Single Nucleotide Polymorphism

Benning ATGCT TAGTC

Danbek ATGCG TAGTC
Hutcheson ATGC T TAGTC
Williams ATGCT TAGTC

* Dạng phong phú nhất của biến dị di truyền

* Nguồn tài nguyên cho việc vẽ bản đồ các tính trạng
di truyền phức tạp
 Dấu SNP

Mặc dù từng cá thể SNPs cho ít thông tin về đa hình

hơn so với dấu SSRs, chúng cũng có vài ưu điểm:
- Phong phú hơn (1/kb)
- Dấu SNPs có thể làm thay đổi cấu trúc mRNA/protein
hoặc các mức độ biểu hiện
- Dấu SNPs được di truyền ổn định
- Tiềm năng to lớn hơn là việc tự động hóa khi dùng in
dấu SNP
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)

G T A T

C A T A
Denature Denature
G T A T

C A T A
Snap-cool Snap-cool
TG AT

AC TA

ds DNA
 Khám phá SNP bằng cách dùng dHPLC
High Pressure Liquid Chromatography

PCR - Pooling - dHPLC - Sequencing

Heteroduplex detection
100개 1000개
TransGenomic WAVE DHPLC
 Microchip DNA

5’ … CGGATCGGCTAACACTCAGCTACGCGAGCATTG… 3’ Allele A
5’ … CGGATCGGCTAACACTTAGCTACGCGAGCATTG… 3’ Allele B

G/C homozy gote C/T heterozy gote T/T homozy gote

G T G A G T C G G T G A G T C G G T G A G T C G

T
G
C Allele A
A

G T G A A T C G G T G A A T C G G T G A A T C G

T
G Allele B
C
A
 Phương pháp Flow Cytometry
1. Ligation Target PCR- SNP query position
amplified product A

T Fluorescein-labeled
Allel-complementary allele-complementary
ZipCode sequence sequence sequence

Capture Probe Reporter Probe

2. Hybridization to Microsphere
Ligated capture and reporter probes

cZipCode sequence
Luciferase sequence Fluorescent microsphere
15-18 Carbon spacer 2000. 39: 131-140
By Cytometry

3. Flow Cytometric Analysis

Pureunkong Jinpumkong 2

Lx 1 lx 1

Lx 2 lx 2

Lx 3 lx 3

Beany taste
 Lipoxygenase 2
Pureunkong 1 GGTGTCGGGAATCCTGAACAGAGGAGGAGGGCATAAGATAAAAGGGACAGTGGTGTTGAT
Jinpumkong 1 GGTGTCGGGAATCCTGAACAGAGGAGGAGGGCATAAGATAAAAGGGACAGTGGTGTTGAT
************************************************************
Pureunkong 61 GAGGAAGAATGTGTTGGACTTCAACAGCGTGGCTGATCTTACTAAAGGAAATGTTGGGGG
Jinpumkong 61 GAGGAAGAATGTGTTGGACTTCAACAGCGTGGCTGATCTTACTAAAGGAAATGTTGGGGG
************************************************************
Pureunkong 121 ACTCATAGGCACCGGCCTCAACGTTGTTGGCTCAACACTTGATAACCTCACTGCTTTCTT
Jinpumkong 121 ACTCATAGGCACCGGCCTCAACGTTGTTGGCTCAACACTTGATAACCTCACTGCTTTCTT
************************************************************
Pureunkong 181 GGGCCGAAGTGTCGCCCTACAGCTCATTAGTGCTACCAAACCTCTTGGTTCATTTCTTCT
Jinpumkong 181 GGGCCGAAGTGTCGCCCTACAGCTCATTAGTGCTACCAAACCTCTTGGTTCATTTCTTCT
************************************************************
Pureunkong 241 TCCTTCCACATAATCAATAACTTCTATATTCAAAATTAAGTGTTTAATCTCTATACTCTC
Jinpumkong 241 TCCTTCCACACAATCAATAACTTCTATATTCAAAATTAAGTGTTTAATCTCTATACTCTC
********** *************************************************
Pureunkong 301 ATTCATTTCATTCAATGAAAAAAAAATCATAAGACTTTTAACTAAAATTAACCTATGTAA
Jinpumkong 301 ATTCATTTCATTCAATGAAAAAAAAATCATAAGACTTTTAACTAAAATTAACCTATGTAA
************************************************************
Pureunkong 361 AGAATCGCAAACAAAAAACTATATAATATTAAAGTTTATTTACTTTTTTTTATAATGACC
Jinpumkong 361 AGAATCACAAACAAAAAACTATATAATATTAAAGTTTATTTACTTTTTTTTATAATGACA
****** ****************************************************
Pureunkong 421 AAAAAAATTATTGTATATGGTGCACAAATTTTTGTACTCTTTAAAAATATATCACTTTAT
Jinpumkong 421 AAAAAAATTATTGTATATGGTGCACAAATTTTTGTACTCTTTAAAAATATATCACTTTAT
************************************************************
Pureunkong 481 ACATAGCCAAACATATTTATTTTGTATAGTATTAACTTATTTGGGTACGTACCTTAATAA
Jinpumkong 481 ACATAGCCAAACATATTTATTTTGTATAGTATTAACTTATTTGGGTACGTACCTTAATAA
************************************************************
Pureunkong 541 TATTATTATGTGTGTATGTATGGTCTGTTTGTAGCAAATGGAAAAGGAAAAGTTGGAAAG
Jinpumkong 541 TATTATTATGTGTGTATGTATGGTCTGTTTGTAGCAAATGGAAAAGGAAAAGTTGGAAAG
************************************************************

Sự sắp xếp trình tự chuỗi theo cặp giữa Pureunkong và Jinpumkong2 ở mồi Lx-2
Phương pháp mở rộng của SNaPshot ddNTP
Pureunkong Jinpumkong 2
SNP SNP

NTCATTTCTTCTTCCTTCCACATN NTCATTTCTTCTTCCTTCCACACN
Denature
the template
NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTAN NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTGN

Genotyping primer-1 Genotyping primer-2

5’ -TCATTTCTTCTTCCTTCCACA 5’-TCATTTCTTCTTCCTTCCACA
NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTAN NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTGN

PCR with
fluorescence ddCTP ddTTP ddGTP ddATP
labeled
ddNTP TCATTTCTTCTTCCTTCCACAT TCATTTCTTCTTCCTTCCACAC
NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTAN NAGTAAAGAAGAAGGAAGGTGTGN

Amplified
TCATTTCTTCTTCCTTCCACAT TCATTTCTTCTTCCTTCCACAC
products
Hình phân tích SNaPshot Analysis dùng ABI377
Plant Physiology (2000) 124:1483-1492
 PCR with allele 1-specific primer (ASP1) and allele 2-specific
primer (ASP2)

5’ 5’
Reverse primer Reverse primer
3’ T
3’ C
ASP1 No amplification
ASP1 G G
5’
5’ Reverse primer
Reverse primer
3’ C 3’ T
ASP2 ASP2 A
A No amplification
allele1 allele2
Analysis of PCR by gel electrophoresis

Homozygous to A1/A1 Heterozygous to A1/A2 Homozygous to A2/A2

 !
Xem thí dụ về gen
GmNARK ở đậu nành
Làm thế nào xác định
kiểu gen bằng
phương pháp SNP
vừa đơn giản vừa rẻ
hơn?
Template amplification Primer binding Primer extension

SNP
genotyping

Primer terminates Primer extension products

Phân tích quang phổ của các sản phẩm kéo dài đoạn mồi
 Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (CAPS)

1) Việc sử dụng dấu SNPs trong bộ gen để khảo nghiệm

có tiềm năng cung cấp những trả lời cho nhiều câu hỏi
quan trọng liên quan đến sinh học.

2) Hầu hết những khảo nghiệm này đòi hỏi những trang
thiết bị chuyên biệt và đắt tiền dùng cho việc phân tích.

3) Dấu Cleaved amplified polymorphic sequences

(CAPS) cho thấy việc khảo nghiệm mạnh và hiệu quả
mà nó có thể được thực hiện trong các phòng thí
nghiệm và việc sử dụng các trang thiết bị cũng không
phức tạp.
Nguyên tắc của khảo nghiệm dấu CAPS

1) Khuếch đại PCR của từng điểm SNP

2) Việc phát hiện các điểm này bằng cách dùng

enzyme phân cắt tới hạn thích hợp mà trình tự nhận
biết có thể bị thay đổi bởi dấu SNP.

Nếu làm bằng tay, việc chọn lọc các enzyme phân
cắt tới hạn thích hợp có thể khó khăn và tốn nhiều
thời gian.
Generation and visulaization
of Arbidopsis ecotype-
specific CAPS markers
Vị trí bản đồ và mồi PCR đối với Arabidopsis dùng dấu CAPS

Một bộ gồm 18 dấu CAPS markers, đồng trội, đuợc phát

triển và vẽ bản đồ thành công bằng cách dùng tổ hợp lai đơn
của thế hệ F2
Enzyme phân cắt tới hạn
phát hiện sự đa hình
thẳng đứng ở giống
Landsberg (Ler) và giống
Columbia (Col) với các
sản phẩm khuếch đại của
dấu CAPS

Each pair of primers

amplified a single major
PCR product and the size of
each PCR product was as
predicted from the
nucleotide sequence.

Exception of GAPA
The Ler product was
approximately 10 bp larger
than the Col product
 Frequency of CAPS polymorphisms

A total of 20 polymorphic changes in approximately 5227

nucleotides that comprised the recognition sites surveyed
for polymorphisms in this study.
This suggests that Le and Col differ once every 261, even
though oversimplification.
A total of 18 CAPS markers were developed.
Also identified was at least one restriction endonuclease
for each of these PCR products that generate ecotype-
specific digestion patterns.
1) SNP2CAPS facilitates the computational conversion of SNPs into
CAPS markers.

2) A simple algorithm involves the screening of multiply-aligned

sequences for restriction sites followed by a selection pipeline that
allows the deduction of CAPS candidates by the identification of
putative alternative restriction sites.
 Required Input Files

1 .Multiple alignment file

• modified FASTA formatted file that may contain

data of more than one multiple alignment.
Structure of the header line:
">id_seqname" (with "id" = name of the multiple
alignment and "seqname" = sequence name)

• various multiple alignment formats supported by

the AlignIO handler of the BioPerl 1.2 module
http://www.bioperl.org/ (e.g. aln, msf, meme,...)
Thí dụ
2) REBASE: restriction enzyme database
(GCG-format data file) downloadable
 Dấu CAPS và dCAPS

CAPS markers detect polymorphisms that occur in restriction sites.

Derived CAPS (dCAPS) markers are created during PCR

amplification by introducing a restriction site at the site of an SNP
using specially designed primers
Thí dụ về dấu
dCAPS

The region of DNA

containing a point
mutation is amplified
using a primer that
contains a mismatch.
The introduction of
this match into the
PCR product
generates an MboI
site in product 2 only
Effectiveness of various positions and
number of primer mismaches

Position 1: altering the base at the 3’ end

Position 2: the 2nd base from the 3’ end
Position 3: the 3rd base from the 3’ end
Two base changes at positions 1,2; 2,3; 3.4
 Sự thay chủ yếu của base đơn có thể được
khám phá bằng cách dùng MwoI

Any point mutation other than an A to T can be made into a marker using the
restriction enzyme MwoI. MwoI has the recognition site GCNNNNNNNGC.
With the exception of an A to T mutation, all point mutations will contain either
a G or a C in one of two alleles. By introducing a single mismatch into one of
the primers and two mismatches into the other primer, three of the four bases
specified in the MwoI recognition sequence can be incorporated into the PCR
products.
Trends in Genetics (2002) 18:613-615
dCAPS Finder 2.0 Output
TaqMan probe-based 5’-nuclease chemistry for SNP genotyping
Genome Research (2001) 11:163-169.
Cấu trúc của mồi “universal energy-transfer-
labeled”
Sơ đồ khảo
nghiệm

Các bước phản

ứng cho A/G
được trình bày
Hình ảnh Fluorescence của 2 khảo nghiệm
SNP
Đo cường độ Fluorescent
SNP Genotyping Using
Luminex
 Color Suspension
Array

Luminex use internally dye

polystyrene microspheres with two
spectrally distinct fluorochromes.
Using precise ratios of these two
fluorochromes, a spectral assay is
created encompassing 100 different
microsphere sets with specific
spectral addresses - 100 different
analytes
Sự lượng hóa phân tử Reporter

A third fluorochrome coupled to a reporter

molecule was captured by microspheres.
Microspheres are interrogated individually in a
rapidly flowing fluid stream.
High speed digital signal processing classifies
microspheres based on its spectral addresses.
100 different reaction in a single well in just sec.
Hệ thống Luminex
LabMAP
 Hệ thống Luminex dựa
1.
trên
Đoạn dò bắt cặp SNP-chuyên biệt
Một trình tự chuỗi DNA (được gọi là ZipCode)
2. CZipCode + Fluorescent microsphere
SNP dùng xác định kiểu gen trong hệ thống
Luminex

1. Direct hybridization (DH)

2. Single base chain extension (SBCE)
3. Allele-Specific PCR (ASPCR)
4. Oligonucleotide ligation (OL)
 Không zipcode
Gắn chất huỳnh quang vào
đoạn mồi

Lai trực tiếp

SBCE
Phân tích SNP dựa trên
SBCE
AGTCGGTATAGCATATGGT AGTCGGTATAGCATATGGT

AGTCGGTATAGCACATGGT AGTCGGTATAGCACATGGT

TCAGCCATATCGTA
TCAGCCATATCGT
A C
TCAGCCATATCGTG
C
G

T
AGTCGGTATAGCATATGGT
AGTCGGTATAGCATATGGT TCAGCCATATCGAATACCA
TCAGCCATATCGAA

SBCE ASPCR
 So sánh giữa
ASPE với SBCE

Đọc các alen từ SNP có sẵn trong ống

quy trình phản ứng được đơn giản
hóa
Để có thể chuyển sang các khảo
nghiệm khác

Cần có kinh nghiệm nhiều trong việc

thiết kế “dò” (probe)
Sự tối hảo hóa trong việc xác định
kiểu gen trong đó hai dò bắt cặp là cần
thiết
Sự kết nối Oligonucleotide