Dấu phân tử (phần II)

Các dấu dựa trên DNA

Các điểm đánh dấu chuỗi
(Sequence-tagged Sites)
 Sequence-tagged Microsatellites

„ Microsatellites đánh dấu trình tự chuỗi (STMS)

- cũng được biết như tính đa hình của những trình
tự lặp đơn (Simple Sequence Repeat Polymorphism)
„ Thường được dùng phát hiện 1 locus, dãy nhiều alen
„ Dấu đồng trội
„ Tính lặp cao
 Anchored Microsatellite
Oligonucleotides

„ Khuếch đại các đoạn gene nằm cạnh bởi các đoạn lặp
„ Bắt cặp chuyên biệt với các điểm
„ Giữa các trình tự lặp đơn
- được gắn đầu 3’
„ Các dấu thường là trội
Microsatellites thường hữu ích hơn minisatellites
Các chuỗi “lõi” của cả hai satellites có thể được
dùng
 SCARS và CAPS

„ SCARS - Các vùng khuếch đại cho đặc tính hóa

chuỗi
- dấu locus đơn được rút ra từ các đoạn RAPD
„ CAPS – chuỗi đa hình được “cắt và khuếch đại”
- dấu chuyên biệt cho locus
- sản phẩm được khuếch đại PCR và phân tích
bởi dấu RFLP
 Dấu Simple Sequence Repeat
(SSRs)
ƒ các mãng gồm một- hai- ba- hoặc bốn đơn vị nucleotide (mono-,
di-, tri-, or tetra-nucleotide units)

ƒ được phân bố một cách rộng rãi khắp các bộ gen của động và
thực vật

ƒ biểu hiện mức độ cao về biến dị di truyền dựa trên sự khác biệt
về số lượng các đơn vị trình tự lặp ngẫu nhiên tại một locus
 Tại sao các microsatellites hữu ích một
cách ngoại lệ như các dấu phân tử?

ƒ biến dị rất cao giữa các nhóm (taxa), chủ yếu do tính
biến dị của trình tự lặp ngẫu nhiên - (VNTR)- dạng đa hình

ƒ xảy ra một cách phổ biến ở hầu hết tất cả các bộ gen
của sinh vật chân hạch

ƒ ít hay nhiều phân bố một cách đồng đều khắp bộ gen

ƒ không chức năng, và vì vậy chọn lọc trung tính

Cấu trúc của SSR
 Các dạng đa hình của dấu SSR

ƒ Chiều dài đơn vị lặp

ƒ Kiểu hình đồng trội
SSR
 Phát triển dấu SSR (I)

1 Xây dựng thư viện DNA trong đó các mẫu nhỏ DNA
thực vật được chèn vào vectơ “cloning”

2. Thanh lọc các plasmids mà nó mang DNA với dạng

SSR mong muốn như (ATT)n, (AT)n, .v.v…

3. Chọn các clones plasmid mà chúng được xác định là có

chứa dạng mong muốn sau đó chúng được phân lập để
trình tự chuỗi DNA của toàn bộ đoạn chèn ở đậu nành
có thể được khảo sát.

4. Việc xác định trình tự chuỗI DNA (xác nhận sự hiện

diện SSR và cung cấp trình tự chuỗi chính xác DNA
trên cả hai phía của SSR, điều này thiết yếu cho việc
xây dựng các mồi)
 Phát triển dấu SSR (II)

5.Thiết kế mồi cho PCR ở vùng kề cận SSR

6. Kiểm nghiệm bổ sung cho việc khẳng định dấu hữu ích
SSR.

Phản ứng PCR được đánh dấu bởi đồng vị phóng xạ

32P và sau đó được phân lập dựa trên các gels mang

trình tự chuỗi DNA polyacrylamide biến tính

Các mồi biểu hiện tốt, bằng cách tạo những sản phẩm
sạch đơn sau đó được dùng để kiểm định

Việc kiểm định lần thứ 2 này bao gồm một mãng rộng
hơn của DNA các hoa màu bao gồm nhiều kiểu gen
hơn
 SSR

ƒ Các ứng dụng thích hợp khác - vẽ bản đồ bộ gen,

chọn lọc hổ trợ dấu (marker aided selection-MAS),
phân tích cha mẹ, phân tích di truyền quần thể
ƒ Thông tin hữu ích – hệ thống tính đa hình cao, được
minh chứng và sử dụng rộng rãi, mức độ giàu alen,
các đột biến từng bước “stepwise mutations” cung
cấp thông tin duy nhất về sự tiến hoá
ƒ Khả năng tin cậy – phát triển một cách nghiêm nhặt,
mồi tương đồng (homology) xác định các cá thể có
huyết thống gần
 Universal marker

TGTAAAACGACGGCCAGT

Forward primer with M13(- 21) Reverse primer

tail at the 5’- end
Universal FAM labeled
M13(- 21) primer

Template
DNA CACA…(CA)n…CACA Template DNA

5’- CACA…(CA)n…CACA - 3’

5’- CACA…(CA)n…CACA - 3’

Nature Biotech 18:233-234 (2000)

Khảo nghiệm nhiều mồi
(Multiplex assay)

• Trên ba dấu có thể được sao chép

cùng lúc
• Nhạy cảm vớI số lượng nhỏ DNA
• Các chất huỳnh quang nhuộm màu
khác nhau được dùng để phân biệt
các alen với các khoảng kích thước
trùng lắp
 Khảo nghiệm dấu fSSR

GEL ELECTROPHORESIS

GENESCAN &
GENOTYPER

Đặc tính hoá chính

xác của kích thuớc
và đỉnh các alen
 Đánh dấu huỳnh quang cho dấu SSR có
thể dùng nhiều mồi cùng lúc (Multiplexing)

ƒ Gel Acrylamide gel với

vị trí 5 mồi và khoảng kích
thước chuẩn giữa các mồi
ƒ Bốn màu hoặc nhiều hơn
có thể được phân biệt
trên màn ảnh màu huỳnh
quang
ƒ Mồi cặp đôi với sự khác
biệt kích thước cho phép
phân tích đồng thời chín vị
trí hoặc nhiều hơn
 Phân tích SSR Kích
thước
fm Recombinant inbred line
băng
250bp

200bp

160bp
150bp
Dòng ĐB Giống HD
SS2-2 Sinpaldal 2
 Trình tự chuỗi satt294

Sinpaldal2 SS2-2 Bragg nts382 nts1116 Williams82 NOD1-3

300 bp

250 bp
 Dấu ISSR

Viết tắt bởi (Inter-simple sequence repeat

amplification repeat)
Biến dị của PCR dùng các mồi SSR (nghĩa là
[AC]n để khuếch đại các vùng giữa các trình
tự chuỗi mục tiêu
Sự khuếch đại ISSR amplification giúp khá
phá sự phân bố ngẫu nhiên và phong phú của
SSRs ở các bộ gen thực vật bằng cách khuếch
đại trình tự chuỗi DNA giữa các liên kết gần
SSR.
 Ưu điểm của dấu ISSR

ƒ Không yêu cầu biết trình tự chuỗi

ƒ Các mồi dựa trên trình tự lặp với sự gắn ở đầu 3’ hoặc
đầu 5’, nghĩa là

CACACACACACACACARG

or AGCAGCAGCAGCAGCAGCTY

ƒ Tốt cho việc xác định các các quan hệ thân thuộc gần
 Minh hoạ dấu - ISSR

(A)

(B)
Minh hoạ dấu - ISSR
 Các hạn chế của dấu ISSR

ƒ Các mồi tốt nhất, khi chúng cho dấu in hữu ích nhất
(most informative fingerprints), và phải được xác
định thực tiễn đối với mỗi loài mới khi nghiên cứu.

ƒ Tính lặp phụ thuộc vào: nhiệt độ bắt cặp của mồi,
nồng độ magnesium

ƒ Mồi giàu AT vớI ba nucleotide và mồi có hai

nucleotide không được gắn sẽ không cho băng rõ rệt.
 Các phương pháp khác

Các phương pháp khác “in dấu” dùng các mồi

bổ sung vào các dạng của SSR bao gồm các
mồi chuyên biệt đơn SSR kết hợp với mồi
ngẫu nhiên (Davila et al., 1999), hoặc kết hơp
với mồi mà nó tác động vào chuỗi DNA phong
phú khác như yếu tố chuyển vị ngược
retrotransposon (Provan et al., 1999)
Các dấu dựa trên DNA
 Dấu AFLP

Amplified
Fragment
Length
Polymorphism
 Dấu AFLP

Kỹ thuật này bao gồm các bước như sau:

I. Dùng enzyme phân cắt tới hạn DNA của bộ gen

II. Sự kết gắn của các các oligonucleotide adapters
III. Khuếch đại tiền chọn lọc (Preselective amplification)
IV. Khuếch đại chọn lọc với các mồi đánh dấu (Selective
amplification with labeled primers)
V. Phân tích các đoạn khuếch đại trên gel
 Tới hạn của bộ gen DNA

Các đoạn phân cắt tới hạn của bộ gen DNA được sản sinh
bằng cách dùng 2 enzymes phân cắt tới hạn khác nhau: một phân
cắt phổ biến (enzyme MseI phân cắt 4 base) và một cắt hiếm
hơn (enzyme EcoRI phân cắt 6 base). Ba dạng của các đoạn
phân cắt tới hạn được tái sinh: một với enzyme EcoRI cắt tại
hai đầu, một với enzyme EcoRI và enzyme MseI cắt tại đầu
khác, và một với enzyme MseI cắt tại cả hai đầu.
 Sự kết nối của các “Adapters”
Oligonucleotide

Sợi đôi adapters bao gồm một trình tự lõi và một trình tự
enzyme-chuyên biệt. Chúng chuyên biệt cho hoặc điểm do enzyme
EcoRI hoặc điểm do enzyme MseI. Các đoạn tới hạn và sự kết
nối diễn ra trong một phản ứng đơn. Sự kết nối của “adapter”
vào DNA được phân cắt tới hạn thay đổi điểm phân cắt tới hạn
do vậy sẽ ngăn được đoạn phân cắt thứ hai diễn ra từ lúc sau
khi sự kết nối xảy ra.
 Khuếch đại tiền chọn lọc
[Preselective Amplification (I)]

Các mồi (primers) được dùng trong giai đoạn này bao gồm
một trình tự lõi, trình tự enzyme chuyên biệtr và sự kéo dài
của base chọn lọc đơn tại đầu 3’.

Các trình tự của “adapters” và các điểm tới hạn dùng như
mồi gắn với các điểm cho “sự khuếch đại PCR tiền chọn lọc”.
 Khuếch đại tiền chọn lọc
[Preselective Amplification (II)]

Mỗi mồi tiền chọn lọc có một nucleotide “chọn lọc” mà

nó sẽ nhận biết phần phụ của các đoạn tới hạn và hợp với
nucleotide “dưới dòng” (nucleotide downstream) từ điểm
tời hạn.

Các sản phẩm đầu tiên của PCR tiền chọn lọc là những
đoạn có một enzyme MseI phân cắt và một enzyme EcoRI
cắt, đồng thời cũng có nucleotide bên trong tiếp hợp.

Giai đoạn khuếch đại tiền chọn lọc đạt sự giảm 16 lần
hỗn hợp phức của các đoạn.
 Khuếch đại chọn lọc
[Selective Amplification (I)]

Các mồi chọn lọc hoặc được gắn đồng vị phóng xạ hoặc được gắn
chất huỳnh quang.
Chúng cấu tạo bởi một trình tự chuỗi giống nhau với các mồi tiền
chọn lọc cộng với nucleotides chọn lọc bổ sung ở đầu 3’ (nghĩa là,
một tổng cộng ba nucleotides chọn lọc).
Hai nucleotides bổ sung có thể là bất kỳ của 16 tổ hợp của 4
nucleotide.
 Khuếch đại chọn lọc (II)

Từ số lượng lớn các phân đoạn được tạo ra bởi hai

enzyme tới hạn, chỉ một phần nhỏ phân đoạn có nucleotides
trùng nhau tạI tất cả 3 vị trí sẽ được khuếch đạI vào giai
đoạn này (khoảng 50-200 phân đoạn).

Bước này giảm phức hợp của sản phẩm PCR hỗn hợp
khoảng 256 lần.

Các tổ hợp mồi khác nhau sẽ sản sinh nhiều phân đoạn
khác nhau.

Thanh lọc bước đầu thường chọn cặp mồi mà nó cho

mức độ biến dị thích hợp đối với các nhóm nghiên cứu.
Phân tích dấu AFLP dựa trên Gel
 Khảo nghiệm dấu fAFLP

GEL ELECTROPHORESIS

GENESCAN &
GENOTYPER

50-300 được
chọn nhưng các
đơn vị khúêch đại
từ PCR “ẩn”
Khoảng áp dụng rộng của kích thước bộ gen

Các tổ hợp mồi sẽ minh chứng hữu ích hơn

những mồi khác, tùy vào kích thước bộ gen khảo
nghiệm. Nếu bộ gen khác được trắc nghiệm,
người dùng cần xác định nếu bộ gen được phân
cắt tới hạn một cách thích hợp do hai enzyme
EcoRI và MseI. Nói chung, dấu AFLP sẽ cho in
dấu di truyền chất lượng vớI bộ gen thực vật từ
5 x 108 đến 6 x 109 cặp base (base pairs-bp).

Khi kích thước bộ gen của vài loài thực vật vào
khoảng 3,000 Mbp, có bao nhiêu phân đoạn DNA sẽ
được thấy khi dùng enzyme EcoR1 và Mse 1 cũng
như mồi EcoR 1 và mồi Mse1 chứa 3 nucleotide
chọn lọc, theo thứ tự?
 AFLP
Ưu điểm
„ Mức độ nhạy cảm cao
„ Tính lặp cao
„ Ứng dụng rộng

Nhược điểm
„ Đắc tiền
„ Yêu cầu kỹ thuật
„ Sử dụng đồng vị phóng xạ
„ Vấn đề giải thích
 Quy trình cDNA-AFLP

- RNA tổng số được phân lập từ mầm nốt rể (primordia) 7 ngày

sau khi chủng vi khuẩn Bradyrhizobium japonicum (USDA110)
- sợi đôi cDNA được tổng hợp bằng cách dùng bộ kit tổng hợp
cDNA (Roche)
- 30ng của cDNA được dùng cho cDNA-AFLP với mồi EcoRI+NNN
- các mẫu được đặt lên gel 5% polyacrylamide/6M UREA và được
nhuộm bạc
- Các đoạn DNA khuếch đại được hồi phục từ gel
- Tái khuếch đại với cùng mồi
- nhân dòng (Cloned) bởi T-vector và trình tự chuỗi với bộ kit Big
Dye Terminator Cycle Sequencing
- Các trình tự chuỗi được phân tích bằng cách sử dụng chương
trình BLAST
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

In dấu cDNA-AFLP của giống Shinpaldalkong 2 và SS2-2 được dùng bởi

các tổ hợp mồi. Cột 1, 6: bộ mồi 1+6+11; cột 2, 7: bộ mồi 2+7+12; cột 3, 8:
bộ mồi 3+8+13; cột 4, 9: bộ mồi 4+9+14; cột 5, 10; bộ mồi 5+10+15
 Primer Set Number
M 13 14 15 16 17 18 M
Sh S Sh S Sh S Sh S Sh S Sh S

Primer Set Number

8 9 10 1112M 13 14 15 16 17 18 M 19 20 21 22 23 24 M
Shssh SshSshSsh S shS shS shSshSshSshS shSshSshSshSshSshS

Phân tích cDNA-AFLP giống đậu nành Sinpaldalkong2ho và giống SS2-2 bằng cách nhuộm
bạc. Các mũi tên dùng để chỉ sự khác biệt gene biểu hiện hoặc giống Sinpaldalkong2ho
(mũi tên xanh) hoặc SS2-2 (mũi tên đỏ). Số lượng mồi: các tổ hợp mồi từ 6 mồi EcoRI và 6
mồi MseI. Sh: Sinpaldalkong2ho ; S: SS2-2.
 Tóm tắt các dấu phân tử thông dụng

Một Locus Phát hiện

bằng cách
ƒ RFLP
(restriction fragment length polymorphism) Lai

ƒ CAPS
(cleaved amplified polymorphic sequences) PCR

ƒ SNP (Single nucleotide polymorphism)

- DASH (dynamic allele-specific hybridization) Lai
- DNA chip Lai
- DNA sequencing Trình tự chuỗi
- SSCP (single strand conformation polymorphism) Cấu tạo
 Tóm tắt các dấu phân tử thông dụng
Nhiều Loci Phát hiện
bằng cách
ƒ AFLP (amplified fragment length polymorphism) PCR

ƒ RAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR

ƒ SSLP (simple sequence length polymorphism) PCR

- VNTR (variable number of tandem repeat) Hybridization
- SSR/STR
(simple sequence repeats/simple tandem repeats) PCR

ƒ ISSR (inter-simple sequence repeat

inter-simple tandem repeats) PCR

ƒ SNP (Single nucleotide polymorphism)

- SSCP (single strand conformationpolymorphism)
when used to scan for randomly located SNPs Cấu tạo
 Các thuộc tính của dấu “đồng trội”
dựa trên phản ứng PCR

Dạng biến dị

Nguồn gốc
dấu

Dấu dẫn xuất?

Bao phủ bộ gen

 Các thuộc tính của các dấu độc lập
với trình tự chuỗi

Dạng biến dị

Nguồn gốc
dấu

Bao phủ bộ
gen