1

Supplementary Methods

Preparation of synthetic siRNAs

Sequences of E­cadherin­siRNAs were as follows: site 1, sense strand 5’­

AUU AGG CCG CUC GAG GCA GAG UGC A­3’, antisense strand 5’­

CAC UCU GCC UCG AGC GGC CUA AUU U­3’; site 2, sense strand 5’­

AGC CGG UGU GGU GGC ACA CGC CUG U­3’, antisense strand 5’­

AGG CGU GUG CCA CCA CAC CGG CUA A­3’; site 3, sense strand 5’­

ACC CGG CAG GCG GAG GUU GCA GUG A­3’, antisense strand 5’­

ACU GCA ACC UCC GCC UGC CGG GUU C­3’; site 4, sense strand 5’­

CCA CUG CCC CUG UCC GCC CCG ACU U­3’, antisense strand 5’­

GUC GGG GCG GAC AGG GGC AGU GGG G­3’; site 5, sense strand

5’­CCG GCG GGG CUG GGA UUC GAA CCC A­3’, antisense strand 5’­

GGU UCG AAU CCC AGC CCC GCC GGU G­3’; site 6, sense strand 5’­

UCA CCG CGU CUA UGC GAG GCC GGG U­3’, antisense strand 5’­

CCG GCC UCG CAU AGA CGC GGU GAC C­3’; site 7, sense strand 5’­

GGC CGG GUG GGC GGG CCG UCA GCU C­3’, antisense strand 5’­

GCU GAC GGC CCG CCC ACC CGG CCU C­3’; site 8, sense strand 5’­

CCG CCC UGG GGA GGG GUC CGC GCU G­3’, antisense strand 5’­

GCG CGG ACC CCU CCC CAG GGC GGA G­3’; site 9, sense strand 5’­

GCG GUA CGG GGG GCG GUG CCU CCG G ­3’, antisense strand 5’­

GGA GGC ACC GCC CCC CGU ACC GCU G­3’; site 10, sense strand

5’­CGG UGC CUC CGG GGC UCA CCU GGC U­3’, antisense strand 5’­
 2

CCA GGU GAG CCC CGG AGG CAC CGC C­3’; and mutant siRNA

(site 1), sense strand 5’­AUU AGG UUG CUU UAG GCA GAG ACC A­

3’, antisense strand 5’­GUC UCU GCC UAA AGC AAC CUA AUU U­3’.

Sequences of DNMT1­siRNAs were as follows: sense strand 5’­AAG CAU

GAG CAC CGU UCU CC dTdT­3’, antisense strand 5’­GGA GAA CGG

UGC UCA UGC UU  dTdT­3’ and mutant siRNA, sense strand 5’­AAG

CUU GUG CAG CGU UGU CC dTdT­3’, antisense strand 5’­GGA CAA

CGC UGC ACA AGC UU dTdT­3’.  Sequences of DNMT2­siRNAs were

as follows: sense strand 5’­CCA AGA CGA UUG AAG GCA UU dTdT­

3’, antisense strand 5’­AAU GCC UUC AAU CGU CUU GG dTdT­3’ and

mutant   siRNA,   sense   strand   5’­CCA   ACA   CGC   UUG   AAC   GCG   UU

dTdT­3’, antisense strand 5’­AAC GCG UUC AAG CGU GUU GG dTdT­

3’.  Sequences of DNMT3b­siRNAs were as follows: sense strand 5’­ AGA

UGA CGG AUG CCU AGA GdTdT­3’, antisense strand 5’­ CUC UAG

GCA UCC GUC AUC UdTdT­3’ and mutant siRNA, sense strand 5’­AGA

UGA UGG GUG CUU AUA GdTdT­3’, antisense strand 5’­CUA UAA

GCA CCC AUC AUC UdTdT­3’. 

Construction of tRNA­shRNA expression plasmids

Sequences of tRNA­shRNAs (sites 1­5) targeted to the  erbB2 promoter

were as follows: site 1, 5’­UAU CCC GGA CUC CGG GGG AGG GGG

CAG   AG­  CACACCAA  (loop   sequence)­CUC   UGC   CCC   CUC   CCC

 3

CGG AGU CCG GGA UA­3’; site 2, 5’­UGC AGG GCA ACC CAG CGU

CCC   GGC   GCU   AG­  CACACCAA  (loop   sequence)­CUA   GCG   CCG

GGA CGC UGG GUU GCC CUG CA­3’; site 3, 5’­CCA GCG UCC CGG

CGC   UAG   GAG   GGA   CGC   AC­  CACACCAA  (loop   sequence)­GUG

CGU CCC UCC UAG CGC CGG GAC GCU GG­3’; site 4, 5’­CAG GCC

UGC   GCG   AAG   AGA   GGG   AGA   AAG   UG­  CACACCAA  (loop

sequence)­CAC UUU CUC CCU CUC UUC GCG CAG GCC UG­3’; site

5,   5’­GGA   GGG   GGC   GAG   CUG   GGA   GCG   CGC   UUG   CU­

CACACCAA  (loop  sequence)­AGC   AAG  CGC   GCU   CCC   AGC   UCG

CCC CCU CC­3’; and mutant shRNA (site 1), 5’­UAU CGG GGA CUG

GGG   AAG   AGG   AAG   CGG   AG­CACACCAA  (loop   sequence)­CUC

CGC UUC CUC UUC CCC AGU CCC CGA UA­3’;.

Chromatin immunoprecipitaion assay

MCF­7 and normal breast  epithelial cells  were fixed with formaldehyde

(1%   final   concentration)   at   room   temperature   for   10   min.     Soluble

chromatin was made as described1,2 and subject to immunoprecipitation in

lysis buffer [25mM Tris (pH 8.1), 140mM NaCl, 1% Triton X­100, 0.1%

SDS,   3mM   EDTA,   1x   protease   inhibitor]   with   8µl   of   anti­methylated

histone H3 lysine 9 antibody (UBI, CA, USA) at 4˚C overnight.  Sonicated

salmon sperm DNA (5µg) was mixed with the chromatin solution briefly.

Immunocomplexes were then recovered by adding 50 µl of 50% protein A­
 4

Sepharose beads suspension and incubated at 4˚C for 2 hr.   Beads were

washed sequentially for 5 min each in 10 ml of TSE buffer with 150 and

500mM NaCl, buffer III, and TE (pH 8).  Immunocomplexes were eluted

off the beads by incubation with 200 µl of 1% SDS, 0.1M NaHCO 3.  The

eluent was heated at 65˚C for 6 hr to reverse the formaldehyde cross­links

and   phenol:chloroform   extracted.     Ethanol­precipitated   DNA   was

resuspended in 50 µl TE.  PCR was performed with 10 µl of DNA sample,

specific primers (E­cadherin promoter, forward primer 5’­CAC TCC AGC

TTG GGT GAA AGA­3’, reverse primer 5’­CAG CGC CGA GAG GCT

GCG GCT­3’;  erbB2 promoter, forward primer 5’­CTG AGA CTT AAA

AGG GTG TTA­3’, reverse primer 5’­TTT CTC CGG TCC CAA TGG

AGG­3’) and 22 to 25 cycles.  PCR products were resolved and visualized

with ethidium bromide.  

References

1. Orlando, V., & Paro, R.  Mapping Polycomb­repressed domains in the
bithorax complex using  in vivo  formaldehyde cross­linked chromatin.
Cell 75, 1187­1198 (1993).
2. Orlando, V., Strutt, H., & Paro, R. Analysis of chromatin structure by in

vivo formaldehyde cross­linking. Methods 11, 205­214 (1997).