Palmira Homedes

Tema 2.1: Tècniques i aplicacions

avançades de la reacció en cadena de la
polimerasa (PCR)
Amplificació de l’ADN:

Per fer una digestió necessitem entre 0,5 a 1 microgram d’ADN. Per tant, necessitem més
quantitat d’ADN per tal de poder posar-ho dins del bacteris. Necessitem una estratègia per
poder obtenir més ADN. Aquesta tècnica és la reacció en cadena de la polimerasa(PCR).

Segons el seu creador, la PRC és un procediment químic que farà que la estructura de les
molècules dels nostres gens siguin tan fàcils de veure com un panell lluminós al desert i tan fàcils
de manipular.

Síntesi de ADN: els components:

Cèl·lula PCR
Motllo d’ADN de cadena senzilla Helicasa, etc ?
DNTPs (components estructurals de l’ADN) Present Present
Primer Primassa ?
ADN polimerasa ADN polimerasa III ?
Entorn Nucli Tub d’assaig
Direcció de replicació: de 5’ a 3’.

Els primers o encebador són petits fragments

que són complementaris a la seqüencia de ADN
que volem replicar i que es capça de fer pont
d’hidrogen amb ell. A partir del primer, la ADN
polimerasa és capaç de duplicar la cadena, seguint el motllo.

Aquests primers han de ser específics. Quan

més curt sigui l’encebador, més llocs trobarà,
per tant, no està molt controlat. Quan més
llarg sigui el encebador, més m’asseguro que
trobarà la diana que jo necessito.

Normalment, en el laboratori, uso encebador que es diuen 20-mer, són encebador que tenen
20 bases. La seva probabilitat es de 9,1*10-13.

Si vull fer dos cadenes, necessitaré dos encebadors (si volem amplificar la totalitat del fragment
d’ADN):

 Primer de cap: que ca de 5’ a 3’ i es posa en la cadena de 3’ a 5’

 Primer de cua que va de 3’ a 5’ es posa en la cadena que va de 5’ a 3’.

La seqüencia de l’encebador de cap es igual a la seqüencia que va de 5’ a 3’. La seqüència de cua

va el reves.

Apuntes descargados de wuolah.com

Palmira Homedes

Ara hem crear una doble cadena, i necessitem una cadena senzilla. En el tub d’assaig l’estratègia
que uso per tal de tenir una cadena senzilla és augmentar la temperatura i que ens trenqui els
ponts d’hidrogen. Normalment s’arriba a 90 a 100ºC per desnaturalitzar l’ADN. A part de la
temperatura, també es pot usar concentracions de sal baixes.

Inconvenients d’etapes successives de desnaturalització: Abans de la PCR, es podien realitzar

diferents cicles successius de replicació in vitro, però l’acumulació de
molècules de polimerases desnaturalitzades provocava ràpidament
l’enverinament de les reaccions. Com que la polimerasa necessitem molta
temperatura es va buscar la solució en el Bacteri aquàtics que viu a les
aigües termals i està acostumat a treballar a temperatures elevades. El
que farem es treballar amb l’ADN polimerasa d’aquest bacteri per poder
replicar el ADN.

Etapes de PCR:

1. Desnaturalització per calor del motllo (aprox. 95-100ºC)

2. Hibridació dels primers (aprox. 60ºC): la temperatura la determinarà l’encebador segons

els nucleòtids que contingui

3. Extensió o síntesi de l’ADN (aprox. 60-72ºC): temperatura a la que està acostumada a

treballar la polimerasa del bacteri aquàtic. Treballar a temperatures elevades ens
assegura que estem replicant el que nosaltres volem.

BNext, tu cuenta sin banco.

Palmira Homedes

4. Repetició del cicle (aprox. 95ºC).

Al final de la OCR acabarà amb una electroforesi per poder veure el nostre fragment d’ADN que
em replicat. I veure si hi ha hagut algun problema.

La PCR es veu el resultat a temps final.

Síntesi exponencial: Amb només una molècula de DNA motllo, i sempre que disposem de un
excés de dNTPS i de primers, si realitzem n cicles de
reacció, la quantitat de producte amplificat és de
2n molècules.

En el gràfic, la corba que es veu representada

correspon a la quantitat de producte que
sintetitzem a la reacció de PCR. Quan miro el
producte a traves de una electroforesis, estic en el
planell de la reacció. En aquest nivell, estic una fase
de saturació. La quantitat de producte final que
tinc ja no es proporcional a la de l’inici. I per tant,
és una informació qualitativa. Per tenir informació quantitativa ens hauríem de moure en la
regió lineal de la gràfica.

A vegades, enlloc de ADN, voldrem treballar amb el ARN de la cèl·lula. Ja que totes les cèl3lules
tenen el mateix ADN però la diferent expressió dels gens es el que les fa ser especifiques i per
tant, ens interessarà treballar amb el ARN, concretament amb el ARN missatger. Aquest tipus
d’ARN és el minoritari en la cèl·lula, i encara més per el gen que ens interessa.

Per tal de ser tractat en el ARN, és a través del cADN, que es una copia d’ADN a partir d’un motllo
de mADN per acció de l’enzim de la transcriptasa inversa.

BNext, tu cuenta sin banco.

Palmira Homedes

Transcriptasa inversa:

 La transcripció inversa permet fabricar una còpia en cDNA de l’RNA

 Reactius:
 Transcriptasa inversa RT
 dNTPs
 Tampó per a la RT
 Primers: per assegurar que es repliqui el meu ARNm podríem dissenyar
un encebador específic, però no hi haurà molta quantitat. Però no es
problema perquè després farem un PCR.
o Random hexàmers: combinacions de 6 nucleòtids col·locat aleatòriament i es
poden hibridar a la seva seqüencia complementaria de l’ARN missatger. A partir
del punt on s’hibridin li permetrà a la transcriptasa inversa per crear les cadenes.
o Oligo-dT: és el que ens proporcionarà la cadena de A que ha de haver en es
mARN. Per tant, és assegurem que només sigui el ARN missatger el que es
repliqui.
o Tots dos
 Important:
o Assegurar-se que la reacció és línial
o No intentar transcriure massa RNA
o La sensibilitat de les reaccions posteriors depenen d’una bona RT
o Monitoritzar la reacció de RT per assegurar-se de una eficiència equivalent a
totes les mostres

Mitjançant aquesta reacció aconseguíem un cADN de cadena sencilla, per tant no és un producte
bo per tal de fer una PCR. Necessitem sintetitzar una cadena complementària. Ho fem de la
següent manera:

mARN/ARN cADN ss cADN ds

Transcriptasa inversa ARNsa hidrogenasa i

ADN polimerasa
Palmira Homedes

Llibreries de ADN: Una llibreria d’DNA és una col·lecció de fragments d’DNA que han sigut
clonats en un vector de manera que els investigadors puguin identificar i/o aïllar fragments de
DNA específics per poder-los estudiar. Existeixen dos tipus bàsics de llibreries: llibreries de DNA
genòmic i llibreries de cDNA.

L’ADN genòmic serà el mateix en qualsevol tipus de cèl·lules. En canvi, si treballem amb cADN,
és un material molt més important ja que ens dona
informació sobre els gens expressats en una
determinada cèl·lula. La informació que obtinc dels
gens a partir del cADN És la informació
corresponen als exons, per tant no conté
seqüencies reguladores. Si volem estudis un
promotor, necessitarem un llibreria d’ADN
genòmica.

Si volem clonar el cADN, l’estratègia que he de

segur es lligar-lo amb un adaptador.

Per exemple: hemoglobina

 Aïllament d’eritròcits a partir de la sang de l’individu:

o Els eritròcits fabriquen gran quantitat d’hemoglobina de manera que l’mRNA a
aquestes cèl·lules està enriquit en seqüències per la Hemoglobina
 Construcció d’una llibreria de cDNA,
 L’aïllament de clons corresponents a la Hemoglobina es facilita considerablement:
o DNA genòmic: ~1 de 1,000,000 clons
o cDNA d’eritròcits: 1 de cada 3 clons.

Per tant, com puc veure en el exemple, amb el cADN treballo amb moltes menys molècules i per
tant, és un aprofitament dels recursos que tinc. A part, de trigar menys temps a trobar la
seqüencia que desitjo.

Com podem fer informació quantitativa amb la PCR?

El que hem de fer és que la detecció, enlloc de ser a punt final, ha de ser en el punt de la corba
on hi ha una inflexió, que és el moment on hi ha una amplificació de l’ADN.

Si sintetitzo un producte florescent, veure la

evolució de la fabricació de l’ADN a mesura que
es fa. Per tant, ho podré controla la reacció. Això
és el que es diu una PCR a temps real.

La PCR a temps real permet la detecció temprana

a la fase exponencial de la reacció. En aquestes
condicions, el producte és proporcional a la
quantitat inicial de cADN motllo.

BNext, tu cuenta sin banco.

Palmira Homedes

Aquest és el perfil de la corba que nosaltres

obtindrem amb una PCR a temps reals. L’aparell ens
donarà un valor numèric que correspondrà a
l’expressió del gen que estiguem considerant.

A través d’aquest mètode, també em permetrà

comparar el mateix gen en diferents situacions per
tal de poder extreure conclusions.

Per tal de poder veure el meu producte, necessito que aquest es vagi fent florescent al llarg de
la reacció per tal de poder-lo quantificar. Els reactius que empraré seran:

 SYBR greenagent que s’uneix a l’ADN (agent intercalador)

 Sondes Taqmansondes hidrolitiques

SYBR green: és una molècula florescent i es intercalador i es posa

entre les cadenes de dobles cadena. Perquè la reacció de PCR tingui
lloc necessitem: cADN doble cadena (que serà el motllo),
nucleòtids, encebadors, ADN polimerasa. En aquesta barreja
posarem el SYBR green. De partida té poca florescència i a mesura
que es va unint a l’ADN, sentirà intercalant i hi haurà més
florescència a mesura que hi hagi més ADN.

Inconvenient d’aquesta aproximació: es requereix una elevada

especificitat donat que el SYBR green s’uneix a tots els ADNs de
doble cadena presents a l’assaig (poden haver productes
inespecífics o dimers de primers). Ens hem d’assegurar que només
amplifiquem el que volem.

Aquesta tècnica és molt senzilla i econòmica.

Per solucionar la problemàtica de la “poca especificitat” que té aquesta tècnica, podem recorre
a les sondes Taqman.

Quan la Taqman està hibridada a través de ponts d’hidrogen a la seva seqüencia

complementaria. Al estar hibridada NO veiem fluorescència ja que està actuant com a
apantallador de la florescència. Ens trobem a la fase de hibridació dels encebadors.

BNext, tu cuenta sin banco.

Palmira Homedes

A mesura que la cadena es vagi sintetitzant, la sonda haurà de saltar ja que no pot haver cadenes
de 3 complementaries. En el moment en que la sonda quedi lliure, és quan podrem veure la
fluorescència.

Requisits: la sonda ha de ser complementaria a l’ADN que hem de amplificar. Necessitarem una
sonda per a cada gen que voldrem amplificar.

Un bon assaig de PRC a tempre real:

 Quantitatiu: hem de fer un patró amb varies concentracions d’ADN i posteriorment

valoraríem l’absorbància del resultat de la nostre PCR. I compararem.
 Sensible: volem treballar amb una quantitat molt petita de la nostre mostra: biòpsies,
etc.
 Específic: això va associada a que només amplifiquem la seqüencia que volem, per tant,
els primers han de ser bon. Hi ha dos maneres:
o Manera 1: electroforesis on nomes veurem una banda. Aquesta informació ens
la pot donar la PCR quan nomes veiem un pic de florescència.
o Manera 2: analitzant les corbes de fusió a través de la florescència.

Volem comparar l’expressió de gens control amb els gens “tractats” en el nostre experiment:

Agafarem el gen de referència o control, són gens del quals esperem que la seva expressió no
varií en les nostres condicions experimentals, són els que coneixem com a GENS
HOUSEKEEPING. D’aquests gens s’espera que no varií, però, a més, són gens que s’han
d’expressar a totes les cèl·lules i el nivell d’expressió és constant. Un exemple d’aquest tipus de
gens és els enzims que formen part del metabolisme.

L’aparell ens dona un valor numèric que és el Ct. Sempre hi haurà una florescència basal deguda
a la tècnica emprada. Per tant, sempre hi haurà un llindar a partir del qual hem de considerar la
fluorescència. El valor de Ct, és el moment en el qual es supera el llindar de fluorescència. Per
cadascun dels gens que usem, tindrem el seu corrompen Ct.

Un valor de Ct petit, implica que es un gen que s’està expressant més que els altres.

BNext, tu cuenta sin banco.

Palmira Homedes

De cadascun dels gens obtinc el seu Ct i les formules que empro són les segünets:

Exemple:

Un valor final positiu implica que hi ha hagut un augment de l’expressió del gen que estic
estudiant.

Un valor final negatiu implica que el gen del meu estudi ha disminuït la seva expressió.