dung môi
đã được lọc cặn vào trong bể siêu âm khoảng 30 phút.

❖ Pha dung dịch chuẩn gốc (Nhóm 1)

a/ Pha 500 mL dd Caffein 100 ppm:

𝑚𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛𝑒
𝐶𝑝𝑝𝑚 = ⟹ 𝑚𝑐𝑎𝑓𝑓𝑒𝑖𝑛𝑒 = 𝐶𝑝𝑝𝑚 . 𝑉 = 100 × 0,5 = 50(𝑚𝑔) = 0,05(𝑔𝑎𝑚)
𝑉

Tiến hành pha: Cân chính xác 0,05 gam Caffeine đã tính toán trên cân phân tích 4
chữ số, đựng trong becher 100 mL. Đợi cân ổn định, kết quả hiển thị giữ nguyên trong
5 giây. Đọc kết quả, lấy becher ra. Dùng nước cất 2 lần để hoà tan hết lượng rắn vừa cân
trong becher 100 mL, sau đó chuyển toàn bộ dung dịch vào trong fiol 500 mL, tráng rửa

114
cốc 3 lần và cho luôn vào fiol, định mức tới vạch và đậy nút, lắc đều. Ta được 500 mL
dd chuẩn gốc caffeine 100 ppm.

b/ Pha 500 mL dd Paracetamol 100 ppm:

𝑚𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙
𝐶𝑝𝑝𝑚 = ⟹ 𝑚𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑚𝑜𝑙 = 𝐶𝑝𝑝𝑚 . 𝑉 = 100 × 0,5 = 50(𝑚𝑔)
𝑉
= 0,05(𝑔𝑎𝑚)

Tiến hành pha: Cân chính xác 0,05 gam Paracetamol đã tính toán trên cân phân tích
4 chữ số, đựng trong becher 100 mL. Đợi cân ổn định, kết quả hiển thị giữ nguyên trong
5 giây. Đọc kết quả, lấy becher ra. Dùng nước cất 2 lần để hoà tan hết lượng rắn vừa cân
trong becher 100 mL, sau đó chuyển toàn bộ dung dịch vào trong fiol 500 mL, tráng rửa
cốc 3 lần và cho luôn vào fiol, định mức tới vạch và đậy nút, lắc đều. Ta được 500 mL
dd chuẩn gốc Paracetamol 100 ppm.

❖ Pha dung dịch chuẩn làm việc (Nhóm 1)

115
• Chuẩn hỗn hợp (A): Pha 100 mL chuẩn hỗn hợp Caffeine 10 ppm và Paracetamol
5 ppm từ dd chuẩn gốc là 100 ppm bằng nước cất 2 lần.
𝐶𝐶𝐴 đặ𝑐 × 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 𝐶𝐶𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑉𝐶𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 ⟺ 100 × 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 10 × 100
⟹ 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 10 (𝑚𝐿)
𝐶𝑃𝐴 đặ𝑐 × 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 𝐶𝑃𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑉𝑃𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 ⟺ 100 × 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 5 × 100
⟹ 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 5 (𝑚𝐿)
Tiến hành pha: Dùng pipette 10,0 mL hút chính xác 10 mL Caffeine và 5 mL
Paracetamol vào fiol 100 mL, thêm nước cất 2 lần vào và định mức tới vạch sau đó
đậy nút, lắc đều. Ta được dd chuẩn hỗn hợp A.
• Chuẩn đơn Caffeine (B): Pha 100 mL chuẩn đơn Caffeine 10 ppm từ dd chuẩn
gốc là 100 ppm bằng nước cất 2 lần.
𝐶𝐶𝐴 đặ𝑐 × 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 𝐶𝐶𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑉𝐶𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 ⟺ 100 × 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 10 × 100
⟹ 𝑉𝐶𝐴 đặ𝑐 = 10 (𝑚𝐿)
Tiến hành pha: Dùng pipette 10,0 mL hút chính xác 10 mL Caffeine 100 ppm cho
vào fiol 100 mL, thêm nước cất 2 lần vào và định mức tới vạch sau đó đậy nút, lắc
đều. Ta được dd chuẩn đơn Caffeine B.
• Chuẩn đơn Paracetamol (C): Pha 100 mL chuẩn đơn Paracetamol 5 ppm từ dd
chuẩn gốc là 100 ppm bằng nước cất 2 lần.
𝐶𝑃𝐴 đặ𝑐 × 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 𝐶𝑃𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 × 𝑉𝑃𝐴 𝑙𝑜ã𝑛𝑔 ⟺ 100 × 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 5 × 100
⟹ 𝑉𝑃𝐴 đặ𝑐 = 5 (𝑚𝐿)
Tiến hành pha: Dùng pipette 10,0 mL hút chính xác 5 mL Paracetamol 100 ppm
vào fiol 100 mL, thêm nước cất 2 lần vào và định mức tới vạch sau đó đậy nút, lắc
đều. Ta được dd chuẩn đơn Paracetamol C.
❖ Pha dãy chuẩn (Nhóm 3)
Chuẩn bị 6 fiol 100 mL và hút theo tỷ lệ bên dưới (từ dung dịch chuẩn gốc để pha
loãng).

116
 Nhãn tên Blank STD1 STD2 STD3 STD4 STD5
Nồng độ dãy Caffeine 0 1 2 5 10 20
chuẩn (ppm) Paracetamol 0 0,5 1 2,5 5 10
Định mức Định mức tới vạch 100 mL
Sau khi pha xong dãy chuẩn, lọc bằng xylanh và đầu lọc 0,45 μm PTFE
(PolyTetraFuloroThylene – Filter), chuyển phần dịch lọc vào từng ống nghiệm riêng biệt
và dãn nhãn tên theo đúng tên của dung dịch đó.

5/ THỰC NGHIỆM

5.1 Nguyên tắc:

Sử dụng phương pháp HPLC – UV có thể xác định được nồng độ Caffeine và
Paracetamol có trong dược phẩm. Nên xây dựng đường chuẩn, tối ưu quá trình tách trên
chất chuẩn, sau đó tiến hành xác định hàm lượng trên mẫu thuốc.

5.2 Quy trình:

5.2.1 Quá trình phân tách được tối ưu hoá:

Các sinh viên chọn theo điều kiện đã tối ưu với tốc độ dòng là 1 mL/phút , do thời
gian của buổi thí nghiệm bị hạn chế nên không cần thực hiện khảo sát tốc độ dòng chảy.

5.2.2 Khảo sát thành phần pha động:

Thành phần của pha động đang được nghiên cứu, với các phân tích riêng rẽ về từng
thành phần của nó. Để khảo sát sơ bộ quá trình tách, hãy chọn bước sóng 263 nm. Để
nghiên cứu thành phần pha động, chúng ta sẽ sử dụng một hỗn hợp tiêu chuẩn (A). Chúng
ta sẽ tiến hành khảo sát thành phần của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ dung môi (v/v)
theo thứ tự sau:

o CH3OH : H2O = 30 : 70
o CH3OH : H2O = 50 : 50
o CH3OH : H2O = 60 : 40

117
 5.2.3 Xác định các peak và khảo sát bước sóng tương ứng:

Sau khi có được thành phần pha động phù hợp, tiến hành tiêm chuẩn đơn Caffeine
(B) và chuẩn đơn Paracetamol (C) để định danh peak (tR) của từng chất.

o Ở bước sóng 272 nm tương ứng với caffeine.

o Ở bước sóng 207 nm tương ứng với Paracetamol.

Bước sóng phụ thuộc vào độ hấp thu mol ε, bước sóng λ thay đổi dẫn đến độ hấp
thu mol ε cũng sẽ thay đổi. Do đó, bước sóng càng lớn thì ε tại đó càng lớn, độ nhạy của
phương pháp (sensitivity) càng lớn, LOD sẽ càng thấp.

Nếu muốn kết quả phân tích đạt được độ nhạy cao, thì chọn bước sóng λMax lớn
nhất để đạt được độ nhạy tối đa, giới hạn phát hiện tín hiệu LOD sẽ có khả năng phát
hiện và đo chính xác nồng độ nhỏ.

5.2.4 Xây dựng đường hồi quy tuyến tính:

Hệ thống HPLC đang sẵn sàng để chờ tiêm dung dịch. Hãy chắc chắn rằng mẫu
trắng được tiêm trước, tiếp theo là các dung dịch mẫu có chứa các hàm lượng Caffeine
và Paracetamol khác nhau.

118
5.2.5 Phân tích mẫu thuốc:

119
7/ KẾT QUẢ BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

7.1 Khảo sát thành phần pha động:

a/ Đối với hệ CH3OH : H2O = 30 : 70

Ta thấy được 2 peak của hỗn hợp tách nhau tương đối tốt, tuy nhiên vẫn còn bị ảnh
hưởng của nền mẫu khá nhiều, hình dạng peak không rõ ràng, đỉnh peak không nhọn,
peak không hẹp  Khả năng rửa giải kém, khó có thể định danh chính xác.

b/ Đối với hệ CH3OH : H2O = 50 : 50

Ta thấy 2 peak trong hỗn hợp tách tốt, nhưng thời gian rửa giải ra lâu hơn, bề ngang
của peak hẹp và đỉnh peak nhọn.  có thể dùng để định danh tốt các chất.

120
 c/ Đối với hệ CH3OH : H2O = 60 : 40

Ta thấy 2 peak trong hỗn hợp tách tương đối tốt, với thời gian rửa giải ra nhanh
hơn, bề ngang của peak hẹp và đỉnh peak nhọn.  có thể dùng để định danh tốt các chất.

7.2 Định danh các peak và khảo sát bước sóng tương ứng:

Khảo sát thời gian lưu của Caffeine – Thể hiện cường độ chuẩn đơn Caffeine (B)

121
Khảo sát thời gian lưu của Paracetamol – Thể hiện cường độ chuẩn đơn
Paracetamol (C)

Từ 2 hình chụp trên, ta quan sát thấy được:

• Chuẩn đơn Caffeine (B) có bước sóng hấp thu cực đại λMax = 272 nm, tương ứng
với kênh CH1, có thời gian lưu tR = 3,883 phút, diện tích peak cực đại 17019.
• Chuẩn đơn Paracetamol (C) có bước sóng hấp thu cực đại λMax = 207 nm, tương
ứng với kênh CH2, có thời gian lưu tR = 3,133 phút, diện tích peak cực đại 12209.

Hợp chất Kênh Bước sóng hấp Thời gian lưu Diện tích peak
thu cực đại cực đại
Chuẩn đơn CH1 272 nm 3,883 phút 17019
Caffeine (B)
Chuẩn đơn CH2 207 nm 3,133 phút 12209
Paracetamol (C)

122
 Từ đó, ta xác định được peak thứ 1 là của Paracetamol và peak thứ 2 là của Caffeine,
thời gian lưu của Paracetamol nhỏ hơn của Caffeine nên được rửa giải ra sớm hơn.
Căn cứ vào đó để làm cơ sở cho việc định danh các peak ở các chuẩn phía sau.

7.3 Xây dựng đường hồi quy tuyến tính:

Kết quả đo các mẫu chuẩn STD cho Caffeine và Paracetamol

Nhãn Nồng độ Thời gian lưu (tR) Diện tích peak

mẫu CA PA CA PA CA PA
STD1 1 0,5 3,642 3,083 6512 2232
STD2 2 1 3,676 3,027 8272 3537
STD3 5 2,5 3,625 3,042 12171 7875
STD4 10 5 3,683 3,167 19582 15317
STD5 20 10 3,533 3,050 34366 30277

Đường chuẩn A=f(C) của Caffeine trong dãy chuẩn

40000

35000

30000 y = 1.460,150082918740x + 5.083,459369817580

R² = 0,999736892985
25000

20000

15000

10000

5000

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

123
 Đường chuẩn A=f(C) của Paracetamol trong dãy chuẩn
35000

30000
y = 2.961,709784411280x + 593,102819237148
25000 R² = 0,999901889970

20000

15000

10000

5000

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Dựa vào đồ thị, phương trình đường hồi quy tuyến tính của

o Caffeine: A = 1460,150082918740C + 5083,459369817580

o Paracetamol: A = 2961,709784411280C + 593,102819237148

7.4 Kết quả mẫu đo được của phân tích mẫu thuốc

a/ Bột thuốc hoà tan trong 100 mL nước cất 2 lần + hệ số pha loãng f1

124
 Chất Thời gian lưu tR Diện tích peak
Caffeine 3,083 7234
Paracetamol 3,083 27677

b/ Bột thuốc hoà tan trong 100 mL nước cất 2 lần + 0,5 mL Caffeine 100 ppm
với hệ số pha loãng f2

Chất Thời gian lưu tR Diện tích peak

Caffeine 3,008 8383
Paracetamol 3,008 30273

125
 7.5 Xử lý số liệu phân tích mẫu thuốc

1 viên thuốc Panadol Extra sẽ bao gồm 500 mg Paracetamol và 65 mg Caffeine

(đây là số liệu do nhà sản xuất cung cấp).

126
 Trong 0,5036 gam bột 1 viên thuốc panadol extra đã được nghiền mịn thì sẽ có

0,5036 × 500
𝑚𝑃𝐴 = = 366,3611232 (𝑚𝑔)
0,6873
0,5036 × 65
𝑚𝐶𝐴 = = 47,62694602 (𝑚𝑔)
{ 0,6873

% theo khối lượng của từng chất trong 0,5036 gam bột 1 viên thuốc panadol extra
đã được nghiền mịn:

366,3611232
%𝑚𝑃𝐴 = × 100% = 88,49557522%
366,3611232 + 47,62694602
47,62694602
𝑚𝐶𝐴 = × 100% = 11,50442478 %
{ 366,3611232 + 47,62694602

127
 Nồng độ ppm của từng chất trong 0,5036 gam bột 1 viên thuốc panadol extra đã
được nghiền mịn pha loãng với 100 mL nước cất 2 lần:

366,3611232
𝐶𝑝𝑝𝑚𝑃𝐴 = = 3663,611232 (𝑝𝑝𝑚)
0,1
𝑑ị𝑐ℎ 𝑙ọ𝑐 𝑋𝑜
47,62694602
𝐶𝑝𝑝𝑚𝐶𝐴 = = 476,2694602 (𝑝𝑝𝑚)
{ 0,1

Đem dịch lọc Xo đi pha loãng tiếp tục với nước cất 2 lần với hệ số pha loãng f1 =
400 lần.

Nồng độ ppm của từng chất sau khi pha loãng tiếp tục với nước cất với hệ số pha
loãng f1 = 400 lần.

3663,611232
𝐶𝑝𝑝𝑚𝑃𝐴 = = 9,159028081 (𝑝𝑝𝑚)
𝑑ị𝑐ℎ 𝑙ọ𝑐 𝑋1 { 400
476,2694602
𝐶𝑝𝑝𝑚𝐶𝐴 = = 1,190673651 (𝑝𝑝𝑚)
400

Dịch lọc X1 được pha loãng trong fiol 100 mL, vậy thể tích của dịch lọc Xo cần hút
9,159028081×100
để đi pha loãng thành X1 là: = 0,25 (𝑚𝐿 𝑑ị𝑐ℎ 𝑙ọ𝑐 𝑋𝑜 ).
3663,611232

Kiểm tra xem nồng độ của Caffeine theo diện tích peak trong
mẫu thuốc với hệ số pha loãng f1
35000

30000
y = 1.454,294215626210x + 5.172,038333926560
R² = 0,999653555328
25000

20000 Mẫu thuốc

15000

10000

5000

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

128
 Kiểm tra xem nồng độ của Paracetamol theo diện tích
peak trong mẫu thuốc với hệ số pha loãng f1
35000

30000

25000 y = 2.959,457261803850x + 596,593310108814

R² = 0,999928197216
20000

15000
Mẫu thuốc
10000

5000

0
0 2 4 6 8 10

Đem dịch lọc Xo đi pha loãng tiếp tục với nước cất 2 lần + thêm 0,5 mL Caffeine
100 ppm với hệ số pha loãng f2 = 400 lần.

Nồng độ ppm của từng chất sau khi pha loãng tiếp tục với nước cất + thêm 0,5 mL
Caffeine 100 ppm với hệ số pha loãng f2 = 400 lần.

(9,159028081 × 100)
𝐶𝑝𝑝𝑚𝑃𝐴 = = 9,113460777 (𝑝𝑝𝑚)
100,5
𝑑ị𝑐ℎ 𝑙ọ𝑐 𝑋2
(1,190673651 × 100 + 0,5 × 100)
𝐶𝑝𝑝𝑚𝐶𝐴 = = 1,682262339 (𝑝𝑝𝑚)
{ 100,5

Kiểm tra xem nồng độ của Caffeine theo diện tích peak trong mẫu thuốc với
hệ số pha loãng f2 + chất thêm chuẩn 0,5 mL Caffeine 100 ppm
35000

30000
y = 1.451,519777821540x + 5.219,401897749430
R² = 0,999470527310
25000
Mẫu thuốc
20000

15000

10000

5000

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

129
 Kiểm tra xem nồng độ của Paracetamol theo diện tích peak trong mẫu
thuốc với hệ số pha loãng f2 + chất thêm chuẩn 0,5 mL Caffeine 100 ppm
35000

30000

25000

20000 y = 2.945,254383665040x + 618,284401085409

R² = 0,999848646501
15000 Mẫu thuốc

10000

5000

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

8/ TRẢ LỜI CÂU HỎI

Câu 1: Trình bày cấu tạo của một hệ thống sắc lý lỏng hiệu năng cao?

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bao gồm các bộ phận cơ bản như sau:

o Bể chứa dung môi (pha động)

o Bộ phận tách loại bỏ khí (khử khí)
o Bơm cao áp (bơm phân tích)
o Bộ phận tiêm mẫu (đầu tiêm/dụng cụ bơm mẫu tự động)
o Cột bảo vệ
o Cột tách sắc ký (cột phân tích)
o Detector UV
o Data system. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý tín hiệu
và điều khiển hệ thống.

130
Câu 2: Trình bày cơ chế hoạt động của van tiêm mẫu trong sắc ký lỏng?

131
 Trong sơ đồ này, chúng ta thấy được 2 chế độ hoạt động của van bơm 6 chiều – 1
vòng lặp, đó là chế độ Load và Inject. Ở chế độ Load, đầu tiên chúng ta đưa mẫu vào,
mẫu sẽ được phủ đầy vòng lặp (Loop). Sau đó, ta chuyển sang chế độ bơm (Inject), lúc
này mẫu được đưa vào cột.

132
 (a)

Charge

Inject

Ở chế độ Load, thì rõ ràng bơm vẫn hoạt động nhưng lúc này bơm chỉ đẩy dung
môi đi qua cột thôi, và tất nhiên là không có mẫu phân tích ở đây. Vì mẫu phân tích sẽ
được bơm vào và sẽ được phủ đầy vòng lặp, phần còn dư thì sẽ thải ra. Giả sử kim tiêm
có thể lấy được 100 μL và bơm vào 100 μL, thì khi đưa vào cũng chỉ giữ lại vòng lặp là
20 μL thôi, còn lại thải ra ngoài.

Khi chuyển sang chế độ Inject, lúc này ta sẽ thực hiện thao tác “xoay tay van” đi
khoảng 60o. Bơm sẽ đẩy dung môi đi qua vòng lặp và mẫu sẽ được đưa vào trong cột.

Câu 3: Trình bày nguyên tắc hoạt động của đầu dò UV?

Nếu một dung dịch mẫu được chiếu một chùm ánh sáng xuyên qua có bước sóng
thích hợp thì dung dịch sẽ hấp thu một phần năng lượng của chùm sáng đó, phần còn lại
sẽ được truyền qua dung dịch. Sự hấp thu chùm ánh sáng của dung dịch được tính theo
định luật Lambert – Beer. Nếu ta biết được cường độ của chùm sáng truyền qua là bao
nhiêu thì ta có thể tính được nồng độ của dung dịch mẫu đó.

133
 𝐼𝑜 𝐼𝑡
𝐴 = −𝑙𝑜𝑔𝑇 = 𝑙𝑜𝑔 ( ) = 𝜀𝑏𝐶 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 đó 𝑇 = 𝑙à độ 𝑡𝑟𝑢𝑦ề𝑛 𝑞𝑢𝑎
𝐼𝑡 𝐼𝑜

Thông qua ánh sáng đi qua dòng pin, detector phát ra tín hiệu mạnh nhất (lớn
nhất) khi không có dòng mẫu đi qua. Tuy nhiên, khi có mặt một mẫu có bước sóng cụ
thể di tới detector, nó sẽ làm giảm ánh sáng trong dòng cảm biến dẫn đến sự dịch
chuyển tín hiệu của dectector, do đó, giúp phát hiện sắc ký đồ trên giấy. Mẫu hiện tại
của dòng pin hiển thị tín hiệu cao hơn trên màn hình. Nội dung của dòng điện pin bị
ảnh hưởng theo sự dao động trong phản ứng của detector.

(UV – Vis)

Trạm dữ
liệu
Thải thừa

Cảm biến ánh sáng Flow

cell

Từ cột

Về cấu tạo thì detector UV – Vis có cấu tạo tương tự như hệ thống UV – Vis, chỉ
khác nhau ở tên gọi của bộ phận chứa mẫu. Trong hệ thống UV – Vis, ta gọi là Cuvette,
còn trong sắc ký gọi là Flow cell; tức là mẫu phân tích sẽ được chứa trong 1 dòng chảy
liên tục. Tín hiệu đi tới detector là tín hiệu của dòng chảy liên tục mẫu. Bởi vì khi tách
thì các chất sẽ được tách ra theo các thời gian khác nhau và sẽ được đưa qua detector.
Sau khi đưa qua detector thì nếu là sắc ký HPLC dùng để định lượng thì mẫu sẽ được

134
thải ra ngoài; còn nếu HPLC dùng để điều chế thì sẽ có các bộ phận hứng mẫu để hứng
lại các chất đó sau khi tách.

Khi sử dụng detector UV – Vis, ta cần phải lưu ý tới UV cutoff, tức là giá trị λMax
tới hạn của dung môi để có thể sử dụng được trong phân tích

Câu 4: Trình bày cách xác định LOD, LOQ trong bài?

Việc xác định LOD có thể được tiếp cận thông qua nhiều phương pháp khác nhau:
độ lệch chuẩn, tỷ lệ tín hiệu chia cho tạp nhiễu, dựa vào đường chuẩn,…Mục đích của
bài thí nghiệm này là để sinh viên học cách xác định LOD bằng cách sử dụng tỷ lệ tín
hiệu trên tạp nhiễu.

Các quy trình sắc ký và điện di thường sử dụng các công cụ có nhiễu nền, đó là lý
do tại sao việc xác định LOD dựa trên tỷ lệ tín hiệu trên tạp nhiễu có thể được áp dụng
trong những trường hợp như thế, quy trình sử dụng các công cụ có nhiễu nền.

Cách xác định:

Thu tín hiệu của chất phân tích bằng cách chạy mẫu, chất thêm chuẩn ở nồng độ
thấp nhất. Do đó, tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) có thể được xác
định

Trong đó: chiều cao tín hiệu của chất phân tích được ký hiệu là S

N: nhiễu của nền mẫu, thiết bị

Nhiễu đường nền được xác định ở khu vực xung quanh hai bên của đường nền, với
khoảng cách lý tưởng của bề rộng mỗi bên đường nền ít gấp 10 lần chiều rộng của peak
tại nửa chiều cao, khuyến khích nên tính nhiễu lân cận ở hai bên của peak.

Mức LOD chấp nhận đạt được ở nồng độ có tín hiệu lớn gấp 2-3 lần so với nhiễu
đường nền, thường được lấy S/N = 3

135
Câu 5: Trình bày cách xác định phương trình hồi quy tuyến tính trong bài?

- Tỷ lệ thuận với diện tích peak chính là nồng độ của chất phân tích hay nói cách
khác diện tích của peak chính là 1 hàm số theo nồng độ chất phân tích có trong
mẫu A = f(C).
- Thu được các peak tăng dần bằng cách cho chạy máy sắc ký, từng cái một cho
từng dung dịch có chứa chất phân tích với nồng độ tăng dần.

 Một đường thẳng hướng lên trên mà ta thu được đó là đường hồi quy tuyến tính,
lấy diện tích peak làm trục tung và nồng độ chất phân tích làm trục hoành.

Câu 6: Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số nào của sắc ký đồ? Giải
thích?

Quá trình tối ưu tách sắc ký dựa trên các thông số

❖ Thành phần của dung môi pha động: ta tiến hành khảo sát thành phần của pha
động với tỷ lệ dung môi phù hợp để tối ưu hoá thời gian lưu tR và khả năng tách
riêng rẽ thành từng peak của mỗi chất.
❖ Thời gian lưu, thể tích lưu:

136
 Thời gian lưu tR: là thời gian bơm mẫu vào đầu cột cho tới khi peak đạt cực đại.

Thời gian chết t0 hay tm: thời gian cấu tử không được lưu giữ trên cột.

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R: thời gian lưu không tính đến thời gian chết.

Thể tích lưu VR: thể tích dung dịch rửa giải tính từ khi bơm mẫu vào cột cho tới
khi peak đạt cực đại.

Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R: Thể tích lưu không tính đến thể tích trống của cột.

Trong sắc ký khí, tm thường được dùng làm thời gian cần thiết để CH4 di chuyển
ra khỏi cột sắc ký.

❖ Hệ số dung tích k’:

𝑡′𝑅
𝑘′ =
𝑡0

Hệ số dung tích này tỷ lệ thuận với thời gian lưu mỗi chất trong pha động và pha
tĩnh, nếu như giá trị k’ giảm thì sẽ làm giảm sự tối ưu của việc tách sắc ký.

Nếu như k’ ⁓ 0 thì tR ⁓ 0: chất phân tích rửa giải ra nhanh, cột không có khả năng
giữ lại chất phân tích.

Nếu như k’ càng lớn thi tR càng lớn: chất sẽ bị giữ lại trong cột càng lâu, thời gian
rửa giải ra lâu hơn.

137
 ❖ Hệ số phân bố k

Cấu tử A của chất phân tích phân bố giữa pha tĩnh và pha động As  Am

Và sự phân bố này luôn luôn tạo được cân bằng

[𝐴𝑠 ]
𝑘=
[𝐴𝑚 ]

Với [As] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

[Am] là nồng độ chất phân tích trong pha động

Cân bằng phân bố là cân bằng động, luôn luôn được thiết lập trong hệ sắc ký. Đó
là cân bằng lỏng – lỏng, khí – lỏng hoặc là rắn – lỏng. Giả sử chất phân tích phân bố ở
phần nào đó của cột, tức là đĩa thứ N, do pha động tiếp tục di chuyển nên chất phân tích
đi xuống đĩa thứ N+1 và ở đây lại thiết lập 1 cân bằng mới giống như đĩa thứ N. Số đĩa
lý thuyết càng nhiều thì cân bằng thiết lập sẽ càng nhiều, khả năng phân tách sẽ càng tốt.

❖ Hệ số tách α

Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách của 2 chất A và B bằng phương
pháp sắc ký.

𝑘′𝐴 𝑘𝐴 𝑡′𝑅𝐴 𝑉′𝑅𝐴

𝛼= = = =
𝑘′𝐵 𝑘𝐵 𝑡′𝑅𝐵 𝑉′𝑅𝐵

Điều kiện để 2 chất A và B tách ra khỏi nhau là α ≠ 1.

❖ Đĩa lý thuyết

Đĩa lý thuyết là phần nhỏ của cột khi đạt được cân bằng phân bố chất phân tích. N
càng lớn thì peak càng hẹp.

Đại lượng đặc trưng cho độ rộng của peak là độ lệch chuẩn σ ⁓ N

𝑡𝑅 2
𝑁=( )
𝜎

138
 Độ rộng của peak là w = 4σ
2
𝑡𝑅 2 𝑡𝑅
𝑁 = 16 ( ) = 5,54 ( )
𝑤 𝑤1⁄
2

❖ Độ phân giải R

R thể hiện mức độ tách các cấu tử ra khỏi nhau. R càng lớn thì cấu tử A và B tách
nhau ra càng tốt.

∆𝑡 ∆𝑡
𝑅=2 ≈
(𝑊𝑏1 + 𝑊𝑏2 ) (𝑊𝑏1 + 𝑊𝑏2 )

√𝑁 𝛼 − 1 𝑘′2
𝑅= ( )( )
4 𝛼 1 + 𝑘′𝑎𝑣

139
 R ≥ 1,50 thì xem như 2 peak sẽ tách hoàn toàn ra khỏi nhau.

❖ Chiều cao đĩa lý thuyết H

Chiều cao đĩa lý thuyết H liên quan đến chiều cao và độ rộng của peak sắc ký, H
càng lớn thì peak càng hẹp, thời gian lưu càng lâu, khả năng tách càng tốt.

140