KHMD 2 Slajdovi 16-17 Prof. DR Svetlana Ignjatović Za Studente PDF

KLINIČKA HEMIJA SA
MOLEKULARNOM DIJAGNOSTIKOM II
Prof. dr Svetlana Ignjatović

svetlana.ignjatovic@pharmacy.bg.rs
Katedra za medicinsku biohemiju, objekat A, 206
1
КЛИНИЧКИ ЦЕНТАР СРБИЈЕ
ЦЕНТАР ЗА МЕДИЦИНСКУ БИОХЕМИЈУ
KLINIČKA HEMIJA SA MOLEKULARNOM

DIJAGNOSTIKOM
akreditacija iz 2008. godine
č a hemija
• Klinička e ja sa molekularnom
oe ua o
dijagnostikom I (KHMD I)
– VII i VIII semestru
• Klinička hemija sa molekularnom

dijagnostikom II (KHMD II)
– IX semestar
2
CILJ PREDMETA
• Proučavanje i ispitivanje biohemijskih
promena koje
k j se jjavljaju
lj j u h
humanim
i
bolestima.
http://pharmacy.bg.ac.rs/ 5
ISHOD PREDMETA
• Razumevanje biohemijske osnove humanih

bolesti uloge biohemijske laboratorije u
bolesti,
dijagnostici, praćenju i lečenju bolesti i kliničkog
značaja određivanja biohemijskih parametara,
poznavanje teorijskih principa i faktora koji utiču
na izbor metoda koje se koriste u biohemijskim
laboratorijama
j ip
principi
p pprocene laboratorijskih
j
testova i kliničkog značaja određivanja
biohemijskih parametara.
3
KHMD II
SADRŽAJ PREDMETA – teorijska nastava
• IX semestar
– FFunkcija
k ij srca i biomarkeri
bi k i kardiovaskularnog
k di k l sistema; Ispitivanje
it I iti j funkcije
f k ij
koštanog sistema; Laboratorijska dijagnostika kancera i tumorski markeri;
Biohemijska analiza različitih telesnih tečnosti (cerebrospinalna, amnionska,
sinovijalna i seminalna tečnost, serozne tečnosti, saliva i znoj); Dijagnostika
bolesti i poremećaja u specifičnim stanjima (prenatalna i pedijatrijska
dijagnostika bolesti, dijagnostika bolesti u gerijatriji, dijagnostika poremećaja
u trudnoći); Praćenje koncentracije lekova u telesnim tečnostima; Osnovni
principi i tehnike molekularne dijagnostike, organizacija laboratorije za
molekularnu dijagnostiku, molekularna
dijagnostiku, molekularna dijagnostika monogenskih bolesti
(cistična fibroza, Hantingtonova bolest, hemofilija A) i kompleksnih bolesti, u
onkologiji, utvrđivanju očinstva, transplantaciji i infektivnim bolestima;
Kontrola kvaliteta rada kliničke laboratorije; Interpretacija rezultata kliničke
laboratorije; Klinička vrednost laboratorijskih određivanja.;
KHMD II
SADRŽAJ PREDMETA – vežbe
• IX semestar
– P
Praktičan rad u kliničkoj laboratoriji: zahtevi za pravilnim uzimanjem
ktič d kli ičk j l b t iji ht i il i i j
različitih telesnih tečnosti; Ispitivanje cerebrospinalne i amnionske
tečnosti; određivanje biomarkera kardiovaskularnog sistema;
određivanje tumorskih markera, određivanje kateholamina;
određivanje koncentracije lekova; određivanje hidrosolubilnih i
liposolubilnih vitamina; molekularna dijagnostika nedostatka α1‐
antitripsina; sprovođenje kontrole kvaliteta u kliničkoj laboratoriji;
klinička vrednost laboratorijskih određivanja.
j j
4
Literatura
1. Carl A. Burtis, Edward R. Ashwood, David E. Bruns:
Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular
Di
Diagnosis,i W.B.
W B Saunders
S d Company,
C 2005
2005.;
2. Lawrence A Kaplan, Amadeo J Pesce, Steven
Kazmierczak: Clinical Chemistry, 4th Edition – Theory,
Analysis, Correlation, W.B. Saunders Company, 2003.;
3. Spasić S, Jelić-Ivanović Z i Spasojević-Kalimanovska
V. Medicinska biohemija, Beograd, 2004.;
4. Spasić S, Jelić-Ivanović Z i Spasojević-Kalimanovska
V Praktikum iz medicinske biohemije,
V. biohemije Farmaceutski
fakultet, Beograd, 2005.
5. Majkić-Singh N. Medicinska biohemija, DMBSCG,
Beograd, 2006.
Opis predmeta
ESPB: 5
Broj časova nastave

Predavanja: 45
Vežbe: 75
Seminarski rad/radionica: 1
Izvođenje
u IX semestru
Teorijska nastava – predavanja, interaktivna nastava
Praktična nastava – laboratorijski rad, seminari, diskusije i
analiza slučajeva iz prakse, korišćenje Interneta i
biblioteke
10
5
Izvođenje
• Teorijska nastava
– IX semestar: 45 časova (1x3); četvrtak (KCS,
(KCS Poliklinika
Poliklinika, P-140):
P 140):
1115-1345,
• Praktična nastava
– IX semestar: 1 radionica (4 časa) i 9 ciklusa vežbi po 8 časova (6h)
– Klinički centar Srbije, Centar za medicinsku biohemiju
• Služba za polikliničku laboratorijsku dijagnostiku (zgrada Poliklinike,
I sprat)
• Urgentni centar
– Centar za laboratorijsku medicinu, Farmaceutski fakultet, Centralna
laboratorija
11
ЦЕНТАР ЗА МЕДИЦИНСКУ БИОХЕМИЈУ

Служба за поликлиничку лабораторијску дијагностику
Poliklinika, I sprat, tel. 3615631

12
6
CENTAR ZA LABORATORIJSKU MEDICINU
CENTRALNA LABORATORIJA
CENTAR ZA LABORATORIJSKU MEDICINU
CENTRALNA LABORATORIJA
13
Predavači
Predavanja:
• Prof. dr Svetlana Ignjatović
• Prof. dr Duško Mirković
Vežbe:
• Prof. dr Duško Mirković
• Ass.
Ass dr Snežana Jovičić
• Saradnik u nastavi master farmacije-medicinski biohemičar Miljan
Savković
• Saradnik u nastavi master farmacije-medicinski biohemičar Marija
Sarić
14
7
Poeni i ocenjivanje
• Poeni:
– predispitne aktivnosti: 17 - 30
– završni ispit: 23 - 70
– predispitne aktivnosti+završni ispit=krajnja ocena
Ukupan broj poena Krajnja ocena

51-60 6
61 70
61-70 7
71-80 8
81-90 9
91-100 10
15
Predispitne aktivnosti
Uslov: uraditi svih 8 vežbi i položiti ulazne i izlazne kolokvijume
Ukupno poena: 15‐30
AKTIVNOST OPIS AKTIVNOSTI POENI MINIMUM MAKSIMUM
Vežbe Mora da se urade sve 9 termina x 1 poena = 9 9 9

vežbe poena
Ulazni Mora da se položi 9 termina x 0,45 poena= 4 2 4

kolokvijum ulazni kolokvijum poena
Izlazni Mora da se položi ‐ 6 12
j
kolokvijum izlazni kolokvijum
j
Seminarski Algoriritmi, slučajevi , 1 termin x 5 poena = 5 0 5

rad/Radionica esejski rad (nije poena
obavezno)
Ukupno poena za predispitne aktivnosti 9+2+6=17 9+4+12+5=30

16
8
ZAVRŠNI ISPIT
• Prvi termin za polaganje: januarski rok
• Uslov: položen test (test važi do kraja školske 2016/17?)
ZAVRŠNI ISPIT: 23 – 70 POENA

AKTIVNOST OPIS AKTIVNOSTI MINIMUM MAKSIMUM
POENA POENA
Test Funkcija srca i biomarkeri kardiovaskularnog sistema; Ispitivanje funkcije koštanog sistema;
15 30
Laboratorijska dijagnostika kancera i tumorski markeri; Biohemijska analiza različitih telesnih
tečnosti (cerebrospinalna, amnionska, sinovijalna i seminalna tečnost, serozne tečnosti, saliva i
znoj); Dijagnostika bolesti i poremećaja u specifičnim stanjima (prenatalna i pedijatrijska
dijagnostika bolesti, dijagnostika bolesti u gerijatriji, dijagnostika poremećaja u trudnoći); Praćenje
koncentracije lekova u telesnim tečnostima; Osnovni principi i tehnike molekularne dijagnostike,
organizacija laboratorije za molekularnu dijagnostiku, molekularna dijagnostika monogenskih
bolesti (cistična fibroza, Hantingtonova bolest, hemofilija A) i kompleksnih bolesti, u onkologiji,
utvrđivanju očinstva, transplantaciji i infektivnim bolestima; Kontrola kvaliteta rada kliničke
laboratorije; Interpretacija rezultata kliničke laboratorije; Klinička vrednost laboratorijskih
određivanja.
Usmeni Uslov za izlazak na usmeni ispit je položen test 8 40

ispit
Ukupno poena za završni ispit 15+8=23 30+40=70
Ukupno poena: predispitne aktivnosti + završni ispit 17+23=50 30+70=100
17
TEST
• Prvi termin za polaganje: ?. februar 2016. godine (FF, amfiteatar ?)
• Ostali termini: april, jun, jul, septembar, oktobar
• Obavezno prijavljivanje odgovornom asistentu
• Svaka oblast ima više pitanja označeno sa * koja nose negativne poene
Broj Minimum Maksimum
Oblast Sadržaj
pitanja poena poena
I Kontrola kvaliteta rada kliničke laboratorije; Interpretacija rezultata kliničke laboratorije; 6‐12 3 6

Funkcija srca i biomarkeri kardiovaskularnog sistema; Ispitivanje funkcije koštanog
II
sistema; 4‐8 2 4
III Laboratorijska dijagnostika kancera i tumorski markeri; 4‐8 2 4
Biohemijska analiza različitih telesnih tečnosti (cerebrospinalna, amnionska, sinovijalna i
IV
seminalna tečnost, serozne tečnosti, saliva i znoj); 6‐12 3 6
Dijagnostika bolesti i poremećaja u specifičnim stanjima (prenatalna i pedijatrijska
V dijagnostika bolesti, dijagnostika bolesti u gerijatriji, dijagnostika poremećaja u 4‐8 2 4
trudnoći); Praćenje koncentracije lekova u telesnim tečnostima;
Osnovni principi i tehnike molekularne dijagnostike, organizacija laboratorije za
molekularnu dijagnostiku, molekularna dijagnostika monogenskih bolesti (cistična
VI
fibroza, Hantingtonova bolest, hemofilija A) i kompleksnih bolesti, u onkologiji, 4‐8 2 4
utvrđivanju očinstva, transplantaciji i infektivnim bolestima;
VII Klinička vrednost laboratorijskih određivanja; 2‐4 1 2
Ukupno 30-60 15 30
18
9
USMENI DEO ZAVRŠNOG ISPITA
Pitaju:
Prof dr Svetlana Ignjatović
Prof.
Prof. dr Duško Mirković ?
Ocena i broj poena za usmeni deo ispita:
6 7 8 9 10
Ocena
Broj poena 8 16 24 32 40
19
10
Sprovođenje kontrole kvaliteta analitičkih
Sprovođenje kontrole kvaliteta analitičkih
rezultata u medicinsko‐biohemijskim
laboratorijama
Kontrola kvaliteta analitičkih rezultata
 većina analitičkih rezultata u kliničko‐
bihemijskim laboratorijama je numerički rezultat
 za rezultat pacijenta treba da se da odgovor da li
j d b
je dobrog kvaliteta (što znači ispravna vrednost)
k lit t (št či i d t)
Predavanja iz kliničke hemije sa

molekularnom dijagnostikom
Prof. dr Svetlana Ignjatović 1/18
 Unutrašnja kontrola kvaliteta u laboratorijskoj
medicini ‐ indirektna kontrola
 Kontrola mnogih industrijskih proizvoda ‐
K t l ih i d t ij kih i d direktna
di kt
kontrola (dužina, brzina, itd.)
 KK ne ukazuje uvek na kvalitet
 KK se prati tekući kvalitet procesa
 poboljšanje kvaliteta analitičkog postupka se
postiže uvođenjem boljih metoda i standarda
p j j
4/106

ANALITIČKI REZULTAT
Konvenvencionalna prava vrednost
Sistematsko Slučajno
odstupanje odstupanje
•
greška
ANALITIČKI
REZULTAT
=
Konvencionalna
prava vrednost
+
Sistematsko tj. greška u

odstupanje kalibraciji
("bias")
+
Sistematsko Neslučajno "Označeni
odstupanje promenljivo odstupanje uzroci greške"
+
Odstupanje zbog Uticaj koji
"greške" uzorka potiče od uzorka
+
Slučajno Slučajno "Konstantan
odstupanje promenljivo odstupanje sistem uzroka"
+
Greška

TAČNOST I PRECIZNOST
• TAČNO
Č ali neprecizno
 neispravno
• Precizno ali netačno
 neispravno
• Precizno i tačno
 neispravno
7/106
KONCEPT TAČNOSTI: ISTINITOSTI I
PRECIZNOSTI
TAČNOST (accuracy) MERENJA
izražena netačnošću merenja
izražena netačnošću merenja
( xi ─ µ)
tačnost=istinitost preciznost
(trueness) merenja
( xsr ─ µ)
+ merenja
( xi ─ xsr)

Razlika između “trueness” i preciznosti
Tačnost=Istinitost
Preciznost merenja
(trueness) merenja
približavanje slaganja između srednje
približavanje slaganja
vrednosti i prave (true) vrednosti
između rezultata merenja
( xsr ─ µ)
( xi ─ xsr)
sistematska komponenta
slučajna komponenta
slučajna komponenta
greške
greške
izražena sistematskim
izražena standardnom
odstupanjem (bias)
devijacijom
Razlika između “trueness” i preciznosti
Poboljšanje tačnosti Poboljšanje
(trueness) merenja preciznosti
j
merenja
• bolja standardizacija
(referentni materijali) • bolja oprema
• hijerarhija metoda • primena
(razvoj specifičnijih tehnika“quality
metoda) assurance”

Elementi analitičkog kvaliteta
Specifikacija za
analitički kvalitet
litički k lit t
Stvaranje Kontrola
analitičkog analitičkog
kvaliteta kvaliteta
Specifikacija za analitički kvalitet
 maksimalna dozvoljena analitička nepreciznost
(koeficijent varijacije), KVanalitički
KVanalitički < 0,5 x KVunutar osobe
 KVunutar osobe ‐ biološka varijacija unutar osobe dobijena kod zdravih
Cotlove ‐ Harris ‐ Fraser

 maksimalno dozvoljeno analitičko sistematsko odstupanje
(bias) (u %), Biasanalitički
Biasanalitički < 0,25 x (KV2 unutar osobe + KV2 između osoba)1/2
• ((KV2 unutar osobe 2
unutar osobe + KV između osoba
između osoba)
1/2 ‐ kombinacija biološke
j
varijacije unutar osobe i između osoba dobijene kod zdravih
Gowans at al. (1988)
 maksimalna dozvoljena sistematska greška, SE
SE < 0,33 x KVunutar osobe
 KVunutar osobe ‐ biološka varijacija unutar osobe
dobijena kod zdravih

Stvaranje analitičkog kvaliteta
 Stvaranje kvaliteta metoda (odgovornost
proizvođača opreme i reagenasa)
 Stvaranje kvaliteta laboratorije
(odgovornost individualne laboratorije)
Stvaranje kvaliteta metoda
 Metode koje su osetljive, specifične, precizne
 Posebna pažnja na tačnost (trueness); serum
“matriks” standardi
 Referentne metode i referentne laboratorije
 Referentni materijali

Stvaranje kvaliteta laboratorije
 Organizacija (prostor, osoblje, održavanje,
finansijski resursi)
 Adekvatna oprema, test‐reagensi, standardi
 Konstantne radne procedure i postupci
Stalni faktori koji su uključeni u stvaranje
analitičkog kvaliteta
Spoljašnji Unutrašnji
j
• Analitički princip • Izbor uslova
• Oprema • "in house" oprema
• Reagensi (izbor
Reagensi (izbor • "in house" reagensi,
g ,
proizvođača) vreme, temperatura,
• “Traceability” zapremina, itd.
kalibracije • Kalibraciona funkcija

Promenljivi faktori koji su uključeni u
stvaranje analitičkog kvaliteta
Spoljašnji Unutrašnji
j
• Reagensi • "in house" reagensi
(varijabilnost) • Obuka, održavanje,
• Standardi itd
• Potrošni materijal • Kontrola kvarova
• Dokumentacija
Odnos između faktora koji učestvuju u stvaranju i kontroli
analitičkog kvaliteta
Stalni External
faktori assessment
Stvaranje analitičkog Kontrola
kvaliteta analitičkog kvaliteta
Unutrašnja
Promenljivi kontrola
faktori

Kontrola analitičkog kvaliteta
dizajn
Specifikacija za
analitički Unutrašnja
k lit t
kvalitet kontrola
materijali
Stvaranje Kontrola
analitičkog analitičkog
kvaliteta kvaliteta dizajn
j
Spoljašnja
kontrola
materijali
Unutrašnja kontrola kvaliteta (IQC)
• za praćenje promenljivih faktora
• za detekciju ili odstupanje od stabilnog
izvođenja u individualnoj laboratoriji

Način sprovođenja kontrole kvaliteta
postupak koji obuhvata:

• sakupljanje rezultata određivanja stabilnog
pj j j g
kontrolnog materijala
• koji se predstavljaju na kontrolnoj karti
• koja sadrži specifične kontrolne granice,
• a procena se vrši primenom specifičnih
p p p
kontrolnih pravila
Način sprovođenja kontrole kvaliteta
 sprovodi se kontinuirano
 zajedno sa uzorcima pacijenata
zajedno sa uzorcima pacijenata
 sprovode je svi neposredni izvršioci
(laboratorijski tehničari i medicinski
biohemičari)
• ukoliko
ukoliko kontrolna vrednost ne zadovoljava,
kontrolna vrednost ne zadovoljava
rezultati pacijenata ne smeju da se izdaju

Model za rešavanje problema sistemom IQC
Stvaranje Unutrašnja kontrola
analitičkog analitičkog kvaliteta
kvaliteta
Korekcija grešaka
Sprečavanje “Popravka
grešaka kvarova”
PROBLEMI KOJI SE JAVLJAJU PRI POSTAVLJANJU
ADEKVATNOG SISTEMA IQC
1.
1 Kvalitet kontrolnih materijala
2. Tipovi i učestalost mogućih grešaka
3. Broj i vrsta kontrolnog materijala
4. Broj replikata kontrole
5
5. Verovatnoća detekcije grešaka
6. Verovatnoća lažnog odbacivanja
7. Posledice odbačenih signala

Kvalitet kontrolnih materijala
Kontrolni materijali
Internacionalna federacija za klinički hemiju i
j j
laboratorijsku medicinu (IFCC) definiše
kontrolne materijale kao
"uzorke ili rastvore koji se određuju u cilju
kontrole, a ne za kalibraciju"

KONTROLNI MATERIJALI
• korišćenje kontrolnih materijala predstavlja osnovu

osiguranja kvaliteta ispitivanja na dnevnoj bazi
• treba da odgovaraju onome što se ispituje, kao i svrsi
ispitivanja
• kompatibilan matriks, koncentracije analita koje simuliraju
klinički važne nivoe, izvor materijala treba da bude
nezavistan od proizvođača IVD koji se koristi u procesu
ispitivanja
29/106
• mogućnost refleksije odstupanja od stabilnog
ć fl k ij d j d bil
analitičkog izvođenja
• treba da budu stabilni i reproducibilni
• molekularna forma i koncentracija koja se
određuje treba da budu uvek iste
određuje treba da budu uvek iste
• identičan “matriks”

“Matriks”
• odnosi se na supstancu ili osnovu
p od koje je
j j
kontrolni materijal pripremljen, kao i na sve
aditive, konzervanse koji su dodati u toku
pripreme
•u
u idealnom slučaju kontrolni materijal treba da
idealnom slučaju kontrolni materijal treba da
sadrži isti “matriks” kao i uzorak koji se koristi za
određivanje (puna krv, serum/plazma, likvor, urin
itd.)
• dodatak različitih aditiva humanog ili nehumanog
porekla
• fizičke promene u toku procesa liofilizacije
• da li je matriks humanog ili goveđeg porekla
(određivanje albumuna metodom sa brom krezol
ljubičastim za koju treba koristiti humani kontrolni
ljubičastim za koju treba koristiti humani kontrolni
materijal, a za metodu sa brom krezol zelenim goveđi
kontrolni materijal)

Matriks kontrole je važan!
 kontrolni materijali sa "određenom" (engleski:
assayed) vrednošću
assayed) vrednošću
 "neodređenom" (engleski: unassayed) vrednošću
 u liofilizovanom ili tečnom stanju
 postupak rekonstitucije strogo standardizovan

 uticaj matriksa; stabilnost; varijacije od bočice
do bočice; da li su sa "određenim" vrednostima
ili ne; problemi vezani za pretretman
 nabavku istog "lot‐a", ili serije proizvodnje za
najmanje godinu dana
 da pokrije nivoe (koncentracije) pri kojima se
donose medicinske odluke i/ili kritične tačke pri
određivanju
• svež “pool” seruma (zdravi!) ‐ za proteine i

hormone
• pojedinačna donacija od jednog pacijenta
• preporučuju se liofilizovani materijali
(rekonstitucija!)
• “prave” vrednosti nisu neophodne (“target”
p p ( g
vrednosti se određuju pri stabilnim uslovima)

Priprema kontrolnog materijala
• komercijalno dostupni u liofilizovanom ili tečnom
stanju
j
• bočice zapremine 5 mL ili 10 mL
• ukoliko su u liofilizovanom stanju, treba da se
rekonstituišu i stabilni su 48 sati posle
rekonstitucije
• posle rekonstitucije se mogu razliti u manje
porcije od 0,5 do 1 mL i čuvati na ‐20 C do
upotrebe
• Postupak rekonstitucije treba da bude strogo
standardizovan
• Korišćenje volumetrijskih pipeta klase A,
dejonizovane vode tipa I, kao i strogo
pridržavanje vremena mešanja kontrolnog
pridržavanje vremena mešanja kontrolnog
materijala pri njegovoj rekonstituciji smanjuju
varijacije koje potiču od bočice do bočice

• kontrolni materijali u tečnom stanju ne zahtevaju
rekonstitucijuj
• varijacija od bočice do bočice je znatno manja
nego kod prozvoda u liofilizovanom stanju
• stabilnost im je mnogo duža (14 do 30 dana)
• skuplji su i ponekad sadrže aditive i konzervanse
pj p
koji mogu da budu izvor grešaka kod nekih
metoda
Kontrolne karte
• Statistička kontrola procesa predstavlja kontrolu
sistema koja koristi statistiku kako bi se odredilo da li
je posmatrano izvođenje unutar očekivanih varijacija
procesa
• Statistički postupak unutrašnje kontrole u kliničko‐
biohemijskim laboratorijama obuhvata specifičan
protokol određivanja kontrolnih materijala i
interpretaciju specifičnog broja rezultata

Kontrolne karte
• Levey i Jennings su prvi uveli metode statističke kontrole
(određivanje uzoraka pacijenata u duplikatu, kao i
kontrolnu kartu u koju se unosi srednja vrednost i raspon
d
dva merenja)
j )
• Henry i Segalove su razvili alternativni postupak koji se
zasnivao na ponovljenom određivanju stabilnog
referentnog uzorka a pojedinačna određivanja su
predstavljana direktno na kontrolnoj karti
d l d k k l k
• danas je poznata kao Levey‐Jennings‐ova kontrolna karta
Formiranje kontrolne karte
Predkontrolni period
 analiziranje
analiziranje dva kontrolna uzorka pri standardnim
dva kontrolna uzorka pri standardnim
rutinskim uslovima
 4 nedelje ili 20 radnih dana po jedno određivanje na dan
 izračunaju se statistički parametri kao što su srednja
vrednost (=), standardna devijacija (Sd) i koeficijent
varijacije (Kv)

 srednja vrednost govori o tačnosti ili sistematskoj grešci
j j g
• standardna devijacija govori o nepreciznosti ili slučajnoj grešci
p j jg
 koeficijent varijacije odražava odnos standardne devijacije prema
koncentraciji i bolje govori o karakteristikama metode u celom
opsegu koncentracija
Formiranje kontrolne karte
• grafički postupak prikazivanja kontrolnih rezultata i
procene da li primenjeni merni postupak zadovoljava ili
ne zadovoljava
• rezultati analiziranja kontrolnog materijala se
predstavljaju u funkciji vremena (ili po redosledu
određivanja) tako što se povlači linija od tačke do tačke

Formiranje Levey Jennings‐ove kontrolne karte
• iz izračunatih podataka za = i Sd za dva korišćena

kontrolna materijala izračunaju se dva para
kontrolnih granica
• prvi par kontrolnih granica se izračunava kao (= 

2Sd), a drugi kao (=  3Sd)
Kontrola 1: parametar (jedinice)

220
218
216
214 + 3Sd
212
210
+ 2Sd
kontrolna vrednost
208
206
204
202
200
198
196
194
192
190 - 2Sd
188
186 - 3Sd
184
182
180
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Dani / broj kontrolnog merenja

Kontrola 1:param etar (jedinice)
220
218
216
214
+ 3Sd
212
st
kontrolna vrednos
210
208 + 2Sd
206
204
202
200 X
198
196
194
192
190 - 2Sd
188
186 - 3Sd
184
182
180
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
47/106
Kontinuirana kontrola kvaliteta
 Uz svaku analitičku seriju
Uz svaku analitičku seriju odrede se dva kontrolna
odrede se dva kontrolna
uzorka; vrednosti se unose u kontrolnu kartu
• Maksimalno trajanje analitičke serije kada se određuju
biohemijski parametri iznosi 24 sata, odnosno 8 sati za
hematološke parametre

Kontinuirana kontrola kvaliteta
Kontrolna pravila ‐ kriterijumi koji se primenjuju da

bi se ocenilo da li rezultati "analitičke serije"
zadovoljavaju ili ne zadovoljavaju
Najčešće se primenjuju dva kontrolna pravila:

 12Sd ‐ jedna kontrolna vrednost je izvan granica (=
 2Sd)
 13Sd ‐ jedna kontrolna vrednost je izvan granica (=
 3Sd)
Donošenje zaključaka o
izvedenoj kontroli kvaliteta
 ako je vrednost kontrolnog uzorka unutar granica

(=  2Sd) metoda je pod kontrolom i rezultati
pacijenata mogu da se izdaju
 izdaju se takođe i kada je vrednost izvan ovih

granica, a unutar granica (=  3Sd)

Donošenje zaključaka o
izvedenoj kontroli kvaliteta
• Sistem je izvan kontrole kada se rezultat za
kontrolni uzorak nađe izvan granica (= 
3Sd) i u tom slučaju se rezultati pacijenata
ne izdaju
Formiranje Levey Jennings-ove kontrolne karte
235 245 255 265

240 250 260
VRLO NEOČEKIVANO
X
265
260 X
X X X
255 X X X X
X X X
250 X X
X X
X X X
245 X X X
240 X NEOČEKIVANO
235
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4

Westgard‐ova višestruka kontrolna pravila
• 12Sd • problem sa lažnim odbacivanjem
• 13Sd • slučajnu grešku
• 22Sd • sistematsku grešku
• R4Sd • slučajnu grešku
• 41Sd • sistematsku grešku
• 10= • sistematsku grešku
53/106
Westgard-ova višestruka kontrolna pravila
+ 3Sd
+ 2Sd
+ 1Sd
x 12Sd
- 1Sd
izvan
- 2Sd
d granica
- 3Sd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dani/brojkontrolnog m erenja
54/106

+ 3Sd
+ 2Sd
+ 1Sd
x 13Sd
- 1Sd izvan
- 2Sd granica
- 3Sd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
D ani/brojkontrolnog m erenja
55/106
+ 3Sd
+ 2Sd
+ 1Sd 22Sd
x izvan
- 1Sd granica
- 2Sd
- 3Sd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
56/106

+ 3Sd
+ 2Sd
+ 1Sd
x
- 1Sd R4Sd
- 2Sd izvan
- 3Sd granica
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
57/106
12Sd
13Sd
22Sd
R4Sd
58/106

41sd
10x
8x 12x
59/106
31sd
2 od 32sd
6x
9x
60/106

PROBLEM U PRECIZNOSTI
POVEĆANJE Sd
X
X
265
X X
veća X
260
slučajna X X X
X
greška 255
X
X X X X X
X
250 X
X
daje 245
X
X X
X
X X
širi X
240
opseg X X
235
X
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4
D ani/brojkontrolnog m erenja
61/106
PROBLEM U TAČNOSTI
POMERANJE x
X
X
X X X
X
265 X X X X X
X
X
260 X X X
X X
X X
255 X X
X
250 X
245
sistematska
i t t k 240
greška 235
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4

62/106

UZROCI SISTEMATSKE GREŠKE
• promena “lot‐a” reagensa/standarda
• pogrešna vrednost standarda
• neadekvatno pripremljeni reagensi
• propadanje ili neadekvatno čuvanje reagenasa/standarda
• promena u pipetiranju reagenasa/uzoraka
• promena reakcione temperature, izvora svetlosti
k i i l i
• promena u radu od operatera do operatera
63/106
UZROCI SLUČAJNE GREŠKE
• mehurići u liniji kojom se pipetiraju reagens ili
h ići li iji k j i ti j ili
uzorak
• neadekvatno mešanje reagenasa ili reakcione smese
• nestabilno napajanje električnom energijom
• individualna promena pri pipetiranju ili inkubiranju
i di id l i i ti j ili i k bi j
• itd.
64/106

Kontrolne karte: analizatori
65/106
66/106

MedLabQC:
Laboratoty quality control software
Version : stand‐alone 3.21 ‐ 28 sept 1999, Freeware.
• Copyright (C) 1998‐1999 Philippe Marquis
• Biologiste des hôpitaux
• METZ ‐ FRANCE
• E‐mail: philimar@easynet.fr
• English version : Phillip Jordan
English version Phillip Jordan
• Royal Devon and Exeter Hospital ‐ UK
• E‐mail: phillip.jordan@lineone.net
67/106
MedLabQC:
Laboratoty quality control software
http://www.thehealthcarenet.com
http://www.btinternet.com
68/106

Alarmiranje grešaka
• 100% mogućnost (verovatnoća 1,00)
detekcije nestabilnog izvođenja ili “STVARNI
detekcije nestabilnog izvođenja ili STVARNI
ALARM”
• 0% mogućnost (verovatnoća 0,00) detekcije
greške pri stabilnom izvođenju, odnosno
“LAŽNI ALARM”
Verovatnoća za otkrivanje greške (Ped)
• verovatnoća odbacivanja analitičke serije pri
pojavi greške pri stabilnoj nepreciznosti
mernog postupka (100% šansa da se greška
otkrije)
• idealno treba da bude 1,00

Verovatnoća za lažno odbacivanje (Pfr)
• verovatnoća odbacivanja analitičke serije kad
greška ne postoji pri stabilnoj nepreciznosti
mernog postupka (0,00% šansi za lažno
odbacivanje)
• idealno treba da bude 0,00
Različite mogućnosti kontrolnih pravila !
X
265
260
X
X X X
255 X
X X X X X
X
250 X
X X X
X X
245 X X
X X
X
240
X
235
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4

Standardna devijacija govori o nepreciznosti
ili slučajnoj grešci
• govori o širini ili distribuciji kontrolnih rezultata oko
očekivane srednje vrednosti
očekivane srednje vrednosti
• ukoliko je viša vrednost standardne devijacije, veća je
i slučajna greška i lošija preciznost metode
• ukoliko
ukoliko je niža vrednost standardne devijacije,
je niža vrednost standardne devijacije
raspodela je uža i oštriji pik, niža slučajna greška i
bolja preciznost metode.
Srednja vrednost govori o tačnosti ili
sistematskoj grešci
 govori o centralnoj tendenciji očekivane raspodele
g j j p
ukoliko je izvođenje metode stabilno
 bilo koja promena u tačnosti, kao što je
sistematsko odstupanje uticaće na srednju
vrednost kontrolnog materijala

Koeficijent varijacije reflektuje odnos Sd prema
koncentraciji
• Sd se menja sa koncentracijom, tj. ukoliko je viša
koncentracija, viša je i Sd
• neophodno je da se Sd posmatra pri datoj koncentraciji
j g
• Kv bolje govori o karakteristikama metode u celom
opsegu koncentracija
Loša navika ‐ponavljanje kontrole
X
X
X X X
X
265 X X X X X
X
X
260 X X X
X X
X X
255 X X
X
250 X
245
sistematsko 240
pomeranje 235
za 2 Sd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4

Dobra navika - posmatranje karte i
primena pravila koja će utvrditi grešku
1 2 3 4 X
X 5
441Sd
1Sd
222Sd
2Sd
X
X
X
X X
X X
X
X
X
265
265 X
X X
X X
X X
X X
X
X
X
X
X
260
260 X
X X
X X
X
X
X X
X
X
X X
X
255
255 X
X X
X
X
X
250
250 X
X
245
245
sistematsko 240
240
pomeranje 235
235
za 2 Sd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 20 1 2 3 4
* Sprovođenjem unutrašnje kontrole kvaliteta
rada u laboratorijskoj medicini koriste se uzorci
sa poznatim vrednostima a koje su izračunate
kao srednje vrednosti iz više merenja pod
“stabilnim” uslovima u istoj kliničkoj laboratoriji.

* kontrola je indirektna
* ne može uvek da reflektuje kvalitet
određivanja uzoraka pacijenata jer
određivanja uzoraka pacijenata jer
nedostatak preciznosti ima različite i slučajne
uticaje u toku određivanja
* uticaj interferirajućih supstanci u uzorku
pacijenta ne može da se detektuje
pacijenta ne može da se detektuje
* unutrašnja kontrola kvaliteta ima svoja
ograničenja i predstavlja samo deo
kvaliteta analitičkog procesa
č
ali
* je važna za detekciju grešaka u svakoj seriji
i pri promeni izvođenja
ali
* kada se sprovodi kako treba

OSIGURANJE KVALITETA ISPITIVANJA
• širi koncept od osiguranja kvaliteta na dnevnoj bazi
• aktivnosti koje se sprovode na dnevnoj bazi za osiguranje
kvaliteta ispitivanja (merenja ili opservacije):
• kalibracija
• odgovarajuća kontrola reagenasa
• praćenje rezultata određivanja materijala unutrašnje
praćenje rezultata određivanja materijala unutrašnje
kontrole kvaliteta (IQC) (surogat za uzorke pacijenata koji
sprečavaju da se pogrešan rezultat autorizuje i izda)
81/106
OSIGURANJE KVALITETA ISPITIVANJA
• dokaz o odgovarajućem treningu osoblja
• odabir i validacija opreme
• učešće u programima spoljašnje kontrole (EQA)
• interne provere procesa ispitivanja
Učešće u EQA ne može da spreči izdavanje pogrešnog
č šć Q ž d či i d j š
rezultata u toku dana, ali dobra IQC će smanjiti ovaj
rizik!
82/106

External Quality Assessment
(EQA)
• najbolja evaluacija stalnih faktora
• može da pomogne u evaluaciji IQC ali

suviše spora za praćenje izvođenja
• odnosi se na stabilno izvođenje
IQC naspram EQA
EQA
IQC
84/106

IQC naspram EQA
IQC EQA
∙ radi se dnevno ∙ radi se periodično
∙ odmah se znaju rezultati ∙ retrospektivno znanje
∙ poređenje sa poznatom
poređenje sa poznatom ∙ nivoi analita
nivoi analita
srednjom vrednošću nepoznati
NACIONALNI PROGRAM SPOLJAŠNJE
KONTROLE KVALITETA
se sprovodi na osnovu odluka
 Komisija za medicinsku biohemiju Saveznog

zavoda za zaštitu i unapređenje zdravlja
 Republičke stručne komisije za medicinsku i

kliničku biohemiju Ministarstva za zdravlje
Republike Srbije

SNEQAS
MEDICINSKA BIOHEMIJA
v Komisija za kontrolu kvaliteta i akreditaciju
D št
Društva medicinskih biohemičara Srbije
di i kih bi h ič S bij
v Centar za medicinsku biohemiju Kliničkog
centra Srbije
SNEQAS
MEDICINSKA BIOHEMIJA
v oko 300 kliničko‐biohemijskih laboratorija u
oko 300 kliničko biohemijskih laboratorija u
medicinskim ustanovama na teritoriji Srbije
v dva puta godišnje
v mogućnost određivanja 29 biohemijskih
parametara

DRUŠTVO MEDICINSKIH
BIOHEMIČARA SRBIJE
NACIONALNI PROGRAM
SPOLJAŠNJE KONTROLE
KVALITETA
SNEQAS - MEDICINSKA BIOHEMIJA

ORGANIZACIJA SNEQAS - MEDICINSKA BIOHEMIJA
- liofilizam (humanog / goveđeg porekla)
- 2 puta godišnje
ORGANIZATOR PROGRAMA
- učešće obavezno
- 29 parametara
slanje izveštaja -šifra laboratorije
kontrolni uzorak - obrasci za komunikaciju
izveštaj o obrađenim uzorcima priprema

“konsenzus” vrednost
za slanje
- za datu metodu
- za sve metode statistička evaluacija
- unošenje podataka
- provera prijem rezultata slanje uzoraka
slanje rezultata
određivanja UČESNIK
SNEQAS
određivanje
medicinska
biohemija
Kontrola datum određivanja Datum izveštaja Šifra laboratorije

DMBJ-2 18/5/1998 15/6/1998 44
Parametar: HOLESTEROL Jedinica: mmol/L
Vaša metoda: A holesterol-oksidaza Vaš rezultat: 6.13
26
24
""
22 ""
""
20 "" " " vaša metoda
"" "
18 "" "  ostale metode
"" " "
16 "" " "" vaš rezultat
"" " ""
14 "" " ""
"" " ""
12 """ " ""
""" " ""
10 """"" ""
""""""""" "
8 """"""""" "
" """"""""" "
6 "" """"""""" " "
" " """ """"""""" " "
4 " " " """" """"""""""" " " "
" " """""" """"""""""""" " ""
2 " " "" """""""""""""""""" " "" "
"""""" """""""""    " "" " " "" """ " ""
0
4.79 6.11 7.43
92/106

SNEQAS-medicinska biohemija
Vaš rezultat 6.13 mmol/L Vaša metoda Sve metode
Broj dobrih rezultata 219 231
“Konsenzus” vrednost 6.10 6.11
Donja i gornja granica prihvatanja rezultata 5.47
6.74
Donja i gornja granica prikazivanja na grafiku 4.79
7.43
Standardna devijacija 0.44 0.44
Koeficijent varijacije 7.19 7.20
Indeks standardne devijacije 0.06
Prosečan indeks standardne devijacije 0.04
Ukupan broj rezultata 228 240
93/106
Prosečan indeks standardne devijacije (SDI)
– “z” skor
• KBL poredi svoje izvođenje sa izvođenjem ostalih
laboratorija u isto vreme, kao i sa svojim
prethodnim izvođenjem
• SDI od 0 do 0,5  rezultat je odličan
• SDI od 0,5 do 2  rezultat je dobar
• SDI veći od 2  rezultat je loš
94/106

Koncept “šest sigma”
“šest sigma” nije nova tehnika

primenjuje se od 1980. godine u industrijskoj
proizvodnji
p
polako se proširuje na industriju usluga
p j j g i
druge sektore
Primena koncepta “šest sigma”
Motorola Johnson & Johnson
General Electric Kodak
Allied Navistar
Signal/Honeywell Polaroid
Black & Decker Sony
Dupont Toshiba
Dow Chemical Quest Diagnostics
Federal Express

Harry M & Schroeder R
Six Sigma: The Breakthrough Management
Strategy Revolutionizing the World's Top
Corporations
Currency, New York, 2000.
Šta je “šest sigma”?
POBOLJŠANJE PROCESA
izvršenje procesa nivoa “šest sigma”
primena kvantitavnih tehnika u merenju
t
trenutnog izvršenja procesa
t i š j

analiza procesa
mera izvršenja procesa:
broj grešaka na milion proizvoda
na milion proizvoda
broj grešaka na milion proizvoda
(Defects Per Million) – DPM
izvršenje procesa nivoa “šest sigma”:
manje od 1 DPM
99,9997% perfekcija

Koncept “šest sigma”
ciljna vrednost
-specifikacija + specifikacija
tolerancije tolerancije
± 2Sd 4,5% (45400 DPM)

± 3Sd 0,27% (2700 DPM)
± 4Sd 0,0063% (63 DPM)
± 5Sd 0,000057% (0,57 DPM)
± 6Sd 0,0000002% (0,002 DPM)
Pomeranje ili odstupanje za 1,5 sigma
1,5
odstupanje
Šest sigma proces 3,4 DPM

Pet sigma proces 233 DPM
Četiri sigma proces 6210 DPM
Tri sigma proces 66807 DPM
Dva sigma proces 308537 DPM

Konverzija DPM u sigma
Sigma DPM bez DPM sa 1,5s

vrednost odstupanja odstupanjem
1,00 317400 697700
2,00 45400 308637
2,50 12419 158686
3,00 2700 66807
3,50 465 22750
oko
4,00 63 6210 333 DPM
4 9-5 0
4,9-5,0
4,50 6,8 1350
5,00 0,57 233
5,50 0,038 32
6,00 0,002 3,4
Primeri
svetska klasa u kvalitetu: 3,4 DPM ili 6 sigma
sigurnost avionskog prevoza (smrtnost
sigurnost avionskog prevoza (smrtnost
putnika): 0,43 DPM, bolje od 6 sigma
manipulacija avionskim prtljagom: 4000 DPM
ili 4,15 sigma proces
tipični “biznis”
tipični biznis procesi: 4 sigma
procesi: 4 sigma
početni “šest sigma” cilj: 5 sigma

Postizanje “šest sigma”
šampioni
“šampioni”
“zeleni pojas”
“crni pojas”
“majstorski crni pojas”
j p j
LITERATURA ZA UČENJE
Ignjatović S. Sprovođenje unutrašnje kontrole kvaliteta

Ignjatović S. Sprovođenje unutrašnje kontrole kvaliteta
analitičkih rezultata u kliničko‐biohemijskim
laboratorijama. U: Majkić‐Singh N. Medicinska
biohemija, drugo izdanje, Društvo medicinskih
biohemičara Srbije, Beograd, 2006; 99‐106. (ISBN 86‐
83023‐09‐5)
Ignjatović S. Slajdovi sa predavanja

FUNKCIJA SRCA I BIOMARKERI
KARDIOVASKULARNIH
OBOLJENJA
Bolesti srca i krvnih sudova

• imaju razmere globalne epidemije
• u svetu je 1990. godine od KVB umrlo 5
miliona ljudi u razvijenim i 9 miliona u
nerazvijenim i srednje razvijenim
zemljama
• predviđa se da će 2020.
2020 godine taj broj
iznositi 6 miliona, odnosno 19 miliona ljudi
• Srbija zauzima neslavno treće mesto na
svetu, odmah iza Rusije i Ukrajine
2
Prof. dr Svetlana Ignjatović 1

OSNOVNA ANATOMIJA SRCA
• srce je šupalj mišićni organ smešten u

medijastinumu između levog i desnog plućnog
krila, a iznad dijafragme
• prosečno ljudsko srce teži oko 325 g kod
muškaraca i 275 g kod žena
• g
građu srčanog g zida čine tri sloja:
j
– epikardijum – spoljašnji
– miokardijum – srednji
– endokardijum – unutrašnji sloj
• srce je pregradom (septum)

podeljeno na dve polovine, levu i
desnu
• svaka polovina se sastoji iz
pretkomore (atrium) i komore
(ventriculum)
• pretkomore su povezane sa
komorama preko atrioventrikularnih
(AV) zalistaka koji se otvaraju i
zatvaraju i tako regulišu protok krvi
kroz srce
4

• zalistak leve strane srca se sastoji od dva

listića i zove se dvolistni ili mitralni zalistak
• zalistak desne strane srca se zove trolisni

ili trikuspidalni zalistak
6

ELEKTROKARDIOGRAM (EKG)
• srčani ciklus započinje električnim impulsima koji se

prenose p
p putem specifičnog
p g sprovodnog
p g sistema do
miokardijuma
• ove manifestacije se mogu registrovati na EKG-u
• EKG predstavlja grafički prikaz različitih električnih
potencijala izazvanih ekscitacijom srčanog mišića, a
detektuju se na površini tela
• EKG se koristi za registrovanje anatomskih,
metaboličkih,
t b ličkih jjonskih
kih ili h
hemodinamskih
di kih promena u srcu
• EKG omogućava detekciju širokog spektra fizioloških i
anatomskih promena i kliničkih situacija
EKG
Pod normalnim uslovima, svaki električni
ciklus
ikl jje iistiti i čine
či ga ttrii velike
lik
komponente:
• pretkomorska depolarizacija (P- talas)
• komorska depolarizacija (QRS-talas)
• repolarizacija (ST deo i T T-talas)
talas)

EKG
• P-talas je odraz pretkomorske
• QRS je odraz komorske kontrakcije
• ST segment i T-talas predstavljaju
električnu nadoknadu srčanih komora
SRČANA OBOLJENJA
• postoji mnogo različitih oblika

• najveći kliničko – laboratorijski značaj
imaju:
1. akutni infarkt miokarda (AIM)

2. kongestivna srčana insuficijencija (KSI)
10

SRČANA OBOLJENJA
Akutni koronarni sindromi (AKS)
ishemijski događaji u srcu u opsegu od:

angine (bez smrti ćelije) do AIM (smrti ćelije)
11
Akutni infarkt miokarda (AIM)

• disbalans između snabdevanja i potrebe
miokarda za kiseonikom
• nastaje oštećenje i eventualna smrt
srčanih ćelija – miocita
• prekid snabdevanja krvlju i nastupa velika
nekroza srčanog tkiva
• začajna nekroza je najčešće udružena sa
trombotičnim začepljenjem nastalim usled
procesa ateroskleroze
12

KONGESTIVNA SRČANA INSUFICIJENCIJA
(KSI)
• KSI je patofiziološko stanje u kome postoji poremećaj

srčanoggppumpanja
p j što dovodi do nakupljanja
p j j tečnosti u
plućima
• abnormalna srčana funkcija onemogućava da se
obezbedi dovoljna količina krvi za metabolizam perifernih
tkiva
• KSI obuhvata stanja kao što su:
– primarna oštećenja nastala posle velikog infarkta miokarda
– povećana
ć srčana
č ukrućenost
k ć t uzrokovana
k većim
ći pritiskom
iti k u
srcu
– stanja kada su potrebe perifernog tkiva povećane usled već
oštećenog srčanog rada
13
AKUTNI KORONARNI SINDROM

(AKS)
• spontana pojava akutnog ishemijskog
srčanog
č oboljenja
b lj j koje
k j obuhvata:
b h t
– dijagnostikovanu nestabilnu anginu pektoris

– infarkt miokarda sa ne-ST elevacijom
(NSTEMI)
– infarkt miokarda sa ST elevacijom (STEMI)
14

Šta je ishemija?
Kiseonik
Snabdevanje kiseonikom se
smanjuje sa progresijom bolesti
Disrupcija Početak
plaka nekroze
Promene u zahtevu za kiseonikom

dnevne i u toku života
SA SA UA MI
Vreme
Do ishemije dolazi kada zahtevi za
O2 prevaziđu snabdevanje
15

• spektar oboljenja u čijoj je osnovi ruptura ili
erozija
j ateromatoznog gpplaka,, koja
j dovodi do
agregacije trombocita i različitog stepena
koronarne tromboze, koronarnog vazospazma i
distalne trombocitne mikroembolizacije
• da li će se kod pacijenta razviti infarkt miokarda

sa ne-ST ili ST- elevacijom zavisi od trajanja
umanjenog
j kkoronarnog protoka,
t k kvaliteta
k lit t
kolateralnog protoka do ugroženog miokarda i
prirode formiranog tromba na mestu rupture
plaka
16

• kod pacijenata sa NSTEMI obično nastaje
b li (t
beli (trombocitni)
b it i) ttrombb
• u 80% pacijenata sa STEMI javlja crveni
(fibrin sa eritrocitima) tromb
• utiče na efikasnost antitrombolitičke
terapije u NSTEMI u poređenju sa
primenom fibrinolitičke terapije u STEMI
17
EKG U AKS
• AKS obuhvata stanja pacijenata koji imaju
j
nestabilnu ishemijsku bolest srca
• kada dođe do potpunog prekida koronarnog
protoka, na EKG zapisu može se videti
uzvišenje ST segmenta
• za pacijente sa ovakvim nalazom i
odgovarajucom kliničkom slikom kaže se da
imaju STEMI (ST elevation myocardial
i f ti )
infarction)
• obično, mada ne uvek, na EKG-u može da se
pojavi i Q – talas infarkta miokarda
18

EKG srčanog ciklusa kod pacijenata sa STEMI
A- normalan EKG
B- 1 sat nakon infarkta
C- nekoliko dana posle
D- nekoliko nedelja posle
E- par meseci posle
19
EKG U AKS
• delimičan gubitak koronarne perfuzije je manje
j stanje,
ozbiljno j , ali ipak
p može dovesti do nekroze
tkiva
• pacijenti sa ovakvom koronarnom perfuzijom
nemaju ST uzvišenje na EKG-u, ali imaju
biohemijske pokazatelje srčanog oštećenja
• takvo stanje se naziva NSTEMI (non-ST
elevation myocardial infarction)
• oni koji imaju nestabilnu ishemiju i bez nekroze
tkiva su pacijenti sa nestabilnom anginom
pektoris.
20

UZROK AKS
• ateroskleroza koja predstavlja suženje
arterijskog lumena
• ruptura aterosklerotskog plaka može dovesti do
otkidanja jednog dela i sledstvene tromboze
• ishemija i infarkt miokarda najčešće proizilaze iz
ateroskleroze
• u 90% slučajeva
l č j postoji
t ji ffokalno
k l začepljenje
č lj j
samo jednog od tri velika koronarna krvna suda
ili ogranka
21
RAZVOJ AIM
• miokardna ishemija i preteći infarkt obično počinju u
endokardu i šire se prema epikardu
• ireverzibilno srčano oštecenje se događa kada je
začepljenje potpuno i traje najmanje 15 do 20 minuta
• najveće oštećenje se događa u prvih dva do tri sata, a
obnavljanje protoka u prvih 60 do 90 minuta izaziva
maksimalno očuvanje tkiva
• u nekim slučajevima, obnavljanje protoka čak i kasnije je
od velikog značaja
• u skoro svim slučajevima, AIM pogađa levu komoru
(može i desna)
• postoje kliničke situacije u kojima je oštećenje desne
komore predominantno
22

RAZVOJ AIM
• nastali koronarni trombovi se spontano liziraju u
oko 50% slučajeva u toku deset dana
• za pacijente sa STEMI važno:
– što ranije otčepljenje krvnih sudova tromboliticima i/ili
invazivnom perkutanom intervencijom
– urgentna invazivna revaskularizacija
– noviji antikoagulansi
antikoagulansi, trombolitici i antiinflamatorna
sredstva u kombinaciji sa koronarnom
revaskularizacijom spašavaju živote ovih pacijenata
23
Ruptura plaka: karakteristični morfološki, angiografski i IVUS nalazi
Virmani R, Kolodgie F, et al Eur Soc Card Annual Mtg 2005 24

Plaque
RupturaRupture:
plaka: karakteristični
Characteristicmorfološki,
Morphologic,
angiografski
Angiographic,
i IVUS
and
nalazi
IVUS findings

Heart Scans from 3 Individuals Classified at

Same CHD Risk According to FRS
28

KLINIČKA SLIKA
• Bol pri AIM je različitog intenziteta i može potrajati i do 30 minuta
• Osećaj
O ć j nelagodnosti
l d ti se opisuje
i j kkao stezanje
t j i gušenje
š j u grudimadi
• Pacijenti to obično opisuju kao da im neko sedi na grudima, a jačinu
bola kao jako probadanje nožem u grudi
• Bol se lokalizuje sa obe strane grudne kosti više na levu stranu i širi
se ka levom ramenu i ruci ili ka vratu i donjoj vilici
• Kod nekih pacijenata, AIM može početi u epigastrijumu i sa
stomačnim tegobama (uzrok loše početne dijagnoze kada se
umesto na infarkt miokarda sumnja na oboljenje digestivnog trakta)
• Kod pacijenata sa stabilnom anginom pektoris,
pektoris bol infarkta miokarda
može da liči na napad angine, ali je ovaj mnogo ozbiljniji, duže traje i
ne prolazi po uzimanju nitroglicerina
29
DIJAGNOZA AIM
•p
prema SZO ako p
postoje
j bar dva od sledeca tri kriterijuma:
j
– bol u grudima koji se javljao i ranije
– promene na EKG nalazu
– visoki srčani markeri
• samo nalaz visokih srčanih markera ne ukazuje da je reč
o AIM osim ako se oni udruže sa odgovarajućom
kliničkom slikom i EKG
• klasična EKG promena kod STEMI je porast ST segmenta
t l
talasa
• kod većine NSTEMI javlja se depresija ST segmenta, sa
ili bez promene T-talasa
• AIM sa promenom ST segmenta imaju lošiju prognozu
30

Četiri grupe pacijenti sa AIM
• I grupa – prva 4 sata po pojavi bola u grudima
primljeni
p j na UO bez EKG evidencije j o AIM. U
ovom slučaju srčani markeri treba da budu
dovoljne osetljivosti i specifičnosti kako bi dali
dijagnostičku informaciju. Ovi markeri se u
cirkulaciji odmah pojavljuju i brzo se iz nje
eliminišu pa je brzina njihovog određivanja od
velikog značaja.
• II grupa – u periodu od 4 do 48 sati od pojave
bola u grudima bez EKG pokazatelja. Ovde je
neophodno ozbiljno praćenje srčanih markera i
EKG promena.
31
Četiri grupe pacijenti sa AIM

• III grupa – nakon 48 sati od pojave bola u
grudima,, a sa nespecifičnim
g p EKG p promenama.
Za ovu situaciju idealan srčani marker bi bio onaj
koji se u cirkulaciji zadrži nekoliko dana.
• IV grupa – pacijenti koji su primljeni na urgentno
odeljenje u bilo koje vreme od pojave bola u
grudima, ali imaju jasan EKG nalaz AIM. U ovoj
situaciji, određivanje srčanih markera nije
neophodno Kod pacijenata ove grupe kojoj je
neophodno.
data trombolitička terapija, određivanje
biomarkera može biti od važnosti za praćenje
toka i efekta terapije.
32

BIOMARKER
• definiše se kao merljivi događaj u
bi l šk
biološkom sistemu
i t ((npr. h
humanom
organizmu)
ili alterantivno
• kao molekul koji ukazuje na promene

različite od fiziološkog ponašanja
33
IZBOR BIOMARKERA
• Izjava o objedinjenim standardima za pripremu izveštaja
ispitivanja
p j ((eng.
g Consolited Standards of Reporting
p g
Trials, CONSORT),
• Sadrži listu pitanja na koja treba odgovoriti prilikom
ispitivanja dijagnostičke tačnosti
• Standardima za iskazivanje dijagnostičke tačnosti (eng.
Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy,
STARD) opisani su svi neophodni dokazi potrebni za
obezbeđivanje pojedinih zahteva navedene CONSORT
izjave
• Koncept laboratorijske medicine zasnovane na dokazima
(eng. Evidence-Based Laboratory Medicine, EBLM)
34

SRČANI BIOMARKERI
• kli
kliničko-laboratorijski
ičk l b t ij ki bi biomarkeri
k i kkojiji se
koriste za detekciju AIM ili manjih srčanih
oštećenja
• najveći broj biomarkera su srčani proteini
koji se međusobno razlikuju po mestu gde
se nalaze
l u miocitu,
i it kretanju
k t j nakonk
oštećenja miocita i brzini uklanjanja iz
cirkulacije
35
SRČANI BIOMARKERI
1. Postavljanje dijagnoze
2. Procenu rizika
3. Promenu terapije
36

SRČANI BIOMARKERI
• Uslovi specifičnog srčanog markera treba
d iispune potrebe
da t b dijagnostikovanja
dij tik j
infarkta miokarda i procenu mogućeg
rizika
• Idealan protokol za evaluaciju srčanog
markera ne postoji
• Mora se obezbediti tačnost dijagnostičkog
testa
37
KARAKTERISTIKE IDEALNOG
SRČANOG BIOMARKERA
• Veličina
• Ćelijska lokalizacija
• Apsolutna srčana tkivna specifičnost
• Visoka tkivna specifičnost
• Specifičnost za ireverzibilno oštećenje
• Izlazak
• Stabilnost
• Klirens
• Primene
• Pogodnost određivanja
38

BIOHEMIJSKI MARKERI OŠTEĆENJA
MIOKARDA
• univerzalno su značajni za
dij
dijagnostikovanje
tik j pacijenata
ij t sa AKS
• definitivno prihvaćeni biomarkeri AKS
• novi biomarkeri, kao što su natriuretski
peptidi, kardiotonični steroidi, citokini,
albumin modifikovan ishemijom
ishemijom, slobodne
masne kiseline itd
39
RAZVOJ I PRIMENA BIOHEMIJSKIH POKAZATELJA

OŠTEĆENJA TKIVA MIOKARDA I NJEGOVE FUNKCIJE
RIA za BNP RIA za

Mioglobin i proANP proBNP
BNP
IRMA za
INH za CK-MB ANP i BNP
CK-MB cTnI POCT za mioglobin,
Elektroforeza mass CK-MB, cTnI i BNP
za CK i LD
ECLIA za
RIA za proBNP
AST u AIM CK u AIM ANP cTnT
osetljivi Tn
1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010

vreme (godine)
40

NOVI KRITERIJUM
za akutni,
akutni, koji se razvija ili skori AIM
ishemijski patološki Q zubac
simptomi na EKG
EKG--u
 sr
srččani troponin
perkutana
ishemijske koronarna
promene na EKG
EKG--u intervencija
(ST--segment)
(ST
41
ESC/ACC:: JACC 2000
ESC/ACC 2000;; 36:959-
36:959-969.
Troponin
“zlatni standard”
tandard”
srčanog oštećenja
42

SRČANI TROPONIN
• kontraktilni protein miofibrila

• primarno smešten u miofibrilama (94-
97%), a nešto malo ga ima u citoplazmi
(3-6%)
• proteinski kompleks koga čine tri
subjedinice: troponin C, troponin I i
troponin T
43
SRČANI TROPONIN
•troponin C: Ca2+- vezujuća komponenta
•troponin I: inhibitorna komponenta
•troponin T: tropomiozin-vezujuća
komponenta
•sve tri subjedinice se mogu naći u više
izoformi
•izoforme T i I su srčano specifične
44

STRUKTURA MIKROFIBRILA
TnI
TnC TnT
Tropomiozin
Aktin
45
Struktura kompleksa srčanog troponina i formi

troponina koji se oslobađaju posle nekroze miofibrila
46

Najbolji biohemijski pokazatelj
za detekciju
j srčane nekroze
«koncentracija srčanog
troponina viša od granične
vrednosti bar jedanput u toku
prvih 24 sata posle početka
kliničkog događaja».
The Joint European Society of Cardiology/ 47

American College of Cardiology Committee, Sept 2000
MOŽDANI NATRIURETIČNI PEPTID
• BNP (brain
(b i natriuretic
t i ti peptid):
tid) hormon
h i l
izolovan iiz
svinjskog moždanog tkiva
• njegov biološki efekat je sličan efektu atrijalnog
natriuretičnog peptide (ANP - atrial natriuretic peptid)
• uglavnom je smešten u miokardijumu srčanih
k
komora
• nivo BNP-a u krvi je veći u stanjima hipervolemije
kao što je to kod KSI i hipertenzije
48

Natriuretični peptidi (NP – natriuretic peptid)
• regulišu volumen tečnosti u organizmu, krvni

pritisak
iti k i elektrolitički
l kt litički b
balans
l
• aktivnost u centralnom i perifernom sistemu
• prvo je otkriven ANP, a nešto kasnije i BNP
u svinjskom mozgu
• kod ljudi,
ljudi iako se stvara u mozgu
mozgu, najveće
vrednosti BNP u cirkulaciji potiču iz srčanih
komora
49
Natriuretični peptidi (NP – natriuretic peptid)
• ANP i BNP se oslobađaju kao odgovor na

pretkomorsko i/ili komorsko rastezanje u stanju
hipervolemije
• porast NP se javlja u svim bolestima sa
hipervolemijom uključujući bolesti bubrega, jetre i
neka endokrina oboljenja (Kušingova bolest,
primarni hiperaldosteronizam)
• redukuje
d k j produkciju
d k ij renina
i i aldosterona
ld t i ttako
k
omogućava bolju glomerularnu filtraciju i izlučivanje
urina
50

BNP
• sintetiše se u miocitu kao prepro-hormon, zatim se prevodi u
proBNP i p
p potom izbacuje
j u cirkulaciju
j
• dejstvom proteaze se iz proBNP-a oslobađa NT-proBNP
fragment (nepoznate funkcije) i BNP koji ima fiziološku
aktivnost
• eliminacija ove dve forme se odvija preko bubrega
• BNP se razgrađuje dejstvom neutralne endopeptidaze, a
renalna eliminacija je receptorski posredovana
• za razliku od BNP-a, NT-proBNP fragment se ne izlučuje
mehanizmom preko receptora, ali ima dominantnu bubrežnu
eliminaciju
51
BNP
• ima višestruku srčanu funkciju
• oslobađa se kao regulatorni hormon u odgovoru
na različite srčane napore, naročito pri srčanom
rastezanju
• osetljiv marker za promene u fiziologiji komore
• koncentracija cirkulišućeg BNP-a zavisi od pola i
starosti, a p
povećan je
j kod hroničnogg srčanog g
oboljenja srazmerno njegovoj ozbiljnosti
• za identifikaciju pacijenata sa srednje ozbiljnom
kongestivnom srčanom insuficijencijom
52

Bitransformacija i oslobađanje BNP i NT‐proBNP iz
miocita u cirkulaciju
53
ROC analiza za BNP i NT‐proBNP za dijagnozu akutnog
popuštanja srca
54

BIOMARKERI CHF
•CRP
Inflamacija •Faktor nekroze alfa
•IL‐1, IL‐6 i IL‐18
•Oksidovani LDL
Oksidativni stres •Mijeloperoksidaza
•Biopirini
p u urinu
•Izoprostani u urinu i plazmi
•Malondialdehid u plazmi
•Troponini T i I
Oštećenje miocita •Miozin laki lanci kinaza I
•Srčani tip masna kiselin protein
•CK MB frakcija
•BNP
Stres miocita •NT‐proBNP
•Midregional proANP
•ST2
•Matriks metaloproteinaze
Remodelovanje ekstraćelijskog •Tkivni inhibitori metaloproteinaza
•Peptidi kolagena
matriksa
•Hromogranin
Novi biomarkeri •Galektin‐3
•Osteoprotegerin
•Adiponektin
•Faktor diferencijacije rasta 15 (GDF 15)
•Norepinefrin
Neurohormoni •Renin
•Angitenzin II
•Arginin vazopresin 55
•Endotelin
NEJM 2008;358:2148-59.
Galektin-3
• protein koji je član familije lektina koji sadrži ugljeno
hidratni ‐ prepoznavajući ‐ vezujući domen (CRD) od
oko 130 aminokiselina koje omogućavaju vezivanje
oko 130 aminokiselina koje omogućavaju vezivanje
beta‐galaktozida.
• Uključen u nekoliko bioloških procesa uključujući
ćelijske adhezije, aktivaciju ćelija, hemoatrakciju, rast
ćelije i diferencijaciju, ćelijski ciklus i apoptozu.
• Klinički uključen u kancer, inflamaciju, fibrozu, šlog i
bolesti srca.
• Ekspresija je implicirana u različitim o procesima
povezanim sa CHF, proliferacijom miofibroblasta,
fibrogenezom, popravkom tkiva, inflamacijom i
remodelovanjem komora. 56

Kreatin kinaza (CK)
• enzim neophodan za mišićnu kontrakciju
• katalizuje reakciju prevođenja kreatina u kreatin
kreatin-
fosfat uz pomoć ATP-a
• nalazi se u skeletnim mišićima, mozgu i srčanom
mišiću
• postoji u obliku dimera koga čine kombinacije
monomera ((M - iz mišića, B - iz mozga)
g )
• elektroforezom na agarozi i celuloza-acetatu
identifikovana su tri citozolna (CK-3, CK-2, CK-1) i
jedan mitohondrijalni izoenzim (CK-Mt)
57
Kinetika mioglobina, troponina i CK‐MB
58

ROC analiza troponina, mioglobina i CK‐MB od
početka simptoma
59
Kreatin kinaza (CK)

• CK-1 (CK-BB) - kod zdravih ljudi se ne nalazi u
serumu; pojavljuje
j lj j se u serumu usledl d povrede
d
mozga, kancera prostate, bubrega ili kancera
pluća; najveća elektroforetska brzina
• CK-2 (CK-MB) - više specifičan za miokard
• CK-3 (CK-MM) - dominantan i u skeletnim i u

srčanom mišiću
60

Kreatin kinaza (CK)
• u serumu zdravih osoba ima 95% CK-MM, a ostatak

či i CK
čini CK-MB
MB
• postoji bar tri izoforme CK-MM i najmanje četiri
izoforme CK-MB
• tkivna forma CK-MM se oznacava CK-MM3 (kada se
ovaj enzim oslobodi u cirkulaciju dejstvom
karboksipeptidaza razlaže se na proizvode CK-MM2 i
CK-MM1); slično se dešava i sa CK-MB izoenzimom
• svakak ova iizoforma
f i
ima različito
ličit poluvreme
l eliminacije
li i ij i
to CK-MM1 > CK-MM2 > CK-MM3, a CK-MB1 > CK-
MB2
61
CK-MB
• normalni skeletni mišići, u zavisnosti od lokacije,
sadrže jako malo CK-MB
CK MB (manje od 2%)
• usled ozbiljnih povreda mišića ili hirurške
intervencije nivo CK-MB može značajno da
poraste
• stalno povećanje CK-MB u serumu se sreće kod
mišićnih bolesti (muskularna distrofija,
polimiozitis),
li i iti ) u kkrajnjem
j j stadijumu
t dij renalnih
l ih
bolesti ili pri teškom fizičkom naporu kod
sportista
62

MIOGLOBIN
• kiseonik-vezujući
kiseonik vezujući protein srčanih i skeletnih mišića
• rana pojava u cirkulaciji po povredi mišića zbog male
MM i to što je smešten u citoplazmi ćelije
• kratko vreme polueliminacije od 10 minuta
• porast u serumu se događa usled povrede i skeletnih i
srčanih mišića
• čak i najmanja povreda skeletnog mišića može biti uzrok
visokih koncentracija u serumu što za posledicu može da
da pogrešnu interpretaciju o povredi miokarda
63
MIOGLOBIN
• najveći nedostatak: niska tkivna specifičnost,

specifičnost
pošto je mioglobin iz srca identičan onom koji se
nalazi u skeletnim mišićima
• rani marker sa visokom negativnom
prediktivnom vrednošću, ali niskom
specifičnošću
p
• marker za detekciju AIM u prva četiri sata (CK-
MB i troponin su još uvek u intervalima svojih
RV)
64

LAKTAT DEHIDROGENAZA (LDH)
•enzim
enzim smešten u citoplazmi ćelija različitih tkiva
•katalizuje reakciju stvaranja piruvata iz laktata
•najveća aktivnost LDH pronađena je u skeletnim mišićima,
jetri, srcu, bubrezima i crvenim krvnim zrncima
•elektroforezom na različitim podlogama i u kombinaciji sa
imunohemijskim ispitivanjima pronađeno je najmanje pet
izoenzima LDH
•izoezime čine dva različita tipa peptida, M (iz mišića) i H
(iz srca), koji su ujedinjeni kao četiri peptidne subjedinice
65
LAKTAT DEHIDROGENAZA (LDH)
•LDH-1
LDH 1 (H4) ima najveću elektroforetsku pokretljivost ka
anodi dok LDH-5 (M4) ostaje bliže katodi
•LDH-1 je pronađen u najvećoj koncentraciji u srcu,
bubrezima (u korteksu) i eritrocitima, a LDH-5 u jetri i
skeletnim mišićima
•može da se poveća u različitim bolestima i LDH nije
tkivno specifičan enzimski marker
•srčano specifični LDH-1 može dvostruko da se poveća u
skeletnim mišićima (od 10% do 20% od ukupne aktivnosti
LDH) tokom devetonedeljnog perioda aktivnog treninga ili
trčanja
66

C – REAKTIVNI PROTEIN (CRP)
• reaktant akutne faze koji se povećava kod infektivnih stanja
• naziva se visoko osetljivi CRP (hsCRP - high sensitivity CRP) jer se
detektuje u niskim koncentracijama
• marker akutnih i hroničnih aterosklerotskih procesa
• CRP sam može da poveća inflamatorni i protrombinski odgovor
• hsCRP-u i LDL zajedno mogu da predvide rizik od ateroskleroze
– manje od 1 mg/L -nizak rizik
– 1-3 mg/L-srednji rizik
– veće od 3 mg/L –visoki rizik
• za pacijente sa AKS, početne vrednosti hsCRP imaju prognostički
značaj
• većina studija pokazuje da je značaj merenja srčanog troponina
dominantan za kratkoročnu, a da zajedno sa hsCRP-om daje
dugoročnu prognozu (ne mora uvek da bude pravilo)
67
MIJELOPEROKSIDAZA
• enzim koji se oslobađa nakon agregacije

neutrofila kada indukuje aktivni
inflamatorni odgovor u krvnom sudu
• povećan kod pacijenata sa AKS
• prve prognostičke studije su ohrabrujuće
mada ne postoji adekvatna uporedivost sa
d i analizama
drugim li
• ne postoje standardni testovi i referentne
vrednosti za određivanje
68

FOSFOLIPAZA A2 UDRUŽENA SA
LIPOPROTEINOM
• Lp PLA2 (lipoprotein-associated
(lipoprotein associated phospholipase
A2) je lipoprotein udružen sa LDL
• inflamatorni marker
• faktor aktivacije trombocita, tj. (PAF-platelet
activating factor) acetil-hidrolaza
• eksprimuje se u nekrotičnom jezgru koronarnih
lezija
• proizvodi Lp PLA2 enzimske aktivnosti
doprinose inflamaciji i ćelijskoj smrti, kao i
osetljivosti plaka na rupture
69
METALOPROTEINAZE MATRIKSA
• MMP (matrix metalloproteinases) su enzimi koje

mogu da razgrađuju kolagen matriksa i u
koronarnim arterijama i u miokardu
• one su ključne u procesu remodelovanja
koronarnih arterija i/ili srca nakon akutnog
srčanog događaja
g
• odgovorne su za destabilizaciju j
aterosklerotskog plaka
• za sada, ne postoje standardizovane metode i
referentne vrednosti
70

Abrams JA. NEJM 2005;352:2524 71
BIOHEMIJSKI PROFIL PACIJENATA SA AKS
od vaskularne inflamacije do rupture plaka
od ishemije do smrti ćelije i do disfunkcije miokarda
Apple, F. S. et al. Clin Chem 2005;51:810-824
72

VASKULARNA INFLAMACIJA
Proinflamatorni Destabilizacija Ruptura plaka

citokini plaka Reaktanti akutne
sCD40L faze
IL-6 MMP-9
PlGF CRP
TNFα MPO
PAPP-A
ICAM
VCAM
Ishemija
Disfunkcija
IMA Nekroza miokarda
FFAu cTnT BNP
Holin cTnI NT-proBNP
73
BIOHEMIJSKI PROFIL PACIJENATA SA AKS
Clinica Chimica Acta, Volume 443, Pages 1‐126 (30 March 2015)
Biomarkers in Heart Failure, Edited by Marc De Buyzere and Damien Gruson 74

MARKERI NESTABILNOSTI PLAKA
75
PLAZMA PROTEIN-A POVEZAN SA

TRUDNOĆOM (PAPP-A)
(Pregnancy-associated plasma protein-A)
• Heterotetramerni protein ~500 kDa

• Cink metaloproteinaza, cirkuliše u krvi majke u
toku trudnoće
• Marker za prenatalni “screening”
• Specifični
S ifič i aktivator
kti t insulin-sličnog
i li lič faktora
f kt rasta
t I
(medijator ateroskleroze)
• PAPP-A: marker nestabilnog plaka?
76

PAPP-A u AKS
77
Lund et al. Circ 2003;108:1924
MARKERI AKTIVACIJE TROMBOCITA
78

SOLUBILNI CD40 LIGAND
CD40:CD40L:
nalaze se na leukocitima,
endotelijalnim ćelijama,
ćelijama glatkih mišića i
aktiviranim trombocitima
Prasad et al. Curr Opin Hem 2003,10:356

79
Solubilni CD40L
Schoenbeck et al. Circ Res 2001;89:1092
KONTROLA
Imunobojenje u AKS
luminalni endotelijum aterosklerotskog karotidnog ateroma 80

CD40L u AKS (CAPTURE)
Heeschen et al. NEJM 2003;348:1104-11.
>5 ng/mL
≤5 ng/mL
81
Statini smanjuju rizik od KVO posle 16 nedelja

Kinlay et al. Circ 2004;110:386-91.
82

MARKERI ISHEMIJE
83
ALBUMIN MODIFIKOVAN ISHEMIJOM

(IMA)
Humani serum albumin je
cirkulušići protein krvi koji ima
mestot za vezivanje
i j metala
t l na NN-
kraju.
U toku ishemijskih stanja dolazi do promena na N-kraju čime

nastaje IMA koji ne može da vezuje metale na N-kraju.
84
Bar Or et al, Eur J of Biochem 2001

Primena IMA u kliničkoj praksi
Urgentna medicina Kardiologija
IMA negativan IMA pozitivan

Odbacivanje CILJ Prijem
Nizak RIZIK Visok
Visoka osetljivost IZVOĐENJE Visoka specifičnost
Prohodnost ISHOD Odgovarajuća nega
Odloženo koštanje FINANSIJE Koštanje
Propušten infarkt GREŠKE Nepotrebna terapija
85
DONOŠENJE ODLUKE
BEZ ODLUKE ODLUKA
85 > IMA <100 IMA ≥100

Potrebni dodatni Prijem
podaci
IMA ≤ 85
Otpust
IMA
86
Jesse et al, u pripremi

MULTIMARKER STRATEGIJE
NEKROZA
ISHEMIJA cTnT, cTnI, RUPTURA PLAKA
Myo, FABP
IMA, uFFA MMPs, PAPP
sCD40L, PIGF
ARITMIJE TROMBOZA
PAI-1, sCD40L
vWF, D dimer
NEUROHORMONSKA AKTIVACIJA
AKTIVACIJA
ENDOTELA
INFLAMACIJA
BNP, NE sICAM, pSelektin
hs-CRP, Ox LDL
87
MCP-1, MPO, IL18 J deLemos, Univ of Texas SW
Troponin
“zlatni standard”
tandard”
srčanog oštećenja
88

Određivanje CKMB mase
ukoliko ne postoji mogućnost
određivanja troponina (dve
sukcesivne vrednosti više od
99-te p
99- percentilne))

Ne preporučuje se
određivanje CK
Određivanje AST, LDH i

HBDH da se ne koristi


PREDNOSTI I NEDOSTACI
PRIMENE TROPONINA
UKAZUJE NA OŠTEĆENJE
NE OBJAŠNJAVA MEHANIZAM
91
Povišena vrednost srčanog

troponina bez kliničkog dokaza o
prisustvu ishemijskog oboljenja
srca
?
92

Povećanje koncentracije srčanih troponina kod
bolesnika bez prisustva ishemijskih srčanih oboljenja
Akutna reumatska groznica Hemoglobinopatije sa

Amiloidoza
l d transfuzijom
Oštećenje miokarda Hipertenzija, uključujući i
gestacionu
Kardiotoksičnost (terapija
karcinoma) Hipotenzija, najčešće sa
aritmijama
Hronična bubrežna oštećenja
Hipotiroidizam
CHF
Pneumonija
Kritično bolesni ((dijabetes)
j )
Mi k diti
Miokarditis
Glkogenoze (Pompeovo
oboljenje) Postoperativna nesrčana
hirurška intervencija
Transplantacija srca
Embolija pluća
Hemosideroza
Sepsa
93
Komitet za standardizaciju markera

srčanogg oštećenja
j
(IFCC Committee on Standardization

of Markers of Cardiac Damage)
(C--SMCD)
(C
94

Preporučene biohemijske strategije
korišćenje dva markera:

mioglobin i srčani troponin
određuje se samo koncentracija

troponina 95
“Mioglobin
g jje najosetljiviji
j j j
marker za rano odbacivanje
dijagnoze AIM”
Panteghini M et al.
The sensitivity of cardiac markers: an evidence-based
approach. Clin Chem Lab Med 1999; 37: 1097 96

Negativna prediktivna vrednost
mioglobina za rano odbacivanje
AIM iznosi 100% i to 4 sata posle
prijema bolesnika u bolnicu
97
NASTAV LJAJU SE
ISTRAŽIVANJA ZA
ALTERNATIVNIM
“RANIM” MARKERIMA
OŠTEĆENJA
Š Ć
MIOKARDA
98

Preporučeni “rani” m
Preporučeni marker
arkerii
ishemijskog oštećenja miokarda
nevezane slobodne masne kiseline
(FFAu)
glikogen
ikogenffsfor
oriila
laza
za BB
srčani protein koji se vezuje za masnu
kiselinu (FABP)
ishemi
shemijja-modifi
modifikovani
kovani albumin (IMA™)
(IMA )
plaz
lazma protein A udružen sa trudnoćom
(PAPP--A)
(PAPP
holin u punoj krvi (WBCHO) 99
Committee on Standardization
of Markers of Cardiac Damage
Primena biohemijskih markera u akutnom koronarnom sindromu
Frekvencija uzimanja uzoraka
marker prijem +4h +8h +12h

ili naredno jutro
“rani”
rani
npr. mioglobin X X (X)
troponin X X X X
(X) Označava optimalno uzimanje uzoraka
100
Panteghini M et al, CCLM 1999

Izbor
granica odlučivanja
pri primeni
troponina
101
«Koliko nekroze je
potrebno za postavljanje
dijagnoze AIM?».
AIM?»
102

INFARKT MIOKARDA
REDEFINICIJA
“d fi iš nekrozu
“definiše k miokarda
i k d k kao
povećanje vrednosti srčanog troponina
iznad gornje granice normalne zdrave
populacije i to iznad 99-te percentilne
vrednosti distribucije ”
The Joint European Society of Cardiology/
American College of Cardiology Committee, Sept 2000 103
Committee on Standardization
of Markers of Cardiac Damage (C-SMCD)
PREPORUKA
U kliničkoj praksi troponin se određuje

tako da ukupna nepreciznost, izražena
k koeficijent
kao k fi ij t varijacije
ij ij (K(Kv)) b
bude
d niži
iži
od 10% na AIM nivou odlučivanja
Panteghini M et al, CCLM 2001 104

NORMAL AMI
99th URL
10% CV
cut-off
for AMI
10% / 99thRATIO
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.04 0.06 BECKMAN ACCESS® AccuTnI 1.5

0.05 0.09 TOSOH AIA 21 1.8
0.05 0.10 DADE-BEHRING STRATUS CS® 2.0
DPC IMMULITE®
Concentration of
0.15 0.32 2.1

onin (g/L)
0.15 0.33 BAYER ACS CENTAUR 2.2

0.03 0.065 BYK SANGTEC LIASON 2.2
0.10 0.34 BAYER IMMUNO 1® 3.4
0.10 0.36 BIOMERIEUX VIDAS 3.6
Tropo
®
0.10 0.37 BAYER ACS:180 3.7
®
0.07 0.26 DADE-BEHRING DIMENSION RxL® 3.7
0.01 0.04 ROCHE ELECSYS® TnT 4.0
®
0.30 1.22 ABBOTT AXSYM 4.1
0.10 0.44 ORTHO VITROS ECi 4.4
0.10 0.90 DADE-BEHRING OPUS® 9.0
0.15 NA FIRST MEDICAL ALPHA Dx® NA
105
ZAHTEV ZA PROIZVOĐAČE
TESTOVA
treba da zadovolje neophodnu

preciznost < 10% na preporučenoj
preporučenoj
«cut--off» 99
«cut 99--oj percentiln
percentilnoj
oj
vrednosti
106

Preporučena vrednost za ukupnu
nepreciznost na granici
odlučivanja za AIM za
određivanje
j mioglobina
g treba da
bude niža od 6%
107
Ukupnu nepreciznost na 99-

99-oj
percentilnoj vrednosti za CKMB
masa za većinu testova <10%;
zavisnost od p
pola,, etničke
pripadnosti
108

Dodatna primena
srčanih
biohemijskih markera
109
Procena rizika
važna u početnoj evaluaciji

bolesnika sa AKS
tretman zavisi od rizika
110

Procena rizika
bilo koje povećanje troponina

predviđa kardiovaskularni
rizik
111
Povišen rizik
FRISC II sub cTnT > 0,01 g/L

FRISC II cTnI > 0
0,03
03 g/L
112

Specifičnost
imunoodređivanja markera
različiti rezultati primenom

različitih sistema i generacija
testova
113
Standardizacija određivanja
biohemijskih srčanih markera
pripremu primarnih i sekundarnih

«matriks» referentnih materijala
114

Unificirani referentni intervali
i granice odlučivanja
Sa svakom novom generacijom

testova menjale su se i gornje
granice referentnog intervala
115
Preanalitičke varijacije
vreme i temperatura čuvanja,
antikoagulanasi
IFCC C-SMCD preporučuje
plazmu umesto seruma
zavisnost od pola i etničke

pripadnosti
116

Srčani troponini danas se sa pravom smatraju:
srčano najspecifičnijim biohemijskim markerima

oštećenja miokarda
najboljim pokazateljima u dijagnozi AIM,
proceni
p rizika
k i praćenju
p j terapije
p j u akutnom
k
koronarnom sindromu
117
DILEMA KOD BOLA U GRUDIMA:

rana detekcija ishemije
BOL U GRUDIMA
liberalno primanje liberalno odpuštanje
povećanje troškova u bolnici povećanje propuštenih infarkta

118

Pacijent sa bolom u grudima (srčani bol)?
• infarkt miokarda?
• trombolitička terapija?
• angina?
• g j
odgovarajuća intervencija?
j
• rizik od infarkta?
119
Komercijalne platforme za određivanje multimarkera
120

121
122

123
124

KATEGORIZACIJA AKS
AKUTNI KORONARNI SiNDROM

Electrocardiogram
NSTEACS STEMI
Biomarkeri nekroze potvrda
UA NSTEMI STEMI
125
Biohemijski profil ACS pacijenata: vaskularna inflamacija →

ruptura plaka → ishemija → smrt ćelije → disfunkcija miokarda
126
Copyright ©2005 American Association for Clinical Chemistry

MEĐUZAVIZNOST SRČANIH BIOMARKERA
Patofiziologija Biomarkeri
Oboljenje koronarnih arterija faktori rizika (npr. holesterol)
Srčana inflamacija CRP, Lp-PLA2, homocistein, MPO
Nestabilnost/razgradnja plaka MPO, Lp(a), Lp-PLA2
Ishemija/nekroza miokarda srčani troponini, CK-MB, mioglobin
Preopterećenje ventrikula BNP, Nt-proBNP
127
Panteghini. Eur Heart J. 2004;25:1187-1196.
NACB LMPG: KLINIČKE KARAKTERISTIKE I

KORIŠĆENJE BIOHEMIJSKIH MARKERA U AKS
Korišćenje biomarkera za:
INICIJALNA EVALUACIJA AKS
MENADŽMENT NSTE-AKS
MENADŽMENT STEMI
128

KORIŠĆENJE BIOMARKERA U
INICIJALNOJ EVALUACIJI AKS
A. Dijagnoza AIM
1. Biomarkeri nekroze miokarda
1
2. Optimalno vreme uzimanja uzorka
3. Kriterijumi za dijagnozu AIM
4. Dodatna razmatranja primene biomarkera u dijagnozi AIM
B. Rani rizik stratifikacija

1. Biomarkeri oštećenja miokarda
2 Natriuretični peptidi
2.
3. Biomarkeri inflamacije
4. Biomarkeri ishemije
5. Multimarker prilaz
6. Drugi novi markeri
129
Dijagnoza AIM
• Srčani troponin
p jje p
preporučeni
p marker za dijagnozu
j g
AIM
• Masena koncentracija CK-MB je prihvatljiva

alternativa ukoliko određivanje srčanih troponina
nije na raspolaganju
klasa I, nivo dokaza A

130

Dijagnoza AIM
• Ukupni CK,
CK aktivnost,
aktivnost AST,
AST hidroksibutirat
dehidrogenaza i/ili LDH ne treba da se
koriste kao biomarkeri za dijagnozu AIM
klasa III, nivo dokaza C

131
Dijagnoza AIM
Korišćenje ukupnog CK za dijagnozu AIM SE NE
PREPORUČUJE
Međutim,
Ukoliko nema podataka o vrednosti troponina ili CK-
MB (masa ili aktivnost), već postoje samo podaci za
ukupnu CK, preporučeni nivo odlučivanja treba da
bude 2 puta viši od polno specifičnih gornje granice
referentnog intervala. Povećanje i/ili pad CK-MB ili
ukupne CK omogućava dodatne dokaze za potvrdu
dijagnoze AIM.
132

Integration of Imagiging, Biomarkers
and Interventional Therapy for
Improving Patient Outcomes
Joint ESC-ACC-AHA-World Heart

Federation (WHF) Task Force for the
Redefinition of MI – a g
global consensus
document
AACC Annual Meeting 2007, San Diego, CA 133
Universal Definition of Myocardial Infarction

Kristian Thygesen; Joseph S. Alpert; Harvey D. White;
on behalf of the Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force
for the Redefinition of Myocardial Infarction
• This document was approved by the European Society of Cardiology in April

2007, the World Heart Federation in April 2007, and by the American Heart
Association Science Advisory and Coordinating Committee May 9, 2007. The
European Society of Cardiology, the American College of Cardiology, the
American Heart Association, and the World Heart Federation request that this
document be cited as follows: Thygesen K, Alpert JS, White HD; Joint
ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Redefinition of Myocardial Infarction.
Universal definition of myocardial infarction. Circulation.2007;116:2634 –2653.
• This article has been copublished in the October II (Vol. 28, no. 20), 2007, issue
of the European Heart Journal (also available on the Web site of the European
Societyy of Cardiology
gy at www.escardio.org),g), the November 27,, 2007,, issue of
Circulation (also available on the Web site of the American Heart Association at
my.americanheart.org), and the November 27, 2007, issue of the Journal of the
American College of Cardiology (also available on the Web site of the American
College of Cardiology at www.acc.org).
• (Circulation. 2007;116:2634-2653.)
134

Kriterijumi za definiciju AIM
Treća unuverzalna definicija AIM, 2012. godina
1. Detekcija porasta i/ili pada srčanih biomarkera (poželjno troponina)
iznad 99 percentilne gornje granice referentnog intervala, zajedno sa
iznad 99 percentilne gornje granice referentnog intervala, zajedno sa
dokazom o ishemiji barem jednog od sledećeg:
a. ishemijski simptomi
b. elektrokardiogramske (EKG) promene nove ishemije (nove ST‐T
promene ili novi blok leve grane (left bundle branch block, LBBB)
c. razvoj patološkog Q talasa na EKG‐u
d. "imaging" dokazi novog gubitka vijabilnog miokarda ili nove
abnormalnosti kretnje zida
e. identifikacija intrakoronarnog tromba angiografijom ili
autopsijom
135
Materijal za učenje
1. Ignjatović S. Srčani markeri. (tekst, pdf fajl)
2. Ignjatović
g j S. Srčani markeri. ((slajdovi
j sa p
predavanja,
j p pdf
fajl)
3. Majkić-Singh N. Biohemijski pokazatelji za
dijagnostikovanje akutnog koronarnog sindroma. U:
Majkić-Singh N. Medicinska biohemija, drugo izdanje,
Društvo medicinskih biohemičara Srbije, Beograd, 2006;
545-559. (ISBN 86-83023-09-5)
136

10/26/2016
TUMORSKI MARKERI
I deo
Prof dr Svetlana Ignjatović

Prof.
1/134
Neka od pitanja za početak...

• Kako nastaje kancer?
• Šta
Š su “tumorski markeri”?
• Koje su poželjne karakteristike tumorskih
markera?
• Na koji se način koriste tumorski markeri?
• Za koje ste tumorske markere čuli?
2/134
1
10/26/2016
Primeri iz brošura proizvođača

reagenasa
3/134
INCIDENCIJA I MORATALITET OD KANCERA
4/134
2
10/26/2016
PREŽIVLJAVANJE U TOKU OD PET GODINA U %
5/134
PRIMARNI, SEKUNDARNI I TERCIJERNI TUMORSKI MARKERI
6/134
3
10/26/2016
PRIMARNI I SEKUNDARNI TUMORSKI MARKERI
7/134
Glavni uzroci smrti u USA

Ukupan
p brojj Procenti od ukupnog
p g
broja
Svi uzroci 2391399 100
Kardiovaskularna 725192 30,3
Karcinomi 539838 23,0
Cerebrovaskularna 167366 7,0
Hronicna opstrukivna 124181 5,2
oboljenja pluca
Udesi 97860 4,1
8/134
4
10/26/2016
OBOLJEVANJE OD MALIGNIH TUMORA U SRBIJI
9/134

ŽENE
10/134
5
10/26/2016

MUŠKARCI
11/134
EPIDEMIOLOŠKI PODACI
INCIDENCIJA I SMRTNOST U MUŠKARACA
12/134
6
10/26/2016
INCIDENCIJA I SMRTNOST OD MALIGNIH BOLESTI U ŽENA
13/134
Tumorske ćelije nastaju akumuliranjem

mutacija (6 do 10)
14/134
7
10/26/2016
KARAKTERISTIKE TUMORSKIH ĆELIJA
• Automan rast
• Nediferenciranost i primitivna građa
• Infiltrativni rast
• Promenjen metabolizam
• Sposobnost metastaziranja
15/134
Nastanak kancera
precizna regulacija proliferacije, diferencijacije i
preživljavanja
ži lj j ćelije
ć lij višećelijskog
iš ć lij k organizmai
• posledica sloma regulacionih mehanizama koji

upravljaju ponašanjem normalne ćelije
• u ćelijama kancera nema regulacije i one
nekontrolisano rastu, dele se i šire po čitavom
organizmu ometajućić normalne funkcije
f zdravih
ćelija
16/134
8
10/26/2016
Nastanak kancera
• poremećaji aktivnosti mnogih proteina koji imaju ključnu
ulogu u ćelijskoj signalizaciji, regulaciji ćelijskog ciklusa i
kontroli programirane ćelijske smrti dovode do
nekontrolisane proliferacije karakteristične za ćelije
kancera
• nastaje kao posledica proliferacije bilo koje ćelije u
organizmu – više od sto vrsta kancera
TUMOR
– svaka nenormalna proliferacija ćelija u
organizmu
17/134
VRSTE TUMORA
benigni (dobroćudni) i maligni (zloćudni) tumori
• benigni – ostaje ograničen na mestu na kome

je nastao, ne širi se na okolna tkiva, kao i na
udaljene delove organizma
• maligni – može da se proširi na okolna tkiva ili
udaljene delove organizma putem krvi ili limfe
( t t
(metastaze) )
• pojam KANCER odnosi se na isključivo maligne
tumore
18/134
9
10/26/2016
Benigni tumori Maligni tumori
• slični zdravom tkivu • razlikuju se od okolnog tkiva

• lagan rast • naglili rastt
• obično su kapsulirani u • nisu kapsulirani: pokazuju
vezivnom tkivu infiltrativan i destruktivan rast
• ne stvaraju metastaze • stvaraju metastaze
• histološki: tipičan nalaz, • histološki: atipičan nalaz,
ćelije su diferencirane polimorfnost ćelija
p j
19/134
Klasifikacija tumora
• prema vrsti ćelija iz kojih nastaju (i benigni i

maligni tumori)
• tkivu iz kojeg nastaju (karcinom pluća ili dojke)
• vrsti zahvaćenih ćelija (fibrosarkomi – fibroblasti,

eritoblastna leukemija – eritroblast)
20/134
10
10/26/2016
Klasifikacija tumora
• KARCINOMI – epitelne ćelije (90%)
• SARKOMI – vezivna i potporna tkiva

(mišići, kosti, hrskavice) (retki kod ljudi)
• LEUKEMIJE i LIMFOMI – bolesti

hematopoetskih ćelija i ćelija imuno
sistema (7%)
21/134
Uzroci nastanka tumora -

KARCINOGENI
• izlaganje mutagenima (vreme i doza)
• h ij ki –modifikacija
hemijski difik ij bbaza
• UV i X-zraci –oštećenje DNK
• infekcija
• virusi – hepatitis B, papiloma (HPV)
• j –Helicobacter py
bakterije pylori
• spontane mutacije (učestalost se naglo
povećava starenjem)
22/134
11
10/26/2016
Vreme kao faktor: kancer kao dugotrajan proces

četiri obavezne faze
FAZA INDUKCIJE In situ FAZA

•može da traje više godina (30) • transformisana ćelija postaje zaista
•uticaj kacinogena (3/4 tumora) tumorska
• kancer ostaje lokalizovan na
originalnom mestu
INVAZIVNA FAZA FAZA ŠIRENJA

•maligne ćelije se umnožavaju (DISEMINACIJA)
•prodiru u okolna tkiva putem krvi • može da traje 1-5 godina
ili limfe • maligne ćelije prodiru u tkiva koja su
udaljena od mesta stvaranja
23/134
TNM klasifikacija malignih oboljenja

(Union Internationale Contre de la Cancer, UICC)
PREOPERATIVNO STANJE
• T = TUMOR (stepen primarnog tumora)

• N = NODI LYMPHATICI (status regionalnih
li f ih čvorova)
limfnih č )
• M = METASTAZE (prisustvo udaljenih
metastaza)
24/134
12
10/26/2016
TNM klasifikacija
T = primarni tumor
T1 = mali tumor, bez invazivnog rasta u okolno tkivo

T2 = tumor srednje veličine, sa malim invazivnim
rastom u okolno tkivo
T3 = veliki tumor, sa značajnim invazivnim rastom u
okolno tkivo
T4 = veoma veliki tumor, obiman invazivni rast u okolno
tkivo
25/134
TNM klasifikacija
N = metastaze u limfnom čvoru
N0 = bez metastaza u limfnom čvoru

N1 = regionalne, u blizini, mobilne metastaze limfnog
čvora
N2 = regionalne, nemobilne metastaze limfnog čvora
N3 = obimne, nemobilne metastaze limfnog čvora
N4 = regionalne, nedostupne metastaze limfnog čvora
26/134
13
10/26/2016
TNM klasifikacija
M = udaljene metastaze
M0 = bez merljivih metastaza

M1 = p
prisustvo udaljenih
j metastaza
M2 = prisustvo udaljenih nedostupnih metastaza
27/134
POSTOPERATIVNO STANJE
 histološka klasifikacija
G (grading) - stepen diferencijacije tumora
G1 = dobro diferenciran
G2 = srednje diferenciran
G3 = loše diferenciran
G4 = nediferenciran
Gx = nemerljiv stepen diferenciranosti tumora
28/134
14
10/26/2016
POŽELJNE KARAKTERISTIKE TUMORSKIH

MARKERA
podesni
d i za određivanje
d đi j
specifični za tumor
uvek prisutan u prisutsvu tumora
29/134
KANCER
+ -
STVARNO LAŽNO = 100% ISPITANIKA
+ POZITIVNI POZITIVNI SA + ODREĐIVANJEM
TUMORSKI
MARKER - LAŽNO
NEGATIVNI
STVARNO
NEGATIVNI
= 100% ISPITANIKA
SA - ODREĐIVANJEM
100% 100%
BOLESNI ZDRAVI
ISPITANICI ISPITANICI
30/134
15
10/26/2016
DIJAGNOZA
cena:
cena: KANCER NEPOTREBNA
LEČENJE TERAPIJA
+ -
TUMORSKI
MARKER - LAŽNO
NEGATIVNI
STVARNO
NEGATIVNI
= 100% ISPITANIKA
SA - ODREĐIVANJEM
100% 100%
cena: BOLESNI ZDRAVI cena:
NELEČENA ISPITANICI ISPITANICI
KOLIKO KOŠTA
BOLEST ODREĐIVANJE
31/134
kera
ncentracija mark
Kon
- oboljenje +
32/134
16
10/26/2016
METODE ODREĐIVANJA TUMORSKIH MARKERA
• ANALITIČKE TEHNIKE
– Određivanje aktivnosti enzima
– Imunoodređivanje (kompetitivno, nekompetitivno)
– Testovi na receptore
• INSTRUMENTALNE TEHNIKE
– Hromatografija
g j
– Elektoroforeza
– MS/HPLC/GH
33/134
METODE ODREĐIVANJA
RIA (Radioimmunoassay)
EIA (Enzymioimmunoassay)
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
EMIT (Enzyme multiplied immunoassay Technique)
CEDIA (Cloned enzyme donor immunoassay)
MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay)
FPIA (Fluorescence Polarization Immunoassay)
CLIA (Chemiluminescence
(Ch il i IImmunoassay))
CMIA (Chemiluminescent Magnetic Immunoassay)
ECLIA (Electrochemiluminescence Immunoassay)
34/134
17
10/26/2016
IMUNOODREĐIVANJE
obeleženo antitelo
35/134
IMUNOODREĐIVANJE
obeležen antigen
36/134
18
10/26/2016
Kompetitivno jednostepeno
imunoodređivanje
37/134
Kompetitivno dvostepeno
imunoodređivanje
38/134
19
10/26/2016
Nekompetitivno imunoodređivanje
“sendvič”
39/134
Razlika između kompetitivnog i

nekompetitivnog imunoodređivanja
40/134
20
10/26/2016
Homogeno i hetrogeno imunoodređivanja
41/134
RIA
42/134
21
10/26/2016
FPIA
homogeno kompetitivno fluoroscentno
imunoodređivanje
43/134
KOMPONENTE MEIA
• Mikročestice‐antitelo čvrsta faza:
lateks mikročestice obložene antitelom koje vezuje specifični analit koji se meri;
• Antitelo‐enzim konjugat:
Alkalna fosfataza enzim konjugovana za antitelo;
• Enzim supstrat:
Fluorescentni 4‐metil umbeliferon fosfat (MUP) u rastvoru koji je raspoloživ za
reakciju sa enzimom na antitelu. 44/134
22
10/26/2016
MEIA
Mikročestice kao čvrsta faza su obložene anitelom
nasuprot antigenu koji se određuje i služe za vezivanje
analita
Antitelo za detekciju je obeleženo enzimom kao u EIA.
Koncentracija analita je proporcionalna količini izmerenog
signala
Nekompetitivni sendvič format daje rezultate koji su
direktno proporcionalni količini prisutnog analita
45/134
CMIA
Hemiluminiscentni obeleživač je konjugovan za
antitelo ili antigen i proizvodi svetlost kada se
kombinuje sa svojim supstratom
Metoda je slična MEIA, s time da hemiluminiscentna
reakcija daje visoku osetljivost i jednostavno
merenje
Nekompetitivni sendvič format daje rezultate koji su
direktno proporcionalni količini prisutnog analita
46/134
23
10/26/2016
POREĐENJE MEIA I CMIA
47/134
METODE ODREĐIVANJA
koncentracija TM zavisi od upotrebljenih

koncentracija TM zavisi od upotrebljenih
metoda za njihovo određivanje
testovi različitih proizvođača daju različite
vrednosti za TM u istom uzorku čak i kada se
koriste ista antitela i metode (primer CA 19‐9)
treba uvek da se navede kojom metodom i
kojim testom je određen TM
48/134
24
10/26/2016
METODE ODREĐIVANJA
u slučaju promene metode i testa odrediti TM
u slučaju promene metode i testa odrediti TM
istovremeno i starom i novom metodom ili
sačuvati uzorke pacijenta za eventualno
određivanje i novom metodom
zavisnost referentnih vrednosti od pola,
fiziološkog stanja, navika itd.
WHO standard za AFP (AFP 72/225)
49/134
INTERFERENCIJA
zbog oslobađanja iz trombocita
bog os obađa ja t o boc ta do dolazi do
a do
povišenja vrednosti NSE; serum treba da se
odvoji u roku od 60 minuta
hemoliza povišava vrednosti NSE zbog
oslobađanja iz eritrocita
kontakt kože sa unutrašnjošću epruveta za
kontakt kože sa unutrašnjošću epruveta za
uzimanje uzoraka za određivanje skvamoznog
ćelijskog kancera (SCC) dovodi do povišenja
vrednosti
50/134
25
10/26/2016
INTERFERENCIJA
lekovi koji se koriste u
koji se koriste u terapiji su uzrok
su uzrok
povišenih vrednosti PSA (dvo‐ i trovalentni
metalni joni, analozi purina, indoli i gvanidini,
vitamin C, cisplatin, mitomicin, estradiol,
epirubicin)
u ikteričnim uzorcima su povišene vrednosti
PSA
51/134
INTERFERENCIJA
HAMA
HAMA (human anti
(human anti‐mause
mause antibodies)
Heterofilna antitela
U serumu prisutni Ig ‐ kod pacijenata koji dobijaju
mišje imunoglobuline u svrhu dijagnoze i terapije u
mišje imunoglobuline u svrhu dijagnoze i terapije u
toku imunoscintigrafskog postupka ili u toku
imunoterapije
52/134
26
10/26/2016
INTERFERENCIJA
do lažno pozitivnih rezultata kada testovi za
do lažno pozitivnih rezultata kada testovi za
određivanje TM sadrže ovo monoklonsko
antitelo
ova heterofilna anti‐IG antitela su samo prisutna
i kod pacijenata koji primaju tzv. "sveže ćelije"
(vrlo retko kod zdravih)
53/134
INTERFERENCIJA
biološki faktori
biološki faktori
kod zdravih osoba starih 66‐99 godina
(40% ima povišene vrednosti CA 19‐9, CEA, CA
72‐4, CA 15‐3, AFP i PSA)
ovo je inače ciljna populacija zdravih gde se ovi
TM rutinski određuju
54/134
27
10/26/2016
Visoka doza “hook” efekat

anog antigena
%veza
55/134
Koncentracija antigena
Preanalitički zahtevi za kvalitet u primeni
tumorskih markera
• zahtev prema protokolima zasnovanim na nacionalnim i međunarodnim
vodičima
dč
• treba da se izbegava zahtev za panelom tumorskih markera
• poželjno uzorkovanje pre tretmana
• uzorkovanje (dnevne varijacije, klinička stanja, lekovi i drugo)
• odgovarajuća epruveta (npr. EDTA može da interferira
• čuvanje uzoraka ‐ kratkoročno: 4 oC; dugoročno: ‐30 oC; duže vremensko
razdoblje: ‐70 oC
• izbegavati tretiranje uzorka toplotom (npr. za PSA, hCG)
• imunohistohemijske analize (standardizacija uslova skupljanja i
fiksacije uzoraka)
56/134
28
10/26/2016
Analitički zahtevi za kvalitet u primeni tumorskih
markera
• analizatori za imunohemijske metode – analitički
kvalitet – FDA, Food and Drug Administration; IVDD,
In Vitro Diagnostics Directive
• sprovođenje unutrašnje kontrole kvaliteta (Internal
Quality Control, IQC)
• učestvovanje u programima spoljašnje procene
kvaliteta (External Quality Assessment, EQA)
57/134
Važni postanalitički zahtevi za primenu tumorskih markera
klinička informacija npr. „postoperativno“, „posle hemoterapije“ –važno za interpretaciju

ordinirajućeg doktora i za identifikuju slučajne laboratorijske greške
odgovarajući opseg za zdravu populaciju; pacijentova bazalna vrednost je

referentni najvažnoji podatak za interpretaciju; porast čak i u okviru
opsezi referentnog opsega klinički značajano;
klinički važne biološka i analitička varijacija;↑ ili ↓ vrednosti markera od ±25%

promene klinički važno;
definisanje protokola obaveštenje ako se promeni metoda; da li će promena metode

pri uticati na interpretaciju rezultata;
promeni metoda
pol reme
poluvreme vreme
reme potrebno da se koncentracije t.m.
t m smanji za
a 50% posle
života t.m. potpunog uklanjanja tumorskog tkiva; važno za AFP i hCG;
poređenje korisnosti objektivna klinička informacije o korisnosti tumorskog markera je

tumorskog markera prioritet brojnih profesionalnih organizacija
58/134
29
10/26/2016
Važni zahtevi pri izdavanju rezultata
tumorskih markera
• kompletni pregled svih vrednosti, pošto trend
kompletni pregled svih vrednosti, pošto trend
kretanja u koncentraciji markera daje najbolju
informaciju
• preporuke za frekvenciju određivanja
• preporuke za određivanje radi potvrde rezultata
(porast u koncentraciji trebalo bi uvek potvrditi
ponovnim merenjem)
i j )
• komunikacija između laboratorije i kliničkog
osoblja
59/134
Uzroci netačnog rezultata tumorskog markera
efekat prozona kod identifikacija ovog efekta kako bi se izbeglo pogrešno izdavanje
visokih koncentracija niskog rezultata; mogu se smanjiti korišćenjem antitela u čvrstoj
fazi ili većeg vezujućeg kapaciteta, određivanjem uzorka u dva
različita
ličit razblaženja
bl ž j ili korišćenjem
k išć j određivanja
d đi j u sekvencama
k
koje uključuju ispiranje (wash step);
carry-over uzorka potencijalni problem kad god se određuje uzorak jako visoke
koncentracije
interferencija lažno povišeni ili sniženi rezultati kod uzoraka pacijenata koji
heterofilnih antitela sadrže anti-IgG antitela sposobna da reaguju sa antitelima koja
ili se koriste u određivanju; kod pacijenata koji koriste mišja
humanih anti-mišjih monoklonska At za terapeutske svrhe ili imaging procedure;
antitela
tit l (HAMA) mogu se otkriti
tk iti ponovnim
i određivanjem
d đi j uzorka
k posle
l tretmana
t t
sa blokirajućim agensom (imobilizovan na epruvetama),
dodatkom ne-imuno mišjeg seruma reakcionoj smeši, ili
ponovnim određivanjem uzorka drugom metodom;
60/134
30
10/26/2016
Zahtevi unutrašnje kontrole kvaliteta
procena reproducibilnosti poželjna varijabilnost unutar određivanja <5%, a između
određivanja <10%; kriterijumi za željenu preciznost
određivanja
j mogug se zasnivati na biološkojj varijaciji;
j j
ustanovljeni kriterijum za izbor odgovarajućeg kriterijuma za prihvatljivost IQC

prihvatanje određivanja
kontrolni uzorci treba da nije poželjno oslanjati se isključivo na kontrolni materijal dat
odražavaju serum u sklopu testa; koristiti i kontrolu sa autentičnim serumskim
pacijenta matriksom iz nezavisnog izvora,
koncentracije u negativna i niska pozitivna kontrola treba da se koristi za

kontrolnom sve tumorske markere, ali takođe postoji potreba i za širim
uzorku treba da koncentracionim opsegom, kao i za procenu tačnosti
odgovaraju dilucionih etapa kod uzorka sa visokim koncentracijama;
kliničkoj primeni
procena interferencija povremena provera mogućih interferencija (npr. od
u toku određivanja heterofilnih i dr. antitela, od aditiva u vakutajnerima i dr.)
61/134
Zahtevi spoljašnje kontrole kvaliteta
EQA uzorak sa koncentracije koje pokrivaju radni opseg određivanja;

odgovarajućom povremeno uključiti više koncentracije da bi se proverilo
koncentracijom ponašanje pri razblaživanju uzorka; za npr. npr AFP i hCG
analita koristiti i normalni serum radi provere bazalnih vrednosti;
procena „stabilnosti“ ponovljenim merenjem uzoraka istog pool-a i poređenjem
određivanja rezultata tokom vremena (npr. 6–12 meseci);
utvrđivanje tačnosti i koriste se konsenzus srednje vrednosti (ne postoje

stabilnosti referentne metode) koje se dokazuju procenom njihove:
ciljnih vrednosti 1. stabilnosti (ponovljenom distribucijom istog pool-a)
2. tačnosti (recovery testom), koristi se “pool” sa poznatom
količinom internacionalnog standarda (za AFP,
AFP hCG,
hCG CEA i
PSA su BS 72/225, IS 75/537, IRP 63/601 i IS 96/670).
interpretaciona praksa omogućava poređenje rezultata iz različitih laboratorija
62/134
31
10/26/2016
REFERENTNI INTERVAL
p j j
svaki pacijent sa tumorom ima svoj "bazni
nivo" za različite tumorske markere
vrednosti posle prve terapije se uzimaju kao
specifične referentne vrednosti koje će služiti
kao bazni nivo za naredno praćenje
63/134
REFERENTNI INTERVAL
gornja referentna granica kod zdravih osoba igra malu
ulogu
mnogo je značajnije da se prate promene kod svakog
pacijenta ponaosob jer one predstavljaju osetljiviji
dijagnostički kriterijum od poređenja individualne
vrednosti za svakog pacijenta sa gornjom
d ti k ij t j
referentnom granicom
64/134
32
10/26/2016
METASTATSKA OBOLJENJA
g p
maligna priroda različitih tumora se
praktično zasniva na njihovoj osobini da
metastaziraju
primer: karcinom kolona
65/134
ako je tumor lokalizovan u intestinalnom zidu,
očekivana dužina života posle operacije nije
skraćena
ako su zahvaćeni regionalni limfni čvorovi, samo

će za jednu trećinu pacijenata očekivana dužina
života odgovarati normalnoj
u slučaju udaljenih metastaza organa najviše 5

godina iznosi dužina preživljavanja
66/134
33
10/26/2016
 tendencija primarnih tumora ka
tendencija primarnih tumora ka
metastazama
 na razvoj metastatskog oboljenja utiču:
vrsta tkiva, lokalizacija organa i veličina
vrsta tkiva, lokalizacija organa i veličina
tumora
67/134
 karcinom prostate: rane metastaze na kostima
 karcinom ovarijuma: formiranje malignih ascita
 karcinom dojki: multiple metastaze (kosti, mozak, pluća)
 karcinom "malih ćelija"pluća: multiple metastaze
 karcinom
karcinom kolona, karcinom stomaka, karcinom pankreasa:
kolona karcinom stomaka karcinom pankreasa:
jetra je primarno mesto metastaza
 melanom: uglavnom u mozgu, jetri, plućima i ovarijumu
68/134
34
10/26/2016
Današnja primena tumorskih markera i

njena ograničenja
• Detekcija ili “skrining” kancera – ograničena (PSA)
• Potvrda ili dijagnoza (simptomatičnih pacijenata)
Potvrda ili dijagnoza pacijenata) – ograničena
• Evaluacija prognoze – ograničena
• Predviđanje terapeutskog odgovora – važno
• Klasifikacija (stadijum i veličina tumora) – ograničena
• Monitoring (praćenje efikasnosti terapije) – važno
• Detekcija ponovnog javljanja oboljenja – kontraverzno
• Lokakizacija tumora ograničena
Lokakizacija tumora –
69/134
INDIKACIJE
rano otkrivanje malignih tumora u grupi sa
visokim rizikom
• ffamilijarni rizik, simptomatski pacijenti sa visokom
ilij i i ik i t t ki ij ti i k
prevalencijom pojave tumora
• AFP kod pacijenata sa cirozom jetre
• AFP i hCG kod "germ cell" tumora (seminom)
• PSA kod muškaraca starijih od 50. godina sa
adenomom prostate
adenomom prostate
• kalcitonin u slučaju medularnog karcinoma štitaste
žlezde
70/134
35
10/26/2016
INDIKACIJE
za postavljanje primarne dijagnoze
• retko se koristi; klinički nalaz, endoskopski postupci,
e o se o s ; č a a , e dos ops pos upc ,
intraoperativni nalaz
• korelacija nekih markera sa veličinom tumora
CEA i kolorektalni karcinom
CA 125 i karcinom ovarijuma
CA 125 ik i ij
CYFRA 21‐1 i karcinom pluća
71/134
PREOPERATIVNO ODREĐIVANJE
• ukoliko
ukoliko je vrednost nekog TM pri postavljanju
je vrednost nekog TM pri postavljanju
primarne dijagnoze visoka to može da bude
relevantan marker za postoperativno praćenje
i ova vrednost će biti "bazna"
72/134
36
10/26/2016
ukoliko određivanje TM ima prediktivnu vrednost u
prognozi izvesnih tumora:
prognozi izvesnih tumora:
• AFP i hCG kod "germ cell" tumora

• CEA i CA 19‐9 kod kolorektalnog karcinoma
• CYFRA 21‐1 kod karcinoma pluća
• CA 15‐3 i CEA kod karcinoma dojke
• CA 125 kod karcinoma ovarijuma
• 2‐mikroglobulin kod multiplog mijeloma
73/134
• ukoliko pad koncentracije TM može da posluži

posle završetka terapije za procenu odnosa
preostalog tumorskog tkiva prema nestalom
74/134
37
10/26/2016
INDIKACIJE
za prognozu
• visoke
visoke vrednosti TM idu sa uznapredovalim
vrednosti TM idu sa uznapredovalim
stadijumima bolesti i govore o lošoj prognozi
• normalne ili blago povišene vrednosti su znak da će
period za ponovnu pojavu tumora biti duži pa samim
time i produžen period preživljavanja
time i produžen period preživljavanja
75/134
INDIKACIJE
praćenje terapije
• postoperativni
postoperativni pad vrednosti preoperativno povišenih
pad vrednosti preoperativno povišenih
vrednosti TM je važan prognostički pokazatelj
• ako nema pada ili je on mali ukazuje na nekompletnu
resekciju ili prisustvo multiplih tumora
76/134
38
10/26/2016
INDIKACIJE
praćenje terapije
• ako nivo TM ne dostigne vrednosti kod zdravih posle

završetka terapije ukazuje na neefikasnu terapiju i
prisustvo rezidualnih tumora koje treba da se
lokalizuju "imaging" tehnikama
77/134
INDIKACIJE
praćenje terapije
• važno poznavanje biološkog poluživota različitih
TM za "timing" prvog određivanja posle
primenjene terapije
• URL za CEA iznosi 3 g/L, poluživot iznosi 3

dana, ako je preoperativna vrednost iznosila 100
g/L
/L treba
t b d da prođe
đ 20 ddana za prvo određivanje
d đi j
posle operacije
78/134
39
10/26/2016
INDIKACIJE
rano otkrivanje ponovnog javljanja tumora
posle hirurške resekcije tumora određivanje TM
predstavlja neinvazivnu formu praćenja pacijenata
ukoliko je vrednost TM dobro određena ona u oko 50%
slučajeva može da ukaže na promene u ponašanju
tumora 10 i više meseci pre drugih dijagnostičkih
p g j g
postupaka
79/134
INDIKACIJE
rano otkrivanje ponovnog javljanja tumora
praćenje toka terapije malignih tumora određivanjem
dva ili više TM
nisu pogodni za "screening"asimptomatskih osoba zbog
niske organ i tumor specifičnosti kao i niske +PV testa
80/134
40
10/26/2016
1. Chan DW, Booth RA. Tumor markers. U: Burtis CA,
Ashwood, Bruns D. Tietz textbook of clinical chemistry
and
d molecular
l l di
diagnostics.
ti 2006 745-797.
2006; 745 797 Elsevier
El i
Saunders, St. Louis, Missouri, USA
2. Majkić-Singh N. Biohemija tumora i tumorski markeri. U:
521-544. (ISBN 86-83023-09-5)
3. Ignjatović S. Tumorski markeri. (slajdovi sa predavanja,
pdf fajl)
4. Ignjatović S, Majkić-Singh N. Klinička korisnost i
ograničenja tumorskih markera. Acta Clinica 2010; 2: 98-
108.
81/134
41
10/26/2016
TUMORSKI MARKERI
II deo
P f dr
Prof. d Svetlana
S tl IIgnjatović
j t ić
1/134
DEFINICIJA TUMORSKIH MARKERA
supstance koje mogu da nastanu:
k d
direktnom sintezom tumorskih ćelija
ili
sintezom u netumorskim ćelijama (izazvanom
od strane tumorskih ćelija)
2/134
1
10/26/2016
KRATAK ISTORIJAT TUMORSKIH MARKERA
•1846. godina
g – Bence •1969
1969. – onkogeni
Jones protein •1975. – monoklonska antitela,
•1928. – sindrom ektopičnog ugljenohidratni antigeni
hormona CA 125, CA 15‐3, CA 549
•1930. – hCG •1980. – analiza onkogena
•1932. – ACTH •1985. – supresorski geni
•1949. – delecija antigena •2001. – genomika, proteomika,
krvnih grupa
krvnih grupa microarrays MS
microarrays, MS,
•1959. – izoenzimi neuronske mreže,
•1963. – AFP multiparametarska analiza
•1965. – CEA
3/134
PODELA TUMORSKIH MARKERA
HUMORALNI (CIRKULIŠUĆI)
detektuju se u krvi ili u nekoj drugoj telesnoj
tečnosti
CELULARNI
detektuju se u ili na ćeliji
4/134
2
10/26/2016
TUMORSKI MARKERI
• Enzimi
• Hormoni
• Onkofetalni antigeni
• Citokeratini
• Ugljenohidratni molekuli (mucini i
antegini krvnih grupa)
• Proteini
• Receptori i ostali markeri
Receptori i ostali markeri
• Genetski markeri
• Raznovrsni markeri
5/134
ENZIMI KAO TUMORSKI MARKERI
- Alkohol dehidrogenaza - Laktat dehidrogenaza

- Aldolaza - Leucinaminopeptidaza
p p
- Alkalna fosfataza - Neuron specifična enolaza (NSE)
- Alkalna fosfataza-placentalna (PLAP) - 5`-Nukleotidaza
- Amilaza - Prostatična kisela fosfataza (PAP)
- Aril sulfataza B - PSA
- Kratin kinaza BB - Piruvat kinaza
- Esteraza - Ribonukleaza
- Galktozil trasferaza -Salicil
Salicil transferaza
- Gamaglutamil trasferaza - Terminalna deoksitransferaza
- Heksokinaza -Timidin kinaza
6/134
3
10/26/2016
Prostata‐specifični antigen (PSA)
• serin proteaza familije kalikreina
serin proteaza familije kalikreina
• isključivo potiče iz epitelijelnih ćelija prostate
• organ specifičan, ali ne i tumor specifičan tumorski
marker (prostatitis, benigna hiperplazija)
• jjedini TM za “skrining”
g
7/134
Molekularne forme PSA
komplekse sa 1‐antihimotripisinom (ACT‐PSA)

• stvara komplekse sa (ACT‐PSA)
ili sa 2‐makroglobulinom (AMG‐PSA) i nalazi se u
slobodnoj formi (fPSA)
• većina imunoodređivanja mere fPSA i ACT‐PSA,
ali ne AMG‐PSA
8/134
4
10/26/2016
Odnos slobodnog i vezanog PSA
kod karcinoma prostate: viša koncentracija ACT‐PSA
kod benigne hiperplazije prostate (BPH): viša koncentracija fPSA
Istovremeno određivanje fPSA i ukupnog PSA poboljšava
specičnost; izražava se kao %fPSA
• > 25% fPSA, mogućnost tumora prostate je < 10%
• < 10% fPSA, mogućnost tumora prostate je >50%
10% fPSA ć tt t t j 50%
9/134
Klinička primena PSA
• rano otkrivanje tumora, praćenje stadijuma razvoja tumora i
praćenju terapije
• određivanje PSA kod muškaraca starijih od 50 godina, jednom
određivanje PSA kod muškaraca starijih od 50 godina jednom
godišnje
• gornja granica je 4 mg/L (danas se preporučuje i 2,5 mg/L)
• siva dijagnostička zona 4 – 10 mg/L zahteva povećanje
dijagnostičke osjetljivosti i specifičnosti:
– referentni intervali prema godinama
– PSA density (podeliti koncentraciju PSA sa zapreminom prostate
određenom transrektalnim UZ))
– PSA velocity (brzina povećanja PSA u funkciji vremena)
10/134
5
10/26/2016
HORMONI KAO TUMORSKI MARKERI
- ACTH - hCG
- Antiduretični hormon - Humani placentalni laktogen
- Bombesin - Neurofizini
- Kalcitonin - PTH
- Gastrin - Prolaktin
- Hormon rasta - Vazoaktivni intestinalni peptid
11/134
hCG
• glikoprotein
glikoprotein koga sekretuju ćelije trofoblasta
koga sekretuju ćelije trofoblasta placente
–  subjedinica je ista kao kod LH, FSH, TSH
–  subjedinica je specifična za hCG
• može da se određuje intaktna subjedinica (ELISA) ili
obe
– kod pacijenata sa karcinomom prisutne su obe
subjedinice (intaktna hCG i  subjedinica)
12/134
6
10/26/2016
Primena hCG
• Trudnoća
• Povišen kod gotovo svih trofoblastičnih tumora
• Povišen kod 70% of neseminomatoznih testikularnih
tumora
13/134
ONKOFETALNI ANTIGENI KAO TUMORSKI
MARKERI
- AFP
- β-Onkofetalni
β O k f t l i antigen
ti
- Karcinofetalni feritin
- CEA
- Pankreasni onkofetalni
- Skvamozni ćelijski antigen
- Tenesi
T i antigen
ti
- Tkivni polipeptidni antigen
14/134
7
10/26/2016
Alfa‐fetoprotein
• glavni fetalni protein (glikoprotein)

protein (glikoprotein)
– sintetiše su u fetalnoj jetri, GI traktu, bubrezima
– strukturno odgovara albuminu
• marker defekta neuralne cevi
• umereno povišen kod oboljenja jetre (hepatitis/ciroza)
• kod hepatocelularnog karcinoma
kod hepatocelularnog karcinoma
koncentracija > 1000 g/L
15/134
Karcinoembrioni antigen (CEA)
• Familija od 36 glikoproteina
• Povišen kod . . .
– 70% of kolorektalnih karcinoma
– 45% of karcinoma pluća
– 50% of karcinoma želuca
– 40% of karcinoma
40% of karcinoma dojki
– 55% of karcinoma pankreasa
– 25% of karcinoma ovarijuma
– 40% of karcinoma bešike
16/134
8
10/26/2016
Karcinoembrioni antigen (CEA)

• glikoprotein (45 – 55% ugljenih hidrata; 150 – 300 kDa)
• za vreme embrionalnog razvoja sintetiše se uglavnom u gastrointestinalnom
traktu i pankreasu kao ćelijski površinski antigen
• kao adhezioni molekul uključen u procese širenja i metastaziranja tumora
• kod odraslih sinteza ne prestaje u potpunosti
• 2,5 mg/L (imunološke metode)
• 2,5 – 10 mg/L (pušači i benigne bolesti)
• 10 – 20 mg/L (maligni procesi)
• više od 20 mg/L (metastaze)
• porast sinteze u primarnim karcinomima kolona, rektuma, jednjaka,
želuca, bronha, jetre, dojke, ovarija
• ne koristi
k i ti se u ““screening”
i ” programimai jjer se porastt jjavlja
lj i u “benignim”
“b i i ”
bolestima: hepatitis, kolitis, gastrointestinalne infekcije
17/134
Primena CEA
• povišen u nemalignim stanjima:
povišen u nemalignim stanjima:
– ciroza, emfizem, rektalni polipi, benigna
oboljenja dojki, ulcerativni kolitis
• najvažnija primena pri evaluaciji stadijuma i
j j p p j j
praćenju ponovnog javljanja bolesti
18/134
9
10/26/2016
CITOKERATINI KAO TUMORSKI MARKERI
- Tkivni polipeptidni antigen (TPA)

- Tkivni
Tki i polipetidni
li tid i specifični
ifič i antigen
ti (TPS)
- Citokeratin 19 fragmenti (CIFRA 21-1)
19/134
Ugljenohidratni antigeni
• glikoproteini koji su antigeni na površini tumorske
ćelije ili ih sekretuju tumorske ćelije (površinski ili
ćelije ili ih sekretuju tumorske ćelije (površinski ili
ekskretorni)
• mucini visoke molekulske mase (mukopolisaharidni
proteini) ili antigeni krvnih grupa
20/134
10
10/26/2016
UGLJENOHIDRATNI TUMORSKI MARKERI
MUCINI ANTIGENI KRVNIH GRUPA
- CA 125 - CA 19-9
- Episialini - CA 19-5
# CA 15-3 - CA 50
# CA 549 - CA 72-4
# CA 27.29
27 29 - CA 242
- MCA
- DU-PAN-2
21/134
Specifičnost episialinih markera
osetljivost specifičnost
pankreas, pluća, ovarijumi,

CA 15-3 69% kolorektalni, jetra
CA 549 77% ovarijumi, prostata, pluća
CA 27.29 58% 98% (za praćenje ponovne pojave)
22/134
11
10/26/2016
CA 125
• glikoprotein visoke molekulske mase koji se prepoznaje
od strane
d t mAb OC125
Ab OC125
– izolovan iz karcinoma ovarijuma
• povišen kod 50% pacijena sa karcinomom ovarijuma u
stadijumu I, odnosno 90% u II, III i IV stadijumu
• osetljivost 95%; specifičnost 82%; PPV 78%; NPV 91%
23/134
Ugljohidratni antigeni
osetljivost 80% za karcinom pankreasa; 30% za
CA 19-9 kolorektalni karcinom
CA 19-5 GI, pankreas, karcinom ovarijuma
osetljivost 90% za karcinom pankreasa; takođe

CA 50 povišen kod karcinoma ezofagusa, jetre, želuca
osetljivost 40% u GI kanceru, 40% karcinom pluća,

CA 72
72-4
4 36% karcinom
k i ovarijuma
ij
osetljivost 75% za karcinom pankreasa, 70% za

CA 242 kolorektalni karcinom, 44% karcinom želuca
24/134
12
10/26/2016
PROTEINI KAO TUMORSKI MARKERI
- β2-Mikroglobulin
- C-peptid
C tid
- Feritin
- Imunoglobulin
- Antigen udružen sa melanomom
- Antigen udružen sa pankreasom
- Specifični
S ifič i protein
t i 1 ttrudnoće
d ć
- Prekursor protrombina
- Tripsin inhibitor udružen sa trudnoćom
25/134
RECEPTORI I OSTALI TUMORSKI
MARKERI
- Estrogen i progesteron receptori

- Metaboliti kateholamina
- Sijalinska kiselina udružena sa lipidima
- Poliamini
26/134
13
10/26/2016
GENETSKI MARKERI
ONKOGENI TUMOR SUPRESOR GENI
- VHL mutacija
- N-ras mutacija
j
- K-ras mutacija - APC mutacija
- c-myc translokacija - p16 (cdkn2) mutacija

- c-erb B-2 (HER-2) - WT1 mutacija
amplifikacija
- gubitak heterozigosti
- c-abl/bcr translokacija
- BRCA2, RB1
j
- c-abl/bcr translokacija
- N-myc amplifikacija - RB1 mutacija
- bcl-2 - P16 E-kaderin mutacija
- BRCA1 mutacija
- p53 mutacija
- DCC mutacija
27/134
- NF2 mutacija
Onkogeni
N-ras AML, neuroblastomi
K-ras leukemija, limfomi
B, T-ćelijski limfomi, karcinom malih

c-myc
ćelija pluća
HER-2/neu
HER 2/neu dojka, ovarijumi, GI karcinomi
bcl-2 leukemija, limfomi
28/134
14
10/26/2016
RAZNOVRSNI TUMORSKI MARKERI
- Markeri angigeneze
- Ćelije bez nukleinskih kiselina
- Cirkulišuće ćelije kancera
29/134
TM koji se primenjuju:
PSA
• prostata
t t
• povišen u benignoj hipertrofiji prostate,
prostatitisu i sa godinama
• “skrining” i pomaže u dijagnozi, praćenje
tretmana određivanje ponovnog javljanja
tretmana, određivanje ponovnog javljanja
30/134
15
10/26/2016
AFP
• jetra, “germ cell” karcinom ovarijuma ili testisa
• povišen i u trudnoći
iš i d ći
• pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog
javljanja
CA 15‐3
• dojka; drugi karcinomi koji uključuju pluća, ovarijume
• povišen kod benignih promena u dojci
• može da se koriste CA 15‐3 ili CA 27.29 (dva različita određivanja
za isti marker
• gradiranje bolesti, praćenje tretmana, određivanje ponovnog
javljanja
31/134
CA 19‐9
• pankrasni; ponekad kolorektalni ili žučnih puteva
• povišen i u pankreatitisu ili inflamatornim
iš i k i i ili i fl i zapaljenjima creva
lj ji
• gradiranje bolesti, praćenje tretmana, određivanje ponovnog
javljanja
CA 125
• ovarijumi
• povišen i u endometriozi, nekim drugim oboljenjima i ne
preporučuje se za generalni “skrining”
• pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje ponovnog
javljanja
32/134
16
10/26/2016
CEA
• kolorektalni, pluća, dojka, tiroidni, pankreasni, jetreni,
cerviks, bešika
• povišen u hepatitisu, COPD, kolitisu, pankreatitisu i
kod pušača
• praćenje tretmana, određivanje ponovnog javljanja
Estrogen receptori
• dojka
• povišen kod hormon zavisnih karcinoma
• prognoza i vođenje terapije
33/134
hCG
• testikularni i trofoblastični
• povišen u trudnoći, testukularnim poremećajima
• pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje
ponovnog javljanja
Her‐2/neu
• dojka
• Onkogen koji je prisutan u multiplim kopijama kod 20‐
30% invanzivnih karcinoma dojke
34/134
17
10/26/2016
Monoklonski imunoglobulini
• multipli mijelom i Waldenstromova
makroglobulinemija
• veliko stvaranje imunoglobulina ili antitela koje se
detektuje elektroforezom proteina
• pomaže u dijagnozi, praćenje tretmana, određivanje
ponovnog javljanja
Progesteron receptorii
• dojka
• povišen kod hormon zavisnih karcinoma
35/134
TM koji se manje primenjuju:
B2M (beta 2 mikroglobulin)

• multipli
lti li mijelom
ij l i lilimfomi
f i
BTA (bladder tumor antigen)
• bešika
CA 72-4
• ovarijumi
Kalcitonin
• medularni tiroidni karcinom
36/134
18
10/26/2016
NSE
• neuroblastom,
neuroblastom karcinom malih ćelija pluća
NMP22
• bešika
PSMA (prostate specific membrane antigen)
• p
prostata
PAP (prostatic acid phosphatase)
• metastatski karcinomi prostate, mijelomi,
karcinom pluća
37/134
S-100
• metastatski
t t t ki melanom
l
TA-90
• metastatski melanom
Tiroglobulin
• tiroidni
38/134
19
10/26/2016
Kancer pluća
• najčešći oblik karcinoma (prema incidenciji:1,2 milion
novootkrivenih u svetu; prema smrtnosti: 1 1 milion
novootkrivenih u svetu; prema smrtnosti: 1,1 milion
umrlih u svetu)
• dva glavna histološka tipa:
‐ nemikrocelularni (nesitnoćelijski, NSCLC)
‐ mikrocelularni (sitnoćelijski, SCLC)
• NSCLC‐ obuhvata nekoliko podtipova, uglavnom
k i
karcinome skvamoznih ćelija, adenokarcinome i
k ih ć lij d k i i
karcinome velikih ćelija
• SCLC ‐ često podrazumeva neuroendokrini sastav
39/134
Kancer dojki
• najčešći karcinom kod žena u USA (kod 7% žena do 70‐

te godine života)
• ekspresija episialina od strane ćelija dojki
• CA (cancer antigen)
CA (cancer antigen)
• CA 15‐3, CA 549 i CA 27.29 su tri odvojena epitopa na

episialinu
40/134
20
10/26/2016
Karcinom ovarijuma
41/134
Dijagnostika karcinoma ovarijuma
•Anamneza (opšta, ginekološka, porodična)
•Klinički pregled (opšte stanje pacijentkinje kao i i ginekološki
pregled)
•Dodatne analize: određivanje tumorskih markera (CA125, HE4 i
ROMA algoritma), vaginalni ultrazvučni pregled (UZ), po potrebi i
abdomena, skener (CT) i magnetna rezonanca (MRI) abdomena,
laparoskopija i rentgen pluća
•Citomorfološki pregled (ascita ili peritoneanog ispirka) i
hitopatološki pregled
42/134
21
10/26/2016
CA 125 u različitim stadijumima kancera ovarijuma
43/134
Humani epididimis protein 4 (HE4)
• glikoprotein koji je prvobitno otkriven u epitelnim ćelijama distalnog epididimisa
• kasnije je pronađen i u drugim normalnim epitelnim tkivima (respiratornim i
kasnije je pronađen i u drugim normalnim epitelnim tkivima (respiratornim i
reproduktivnim) kao i u maligno promenjenom tkivu ovarijuma
• detektuje se u normalnom tkivu jajnika, ali se prekomerno sekretuje kod karcinoma
ovarijuma, posebno u seroznim ili endometrioidnim histološkim podtipovima
• pokazuje visoku osetljivost i specifičnost za detekciju karcinoma ovarijuma i to
naročito u početnoj fazi bolesti
• osetljivost HE4 slična sa osetljivošću CA125, ali njihovo istovremeno određivanje
bolje dijagnostički razdvaja maligna stanja od benignih ili zapaljenskih ginekoloških
oboljenja
b lj j
44/134
22
10/26/2016
Humani epididimis protein 4 (HE4)
• NIJE SPECIFIČAN ZA TUMORE OVARIJUMA
• 79% ŽENA SA KANCEROM OVARIJUMA IMA POVIŠENE VREDNOSTI
79% ŽENA SA KANCEROM OVARIJUMA IMA POVIŠENE VREDNOSTI
• POVIŠEN U DRUGIM KANCERIMA: DOJKA (13%), ENDOMETRIJUM (26%), GIT
(16%), PLUĆA (42%), BENIGNA GINEKOLOŠKA OBOLJENJA (7%) I DRUGA
BENIGNA OBOLJENJA (24%)
• FDA ODOBRENJE ZA PRAĆENJE REKURENCIJE ILI PROGRESIJE OBOLJENJA
KOD PACIJENTKINJA SA EPITELIJELNIM KANCEROM OVARIJUMA
45/134
Algoritam za malignitet ovarijuma ili ROMA algoritamTM
(engleski naziv: Risk of Ovarian Malignancy Algorithm)
ili Risk of Malignancy Index
• kvalitativan test u serumu koji kombinuje rezultate određivanja koncentracija CA125 i HE4, kao i
status menopauze u numerički skor
• koristi se kao pomoć u proceni rizika epitelijalnog karcinoma ovarijuma kod pacijenata sa
pelvičnom masom
• koriste se logističke regresione jednačine za žene u premenopauzi i menopauzi
• ROMATM predstavlja zaštićen naziv ukoliko se koncentracije HE4 I CA125 određuju na Architect i
sistemu firme Abbott
• kao pomoćno dijagnostičko sredstvo u ranim stadijumima bolesti kada su serumske koncentracije
CA125 niske, kao i u slučajevima visokih koncentracija CA125 u benignim ginekološkim stanjima
• Za izračunavanje ROMA vrednosti prvo se izračuna prediktivni indeks (PI) (posebno za žene pre
menopauze a posebno za žene u menopauzi) i u jednačinu za njegovo izračunavanje ulaze
b ž i) i j d či j i č j l
vrednosti CA125 i HE4 koje su izmerene na aparatu
46/134
23
10/26/2016
Prediktivni indeks (PI) i ROMA vrednosti
Izračunavanje ROMA vrednosti
Jednačine za izračunavanje (Cobase e411 sistem firme Roche)
Žene u reproduktivnom periodu (premenopauza)
PI =‐12.0 + 2.38*LN[HE4] + 0.0626*LN[CA125]
Žene u menopauzi
PI =‐8.09 + 1.04*LN[HE4] + 0.732*LN[CA125]
ROMA vrednosti
ROMA (%) = exp(PI) / [1 + exp(PI)] * 100
47/134
Cut‐off vrednosti za ROMA vrednosti kod žena u različitom reproduktivnom dobu
(Elecsys, Roche)
• Žene u reproduktivnom periodu (premenopauza)
– ROMA
ROMA vrednost
vrednost ≥ 11,4%
≥ 11 4% ‐ visok rizik za karcinom ovarijuma
visok rizik za karcinom ovarijuma
– ROMA vrednost < 11,4% ‐ nizak rizik za karcinom ovarijuma
• Žene u menopauzi
– ROMA vrednost ≥ 29,9% ‐ visok rizik za karcinom ovarijuma
– ROMA vrednost < 29,9% ‐ nizak rizik za karcinom ovarijuma
48/134
24
10/26/2016
Kancer prostate
kod muškaraca po učestalosti na drugom mestu
kod muškaraca po učestalosti na drugom mestu (19%),
(19%)
kao i po smrtnosti od kancera
pri koncentraciji od 4,0 g/L: osetljivost PSA iznosi 78%;
specifičnost 33%;
koncentracija PSA je u korelaciji sa kliničkim stadijumom
kancera
koristi se za praćenje terapije
49/134
Kolorektalni karcinom
(CRC)
• na trećem mestu po učestalosti pojavljivanja u svetu
• najznačajniji faktori rizika za
najznačajniji faktori rizika za CRC su: ishrana bogata životinjskim
ishrana bogata životinjskim
mastima i proteinima, gojaznost, pušenje i genetska predispozicija
• CEA pre operacije kod pacijenata sa novo dijagnostikovanim CRC
• CEA ne može da se koristi za “skrining” u asimptomatskoj
populaciji zbog nedostatka specifičnosti i osetljivosti i niske
prevalencije CRC
• za “skrining” se najčešće koristi test na okultno krvarenje (FOBT);
gvajak i imunohemijski test;
gvajak i imunohemijski test;
50/134
25
10/26/2016
Primarni hepatocelularni karcinom (HCC)
• jjedan od najučestalijih karcinoma i često mu prethode hronični
j j p
virusni hepatitis B ili C ili alkoholno oboljenje jetre
• ako lečenje počne dovoljno rano, rizik od razvoja HCC je smanjen ili
ga nema
• kod pacijenata koji su već razvili HCC, resekcija ili transplantacija
zahteva ranu lokalnu detekciju malih malignih područja
• određivanje koncentracije AFP zajedno s ostalim imaging
tehnikama ima dobro utvrđenu kliničku korisnost
• razvoj molekularne genetike i proteomike može dovesti do
poboljšane rane detekcije i tretmana bolesnika s HCC
51/134
Kancer pankreasa
• kod
kod muškaraca na četvrtom mestu kao uzrok smrti od kancera (kod
muškaraca na četvrtom mestu kao uzrok smrti od kancera (kod
žena na petom)
– porast incidencije u svetu
– 2:1 češće kod muškaraca
• retka rana dijagnoza
– bol u epigastrijumu i značajan gubitak u težini su najčešći znaci
• preživljavanje: 1 godina <10%; 5 godina 2%
52/134
26
10/26/2016
Gestacioni trofoblastični tumor
• redak karcinom (kod žena)
redak karcinom (kod žena)
• maligne ćelije rastu u tkivo koje se stvara odmah po oplođenju
• rast tumora počinje u unutrašnjosti uterusa
• javlja se kod žena koje godinama pokušavaju da zatrudne
• dva tipa: hidatidiformne mole i horiokarcinom
53/134
NACB: PRAKTIČNE SMERNICE I PREPORUKE ZA UPOTREBU
TUMORSKIH MARKERA U KLINIČKOJ PRAKSI
preporuke:
• svi trenutno dostupni
i d i
• opšti zahtevi za kvalitet markeri kancera
• praktična upotreba tumorskih • faze razvoja svakog
tumorskog markera
markera kod različitih kancera • snaga dokaza (engl. level of
evidence, LOE)
National Academy of Clinical Biochemistry, NACB
54/134
27
10/26/2016
Nivo dokaza za klasifikaciju kliničke korisnosti
tumorskih markera
Nivo Tip dokaza
I D k iz
Dokaz i pojedinačnog
j di č j k “moćnog”
jako “ ć ” prospektivnog
kti i iti
ispitivanja
j koje
k j je
j specifično
ifič
dizajnirano kako bi se ispitao marker ili dokaz iz meta analize i/ili pregleda nivoa II
ili nivoa III ispitivanja
II Dokaz iz ispitivanja u kome su podaci o markeru određeni u odnosu na
prospektivno terapeutsko ispitivanje koje je izvedeno kako bi se testirala
terapeutska hipoteza ali nije specifično dizajnirano da bi se testirala korisnost
markera (tj. ispitivanje markera je sekundarni cilj protokola).
III Dokaz iz velikog ali retrospektivnog ispitivanja u kome su promenljivi broj
uzoraka bili na raspolaganju
p g j ili su selektovani.
IV Dokaz iz malog retrospektivnog ispitivanja koje nema prospektivno diktiranu
terapiju, praćenje, odabiranje uzoraka ili statističku analizu.
V Dokaz iz malog “pilot” ispitivanja koje je dizajnirano da odredi ili proceni
distribuciju nivoa markera u ispitivanoj populaciji.
55/134
Vodiči o tumorskim markerima
– preporučuju se samo markeri na osnovu čijih
č j k i čijih
rezultata može da se promeni klinička odluka
– zasnovanost na dokazima
“Tumor Marker Utility Grading Scale” (TMUGS)
Hayes, et al‚. J Nat Cancer Institute 1996; 88:1456‐66.
56/134
28
10/26/2016
TMUGS
• uključuje semikvantitativnu klasifikacionu
skalu sa šest tačaka (0 – 3+)
• 3+ ukazuje da taj marker može da se primeni
nezavisno pri donošenju kliničkih odluka (kao
što je βHCG kod horiokarcinoma)
57/134
TMUGS
0 nema korisnost
NA nije ispitivan
nije ispitivan
+/‐ preliminarni podaci ukazuju da primena markera
može da doprinese povoljnom kliničkom ishodu
+ marker kolerira sa biološkim procesom i/ili sa
krajnjim ishodom; još uvek u statusu istraživanja
++ koristi za datu kliničku primenu i može da se razmatra
koristi za datu kliničku primenu i može da se razmatra
u standardnoj praksi u izabranim situacijama
+++ marker može da se koristi kao jedini kriterijum pri
donošenju odluke za datu primenu
58/134
29
10/26/2016
Najbolji dizajn:
Prospektivno, “slepo” poređenje tumorskog markera i referentnog
standarda u uzastopnoj (ili slučajno selektovanoj) seriji pacijenata
iz relevantne kliničke populacije za koju se sumnja da ima
oboljenje
+ SP
HISTOPATOLOGIJA/
+ PRAĆENJE _
Uzastopna serija LP
pacijenata za koje se
sumnja da imaju
sumnja da imaju PSA Zlatni standard
Zlatni standard
malignitet prostate
_ + LN
HISTOPATOLOGIJA/
PRAĆENJE _
SN
59/134
TMUGS PLUS
uključuje relativnu snagu
PROGNOSTIČKOG ili PREDIKTIVNOG
markera
Hayes DF, Trock B, Harris AL.
Assessing the clinical impact of prognostic factors: when is ‘‘statistically
significant’’ clinically useful? Breast Cancer Res Treat 1998;52:305–19.
60/134
30
10/26/2016
PROGNOSTIČKI MARKER
• reflektuje osnovu biologije tumora
• govori o verovatnoći da karcinom
proliferira, napada i širi se
61/134
PREDIKTIVNI MARKER
• ukazuju na relativnu osetljivost ili na
rezistenciju na specifičan tretman ili
intervenciju
62/134
31
10/26/2016
1. Chan DW, Booth RA. Tumor markers. U: Burtis CA,
Ashwood, Bruns D. Tietz textbook of clinical chemistry
and
d molecular
l l di
diagnostics.
ti 2006 745-797.
2006; 745 797 Elsevier
El i
Saunders, St. Louis, Missouri, USA
2. Majkić-Singh N. Biohemija tumora i tumorski markeri. U:
521-544. (ISBN 86-83023-09-5)
3. Ignjatović S. Tumorski markeri. (slajdovi sa predavanja,
pdf fajl)
4. Ignjatović S, Majkić-Singh N. Klinička korisnost i
ograničenja tumorskih markera. Acta Clinica 2010; 2: 98-
108.
63/134
32
KOŠTANI MARKERI
1/77
Uvod
• razvoj koštanog sastava od 8. nedelje
embrionog razvoja,
razvoja prelaz u fetalni razvoj
• membransko (mezenhimne ćelije se
direkno diferenciraju u osteoblaste)
i
• enkondralno okoštavanje (mezenhim se
diferencira u hijalinu hrskavicu u kojoj se
pojavljuju centri okoštavanja iz kojih
nastaje kost)
2/77
1
Uvod
206 kostiju kod odraslih
300 kod dece
70% minerala
22% proteina
8% vode
Gubitak koštane mase od 30-te godine

(pik 30-36)
Kompletno remodelovanje na 10 godina
3/77
Uvod
• Koštana masa koja se dostigne u mladosti je odlučujuća
za p
preostatak u zrelom dobu i starosti
• Faktori koji utiču na prirodan gubitak, na trenutak kada
otpočinje sa gubitkom koštane mase:
– Ishrana
– Način života
– Genetika
– Mehanički faktori
– Ostale osnovne bolesti
– Lekovi
– Itd.
4/77
2
KOMPAKTNA ili KORTIKALNA KOST
TRABEKULARNA KOST
5/77
ĆELIJSKA STRUKTURA
• Osteoblasti – odgovorne za stvaranje
kolagena tip I i ostalih nekolagenskih
proteina
• Obložne ćelije – osteoblasti u stanju
mirovanja
• Osteociti – zreli osteoblasti
• Osteoklasti – razgradnja mineralizovanog
koštanog tkiva lučenjem kiselina,
kolagenaza i drugih proteilitičkih enzima
6/77
3
MOLEKULARNA STRUKTURA
• Organski matriks, 40% (95% kolagen tip I,
5% proteoglikani,
t lik i proteini
t i i matriksa
t ik
nekolagenskog tipa, citokini)
• Neorganski deo, 60% (kalcijum i fosfat kao

hidroksiapatit nekristaloidni kalcijum
hidroksiapatit,
fosfat, osteociti u šupljinama k. matriksa)
7/77
Struktura zrelog kolagena tip I
8/77
4
Modelovanje i remodelovanje
• ''Modelovanje'' kosti s rastom kosti odvija se do
odraslog doba
doba, dok se ''remodelovanje''
remodelovanje
nastavlja tokom života i u ravnoteži je između
resorpcije i formiranja
• Ova ravnoteža se postiže i reguliše dejstvom
različitih sistemskih hormona (npr. PTH,
stereoidni hormoni , vitamin D) i lokalnih
medijatora (citokina, hormona rasta)
9/77
Modelovanje i remodelovanje
• Osteoblasti iznova stvaraju takozvane
nove kosti,
k ti alili svaki
ki putt se stvara
t nešto
št
slabija kost, odnosno količina koštane
mase je posle svakog remodelovanja
nešto manja
• tokom sazrevanja i starenja skeletna masa
postaje sve manja
10/77
5
Ciklus remodelovanja kosti
11/77
Najčešće metaboličke koštane

bolesti
• Primarni hiperparatiroidizam
• Rahitis i osteomalacija
• Paget-ovo oboljenje
• Fibrozna displazija
• Ostegenesis imperfecta (bolest krhkih k.)
• Osteoporoza
• B b ž osteodistrofija
Bubrežna t di t fij (k (kod
dhhronične
ič b bubrežne
b ž
insuficijencije)- stari naziv
• Chronic Kidney Disease-Mineral Bone Disorder
(CKD-MBD)
12/77
6
Značaj biohemijskih markera kod
koštanih bolesti
• Evaluacija etiologije metaboličkih k. bolesti

• Prepoznavanje faktora koji mogu
negativno da utiču na k. metabolizam
• Praćenje efikasnosti lečenja (markeri
razgradnje posle 11-22 nedelje; markeri
izgradnje tek posle nekoliko meseci)
13/77
Značaj biohemijskih markera kod

koštanih bolesti
• Važni, ali nisu dovoljno specifični za
dijagnozu metaboličke k. bolesti !

• U rutinskoj
ti k j dij
dijagnostici
ti i se kkoristi
i ti ttzv.
triplet metoda
14/77
7
RUTINSKA DIJAGNOSTIKA
(triplet metoda)
• ODREĐIVANJE MINERALNE GUSTINE

KOSTI
• RADIOLOŠKI PREGLED SKELETA
• BIOHEMIJSKI MARKERI
REMODELOVANJA KOSTIJU
15/77
BIOHEMIJSKI MARKERI
REMODELOVANJA KOSTIJU
1. markeri neorganskog matriksa kosti (Ca, P)

2. enzimi vezani za aktivnost osteoblasta
(markeri izgradnje) i osteoklasta (markeri
razgradnje)
3. biomolekuli i degradacioni proizvodi
organskog matriksa kosti koji se otpuštaju
za vreme izgradnje ili razgradnje kostiju
16/77
8
MARKERI KOŠTANE IZGRADNJE
• Osteokalcin
• PICP (C‐terminalni peptid prokolagena)
• PINP (N‐terminalni peptid prokolagena)
• AP
• AP‐koštani izoenzim
17/77
OSTEOKALCIN (OC)
• koštani GLA protein (prema postranslacionom vezivanju

-karboksiglutamata; engl. glutamic acid, GLA)
• nekolagenski peptid male MM (5,8 kDa; sadrži 49 ak)
• sintetišu ga osteoblasti u fazi mineralizacije k. matriksa
(vezuje Ca u ovoj fazi)
• njegovu ekspresiju kontroliše 1,25-dihidroksivitamin D, a
sinteza zavisi od vitamina K
• najvećim delom se ugrađuje u k. matriks, a u manjem
delu dospeva u cirkulaciju gde podleže brzoj razgradnji i
eliminiše se urinom
18/77
9
OSTEOKALCIN (OC)
• osetljiv
j i specifičan
p marker stvaranja
j kosti
• specifični proizvod osteoblasta
• glavni nekolageni proizvod koštanog
matriksa
• visoka Ca-vezujuća
j svojstva
j
• glasnik za kalcitriol
• inhibitor leukocitne esteraze
19/77
OSTEOKALCIN (OC)
• podleže hidrolitičkom cepanju u jetri, bubrezima,
plazmi kao i u samim kostima
plazmi,
• intaktni 1 – 49 osteokalcin
• dva mesta cepanja “intaktne” molekule
• fragmenti u cirkulaciji 1-19, 20-43, 44-49, 1-43 i
20-49
• srednji 1 – 43 osteokalcin (N-MID
(N MID osteokalcin);
30%
• imunohemijske metode određivanja : RIA,
ELISA, IRMA, ECLIA)
20/77
10
OSTEOKALCIN (OC)
• Poluživot cirkulišućeg OC je oko 4-5

minuta
• OC i njegovi fragmenti se nakupljaju u
cirkulaciji kada je promenjena f-ja bubrega
• Cirkulišući OC pokazuje cirkardijalni ritam
(max noću i rano ujutru, min prepodne);
razlike su i do 50%
21/77
OSTEOKALCIN (OC)
• Kontraceptivi 24% ↓
• Značajno posle dužeg boravka u krevetu
• ↑ kod fizičke aktivnosti
• Analitičke i biološke varijacije
• ↑ kod dece u intenzivnom rastu od odraslih
• ↑ kod muškaraca nego kod žena
• ↑ kod
k d žžena za vreme menopauze
• Nezavistan pokazatelj preloma kuka u populaciji
starijih žena
22/77
11
OC - analitika
• Razlika u metodama (princip, izvor
antitela,
tit l specifičnost,
ifič t izvor
i kalibratora)
k lib t )
• GUBITAK IMUNOREAKTIVNOSTI POSLE
1 SATA STAJANJA NA SOBNOJ T.!
• Utiče hemoliza zbog oslobađanja proteaza
iz eritrocita
23/77
OC – povećane vrednosti
kod povećane razgradnje kostiju
• Hiperparatiroidizam
• Paget-ova bolest
• Značajna osteoporozno remodelovanje
• Hipertiroidizam
• Bubrežna osteodistrofija
• Frakture
• Akromegalija
24/77
12
PROPEPTIDI PROKOLAGENA TIPA I
PICP, PINP
• PICP - karboksi-terminalni
karboksi terminalni propeptid tipa I
prokolagena
• PINP - amino-terminalni propeptid tipa I
prokolagena
• kolagen tip I je glavni protein k. matriksa i
sintetiše se u obliku p
prokolagena
g ((50% duži
molekul od krajnjeg molekula
• prokolagen sprečava prevremenu agregaciju
molekula kolagena u ćeliji
25/77
PICP i PINP
• Specifične tkivne endopeptidaze cepaju sa
prokolagena tip I C- i N- propeptide pre
sazrevanja kolagenskih fibrila
• PICP je glikoprotein koji sadrži 2 (α1 I) od 246 ak

i jedan polipeptidni lanac (α2 I) od 247 ak sa
među- i unutarćelijskim disulfidnim vezama; uh
komponenta sadrži ostatke N-acetilglukozamina
i manoze
• PICP se metaboliše na endotelnim ć jetre,

poluživot 6-8 min (disfunkcija jetre !)
26/77
13
PICP- šta utiče na vrednosti?
• Genetski faktori
• Dnevni ritam sa amplitudom od 20% (više noću,
niže poslepodne)
• Relativno stabilan u uzorku (15 d na 4 °C, više
m na -20 °C)
• Nije ugrađen u matriks, ali se otpušta u
cirkulaciju
• Manje osetljiv i specifičan od B-ALP i OC zbog
relativne nespecifičnosti za kost i različitog
klirensa
27/77
AP – alkalna fosfataza
• najstariji marker koštane izgradnje

• nedovoljno specifičan i osetljiv
• povezan sa plazmatskom membranom
osteoblasta
• određuje se automatizovanim
kolorimetrijskim metodama
28/77
14
AP – alkalna fosfataza
• Ul
Uloga u stvaranju
t j osteoida
t id i mineralizaciji
i li iji
kostiju
• U serumu su najzastupljeniji koštani i
jetreni oblici AP i metode za razlikovanje i
merenje koriste razlike f-h svojstava
pojedinih
j di ih iizoenzima:
i t l t denaturacija,
toplotna d t ij
elektroforeza, precipitacija, selektivna
inhibicija, HPLC i imunohemijski postupci
29/77
Koštani izoenzim alkalne fosfataze

B-ALP
• B-ALP ima veću diskriminirajuću vrednost

od ukupne ALP (bolja razlika na gornjoj
granici referentnog intervala)
• vrlo specifičan i osjetljiv marker pojačanog
koštanog metabolizma
• vrlo pouzdan indeks efikasnosti
antiresorptivne terapije
30/77
15
MARKERI KOŠTANE RAZGRADNJE
• Poprečne veze kolagena (eng. Collagen

cross-links):
li k ) deoksipiridinolin
d k i i idi li (DPD) i
piridinolin (PYD)
• Telopeptidi kolagena tip I (CTX, NTX)
• Tartarat rezistentna kisela fosfataza (TR-
ACP TRAP)
ACP,
• Hidroksiprolin (OHP)
• Hidroksilizin-glikozidi (Hyl-Glyc)
31/77
DEOKSIPIRIDINOLIN (DPD) I
PIRIDINOLIN (PYD)
• Poprečne veze kolagena - intra- i
intermolekularne kovalentne veze) između
terminalnog neheliksnog dela jednog
molekula kolagena i heliksnog dela drugog
molekula kolagena u koštanom matriksu
stabilizuju molekul zrelog kolagena tip I
• DPD i PYD su dve neredukujuće poprečne
veze i poseduju prirodnu imunogenost i
fluoroscenciju
32/77
16
33/77
DEOKSIPIRIDINOLIN (DPD) I
PIRIDINOLIN (PYD)
• Kost je najvažniji izvor DPD i PYD
• Pri proteolitičkoj razgradnji kolagena dolazi

do otpuštanja obe vrste poprečnih veza
• Pošto imaju malu MM, izlučuju se urinom
• Izlučuju se kao slobodni (40%) i kao

peptidno vezani (60%) ak derivati
34/77
17
DPD I PYD- šta utiče na vrednosti?
• Cirkardijalni ritam (max 5-8 h, min 17-20 h)

• Menopauza
• Intraindividualna varijabilnost 20-30%
• DPD je specifičniji marker razgradnje jer
nastaje za vreme sazrevanja kolagena (ne
biosinteze pojavljuje se samo kao
biosinteze,
razgradni proizvod zrelog matriksa)
35/77
DPD I PYD- metode

• HPLC, fluorometrija, imunohemijske
metode
t d
• Uzorak: drugi jutarnji urin (između 8 i 10
sati)
• UV svetlost brzo razlaže (t1/2 < 30 sekundi)
obe poprečne veze
• Stabilni na -20 °C 10 do 20 godina
36/77
18
TELOPEPTIDI KOLAGENA TIPA I
CTX I NTX
• Razgradnjom kolagena tip I osteklastima
dolazi do otpuštanja N
N- i C
C-terminalnih
terminalnih
telopeptidnih fragmenata u cirkulaciju i
njihovog uklanjanja kroz bubrege
• Stvara se višak razgradnih telopeptidnih
proizvoda koji mogu ili ne moraju da budu
poprečno vezani,
vezani izmenjeni beta
beta-
izomerizacijom ili povezani za helikoidnu
kolagensku strukturu
37/77
38/77
19
C-TERMINALNI TELOPEPTID
KOLAGENA, CTX
• engl. C-telopeptide of type I collagen
• Imunohemijsko određivanje u urinu;
• monoklonska At protiv sintetskog
oktapeptida koji sadrži poprečno vezano
mesto (Glu-Lys-Ala-His-beta-Asp-Gly-Gly-
Arg) koja se zovu beta-CTX ili beta
CrossLaps
39/77
KOLAGENA, CTX
• Može da se meri i neizomerizovan
oktapeptid
kt tid u urinu
i – alfa-CTX,
lf CTX kao
k i
alfa/beta CTX kao indeks remodelovanja
kostiju (↑ kod Paget-ovog oboljenja a ↓
posle terapije bifosfonatima)
• Imunohemijski postupak za merenje CTX
u serumu (lipemija i
zamrzavanje/odmrzavanje smeta)
40/77
20
KOLAGENA, CTX
• Visoka specifičnost (100%) i oseljivost
(83 8%) pri praćenju odgovora na
(83,8%)
antiresorpcijsku terapiju
• Vrednosti odgovarajuće odražavaju lošu
prognozu u multiplom mijelomu, povezane
su sa težim radiografskim nalazima kod
reumatoidnog artritisa,
artritisa kao i sa niskom
koštanom masom kod pacijenata sa
Crohn-ovom bolešću
41/77
N-TERMINALNI TELOPEPTID
KOLAGENA, NTX
• engl. N-telopeptide of type I collagen
• Antitela
A tit l prepoznaju j kkonformacioni
f i i epitop
it
poprečno vezanog α2-N-telopeptida sa
određenom sekvencom (QYDGKGVG)
koja je proizvod osteoklastne proteolize
• Cirkardijalni ritam, ↑ za vreme folikularne
faze, ↓ za vreme lutealne faze, ↑ sa
godinama kod žena, ↑ u
postmenopazalnoj osteoporozi
42/77
21
N-TERMINALNI TELOPEPTID
KOLAGENA, NTX
• Značajan u proceni razgradnje kostiju kod
d
dece j odražava
jer d ž b i rasta
brzinu t
• Vrednosti adekvatno odražavaju supresiju
remodelovanja kostiju primenom ERT
• Specifičnije odražava razgradnju kostiju
kod osoba na bifosfonatnoj terapiji od
poprečnih veza kolagena
43/77
TARTARAT-REZISTENTNA KISELA
FOSFATAZA (TR-ACP, TRAP)
• Lizozomalni enzimi raznih tkiva
(t
(trombociti,
b iti eritrociti,
it iti kkost,
t prostata)
t t )
• U plazmi 5 izoenzima koji se razlikuju
prema tkivnom i hromozomskom poreklu,
MM i elektroforetskoj pokretljivosti
(izoenzimi 1-5)
• Prema osetljivost na inhibiciju sa L(+)-
tartaratom na tartarat-osetljive i tartarat-
rezistentne oblike
44/77
22
• Ukupna aktivnost u seremu – dosta nedostataka
kao marker razgradnje kostiju i ne preporučuje
se za postavljanje dijagnoze
• TR-ACP tip 5:
– stvaraju makrofagi (TR-ACP5a) - ↑ kod Gaucher-ovoj
bolesti i leukemiji vlasastih ć
– stvaraju osteoklasti (TR-ACP5b) - ↑ kod bolesti
k tij posebno
kostiju, b osteoporozi;
t i odražava
d ž broj
b j aktivnih
kti ih
osteoklasta; nema sijalinskih ostataka
45/77
• Aktivnost je povećana kod pacijenata sa
različitim
ličiti oboljenjima,
b lj ji alili najviše
j iš kkod
d
metastaza u kostima
• Manje koristan marker razgradnje kostiju,
posebno pri praćenju pacijenata sa Paget-
ovim oboljenjem na terapiji bifosfonatima
46/77
23
TR-ACP 5b
• Većina postupaka ne razlikuje osteoklasni

(i f
(izoforma 5b) od
d ostalih
t lih oblika
blik (izoforma
(i f
5a) koje se nalaze u plazmi
• Nove metode, u fazi evaluacije – inhibicija

TR-ACP 5b fluoridom, a TR-ACP 5a sa
heparinom, pa imunohemijski postupak sa
monoklonskim At naspram TR-ACP 5b
47/77
HIDROKSIPROLIN (OHP)
• Tradicionalno korišćeni marker razgradnje

kostiju
• Danas se ne preporučuje s obzirom na
karakteristike novijih specifičnijih markera
• Nedostaci:
– nalazi se u i u kolagenu drugih tkiva, u C1q, elastinu i
Ac-holin E
– nije specifičan marker razgradnje jer se otpušta i za
vreme vanćelijskog metabolizma novosintetisanog
(pro)kolagena
– 90% OHP se metaboliše u jetri
– izlučivanje u urinu jako zavisi od sadržaja u hrani
48/77
24
HIDROKSILIZIN-GLIKOZIDI (Hyl-Glyc)
• Galaktozil-hidroksilizin (GHL)
• Glukozil-galaktozil-hidroksilizin
Glukozil galaktozil hidroksilizin (GGHL)
– nastaju iz lizina za vreme postranslacione
faze sinteze kolagena
– GHL je relativno specifičniji marker za vreme
razgradnje k. matriksa od GGHL, a mnogo
specifičniji od hidroksiprolina
– prednost jer se ne metabolišu i ne utiču činioci
iz hrane
– u urinu se mere metodom HPLC
– još uvek nema imunohemijskog postupka
49/77
OSTALI PROTEINI KOŠTANOG

MATRIKSA
• OSTEONEKTIN
• KOŠTANI SIJALOPROTEIN
50/77
25
OSTEONEKTIN
• Prisutan je u aktivnim osteoblastima i
mladim
l di osteocitima
t iti ((alili ne u mirnim/tihim)
i i /tihi )
pa se smatra pogodnim markerom
diferenciranja osteogenih ćelija kosti,
ukazujući na izgradnju kostiju
• Smanjena uloga kao cirkulišućeg markera
jer se nalazi i većem broju vezivnog tkiva i
trombocitima
51/77
KOŠTANI SIJALOPROTEIN
• engl. Bone Sialoprotein, BSP
• sintetišu
i t tiš ga osteoblasti
t bl ti i odontoblasti
d t bl ti
• suprotno drugim fosforilisanim
glikoproteinima (kao osteonektin) je
relativno ograničen na kost
• stimuliše rastvaranje hidroksiapatita in
vitro, a deluje kao ćelijski adhezioni
molekul i omogućava osteoklastima da se
pričvrste na vanćelijski matriks
52/77
26
Klinička evaluacija kliničke efikasnosti
markera remodelovanja kostiju
Marker Uzorak Vrlo Koristan Nije
koristan koristan
B-ALP S X
OC S/P X
PICP S X
“Cross-links” U X
NTX U X
“CrossLaps” U X
CTX S X
TR-ACP S/P X
53/77
IZBOR MARKERA REMODELOVANJA KOSTIJU
• mogućnost međulaboratorijske
uporedivosti rezultata
• uspostavljanje referentnih intervala
• standardizacija mernih postupaka
• koncept QA
• smanjenje individualnih varijacija
merenjem u serumu,
ser m a ne u urinu
rin
• automatizacija mernih postupaka
• stabilnost ključnih reagenasa
54/77
27
IZBOR MARKERA REMODELOVANJA KOSTIJU
• International Osteoporosis Foundation – preporuke iz
2000. god.:
– Markeri izgradnje kostiju: B-ALP
B-ALP, OC i PINP u serumu
– Markeri razgradnje kostiju: NTX u urinu, CTX u serumu i
urinu, DPD u urinu
– Korišćenje jednog k. markera ili jedan marker izgradnje i
jedan razgradnje kostiju, pri čemu se daje prednost
merenja u serumu
– Krv treba da se uzme natašte p pre 9 h
– Ako se koristi urin – prvi ili drugi jutarnji uzorak
– Markere izgradnje meriti pre i posle 6 meseci terapije
– Markere razgradnje meriti pre i posle 3 ili 6 meseci terapije
55/77
IZBOR MARKERA REMODELOVANJA

KOSTIJU
56/77
28
OSTEOPOROZA
• porozne kosti
• bolest koja
j se odlikuje
j malom masom
kostiju i pogoršanjem strukture koštanog
tkiva, što dovodi do krhkosti i povećane
osetljivosti od preloma kuka, kičme i
zglobova
57/77
OSTEOPOROZA
• progresivna metabolička bolest koštanog
tkiva koju karakteriše smanjenje koštane
čvrstine koja ne zavisi samo od koštane
gustine već i od kvaliteta kosti, odnosno
njene mikroarhitekture, matriksa,
rasporeda kristala i drugih elemenata
• smanjenjem koštane čvrstine,
čvrstine kosti postaju
podložne prelomima
• gubitak koštane mase veći od 30% dovodi
do početka bolesti
58/77
29
TIPOVI OSTEOPOROZE
• Postoje dva osnovna oblika osteoporoze
zavisno od toga da li je oboljenje primarni
poremećaj ili sekundarni u odnosu na
drugo medicinsko stanje ili tretman
– PRIMARNA
– SEKUNDARNA
59/77
PRIMARNA OSTEOPOROZA
1. postmenopauzalna (tip 1)
obično se javlja izmađu 50. i 65. godine života; karakteriše se
gubitkom trabekularne kosti;
2. senilna (tip 2)
javlja se kod starijih od 70 godina i dva puta je češća kod žena;
napada trabekularnu i kortikalnu kost;
3. idiopatska
pogađa mlađe muškarce, žene pre menopauze i one srednje
starosne dobi; može biti posledica nekoliko ranijih oboljenja, a
odlikuje se vertebralnim frakturama u periodu od 5 do 10 godina;
4. juvenilna
karakteristična za decu i adolescente,sa normalnim funkcijama
gonada;
d odlikuje
dlik j se zastojem
t j u rastu
t i apendikularnim
dik l i ffrakturama;
kt
ovo stanje obično traje dve do tri godine kada dolazi do remisije i
obnavljanja normalnog rasta
60/77
30
SEKUNDARNA OSTEOPOROZA
• Posledica je drugih oboljenja ili dugotrajne

primene lekova koji izazivaju gubitak
kalcijuma iz kostiju ili pojačavaju aktivnost
ćelija koje razgrađuju, a smanjuju aktivnost
ćelija koje izgrađuju kost
61/77
UZROCI SEKUNDARNE OSTEOPOROZE
• Endokrini uzroci:
– muški hipogonadizam
– hipertireoidizam
– hiperparatireoidizam
– Kušingov sindrom
– dijabetes (nedostatak insulina)
– amenoreja j
– aktivne sportiskinje
– anorexia nervosa
– hiperprolaktinemija
62/77
31
UZROCI SEKUNDARNE OSTEOPOROZE
• Lekovi
– steroidi
– antikonvulzivi
– heparin
• Neoplastične
N l tič bolesti
b l ti
– Multipli mijelom
– metastaze kostiju
• Drugi uzroci
– poremećaji u ishrani (deficit kalcijuma, vitamina D, proteina)
– smanjena fizička aktivnost
– karcinomi, leukemija, limfomi
– gastroinestinalni poremećaji (operacija digestivnog trakta
trakta,
Kronova bolest)
– hronične bolesti jetre, opsrutktivna žutica
– transplantacija
– alkoholizam
– trudnoća
– dugotrajna imobilizacija 63/77
Etiologija osteoporoze kod muškog i ženskog pola
64/77
32
Simptomi osteoporoze
• ''nema'' bolest ili ''tihi kradljivac kostiju'‘, razvija
se neopaženo i može napredovati bez simptoma
• bolest koja ne boli (dijagnostifikuje se manje od
1/3, a samo 1/7 od njih se leči)
• bolovi u kostima (u predelu leđa i u mišićima su
umerenog intenziteta)
• ne razlikuju se od onih izazvanih drugim
uzrocima
• bol može biti znak početka preloma pršljenova
koji nastaju spontano, bez prethodnog povoda
65/77
• znaci za uzbunu su osećaj nestabilnosti, zamora u
predelu kičme, traženja oslonca tokom hodanja,
otežano dugo stajanje, a posebno treba obratiti
pažnju na iznenadni jak bol koji je stalan i
pogoršava se pri kretanju
• prelomi kičmenih pršljenova mogu biti bezbolni ili
umereno bolni
b l i i otkrivaju
tk i j se ttek
k više
iš godina
di kkasnije,
ij
kada se primeti gubitak visine, obično 3 cm do 5 cm,
uz pojavu pogrbljenosti
66/77
33
• prelom kičmenih pršljenova
(najčešći)
• prelomi drugih kostiju (kosti

rebara, podlaktice, nadlaktice,
sedalnih kostiju, kosti stopala)
• najteži
ž i najozbiljniji prelom je
prelom vrata butne kosti – kuka,
koji se kod starijih osoba može
završiti smrtnim ishodom
67/77
Zavisnost preloma kuka kod

muškaraca i žena tokom godina
68/77
34
Dijagnoza osteoporoze
• Na osteoporozu treba misliti od detinjstva,
ne samo u smislu prevencije
prevencije, nego i u
smislu blagovremenog otkrivanja bolesti
• Dijagnostička evaluacija bolesnika mora
započeti detaljnim razgovorom i kliničkim
pregledom sa uvidom u sve bolesti i stanja
koje mogu biti faktori rizika na temelju
čega se postavlja sumnja i preduzimaju
drugi dijagnostički postupci
69/77
Dijagnoza osteoporoze
1. denzitometrija skeleta, odnosno merenje
mineralne
i l gustine
ti kkostiju
tij (BMD)
2. rendgen grudnog i slabinskog dela kičme
3. laboratorijski testovi
4. ostala ispitivanja: pregled koštane srži,
biopsija kosti sa histomorfometrijom i
scintigrafija kosti
70/77
35
Denzitometrija skeleta
merenje mineralne gustine kostiju
• Bone density (ili bone mineral density) - BMD
• sadašnji standard za dijagnozu osteoporoze
• nenametljiv i bezbolan test
• pokazatelj čvrstine kostiju
1. DXA denzitometrija (dual energy X-ray

absorptiometry, DEXA) (za dijagnozu i
lečenje)
2. Kvantitativna ultrazvučna denzitometrija,
QUS (za brzo otkrivanje bolesti, kao
“skrining” metoda)
71/77
DXA denzitometrija
• najbolja metoda za merenje mineralne
koštane gustine
• predstavlja dvoenergetsku apsorpciometriju
X (rendgen) zraka (DXA)
• visoka preciznost
• mogućnost merenja na više mesta
• 1994 god. SZO je na temelju ove metode
postavila dijagnostičke, a lekari terapijske
kriterijume za osteoporozu
72/77
36
Smanjenje BMD-a sa starenjem
DXA metoda
73/77
DXA denzitometrija
• mala izloženost zračenju
• ulazi u okvire raspona dnevno dozvoljenog spoljašnjeg
zračenja, i ne predstavlja nikakvu opasnost za bolesnike, i
u slučaju da se ispitivanje mora češće ponavljati (1 do 2
puta godišnje)
• ispitivanje traje 10-ak minuta za svako područje
• bolesnik može ostati potpuno odeven, pod uslovom da u
području snimanja nema nikakvog metala
• rutinski se snima područje slabinskog dela kičme, vrata,
bedrene kosti, a ponekad poslednja trećine palčane kosti
(90% je sastavljena od kortikalne kosti)
74/77
37
DXA denzitometrija
• na osnovu izračunate regije (cm²) i procenjenog
mineralnog g sadžajaj u g gramima,, izračunava se
mineralna gustina (g/cm²)
• dobijene vredosti upoređuju se sa mineralnom
gustinom mlade i zdrave populacije istog pola za
koju se očekuje maksimalna mineralna gustina, a
odstupanje se izražava pomoću T vrednosti
• upoređivanjem dobijene mineralne gustine
i it ik sa mineralnom
ispitanika, i l gustinom
ti k ti istog
kosti i t
pola i uzrasta, dobije sa odstupanje - Z vrednost
• rizik od frakture raste sa svakom standardnom
devijacijom za 3 do 6 puta
75/77
DXA denzitometrija - T skor
• Normalan
N l
– T-skor: -1,0 ili viši
• Osteopenija
– T-skor: -1,0 ili više od -2,5
• Osteoporoza
– T-skor: -2,5 ili niže (znači da
je BMD 2,5 puta ispod
srednje vrednosti BMD 30
godina stare žene)
76/77
38
Mineralna gustina lumbalnog dela
kičme i vrata butne kosti
77/77
SMERNICE NCCLS
• 2004. god. – smernice za upotrebu koštanih markera
• Primena biohemijskih markera za koštane promene u
proceni i praćenju bolesti kostiju
National Committee for Clinical Laboratory Standards Guidelines Document 78/77

C48-A
39
1. Endres DB, Rude RK. Mineral and bone metabolism. U:
Burtis CA, Ashwood, Bruns D. Tietz textbook of clinical
chemistry
h i t and d molecular
l l diagnostics.
di ti 2006 1935-1965.
2006; 1935 1965
Elsevier Saunders, St. Louis, Missouri, USA
2. Majkić-Singh N. Biohemijski pokazatelji oboljenja kostiju.
U: Majkić-Singh N. Medicinska biohemija, drugo izdanje,
545-559. (ISBN 86-83023-09-5)
3. Ignjatović S. Koštani markeri. (slajdovi sa predavanja, pdf
fajl)
79/77
40
10/26/2016
Harmonizacija, standardizacija i
Problemi i rešenja
• prevalencija i incidencija osteoporoze (44 miliona ljudi u Americi)
• trošak države 19 biliona dolara godišnje
(do 2025. godine 25 biliona dolara godišnje)
(do 2025. godine 25 biliona dolara godišnje)
• incidencija za prelome usled osteoporoze kod žena su veći nego srčani udari, šlog i
rak dojke
• markeri prometa kostiju su dodatno oruđe koje lekari mogu da koriste da
poboljšaju ishod pacijenta, proceni i sprečavanju smrtnosti i udružene bolesti (bolja
zdravstvena nega)
• udruženo dejstvo državnih, akademskih, profitnih i neprofitnih organizacija,
naučnih i rutinskih laboratorija za harmonizaciju preanalitičkih i analitičkih
naučnih i rutinskih laboratorija za harmonizaciju preanalitičkih i analitičkih
promenljivih i standardizaciju procedura sakupljanja uzoraka, definisanja
referentnih opsega i adekvatnih metoda u kliničkim laboratorijama
1
10/26/2016
Udruženja koji rade na unapređenju oblasti o
markerima prometa kostiju
• Međunarodno udruženje USA za osteoporozu (International
Osteoporosis Foundation, IOF)
Osteoporosis Foundation, IOF)
• Međunarodno udruženje za kliničku hemiju i laboratorijsku
medicinu (International Federation of Clinical Chemistry and
Laboratory Medicine, IFCC)
• Nacionalno udruženje USA za zdravlje kostiju (National Bone
Health Alliance, NBHA)
2
10/26/2016
Harmonizacija i standardizacija
• Standardizacija i harmonizacija omogućava da
p
poređenje izmerenih rezultata ne zavisi od
j
laboratorije, vremena i lokacije
• Trenutno se markeri prometa kostiju ne mogu
standardizovati zbog:
– nedostatka referentnih mernih sistema
– nedostatka primarnih referentnih materijala
– nedostatka referentnih mernih procedura
Harmonizacija i standardizacija omogućava:
• Otkrivanje efekta lečenja pacijenata u toku vremena,
nezavisno od laboratorije u kojoj se merenje izvodi
j j j j
• Poređenje rezultata pacijenta sa referentnim
opsegom predhodno definisanim u mernoj ili nekoj
drugoj laboratoriji
• Primenu vodiča o lečenju poređenjem rezultata
p j
pacijenta i kliničke odluke koja je definisana
j j
korišćenjem podataka o markerima kostiju iz
istraživačke laboratorije.
3
10/26/2016
Osnovni koraci u harmonizaciji markera prometa kostiju
I. Definisanje posebnih analitičkih metoda (preciznost, recovery i specifičnost) i

analiziranje velikog broja humanih uzoraka da bi se odredila ciljna koncentracija
analiziranih markera u istim uzorcima; kao kalibratori i kontrolni uzorci za rutinske
testove koriste se humani uzorci.
testove koriste se humani uzorci.
II. Rutinski testovi se kalibrišu korišćenjem humanih uzoraka koji su jasno
definisani u prvom koraku; redovno sprovoditi verifikaciju kalibracije; (na
imunohemijskim analizatorima, kalibracija se izvodi upotrebom sopstveno
napravljenih kalibratora proizvođača koji se koriste za kalibrisanje rutinskih
testova). Kalibracija testova i verifikacija kalibracije je zajednička aktivnost
proizvođača testa i nezavisne organizacije koja potvrđuje adekvatnost kalibracije.
III.Procena da li se kalibracija testa krajnjeg korisnika sa kalibratorom proizvođača
testa ispravno sprovodi, što vodi doslednim i uporedivim izmerenim rezultatima
pacijenata u rutinskim i istraživačkim laboratorijama (sprovođenjem studija o
međulaboratorijskim poređenjima, koje koriste podatke programa spoljne
kontrole kvaliteta i podatke odgovarajuće unutrašnje kontrole kvaliteta
upotrebom kontrolnih uzoraka koje koristi laboratorija).
7
REFERENTNI OPSEZI
 Baza podataka referentne populacije (pol i starost)
• Trenutne referentne granice su utvrđene za Roche Diagnostics
Trenutne referentne granice su utvrđene za Roche Diagnostics
(Elecsys) i Immunodiagnostic (IDS) imunohemijske testove, ali
odvojeno i nikada u istoj populaciji uporednim korišćenjem oba
analizatora.
• Što je manja biološka varijacija analita, referentni opseg će imati veći
naučni značaj!
č i č j!
• Najmanje značajna promena analita u određenom vremenskom

periodu − klinički važna informacija!!!
8
4
10/26/2016
Definisanje referentnih opsega pomaže u:
• izgradnji poverenja u rezultate markera prometa kostiju koje
laboratorije obezbeđuju lekarima
• povezivanju nivoa izmerenog markera (najčešće povećanog) sa
kratkoročnim ili dugoročnim rizikom od preloma kod pacijenata koji
nisu na terapiji;
• proceni stepena promene (gubitka) mineralne gustine kostiju kod
pacijenata koji nisu na terapiji;
• definisanju koja promena u vrednostima markera prometa kostiju je
neophodna da bi se potvrdio odgovarajući farmakološki odgovor na
terapiju osteoporoze, bilo definisanjem porasta mineralne gustine
kostiju ili još bolje smanjenja rizika od preloma
9
Značaj definisanja referentnih opsega za:
• osobe starije od 60 godina, da bi se izbegle promene u
menopauzi i mlađe od 75, jer starije osobe od 75 godina imaju
udružene bolesti što ubrzava gubitak tkiva kostiju
• odgovarajuće godine starosti pacijenta u odnosu na primenu

denzitometrije kostiju
• mlađu i stariju zdravu populaciju zbog analiziranja dejstva

prestanka
t k terapije,
t ij prometa
t kostiju
k tij i jjačine
či kkostiju.
tij
• postmenopauzalne žene i starije muškarce, da bi se uočile

promene markera prometa kostiju sa godinama u odnosu na
nivo bubrežne funkcije koja opada sa godinama
10
5
10/26/2016
Osnovni koraci IOF/IFCC radne grupe
Predloženi referentni markeri prometa kostiju za

predviđanje rizika od preloma i praćenje lečenja
osteoporoze su:
1.jedan marker formiranja kostiju (serumski

prokolagen tip I N propeptid, PINP)
2.jedan
d marker
k resorpcije kostiju
k (
(serumski
k C-
terminalni telopeptid kolagena tipa I, CTX)
11
 Problemi za upotrebu u kliničkoj praksi:

• neodgovarajuće kontrole kvaliteta
• mali broj podataka koji analiziraju
• promene prometa kostiju u odnosu na terapiju u vremenskom periodu
• biološka i analitička varijabilnost
• neodgovarajuće baze podataka o referentnoj populaciji
 Rešenja su:
• razvoj referentnih mernih sistema (koji su zasnovani na izotopskoj diluciji-
masenoj spektrometriji)
• razvoj sekundarnih referentnih materijala koji bi bili dostupni

proizvođačima komercijanih testova za kalibraciju
• provera referentnih mernih procedura
• sledivost prema primarnom referentnom materijalu (visoko prečišćenom

serumskom molekulu CTX i PINP)
12
6
10/26/2016
Prelazno rešenje IOF/IFCC

• poređenje različitih testova koji se koriste u rutinskoj
kliničkoj praksi
• srednje vrednosti parametara određenih u različitim

humanim uzorcima se porede sa ukupnom srednjom
vrednošću za sve testove
• na ovaj način bi se identifikovala odstupanja za svaki

komercijalni test, dobijala konsenzus srednja vrednost i
omogućavala harmonizacija rezultata
13
Trenutni pristupi i regulative o statusu markera u USA
• DXA svake 1–2 godine (promena mineralne gustine
kostiju je spora)
kostiju je spora)
• markeri prometa kostiju mogu da procene odgovor na
terapiju ranije
• kombinovanje DXA i markera doprinosi usklađenom
menadžmentu osteoporoze i drugih metaboličkih
bolesti kostiju i sprečava morbiditet i mortalitet
bolesti kostiju i sprečava morbiditet i mortalitet
uzrokovan prelomima usled osteoporoze
14
7
10/26/2016
Sinteza kolagena kostiju DegradacijaDD

kolagena kostiju
PINP
PINP PICP NTX CTX
Prokolagen tipa I se stvara u osteoblastu i sekretuje u nov matriks

kostiju gde se dejstvom prokolagen peptidaze odvajaju N-terminalni
(PINP) i C-terminalni (PICP) delovi koji odlaze u cirkulaciju što
rezultuje stvaranje zrelog kolagena tipa I
15
Određivanje na komercijalnim platformama
PINP – trimerna i monomerna forma molekula
 intaktni PINP – samo trimerna forma (test Orion Diagnostica u USA);
manualno radioimunoodređivanje (odobrio FDA)
 ukupan PINP – trimerna i monomerna (test Roche Diagnostics u
Evropi); potpuno automatizovan test
 intaktni PINP – samo trimerna forma (test Immunodiagnostic
System, IDS); potpuno automatizovan test
 bubrežni bolesnici imaju dominantnu trimernu formu!!!
CTX – detekcija C‐terminalnog oktapeptida
(Roche Diagnostics i IDS) u USA i Evropi
 oba testa koriste isto (primarno) antitelo
16
8
10/26/2016
Preanalitički uzroci varijacije i kontrole
1. Koji se mogu kontrolisati:

• dnevni ritam (max koncentracija, 2x veća u ranim jutarnjim satima)
• uticaj ishrane
•uuticaj
aj fizičke aktivnosti
a o
2. Koji se ne mogu kontrolisati:

• godine starosti
• menopauza
• pol
• prisustvo bolesti
 Preporuka: sakupljanje rano ujutru, nakon perioda gladovanja, pravilno

čuvanje uzorka i određivanje u tačno definisanom vremenskom periodu
 Poželjan uzorak za određivanje koncentracije CTX je EDTA plazma zbog velike

stabilnosti
 Roche Diagnostics i IDS dali preporuke i za serum i za EDTA kao prihvatljive
uzorke za PINP; Orion Diagnostica preporučuje samo serum u FDA odobrenom
radioimunoodređivanju.
17
Kontrola analitičkog postupka

• Tačnost merenja zavisi od specifičnosti antitela, standardizacije
kalibratora, analitičke platforme i drugih karakteristika testa (postiže se
upotrebom EQA)
• Preciznost u seriji i između serija prati se određivanjem tri nivoa

kontrolnih uzoraka, sa svakim puštanjem uzoraka (matriks kontrolnih
uzoraka treba da je sličan uzorku pacijenta u cilju otkrivanja uticaja
reagensa, kalibracije, aparata i tehnika operatera)
• Potrebna je standardizacija između laboratorija u cilju postizanja iste

ciljne tačnosti da bi se obezbedile jedinstvene referentne vrednosti i
odgovarajuće granice odlučivanja
• Klinička validacija i procena (koliko dobro test detektuje prisustvo,

odsustvo ili rizik od bolesti i uglavnom zavisi od unutrašnjih karakteristika
testa, pa je neophodno da se navedu podaci o dijagnozi, prognozi,
prevenciji, lečenju i tretiranju ishoda bolesti
18
9
Klinička hemija u pedijatriji
i gerijatriji
Klinička hemija u pedijatriji
Svaka klasifikacija pedijatrijske populacije u starosne kategorije je do

nekog nivoa arbitrarne prirode.
P t ji preklapanje
Postoji kl j u fifizičkom,
ičk kkognitivnom
iti i psihosocijalnom
ih ij l razvoju
j
deteta.
Jedna od mogućih klasifikacija je sledeća:

• novorođenčad rođena pre vremena, nedonoščad (0 do 27 dana)
• novorođenčad rođena u terminu (0 do 27 dana)
• odojčad i bebe (28 dana do 23 meseca)
• deca (2 do 11 godina)
• adolescenti (12 do 16 ili 18 godina, zavisno od regiona)
Klinička hemija sa molekularnom

dijagnostikom
Distribucija laboratorijskih testova u zavisnosti od starosnog doba
pacijenata u velikom regionalnom sistemu zdravstvene zaštite
0 – 2 godine
3 – 12 godina
13 – 18 godina
odrasli
Pedijatrijski pacijenti zahtevaju jedinstven medicinski pristup
• zbog postojanja značajnih razlika u:

- frekvenciji bolesti
- uzorkovanju biološkog materijala
- izvođenju analitičkih procedura
- interpretaciji rezultata
• zahtev za skraćenjem obrtnog vremena obrade,

turnaround time (TAT)

dijagnostikom
Skraćenje obrtnog vremena obrade - rešenja
• testovi koji se retko traže, ali zahtevaju kratko TAT, nisu

ekonomski p podesni za male laboratorije j → integrisane
g
regionalne i referentne laboratorije, uz optimizirane
preanalitičke i postanalitičke faktore, su moguće rešenje
• point-of-care analiziranje, transkutani monitoring i

analize iz pune krvi omogućuju kratko TAT na odeljenjima
kritične neonatalne nege, ali:
- takvi
t k i iinstrumenti
t ti moraju
j biti validovani,
lid i uz adekvatnu
d k t
dokumentaciju
- preporuka je da im rad bude praćen i kontrolisan od strane
stručnog laboratorijskog osoblja
Uzorkovanje i zapremina uzorka

Venepunkcija, arterijska punkcija:
• 10 mL krvi u odrasle osobe predstavlja oko 0,2% ukupne zapremine krvi,
dok ista količina kod novorođenčeta rođenog u terminu i prevremeno
rođene bebe, težine oko 1000 g, čini 3-4% odnosno 8-10% ukupne
zapremine krvi
• u nedononoščeta teškog 1000 g venepunkcija 10 mL krvi u pojedinačnom
uzorkovanju, ili tokom jedne nedelje, bi bila indikacija za transfuziju
(jatrogena anemija)
• preporuka je da se novorođenčetu sa telesnom težinom manjom od 7
kilograma maksimalno može u pojedinačnom uzorkovanju izvaditi manje
od 1 mL krvi/kg telesne težine ili oko 1% ukupne zapremine krvi

dijagnostikom
Uzorkovanje i zapremina uzorka
Punkcija kože:
- kapilarna krv
- punkcija
k ij pete
t ili srednjeg
d j prsta
t na rucii (kod
(k d d
dece starije
t ij odd 6 ili 12 meseci)
i)
- preporuka za maksimalnu dubinu punkcije je 2 mm, prema NCCLS
Problemi u obradi pedijatrijskih uzoraka:

• dizajn epruveta za uzrkovanje u pedijatrijskoj populaciji
• dizajn analizatora sa minimalnom zapreminom uzorka
• prilagođavanje epruveta pedijatrijske veličine na automatizovane

platforme
• prilagođavanje tehnike identifikacije biološkog materijala
pedijatrijskim uzorcima
• većina analizatora i robotičkih sistema su dizajnirani za standardne

epruvete, zapremine 5 do 7 mL, i ne mogu procesuirati male
epruvete pedijetrijske zapremine
• ova nekompatibilnost je uzrok transfera pedijatrijskih uzoraka u
mikro- čašice za uzorak i njihovog manuelnog obrađivanja, čak i u
mikro
velikim automatizovanim laboratorijama
• manualna obrada uzorka može biti uzrok mnogim preanalitičkim i
analitičkim greškama
• iako mnogi instrumenti zahtevaju za očitavanje vertikalno postavljen
barcode, standardne barcode nalepnice su velike za pedijetrijske
epruvete
8

dijagnostikom
Problemi u obradi pedijatrijskih uzoraka:
- barcode nalepnice ne odgovaraju epruvetama male veličine

- barcode ne može da se očitava pomoću standardnih barcode čitača
- epruvetat ne možež da
d se centrifugira
t if i bez
b oštećenja
št ć j barcode
b d
- barcode ne može elektronski da se očita ukoliko se štampa u
manjem formatu
- epruvete pedijatrijske veličine ne odgovaraju nosačima epruveta na
analizatorima
- igla za uorkovanje ne ulazi u male pedijatrijske epruvete
- ručni transfer uzorka vodi ka greškama identifikacije
- greške u stavljanju uzorka na neodgovarajuće pozicije na nosaču
uzoraka
- ručno zadavanje neodgovarajućeg testa
→ manuelno procesuiranje pedijatrijskih uzoraka u velikim

laboratorijama
Moguća rešenja
- direktno uzorkovanje iz primarnih epruveta zahteva manje vremena
obrade uzorka i eliminiše greške povezane sa ručnim transferom i
identifikacijom uzorka
Izračunat dead volume

različitih pedijatrijskih
epruveta i čašice za uzorak
64 µL 64 µL 65 µL 81 µL 41 µL 18 µL
10

dijagnostikom
Moguća rešenja
- pedijatrijsku gel epruvetu, stavljenu u “ekstendor epruvete” sa
vertikalno zalepljenom barcode nalepnicom, je moguće zajedno sa
standardnim epruvetama postavljati u nosače epruveta i obrađivati na
analizatorima
11
Nedostatak odgovarajućih referentnih

vrednosti za pedijatrijsku populaciju
Deca nisu mali odrasli ljudi!
Opšte je pravilo da laboratorijski testovi odražavaju fiziološke promene

povezane sa bolestima ili sa njihovim tretmanom. Za pedijatrijske
pacijente, ovo određivanje se dešava u kontekstu rasta i razvoja.
Neophodno je da se za svaki parametar utvrde referentne vrednosti u
zavisnosti od strosnog doba:
- u toku je više studija za određivanje referentnih vrednosti
- sakupljanje uzoraka od zdrave dece je teško,
teško naročito kod
novorođenčadi i odojčadi
- tretiranje dece kao “subjekta istraživanja” donosi etičke dileme
- u prvih nekoliko meseci života priroda ishrane značajno utiče na
12

dijagnostikom
Patološka stanja u neonatalnoj medicini
Najčešći poremećaji koji se javljaju u neonatalnom periodu su:

• Konvulzije
j
- posledica metaboličkih poremećaja, najčešće uzrokovanih anoksijom,
infekcijom ili traumom
• poremećaji acido – baznog statusa
• neonatalna hiperbilirubinemija
- za dijagnostifikovanje i praćenje bolesti koristi se određivanje

glukoze, kalcijuma, magnezijuma i natrijuma u krvi
13
Neonatalna hipoglikemija
• neonatalna hipoglikemija je uobičajena (10% novorođenih)
• vrednosti
d ti glukoze
l k od
d 1,1
1 1 mmoL/L
L/L za novorođenčad
đ č d male
l ttežine,
ži
odnosno 1,6 mmoL/L za novorođenčad normalne težine se uzimaju
kao kritične za utvrđivanje hipoglikemije
• učestalost konvulzija usled hipoglikemije je 1:500, obično između 24

i 72 sata nakon rođenja
• često je praćena ketozom (pozitivna ketonska tela u urinu)
• glukoza se može određivati glukometrima, point of care, ali niski

rezultati se trebaju potvrditi nekom drugom metodom
14

dijagnostikom
Neonatalnu hipoglikemiju uzrokuje:
Povećana potrošnja glukoze usled:
• kataboličkog stresa
• septičnog šoka
• hladnoćom indukovane termogeneze
Smanjeno stvaranje glukoze usled:

• niske rezerve hepatičnog glikogena (nedonoščad ili bebe sa malom težinom za
gestacionu straost)
• intrauterine malnutricije
• endokrinih poremećaja (deficijencija hormona rasta, adrenalna insuficijencija)
• genetskih poremećaja (neregulisana produkcija insulina, poremećaji oksidacije
masnih kiselina
kiselina, galaktozemija
galaktozemija, poremećaji u skladištenju glikogena)
• hipoksije
• dijabetesa majke (neonatalni hiperinsulinizam)
15
Neonatalna hipokalcijemija
Može da se podeli u dve kategorije:
Rana hipokalcijemija:
• javlja
j lj se u prvih
ih 48 satiti od
d rođenja
đ j
• izaziva konvulzije uglavnom kod prerano rođenih beba, u beba čije su
majke dijabetičari i u slučaju asfiksije
• dolazi do sporog ili neodgovarajućeg odgovora PTH na hipokalcijemiju
Kasna hipokalcijemija:
• javlja se između četvrtog i desetog dana od rođenja
• obično je praćena znacima hiperekscitabilnosti mišića
• kod beba čije su majke unosile nedovoljno vitamina D
16

dijagnostikom
• hipokalcijemija i neodgovarajuća mineralizacija kostiju (osteopenija)
dovode do pojave rahitisa, naročito u prerano rođenih beba
• vitamin D deficitni rahit se javlja uglavnom u odojčadi, a bitan značaj
u patogenezi ima nedovoljna fotoliza 7-dehidroholesterola
(neizlaganje suncu) i ishrana koja favorizuje malapsorpciju kalcijuma
(kravlje mleko, žitarice)
• novorođenim bebama se daje vitamin D u toku prve godine života u
cilju profilakse rahitisa
17
Neonatalna hipomagnezijemija
Nastaje usled:
- povećanog urinarnog ili intestinalnog gubitka magnezijuma
- neodgovarajuće ishrane
• hipomagnezijemija je čest uzrok neonatalnih konvulzija, i često se

javlja udružena sa hipkalcijemijom
• nivoi u plazmi mogu da budu niži i od 0,1 mmol/L kod netretiranih
beba
18

dijagnostikom
Voda i elektroliti
• novorođenče ima 78% ukupne telesne vode (40% je ekstracelularnrno),

dok odrasla osoba ima 60% vode (25-25% je ekstracelularno)
• nakon rođenja sakupljaju se ekstracelularni prostori i gube se voda i
natrijum putem urina
• potrebe za tečnošću su 5 puta veće kod beba nego kod odraslih
• ukupan telesni sadržaj natrijuma i kalijuma je mnogo manji kod beba

nego kod odraslih što znači da ravnoteža elektrolita mora pažljivo da se
kontroliše
• visoki ili ređe niski nivoi natrijuma se nalaze kod malog broja beba sa
konvulzijama
• hiperkalijemuju bolje podnose novorođenčad od odraslih → nastaje
usled glomerularne disfunkcije i oštećenja tkiva uzrokovanog
hipoksijom
• hipokalijemija najčešće nastaje usled dijareja ili diuretičkog tretmana
19
Funkcija bubrega
• bubrežna funkcija nije u potpunosti razvijena kod beba mlađih od dve godine
• glomerularna funkcija se razvija mnogo brže od tubularne
• usled nezrelosti proksimalnih tubula i sabirnih cevčica, regulacija vode,
natrijuma i kalijuma putem antidiuretičnog hormona (ADH) i sistema renin-
angiotenzin-ALD je vrlo ograničena
• koncentracioni kapacitet bubrega je manji u novorođenčadi:
- maksimalni urinarni osmolalitet koji može da se postigne je između
500 i 700 mOsm/kg vode (kod odraslih je veći od 850 mOsm/kg)
• nakon 6 meseci života uspostavlja se takva vrednost GFR i kreatinina
(shodno površini tela deteta) koje odgovaraju vrednostima odraslih osoba
klirens kreatinina
(mL/min/1,73m2)
starost deteta srednja vrednost opseg
4-28 dana 48 28-68
1-5,9 meseci 77 41-103
6-11,9 meseci 103 49-157
20
2-12 godina 127 89-165

dijagnostikom
Acido - bazni poremećaji
• jedan od mogućih uzroka neonatalnih konvulzija je izmena acido – bazne
ravnoteže
• kod prevremeno rođenih beba često se javlja respiratorni distres sindrom

(RDS), oboljenje hijalinih membrana:
- progresivan kolaps alveola i razvoj difuznih mikroatelektaza usled
nedovoljne sinteze surfaktanta
- razvoj RDS favorizuje prevremeno rođenje, perinatalna asfiksija, dijabetes
majke, višestruka trudnoća
- razvija se hipoksemija (niski nivoi pO2 ), hiperkapnija (visoki pCO2) i
respiratorna acidoza
- nedostatak kiseonika u tkivima dovodi do anaerobne glikolize, nakupljanja
laktata i metaboličke acidoze
- najizrazitija progresija RDS postoji u prvih 48-72 sata života, ukoliko
novorođenče preživi taj period, tokom narednih 7-10 dana dolazi do
postepenog kliničkog oporavka
21
Neonatalna hiperbilirubinemija
• u novorođenčeta se žutica zapaža pri bilirubinemiji većoj od 83,3 µmol/L (u

odraslog >33,3 µmol/L), zbog fizioloških karakteristika kože i njene
vaskulizacije
j
• “fiziološka” žutica se se nikad ne javlja prvog dana (<36h) života,

maksimalne vrednosti bilirubina ne prelaze 220 µmol/L, laboratorijski se
gubi u drugoj nedelji života
• patološka žutica je svaka žutica koja se javlja u prvih 24 (<36h) života,
ako je bilirubinemija > 220 µmol/L, ako je porast serumskog bilirubina > 83
µmol/L/24h, ako vrednost konjugovanog bilirubina prelazi 15% ukupnog,
ako žutica perzistira duže od 14 dana života
• nivo serumskog bilirubina ne diferencira fiziološku od patološke žutice
• frakcija nekonjugovanog bilirubina koja prevaziđe vezujući kapacitet

albumina je sposobna da pređe krvno – moždanu barijeru i prouzrokuje
oštećenje mozga, naročito bazalnih ganglija
• postoje vodiči za identifikaciju rizičnih novoređenčadi i prevenciju
bilirubinom indukovanih neuroloških oštećenja (BIND) koristeći terapeutske
mere kao što su fototerapija, transfuzija ili enzimska indukcija
22

dijagnostikom
Uzroci nekonjugovane hiperbilirubinemije
• kratak život eritrocita i neefektivna eritropoeza u novorođenčadi
• deficijencija jetrene UDP-glukuronil transferaze
• nepotpuno unošenje u jetru ili nepotpuna konjugacija (Gilbert i
Crigler-Najjar sindrom)
• hemolitička bolest novorođenčeta, nekompatibilnost krvne grupe
• povećana dekonjugacija i reapsorpcija bilirubina u crevima
• genetski defekti koji utiču na:
- strukturu hemoglobina (anemija srpastih ćelija)
- aktivnost eritrocitnih enzima (deficit glukoza-6-P-DH)
- karakteristike eritrocitne membrane (nasledna sferocitoza)
• policitemija
• sepsa
• trauma
23
Uzroci konjugovane hiperbilirubinemije
• opstrukcije u bilijarnom traktu

- intra- ili ekstrahepatične
p bilijarne
j atrezije
j
• neonatalni hepatitis
- infektivnog porekla (infekcija citomegalovirusom, CMV)
- metabolički uzroci (galaktozemija, deficijencija alfa-1-AT)
• Dubin-Johnson i Rottor sindrom (defekt u prenosu konjugovanog
bilirubina u bilijarne kanaliće)
Određivanje lipoproteina X u plazmi omogućava razdvajanje bilijarne

atrezije od neonatalnog hepatititsa.
24

dijagnostikom
Transdermalni bilirubinometri
BiliChek®
• neinvazivno određivanje koncentracije bilirubina

• koncentracija bilirubina se određuje pomoću mernja optičke
gustine
ti k
kože
ž na više
iš ttalasnih
l ih dužina
d ži (400-760
(400 760 nm)) što
št
omogućava korekciju različite pigmentacije i hemoglobina
• studije ukazuju da bi se uzorkovanje za određivanje bilirubina u
nedonoščadi moglo redukovati za 20-50% nakon šireg uvođenja
bilirubinometara u praksu
25
Transdermalni bilirubinometri
Konica Minolta JM-103 Jaundice Meter
• JM-103
JM 103 određuje
d đ j bili
bilirubin
bi u subkutanom
bk t tkivu
tki novorođenčeta
đ č t merenjem
j
razlike apsorbance reflektovanog svetla na 450 i 550 nm
• inkorporiranjem dva optička puta u mernu jedinicu minimizira se
interferencija usled melanina i zrelosti kože
26

dijagnostikom
Neonatalni bilirubinometar
Pfaff Bilimeter™ II
• spektrofotometrijsko merenje koncentracije bilirubina u neonatalnoj plazmi ili

serumu na 455 nm sa korekcijom prisustva hemoglobina na 575 nm
• staklene kapilare se koriste za uzorkovanje i merenje
• potrebno je oko 4 μL plazme
27
Neonatalni bilirubinometar
Leica Unistat®
• direktno spektrofotometrijsko merenje bilirubina u neonatalnom serumu na

460 nm, sa korekcijom prisustva hemoglobina na 550 nm
28

dijagnostikom
Neonatalne infekcije
• oko 2% novorođenčadi inficirano je in utero, a više od 10% tokom porođaja i

posle rođenja
• nekompetentan imuni sistem
• neonatalni meningitis, infekcije urinarnog trakta i gastroenteritis se trebaju
razmatrati u okviru neonatalne groznice ili drugih znakova sepse
• hsCRP – osetljiv, ali kasni marker sepse

• prokalcitonin – osetljiviji marker bakterijskih infekcija, ali manje specifičan u
neonatalnoj populaciji
• serum amiloid A protein – rani, osetljiv i specifičan marker sepse
• iako je bakteriurija prisutna u 1:1000 novorođenčadi

novorođenčadi, infekcije urinarnog
trakta (UTI) su neuobičajene pre trećeg dana nakon rođenja
• test trake za hemijski pregled urina - test leukocitne esteraze i nitrita imaju
osetljivost 95% u detekciji značajne UTI
29
Nutricioni poremećaji
• prevremeno rođene bebe
- nisu akumulirale veće zalihe nutritienata (masti, kalcijum, gvožđe)
koje se dešava u toku trećeg trimestra trudnoće
- u većem su riziku za nutritivnu deficijenciju
- najbolji indikator praćenje brzine rasta odojčeta
- biohemijske analize su sekundarni, ali koristan indikator
- nedeljna određivanja kalcijuma, magnezijuma, fosfata, albumina i
hemoglobina obezbeđuju korisne informacije
• proteinsko energetska malnutricija (PEM); kvašiorkor; marazam

- koncentracija albumina manja od 30 g/L
- snižena koncentracija aminokiselina naročito valina, izoleucina,
leucina (esenciajlne aminokiseline)
- težina oboljenja se izražava odnosom neesencijalnih prema
esencijalnim aminokiselinama (NAK:EAK), veći odnos ukazuje na
teži oblik malnutricije
- sniženje koncentracije prealbumina i transferina, rani znak PEM
30

dijagnostikom
Proteini plazme
• plazma proteini dostižu različitom dinamikom nivoe koji odgovaraju

odraslim osobama:
- proteini akutne faze oko šestog meseca starosti
- IgM nakon devet meseci
- IgG oko treće godine
- IgA oko petnaeste godine
• u toku normalne trudnoće IgG iz krvi majke prelazi preko placente u

fetalnu cirkulaciju
• visoki nivoi IgM dobijeni iz krvi pupčane vrpce ili u prve četri nedelje
života mogu da ukažu na intrauterine ili neonatalne infekcije (sifilis,
rubela, toksoplazma ili CMV)
31
Poremećaji rasta
• celijačna oboljenja (CD) često dovode do retardacije u rastu
• kliničke manifestacije celijačnog oboljenja su raznorodne:
-ggastrointestinalne ((dijareja,
j j steatoreja,
j ppovraćanje,
j g
gubitak u težini))
- muskuloskeletne (nizak rast, osteoporoza, artritis, miopatija)
- mukokutalne (dematitis, stomatitis, vaskulitis)
- hematološke (anemija, gvožđe/folat/vitamin B12 deficijencija)
- imunološke, neurološke i manifestacije vezane za reproduktivni
sistem
• kao inicijalni screening algoritam u pacijenata sa simptomima
celijačne
lij č bolesti
b l ti vodiči
diči predviđaju
d iđ j određivanje
d đi j IgA
I A anti-
ti
transglutaminskih antitela (tTG)
• ukoliko su tTG serološka određivanja pozitivna, histopatološko
ispitivanje tankog creva uzetog biopsijom služi za potvrdu dijagnoze
• kod pacijenata sa CD smanjeno je izlučivanje sekretina i GIP-a
32

dijagnostikom
Nasledna metabolička oboljenja
• jedno od 600 novorođenčadi ima neku naslednu grešku metabolizma

• nasledne metabolopatije rezultiraju iz mutacije gena (nasledna bolest
po Mendelu)
• najveći broj se nasleđuje autosomno recesivno, manje vezano za pol i
vrlo retko autosomno dominantno
• usled izmene osnovne sekvence gena nastaju greške u sintezi:
- enzima (mukopolisaharidoze, CAH)
- transportnih proteina (cistinurija)
- ćelijskih receptora (nefrogeni dijabetes insipidus)
- strukturnih proteina (homocistinurija)
- plazmatskih proteina (deficit alfa-1-antitripsina)
• najčešće se laboratorijski manifestuju sa neonatalnom hipoglikemijom,

žuticom, metaboličkom acidozom i hiperamoninemijom (> 150µmol/L)
33
Uzorkovanje kapi krvi za neonatalni skrining

novorođenčadi
34

dijagnostikom
Screening novorođenčadi
• neonatalni postupak screening-a se primenjuje kod metaboličkih
grešaka koje:
- imaju
i j veliku
lik učestalost
č t l t u populaciji
l iji
- izazivaju oboljenja koja se mogu uspešno medicinski tretirati
- imaju jeftin i brz postupak dijagnoze
• programi neonatalnog screening-a su bazirani na analizi kapi krvi koja
se uzima iz pete između 3 do 14 dana od rođenja
• ovi uzorci se najčešće čuvaju kao osušene kapi krvi, DBSS, dried
blood spot samples, na specijalnom filter papiru koji se pokazao kao
odgovarajući medijum za sakupljanje, transport i čuvanje
• postoji značajna regionalna nesrazmera u broju poremećaja koji su

obuhvaćeni screening programima (države u SAD sprovode program
od najmanje 4 i najviše 36 oboljenja, najčešće 8)
• uvođenjem tandem masene spektrometrije, MS/MS, značajno se
povećao broj oboljenja koje se mogu identifikovati, više od 60
35
Guthriev mikrobiološki test,

poznat i kao bakterijski inhibicioni esej
• uveden 1960. godine u neonatalnom screening-u fenilketonurije
• iizvodi
di se na agaru kkojem
j su dodati:
d d ti
- bakterijske spore, obično B. suptilis
- kompetitivni inhibitor rasta karakterističan za aminokiselinu koja se
određuje (sprečava bakterijski rast)
- kružno izrezani uzorci filter papira, promera 3 mm, sa osušenom kapi
krvi novorođenčeta
• nakon 18h inkubacije, oko papira posmatra se kružni rast B. suptilis
• u slučaju pozitivnog testa, velike količine aminokiseline iz osušene kapi

krvi omogućavaju bakterijskim kolonijama rast u prisustvu inhibitora
36

dijagnostikom
Fenilketonurija
• fenilketonurija (PKU) najčešći je urođeni metabolički poremećaj u populaciji belaca
(1/10000)
• nastaje kao posledica više od 500 mutacija u genu za fenilalanin hidroksilazu
(PAH)
• usled deficita PAH i/ili kofaktora tetrahidrobiopteridina fenilalanin se ne razgrađuje u
organizmu već se nagomilava i uzrokuje tešku mentalnu retardaciju i neurološka
oboljenja
• aktiviraju se alternativni metabolički putevi razgradnje fenilalanina, transaminacijom
nastaje fenilpiruvat koji se izlučuje urinom, kao i njegovi metaboliti fenillaktat i
fenilacetat
• u Srbiji se svake godine dijagnostikuje, kroz programe neonatalnog screening-a i

genetskih savetovališta, 3 do 4 novorođena detetata sa deficijencijom PAH
• uzoci za screening se uzimaju između drugog i sedmog dana nakon rođenja,
najčešće trećeg
37
Metabolički putevi razgradnje fenilalanina
NH2 NH2
f il l i hid
fenilalanin hidroksilaza
k il
CH2 CH2 CH COOH + kinonoid-
CH COOH dihidrobiopteridin
+ tetrahidrobiopteridin
HO
L-fenilalanin tirozin
transaminacija
CH2 C COO- fenillaktat
O
fenilacetat
fenilpiruvat
o-hidroksifenil metaboliti
38

dijagnostikom
Galaktozemija
• galaktozemija je autosomno-recesivno nasledna enzimopatija uslovljena

deficitom galaktozo-1-fosfat-uridiltransferaze (GALT) sa incidencom od
1/44000 ddo 1/80000 novorođene
đ dece
d
galaktoza-1-fosfat
galaktokinaza uridiltransferaza
galaktoza galaktoza-1-fosfat glukoza-1-fosfat
39
Galaktozemija
• nemogućnost metabolizovanja galaktozo-1-fosfata u ćelijama jetre i

drugih organa, što brzo vodi oštećenju njihove funkcije i strukture
• u jetri nastaju fibroza i ciroza, u bubrezima se razvijaju tubularne
lezije, u moždanom tkivu edem, u očnom sočivu katarakta
• simptomi se javljaju 2 do 3 dana nakon ingestije mleka
• kod dece se manifestuje mukom, povraćanjem, hepatomegalijom i
žuticom koja se zadržava i 10 dana nakon rođenja
• rano postavljanje dijagnoze ostvaruje se iz osušene kapi krvi (DBS)
40

dijagnostikom
Kongenitalni hipotireoidizam
• u većini evropskih zemalja javlja se sa incidencom od 1 u 4000
novorođenčadi, u Srbiji 1 u 6200
• najčešće (80-85% slučajeva) nastaje kao rezultat poremećaja u
embrionalnom razvoju tireoidne žlezde:
- aplazija (atireoza)
- ektopija (npr. sublingvalna tiroidea)
• u 15% slučajeva postoji poremećaj u biosintezi tiroksina,
dishormogeneza (npr. nedostatak peroksidaze)
• screening određivanje TSH treba da se uradi nakon sedam

dana, jer su vrednosti TSH u toku prvih 24 sata 15 puta iznad
gornje granice referentnog intervala (kao odgovor na stres rađanja)
• cilj screening-a je rana dijagnoza i uvođenje supstitucione terapije
(najkasnije do 30 dana od rođenja) → sprečava se mentalna
retardacija deteta
41
Kongenitalna adrenalna hiperplazija (CAH)
• javlja se sa incidencom od 1/10000 do 1/20000 novorođene dece

• najčešći
j poremećaj
p j jje deficijencija
j j enzima 21-hidroksilaze,, usled
čega se javlja nagomilavanje 17-OH progesterona i konverzija u
DHEA i androstendion (steroidni hormoni sa viriliznim efektima)
• smanjeno stvaranje kortizola, usled negativne povratne sprege,
dovodi do prekomernog stvaranja ACTH, i sledstvene, adrenalne
hiperplazije
• koncentracija 17-OH progesterona u serumu dece sa klasičnim
oblikom bolesti je 50-200 puta veća nego u zdrave dece
42

dijagnostikom
Cistična fibroza (CF)
• nasleđuje se autozomno recesivno sa učestalosti od 1/3500

novorođenih
• dijagnostikuje se testovima koji su u vezi sa stvaranjem znoja i
pankreasnom funkcijom:
- referentna metoda je određivanje koncentracije hlorida u znoju koji
se dobija jontoforezom sa male površine kože pod standardnim
uslovima, primenom pilokarpina indukuje se stvaranje znoja
- određivanje albumina u mekonijumu
- određivanje imunoreaktivnog tripsina u mrljama osušene krvi
- tripsin, himotripsin i pankreasna elastaza-1 u fecesu
43
Određivanje koncentracije hlorida u znoju
Faze u testu:
- pilokarpinska jontoforeza
- sakupljanje znoja
- merenje težine ili zapremine znoja
- analiziranje koncentracije hlorida:
- kulorimetrijkom titracijom
- merkurimetrijskom titracijom
- jon selektivnim elektrodana na
analizatorima
44

dijagnostikom
Klinička hemija u gerijatriji
45
Klinička hemija u gerijatriji
• postoji problem interpretacije dobijenih rezultata u odnosu na

• preporuka
k je
j d
da se referentne
f t vrednosti
d ti određuju
d đ j prema sledećim
l d ći
starosnim intervalima: od 55-65, od 65-75, od 75-85, i od 85-95
godina
• tendencija povećanja referentnih vrednosti sa povećanjem godina

strarosti uočava se kod:
- uree, kreatinina (usled progresivnog gubitka nefrona)
- holesterola
- glukoze (promene u toleranciji na glukozu)
- alkalne fosfataze
• tendencija smanjivanja postoji kod:
- ukupnih proteina
- albumina
46

dijagnostikom
Metabolizam glukoze
• kod starijih osoba se povećava bubrežni prag za glukozu
• u 25% osoba starijih od 75 godina dobija se patološki odgovor na
opterećenje glukozom
→ otežan proces postavljanja dijagnoze dijabetes melitusa
j j tireoidne žlezde
Oboljenja
• koncentracije tiroksina i slobodnog tiroksina su normalno niže kod
gerijatrijske populacije
• imaju niži nivo TBP usled siromašnije ishrane i uzimanja lekova koji
utiču na kapacitet vezivanja tiroidnih hormona za proteine
→ otežano postavljanje dijagnoze hipotireoidizma od koga oboljeva
2-6% osoba starijih od 70 godina
Oboljenja kostiju
• Paget-ovo oboljenje se dijagnostikuje u 5-10% osoba starijih od 65
godina (određivanje koštanog izoenzinma ALP i hidroksiprolina u
urinu)
• osteomalacija (usled nutritivne deficijencije i manjeg izlaganja
suncu)
47
Screening ispitivanja u gerijatrijskoj

populaciji
• Screening ispitivanja radi otkrivanja oboljenja kod starijih osoba
treba da obuhvataju određivanja:
- kalcijuma, neorg. fosfora, ALP (hipokalcijemija i osteomalacija)
- glukoze (dijabetes melitus)
- urea, kreatinin (renalna oboljenja, postrenalna uremija)
- brzinu sedimentacije (nespecifična oboljenja i paraproteinemije)
- hemoglobin (anemija)
- albumin, ukupni proteini (nutritivni status)
- kalijum (hipokalijemija izazvana diureticima)
- TSH (hipotiroidizam)
48

dijagnostikom
2000 godina: procenatualna distribucija
populacije starije od 65 godina
49
2030 godina: procenjena procentualna

distribucija populacije starije od 65 godina
50

dijagnostikom
25 “najstarijih zemalja” na svetu
(procenat stanovništva iznad 65 godina)
Srbija
51
Objašnjenje procesa starenja

• predložene su vrlo raznorodne teorije:
- stohastične (somatske mutacije, glikozilacija proteina)
- teorije
j starenja
j zasnovane na p promenama u imunološkom i
neuroendokrinom sistemu
- teorije programirane smrti (bazirane na genomu)
- teorije slobodnih radikala i lipidne peroksidacije
• prosečan životni vek pre 5 000 godina je bio samo 20 godina, pre
100 godina 50 godina, a danas je 75 godina
• među populacijom starih ljudi najveći brojčani porast ima grupa starijih
od 80 godina
Procenat populacije starih u regionu Evrope:
> 65 godina > 75 godina > 85 godina
(%) (%) (%)
2000 15,5 6,6 3,3
2015 18,7 8,8 5,2
2030 24,3 11,8 7,1 52

dijagnostikom
Prevalenca uobičajenih hroničnih bolesti u
populaciji starijoj od 65 godina
65-74 god. ≥ 75 god.

poremećaj
(%) (%)
koronarna srčana bolest 18,7 24,5
hipertenzija 49,6 51,8
dijabetes melitus 17,3 15,0
poremećaj funkcije bubrega 2,3 3,9
artritis 44,9 51,2
oštećenje sluha 29,7 46,0
oštećenje vida 14 5
14,5 21 1
21,1
ulcer 12,3 13,1
kancer (bilo kog tipa) 19,8 23,9
moždani udar 6,4 11,1
sinuzitis 14,1 11,9
emfizem 4,9 4,7
53
Starosno-zavisne referentne vrednosti
• fiziološko doba nije isto što i hronološko doba

• određivanje referntnih vrednosti u starih je komplikovano usled
visoke prevalence bolesti (latentnih, manifestnih, multisistemskih),
kao i zbog fizioloških i anatomskih promena vezanih sa starenjem
• lekovi, koji su u širokoj upotrebi u starih ljudi, mogu lažno izmeniti
rezultate laboratorijskih testova
• usled heterogenosti, ekstrapolacija pravila na pojedinca ima manju
korist u starih nego u mladih osoba
• izuzev vrednosti polnih hormona i hormona rasta, 80-90% zdravih
strarih ljudi ima rezultate koji se ne razlikuju značajno od mlađe
populacije
• mnoge od abnormalnosti nisu rezultat procesa starenja per se, već
nastaju usled: loše ishrane, fizičke neaktivnosti, višestrukih
hroničnih poremećaja i nekontrolisane upotrebe više grupa
lekova
54

dijagnostikom
Uticaj efekata starenja na vrednosti
laboratorijskih testova
tendencija povećanja tendencija smanjenja
• glukoza, postprandijalno • albumin
• insulin, C-peptid
C peptid • prealbumin
• holesterol, • transferin
• HDL-holesterol • CK
• trigliceridi (do 90. godine) • kalcijum
• urea • testosteron
• kreatinin (iznad 90. godine) • estradiol
• PTH • progesteron
• gastrin • androstendion
• PSA • GH
• LH, FSH • IGF-1
• ALP, GGT • 1,25- dihidroholekalciferol
• noradrenalin • selen, cink
• feritin • vitamin B12, B6, C, E
• IgA • IgM
• fibrinogen • gvožđe, Hb, Hct, Lkc, Trc 55
• faktori koagulacije VII i VIII • trijodtironin
Metabolizam glukoze
• epidemiološki podaci u većim evropskim zemljama pokazuju:
- značajno veću prevalenciju predijabetesa (52%) u starosnoj grupi od 60 do 79 godina
-ggodinama p pre jjasnog g ispoljavanja
p j j bolesti se mogu
g utvrditi p
poremećajij u tolerancijij
glukoze
- u trenutku kada se postavlja dijagnoza tipa 2 dijabetesa oko 50% bolesnika
imaju jednu ili više tipičnih dijabetesnih komplikacija
• dijagnoza predijabetesa se postavlja na osnovu sledećih kriterijuma:

- vrednost dve neuzastopne glikemije natašte: 6,1-6,9 mmol/l
(stanje povišne glikemije natašte, impaired fasting glucose, IFG)
- vrednost glikemije u 120. minutu OGTT-a: 7,8-11,0 mmol/l
(stanje smanjene tolerancije glukoze, impaired glucose tolerance, IGT)
• HbA1c je preporučen od ekspertskih grupa kao treći marker (pored glukoze natašte i
OGTT) u screening-u i dijagnozi dijabetesa
- smatra se da bi prelomna tačka od 6,5% bila odgovarajuća
56

dijagnostikom
Metabolizam glukoze
• prema WHO kriterijumima, oko 35% populacije starih ima
poremećenu toleranciju na glukozu (IGT), koja može nastati usled:
- neodgovarajuće sekrecije insulina i periferne rezistencije na insulin
- nedostatka supresije glukagona (zbog relativne deficijencije insulina)
• oko 20% starih ima dijabetes tipa 2, a glavni rizici su:

- gojaznost
- abdominalna gojaznost, uprkos normalnom indeksu telesne mase
(centralna distribucija masnog tkiva)
- porodična istorija dijabetesa
• prevalenca komplikacija uzrokovanih dijabetesom je veća u starih usled

dugotrajne izloženosti hiperglikemiji i velikoj učestalosti hipertenzije i
dislipidemije
• retinopatija i neuropatija u dijabetičara povećava rizik od padova,
ograničene mobilnosti, socijalne izolacije i depresije
57
Karakteristično ponašanje nivoa glukoze u krvi pri izvođenju

OGTT u slučaju različitih starosnih grupa
• vrednosti
d ti glukoze
l k natašte
t št su bez
b značajnog
č j uticaja
ti j d dobi
bi
(povećavaju oko 0,05-0,11 mmol/L za dekadu)
• nagib krive tokom prvih 30 minuta je isti → apsorpcija glukoze je
slična
• pik koncentaracije glukoze između 50 i 75 minuta se značajno
razlikuje (povećava se oko 0,6-0,8 mmol/L za dekadu) →
periferna rezistencija na insulin
• oko 75 minuta sve krive su paralelne → raspodela glukoze, ulazak
glukoze u ćelije je isti
58

dijagnostikom
Karakteristično ponašanje nivoa glukoze u krvi pri izvođenju
OGTT u slučaju različitih starosnih grupa
20-30 god. 30-40 god. 40-60 god. 60+ god.
12.00
11.00
10.00
Koncentracija glukoze (mmol/L)
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
Vreme (min)
59
Poremećaji vode i elektrolita

• dehidratacija je jedna od deset najčešćih poremećaja u starih osoba
- vrlo visoka p
prevalenca akunih “konfuzionih” stanja j u starih se
delom može objasniti poremećajima balansa vode, sa ili bez
popratnog gubitka elektrolita
- laboratorijski se može definisati: hipernatrijemijom, povećanom
osmolalnosti seruma i povećanom specifičnom težinom urina
- određuju se još i urea, kreatinin, elektroliti u serumu i urinu
• hiponatrijemija → u hospitalizovanih pacijenata je povezana sa
lošom prognozom
• hipokalijemija → česta u pacijenata koji uzimaju diuretike
• hipomagnezijemija → povezana je sa povećanom smrtnosti u
postoperativnom periodu
60

dijagnostikom
Tiroidna funkcija
• u starih osoba serumski nivoi tiroksina se ne menjaju sa godinama, iako se

smanjuje preuzimanje joda i produkcija tiroksina u žlezdi →
smatra se da je to fiziološka kompenzacija na smanjen bazalni metabolizam,
tj. smanjen klirens tiroidnih hormona
• blago povećanje TSH sa godinama je kontraverzno pitanje, vodiči NACB su
preporučili da nema opravdanja za korekciju referentnih vrednosti u odnosu
na godine
• prevalenca hipotireoidizma u populacije starije od 65 godina je značajna:

- oko 2,5% starih ima hipotiroidizam, serumski TSH je >10 mU/L
- oko 7,8% ima subklinički hipotireoidizam, TSH je 5-10 mU/L
• određivenje nivoa slobodnog tiroksina (freeT4) je vrlo koristan test jer se

koriguje uticaj promene koncetracije vezujućih proteina (TBG, albumin)
• hipotireoidizam često nije prepoznat jer su klinički znaci atipični i blagi →

znaci “starog doba”
61
Lipidi, ateroskleroza i karonarna srčana

bolest
• referentne vrednosti za holesterol i trigliceride značajno zavise od pola i
starosti:
- vrednosti holesterola se povećavaju sa godinama, a počevši od 55-60
55 60
godine vrednosti su više kod žena nego kod muškaraca
- kod žena, povećanje holesterola je najznačajnije između 65 i 69 godine
- nakon 70. godine, holesterol se smanjuje kod oba pola
- nivoi triglicerida se povećavaju do 55. godine u muškaraca i do 70.
godine u žena nakon čega se smanjuju
• koronarna srčana bolest, coronary heart disease (CHD), je glavni

uzrok morbiditeta i mortaliteta u populacije starije od 65 godina
• neke
k studije
t dij sugerišu
iš da
d je
j stepen
t mortaliteta
t lit t najniži
j iži kod
k d starih
t ih muškaraca
šk
pri vrednosti holesterola od 5,5 mmol/L, a kod starih žena pri 7,0 mmol/L
• holesterol je važan prognostički faktor u pacijenata koji su već imali AMI
62

dijagnostikom
Lipidi, ateroskleroza i karonarna srčana
bolest
• značaj smanjivanja visokih vrednosti holesterola u starih, u terminima
kvaliteta života, morbiditeta i mortaliteta, je sporan
• National Cholesterol Education Program (NCEP) ne daje starosno-zavisne

vodiče → bazirani su na podacima dobijenih na populaciji srednjih godina i
ne razmatraju povećanje lipida koje se dešava sa godinama → 60% osoba
starijih od 65 godina bi se klasifikovalo u grupu za tretman smanjivanja
holesterola
- u redukciji rizika za CHD u žena starijih od 65 godina, statini su značajno
korisniji od hormonske supstitucione terapije
- u primarnoj prevenciji, terapeutska promena životnih navika, therapeutic
lifestyle
y changesg ((TLC)) jje p
prva linija
j terapije
pj uppopulaciji
p j starih
- medikamentozna terapija smanjivanja LDL-holesterola bi trebala da se
razmatra kod starih osoba koji imaju više faktora rizika i uznapredovalu
subkliničku aterosklerozu
63
Nutricione deficijencije
• oko 16% starih koji žive u zajednici je nutritivno deficijentno

• malnutricija je većinom uzrokovana anoreksijom koja je povezana sa
fiziološkim promenama u starih i različitim patološkim stanjima
• na poremećaj ukazuje indeks telesne mase koji je manji od 21 kg/m2
• marazam i kavšiorkor su dve glavne forme proteinsko energetske
malnutricije (PEM)
• u osoba sa marazmom nisu prisutni edemi, nivoi albumina i transferina su
normalni
• u osoba sa kvašiorkorom su prisutni edemi, albumin je niži od 35 g/L,
anemija, linfocitopenija i hipotransferinemija (TIBC manji od 45 µmol/L) su
uobičajene
• nivoi albumina manjij od 32 g g/L u hospitalizovanih
p starih osoba su visoko
prediktivni u sledstvenom mortalitetu
• merenje proteina sa kratkim poluvremnom života (prealbumin, retinol
vezujući protein) imaju malu dijagnostičku vrednost, ali mogu biti vrlo korisni
u hospitalizovanih pacijanata u evaluaciji odgovora na terapiju
• kod starih su česte i deficijencije folata, vitamina B12, B6, A, C, E
64

dijagnostikom
Gojaznost
• u SAD, prevalenca gojaznosti u muškaraca je najveća tokom

srednjeg doba, opada na 26% u populaciji od 65 do 74 godine.
• prevalenca gojaznosti u žena je najveća u populaciji od 65 do 74
godine (36%)
• ukupno masno tkivo (visceralno i nevisceralno) raste do oko 40
godina u muškaraca i do 50 godina u žena, ne menja se u periodu
do 70 godina, nakon čega opada
• u starih muškaraca, gojaznost je posledica smanjene fizičke
aktivnosti, u žena, gubitka estrogena, a u oba pola, smanjenih nivoa
hormona rasta
• genotip utiče na 25% visceralne telesne masti
• starosno zavisno smanjenje metabolizma u mirovanju je rezultat
blagog smanjenja nivoa trijodotironina (T3), smanjenog odgovora na
noradrenalin, smanjenog tonusa mišića i snage mišićne kotrakcije i
smanjene Na+/K+-ATP-azne aktivnosti
65
Metabolizam minerala
• poremećaji metabolizma minerala su vrlo uobičajeni u populaciji starih
• oni uključuju bolesti kostiju (osteoporozu, osteomalaciju, Pagetovu boest),
kao i poremećaje kalcijuma, fosfata i magnezijuma
• smanjenje skeletne mase nastaje zbog:
- smanjene apsorpcije kalcijuma u intestinumu
- smanjenog unosa kalcijuma
- smanjene renalne funkcije (i hidroksilacije vitamina D)
- povećanja PTH
- smanjene sinteze vitamina D u koži
• nivoi vitamina D se smanjuju sa godinama, prouzrokujući osteomalciju

• usled teške deficijencije vitamina D može se javiti bolna miopatija
• mnoge stare osobe imaju korist od uzimanja 800 IU vitamina D dnevno, jer
usporava progresiju osteoporoze, smanjuje incidencu fraktura i povećava
preživljavanje
66

dijagnostikom
Osteoporoza
• osteoporoza je glavni uzrok akcidentne smrti u populaciji starih žena

• 30% do 50% žena starijih j od 65 g godina će imati osteoporozu,
p ,a
jedna trećna njih će u toku svog života doživeti frakturu
• rizik od frakture kuka raste više od 2,5 puta za svaku standardnu
devijaciju smanjenja mineralne gustine kosti (BMD)
• faktori rizika su:
- genetska predispozicija
- endokrine promene
- ishrana
- životne navike
- lekovi
67
Biohemijski markeri remodelovanja kostiju
• koštani markeri su osetljivi parametri praćenja uspešnosti terapije

(antiresorptivne, anaboličke)
• ukazuju na uspeh terapije mnogo ranije nego BMD
Markeri koštane izgradnje

• osteokalcin
• amino-terminalni propeptid tipa I prokolagena (PINP)
• AP-koštani izoenzim
Markeri koštane razgradnje

• poprečne veze kolagena (eng. Collagen cross-links)
deoksipiridinolin (DPD) i piridinolin (PYD)
• telopeptidi kolagena tip I (CTX, NTX)
68

dijagnostikom
Osteoporoza
69
Promene u endokrinom sistemu

• u periodu posle menopauze dolazi do smanjenja estrogena i povećanja
FSH i LH, ove izmenjene koncentracije hormona su povezane sa:
- vazomotornom nestabilnosti
- gubitkom mišićne mase
- atrofijom estrogen zavisnog tkiva
- povećanim rizikom za kardiovaskularna oboljenja
• kontraverzna je upotreba hormonske supstitucione terapije u smanjenju
incidence frektura, oboljevanja od koronarne arterijske bolesti, prevenciji
demencije
• u mušaraca se sa godinama smanjuje koncentracija testostreona, a

povećava SHBG
• sindrom “andropauze”
andropauze nije široko prepoznat kao posledica deficijencije
androgena
• u starije populacije dolazi do povećanog izlučivanja hormona srži

nadbubrežne žlezde (adrenalin i noradrenalin) i hormona kore
(glukokortikoidi i mineralokortikoidi) nadbubrežne žlezde → uloga u
oboljevanju od dijabetesa tipa 2 i u promenjenom odgovoru organizma na 70
stres

dijagnostikom
Uticaj efekta starenja i deficijencije hormona
deficijencija hormona
uticaj Hormon
faktor Testosteron Estrogen
starenja
j rasta
koštana gustina ↓ ↓ ↓ ↓
kognitivna funkcija ↓  ↓ ↓
mišićna masa ↓ ↓ ↓ ↓
mišićna snaga ↓  ↓ ↓
azotni bilans ↓ ↓ ↓ 
protok krvi kroz bubrege ↓ ↓  
hematokrit ↓ kod muškaraca  ↓ 
imunitet ↓ ↓  
libido ↓  ↓ ↓?
71
Hematološke promene
• na sedimentaciju eritrocita (SE) ne utiče proces starenja, ali ima trend viših
vrednosti u populacije starih usled visoke prevalence oboljevanja
• povećana vrednost SE najčešće ukazuje na:
- hroničnu inflamatornu aktivnost (uključujući infekcije)
- monoklonsku gamopatiju (javlja se u 10% naizgled zdravih osoba između
62 i 95 godina)
- karcinom
• deficijencija gvožđa je uobičajena u starih

• nedostatak gvožđa se razmatra prema koncentracijama feritina,
hemoglobina i serumskih transferinskih receptora (sTfR)
• b j eritrocita
broj it it jje kkoristan
i t screening
i test
t t u starih
t ih zbog
b velike
lik iincidence
id
anemija (oko 20%)
• česte su anemije uzrokovane okultnim krvarenjem
• deficijencije vitamina B12 u populaciji iznad 50 godina je oko 5%
72

dijagnostikom
Prostata specifičan antigen (PSA)
• kancer prostate je bolest starijih osoba, sa pikom incidence od oko 75 godina

- tokom života jedan od pet muškaraca će oboleti
- autopsijama je dokazano da maligne promene prostate ima 10% osoba od
40-50 godina i 35-50% osoba starijih od 80 godina
- incidenca se smanjuje sa smanjenjem unošenja mesa i masti ishranom
• screening algoritam uključuje laboratorijsko određivanje PSA (pored

rektalne palpacije i ultrazvuka prostate)
• PSA je specifičan za tkivo prostate, a ne za sam karcinom prostete
• da bi se p
povećala specifičnost
p i osetljivost,
j , učinjeno
j jje više p
poboljšanja:
j j
- utvrđeni su referntni intervali po dekadama starosti
- računanje gustine PSA (deljenje koncentracije sa zapreminom prostate)
- računanje brzine rasta PSA (više od 0,75 µg/L/godini je karakteristično za
maligno tkivo)
- određivanje procenta slobodnog PSA
73
Prostata specifičan antigen (PSA)
• preporuka je da muškarci iznad 50 godina godišnje urade screening određivanje PSA
Predložene gornje granice PSA Procenat slobodnog PSA u raznim

za različite starosne grupe patološkim stanjima
starost PSA medijana
stanje
(god.) (ng/mL) free PSA, %
40-49 < 2,5 karcinom i normalna 9,2
veličina žlezde
50-59 < 3,5
karcinom i povećana 15,9
60-69 < 4,5 veličina žlezde
benigna hiperplazija 18,8
70-79 < 6,5 prostate (BHP)
74

dijagnostikom
Bubrežna funkcija
• faktori koji utiču na smanjenje funkcije bubrega u starih osoba su:

- smanjenje protoka krvi kroz bubreg
- renalna ateroskleroza
- glomerularna skleroza
- intersticijalna fibroza
• protok krvi kroz bubrege progresivno se smanjuje sa godinama, od 1200

mL/min u dobu između 30 i 40 godina do 600 mL/min u osoba
starosti 80 godina
• masa bubrega značajno opada, sa 250-270 g u osoba od 30 godina na 180-
200 g u osoba od 70 godina, što odgovara smanjenju broja glomerula
- postotak
t t k sklerotičnih
kl tič ih glomerula
l l se povećava
ć sa 1-2%
1 2% u mladih
l dih na
više od 12% u populacije starijih od 70 godina
• smanjenje jačine glomerularne filtracije (GFR) je naznačajniji funkcionalni
defekt koji se javlja sa godinama
- najčešće se meri klirensom kreatinina čija vrednost opada nakon
40 godina u proseku za 1 mL/min/ na godinu
75
Smanjanje GFR u populacije starih
GFR
(ml/min)
godine
76

dijagnostikom
Bubrežna funkcija
• većina starih osoba gubi mišićnu masu sa godinama → kreatinin u

serumu ostaje o okviru referentnih vrednosti
- ukoliko se bubrežna funkcija procenjuje preko koncentracije
kreatinina u serumu, ona će biti precenjena → potrebno je
određivati klirens kreatinina
• albumin / kreatinin odnos, u pojedinačnom uzorku urina, je koristan

u proceni bubrežne funkcije → u starih pacijenata je komplikovano
sakupljanje 24-časovnog urina
• ispitivanje renalne funkcije je od velikog značaja u doziranju u

praćenju metabolizma lekova u starih osoba!
77
1. Majkić-Singh N. Klinička hemija u pedijatriji. U: Majkić-Singh
N. Medicinska biohemija, j drugo
g izdanje,
j Društvo medicinskih
biohemičara Srbije, Beograd, 2006; 85-90. (ISBN 86-83023-
09-5)
2. Ignjatović S. Klinička hemija u pedijatriji
i gerijatriji. (slajdovi sa predavanja, pdf fajl)
78

dijagnostikom
Medicinsko biohemijska dijagnostika neuroloških
bolesti
CEREBROSPINALNA TEČNOST (LIKVOR)
Ispitivanje neuroloških bolesnika
 posledica biohemijskih metaboličkih poremećaja
 klinički neurološki i psihijatrijski pregled
klinički neurološki i psihijatrijski pregled
 morfološki, histološki, neurofiziološki,
neuroimunološki pregledi
 biohemijski pregledi telesnih tečnosti – krvi,
urina, likvora i dr.
,
1
OSNOVI NEUROANATOMIJE
 centralni deo somatskog i vegetativnog
nervnog sistema predstavljaju mozak i
kičmena moždina između kojih granicu
kičmena moždina, između kojih granicu
označavaju korenovi prvog kičmenog
živca
 kičmena moždina se kod odraslih proteže
od prvog vratnog do drugog slabinskog
p g g g g g
pršljena i ima oblik cilindrične vrpce
OSNOVI NEUROANATOMIJE
MOZAK
 mozak u širem
smislu predstavlja
il d t lj
onaj deo CNS‐a koji
se nalazi u
lobanjskoj duplji
2
MOZAK
 građen je iz velikog mozga, moždanog
stabla i malog mozga
i malog mozga
 veliki mozak je fisurom podeljen na levu i
desnu hemisferu koje imaju centralno
postavljene šupljine (bočne ili lateralne
postavljene šupljine (bočne ili lateralne
moždane komore)
11. Veliki mozak 6. Parijetalni režanj
7. Okcipitalni režanj
5. Frontalni režanj
1.Mali mozak
4. Hipofiza:
a) prednji režanj
a) prednji režanj 2. Produžena moždina
2. Produžena moždina
b) zadnji režanj 3. Kičmena moždina
8. Corpus callosum 14. Treća ventrikula
9. Talamus 15. Četvrta ventrikula
10. Most
12. Pinealno telašce
13. Forniks;.
3
Šema mozga koja prikazuje povezanost ventrikula i
subarahnoidalnog prostora sa ostatkom mozga
Sve četiri moždane komore su povezane u tzv. ventrikularni

sistem, ispunjen likvorom
4
METABOLIZAM MOZGA
 brzina metabolizma u mozgu je veća nego u
skoro svim ostalim organima u telu, ali
skoro svim ostalim organima u telu, ali
mozak gotovo nema energetskih zaliha
 mozak u potpunosti zavisi od neprekidnog
dotoka glukoze i kiseonika iz periferne krvi
5
METABOLIZAM MOZGA
 mozak koristi glukozu uglavnom u onoj količini
koliko mu energije treba
 pod običnim uslovima na ukupni moždani protok
krvi otpada 15–20% minutnog volumena srca (ili
oko 500 mL na 100 g mozga u minuti) što pokazuje
koliko je mozak ‘‘gladan’‘
koliko je mozak gladan i u kojoj meri zavisi od
i u kojoj meri zavisi od
konstantnog i brzog protoka krvi
MOŽDANICE
 mozak i kičmena moždina su obloženi jednim
zaštitnim pokrivačem, sastavljenim iz tri sloja,
odnosno tri moždanice (meninge)
 one su građene od vezivnog tkiva i između njih se
nalaze međumoždanični prostori
nalaze međumoždanični prostori
6
MOŽDANICE
MOŽDANICE
 spoljašnja
spoljašnja moždanica, tvrda
moždanica tvrda
moždanica ili dura mater je
čvrsta neelastična membrana
koja naleže uz koštani zid
lobanje i kičmenog kanala
 ima dva lista između kojih se
nalazi epiduralni prostor, a od
arachnoidea‐e je odvaja
subduralni prostor
7
MOŽDANICE
 unutrašnja moždanica,
unutrašnja moždanica
arachnoidea
 paučinaste strukture i od
meke moždanice je
odvojena
subarahnoidalnim
prostorom, kroz koji
cirkuliše likvor
MOŽDANICE
 uz
uz samu površinu CNS
samu površinu CNS‐aa
nalazi se meka moždanica,
pia mater
 sadrži krvne sudove za
mozak i kičmenu moždinu
8
Likvor ili cerebrospinalna tečnost
tečnost zastupljena u prostorima CNS‐a
Uloga likvora
1. Zaštita: “puferuje”
1 puferuje mozak
mozak
2. “Plovnost”: mozak zaronjen u tečnost (1400 g →
50 g)
3. Izlučivanje otpadnih materija
4 Endokrini medijum za mozak
4. Endokrini medijum za mozak – transport hormona
transport hormona
do drugih delova mozga
9
Neke činjenice vezane za likvor
 ukupna
ukupna količina
količina iznosi 125‐150 mL
iznosi 125‐150 mL
 ukupna produkcija iznosi 400‐500 mL (0,35 mL/min)
 kontinuirano se stvara i reabsorbuje u ventrikulama
(horoidni pleksusi)
 celokupna količina se izmeni svakih 6 do 8 sati
celokupna količina se izmeni svakih 6 do 8 sati
TOK I APSORPCIJA LIKVORA
 tečnost
tečnost nastala u bočnim
nastala u bočnim
komorama kroz Monroove
otvore prelazi u treću
komoru, tu se meša sa
likvorom koji je tu nastao, i
dalje, kroz Silvijev akvedukt
prelazi u četvrtu komoru
10
 Iz četvrte komore se
kroz tri mala otvora
kroz tri mala otvora
uliva u cisternu magnu,
smeštenu između
produžene moždine i
malog mozga, a koja se
nastavlja u
subarahnoidalni prostor
subarahnoidalni prostor
 gotovo sav likvor
cirkuliše naviše prema
cirkuliše naviše, prema
velikom mozgu
11
 iz subarahnoidalnog
prostora oko velikog
prostora oko velikog
mozga, likvor stiže do
arahnoidnih resica,
preko kojih se drenira u
vensku krv
 arahnoidne
arahnoidne resice su
resice su
razbacane duž cele unutrašnje
strane lobanje (one
predstavljaju prstolike izdanke
arachniodea‐e i više ovih
resica se obično međusobno
spajaju i stvaraju arahnoidne
granulacije koje štrče u venske
sinuse)
12
 Resice
Resice i granulacije stalnom apsorpcijom stvorenog
i granulacije stalnom apsorpcijom stvorenog
likvora održavaju njegovu zapreminu konstantnom
 Predstavljaju “ventile u jednom smeru” ‐ ukoliko je CSF
pritisak manji od venskog pritiska, NE dozvoljavaju da krv
prolazi u ventrikularni sistem
Šematski prikaz cirkulacije likvora
13
Analiza likvora (CSF)
 dobija se postupkom
lumbalne punkcije
Lumbalna punkcija
 Ek
Ekstremna opreznost
t t
 Rizik (koagulacioni
status, tumori)
 CT ili MRI
 Lokalizovana infekcija
Lokalizovana infekcija
14
Lumbalna punkcija
 Lumbalni
Lumbalni deo kičmene
deo kičmene
moždine
 Donji deo kičmene
moždine
 L4‐L5 ((kičmena moždina se
završava kod L2)
Lumbalna punkcija
 Traje oko 30 minuta
Traje oko 30 minuta
 Odgovarajući položaj
pacijenta
 Nega posle punkcije
15
Lumbalna punkcija
 Jedna trećina
Jedna trećina
pacijenata ima
postlumbalnu
glavobolju
 Najmanja igla 22G
 Posle punkcije treba
da leži
Lumbalna punkcija
• posle
posle lumbalne punkcije i pre
lumbalne punkcije i pre
uzimanja uzoraka manometrom
izmeriti pritisak CSF (normalno
iznosi 50 do 180 mm Hg)
• bez opasnosti može da se uzme
20 mL CSF, ali ako je pritisak viši
20 mL CSF, ali ako je pritisak viši
od 200 mm Hg samo 2 mL
16
Indikacije za lumbalnu punkciju
1. Dijagnoza bolesti
2. Terapija
Dijagnoza bolesti
1. Virusne i bakterijske
i bakterijske infekcije kao što su meningitis
infekcije kao što su meningitis i
encefalitis
2. Sifilis i seksualno prenosive bolesti
3. Krvarenje (hemoragije) u mozgu i kičmenoj moždini
4. Multipla skleroza
5. Guillain
Guillain‐Barre‐ov
Barre ov sindrom
sindrom
6. Tumori kičmene moždine i mozga
17
Kontraindikacije za lumbalnu punkciju
1. infekcije kože i zapaljenje tkiva na mestu
i đ j
izvođenja punkcije
k ij
2. maligna hipertenzija
3. tumori zadnje lobanjske jame ili hemisfera sa
edemom i pomeranjem masa
Lumbalna punkcija
CSF uzeti u tri sterilne epruvete i
CSF uzeti u tri sterilne epruvete i
označiti brojevima 1, 2 i 3:
1. hemijska i imunološka
određivanja
2 mikrobiološka ispitivanja
2. ik bi l šk i iti j
3. određivanje ukupnog broja i
diferencijaciju ćelija
18
Vreme izvođenja lumbalne punkcije
 purulentni meningitis  prvog i drugog dana
 virusni meningitis  trećeg do petog dana
ć d d
 tuberkulozni meningitis  prve do treće nedelje
 herpes encefalitis  petog do sedmog dana prodromalne
faze
 neuroborelioza  drugog do četvrtog dana od početka
mijalgične faze
Normalan nalaz
 Bistar i bezbojan, specifična težina neznatno
viša od vode (1,004‐1,007 g/cm3)
 Glukoza >
Gl k 22
2,2 mmol/L
l/L (~60% vrednosti u serumu)
( d )
 Proteini < 0,4 g/L – uglavnom albumin
 Broj ćelija < 4/mL limfocita, bez PMN neutrofila
 IgG < 15% ukupnih CSF proteina, bez
oligoklonalnih traka
oligoklonalnih traka
 Pritisak 50‐180 mm Hg (6‐15 cm H20)
19
MAKROSKOPSKO ISPITIVANJE
CSF
bezbojna i bistra
zamućena mutna ili krvava
zamućena, mutna ili krvava
zamućena i mutna:
 pleocitoza (leukociti > 200/L
 prisustvo mikroorganizama
 eritrocita > 400/L
it it > 400/ L
 povećana koncentracija proteina
Ružičasto crvena CSF
‐ ukazuje na prisustvo krvi ‐
 subarhnoidalna ili intracerebralne
hemoragija
 zbog traumatizacije pri punkciji
20
Razlikovanje hemoragije od
traumatizacije
 traumatizacija daje maksimalnu količinu
daje maksimalnu količinu
krvi u prvoj epruveti koja progresivno
opada sa narednim epruvetama
 kod subarahnoidalnog krvarenja ista
količina krvi u sve tri epruvete
količina krvi u sve tri epruvete
Razlikovanje hemoragije od traumatizacije
posle centrifugiranja CSF je:
1. bistra u slučaju traumatizacije

2. ksantohromna u slučaju subarhnoidalnog
krvarenja
ružičasta ili žuta
ili žuta usled razgradnje hemoglobina
usled razgradnje hemoglobina
21
Ružičasta ili žuta usled razgradnje hemoglobina
 u toku prva 3 sata od početka krvarenja CSF može da
p p j
bude bistra
 liza eritrocita počinje 2‐4 sata posle početka krvarenja
(svetlo narandžasta boja supernatanta usled
oslobađanja oksihemoglobina)
 u toku 24 sata hemoglobin prelazi u bilirubin i
g p
supernatant je žućkast (biliarhija je maksimalna 36‐og
sata i održava se nekoliko nedelja)
MAKROSKOPSKO ISPITIVANJE
stvaranje ugruška
 u slučaju traumatizovanog krvarenja
 u slučaju jako visoke koncentracije
proteina
22
Ispitivanje izgleda
 u staklenoj epruveti
 poredi se
poredi se sa čistom vodom u drugoj
sa čistom vodom u drugoj
staklenoj epruveti
 pod belom svetlošću i naspram čiste bele
pozadine
 u epruvetama mora biti najmanje 1 mL
u epruvetama mora biti najmanje 1 mL
tečnosti
DIJAGNOZA OBOLJENJA CNS‐a
četiri odvojena prostorna dela
1. intravaskularni
2. intraćelijski
3. ekstraćelijski
4. CSF prostor
23
Četiri odvojena prostorna dela
1. intravaskularni prostor lumena kapilara i venula u
parenhimu, horoidnim pleksusima i leptomeningama
2. intraćelijski prostor nerava i glija ćelija
3. ekstraćelijski prostor između nerava i glija ćelija
4. CSF prostor (ventrikule, bazalne cisterne i
subarahnoidalni)
Razmena zavisi od barijera
1. krv ‐ mozak
2. krv ‐ CSF
3. Intra ‐ ekstraćelijska
24
Krv ‐ mozak barijera
 Transendotelna razmena
lipofilnih supstanci
 Različti specifični nosači
Krv ‐ CSF barijera
 filtracija primarne CSF u pleksuse
filtracija primarne CSF u pleksuse
 de novo intratekalna sinteza
 aktivni transport
 specifična apsorpcija
 relativno permeabilna za hidrofilne
molekule (2‐makroglobulin i IgM)
 korelacija između CSF/serum odnosa i
hidrodinamskog prečnika molekula
 dozvoljen prolaz lipofilnih molekula do
500 Da
25
CSF PROTEINI
1. Iz seruma
2. Lokalnog porekla
3. Parenhima mozga
Proteini poreklom iz seruma
(83%)
 albumin (dobar marker krv‐CSF barijere pošto potiče
isključivo iz seruma)
 1‐kiseli glikoprotein
 1‐antitripsin
 hemopeksin
 2‐HS‐glikoprotein
 transferin
26
Proteini lokalnog porekla
 prostaglandin‐D‐sintetaza
 transtiretin (prethodno prealbumin)
 ‐transferin
 cistatin C
Proteini parenhima mozga
manji dijagnostički značaj
 S100 protein
 kiseli glia fibrilarni protein
 mijelin bazni protein
 neuronska acetilholin esteraza
 neuron‐specifična enolaza
27
DETEKCIJA INTRATEKALNE SINTEZE
IMUNOGLOBULINA
 omogućava razlikovanje između Ig koji potiču iz
ć lik j i đ I k ji ič i
seruma u odnosu na one lokalno sintetizovane
 tj. razlikovanje povišenja Ig kao rezultat disfunkcije
barijere u odnosu na lokalnu sintezu
barijere u odnosu na lokalnu sintezu
DETEKCIJA INTRATEKALNE SINTEZE
IMUNOGLOBULINA
 Poređenje imunoglobulinia (Ig) seruma i likvora
 Intratekalno sintetizovani Ig predstavljaju izolovani odgovor
mikroorganizama ili autoantigena i stoga se razlikuju od Ig
seruma po: / odnosu, izgledu elektroforetskog
naelektrisanja, sastavu klase Ig i antigenskoj specifičnosti
 Razlikuju
Razlikuju se dodatno prisutne
se dodatno prisutne "oligoklonalne"
oligoklonalne trake,
trake
naročito u alkalnom opsegu pri IEF
28
Broj oligoklonalnih traka u CSF
• ako
ako su dve ili više traka prisutne u Ig regionu CSF
su dve ili više traka prisutne u Ig regionu CSF
a nisu prisutne u Ig regionu u serumu – pacijent
ima pozitivne oligoklonalne trake
• potvrda lokalne produkcije ologoklonalnog IgG u
CSF
• ukazuje na produkciju u CNS
ukazuje na produkciju u CNS
• izoelektrično fokusiranje i imunofiksacija
57
normalno
intratekalna IgG sinteza
sistemska imuna reakcija
monoklonski IgG
Isoelectric focusing on agarose gels with immunoblotting. Note that all the oligoclonal
bands present are due to IgG. There are 5 classic patterns: type 1, no bands in
cerebrospinal fluid (CSF) and serum (S) sample; type 2, oligoclonal IgG bands in CSF,
not in the S sample,
sample indicative of intrathecal IgG synthesis; type 3, 3 oligoclonal bands in
CSF (like type 2) and additional identical oligoclonal bands in CSF and the S sample
(like type 4), still indicative of intrathecal IgG synthesis; type 4, identical oligoclonal
bands in CSF and the S sample illustrative of a systemic not intrathecal immune
reaction, with a leaky or normal or abnormal blood–CSF barrier and oligoclonal bands
passively transferred in the CSF; and type 5, monoclonal bands in CSF and the S
sample; this is the pattern seen owing to the presence of a paraprotein (monoclonal
IgG component)
58
29
POREMEĆAJI KRV‐CSF BARIJERE
normalan odnos albumina (Ralb) u CSF i u serumu iznosi:
7 x 10‐3
 klasifikacija poremećaja (nezavisno od uzroka):
1. Blag
2. Srednji
3. Težak
POREMEĆAJI KRV‐CSF BARIJERE
1. blag (Ralb do 10 x 10‐3) ‐ multipla skleroza, hronični HIV
encefalitis, Herpes zoster ganglionitis
2. srednji (Ralb do 20 x 10‐3) ‐ virusni meningitis,
dijabetična polineuropatija, infarkt mozga
3. težak
 (Ralb od 20 do 50 x 10‐3) ‐ Guillain‐Barre polineuritis, Herpes
simplex polineuritis
 (Ralb od 50 x 10‐3) ‐ tuberkulozni i purulentni meningitis
30
Disfunkcija barijere
tj. povećan Ralb
1. povećanja permeabiliteta (u virusnom
meningitisu)
2. opstrukcije protoka CSF
opstrukcije protoka CSF (tumori kičmene
(tumori kičmene
moždine)
Razlikovanje povećanja permeabiliteta od opstrukcije
Intracelularna adheziona molekula‐1

Intracelularna adheziona molekula 1 (ICAM
(ICAM‐1)
1)
protein endotelijalnih ćelija
 ekspresija izvana IL‐1, TNF i IFN u toku rane faze
i fl
inflamatornih procesa
t ih
 visoka intratekalna koncentracija
31
Disfunkcija barijere – ICAM indeks
do 0,7  neinflamatorne bolesti CNS‐a
1,0  multipla skleroza
1,5 ‐ 1,7  meningitis
ĆELIJE CSF‐a
 oštećenje krv‐CSF barijere usled akutnih i
subakutnih inflamatornih procesa u CNS‐u dovodi
do povećanog broja ćelija (pleocitoze); ne govori
uvek da je došlo do inflamacije
 Ralb
lb je osetljiv dijagnostički parametar, ali je
je osetljiv dijagnostički parametar ali je
povećan i kod neinflamatornih bolesti
32
Tipovi pleocitoze
1 Granulocitna
1.
2. Limfocitna
3. Mešani tip (granulociti, limfociti,
monociti)
4. Monocitna
1. granulocitna (više od 50% svih leukocita)
u toku akutne inflamatorne faze bakterijskog
meningitisa sa 100 do 1000 puta povećanjem
2. limfocitna (više od 85% svih leukocita)
kod virusnog meningitisa (100‐1000 puta
p
povećanje broja leukocita) i u toku
j j )
proliferativne faze bakterijskog meningitisa
33
3. mešani ćelijski tip (granulociti, limfociti, monociti u
istom odnosu)
tuberkulozni ili sifilistički meningitis (manje od 100 do
nekoliko stotina puta povećanje broja leukocita)
4. monocitna (monociti i limfociti)
sekundarna meningealna iritacija različitog uzroka (npr.
hemoragije)
Aktivirani B limfociti
 indukovani mikroorganizmima nervnog sistema
 u akutnim inflamatornim bolestima (do 180/L)
 multipla skleroza (<10/L)
34
MARKERI TKIVNE DESTRUKCIJE
NEURON‐SPECIFIČNA
NEURON SPECIFIČNA ENOLAZA (NSE)
ENOLAZA (NSE)
 marker procene toka karcinoma "malih ćelija“ bronhija
 medularnog karcinoma tiroideje
 neuroblastoma
NEURON‐SPECIFIČNA ENOLAZA ‐ CSF
 manje od 1% NSE u CSF potiče iz krvi; nije značajna kod blagih
manje od 1% NSE u CSF potiče iz krvi; nije značajna kod blagih
poremećaja barijere
 infarkt mozga; značajno povećanje (> 10 ng/mL); pik trećeg do petog
dana
 Creutzfeldt‐Jakob‐ovo oboljenje; važan marker za razlikovanje od
j j ; j
drugih moždanih kortikalnih oboljenja, posebno u ranoj fazi; > 30
g/mL; u slučaju češće Alzheimer‐ove bolesti vrednosti su normalne,
tj. < 10 g/L
35
NEURON‐SPECIFIČNA ENOLAZA ‐ serum
 infarkt mozga; povećanje u toku nekoliko sati > 20 g/mL; pik se
ne postiže do drugog ili trećeg dana bolesti i u korelaciji je sa
ne postiže do drugog ili trećeg dana bolesti i u korelaciji je sa
veličinom infarkta mozga (ovo ima malu prognostičku vrednost
pošto je lokalizacija infarkta mnogo važnija od njegove veličine);
ovo ne važi u slučaju difuznog oštećenja korteksa praćeno
kardiačnim arestom i mataboličkom komom; vrednosti veće od
100 g/L ukazuju na lošu prognozu
MARKERI MIKROGLIJA/MAKROFAGE SISTEMA
 2‐mikroglobulin
 govori o aktivaciji T ćelija, indikator funkcionalne
aktivnosti mikroglija sistema
 manje od 1% koncentracije u CSF potiče iz seruma, 99%
intratekalnog porekla
 kod zdravih koncentracija je < 2mg/L
k d d ih k ij j 2 /L
 dobar marker HIV infekcije sa učešćem u CNS‐u;
indikativna koncentracija  2 mg/L
36
MARKERI MIKROGLIJA/MAKROFAGE SISTEMA
 neopterin
 govori o aktivaciji makrofaga, indikator funkcionalne
aktivnosti makrofagnog sistema
 2,5% koncentracije u CSF potiče iz seruma, 97,5%
intratekalnog porekla
 kod zdravih koncentracija je < 5 mol/L
 dobar marker HIV infekcije sa učešćem u CNS‐u;
indikativna koncentracija > 20 mol/L
MARKERI IMUNE AKTIVACIJE I PROCESA
 markeri imunološki posredovanih inflamatornih
procesa u multiploj sklerozi
 TNF
 ICAM‐1; u krvi i CSF kao "solubilni" ICAM
 ICAM‐1; u krvi i CSF kao "solubilni" ICAM
;
 IL‐10
 TNF‐R
37
LABORATORIJSKA ODREĐIVANJA U CSF‐u
 Rutinska
 CSF pritisak
 Ukupan broj ćelija
 Diferencijalni broj ćelija
 Glukoza (odnos CSF/serum)
/
 Proteini
LABORATORIJSKA ODREĐIVANJA U CSF‐u
 u određenim stanjima
 Kulture (bakterijske, gljivice, virusi, Mycobacterium
( j ,gj , , y
tuberculosis)
 Gram‐bojenja
 Gljivični i bakterijski antigeni
 Citologija
 Elektroforeza proteina
 VDRL test za sifilis
 D‐dimer
38
METODE ZA ODREĐIVANJE PROTEINA U CSF‐u
 Turbidimetrijske metode: trihlorsirćetna kiselina,
sulfosalicilna kiselina, natrijum sulfat
lf li il ki li t ij lf t
 popularne, jednostavne, brze, ne zahteva specijalnu
opremu, temperaturno zavisne, potrebna veća
količina uzorka
METODE ZA ODREĐIVANJE PROTEINA U CSF‐u
 Kolorimetrijske metode:
1. metoda po Lowry‐u
2. metode zasnovane na vezivanju boje: CBB i
Ponceau S
 CBB:
CBB: brza i visoko osetljiva, mala količina
brza i visoko osetljiva, mala količina
uzorka
 referentni opseg: 15‐45 mg/L
39
ODREĐIVANJE ALBUMINA I Ig G
 Imunohemijska određivanja
 albumin, Ig G
 Kolorimetrijsko određivanje
 albumin
Permeabilnost krv‐mozak barijere
 CSF/serum albumin indeks =
albuminCSF mg/dL
albuminserum g/dL
 manji od 9 (ili odnos ispod 0,009) krv‐mozak
j j
barijera je intaktna
 9‐14 slabo oštećenje
 14‐30 srednje oštećenje
 30‐100 teško oštećenje
40
Intratekalna sinteza
1. CSF/serum IgG odnos
 normalno iznosi 1:390, odnosno 0,003
normalno iznosi 1:390, odnosno 0,003
2. CSF/serum IgG indeks (CSF IgG u mg/dL)
 normalno iznosi 3‐8
 povećan i usled intratekalne sinteze i povećanog
prelaza zbog oštećenja krv‐mozak barijere
DRUGI CSF PROTEINI
1. 2‐MIKROGLOBULIN
 više od 1,8 mg/L u slučaju leptomeningealne
više od 1,8 mg/L u slučaju leptomeningealne
leukemije i limfoma
2. C‐REAKTIVNI PROTEIN
 povišen nivo za razlikovanje bakterijskog od virusnog
meningitisa
 slaba osetljivost
41
GLUKOZA
 normalno 2,8‐4,4 mmol/L (60% vrednosti u
serumu)
 CSF/serum glukoza odnos varira od 0,3 do 0,9
CSF/ l k d i d03d 09
 hipoglikorahija (ispod 2,2 mmol/L): bakterijski,
tuberkulozni i gljivični meningitis; normalni nivo
ne isključuje ove bolesti
 povišene vrednosti su bez kliničkog značaja
iš d ti b kli ičk č j
ENZIMI
1. LDH
 normalno 40 U/L; novorođenčad 70 U/L
 za razlikovanje traumatske punkcije od
intrakranijalne hemoragije
 više vrednosti u slučaju bakterijskog
meningitisa u odnosu na aseptični
2. CK
 normalno 5 U/L (uglavnom CK‐BB)
 CK‐BB u prognozi oštećenja mozga zbog
ishemije ili anoksije
42
SEROZNE TEČNOSTI
SEROZNE MEMBRANE
 Serozan: stvaranje telesne tečnosti od
plazme
l
 Zatvorene telesne šupljine, odnosno organi
kao što su pluća, srce i peritoneum su
okruženi jjednoćelijskom
j DVOSLOJNOM
membranom (serozna membrana)

SEROZNE MEMBRANE
pluća, srce i peritoneum su okruženi

jednoćelijskom dvoslojnom membranom
SEROZNA MEMBRANA
Sastavljena je od:
1. Parijetalne membrane
 spoljašnja, naleže na zid organa, oblaže zid šupljine
2. Visceralne membrane
 unutrašnja, naleže na organ, prekriva organe u šupljini

Formiranje serozne tečnosti
• ultrafiltrat plazme i stvara se iz bogate mreže
kapilara u seroznoj membrani
• stvaranje je kontinuiran proces
• stvaranja zavisi od kapilarnog hidrostatičkog
pritiska, onkotskog (koloidnog) pritiska
plazme i permeabilnosti kapilara
• smanjuje ili eliminiše trenje koje nastaje

širenjem i kontrakcijom organa
Vrste seroznih tečnosti
• Pleuralna
(po 15 mL u svakoj pleuralnoj šupljini)
• Perikardijalna
(10-50 mL)
• Peritonealna (ascitna tečnost)
(50 mL)

Tečnost za laboratorijsku analizu se dobija
aspiracijom iz odgovarajuće šupljine
• toracenteza - pleuralna tečnost
• perikardiocenteza - perikardijalna tečnost
• paracenteza - peritonealna tečnost
• uzorke krvi treba uzimati u isto vreme sa

aspiracijom odgovarajuće tečnosti
Patološko stvaranje
EFUZIJA (IZLIV)
 poremećaj mehanizama formiranja i

reapsorpcije seroznih tečnosti
 dovodi do povećanja zapremine tečnosti
između membrana
 TRANSUDATI I EKSUDATI – klasifikacija

uzroka efuzije
8

Uzroci nastanka efuzija
1. povećan hidrostatski pritisak u kapilarima

( l d kkongestivne
(usled ti srčane
č insuficijencije)
i fi ij ij )
2. smanjen onkotski pritisak (kod
hipoproteinemije usled ciroze jetre ili
malnutricije)
3 povećana propustljivost kapilara
3.
(inflamacija i infekcija)
4. opstrukciju toka limfe (tumori)
9
Klasifikacija uzroka efuzije –

klasifikacija u kategoriju transudata ili eksudata
• Transudati
posledica sistemskog poremećaja koji remeti
ravnotežu u tečnosti (↑ hidrostatskog pritiska ili ↓
koloidno-onkotskog pritiska)
• Eksudati
u stanjima kada je ↑ permeabilitet kapilara ili kod
opstrukcije limfne drenaže (u stanjima u kojima su
direktno zahvaćene membrane odgovarajuće šupljine, kao
što su infekcije i maligniteti)
10

Razlikovanje transudata i eksudata
• prvi dijagnostički korak i pomoć u daljim

laboratorijskim ispitivanjima
ispitivanjima, zato što obično
nema potrebe za daljom analizom transudata
• veliki broj testova se koristio (izgled, koncentracija
ukupnih proteina, LDH, broj ćelija i sposobnost
koagulacije)
• najpouzdanija diferencijacija se postiže
određivanjem odnosa koncentracija proteina i
aktivnosti LDH u punktatu i u krvi
11
Laboratorijska ispitivanja zajednička

za sve serozne tečnosti
• klasifikacija transudata i eksudata

• Izgled
• ukupan i diferencijalan broj ćelija
• biohemijska, mikrobiološka i citološka
ispitivanja
12

Razlikovanje transudata od eksudata
• Transudati:
relativna gustina <1,015
koncentracija ukupnih proteina <30 g/L
• Eksudati:
relativna gustina >1,015
koncentracija proteina ≥30 g/L
• samo određivanje ukupnih proteina kao jedini kriterijum

za razlikovanje eksudata i transudata, u 15% slučajeva
može doći do pogrešne klasifikacije efuzija
• potrebni su dodatni kriterijumi u klasifikaciji 13
Laboratorijska diferencijacija
transudata i eksudata
Eksudati
Transudati
Izgled bistar zamućen
[proteini]punktat/[proteini]serum <0,5 >0,5
[LDH]punktat/[LDH]serum <0,6 >0,6
Broj leukocita <1000/μL >1000/μL
Spontana koagulacija ne moguće
[h l t l]pleuralni punktat
[holesterol] <1,16
1 16 – 1,55
1 >1,16
1 16 – 1,55
1
[holesterol]pl. punktat/[holesterol]serum <0,3 >0,3
[bilirubin]pl. punktat/[bilirubin]serum <0,6 >0,6
Serum-ascit albumin gradijent >1,1 <1,1
14

PREPORUČENI TESTOVI U SEROZNIM TEČNOSTIMA
1. razlikovanje transudativne od eksudativne efuzije

2. identifikacija maligniteta ili infekcije u eksudativnoj
efuziji
3. postavljanje specifične dijagnoze
15
PREPORUČENI TESTOVI U SEROZNIM TEČNOSTIMA
• efuzije eksudativnog porekla prolaze mikrobiološka i

citološka ispitivanja
• broj eritrocita i leukocita ima malu dijagnostičku vrednost
• uopšte: broj leukocita >1 000/μL i eritrocita >100 000/μL
ukazuje na eksudat
• brojanje ćelija u seroznim tečnostima može da se radi
manuelno, u Neubauer-ovoj komori ili na hematološkim
brojačima. (voditi računa da debri ne zapuši aparat)
• diferencijalni broj ćelija se rutinski izvodi
• razmaze treba analizirati ne samo na prisustvo leukocita,
već i normalnih i malignih ćelija tkiva
• svaku sumnjivu ćeliju treba da pogleda patolog u
citološkoj laboratoriji
16

PLEURALNA TEČNOST
• dobija se iz pleuralne šupljine, koja se nalazi
između parijetalne pleuralne membrane
membrane, koja
oblaže zid grudnog koša, i visceralne pleuralne
membrane, koja prekriva pluća
• pleuralne efuzije mogu biti:

– transudati
t d ti
– eksudati
17
PLEURALNA TEČNOST
 dobija se hirurškom punkcijom grudnog koša –

toracentezom
 između parijetalnog i visceralnog lista pleure normalno se
nalazi oko 1-15 mL čiste, serozne tečnosti koja omogućava
lako pokretanje pluća delujući kao lubrikans
 pleuralnu tečnost normalno produkuje parijetalna, a
absorbuje visceralna pleura
 kontinuiran proces
 zapremina pleuralne tečnosti koja se dnevno filtrira i
resorbuje može biti veća od 1 litra
18

PLEURALNA TEČNOST
• pleuralni izliv se obično javlja u brojnim plućnim i

drugim
g oboljenjima
j j i to često kao jjedina
manifestacija oboljenja
• kratak dah, bol u grudima i kašalj su karakteristični

klinički simptomi
19
TORACENTEZA
 indukovana u slučaju
nedijagnostikovane efuzije
ili u terapeutske svrhe
 u heparinizarne epruvete
 EDTA za broj i
diferencijaciju ćelija
 normalno pleuralna tečnost
je transudat
20

Pleuralna tečnost se klasifikuje kao eksudat:
1. koncentracija proteina  30 g/L
2. specifična težina > 1,015 g/mL
3 odnos
3. d kkoncentracije
t ij proteina
t i u ttečnosti
č ti prema
koncentraciji u serumu  0,5
4. odnos aktivnosti LDH u tečnosti prema aktivnosti u
serumu  0,6 (marker permeabilnosti kapilara)
5. zamućen (transudati su bistri)
6. obično dolazi do zgrušavanja (transudat ne
zgrušava)
7. koncentracija glukoze je < 3,33 mmol/L (kod
transudata je ista kao u serumu)
21
DODATNI KRITERIJUMI ZA KLASIFIKACIJU

PLEURALNE TEČNOSTI KAO EKSUDAT
1. koncentracija holesterola u tečnosti >

1,55 mmol/L
2. odnos koncentracije holesterola u
tečnosti prema koncentraciji u serumu
 0,3
3. odnos koncentracije bilirubina u
tečnosti prema koncentraciji u serumu
 0,6
22

PREPORUČENI TESTOVI U
PLEURALNOJ TEČNOSTI
1. Rutinski
2. Korisni za većinu pacijenata
3. Korisni u izvesnim situacijama
23
1. Rutinski
 makroskopski pregled
 pleuralna tečnost/serum odnos proteina
 pleuralna tečnost/serum odnos LDH
 pregled obojenog razmaza
24

2. Korisni za većinu pacijenata

 bojenja i kulture mikroorganizama
 citologija
 holesterol u pleuralnoj tečnosti
 pleuralna tečnost/serum odnos holesterola
p
25
3. Korisni u izvesnim situacijama
 pH
 laktat
 amilaza
 pleuralna biopsija
 određivanje lipida
 imunološka određivanja
 tumorski markeri
 pleuralna tečnost/serum odnos bilirubina 26

MAKROSKOPSKI PREGLED
 Transudati:
 bistri
 bledo žuti
 bez mirisa
 ne koagulišu
 Eksudati:
Ek d ti
 zamućeni
 uvek koagulišu bez heparina
 neprijatnog mirisa u slučaju anaerobnih infekcija
27
 krvava pleuralna efuzija: (hematokrit > 1%)

 ukazuje
k j na ttraumu
 malignitet
 pulmonalnu infekciju
 ukoliko je hematokrit > 50% ukazuje na hemotoraks -
prisustvo krvi u pleuralnom punktatu (traumatska povreda),
oštećenje membrana koje se javlja u malignitetima ili kod
traumatske aspiracije; krv koja potiče od traumatske
aspiracije nije ravnomerno prisutna u uzorku i koaguliše u
toku nekoliko minuta;
28

Komplikacije toracenteze
 Hemotoraks (prisustvo krvi u

pleuralnom punktatu)
 Pneumotoraks (nakupljanje
vazduha u pleuralnoj šupljini
koje nastaje kao posledica
prekida kontinuiteta visceralne
ili parijetalne pleure)
29
• mlečan izgled - posledica izlaska limfe iz ductus
thoracicus-a ((hilotoraks)) ili p
pseudohilusnogg materijala
j
koji nastaje u hroničnoj inflamaciji (pseudohilotoraks)
• limfa sadrži visoku koncentraciju triglicerida i
hilomikrona, dok pseudohilusni materijal ima višu
koncentraciju holesterola
• bojenje Sudan III bojom je pozitivno u prisustvu hilusnog
materijala
• pseudohilusne
d hil efuzije
f ij sadrže
d ž kkristale
i t l h
holesterola
l t l
30

Korelacija izgleda pleuralnog punktata i prisustva bolesti
bistar, bledo žut normalno

zamućen, beo bakterijska infekcija (tuberkuloza)
krvav hemotoraksHemoragijska efuzija,
efuzija plućna embolija
embolija, tuberkuloza,
tuberkuloza malignitet
mlečan izlazak limfe iz ductus thoracicus-a
pseudohilusni materijal poreklom od hronične inflamacije
braon ruptura amebnog apscesa jetre
crn aspergiloza
viskozan maligni mezoteliom (povišena koncentracija hijaluronske kiseline), piotoraks
purulentan infektivna stanja (empijem)
zelenkast povećan sadržaj žuči usled perforacije jetre (holotoraks) ili apscesa
žuto-zelen, mutan reumatoidne efuzije
mutan serozni
mutan, ako je posle centrifugiranja supernatant bistar – povećan broj ćelija
ako je posle centrifugiranja supernatant mutan – povećan sadržaj lipida
gnjio miris sekundarni empijem uzrokovan anaerobnom infekcijom
31
 zamućena, mlečna ili krva efuzija
posle centrifugiranja nepromenjena: hilozna ili
psudohilozna
d hil efuzija
f ij
 trigliceridi > 1,24 mmol/L i hilomikroni prisutni
prilikom elektroforeze lipoproteina: hilozna
efuzija
 trigliceridi < 0,56 mmol/L i hilomikroni nisu
prisutni:
i i pseudohilozna
d hil efuzija
f ij
32

Razlikovanje hilusnih i pseudohilusnih
pleuranih efuzija
Hilusna efuzija Pseudohilusna efuzija
Uzrok Izlazak iz ductus thoracicus-a Hronična inflamacija

Izgled Mlečan/beo Mlečan/zelenkast
Leukociti Domoniraju limfociti Mešovite ćelije
Kristali Odsutni Prisutni
holesterola
Trigliceridi >1,24 mmol/L <0,56 mmol/L
Bojenje Jako pozitivno Negativno/slabo pozitivno

Sudan III
33
BIOHEMIJSKA ODREĐIVANJA
1. protein - samo zbog razlikovanja transudata od eksudata
2. glukoza - za razlikovanje; niska koncentracija može da

ukaže na efuziju izazvanu malignitetom, tuberkulozom,
lupus pleuritis, rupturu ezofagusa
3 laktat - > 10 mmol/L ukazuje na infektivni pleuritis

3.
34

5. enzimi – amilaza i adenozin deaminaza (ADA)
- ukoliko je amilaza 1,5 do 2 puta viša od vrednosti u serumu ukazuje na pankreatitis, rupturu ezofagusa i
malignu
li efuziju
f ij
- aktivnost ADA>40 U/L je veoma indikativno za prisustvo tuberkuloze, ali takođe nalazi se i kod
maligniteta
5. pH - normalno iznosi 7,64

6. lipidi - trigliceridi i elektroforeza lipoproteina
7. tumorski markeri - detakcija tumorskih markera CEA, CA-125
(metastatskim karcinomom uterusa),
uterusa) CA15-3
CA15 3 i CA549 (karcinom dojke) i
CYFRA 21-1 (karcinom pluća) daju dodatnu dijagnostičku informaciju kod
efuzija malignog porekla
35
Lajtovi kriterijumi
• postoji značajno preklapanje u koncentraciji proteina u
eksudatima i transudatima, što dovodi do pogrešne
klasifikacije uzoraka tečnosti u oko 30% slučajeva
(koncentracija proteina u transudatima može da se kreće
10-47 g/L, a u eksudatima 10-63 g/L)
• u kliničkoj praksi kao kriterijum u klasifikaciji pleuralnog
izliva, koriste Light-ovi kriterijumi zasnovani na
istovremenom određivanju proteina i LDH u
pleuralnoj tečnosti i serumu
36

Lajtovi kriterijumi
1. Odnos koncentracije proteina u pleuralnoj tečnosti i serumu veći od 0,5
2. Odnos aktivnosti LDH u pleuralnoj tečnosti i serumu veći od 0,6
3. Aktivnost LDH u pleuralnoj tečnosti veći od 2/3 gornje granice referentne
aktivnosti LDH u serumu
Ukoliko je najmanje jedan od navedena tri kriterijuma

zadovoljen, izliv se smatra eksudatom.
37
Lajtovi kriterijumi
• tačna identifikacija eksudata u 98% slučajeva, a
transudata u 77% slučajeva j
• problem pri identifikaciji transudata uzrokovanog
kongestivnim oboljenjem srca kod pacijenata koji su na
terapiji diureticima (što terapija duže traje, pleuralna
tečnost sve više podseća na eksudat)
• u tim slučajevima, kada klinička slika ukazuje na
transudat, a Lajtovi kriterijumi na eksudat, trebalo bi
istovremeno odrediti koncentraciju albumina u serumu i
u pleuralnoj tečnosti; ukoliko je razlika veća od 12 g/L,
pleuralni izliv predstavlja transudat
38

HEMATOLOŠKA ISPITIVANJA
• diferencijalni broj ćelija je klinički najznačajniji
• ćelije koje se primarno nalaze u pleuralnom punktatu su:
– neutrofili
– limfociti
– eozinofili
– mezotelijalne ćelije
– plazma ćelije
– maligne ćelije
• povećan broj neutrofila ukazuje na bakterijsku infekciju
infekciju,
kao što je pneumonija
• roj neutrofila se takođe povećava i kod efuzija koje
nastaju usled pankreatitisa i infarkta pluća
39
Algoritam ispitivanja pleuralnog punktata
izgled → mlečan → trigliceridi

↓
krvav
↓
hematokrit
40

Određivanje proteina i LDH
↓
odnos punktat/serum protein >0,5
odnos punktat/ serum LDH>0,6
aktivnost LDH u punktatu >2/3 gornje granice referentnog intervala u serumu
↓
pozitivan nalaz za jedno od gore navedenih ispitivanja
↓
1. ako ne postoji, punktat je transudat
2. ako postoji, punktat je eksudat
↓ 41
određivanje glukoze, ADA, leukocita i diferencijalnog broja, amilaze i pH
određivanje glukoze, ADA, leukocita i diferencijalnog broja, amilaze i pH
↓
1. Ako je ADA>40 U/L, određuje se ukupan i diferencijalni broj leukocita.
Nalaz limfocitoze ukazuje na tuberkulozu. Nalaz >300/μL granulocitoze
ukazuje na bakterijsku infekciju.
2. Ako je aktivnost amilaze povišena, radi se o pankreatitisu.
3. Ako je pH<7,2, ukazuje na moguću potrebu za postavljanjem drena. Ako je

pH<6,0, to ukazuje na rupturu ezofagusa.
42

Značaj hemijskog ispitivanja pleuralne tečnosti
Test Značaj
Glukoza ↓ ↓ ↓↓ ↓ ↓ Smanjena u reumatoidnoj inflamaciji
Smanjena kod purulentne infekcije
Laktat Povišen kod bakterijske infekcije
Trigliceridi Povišeni u hilusnim efuzijama
pH Smanjen u pneumoniji koja ne odgovara na antibiotike
Značajno snižen kod rupture ezofagusa
ADA Povišena u tuberkulozi i malignitetima
Amilaza Povišena u pankreatitisu,
pankreatitisu kod rupture ezofagusa i maligniteta
43
PERIKARDIJALNA TEČNOST
• između perikardijalnih seroznih membrana normalno se

nalazi mala količina tečnosti (10–50 mL)
• perikardijalne efuzije su primarno rezultat promena u
propustljivosti membrana usled infekcije (perikarditis),
maligniteta i eksudata nastalih usled traume
• metabolički poremećaji (uremija, hipotiroidizam i autoimune
bolesti) su primarni uzrok nastanka transudata
• na prisustvo efuzija se sumnja kada se pri pregledu utvrdi
prisustvo kompresije (tamponade) srca
44

PERIKARDITIS
45
Nije ustanovljen kriterijum za razlikovanje

transudata od eksudata!
46

PERIKARDIOCENTEZA
 sterilna aspiracija iglom
47
 normalna tečnost je bistra i bledo žute boje
 velike efuzije (>350 mL):
– malignitet (zamućena tečnost)
– uremija (bistra i boje slame tečnost)
– AIDS
– idiopatski uzroci
 hemoragijska efuzija:
– ukoliko
k lik jje h
hematokrit
t k it iisti
ti kkao i periferne
if kkrvi,i ukazuje
k j na
aspiraciju krvi iz srca
– ukoliko je niži ukazuje na hemoragijsku efuziju
 mlečan izgled:
– ukazuje na hiloznu ili pseudohiloznu efuziju 48

• perikardijalne efuzije – uzrok:
– oštećenje perikardijalnih membrana
– povećana propustljivost kapilara
• u akutnom perikarditisu - fibrozni eksudat ometa vensku i

limfnu drenažu i podstiče dalji nastanak efuzije
• identifikovanje uzroka perikardijalnih efuzija:

– ehokardiografija
49
PERIKARDIJALNA TEČNOST - UZROCI

• infektivni agensi - odgovorni za perikarditis, virusi iz grupe Coxackie
• purulentne bakterijske i tuberkulozne efuzije - danas se ređe sreću
• renalna insuficijencija sa uremijom
• efuzije povezane sa postinfarktnim (Dreslerovim) sindromom
• ruptura srca ili akutna disekcija aorte - brzo stvaraju krvave efuzije i
tamponadu srca
• metastatski tumori, retko-primarni tumori perikarda (mezoteliomi)
• karcinomi pluća i dojke, zajedno sa limfomima i leukemijama - uzroci
sekundarnih malignih efuzija
• traumatske perikardijalne efuzije izazvane probodnim ranama ili „crush
crush“
povredama mogu često dovesti do tamponade srca
50

Laboratorijska ispitivanja
• razlikovanje
j transudata i eksudata:određivanje j odnosa
punktat/serum za proteine i LDH
• broj leukocita ima mali klinički značaj, iako vrednost
>1000/μL sa velikim procentom neutrofila može da
ukazuje na bakterijski endokarditis
• citološko ispitivanje na prisustvo malignih ćelija je važan
deo analize
• ćelije koje se najčešće sreću rezultat su prisustva
metastatskih karcinoma pluća i dojke i liče na one koje
se nalaze u pleuralnoj tečnosti
• koncentracija tumroskih markera u perikardijalnoj
tečnosti je u korelaciji sa citološkim ispitivanjima
51
1. proteini - niska dijagnostička vrednost

2. glukoza - koncentracija < 2,22 mmol/L može da ukaže na
b k ij k tuberkuloznu,
bakterijsku, b k l reumatsku
k ili malignu
li efuziju
f ij
3. pH - < 7,1 ukazuje na reumatske ili purulentne uslove
4. lipidi - trigliceridi, holesterol i elektroforeza lipoproteina za
razlikovanje hiloznih od pseudohiloznih efuzija
5. enzimi - aktivnost od 40 U/L adenozin deaminaze
ukazuje na tuberkulozni perikarditis
52

PERITONEALNA TEČNOST
• peritonealna šupljina nije prava šupljina, već to postaje u
prisustvu bolesti koja
p j izaziva akumulaciju
j tečnosti u njoj
j j
• akumulacija tečnosti između peritonealnih membrana se
naziva ascites, i tečnost se obično i naziva ascit, a ne
peritonealna tečnost
• uzroci nastanka ascitnih transudata:
– bolesti jetre (ciroza) su česti
• uzroci nastanka eksudata:
– bakterijske infekcije (peritonitis), koje su čest uzrok perforacije
creva ili rupture apendiksa
– maligniteti
53
PERITONEALNA TEČNOST
 u peritonealnoj šupljini je prisutno do 50 mL

tečnosti
 nema dobro definisanih laboratorijskih

kriterijuma za razlikovanje transudata od
eksudata
k d t
54

PARACENTEZA
dijagnostička paracenteza:
 u slučaju pojave ascitesa, kao

i u slučaju da kod postojećeg
dolazi do brzog
nagomilavanja nove tečnosti
55
Peritonealna lavaža
• ponekad se uvodi fiziološki rastvor u peritonealnu
šupljinu, koja se ispira radi detekcije abdominalnih
povredad koje
k j jjoš
š nisu
i ddovelel ddo akumulacije
k l ij ttečnosti
č ti
• osetljiv test za detekciju intra-abdominalnih krvarenja u
slučajevima skrivene traume
• broj eritrocita može da se koristi zajedno sa
radiografijom da bi se utvrdilo da li je potrebna hirurška
intervencija
• ako je broj eritrocita >100 000/μL, to ukazuje na
prisustvo skrivene povrede
56

Razlikovanje transudata i eksudata
• teže nego u pleuralnim i perikardnim efuzijama

• serum-ascites albumin gradijent (SAAG) ima prednost
nad izračunavanjem odnosa koncentracija proteina i
LDH u serumu i punktatu u detekciji transudata koji vode
poreklo od poremećaja funkcije jetre
• koncentracije albumina u serumu i tečnosti se određuju
istovremeno, a zatim se koncentracija albumina u
t č
tečnosti
ti oduzima
d i odd kkoncnetracije
t ij u serumu
• razlika (gradijent) ≥1,1 ukazuje na transudat hepatičnog
porekla a niži gradijenti su prisutni kod eksudata
57
IZGLED
• normalna peritonealna tečnost je bistra i bledo-žuta
• eksudati su zamućeni:
– kod bakterijskih ili gljivičnih infekcija
• zelena ili tamno-braon boja:
– prisustvo žuči, koje se može potvrditi standardnim testovima za
određivanje bilirubina
• tragovi krvi:
– posle traume
– tuberkuloze
– intestinalnih poremećaja
– maligniteta
• hilusni i pseudohilusni materijal:
– kod traume ili blokade limfnih sudova
58

Laboratorijska ispitivanja
• broj leukocita je <350/μL
– broj leukocita
le kocita se po
povećava
eća a kod bakterijskog peritonitisa i ciroze;
ciro e za
a razlikovanje
ra liko anje
ova dva stanja, apsolutan broj neutrofila >250/μL ili više od 50% ukupnog broja
leukocita ukazuje na infekciju
• limfociti
– dominantne ćelije u tuberkulozi
• ispitivanje eksudata na prisustvo malignih ćelija
– važno u detekciji primarnih i metastaskih tumora
– maligniteti su najčešće porekom iz GIT, prostate ili ovarija
• tumorski markeri CEA i CA 125
– za identifikaciju primarnog tumora koji izaziva formiranje ascitnog eksudata
– prisustvo CA 125 antigena i odsustvo CEA ukazuje da se tumor nalazi na
ovarijumima, falopijevim tubama ili endometrijumu
59
Biohemijska ispitivanja
• Glukoza:
– smanjena
j ispod
p koncentracije j u serumu kod bakterijskih
j i
tuberkuloznih peritonitisa i maligniteta
• Amilaza:
– u ascitu da bi se utvrdio pankreatitis
– može biti povišen kod pacijenata sa perforacijama u GIT-u
• ALP:
– povišena aktivnost ima dijagnostički značaj kod perforacije
intestinuma
• urea i kreatinin:
– kada se sumnja na rupturu mokraćne bešike
– slučajnu pukciju bešike u toku paracenteze
60

1 Dijagnostička peritonealna lavaža
1.
2. Peritonealna dijaliza
3. Peritonealno ispiranje
61
1. Dijagnostička peritonealna lavaža
 kod pacijenata sa otvorenim abdominalnim traumama kod

kojih se aspirira > 15 mL krvi iz abdominalne šupljine
 1 L fiziološkog rastvora ili rastvora Ringer laktata se unese
putem katetera, a potrebno je da se povrati bar 600 mL
nazad
 određuje se broj ertrocita i leukocita
 takođe za evaluaciju pacijenata sa akutnim peritonitisom ili
akutnim pankreatitisom
62

2. Peritonealna dijaliza
 ispitivanje prisustva infekcije kod pacijenata

sa renalnim oboljenjima a koji su na ovoj
dijalizi
63
3. Peritonealno ispiranje
 ispiranje peritonealne šupljine fiziološkim
rastvorom u toku operacije
p j u cilju
j ppotvrde
intraabdominalnog širenja karcinoma ovarijuma ili
endometrijuma
 za citološko ispitivanje
64

Serum-ascites albumin gradijent
koncentracija albumina u serumu minus

koncentracija u ascitesu
 fiziološki podesan test

 ascites izazvan portalnom hipertenzijom ima
gradijent  11 g/L
 izazvan ostalim uzrocima  11 g
g/L
65

SISTEMSKE REUMATSKE BOLESTI
SINOVIJALNA TEČNOST
Sistemske reumatske bolesti
 kliničke karakteristike:
multipli organi uključujući muskuloskeletalni
sistem
 tipična karakteristika:
različite podgrupe i preklapajući sindromi

Sistemske reumatske bolesti
 različiti patogenski mehanizmi su
odgovorni za patofiziološke procese i
uključuju:
 zapaljenje
 fibrozu
 imunološki ili drugačije nastala
organska oštećenja
3
KLINIČKA DIJAGNOZA
 prepoznavanje specifičnih simptoma

 određivanje određenih autoantitela
otkrivaju se na početku prvih tipičnih
simptoma bolesti i održavaju se za vreme
trajanja bolesti; ograničena dijagnostička
osetljivost i specifičnost

SISTEMSKE REUMATSKE BOLESTI
1. reumatoidni artritis
2 sistemski
2. i t ki eritemski
it ki llupus i njegove
j
varijante
3. primarni Sjorgenov sindrom
4. različite tipove sistemske skleroze
5 idiopatski
5. idi t ki miozitis:
i iti polimiozitis
li i iti i
dermatomiozitis
REUMATOIDNI ARTRITIS
(RA)
 takođe poznat kao hronični poliartritis; najčešće
inflamatorno reumatsko oboljenje
 manifestuje kao:
 simetrični sinovitis, uglavnom na šakama i
stopalima
 praćen tenosinovitisom i često zapaljenjem
gornje cervikalne kičme
 sa akutnim zapaljenskim epizodama
 destruktivne promene u zglobu sa deformacijama
i progresivnim funkcionalnim oštećenjem
6


10

REUMATOIDNI ARTRITIS (RA)
 postavljanje dijagnoze RA uključuje prisutvo barem 4 od 7

mogućih kriterijuma:
 jutarnja ukočenost
 artritis (nateknuće ili izliv u mekom tkivu) u barem 3
zgloba
 artritis zglobova šake uključujući metakarpofalangalnu i
bliske interfalangalne zglobove, simetrične spletove
zglobova, potkožne reumatoidne nodije
 radiološke promene tipične za RA
11
REUMATOIDNI ARTRITIS (RA)
 laboratorijski dijagnostički kriterijum:
otkrivanje reumatoidnog faktora u

serumu
12

REUMATOIDNI FAKTOR (RF)
 pored reumatoidnog artritisa određuje se i u
slučaju tip II mešovite krioglobulinemije
 sve metode određivanja RF se zasnivaju na
reakciji sa Fc delom humanog ili životinjskog
(zečijeg) imunoglobilina G
 kao uzorak se može koristiti serum ili sinovijalna
tečnost (kod pacijenata sa prisutnim RA rezultati
su u sskoro
o o ssvim sslučajevima
učaje a sslični
č nivoima
o au
serumu)
13
ODREĐIVANJE RF
 test aglutinacije kao što je Waaler-Rose
j g
lateks test i njegove modifikacijej se izvodi
kvalitativno na mikroskopskim test
pločicama ili polukvalitativno titracijom
 kvantitativna analiza uključuje

imunonefelometrijsko i ELISA određivanje;
14

ODREĐIVANJE RF
 u slučaju imunonefelometrije u najvećem stepenu
se odredjuju RF klase IgM, dok se RF klase IgG i
IgA detektuju u minimalnom obimu ili samo
delimično
 ELISA metode dozvoljavaju diferencijaciju

izmedju različitih RF imunoglobulinskih klasa
15
ODREĐIVANJE RF
 rezultati kvalitativnih metoda otkrivanja RF se
izražavaju kao titar (odnos)
 kvantitativnih koji koriste internacionalni referentni

standard za kalibraciju u IU/mL (gornja granica
referentnog intervala iznosi oko 10 IU/mL)
16

RF
 reumatoidni faktor se smatra pozitivnim, tj jedan
RA kriterijum je ispunjen ukoliko je određen
metodom
t d koji
k ji d
daje
j manjej od
d 5% pozitivnih
iti ih
rezultata kod zdravih ljudi
 RF je prisutan kod 70%-90% pacijenata sa RA i

negativan rezultat ne isključuje dijagnozu RA,
naročito
a oč to u sslučaju
učaju sa
samo
o jed
jednog
og od
određivanja
eđ a ja
17
RF
 prisutan mnogo godina pre pojave prvih simptoma
RA
 rizik dobijanja RA kod zdravih osoba sa pozitivnim

rezultatom RF je 5-40 puta veći nego kod osoba
kod kojih je RF negativan, mada ukupan rizik
iznosi samo oko 5%
18

RF
 prisutan u slučaju mnogih reumatskih i
nereumatskih bolesti i nije specifičan za RA
 bez kliničkog RA kriterijuma, pozitivan nalaz RF
nije od koristi
 metodološki problemi u otkrivanju RF mogu biti
prouzrokovani pogrešnim negativnim rezultatima
usled blokade od strane endogenog IgG
(("skrivenog"
s e og reumatoidnog
eu ato d og faktora)
a to a)
19
SISTEMSKI LUPUS ERYTHEMATOSUS

(SLE )
 multisistemska
bolest koja
obuhvata kožu,
mišićno-skeletni
sistem, nervni
sistem i razne
unutrašnje organe
20

SLE
 klinička prezentacija je
mnogostruka i
karakteriše se kliničkim
varijantama
(podgrupama) kao i
mešovitim tipovima
(delimična preklapanja)
21
 otkrivanje autoantitela je
važno
ž u dijdijagnostici
ti i i
kontrolisanju SLE-a
 autoantitela su prisutna
kod skoro svih SLE
pacijenata u toku aktivne
faze bolesti i to često
nekoliko različitih
autoantitela
22

• dva od jedanaest kriterijuma neophodnih
za postavljane dijagnoze SLE su serološki
kvantiteti:
1. otkrivanje antinuklearnih antitela

2. otkrivanje tipičnih SLE autoantitela
23
Antinuklearna antitela (ANA)
 otkrivanje ANA je veoma osetljiv

parametar za aktivni SLE i pozitivan je u
99% slučajeva
 negativan rezultat sa visokom
verovatnoćom odstranjuje prisustvo
aktivnog SLE
 ANA nisu specifična SAMO za SLE i
nadjena su u brojnim drugim oboljenjima
24

ARTROCENTEZA
 pod sterilnim
uslovima da ne
dođe do
bakterijske
kontaminacije
zgloba
 uz anesteziju;
25
SINOVIJALNA TEČNOST
• Dobija se postupkom artrocenteze
26

ARTROCENTEZA
 aspiracija iz zgloba kolena: pacijent treba da bude u
tromoj poziciji sa kompletno ispruženim kolenom;
 nakon palpacije zgloba obeleži se posteriorna oblast
do medijalnog patelarnog ruba;
 nakon čišćenja i dezinfekcije kožne površine koja
prekriva zglob uz lokalnu anesteziju se uvodi igla u
zglobni prostor i aspirira SF
27
ARTROCENTEZA
28

ARTROCENTEZA
29
ARTROCENTEZA
30

ARTROCENTEZA
 natrijum heparin kao antikoagulans
 ne litijum ili oksalat zbog formiranja

kristala koji mogu da utiču na
mikroskopska ispitivanja
31
ARTROCENTEZA
Kada se aspirira dovoljno tečnosti, ona se deli u

odgovarajuće epruvete
epruvete, u zavisnosti od traženih analiza:
• sterilna heparinizirana epruveta za bojenje po Gramu i

kultivisanje
• epruveta sa heparinom ili tečnim EDTA za određivanje
broja ćelija
• epruveta bez antikoagulansa za druge analize
• epruveta sa NaF za određivanje glukoze
32

Sinovijalna tečnost/„tečnost zgloba“
• viskozna tečnost koja se nalazi u šupljinama pokretnih zglobova
(diartroze) ili sinovijalnih zglobova
• kosti sinovijalnih zglobova su obložene glatkom zglobnom
hrskavicom i odvojene šupljinom koja sadrži sinovijalnu tečnost
• zglob je zatvoren u fibroznoj kapsuli koja je obložena sinovijalnom
membranom
• sinovijalna membrana se sastoji od specijalizovanih ćelija koje se
nazivaju sinoviociti
• glatka hrskavica zgloba i sinovijalna tečnost smanjuju trenje između
kostiju u toku pokretanja zgloba
• pored lubrikacije zglobova, sinovijalna tečnost obezbeđuje i hranljive
materije za hrskavicu zgloba i smanjuje šok pri kompresiji zgloba do
koje dolazi u toku aktivnosti kakve su hodanje i trčanje
33
Sinovijalna tečnost
• nastaje ultrafiltracijom plazme kroz sinovijalnu membranu
• filtracija
j jje neselektivna osim što isključuje
j j pproteine velike
molekulske mase
• većina hemijskih supstanci se nalazi u koncentracijama koje su
slične koncentracijama u plazmi
• sinoviociti sekretuju mukopolisaharide koji sadrže hijaluronsku
kiselinu i malu količinu proteina (otprilike jednu četvrtinu
koncentracije u plazmi) u tečnost
• velika količina hijaluronata doprinosi vidljivoj viskoznosti sinovijalne
tečnosti
34

Normalne vrednosti u sinovijalnoj tečnosti
Parametar Vrednost
Zapremina
p < 3,5
, mL
Boja Bezbojna do bledo-žuta
Providnost Bistra
Viskozitet Formira nit dugu 4-6 cm
Broj leukocita < 200 ćelija/µL
Neutrofili < 25% od ukupnog broja leukocita
Kristali Nisu prisutni
Glukoza Za < 0,55 mmol/L niže nego u krvi
Ukupni proteini < 30 g/L
35
Klasifikacija i patološki značaj poremećaja zglobova
Grupa Patološki značaj

Neinflamatorni Degenerativni
g p
poremećajij zglobova,
g ,
osteoartritis
Inflamatorni Imunološki poremećaji, reumatoidni artritis,
lupus eritematozus, skleroderma, polimiozitis,
ankilozirajući spondilitis, reumatska groznica i
Lyme-ov artritis.
Kristalima izazvan giht i pseudogiht.
Septični Bakterijska infekcija
Hemoragijski Traumatska povreda, tumori, hemofilija, drugi
poremećaji koagulacije.
Predoziranje antiokaogulantnom terapijom
36

Laboratorijski nalaz kod poremećaja zglobova
Grupa Laboratorijski nalaz
Neinflamatorni bistra, žuta tečnost
dobra viskoznost
leukociti < 1000/µL
neutrofili < 30%
normalna koncentracija glukoze (slično koncentraciji u krvi)
Inflamatorni zamućena, žuta tečnost
(imunološkog porekla) loša viskoznost
leukociti 2000 – 75000/µL
neutrofili > 50%
smanjena koncentracija glukoze
moguće prisustvo autoantitela
(indukovan kristalima) zamućena ili mlečno-bela tečnost
niska viskoznost
leukociti do 100 000/µL
neutrofili < 70%
prisutni kristali 37
Laboratorijski nalaz kod poremećaja zglobova

Grupa Laboratorijski nalaz
Septični zamućena, žuto-zelena tečnost
promenljive viskoznosti
leukociti 50 000 – 100 000/µL
neutrofili > 75%
pozitivna kultura i bojenje po Gramu
Hemoragijski zamućena, crvena tečnost
niska viskoznost
broj leukocita isti kao u krvi
broj neutrofila isti kao u krvi
normalna koncentracija glukoze
38

Ispitivanje sinovijalne tečnosti
 Osnovna
 Specijalna
39
OSNOVNA ISPITIVANJA
 zapremina ‐ ukupna količina 3,5
mL; ne uzima se sva količina;
abnormalne količine mogu da
iznose 80 mL
 boja ‐ normalno i neinflamatorno
iritantni izliv je svetlo žute
iritantni izliv je svetlo žute boje
40

OSNOVNA ISPITIVANJA
BOJA
 inflamatorni izliv je zelenkast, sivkast,
k t h
ksantohroman ( i
(primarnog ili sekundarnog
ili k d
porekla) ili mlečno siv (piogeni artritis)
 crvenkasta nijansa nastaje zbog akumulacije
eritrocita; destrukcija eritrocita dovodi do
metabolizma hema i nastanka bilirubina
prouzrokujući ksantohromiju;
41
Bakterijski infektivni artritis
42

RA (levo) GIHT (desno)
43
OSNOVNA ISPITIVANJA
BISTRINA i pH
 bistrina
b st a ‐ u u obrnutoj srazmeri sa brojem leukocita;
ob utoj s a e sa b oje eu oc ta;
takođe dolazi do zamućenja ukoliko su prisutni
kristali (mononatrijum urat, kalcijum pirofosfat,
holesterol); vizuelna procena;
 pH ‐ normalno iznosi 7,31‐7,64; nizak pH ukazuje
normalno iznosi 7 31‐7 64; nizak pH ukazuje
na inflamaciju ali ne na sepsu
44

OSNOVNA ISPITIVANJA
VISKOZITET
zavisi od:
 sadržaja visokipolimerizovanog hijaluronata
 temperature
 sadržaja proteina
 ćelija i enzima
 opadad u iinflamatornim
fl t i procesima;
i
45
Viskozitet
• "struna test": razvlačenje SF između palca i kažiprsta
(normalno 3 cm);
• posmatranjem kapi SF; dužina kapi (nizak viskozitet
posmatranjem kapi SF; dužina kapi (nizak viskozitet
rezultuje u kratkom repu);
• tačno se određuje viskozimetrom
• mucin‐"test zgušnjavanja mucina"; mucin predstavlja
komlesks hijaluronata i proteina i odgovoran je za visoki
viskozitet SF; u toku inflamatornih procesa dolazi do
viskozitet SF; u toku inflamatornih procesa dolazi do
fragmentacije mucina;
46

Viskozitet
• sa 1% sirćetnom kiselinom: u cevčicu se sipa 2‐3 mL
sirćetne kiseline i doda 2 kapi SF i promućka; dobijeni
precipitat se klasifikuje u tri kategorije:
• dobra precipitacija (solidni ugrušak): normalna,
artritiska ili traumatska SF
• umerena (nekoliko delića, fragmetalna pojava): ukazuje
na zapaljenski proces
• slaba (beli pahuljast precipitat, snežne pahuljice):
(beli pahuljast precipitat snežne pahuljice):
aktivno sinovijalno zapaljenje
47
SPECIJALNA ISPITIVANJA
1. određivanje biohemijskih parametara
2. hematološka
3. mikroskopska
4. imunohemijski testovi
5
5. bakteriološka
bakteriološka
48

Određivanje biohemijskih parametara
UKUPNI PROTEINI
• biuretsko
biuretsko određivanje; normalno 13 g/L;
određivanje; normalno 13 g/L;
koncentracija od 60 g/L ukazuje na hemartrozu;
• normalna SF ne koaguliše dok u inflamatornim
oboljenjima prolazi fibrinogen i dolazi do zgrušavanja
• povećanje koncentracije 2‐makroglobulina pri
zapaljenju
49
GLUKOZA
•niže za 0,5 mmol/L
•niže za 0 5 mmol/L u odnosu na serum
u odnosu na serum
•snižava se u inflamatornim procesima (za 2,2
mmol/L) i infektivnom artritisu (za 1,1 mmol/L)
•nije najbolji parametar za razlikovanje zbog
preklapanja
p p j vrednosti
50

LAKTAT
 indikator lokalne inflamacije
 povećanje zbog glikolize leukocita u slučaju
povećanje zbog glikolize leukocita u slučaju
inflamatornog izliva u zglobu
MOKRAĆNA KISELINA
 ista koncentracija i granica rastvorljivosti (do
381 mol/L) kao u serumu
381 mol/L) kao u serumu
 ne mora da se određuje u SF
51
ENZIMI
 povišenje aktivnosti u SF sa velikim brojem ćelija
 za diferencijalnu dijagnozu neinflamatornih od
inflamatornih bolesti zglobova
 LDH, ACP
, ((ne sme heparin ili oksalat), ALP i aldolaza
e s e epa o sa a ), a do a a
52

Hematološka ispitivanja
broj ćelija ‐ broj leukocita
• ne automatski
• normalno 50‐100 leukocita/L SF
• neinflamatorna SF 200‐1000 L/L
• > 60 000 L/L u slučaju infekcije
diferencijalno određivanje ćelija
• ćelijski sastav SF se menja u toku zapaljenja
• udeo PMN leukocita je veći od 70% u slučaju
nespecifičnog zapaljenja
53
Septični artritis
PMN leukociti
54

Inflamatorni artritis
PMN leukociti
55
Mikroskopska ispitivanja
detekcija kristala u SF
• predstavlja jedan od najvažnijih delova
celokupnog ispitivanja SF
• ispitivanje kristala može da se izvede iz samo
jedne kapi SF koja je aspirirana na primer iz
prstnog zgloba
• Izvođenje:
I đ j natrijum heparin ili EDTA
t ij h i ili EDTA se koriste
k it
kao antikoagulansi; kap dobro izmešane SF se
postavlja na mikroskopsko staklo sa pokrivajućim
staklom na vrhu;
56

RAGOCITI
• predstavljaju PMN leukocite ili
d t lj j PMN l k it ili
mnocite koji sadrže svetlo
zelena do maslinasto zelena
tela u citoplazmi sastavljena od
imunoglobulina, reumatoidnog
faktora, fibrina i antinuklearnih
faktora, fibrina i antinuklearnih
faktora
57
• ragociti su prisutnI kod:
• 20%‐90% RA seropozitivnih
pacijenata
• u slučajevima septičnog artritisa
i akutnog artritisa (kristalima‐
indukovanog)
58

KRISTALI
• detekcija se vrši korišćenjem polarizujućeg
svetlosnog mikroskopa
59
IDENTIFIKACIJA KRISTALA
• Mikroskopsko ispitivanje ST na prisustvo kristala je važno za
dijagnostičku procenu artritisa.
• Formiranje kristala u zglobu često dovodi do akutne, bolne
Formiranje kristala u zglobu često dovodi do akutne bolne
inflamacije.
• Takođe može postati i hronično stanje.
• Uzroci formiranja kristala:
– metabolički poremećaji
– smanjena renalna ekskrecija koja dovodi do povišene koncentracije
u krvi supstanci koje kristališu
u krvi supstanci koje kristališu
– degeneracija hrskavice i kostiju
– injekcija lekova (kortikosteroidi) u zglob.
60

VRSTE KRISTALA
Primarni kristali koji se nalaze u ST:
• mononatrijum urat (mokraćna kiselina) (MNU)

– prisutni u gihtu
• kalcijum pirofosfat (KPF) – prisutni u
pseudogihtu
61
UZROCI GIHTA
Povišena koncentracija mokraćne kiseline u serumu:
• usled
usled poremećenog metabolizma purina
poremećenog metaboli ma purina
• povećano konzumiranje hrane sa visokim sadržajem purina,
alkohola, fruktoze
• hemioterapija u leukemiji
• smanjena renalna ekskrecija mokraćne
62

UZROCI PSEUDOGIHTA
Najčešće povezan sa:
• degenerativnim artritisom
• kalcifikacijom hrskavice
• endokrinim poremećajima koji dovode do povišene
koncentracije kalcijuma u serumu
63
Priprema preparata
• ispitivanje na prisustvo kristala treba da se radi ubrzo po sakupljanju
uzorka da na kristale ne bi uticala promena temperature i pH
• MNU i KPF kristali se nalaze i ekstracelularno i intracelularno (unutar
neutrofila) ‐ ST se mora ispitivati pre dezintegracije leukocita stajanjem
• ST se ispituje kao neobojeni svež preparat
• jedna kap tečnosti se stavlja na prethodno očišćeno predmetno staklo i
pokriva ljuspicom
• preparat se može prvo pogledati pod malim i velikim uveličanjem
svetlosnog mikroskopa
• kristali se mogu posmatrati i na razmazima obojenim po Wright‐u, ali to
g p j p g ,
ne sme da zameni ispitivanje nativnog preparata i upotrebu
polarizovane i kompenzovane polarizovane svetlosti za identifikaciju
64

Kristali mononatrijum urata
• žuti su i imaju izgled igle ali
takođe mogu biti kratki i
kružnog oblika
• detekcija kristala urata u SF
detekcija kristala urata u SF
potvrdjuje dijagnozu gihta
65
• obično se vide kao kristali oblika iglica
• mogu biti lokalizovani ekstracelularno ili intracelularno, u citoplazmi
neutrofila
• često se viđaju kako probijaju citoplazmu ćelije
• prisustvo intracelularnih kristala treba da se naznači na izveštaju ispitivanja,
pošto ukazuje na akutnu fazu gihta (između akutnih napada, nalaze se kod
oko 75% pacijenata)
• kod malog broja pacijenata, čak i u toku akutnih napada, MNU kristali se
uopšte ne moraju nalaziti ‐ zbog aspiracije sa pogrešnog mesta, lokulacija
unutar zgloba, rastvaranje kristala, neiskustvo ispitivača i neadekvatna
pretraga preparata za kristalima
• ponavljana ispitivanja na prisustvo MNU kristala može ponekad da bude
potrebna za postavljanje definitivne dijagnoze
• pod polarizovanom svetlošću, MNU kristali jako dvojno prelamaju svetlost,
odnosno svetli su na tamnoj potpuno polarizovanoj pozadini
66

67
68

(polarizovana svetlost)
69
Kristali kalcijum pirofosfata
• liče na štapiće, pločice ili romboide

• bledi su na tamnoj pozadini polarizovane svetlosti,
odnosno oni slabo dvojno prelamaju svetlost i lako ih je
prevideti ako ih posmatra neiskusna osoba
• mogu da se jave i u obliku iglica i da se tako zamene sa
MNU kristalima
• njihovo prisustvo u SF potvrđuje skrivenu
hondrokalcinozu (pseudogiht)
70

Prisustvo KPF kristala je

karakteristično za grupu
poremećaja koji se zajedno
nazivaju „bolest nakupljanja
kristala KPF“, „pseudogiht“
ili „hondrokalcinoza“.
71
• nalaze se u vakuolama neutrofila ((MNU kristali liziraju

j membrane
fagozoma, te se stoga ne nalaze u vakuolama)
• da bi se izbegla pogrešna identifikacija KPF kristala, klasičan
romboidan oblik se mora potvrditi i posmatranjem kompenzovanom
polarizovanom mikroskopijom
• nalaze se u uzorcima ST kod:
– pacijenata sa degenerativnim artritisom
– naslednih oblika pseudogihta
– artritisa povezanih sa metaboličkim bolestima kakve su hiperparatireoidizam,
hipotiroidizam, diabetes melitus i hemohromatoza
– ponekad i zajedno sa MNU kristalima u gihtu
72

• Klinička slika bolesti nakupljanja

p j j kristala KPF jje varijabilna
j i može
da liči na različite poremećaje.
• Otprilike polovina ovih pacijenata ima kliničku sliku sličnu
osteoartritisu sa progresivnom degeneracijom u mnogim
zglobovima, naročito u kolenima, ručnim zglobovima, metakarpalno-
falangealnim zglobovima, kukovima, ramenima, laktovima i
gležnjevima (naveden je redosled po frekvenciji pojavljivanja).
• Kod drugih pacijenata se može javiti klinička slika koja liči na giht –
otuda i naziv pseudogiht.
• Kod ovih pacijenata javljaju se akutni ili subakutni napadi artritisa,
koji često pogađaju samo jedan zglob - u ovim slučajevima se uvek
mora isključiti septični artritis.
73
Kristali holesterola
• obično izgledaju kao reckaste, pravougaone
pločice, ali nekad mogu da budu i dugačke
iglice koje dvojno prelamaju polarizovanu
svetlost ili kao romboidi, što liči na MNU i
KPF kristale
• nespecifični su i ponekad se nalaze u
zglobovima sa hroničnom inflamacijom (kao
kod reumatoidnog artritisa) i ponekad u
osteoartritisu
74

Kristali hidroksiapatita
• obično suviše mali da bi se identifikovali svetlosnim mikroskopom
• mogu se videti kao „sjajni novčići“ faznim mikroskopom ili kao ružičaste
inkluzije u preparatima bojenim po Wright-u
Wright u, kada su prisutni agregati
kristala
• za definitivnu identifikaciju je neophodna elektronska mikroskopija
• Povezani su sa sindromima „artropatija povezana sa apatitom“:
– akutni kalcifikujući periartritis - u kome postoji periartikularna inflamacija i prolazna
kalcifikacija u blizini zgloba, kristali hidroksiapatita se nalaze u kalcificirajućim
depozitima
– akutni (kalcificirajući) artritis povezan sa kalcifikacijom u i/ili oko zgloba, kristali
hid k i
hidroksiapatita
tit se nalaze
l u sinovijalnoj
i ij l j ttečnosti
č ti i kkalcificirajućim
l ifi i j ći d depozitima
iti
– subakutni i hronični artritis koji liči na osteoartritis
75
MIKROSKOPSKA ISPITIVANJA - ARTEFAKTI

• veliki broj refraktilnih artefakata može da se zameni sa kristalima
• kristali imaju oštre, jasno definisane ivice i prave strane, nasuprot
nejasnim oblicima mnogih arteafakata
• kada se kalcijum oksalat i Li-heparin koriste kao antikoagulansi mogu da
kristalizuju u ST
• kristali Ca-oksalata imaju kuboidni oblik različitog sjaja
• kristali Li-heparina su mali (2-5 µm) i različitog oblika (Na-heparin ne
kristališe)
• talk sa hirurških rukavica se ponekad može videti u ST kao sjajni
malteški krstovi kada je tečnost polarizovana
• češći artifakti su kristali kortikosteroida koji se mogu videti i nekoliko
nedelja ili meseci posle intra-artikularne injekcije - mogu biti slične
veličine i oblika kao kristali MNU ili KPF
76

IMUNOLOŠKA/SEROLOŠKA ISPITIVANJA
• zbog povezanosti imunskog sistema i inflamatornih procesa, serološki

testovi imaju važnu ulogu u dijagnozi poremećaja zglobova
• većina analiza se izvodi u serumu, dok se analiza sinovijalne tečnosti
koristi kao potvrda u slučajevima koji su teški za dijagnozu
• autoimune bolesti (RA SLE) dovode do ozbiljne inflamacije zglobova i
dijagnostikuju se imunološkim laboratorijama dokazivanjem prisustva
karakterističnih antitela u serumu pacijenata (ista antitela se mogu
dokazati i u ST, ako je potrebno)
• artritis je česta komplikacija Lajmske bolesti - dokazivanje prisustva
antitela na uzročnika, Borrelia burgdorferi, u serumu pacijenata može da
potvrdi uzrok artritisa
77
Imunohemijska ispitivanja
• reumatoidni faktor - odredjivanje je

dij
dijagnostički
tički relevantno
l t samo ako
k jje on
negativan u plazmi
• antinuklearni faktori
• imunoglobulini
• komplement
• citokini (IL-1 i TNF)
78

79
80

81
82

83

ANALIZA SEMINALNE
TEČNOSTI

g j
Spermatogeneza
 odigrava se u semenim kanalićima za vreme
aktivnog seksualnog života
 počinje u doba puberteta usled stimulacije

gonadotropnih hormona adenohipofize i nastavlja
se do
d kkraja
j života
ži t

Spermatogeneza
 poremećaj bilo kog stadijuma u procesu
spermatogeneze dovodi do problema sa plodnošću
 danas se razvijaju nove metode za otkrivanje slabih

tačaka ovih procesa i terapijski tretmani kojima se
onii kkompenzuju,
j među
đ koje
k j spada
d i analiza
li
seminalne tečnosti
Androloška laboratorija
 različita ispitivanja i pregledi u cilju

donošenja ispravnih zaključaka o
neplodnosti, odnosno plodnosti pacijenata

Ispitivanja su prvenstveno
upućena ka analizi semene
tečnosti odnosno njenog
glavnog konstituenta –
spermatozoida.
 lekari koji se bave sterilitetom koriste analizu ST za:
 davanje prognoze parovima

 za izbor pomognute reproduktivne tehnologije (ART)
kao što je in vitro oplodnja uključujući gamet ili embrion
transfer

INDIKACIJE
• sve forme neplodnosti i hipogonadizma

• praćenje egzogenih uticaja
(lečenje, radijacija, ekološki faktori,
kontracepcija)
• dugotrajna
d t j želja
ž lj za potomstvom
t t
Hipogonadizam
 svi poremećaji funkcije testisa

 poremećena endokrina, egzokrina ili obe
funkcije testisa
 primaran (testisi) i sekundran (hipofiza)

Uzroci neplodnosti
androgena deficijencija
 na početku puberteta ga odlaže,
odlaže a posle puberteta
ne utiče na promenu telesnih proporcija, ali dovodi
do smanjenja sekundarne maljavosti, atrofije mišića,
poremećaja depoa masnog tkiva, osteoporoze,
anemije, gubitka libida, potencije i smanjenja
plodnosti)
l d ti)
Uzroci neplodnosti
 poremećaji u funkciji:
 spermovoda
d
 okolnih žlezda (semenih kesica, prostate,
bulbouretralnih žlezda)
 organa koji su meta androgenih hormona
10

Uzroci neplodnosti
varikokela
• izraženo proširenje vena spermatičkog pleksusa zbog patoloških
promena u venskoj drenaži testisa)
• kod 15-20% zdravih i fertilnih muškaraca, u doba puberteta, obično na
levoj strani, mada može biti i bilateralna
• manji broj spermatozoida, veći broj nezrelih formi i manja pokretljivost
• povišena temperatura u skrotumu sa strane varikokele, a povećana
venska staza izaziva anoksiju i refluks u spermatičke vene, čime se u
testise dovode toksični metaboliti i hormoni
11
Uzroci neplodnosti
Razne bolesti
• zaušci (parotitis epidemica) dovode do obostranog
oboljenje semenika – bilateralni orhitis koji uništava semeni
epitel
• tifus, dijabetes ili hronični nefritis
• zapaljivi procesi (gonorea, tuberkuloza) izazivaju suženje
ili potpunu opstrukciju genitalnih kanala
• viša ili niža temperatura kojoj su izloženi semenici može
dovesti do privremenog ili trajnog steriliteta
• kriptorhizam (izostanak spuštanja testisa u skrotum)
izaziva degenerativne promene na testisima
12

Praćenje egzogenih uticaja na plodnost
 toksične materije iz spoljašnje sredine
 na organizam utiču preko hrane, vazduha i vode koji su

kontaminirani uglavnom pesticidima
 direktno - oštećenje semenovoda, inhibicija procesa
sazrevanja spermatozoida u normalno razvijenim
testisima ili nepovoljnim delovanjem na diferencijaciju
fetalnih testisa
 indirektno - promene u funkciji hipotalamusa i hipofize
13
Dugotrajna želja za potomstvom

• zadatak lekara koji prati par koji ima problema sa začećem
je prvenstveno da detaljno pregleda muškarca
 palpacija - ustanoviti sva patološka stanja na

spoljašnim genitalijama muškarca
 analiza sperme kao i rektalni pregled - postaviti
konačnu dijagnozu
 ispitivati oba partnera
14

ANALIZA SEMINALNE TEČNOSTI
 preporučuje se pacijentima kod kojih i pored

seksualnih
k l ih odnosa
d b
bez zaštite
štit u toku
t k šest
š t
meseci do godinu dana još uvek nije došlo do
začeća
 osnovna ispitivanja
p j sperme
p p
predstavljaju
j j
standardizovan postupak koji se izvodi prema
preporukama SZO
15
SEMINALNA TEČNOST
• seminalna tečnost ili sperma
• biohemijski kompleksan rastvor koji se sastoji od
tečnosti, na čiji sastav utiču ili ga modifikuju:
– testisi
– epididimis
– semene vezikule
– prostata
– bulbouretralne žlezde
• svaka frakcija se razlikuje po svom sastavu, a mešanje
svih frakcija u toku ejakulacije je esencijalno za
produkciju uzorka seminalne tečnosti normalnog sastava
16

17
GRAĐA TESTISA
18

SASTAV SEMINALNE TEČNOSTI
• Spermatozoidi 5%
• Semena tečnost 60-70%
• Tečnost prostate 20-30%
• Bulbouretralne žlezde 5%
19
Produkcija seminalne tečnosti

↓ ↓ ↓ ↓
Semene tubule u testisima Spermatogeneza
E ididi i
Epididimis S
Sazrevanje
j spermatozoida
id
Duktus deferens Izbacivanje spermatozoida u ejakulatorne duktuse
Semene vezikule Obezbeđuju tečnost i nutriente za spermu u

seminalnoj tečnosti
↓
Prostata Obezbeđuje enzime i proteine za koagulaciju i

likvefakciju
↓
Bulbouretralne žlezde Dodaju alkalni mukus koji neutralizuje kiselinu

poreklom iz prostate i vaginalni aciditet
20

Formiranje i fiziologija
• testisi sadrže semene tubule
• germinativne ćelije,
ćelije u kojima nastaju spermatozoidi
spermatozoidi, se
nalaze u epitelnim ćelijama semenih tubula
• specijalizovane Sertolijeve ćelije obezbeđuju podršku i
nutriente za germinativne ćelije u fazi mitoze i mejoze
(spermatogeneze)
• kada se spermatogeneza završi, nezreli spermatozoidi
(nepokretni) ulazi u epididimis
21
• u epididimisu, spermatozoidi sazrevaju i razvijaju flagele
• spermatozoidi ostaju u epididimisu do ejakulacije kada

se izbacuju kroz duktus deferens u ejkulatorne duktove
• ejakulatorni duktovi primaju i spermatozoide iz duktus

deferensa i tečnost iz semenih vezikula
22

• semene vezikule produkuju veći deo semene tečnosti
seminalne tečnosti (60 – 70%)
– tečnost sadrži visoku koncentraciju fruktoze
– metabolizam fruktoze obezbeđuje potrebnu energiju za flagele,
što omogućava kretanje kroz ženski reproduktivni trakt
– u odsustvu fruktoze, spermatozoidi nisu pokretni
• semena tečnost vrši transport spermatozoida do
cervikalnog
g mukusa žene
• po dospeću u genitalni trakt žene, spermatozoidi ostaju u
semenoj tečnosti kratko vreme, dok ne uđu u mukus
23
Doprinos testisa sastavu ST

• spermatozoidi, koji čine samo mali deo zapremine
ejakulata, izlaze iz testisa sa malom količinom tečnosti
kroz duktus eferens
• tečnost iz testisa takođe sadrži mnoge supstance:
– steroide (testosteron i dihidrotestosteron)
– androgen-vezujući protein (uglavnom poreklom iz testisa ili
epididimisa)
– p
proteini ((uključujući
j j mnoge
g enzime))
– lipidi
– elektroliti
24

Doprinos epididimisa sastavu ST
• nejasana uloga
• preuzima karnitin iz krvi i zajedno sa acetilkarnitinom i
glicerolfosforilholinom unosi u sastav ST
– Karnitin, acetilkarnitin i glicerolfosforilholin:
• omogućavaju metabolizam masnih kiselina u spermatozoidima
• koncentracija promenjena u muškom infertilitetu
• povezani su sa poremećajima u pokretljivosti spermatozoida
• teško je proceniti ulogu
• preuzima
p androgene
g iz tečnosti koja
j dolazi iz testisa i metaboliše ih
• neophodno je da seminalna tečnost prođe kroz najmanje polovinu
do dve trećine epididimisa da bi spermatozoidi dobili sposobnost da
se kreću i da oplode jajnu ćeliju
25
Doprinos semenih vezikula sastavu ST
• najveći deo seminalne tečnosti vodi poreklo iz semenih

vezikula
• flavin - daje kremast izgled tečnosti i odgovoran je za
fluorescenciju seminalne tečnosti pod UV svetlošću
• fruktoza - nutrient za spermatozoide i za koagulaciji ST
• prostaglandini:
– dobili ime greškom, jer se smatralo da vode poreklo od prostate
– koncentracija koreliše sa brojem i kvalitetom spermatozoida
– ulogu u poremećajima fertiliteta
– utiču na odgovor žene na odlaganje spermatozoida u ženskom reproduktivnom
traktu – veštačkom inseminacijom direktan unos ST do grčeva zbog kontrakcije
mišića uterusa izazvanih semenim prostaglandinima.
26

Doprinos prostate sastavu ST
• okružuje gornji deo uretre, smeštena odmah ispod
mokraćne bešike
• pomaže u pokretanju ST S kroz uretru kontrakcijama u toku
ejakulacije
• daje 20–30% zapremine ejakulata
• proteini i enzimi iz prostate, zajedno sa onima iz ST
učestvuju u regulaciji koagulacije i likvefakcije ST posle
ejakulacije
27
Doprinos prostate sastavu ST

• citrati - kiseli pH, glavni anjon
• kisela fosfataza
• cink - smanjene koncentracije povezane sa povećanim
brojem leukocita u ST i/ili infekcijama; takođe hronični
prostatitis
• magnezijum - poreklom iz prostate i semenih vezikula
28

Doprinos bulbouretralnih žlezda sastavu ST
• locirane ispod prostate
• doprinose sa oko 5% zapremine ST
• gust, alkalni mukus koji pomaže u neutralizaciji kiselosti
iz sekreta prostate i vagine
• bitno je da ST bude alkalna, da bi neutralisala vaginalnu
kiselost, koja je posledica normalne vaginalne flore -.
bez ove neutralizacije, pokretljivost spermatozoida je
smanjena
29
Sakupljanje uzoraka
Indikacija
– glavno za neplodnost
– procenu kvaliteta ST od donora za veštačku oplodnju
– određivanje uspešnosti vazektomije
– kod forenzičkih veštačenja
30

Sakupljanje uzoraka
• pravilno treba analizirati najmanje dva ili više uzoraka od
jedne osobe
• zbog različitog sastava frakcija ST neophodno je pravilno
sakupljanje
• veći deo spermatozoida se nalazi u prvom delu ejakulata
- neophodno sakupljanje kompletnog uzorka za tačno
ispitivanje i fertiliteta i uzoraka posle vazektomije
• pac
pacijenti
je t b
bi ttrebalo
eba o da dobdobiju
ju tač
tačne
e instrukcije
st u c je o
sakupljanju uzoraka
31
Sakupljanje uzoraka
• posle perioda od 2–3 dana do maksimalno 5 dana seksualne
apstinencije (ako je duže, veća zapremina, manja pokretljivost)
• kada se ispituje fertilitet
fertilitet, obično se analiziraju 2 ili 3 uzorka u
razmaku od 2 nedelje, a značajan rezultat je samo ako su oba
uzorka abnormalna
• laboratorija bi trebalo da obezbedi tople, sterilne staklene ili
plastične posude za sakupljanje uzoraka
• uzorci treba da se sakupljaju u udobnoj, privatnoj prostoriji u blizini
laboratorije, ako je to moguće, u posudu koji obezbeđuje laboratorija
• ako
k se uzorakk nećeć iispitivati
iti ti u toku
t k 30 minuta
i t po sakupljanju,
k lj j ttreba
b
ga čuvati na toplom mestu, na temperaturi oko 37 °C
• treba da se analizira u toku 1 do 2 sata od sakupljanja - da bi se
tačno odredila pokretljivost spermatozoida
32

Sakupljanje uzoraka
• ako pacijent donese uzorak u laboratoriju od kuće, trebalo bi mu dati
instrukcije da sakupi ceo uzorak u čistu posudu, umota posudu u
suvi peškir ili krpu da bi se čuvao na toplom,
toplom i dobro zatvorenu
posudu stavi u kesu i donese u laboratoriju u toku jednog sata od
sakupljanja
• osoblje laboratorije mora da zabeleži vreme sakupljanja uzorka i
vreme prijema uzorka
• uzorci se do analize čuvaju na 37 °C
• uzorke bi trebalo sakupljati masturbacijom
• ako
k to
t nije
ij moguće, ć mogu da d se kkoriste
i t samo gumenii ili
poliuretanski kondomi bez lubrikanta
• obični kondomi ne mogu da se koriste, jer imaju spermicidne
osobine
33
Normalne vrednosti analize seminalne tečnosti
Zapremina 2–5 mL
Viskozitet Presipa
p se u kapljicama
pj
pH 7,2–8,0
Koncentracija spermatozoida >20 000 000/mL
Broj spermatozoida >40 000 000/ejakulatu
Pokretljivost >50% u toku 1 h
Kvalitet >2,0 ili a, b, c
Morfologija >14% normalnih oblika (strogi
kriterijumi)
>30% normalnih oblika (normalni
kriterijumi)
Okrugle ćelije <1 000 000/mL
34

ANALIZA SEMINALNE TEČNOSTI
1. FIZIČKI PREGLED
2. MIKROSKOPSKI PREGLED
3. BIOHEMIJSKA ODREĐIVANJA
4. IMUNOLOŠKA ODREĐIVANJA
35
1. FIZIČKI PREGLED
1. Izgled
2. Zapremina
3. Viskozitet
4
4. pH
36

1. Aglutinacija
2
2. P k tlji
Pokretljivost
t
3. Koncentracija spermatozoida
4. Ćelije
5. Vitalnost
6. Morfologija spermatozoida
37
 određuju se markeri u seminalnoj plazmi u
slučaju postojanja oboljenja u izlaznom
kanalu i pomoćnim žlezdama (opstrukcija
(opstrukcija,
ageneza, akutne i hronične infekcije)
1. kisela fosfataza
2. citrat
3. cink
4. magnezijum
5. fruktoza
6. -glukozidaza
38

Izgled seminalne tečnosti
 normalno
normalno, ejakulat je svetlosive boje i
karakterističnog mirisa koji uglavnom
potiče od sekreta prostate
 ejakulat
j k l t predstavlja
d t lj konglomerat
k l t sekreta
k t
primarnih i sekundarnih muških polnih
žlezda
39
Izgled ST
 staklasto sivu boju ima ejakulat sa smanjenim

brojem spermatozoida
 žućkasto-mutna boja i sluzave pruge ukazuju na
infekciju
 crvena boja ukazuje na hemospermiju (pojava
eritrocita u ejakulatu)
40

Crvena boja ukazuje na
hemospermiju
(pojava eritrocita u ejakulatu)
41
Izgled ST
 sekret prostate, pored mirisa, ejakulatu daje mlečni
izgled, a sekret semenih vezikula i mukoznih žlezda,
sluzavu konzistenciju
 koagulacioni enzim, koji se nalazi u sekretu prostate,
uzrokuje da fibrinogen iz sekreta semenih vezikula
stvara nežni koagulum
 u prvim minutima posle ejakulacije, spermatozoidi su
više manje nepokretni zbog viskoznosti koaguluma
 kada se koagulum otopi, spermatozoidi odmah
postaju veoma pokretni
42

Izgled ST
Ispitivanje likvefakcije ejakulata
 treba da se p pojavi
j u toku 20 do 40 minuta od
ejakulacije, na sobnoj temperaturi
 ako se likvefakcija pojavi ranije - ukazuje na

oboljenje izvodnih kanala
 ako se ne pojavi ni posle jednog sata od
ejakulacije - sumnja se na smanjenu sekreciju
prostate
43
Zapremina
 meri se direktno u graduisanoj posudi, i iznosi u
proseku od 3 do 5 mL
 zapremina ispod 2 mL – patološki nalaz
 iznad 8 mL potiče od:
 eliminacije sekreta iz prostate i semenih
vezikula
 kod bilateralne varikokele
44

Viskozitet
 posmatra se pri mešanju ejakulata
 kada je viskozitet povišen, na vrhu

igle se umesto kapi formiraju
končići
45
pH
 odredjuje se indikatorskim papirom

sa rasponom pH od 6,4 do 8,0
 referentne vrednosti: od 7,2 do 8
46

pH
 alkalni karakter ejakulata potiče od prostate
 važno za uspešnu oplodnju jajne ćelije, jer je tečnost u
ductusu deferensu relativno kisela usled gomilanja
k
konačnih
č ih produkata
d k t metabolizma
t b li spermatozoida,
t id št
što
smanjuje njihovu fertilnost
 vaginalni sekret žene je takodje kiseo (pH 3,5-4), a
spermatozoidi postaju optimalno pokretni tek na pH od
6-6,5
 prostatički sekret posle ejakulacije neutrališe kiselost
drugih sekreta, i povećava pokretljivost i fertilnost
spermatozoida
47
1. Aglutinacija
2
2. P k tlji
Pokretljivost
t
3. Koncentracija spermatozoida
4. Ćelije
5. Vitalnost
6. Morfologija spermatozoida
48

Aglutinacija spermatozoida
 ukazuje na antitela
 posmatra se u nativnom uzorku
 može da bude:
1. aglutinacija glava za glavu
2. rep za rep
3. mešana
49
Aglutinacija spermatozoida
 pozitivan test prezentuje aglutinaciju

pokretnih
k t ih spermatozoida
t id i ukazuje
k j na
imunološki uzrok neplodnosti
 treba biti obazriv u tumačenju rezultata ovih

ispitivanja jer se nekada aglutinacija može
ispitivanja,
javiti zbog prisustva raznih nespecifičnih
faktora (mikroorganizama, hemikalija, itd.)
50

Pokretljivost spermatozoida
 posmatra se u nativnom uzorku
 prvo se posmatra procenat pokretljivih
spermatozoida
 zatim kvalitet pokretljivosti koji ima 4
klasifikacije
a - brza progresivna pokretljivost
b - sporo ili "lenjo" napredovanje unapred
c - neprogresivna pokretljivost
d - nepokretljivost
51
 zavisi od temperature
 pri mikroskopskom odredjivanju koristi

topla mikroskopska pločica
52

POKRETLJIVOST SPERMATOZOIDA
53
POKRETLJIVOST SPERMATOZOIDA
54

Computer – aided videocinematographic
sperm analysis (CASA)
– tehnika koja je razvijena za ispitivanje

pokretljivosti spermatozoida (u naučne svrhe)
55
Određivanje morfologije spermatozoida pomoću

medeaLAB CASA sistema
56

Vitalnost
 ukoliko je udeo nepokretnih spermatozoida

viši od 50% koristi se tehnika bojenja sa
eozinom za razlikovanje vitalnih (živih) od
mrtvih spermatozoida
 mrtve ćelije absorbuju boju dok intaktne
membrane sprečavaju ulazak boje
57
Koncentracija spermatozoida
 određuje se u hemocitometrima (Neubauer ili Makler)

uz razblaženje rastvorom koji sadrži bikarbonat,
bikarbonat
formalin ili gencijana violet
 upotreba brojača krvnih ćelija je ograničena zbog
nepreciznosti ove metode ispod 10 miliona
spermatozoida u mL ejakulata
58

59
60

Ćelije
 pored spermatozoida ejakulat sadrži:
1 epitelne ćelije urogenitalnog trakta
1.
2. spermatogenske ćelije
3. leukocite
 spermatogenske ćelije i leukociti su označeni
kao okrugle ćelije i međusobno se razlikuju
bojenjem sa peroksidazom koja detektuje
leukocite
61
Morfologija spermatozoida
 posmatra
p se kontrast-faznim mikroskopom
p
na svežem uzorku obojenim po
Papanicolaou
 diferencijacija različitih abnormalnih formi

ima malu dijagnostičku vrednost i važno je
da se odredi procenat normalno formiranih
spermatozoida
62

 normalni spermatozoid je
ovalnog oblika
 3-5 m dužina
 2-3 m širina
 intaktni srednji deo (7-8 m
d ži )
dužina)
 rep 45 m dug
 ima vidljivu akrozomsku kapu
63
64

65
1. kisela fosfataza
2. citrat
3. cink
4. magnezijum
5. fruktoza
6. -glukozidaza
66

 kisela fosfataza, citrat, cink i

magnezijum u seminalnoj plazmi
potiču iz prostate
 niska koncentracija
j cinka jje nađena
kod poremećaja prostate
67
 fruktoza potiče iz seminalne kesice

 fruktoza govori o endokrinoj aktivnosti
 precenjen marker
 ekstremno nizak nivo govori o odsustvu
(agenezi), postojanju opstrukcije
ejakulatornog kanala ili o teškoj disfunkciji
seminalnih kesica što upućuje na dalje
transrektalno ultrazvučno ispitivanje
68

-glukozidaza
 marker epididimalne funkcije
69
 aglutinacija spermatozoida ukazuje na prisustvo
specifičnih antitela
 međutim ne dovode sva antitela do aglutinacije
 neka se nalaze na površini spermatozoida i dovode
do nepokretnosti spermatozoida u cervikalnoj
mukozi ili su citotoksični
70

 prisustvo ili odsustvo antisperm At i tip At (IgG, IgA i

IgM)
 Ig se nalaze na membrani spermatozoida i
identifikuju se MAR testom (mixed antiglobulin
reaction) za IgG i IgA
 posmatra se aglutinacija između spermatozoida i
eritrocita koji su tretirani anti-rezus antitelima
 koriste se i poliakrilamidne kuglice obložene anti-
imunoglobulinima
71
UZORAK SPERME
 za postavljanje dijagnoze neophodna su
2-3 ispitivanja sperme u toku 3 meseca
 neophodno vođenje sistematske

dokumentacije
 standardizovan p
postupak;
p ; WHO
preporuke; kontrola kvaliteta
 molekularno genetička ispitivanja

72

REFERENTNI INTERVAL
(prema WHO preporuci)
 Zapremina
 2 mL
 Koncentracija sperme
 20 miliona spermatozoida/mL
 Ukupan broj spermatozoida
 40 miliona spermatozoida/ejakulatu
73
REFERENTNI INTERVAL
 Pokretljivost
 50% spermatozoida sa progresivnom
pokretljivošću napred (tj. kategorije a+b),
ili  25% spermatozoida sa brzom
progresivnom pokretljivošću (kategorija a)
 Morfologija
 30% spermatozoida normalnog
izgleda
74

REFERENTNI INTERVAL
 Vitalnost
 75% vitalnih spermatozoida, tj.
ćelija koje ne vezuju eozin boju
 MAR test (mixed agglutination
reaction))
< 10% sperme sa adherirajućim
česticama ili eritrocitima
75
REFERENTNI INTERVAL
 Leukociti
< 1 milion/mL
 -glukozidaza (neutralna)
 11mU/ejakulata
 Fruktoza
 13 mol/ejakulatu
76

REFERENTNI INTERVAL
 Citrat
 Kisela fosfataza
 Cink
 2,4 mol/ejakulatu
77
Hamilton Thorne Computer Assisted Sperm Analyser

HTM-CEROS
78

„playback“ slika sa HTM-CEROS-a
79
Analizator kvaliteta sperme

(The Spermalite/ SQA-V Technology)
80

„Sperm Quality Analyser“ SQA IIC-P
81
„CASA Sperm Analyser“
82

83

10/26/2016
AMNIONSKA TEČNOST
AMNIONSKA TEČNOST
• povezuje se sa citogenetskom analizom
• proizvod fetalnog metabolizma
• daje informaciju o metaboličkim procesima
koji se odvijaju u toku sazrevanja fetusa,
kao i o napredovanju sazrevanja
1
10/26/2016
TRUDNOĆA I RAZVOJ FETUSA

• važna uloga biohemijskih laboratorija u praćenju
trudnoće
• lekar mora da vodi računa o najmanje dva
pacijenta u isto vreme: o majci i detetu
• trudnoća traje 40 nedelja (1. dan pm)
• uobičajena podela trudnoće na tri intervala
(t i
(trimestra),
t ) koji
k ji traju
t j neznatno
t duže
d ž od d 13
nedelja
• termin porođaja je u intervalu 37-42 nedelje
NASTANAK EMBRIONA
• ZAČEĆE U JAJOVODU (14, DANA
CIKLUSA)
• BLASTOCIT
• IMPLANTACIJA U ZID MATERICE
(5, dan po začeću)
• NASTANAK EMBRIONA
TROFOBLAST:
• luči hormone koji održavaju trudnoću
• pomaže ishranu ploda
• uspostavlja fetalnu cirkulaciju
(stvaranjem nabora)
2
10/26/2016
RAZVOJ EMBRIONA I FETUSA

• OD 10 NEDELJE EMBRION SE ZOVE FETUS
• BRZA ĆELIJSKA PODELA, DIFERENCIJACIJA I RAST
• ORGANOGENEZA
kraj I kraj II kraj III

trimestra trimestra trimestra
težina (g) 13 700 3200
dužina (cm) 8 30 50
FORMIRANJE PLACENTE
• po završenoj implantaciji dolazi do brze

koordinisane proliferacije ćelija
endometrijuma i trofoblasta
• odvoja "strano telo"-fetus od majke
• veza između cirkulatornog sistema majke i
fetusa
• ishrana fetusa putem majčine krvi
• otklanjanje "otpada" fetusa ka majci
3
10/26/2016
FORMIRANJE RESICA
• sa rastom embriona se povećavaju nutritivne i

potrebe
t b za kiseonikom
ki ik
• trofoblast povećava svoju površinu formiranjem
resica
• površina ovih resica je jako velika
• iz resica se formira fetalna cirkulacija placente
FETUS OKRUŽEN AMNIONSKOM TEČNOŠĆU

unutrašnja membrana - amnionska memrana
okružuje embrion i ispunjena je tečnošću
amnion (membranska kesa koja okružuje fetus)
"liquor amnii" ili amnionska tečnost
4
10/26/2016
NORMALAN TRASPORT KROZ PLACENTU

NE TRANSPORTUJU SE
• VEĆINA PROTEINA
• TIREOIDNI HORMONI
• MAJČINI IgM, IgA
• MAJČINI I FETALNI ERITROCITI
OGRANIČEN PASIVAN TRANSPORT
• NEKONJUGOVANI STEROIDI
• STEROIDNI SULFATI
• SLOBODNE MASNE KISELINE

PASIVAN TRANSPORT:
• MOLEKULE DO MM 5000, RASTVORLJIVE U LIPIDIMA
• KISEONIK
• UGLJEN-DIOKSID
• NATRIJUM I HLORIDI
• UREA
• ETANOL
AKTIVAN TRANSPORT KROZ ĆELIJSKU MEMBRANU:

• GLUKOZA
• MNOGE AMINO KISELINE
• KALCIJUM
10
5
10/26/2016
PRENOS PREKO RECEPTORA
• MAJČIN IgG
• INSULIN
• LDL
11
ULOGA AMNIONSKE TEČNOSTI

1. zaštita fetusa
2. da omogući kretanje i rast fetusa
3. stabilizuje temperaturu da bi zaštitila
fetus od ekstremnih promena
temperature
4 da omogući odgovarajući razvoj pluća
4.
6
10/26/2016
NASTANAK AMNIONSKE TEČNOSTI
• dinamičan medijum
• menja svoj sastav tokom trajanja trudnoće
• nastaje iz više izvora:
– placenta
– fetalni bubrezi
– pluća
– koža
– intestinum
• različit udeo u različitim fazama razvoja ploda
NASTANAK AMNIONSKE TEČNOSTI

I TRIMESTAR – transudat majčine plazme kroz kožu
fetusa (proširenje fetalne ekstracelularne tečnosti) –
u 28, nedelji koža potpuno zrela
• II TRIMESTAR – od 11-12 nedelje fetalni bubrezi

počinju lučenje urina, posle 20, nedelje imaju glavnu
ulogu u formiranju sastava i volumena
• III TRIMESTAR – u drugoj polovini trudnoće pluća

fetusa sazrevaju i luče sekret koji se meša sa AT,
takođe dolazi do deskvamacije kože sto utiče na
sastav
7
10/26/2016
POREKLO I REGULACIJA AT
• regulisana ravnotežom između produkcije fetalnog urina,
tečnosti u plućima i apsorpcije od fetalnog gutanja i
i t
intramembranskog
b k toka
t k
– intramembranski tok =apsorpcija vode i rastvorenih supstanci iz
amnionske tečnosti u vaskularni sistem fetusa
• količina amnionske se povećava u toku trudnoće,
dostižući maksimum u toku trećeg trimestra, kada se
postepeno smanjuje pre porođaja
• u prvoj polovini trudnoće značajno mesto zauzima fetalna
koža dok keratinizacija kože nakon 6
koža, 6. meseca značajno
smanjuje ovaj put sekrecije
• u drugoj polovini trudnoće amnionska tečnost je
uglavnom fetalnog, a samo delimično majčinog porekla
POREKLO I REGULACIJA AT
• u prvom trimestru: uglavnom majčinog porekla i
predstavlja transudat majčine plazme nastao aktivnim
t
transportom
t rastvorljivih
t lji ih materija
t ij i pasivnom
i dif
difuzijom
ij
vode, a manji deo aktivnom sekrecijom epitela amniona
• u toku drugog trimesta do polovine trudnoće: fetus
sekretuje određenu zapreminu tečnosti iz pluća, što je
neophodno za širenje pluća u toku rasta; u toku svake
epizode širenja fetalnih pluća, sekretovana tečnost iz
pluća ulazi u amnionsku tečnost, što potvrđuje i prisustvo
plućnog surfaktanta, koji predstavlja indeks zrelosti
fetalnih pluća.
• posle prvog trimestra: fetalni urin daje najveći doprinos
zapremini amnionske tečnosti
8
10/26/2016
ZAPREMINA AMNIONSKE TEČNOSTI
• u 12. nedelji - oko 50 mL

• do 15.
15 nedelje - povećava se za 15
15-30
30 mL nedeljno
• 16-20. nedelje - za 50 mL nedeljno
• u 20. nedelji - prosečno 400 mL
• 36-38 nedelje - najveća i iznosi oko 1500 mL
• smanjuje
j j se i pred
d porođaj
đ j – 800 mL
L (300
(300-1500
1500 mL)
L)
• ukoliko trudnoća traje 42 nedelje - oko 600 mL
POREMEĆAJI U VOLUMENU
HIDRAMNION
povećanje volumena preko 2000 mL zbog
nedovoljnog gutanja tečnosti
OLIGOHIDRAMNION
smanjenje volumena ispod 200 mL
((hronično oboleli fetus g
guta više tečnosti
nego što je to normalno)
9
10/26/2016
POREMEĆAJI U VOLUMENU
• HIDRAMNION
– kod anencefalije
– defekata u gutanju amnionske tečnosti zbog
opstrukcije jednjaka i gornjih delova GIT-a fetusa
– hemolitičke bolesti
– defekata u CNS fetusa
• OLIGOHIDRAMNION
– posledica patoloških stanja majke u trudnoći
(diabetes mellitus, hipertenzija)
– kongenitalnih malformacija fetusa (ageneza bubrega,
opstrukcija donjih delova urinarnog trakta)
– insuficijencije placente
• može biti povezan sa kompresijom pupčane vrpce, što
dovodi do usporavanja rada srca i smrti fetusa
STVARANJE – UKLANJANJE
• dinamička ravnoteža između stvaranja i
uklanjanja
• u prvoj polovini trudnoće nastaje kao transudat

iz površine kože fetusa
• kasnije - zapremina zavisi od ravnoteže

između uriniranja fetusa i količine koju fetus
proguta
10
10/26/2016
STVARANJE – UKLANJANJE
• 200-450 mL AF na dan se odstranjuje gutanjem fetusa
a što iznosi polovinu koja se stvara uriniranjem
• s obzirom da se povećava količina u drugom trimestru

značajna količina urina koja se stvara mora da bude
reabsorbovana drugim putevima
• protok
t k AF od
d traheja
t h j i ffarinksa
i k ffetusa
t d
do jjednjaka
d j k
dovodi do pojave plućnih surfaktanata fetusa
SASTAV AMNIONSKE TEČNOSTI

SASTOJCI 15, 25, 40,
NEDELJA NEDELJA NEDELJA
NATRIJUM (mmol/L) 136 138 126
KALIJUM (mmol/L) 3,9 4,0 4,3
HLORIDI (mmol/L) 111 109 103
BIKARBONATI (mmol/L) 16 18 16
GLUKOZA (mmol/L) 2,6 2,16 <1
UKUPNI PROTEINI (g/L) 5 8 3
UREA (mmol/L) 3,97 3,97 6,42
KREATININ (mol/L) 70,7 79,6 194
MOKRAĆNA K. (mol/L) 236 336 614
BILIRUBIN (mol/L) 2,21 2,39 0,7
OSMOLALNOST (mosm/kg) 272 272 255
22
11
10/26/2016
HEMIJSKI SASTAV AT
• sastav sličan sastavu plazme majke i sadrži malu
količinu odvojenih fetalnih ćelija kože, digestivnog
sistema i urinarnog trakta (ove ćelije čine osnovu
citogenetske analize)
• sadrži supstance koje produkuje fetus, kao što su
bilirubin, lipidi, enzimi, elektroliti, jedinjenja azota i
proteini koji se mogu određivati u svrhu procene zrelosti
fetusa
HEMIJSKI SASTAV
• deo tečnosti nastaje iz fetalnog respiratornog trakta, urina, amnionske
membrane i pupčane vrpce
• sastav se menja kada počne produkcija fetalnog urina:
– koncentracije kreatinina, uree i mokraćne kiseline se povećavaju
– koncentracije glukoze i proteina se smanjuju
– koncentracije elektrolita, enzima, hormona i metabolita takođe variraju,
ali imaju mali klinički znača
• Određivanje koncentracije kreatinina u AT se koristi za procenu
starosti fetusa:
– pre 36. nedelje gestacije, koncentracija kreatinina je između 133 i 177 μmol/L
– kada koncentracija kreatinina prelazi 177 μmol/L
μmol/L, starost fetusa se procenjuje kao >36
nedelja
• koncentracija mokraćne kiseline takođe se povećava sa razvojem trudnoće i
korelira za zrelošću fetusa (koncentracije iznad 458 mol/L nalaze se kod
zrelog fetusa)
12
10/26/2016
Diferencijacija urina majke i AT
• neophodno da bi se utvrdilo DA NIJE DOŠLO DO

PREVREMENE RUPTURE MEMBRANA ILI SLUČAJNE
PUNKCIJE MOKRAĆNE BEŠIKE majke u toku sakupljanja
uzorka
• analiza kreatinina, uree, glukoze i proteina pomaže u
diferencijaciji
– kreatinin i urea su mnogo niže u AT nego u urinu (u AT: kreatinin
do 309 μmol/L
μmol/L, urea do 10,7
10 7 mmol/L; u urinu: kreatinin do 884
μmol/L, urea do 107 mmol/L)
– glukoza i proteini test-trakama je manje pouzdan indikator
Diferencijacija urina majke i AT

• “PAPRAT TEST” - test za povišenu estrogensku
aktivnost i za razlikovanje AT i urina u slučaju rupture
membrana
– uzorak vaginalnog sekreta se razvuče na staklenoj

pločici i ostavi da se potpuno osuši na sobnoj
temperaturi, a zatim se posmatra mikroskopski
– prisustvo kristala koji liče na paprat - posledica
povećane sekrecije estrogena (pozitivan screening
test za AT)
13
10/26/2016
SAKUPLJANJE UZORAKA AT
• aspiracijom iz amnionske kese postupkom koji se naziva
amniocenteza
• konitnuiran ultrazvuk se koristi za lokalizaciju fetusa
f i
placente, da bi se procedura izvela bezbedno
• tanka, šuplja igla se uvodi kroz abdomen majke u uterus
i amnionsku kesu da bi se AT aspirirala
• generalno, amniocenteza je bezbedna procedura,
naročito kada se izvodi posle 14. nedelje gestacije
• za hromozomsku analizu se obično sakuplja oko 16.
nedelje gestacije
• testovi za procenu fetalnog distresa i zrelosti izvode se
kasnije, u trećem trimestru
AMNIOCENTEZA - POSTUPCI
• TRANSABDOMINALNA
punktira se iglom kroz trbušni zid žene i sve ovojnice
ploda do amnionske šupljine; uzorak ne sme biti
kontaminiran krvlju ili mekonijumom jer dolazi do
interferencije sa većinom testova
• TRANSVAGINALNA
ređe se koristi jer je veća mogućnost kontaminacije
vaginalnim
i l i sekretom
k t kkojiji ometa
t većinu
ći odredjivanja
d dji j i
veća mogućnost infekcije
28
14
10/26/2016
AMNICENTEZA
29
AMNICENTEZA
30
15
10/26/2016
AMNICENTEZA
31
INDIKACIJE ZA AMNIOCENTEZU
INDIKACIJA NEDELJA
TRUDNOĆE
prenatalno odredjivanje naslednih grešaka (hromozomske 16.

anomalije, nasledne metaboličke greške, defekt neuralne
cevi)
hemolitička bolest novorodjenčeta (izoimunizacija) 20 – 28
utvrdjivanje zrelosti pluća fetusa 34 -42
utvrdjivanje ugroženosti ploda (horioamnionitis) 34 - 42
32
16
10/26/2016
AMNIOCENTEZA -RIZICI
• NAJRANIJE 16. NEDELJA (100 – 175 ml)
uzima se najviše 10 – 20 mL
R I Z I C I:
• kod majke: sepsa, hemoragija, abortus
• kod fetusa: sepsa, povredjivanje, abortus
((fetalne malformacije)
j )
33
AMNIOCENTEZA - PREPORUKE
• maksimalno 20 mL može da se uzme
• uzimanje j veće količine može da izazove p prevremeni p
porođajj ili
spontanu rupturu membrana
• prva 2 ili 3 mL koja se sakupe mogu da budu kontaminirana
majčinom krvlju, tkivnom tečnošću i ćelijama – odbacuju se
• treba da se analizira ubrzo po uzimanju
• treba opisati izgled tečnosti pre i posle centrifugiranja
• ćelije treba izdvojiti centrifugiranjem na 500 do 1000 g 5 minuta
• sediment i supernatant mogu da se čuvaju oko 24h na tamnom
mestu na 2-8 °C
• za analizu bilirubina u slučaju hemolitičke bolesti novorođenčeta
mora sve vreme da bude zaštićena od svetlosti
17
10/26/2016
AMNIOCENTEZA - INDIKACIJE
• RANA AMNIOCENTEZA (u 15. do 18. nedelji gestacije):
– starost majke od 35 ili više godina na porođaju
– porodična istorija hromozomskih abnormalnosti, kao što je trizomija 21
(Down-ov sindrom)
– roditelji su nosioci abnormalnog rearanžmana hromozoma
– ranija trudnoća ili dete sa urođenim defektom,
– roditelj je nosilac metaboličke bolesti,
– istorija genetskih bolesti kao što je anemija srpastih ćelija, Tay-Sachs-
ova bolest, hemofilija, mišićna distrofija, Huntington-ova korea, cistična
fibroza
– povišena koncentarcija AFP u serumu majke
– dete sa defetkom neuralne cevu, kao što je spina bifida, ili defektima
ventralnog zida
– tri ili više spontanih pobačaja
• KASNA AMNIOCENTEZA (posle 20 nedelje

gestacije):
– da bi se procenila zrelost fetalnih pluća
– fetalni distres – hemolitička bolest novorođenčeta
izazvana Rh inkompatibilnošću krvne grupe
18
10/26/2016
• kariotip fetusa zbog mogućih genetskih
malformacija
• -feto protein za dijagnozu defekta neuralne cevi
• enzimi zbog moguće nasledne deficijencije
pojedinih enzima
j može se otkriti
• iz kultivisanih i nekultivisanih ćelija
više od 45 genetski uslovljenih bolesti
• otkrivanje preko 10 metaboličkih grešaka
određivanjem aktivnosti enzima ili metabolita
Rukovanje i obrada uzoraka AT

• zavisi od testa koji se traži
• uzorak mora hitno da se donese u laboratoriju
• za ispitivanja
p j zrelosti fetalnih p
pluća ((fetal lung y FLM)) treba da
g maturity,
se transportuje u laboratoriju na ledu (čuva se u frižideru ili zamrzne
72h pre određivanja; dobro promešati po otapanju; ponovljeno
zamrzavanje i otapanje se ne preporučuje)
• za citogenetske studije se održavaju na sobnoj temperaturi ili telesnoj
temperaturi (inkubacija na 37 °C)
• za hemijska ispitivanja AT bi trebalo da se odvoji od ćelija i debrija
što je pre moguće da bi se sprečila promena hemijskog sastava usled
ćelijskog metabolizma ili raspadanja ćelija
– odvajanje: centrifugiranjem ili filtracijom
– filtracija se preporučuje kod metoda za određivanje FLM da bi se sprečio gubitak
fosfolipida
19
10/26/2016
BOJA I IZGLED AT
• normalno: bezbojna i može da bude blago ili umereno zamućena od
ćelijskog debrija, naročito u kasnijim fazama fetalnog razvoja
• ako sadrži tragove krvi može da bude posledica traume pri uzimanju
uzorka, abdominalne traume ili intraamnionskog krvarenja
• prisustvo bilirubina daje tečnosti žutu boju i ukazuje na destrukciju
eritrocita usled hemolitičke bolesti novorođenčeta
• mekonijum (definiše se kao prvi sadržaj creva novorođenčeta) je
prisutan kao rezultat sekrecije iz intestinuma fetusa tamno zelena
boja
• veoma tamna, tamno crvena do mrka tečnost je povezana sa smrću
novorođenčeta
BIOHEMIJSKA ISPITIVANJA AT
• hemijski sastav amnionske tečnosti je kompleksan i varira

sa razvojem trudnoće
• u ranoj trudnoći sastav amnionske tečnosti je sličan

serumu, a kako trudnoća napreduje koncentracija nekih
parametara se smanjuje (proteini, bilirubin, natrijum,
hloridi), dok se koncentracija drugih povećava (kreatinin,
mokraćna kiselina
kiselina, amilaza,
amilaza alkalna fosfataza
fosfataza, lipidi)
20
10/26/2016
ELEKTROLITI U AT
• u prvoj polovini trudnoće: skoro isti sastav elektrolita kao
serum majke, da bi sa napredovanjem trudnoće postala
blago hipotonična
• u drugoj polovini trudnoće: pad osmolalnosti AT (do 225
mOsm/L) zbog učešća sve većih količina hipotoničnog
fetalnog urina u sastavu AT, što je praćeno padom
koncentracije Na+ i Cl-
• koncentracija natrijuma pred porođaj iznosi 125-130
mmol/L dok K+ ostaje relativno konstantan tokom
trudnoće i iznosi 4-4,5 mmol/L
• bikarbonati, fosfati, kalcijum, magnezijum, gvožđe - nema
klinički značaj
BILIRUBIN U AT
• pojavljuje se u 12. nedelji i dostiže maksimalne vrednosti

u 20
20. nedelji
nedelji, kada naglo opada i posle 30.
30 nedelje se
jedva može dokazati
• povećana kod Rh senzibilizacije majke zbog hemolize
fetalnih eritrocita
• normalna koncentracija bilirubina ne prelazi 5,0 mol/L,
dok kod hemolitičke bolesti iznosi 34,2-51,3 mol/L
21
10/26/2016
GLUKOZA U AT
• opada sa starošću trudnoće i u vezi je sa deponovajem

glikogena u jetri
• u prvom trimestru trudnoće: do 4 mmol/L
• u 34. nedelji: opada na 1,22 mmol/L
• pred kraj trudnoće: svega 0,5 mmol/L
• snižena: insuficijencija placente i hipotrofija fetusa
• p
povišena: diabetes melitus majkej
PROTEINI U AT
• potiču iz plazme majke,

majke fetusa i amnionskog omotača
• majčinog porekla dospevaju transudacijom kroz amnion
– kod defekta neuralne cevi: povišene koncentracije -feto proteina
• fetalnog porekla potiču od kože, urinarnog trakta, GIT-a i
respiratornog trakta
– proteini iz respiratornog trakta: sintetišu se u epitelnim ćelijama i
ulaze
la e u sastav
sasta ssurfaktanta
rfaktanta (sastoje se od nekoliko specifičnih
proteina i fosfolipida; najznačajniji su lecitin i sfingomijelin).
22
10/26/2016
PROTEINI U AT
• ukupni proteini: postepeno se ↓ sa razvojem trudnoće, do

28 nedelje
28. d lj iiznose 3
3,8-8,3
8 8 3 g/L,
/L prii kkraju
j ttrudnoće
d ć 1,5-3,5
1535
g/L
• albumin: ↓ sa 4 g/L na 0,5 g/L na kraju trudnoće
• fibrinogena nema
• IgA, IgG i IgD ↑ do sredine trudnoće, a zatim ↓
• IgM ostaje konstantan do 3535. nedelje
nedelje, a zatim ↑ do kraja
trudnoće
AFP U AT – defekt neuralne cevi
• defekti neuralne cevi: anencefalija i spina bifida (kada ne

dođe do zatvaranja kože iznad nervnog tkiva)
• glavni protein koga produkuje fetalna jetra u toku rane
gestacije (pre 18. nedelje)
• ↑ koncentracije: u cirkulaciji majke i u AT
• u serumu majke: zbog kombinovane cirkulacije majke i
fetusa
• u amnionskoj tečnosti: zbog difuzije i ekskrecije fetalnog
urina
23
10/26/2016
AFP U AT – indikacije
• kada su koncentracije u serumu majke visoke
• kada postoji porodična istorija
• mogućnost multiple trudnoće
• normalne vrednosti zavise od nedelje gestacije, pošto
fetus produkuje maksimalnu količinu AFP između 12. i 15.
nedelje, posle čega koncentracije u amnionskoj tečnosti
počinju da ↓
• koncentracije u serumu i AT se izražavaju kao umnošci
medijane
dij ((multiples
lti l off median,
di M M)
MoM)
• abnormalna vrednost ako je MoM veća od 2,5
• ↑ koncentracije AFP u seumu: određivanje
acetilholinesteraze u AT (specifičnija za defekte neuralne
cevi od AFP, pod uslovom da uzorak nije krvav)
ACETILHOLINESTERAZA U AT
• ↑ koncentracije AFP se prate određivanjem

acetilholinesteraze (AChE) u amnionskoj tečnosti
• test je specifičniji za defekte neuralne cevi od AFP
• uzorak ne sme da bude krvav, pošto eritrociti sadrže

AChE
24
10/26/2016
ENZIMI U AT
• više od 50 enzima koji se razlikuju po aktivnosti u
različitim stadijumima trudnoće
• LDH: neznatno se menja u toku trudnoće i obično je malo
niža nego u serumu majke; veliko povećanje aktivnosti
LDH (2-20 puta) se javlja kada preti smrt fetusa.
• jetreni enzimi: neznatno se menja tokom trudnoće
(izuzetak ALP koja značajno ↑ tokom trećeg trimestra
zbog sinteze placentalnog izoenzima)
• amilaza: ↑ sa razvojem trudnoće
• AST: neznatno se ↑
• CK: niža nego u serumu majke
ENZIMI U AT
• više od 50 enzima koji se razlikuju po aktivnosti u
različitim stadijumima trudnoće
• LDH: neznatno se menja u toku trudnoće i obično je malo
niža nego u serumu majke; veliko povećanje aktivnosti
LDH (2-20 puta) se javlja kada preti smrt fetusa
• jetreni enzimi: neznatno se menja tokom trudnoće
(izuzetak ALP koja značajno ↑ tokom trećeg trimestra
zbog sinteze placentalnog izoenzima)
• amilaza: ↑ sa razvojem trudnoće
• AST: neznatno se ↑
• CK: niža nego u serumu majke
25
10/26/2016
PATOLOŠKA STANJA U TOKU TRUDNOĆE
• OBOLJENJA PLACENTE
– hidatidiformne mole
• NEZRELOST PLUĆA FETUSA
– najčešće dolazi nedovoljnog prisustva surfaktanata pluća; označeno
kao respiratorni distres sindrom (RDS);
• FETALNA HEMOLITIČKA OBOLJENJA
– Rh problemi
• DIJABETES MAJKE
• TOKSEMIJA
– karakteriše se hipertenzijom, edemom i proteinurijom koja počinje
posle 20 nedelje gestacije
51
BIOHEMIJSKA ISPITIVANJA
1. BILIRUBIN U AT
2. PROCENA ZRELOSTI FETUSA
3. PROCENA ZRELOSTI PLUĆA FETUSA
52
26
10/26/2016
HEMOLITIČKA BOLEST NOVOROĐENČETA

ERYTHROBLASTOSIS FETALIS – FETALNA ERITROBLASTOZA
• najstariji laboratorijski test za AT

• procenjuje stepen fetalne anemije nastale usled
hemolitičke bolesti
• incidenca bolesti brzo opada od razvoja metoda koje
sprečavaju produkciju anti-Rh antitela u organizmu
majke posle porođaja (intramuskularnim davanjem anti-
Rh(D)-imunoglobulina majci izloženoj Rh-pozitivnim
fetalnim eritrocitima)
• At na druge Ag eritrocita su takođe sposobna da izazovu
hemolitičku bolest novorođenčeta
• imunizacija Rh-negativne majke ne mora da bude
efikasna i ne mora da se sprovodi u svim slučajevima

• bilo koji od velikog broja Ag na površini eritrocita - A, B,

Rh i dr. mogu biti odgovorni za izoimunu hemolizu
• najčešći uzrok je Rh-imunizacija koja nastaje prelaskom
eritrocita Rh(D) pozitivnog fetusa u krvotok Rh negativne
majke
• ovi eritrociti pokreću imuni odgovor majke i stvaranje
anti-D-imunoglobulina IgG klase
27
10/26/2016

• At se po pravilu ne pojavljuju neposredno nakon prelaska fetalnih

eritrocita, već nastaje tzv. primarni kontakt
• inicijalno izlaganje Ag stranih eritrocita se dešava u toku gestacije i
porođaja, kada eritrociti fetusa ulaze u cirkulaciju majke i stimulišu
imunski sistem majke da produkuje At na Ag eritrocita
• tek u drugoj trudnoći, pri ponovnom prelasku Rh(D) pozitivnih
eritrocita stvaraju se At koja prelaze placentu i izazivaju hemolizu
fetalnih eritrocita
• liza fetalnih eritrocita dovodi do pojave degradacionog
produkta
d kt hhemoglobina
l bi - nekonjugovanog
k j bili
bilirubina
bi u AT
• određivanjem bilirubina u AT određuje se stepen
hemolize i tako može da se proceni opasnost anemije po
fetus

destrukcija fetalnih eritrocita dovodi do nekoliko različitih poremećaja:
• ffetalna
t l anemijaij - otežava
t ž fetalnom
f t l srcu da
d omogući ći adekvatno
d k t
snabdevanje fetalnih tkiva kiseonikom
• anemija stimuliše eritropoezu u koštanoj srži, jetri i slezini - dolazi do
destrukcije hepatocita i nemogućnosti sinteze albumina
• smanjenja onkotskog pritiska u intravaskularnom prostoru
• do kongestivne srčane insuficijencije i generalizovanog fetalnog
edema sa ascitom, pleuralnim i perikardijalnim izlivom
28
10/26/2016

• ukoliko se ne interveniše intrauterina smrt nastupa brzo

• ako fetus preživi novorođenče će se sresti sa brojnim teškoćama
• u uterusu
t su placenta
l t i majka
jk vršili
šili ulogu
l respiracije
i ij i uklanjanja
kl j j
bilirubina, dok posle porođaja novorođenče preuzima tu ulogu na
sebe
• zbog ograničenog kapaciteta oštećene jetre, nevezani bilirubin
prelazi u CNS i dovodi do kernikterusa

• određivanje bilirubina u AT spektrofotometrijski

• meri se apsorpcioni spektar AT između 365 i 550 nm
• normalno:
l apsorbancija
b ij jje najveća
j ć na 365 nm i lilinearno opada
d ddo
550 nm
• kada je prisutan bilirubin: vidi se porast apsorbancije na 450 nm
• razlika između apsorbancije teorijske bazne linije i izmerene
apsorbancije na 450 nm predstavlja koncentraciju bilirubina u
amnionskoj tečnosti
• razlika u apsorbanciji, koja se označava kao razlika u apsorbanciji
na 450 nm (∆A450) se zatim nanosi na Liley-ev grafikon da bi se
odredila težina hemolitičke bolesti
29
10/26/2016
LILEY-EV GRAFIKON
• predstavlja ∆A450 prema gestacionoj

starosti
• podeljen je u tri zone koje predstavljaju
stepen hemolitičkog oštećenja
• u zoni 1 ukazuju na blago pogođen fetus
• u zoni 2 zahtevaju pažljivo praćenje
• u zoni 3 ukazuju na teško oštećen fetus
- treba razmotriti eventualnu intervenciju
indukcijom porođaja ili intrauterinom
izmenom krvi
APSORPCIONA KRIVA AT
NORMALNO
POVEĆAN BILIRUBIN
PIK NA 450 nm
60
30
10/26/2016
PROCENA ZRELOSTI FETUSA

• indikacije za prevremeni porođaj: eritroblastoza fetusa,
toksemija u trudnoći, dijabetes majke i neka druga stanja
• neadekvatna zrelost fetusa je glavni razlog perinatalne
smrti kod indukovanog porođaja
• indikacije:
1. pre indukovanog porođaja kod visoko-rizičnih trudnoća
2. kod diferencijalne dijagnoze prematuracije i dismaturacije
3 pre izvođenja carskog reza ili indukcije kada nije precizno
3.
utvrđena gestacijska starost
TESTOVI ZA PROCENU ZRELOSTI FETUSA
• CITOLOŠKO BOJENJE SA NIL-PLAVIM

metahromatska boja (oksan sulfat) koja boji neutralne
masti narandžasto; fetalne ćelije su žuto-narandžaste a
pozadina od majčinih epidermalnih ćelija se boji plavo;
izražava se kao % u odnosu na majčine ćelije (10-50%)
• KONCENTRACIJA KREATININA
(> 177 µmol/L) odražava zrelost fetusa
62
31
10/26/2016
PROCENA ZRELOSTI PLUĆA
• na rođenju novorođenče treba da preuzme

vitalnu funkciju disanja koju je ranije obavljala
majčina cirkulacija
• pluća novorođenčeta za nekoliko minuta prelaze
iz tečnog prostora u gasni, što je moguće samo
ako su pluća potpuno razvijena
• proces sazrevanja pluća fetusa odvija se kroz:
– morfološki razvoj pluća fetusa
– sintezu, sladištenje i oslobađanje pulmonalnih
surfaktanata
SURFAKTANTI
• funkcionalna pluća treba da imaju:

– razvijene alveole sa adekvatnom površinom i vaskularizacijom
za razmenu gasova
– dovoljno surfaktanta koji treba da održe ventilirajuće pokrete
potrebne za funkcionisanje pluća
• surfaktante sintetišu alveolarne ćelije - pneumociti tip II,
a ponašaju se kao površinski aktivne materije koje
smanjuju površinsku tenziju alveola pri ekspirijumu i
sprečavaju alveolarni kolaps
• u toku ekspirijuma, smanjuje se dijametar plućnih alveola
što dovodi do povećanja tenzije alveolarnog zida
32
10/26/2016
SURFAKTANTI
• ako se povećana alveolarna površinska tenzija ne

smanji, alveole će kolabirati i doći će do nastanka
plućnih atelektaza
• sinteza i skladištenje surfaktanta počinje između 24. i 28.
nedelje gestacije
• oko 32. nedelje dolazi do oslobađanja surfaktanta u AT
iz pneumocita tip II u obliku specijalizovanih struktura
tzv lamelarnih tela (naziv na osnovu svoje strukture koja
tzv.
se sastoji od simetričnih slojeva proteina i lipida)
• humani surfaktanti sastoje se prvenstveno od fosfolipida,
lecitina, sfingomijelina i nekoliko specifičnih proteina
TESTOVI ZA PROCENU ZRELOSTI PLUĆA
• prevremeno rođena deca koja nisu stigla da sinetišu

dovoljne količine surfaktanta:
– mogu da razviju respiratorni distres sindrom koji je jedan od
najčešćih uzroka neonatalnog mortaliteta
• laboratorijski testovi za procenu zrelosti fetalnih pluća:
– od velikog su značaja, jer je kod visoko rizičnih trudnoća moguće
izvršiti prevremeni porođaj ukoliko su fetalna pluća razvijena
– izvode se sa amnionskom tećnošću
33
10/26/2016
• BIOHEMIJSKI TESTOVI
određuju fosfolipide koji ulaze u sastav surfaktanta
• BIOFIZIČKI TESTOVI
određuju surfaktante kao površinski aktivne
materije
67
BIOHEMIJSKI
1.
1 lecitin-sfingomijelin odnos
2. određivanje fosfatidil glicerola
3. fluoroscentna polarizacija
4. lameralna tela
68
34
10/26/2016
LECITIN-SFINGOMIJELIN ODNOS (L/S ODNOS)
• referentna metoda
• lecitin:
– primarna komponenta surfaktanta
– produkuje se relativno sporo i konstantnom brzinom do 35.
nedelje gestacije, kada dolazi do značajnog povećanja njegove
produkcije, što rezultuje stabilizacijom alveola fetalnih pluća
• sfingomijelin:
– produkuje se konstantnom brzinom posle 26. nedelje gestacije
– može da se koristi kao kontrola na osnovu koje se prati porast
sinteze lecitina
• lecitin i sfingomijelin se pojavljuju u AT u količinama proporcionalnim
njihovoj koncentraciji u fetalnim plućima
• pre 35. nedelje gestacije:

– L/S odnos je obično manji od 1,6
1 6 zato što još nije počela sinteza
velike količine lecitina
• posle 35. nedelje gestacije:
– odnos će porasti do 2,0 ili više kada se poveća produkcija
lecitina
• kada L/S odnos dostigne vrednost od 2,0, prevremeni
porođajj se smatra relativno bezbednim
p
• lažno povišene vrednosti se mogu javiti u tečnosti
kontaminiranoj krvlju ili mekonijumom zato što oba
sadrže i lecitin i sfingomijelin
35
10/26/2016
• kvantitativno određivanje lecitina i sfingomijelina

pomoću tankoslojne hromatografije
• procedura je zametna i ima visok koeficijent varijacije
• mnoge laboratorije su zamenile L/S odnos jeftinijim
imunoodređivanjima fosfatidil glicerola, fluorescentnom
polarizacijom i određivanjem lamelarnih tela
ODREĐIVANJE FOSFATIDIL GLICEROLA
• produkcija fosfatidil glicerola je normalno paralelna sa

produkcijom lecitina
• odložena u slučaju dijabetesa majke - pod tim
okolnostima može da se javi respiratorni distres sindrom
i kada je L/S odnos 2,0
• takoslojna hromatografija plućnog profila mora da uključi
određivanje lecitina, sfingomijelina i fosfatidil glicerola
• normalno se NE detektuje u AT pre 35 35. nedelje
nedelje, kada
njegova koncentracija naglo raste i čini 10% ukupnog
sadržaja lipida pred porođaj
36
10/26/2016
ODREĐIVANJE FOSFATIDIL GLICEROLA
• dvodimenzionalna tankoslojna hromatografija:

– određuje se zajedno sa L/S odnosom što se naziva "plućni profil fetusa“
• semikvantitativni imunološki test aglutinacije:
– alternativna procedura - Amniostat-FLM test
– analitička osetljivost 0,5 g/mL
– kontaminacija uzorka AT krvlju i mekonijumom ne utiče na rezultat testa
– izvođenje u kratkom vremenu
– komercijalna dostupnost bez skupe opreme
– preporučuje se upotreba ovog testa kao screening testa za određivanje fetalne
zrelosti pluća
p
• enzimske metode:
– izvode se za manje od 1 sata
METOD FLUORESCENTNE POLARIZACIJE
• sve popularniji kao alternativni metod za procenu zrelosti fetalnih

pluća
• TDx-FLM test se izvodi na Abbott TDx analizatoru
• uzorku AT dodaje se fluorescentna boja koja se vezuje za molekule
surfaktanta (imaju nisku fluorescentnu polarizaciju) ali i za albumin
koji ima visoku fluorescentnu polarizaciju
• odnos polarizovane fluorescentne svetlosti surfaktanta i albumina od
55 mg surfaktanta/1 g albumina i više odražavaju zrelost pluća
• vrednost manja od 39 mg/g albumina nezrelost
• vrednost 40-54 mg/g albumina neodređene
37
10/26/2016
METOD FLURESCENTNE POLARIZACIJE
• metoda je kvantitativna i precizna

• uključuje standardizovane reagense i kalibratore
• ne zahteva posebnu pripremu uzorka
• izvodi se u roku od 30 minuta
• neophodno je 1,0 mL amnionske tečnosti
• tečnost treba filtrirati a ne centrifugirati pre ispitivanja da bi se sprečila
sedimentacija lipida i dobile lažno niske vrednosti
• uzorke kontaminrane krvlju, mekonijumom, majčinim urinom i vidljivo
ikterične uzorke ne treba analizirati
LAMELARNA TELA
• lamelarna tela predstavljaju strukturni oblik surfaktanta
• pneumociti tipa II fetalnih pluća produkuju i sekretuju surfaktante, a

oni se skladište u obliku struktura koje se nazivaju lamelarna tela
oko 20. nedelje gestacije
• ulaze u alveolarne prostore i u amnionsku tečnost oko 26. nedelje

gestacije
38
10/26/2016
LAMELARNA TELA NA KANALU ZA TROMBOCITE
• dijametar: 0,5-1,0 m
• zapremina: 2-20 fL
• veličina lamelarnih tela kao čestica omogućava njihovu kvantifikaciju na
elektronskim brojačima krvnih elemenata na kanalu za trombocite
• na određivanje ne utiče prisustvo liziranih eritrocita, bilirubina ili mekonijuma
• u AT su stabilna do 10 dana na temperaturi od 4 °C
• pošto različiti hematološki brojači određuju broj lamelarnih tela na osnovu
različitih principa i zahtevaju različitu pripremu uzoraka, cutoff vrednosti se
razlikuju, odnosno moraju da se odrede granice odlučivanja specifične za
određeni analizator
• vrednosti od 40 x 109/L za necentrifugirani uzorak AT i 26 x 109/L za
centrifugirani uzorak - ukazuju na fetalnu zrelost pluća
• postoji raspon od 19 do 55 x 109/L kod različitih autora
• zbog jednostavnosti i brzine, kao i zbog male cene koštanja ova metoda je
našla široku primenu i sve više zamenjuje FLM
LAMELARNA TELA - MERENJE APSORBANCIJE
• prisustvo lamelarnih tela povećava aposorbanciju AT

• uzorci se centrifugiraju na 2000 g 10 minuta i meri im se apsobancija na
650 nm
• isključuje interferenciju od hemoglobina, ali ne i od drugih kontaminanata,
kao što je mekonijum
• apsorbancija od 0,150 je u korelaciji sa L/S odnosom ≥2,0 i prisustvom
fosfatidil glicerola
39
10/26/2016
BIOFIZIČKI
• test
t t pene
– Clementsov test
• test indeks stabilnosti pene

– foam stability index – FSI
TEST PENE (CLEMENTSOV TEST)
• “mehanički” screening test - može da se izvodi i pored pacijenta i u

laboratoriji
• još uvek u upotrebi
• zasniva se na osobini fosfolipida AT da kao površinski aktivne
materije, sa alkoholom stvaraju na površini stabilnu penu
• semikvantitativni test
• izvodi se tako što se serijska razblaženja AT pomešaju sa
ekvivalentnom količinom 95% etanola, snažno mućkaju 15 sekundi i
nakon 15 minuta stajanja posmatra stabilnost nastale pene
• pri dovoljnoj koncentraciji fosfolipida stvore se stabilni mehurići,
prsten mehurića ili stabilna pena
40
10/26/2016
• prisustvo mehurića ukazuje na dovoljnu količinu fosfolipida koji

mogu da smanje površinski napon tečnosti čak i u prisustvu
alkohola, agensa koji sprečava stvaranje pene
• negativan nalaz u svim epruvetama ukazuje na nezrelost fetalnih
pluća i veliki rizik od nastanka RDS
• pozitivan nalaz bar u prva tri razblaženja ukazuje na zrelost fetalnih
pluća
• nedostatak:
– neobjektivnost u proceni pojma "stabilnost" pene
– do 40% lažno negativnih rezultata
• u testu se koristi optimalna koncentracija etanola (47,5%) koja treba
da spreči stvaranje pene usled prisustva proteina, žučnih kiselina,
soli ili slobodnih masnih kiselina u AT
Epruveta 1 2 3 4 5
Amnionska tečnost (mL) 1,0 0,75 0,5 0,25 0,2
H20 (mL) - 0,25 0,5 0,75 0,8
95% C2H5OH (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
41
10/26/2016
Tumačenje rezultata:
Pozitivan test samo u epruveti 1: L/S = 1
Pozitivan test u epruvetama 1 i 2: L/S = 1,3
Pozitivan test u epruvetama 1, 2 i 3: L/S = 2
Pozitivan test u epruvetama 1, 2, 3 i 4: L/S = 4
Pozitivan test u svim epruvetama: L/S = 5
TEST INDEKS STABILNOSTI PENE

FOAM STABILITY INDEX – FSI
• modifikovan Clementsov test

• AT se dodaje u epruvete sa različitim količinama etanola
etanola,
tako da koncentracija etanola varira od 44 do 55%
• epruvete se snažno mućkaju i utvrdi epruveta u kojoj
postoji stabilan prsten pene
• FSI je definisan epruvetom koja sadrži najveću frakciju
etanola, u kojoj je AT još uvek sposobna da zadrži
stabilnu penu
• vrednost FSI od 48% etanola odgovara vrednosti 2,0 za
L/S odnos
• uzorak ne sme biti kontaminiran krvlju, mekonijumom i
leukocitima, zato što smanjuju površinski napon
42
ANALIZA ZNOJA i SALIVE
ZNOJ
 tečnost koja
j se stvara u znojnim
j
žlezdama, smeštenim u koži
 pH : 6,3  0,3
 Zapremina: 1-2 L dnevno; 172  4 mL/h

molekularnom dijagnostikom 1
SASTAV ZNOJA
1. Hloridi oko 30 mmol/L
2 Natrijum
2. oko 7
7,5
5 mmol/L
3. Kreatinin 44,2 mol/L
4. Lizozim 0,10  0,02 mg/L
5. 1-mikroglobulin 0,02  0,007 mg/L
6. 2-mikroglobulin 0,005  0,001 mg/L
ODREĐIVANJE HLORIDA I NATRIJUMA
 u postavljanju dijagnoze cistične fibroze
 određivanje i natrijuma i hlorida je podjednako

validno, ali više zastupljeno određivanje
hlorida iz istorijskih razloga
 pilokarpin nitrat jontoforetični test (Gibson-

Cooke) 4

CISTIČNA FIBROZA
• sinonimi: mukoviscidoza, fibrocistično
oboljenje pankreasa, pankreasna cistična
fibroza
fib
• autozomno recesivno nasledno oboljenje
egzokrinih žlezda koje dovodi do poremećaja
u sekreciji elektrolita i mukusa
• promene su različitog intenziteta na skoro
svim egzokrinim žlezdama
CISTIČNA FIBROZA
1. pankreas, intestinalne žlezde, intrahepatični žučni
putevi, žučni putevi, mokraćna bešika: dolazi do
opstrukcije lumena lepljivim ili čvrstim eozinofilnim
materijalom
2. traheobronhijalne i Bruner-ove žlezde: pojačana
sekrecija iz histološki promenjenih žlezda
3. znoj, paratiroidna žlezda i male salivarne žlezde:
velika sekrecija natrijuma i hlorida iz histološki
normalnih žlezda

CISTIČNA FIBROZA
CISTIČNA FIBROZA

CISTIČNA FIBROZA
CISTIČNA FIBROZA
 primarni uzrok smrti je pneumonija, sekundarno
izazvana teškom
teškom, abnormalno viskoznom sekrecijom
u plućima
 abnormalna sekrecija dovodi i do opstrukcije

pankreasnog kanala
kanala, a što dovodi do autoaktivacije
pankreasnih enzima i destrukcije egzokrinog tkiva
pankreasa
10

CISTIČNA FIBROZA
 gen koji se nalazi na hromozomu 7q je

odgovoran
d za sintezu
i t cistična
i tič fibroza
fib
transmembranskog regulatora (CFTR)
 F508 jje najčešća

j mutacija
j ggena koja
j dovodi
do odsustva fenilalalaninskog ostatka na
CFTR proteinu
11
CISTIČNA FIBROZA
 70% alela ima ovu mutaciju, a preostalih 30%
sadrži više od 600 manje čestih mutacija
 CFTR predstavlja deo hloridnog kanala koji
reguliše cAMP; odgovoran za transport Na i Cl
kroz epitelijalnu membranu
 heterozigoti ispoljavaju minimalne poromećaje
u epitelijalnom transportu i nemaju kliničke
manifestacije
12

CISTIČNA FIBROZA
 dijagnoza se zasniva na karakterističnim kliničkim i
laboratorijskim znacima, a potvrđuje se
jontoforetskim testom
 prenatalna mutaciona analiza
 dijagnoza se potvrđuje u najranijem životnom dobu,

ali 10% pacijenata se otkriva tek u adoloscentnom
periodu ili kasnije
 povećana je i koncentracija imunoreaktivnog tripsina

13
CISTIČNA FIBROZA
14

Dijagnostički algoritam cistične fibroze
 patološke vrednosti elektrolita u znoju

 prisustvu abnormalnosti u bronhijama i
pankreasu
 porodična istorija
 "skrining" novorođenčadi: određivanje
imunoreaktivnog tripsina u krvi
 tehnike molekularne genetike (DNA analiza)
15
Pilokarpin nitrat jontoforetični test

(Gibson-Cooke)
 u cističnoj fibrozi dolazi do promene sekrecije
znojnih žlezda a ne dolazi do strukturnih
promena
 pilokarpin (holinergični efekat) stimuliše
znojne žlezde
 farmakološka stimulacija lokalizovanog
znojenja merenje količine znoja i određivanje
znojenja,
hlorida
16

• Primena slabe električne struje

na test površinu
• Pozitivna elektroda se pokrije
gazom i zasiti rastvorom
pilokarpina (stimuliše znojenje)
• Negativna elektroda se pokrije
gazom i zasiti rastvorom
bikarbonata
17
• Aplikacija struje 5 do 12 minuta

• Papir se stavi preko test mesta i
pokrije parafinom
• Posle 1 sat papir se prenese u
odmerenu tikvicu
• Doda se voda zbog rastvaranja soli
• U rastvoru se određuju hloridi i
natrijum
18

(Gibson-Cooke)
 lažno negativni rezultati u slučaju prisustva edema i
hi
hipoproteinemije,
i ij alili i neadekvatnog
d k sakupljanja
k lj j
znoja
 mada su rezultati validni u toku prvih 24 sata života,

teško je sakupljanje odgovarajuće količine pre 3-4
nedelje (> 75 mg na filter papiru ili > 15 L u
mikroepruveti)
19
pilokarpin- normalno patološki

jontoforeza
hloridi (mmol/L) < 50  70
natrijum < 40  50
(mmol/L)
20

ANALIZA SALIVE
21
SALIVA
 tečnost koju sekretuju

brojne žlezde u oralnoj
duplji
22

SALIVA
• Salivarne žlezde stvaraju salivu koja vlaži
hranu i olakšava žvakanje i gutanje hrane
• Sadrži enzime koji otpočinju proces digestije
• Mehaničko čišćenje
j usta ispiranjem
p j bakterija
j
i delova hrane
• Omogućava vlažnost usta

23
SALIVARNE ŽLEZDE
• 3 para salivarnih žlezda
• 2 najveće su parotidne žlezde

(po 1 sa obe strane obraza)
• 2 submandibularne žlezde u
pozadini usta na obe strane vilice
• 2 sublingvalne žlezde na dnu
usta
• Sve žlezde prazne salivu u usta
preko kanala koji se otvraju na
različitim mestima u ustima
24

SALIVA
 1500 mL na dan
 sastav varira
 zavisi od funkcionalnog stanja
salivarnih žlezda
25
SALIVA
1 glandularna saliva
1.
2. saliva mešovitog sastava
26

Glandularna saliva
 dobija se putem kolektora ili kateterizacijom
izlivnogg kanala salivarne žlezde
 sakupljanje salive se izvodi između 6:30 i
8:30 ujutro natašte
 stimulacija se izaziva aplikacijom 1 mL 5%
rastvora limunske kiseline na prvu prednju
t ći jjezika
trećinu ik
 polietilenski kateter povezan sa pipetom
kako bi se izmerio protok
27
Saliva mešovitog sastava

 dobija se na različit način
 tehnike koje se zasnivaju na:
1. protoku
2. "pljuvanju" (najviše se koristi ali dolazi do
uticaja na određivanje zbog prisustva
mikroorganizama)
j i absorbciji
3. "usisavanju" j ((Salivette
komercijalna metoda se zasniva na
sakupljanju salive žvakanjem pamučnog
sunđera)
28

SALIVA
 posle centrifugiranja salive na 1200xg

u toku 5 minuta sva ispitivanja treba
sprovesti u roku od nekoliko sati
 može da se čuva na -20 C
29
REFERENTNI INTERVALI U MEŠANOJ SALIVI
1. albumin 0,25-0,35 g/L

2. ukupni
p p proteini 1,4-1,8 g
g/L
3. kalcijum 1,2-2,8 mmol/L
4. hloridi 5-40 mmol/L
5. urea 2,3-12,5 mmol/L
6. IgA sekretorni 0,42-0,174
0,42 0,174 g/L
7. kalijum 10-36 mmol/L
8. natrijum 2-21 mmol/L
30

PRAĆENJE KONCENTRACIJE LEKOVA
U TELESNIM TEČNOSTIMA
THERAPEUTIC DRUG MONITORING

(MANAGEMENT) TDM
(MANAGEMENT),
TDM
• multidisciplinarna klinička aktivnost
• počinje zahtevom lekara za laboratorijskim određivanjem

koncentracije leka u telesnoj tečnosti
• cilj:
– postizanja terapeutske komplianse (“compliance”)

– efikasnosti leka
– objašnjenja uzroka toksičnosti izazvane lekovima

Prvi
Poznavanje princip TDM
koncentracije leka u serumu
• najkorisnije u slučaju individualnog doziranja kako bi se
ovim doziranjem postigla optimalna efikasnost, a
terapijski efekat nije moguće izmeriti rutinskim
postupcima
• medicinske profesije koje su uključene u TDM su:

– ordinirajući lekar
– medicinski biohemičar
– klinički farmakolog
– sestre koje primenjuju terapiju
U W. J. Taylor, A. L. Finn (eds.) Individualizing Drug Therapy, 1981
Šta omogućava TDM lekaru?

• pre naučni, nego empirijski prilaz u
odabiru
d bi primene
i lleka
k u cilju
ilj optimizacije
ti i ij
terapije
• poboljšava odgovor na terapiju s obzirom
da daje informacije o distribuciji leka, tj.
farmakokinetskom statusu u trenutku
uzimanja uzorka

Farmakokinetika
• Šta je farmakokinetika?
– Proučava absorpciju, distribuciju i eliminaciju
lekova
– Farmakodinamika proučava efekte lekova
• Većina lekova ispoljava svoj efekat na
tkivnim receptorima, ali se određuje
koncentracija leka u plazmi
Model dva odeljka
Kd
Ka
Absorpcija krv tkivo
K-d
Ke
Eliminacija

Absorbcija lekova
• pravci
– oralno
– intravenski
– intramuskularno/subkutano
– dermalno
– inhalacija/intranazalno
• polako/trajno oslobađanje
Brzina absorbcije lekova
IV  Inhalacija > Intramuskularno > Oralno > Dermalno

sekunde minuti sati

Metabolizam prvog prelaza
Prolek  Aktivni lek

ili
Aktivni lek Inaktivni metabolit
ili
Lek rastvorljiv u mastima  Lek rastvorljiv u vodi
Model dva odeljka
kd
ka
k-d
ke
Eliminacija

Distribucija, () faza
• lek koji je absorbovan u krv počinje da se
distribuira u tkiva
• količina koja će se raspoređivati u tkivima zavisi
od:
– lipofilnosti
– vezivanjaj za pproteine
• deljenje leka između krvi i tkiva kvantitavno je
izraženo preko zapremine distribucije
Zapremina distribucije
(Vd)
• Količina krvi na kg telesne težine koja je neophodna za
celokupnu
p količinu leka pri
p ravnotežnojj koncentracijij
• Vd nije “stvarna” već hipotetička zapremina telesne

tečnosti koje bi bila potrebna da rastvori ukupnu količinu
leka u organizmu u istoj koncentraciji u kojoj se lek
nalazi u krvi odnosno plazmi
• To je konstanta proporcionalnosti količine leka u

organizmu, prema merenoj koncentraciji u biološkoj
tečnosti (krv, plazma ili serum)
12

Niska zapremina distribucije
krv kd tkivo
visoka niska
koncentracija u k-d koncentracija u
krvi tkivu
kd << k-d
 Vd je nisko
Vd = 0,07 L/kg (donja granica)
Lekovi sa niskom Vd
lek Vd (L/kg)
Amikacin 0,05 – 0,70
Gentamicin/Tobramicin 0,07-0,70
Fenitoin 0,70
Primidon 0,60
T fli
Teoflin 0 50
0,50
Valproinska kiselina 0,20
Etanol 0,53
14

Visoka zapremina distribucije
krv kd tkiva
Niska konc. visoka konc.
u krvi k-d u tkivu
(ng/mL)
kd >> k-d
 Vd je visoko
Za visoko lipofilne lekove, Vd može da bude  100 L/kg
Lekovi sa visokom Vd
lek Vd (L/Kg)
Digoksin 500 – 600
Karbamazepin 0,8 – 1,9
Lidokain 130
Prokainamid 2,4
Propranolol 200 – 300
Hinidin 3,0
16

Interpretacija Vd
• Lekovi sa niskom Vd se nalaze uglavnom u plazmi:
– ddobro
b se rastvaraju
t j u vodi
di (sadržaj
( d ž j u vodenom
d ddelu
l
plazme je viši nego u tkivima), ili
– vezuju se u visokom stepenu za proteine (što ih
sprečava da slobodno difunduju u tkiva)
• Lekovi sa visokom Vd se nalaze uglavnom u

tkivima, i nivo u plazmi ne govori o njihovoj
koncentraciji
17
Šta utiče na Vd?

• sadržaj masti u telu (muškarci naspram
ž
žene)
)
• tkivna perfuzija (CHF ili edemi)
• koncentracija proteina plazme
18

Efekat Vd na pik nivo u plazmi
Vd = 0,1
a leka u plazmi
Vd = 0,2
Koncentracija
Vd = 0,4
vreme 
Model dva odeljka
kd
ka
k-d
ke
Eliminacija

Eliminacija, () faza
• može da bude renalna,

renalna bilijarna
bilijarna,
sekretorna, respiratorna
• zavisi od metabolizma
• najvarijabilniji farmakokinetički parametar
21
Koji faktori utiču na brzinu eliminacije leka?
• funkcija jetre
• bubrežna funkcija
• pH urina
• genetički faktori (farmakogenetika)
• drugi lekovi
22

Farmakokinetika
Pik koncentracija u plazmi

Koncentracija leka u plazmi
t1/2
 vreme  
Ravnotežno stanje
pik
Koncentrracija leka u plazmi
Terapijski opseg
pad
doza d d d d d d vreme

Praćenje lekova u terapiji i prilagođavanje
doze
• velika interindividualna razlika u brzini
metabolizma leka; kod dece važno
 pojava saturacione kinetike leka, što prouzrokuje

strm odnos između doze i nivoa u plazmi u
okviru terapijskog raspona (na primer fenitoin)
 mali T.I. leka (kada su terapijske doze bliske

toksičnim dozama – aminoglikozidni antibiotici,
npr.)
25
Terapijski indeks (T.I.) leka

(terapijski odnos)
Odnos:
• maksimalne koncentracije leka u krvi koja
se može tolerisati
i
• minimalne koncentracije leka potrebne za
postizanje zadovoljavajućeg terapijskog
efekta
• T.I. = LD50/ED50
26

Terapijski indeks
toksična
toksičnost
Terapeutski opseg
Sub-terapeutski
Koncentracija leka u plazmi
27
Terapijski indeks
• visok • nizak
– NSAID – Litijum
• Aspirin – Neuroleptici
• Tilenol • fenitoin
• Ibuprofen • fenobarbital
– Sedativei/hipnotici – Neki antibiotici
• Benzodiazepini (100) • Gentamicin/Vankomicin
– Većina
V ći antibiotika
tibi tik /A ik i
/Amikacin
– Beta-blokatori – Digoksin (2 do 3)
– Imunosupresivi
28

Praćenje lekova u terapiji i prilagođavanje doze
 teško kliničko prepoznavanje znakova

toksičnosti ili gde se simptomi predoziranja ili
toksičnosti,
subdoziranja ne mogu razlikovati
 prisustvo oboljenja GIT-a, jetre ili bubrega, što
prouzrokuje poremećaje u resorpciji,
metabolizmu i izlučivanju lekova
 primena kombinovane terapije, sa rizikom
i t k ij među
interakcija đ lekovima
l k i
 sumnja u poštovanje uputstva lekara od strane
bolesnika („compliance”-pridržavanje)
29
Kada se TDM ne primenjuje?

 kod svih bolesnika nije moguće i racionalno
 nije primenljivo za sve lekove
 nije praktično jer nema korelacije između farmakodinamskog

(terapijskog) odgovora i farmakokinetičke dispozicije: antidepresivi
tokom prve 2-3 nedelje terapije i antihipertenzivi
 klinički racionalnije direktno merenje efekta za one

lekove za koje se farmakološki efekt lako, brzo i precizno
meri (krvni pritisak, glukoza u krvi, ekskrecija elektrolita,
izlučivanje urina, itd.)
30

PRIMENA TDM
 terapijsko praćenje leka njegovim određivanjem

u krvi
k i
 praćenje leka u krvi zbog nepoštovanja

propisanog režima doziranja („noncompliance”)
- smatra se da čak oko 60% bolesnika ne uzima
lekove kako je propisano
Primena TDM
 velika interindividualna varijabilnost u
resorpciji,
iji raspodeli
d li i eliminaciji
li i iji llekova
k
 mali terapijski indeks
 promene patofizioloških uslova bolesnika
32

TDM za lekove koji imaju ili velike
individualne razlike ili mali T.I.
 antiepiletici (fenitoin, karbamazepin, fenobarbiton)
 antiaritmici (digoksin, lidokain, prokainamid,
acetilprokainamid)
 teofilin
 triciklični antidepresivi
 litijum
 aminoglikozidi
33
Laboratorija za TDM u telesnim tečnostima
Glavni zadaci su:

 iizbor
b lleka
k
 određivanje režima doziranja
 procena terapijskog efekta u bolesnika
 određivanje potrebe za merenjem koncentracije leka
 praćenje koncentracije leka
 farmakokinetička procena nivoa leka
 prilagođavanje režima doziranja
 preporuka specijalnih zahteva za praćenje leka
34

Metode određivanja koje se koriste u TDM
• HPLC
• RIA
• FPIA
• EMIT
• CEDIA
• EIA (hemiluminiscencija)
Lekovi koji se rutinski prate

• prema vrsti terapije koju podržavaju:
– kontrola epilepsije
– menadžment srčane funkcije
– menadžment respiratorne funkcije
– supresija imunog odgovora
– itd.
36

ANTIEPILEPTICI
• Karbamzepin
• Et
Etosuksimid
k i id
• Levetirecetam
• Fenobarbital
• Fenitoin
• Primidon
• Valproinska kiselina
• Lamotrigine
37
Karbamazepin
• Antikonvulziv (Tegretol)
• Vd = 1,5 L/kg (lipofilan, ali je 25% vezano za protein
• Terapijski efekat: 4 - 12 g/mL
• Toksičnost (>15 g/mL) kod svakog četvrtog pacijenta
– diplopia, pospanost, nistagmus, ataksija
– dermatološke, hematološke, hepatične
p promene
p
• Relativno dugačak poluživot – najkorisnija koncentracija
koja je u “dolini”, a “pik” koncentracija je u korelaciji sa
toksičnošću
• Uzima se 4-8h posle oralne doze

Karbamzepin- klinički aspekti
• serumske koncentracije je teško proceniti zbog spore i
nekompletne inrtestinalne resorpcije, slabe renalne
ekskrecije, i velikih interindividualnih razlika u
poluvremenu eliminacije
• obično je nepotrebno meriti karbamazepin-10,11-

epoksid u rutinskoj kliničkoj praksi
• toksične doze karbamazepina mogu imati konvulzivni

efekat
39
Fenitoin
• Najčešće propisivani antikonvulziv (Dilantin)
• Vd = 1,0
, L/kgg
• Terapijski opseg: 10 - 20 g/mL
• Toksičan pri koncentraciji > 20 g/mL
– Nistagmus
– Ataksija
– Pospanost/koma
• Metabolišu ga jetreni mikrozomalni enzimi CyP 2C19 i CyP 2C9
• Za simptome intoksikacije uzima se “pik” koncentracija, 4-5h posle
doze
• Intereakcija sa drugim lekovima utiče na raspodelu (alkohol,
karbamzepin, barbiturati)

Fenitoin- klinički aspekti
• pokazuje nelinearnu farmakokinetiku - ne mogu se precizno predvideti
očekivane serumske koncentracije posle određene doze
• dozu treba povećavati postepeno jer bi se u drugom slučaju mogla ispoljiti
toksičnost zbog ekscesivnog povećanja serumske koncentracije leka
• toksične doze mogu imati konvulzivni efekat
• u prisustvu izražene hronične bolesti jetre brzina metabolizma je redukovana
• za vreme trudnoće generalno se javlja sniženje serumskih koncentracija
• povećanje doze fenitoina je neophodno kod pacijanata sa tumorom mozga ili
metastazama na mozgu koji su pod hemoterapijom, npr. sa cisplatinom, da bi
se održala koncentracija unutar terapijske širine
• koncentracija slobodnog fenitoina, nevezanog za serumske proteina je u
korelacijij sa njegovim
j g koncentracijama
j u cerebrospinalnoj
p j tečnosti i salivi
• kod pacijenata sa promenom u vezivanju serumskih proteina ili za vreme
pojavljivanja neočekivanih efekata, serumska koncentracija slobodnog
fenitoina odslikava bolju procenu toksičnosti i efikasnosti nego totalne
koncentracije fenitoina
41
Valproinska kiselina
• Antikonvulziv širokog spektra
• Vd = 0,2
0 2 L/kg
• Terapijski opseg: 50 - 100 g/mL (brz klirens i velika
dilema u doziranju)
• Hepatotoksična i akutna toksična encefalopatija
• Idealan uzorak se uzima pre sledeće doze, obično rano
ujutro da bi bila adekvatna doza pre spavanja
• Doziranje problematično kod dece koja mogu da spavaju
duže od t1/2

Valproinska kiselina - klinički aspekti
• izgleda da ne postoji direktna veza između efekta i

serumske koncentracije valproinske kiseline
• rutinsko merenje serumskih koncentracija je od

ograničenog značaja za optimiziranje doze
• za p
procenu saradnje
j ppacijenta
j ((compliance)
p )
43
Fenobarbiton
• Antikonvulziv (metabolit Primidona)
– Barbiturat dugog dejstva (t1/2 = 2 - 4 dana)
• Vd = 1,0 L/kg
• Toksični simptomi kada je > 60 g/mL
• Interakcija sa drugim enzimima (indukcija hepatičnih
mikrozomalnih enzima)

Fenobarbiton- klinički aspekti
• interpretacija serumskih koncentracija je komplikovana
zbog toga što se može javiti tolerancija
• maksimalna vrednost terapijske širine može varirati

između pacijenata
• zbog svoje sposobnosti indukovanja mikrozomalnih

enzima jetre, može uticati na metabolizam drugih lekova
45
KARDIOAKTIVNI LEKOVI
• Amiadaron
• Digoksinlidokain
• Prokainamid
• Propranolol
• Verapramil
• Hinidin
46

Digoksin
• Poboljšanje srčanog rada kod CHF pacijenata
• Vd = 500 - 600 L/k
L/kg
– Vezuje se za tkiva (u ravnotežnom stanju 15 do 30
puta veća koncentracija u srčanom tkivu od konc.
u plazmi)
– Dozvoljene su jako male promene u koncentraciji
u plazmi
• Terapijski opseg: 0
0,8
8 – 2,0
2 0 ng/mL
• Toksičan nivo (> 2,0 ng/mL) dovodi do aritmija, GI,
CNS simptoma
Digoksin - klinički aspekti

• efekti digitalisa zavise od brojnih faktora, tako da postoji preklapanje
između terapijske i toksične koncentracije
• faktori koji utiču na serumske koncentracije ili efikasnost kardiotoničnih

glikozida kada su primenjeni u terapijskoj dozi su:
– poremećaj statusa elektrolita i acido-bazne ravnoteže - serumske koncentracije
digoksina koje se obično smatraju terapijskim mogu imati potencijalno toksične
efekte, zbog prisustva hipokalemije npr. pri kombinovanoj terapiji digoksina i
diuretika, hiperkalciemije i hipomagnezemije
– tolerancija na digoksin je redukovana u slučajevima acido-baznih poremećaja,
tkivnih hipoksija, akutnog infarkta miokarda, kardiomiopatije i valvularne bolesti
srca
– interkurentne bolesti ili stanja koja rezultuju u promeni farmakokinetike digoksina
zbog
b smanjenjaj j glomerularna
l l filt
filtracija
ij kkod
d pacijenata
ij t sa uznapredovalom
d l
renalnom insuficijencijom i kod starijih pacijenata, kao i kod oslabljene
interstinalne resorpcije kod pacijenata sa malapsorptivnim sindromom
– inetrakcije lekova - kod istovremene primene hinidina pri uobičajenim dozama
48

Prokainamid
• Antiaritmik
• Aktivni metabolit je NAPA (N-acetil
(N acetil prokain amid)
– N-acetiltransferaza
– Brzi naspram sporih acetilatora
• Vd = 1,9 L/kg
• Toksičnost > 30 g/mL (prokainamid + NAPA)
– blok srca, bradikardija, aritmije
Prokainamid - klinički aspekti

• profilaksa i terapija atrijalnih i ventrikularnih aritmija
• hepatički metabolizam u aktivni metabolit NAPA (20-

50%)
• zbog polimorfizma NAPA značajne interindividualne

razlike u metabolizmu ove supstance: otprilike 50% ove
doze se ekskretuje u nepromenjenom obliku renalno
• u slučajevima srčane i bubrežne insuficijencije viđena su

povećanja serumskih koncentracija
50

Hinidin
• Antiaritmik
• Klirens zavisi od Cyp 3A4
• Vd = 2,7 L/kg
• Toksičnost kada je > 8 g/mL
– Kvinizam praćen glavoboljom, mučninom i
zujanjem u ušima, kardiovaskularni (blok
srca), GIT simptomi
BRONHODILATATORI
• Teofilin
52

Teofilin
• Bronhodilatator za terapiju apneje kod prevremeno
rođene dece
• U neonatalnom periodu metaboliše se do kofeina
• Vd = 0,5 L/kg
• Toksičnost kada je > 20 g/mL (malo povećanje doze
vodi disproporcionalnom povećanju konc. u serumu i
intoksikaciji)
– nauzeja,
nauzeja povraćanje,
povraćanje diareja,
diareja bol u stomaku,
stomaku
glavobolja, insomnija, tahikardija
– šlog, srčana aritmija kada je > 30 g/mL
Teofilin - klinički aspekti

• klirens je redukovan u prisustvu srčane
insuficijencije ciroze jetre
insuficijencije, jetre, akutne virusne
respiratorne infekcije i za vreme istovremene
primene određenih lekova npr. cimetidina,
eritromicina, alopurinola i dr.
• zbog značajnih interindividualnih razlika u
farmakokinetici propisana doza bazirana samo
farmakokinetici,
na telesnoj težini je nepouzdana i ponekad čak
opasna za pacijente
54

Teofilin – indikacije za merenje
• sumnja u toksičnost
• neuspešna terapija npr. zbog nepouzdane saradnje pacijenta
• zbog
b ffarmakokinetičkih
k ki tičkih razloga
l
• primena kao kontinuirane intravenske infuzije (npr. u slučaju jake
opstrukcije respiratornog trakta
• nepoznata predhodna terapijska primena
• terapijska primena kod pacijenata sa izmenjenom farmakokinetikom,
(npr. kao što je nađeno u slučajevima interkurentnih oboljenja,
promena režima konzumiranja duvana, ineterakcije lekova)
• na osnovu koncentracije teofilina u salivi procena se može napraviti
ako je izabrana podesna doza i ako postoji adekvatna saradnja
pacijenta
• odnos koncentracija saliva/serum teofilina je prosečno 0,68
55
ANTIBIOTICI
• Aminoglikozidi: amikacin, gentamicin,
k
kanamicin,
i i neomicin,
i i streptomicin,
t t i i
tobramicin
• Hloramfenikol
• Fluorohinoloni
• Vankomicin
V k i i
• Sulfonamidi
56

Gentamicin
• Aminoglikozidni antibiotik širokog spektra
• Aminoglikozidi su vrlo polarna grupa komponenata i
slabo se absorbuju iz intestinalnog trakta i rutinski se
unose I.V. ili I.M. da bi postigli visok stepen
bioraspoloživosti
• Vd = 0,3 L/kg
• Terapijski efekat
– 5 - 8 g/mL (pik)
• Toksičnost kada je: 12 - 15 g/mL
– Ototoksičnost
O k ič
– Nefrotoksičnost (korekcija doze kod pacijenata sa
kompromitovanom renalnom funkcijom)
Aminoglikozidni antibiotici - klinički aspekti
• koriste se u terapiji ozbiljnih infekcija izazvanih G (-)

bakterijama
j
• oslabljena renalna funkcija rezultuje u redukovanom
klirensu aminogikozida
• u slučajevima dehidratacije Vd se smanjuje
• visoke koncentracije određenih penicilina, npr.
karbenicilna mogu inaktivirati aminoglikozide in vitro i in
vivo
• ispoljavaju ototoksične i nefrotoksične efekte kumilacijom
u tkivima
• minimalne serumske koncentracije (vrednost uzeta
neposredno pre sledeće doze) su važan indikator
kumulacije ovih supstanci
58

Hloramfenikol
• Baktericidno dejstvo na veliki broj gram negativnih
bakterija
• Vd = 0,9 L/kg
– 10 – 25 g/mL (pik)
• Toksičnost kada je > 25 g/mL
– Krvna diskrazija i kadiovaskularni kolaps
– Anemija, retikulocitopenija, povećanje serumskog
gvožđa aplastična anemija
gvožđa,
Hloramfenikol - klinički aspekti
• pokazuje efekte protiv infekcija izazvanih G(+) i G(-)

bakterijama
• upotreba je ograničena zbog mogućih opasnih
neželjenih efekata, npr. depresije koštane srži
• u terapiji bakterijskog meningitisa kod dece
• klirens hloramfenikola pokazuje značajne
inerindividualne razlike i redukovan je u prisustvu bolesti
jetre
• praćenje serumskih koncentracija je neophodno da bi se
optimizirao režim doziranja
60

Fluorohinoloni
• Deluju na gram-pozitivne, gram-negativne bakterije i
atipične
p p
patogene
g
• Vd = 1,5 - 2 L/kg
– 1– 4 g/mL (pik)
• Širok terapijski indeks i dozno-zavisnu toksičnost pa nije
neophodno rutinsko praćenje koncentracije leka
ANTIPSIHOTICI
• Antidepresivi
• Triciklični antidepresivi
• Litijum
62

Litijum
• tretman manične faze, manije i manijakalne depresije
• Vd = 0,8 L/kgg
• terapijski efekat
– 1,0 –1,2 mmol/L (optimalni)
• toksičnost kada je > 1,5 mmol/L u uzorku uzetom 12h od
poslednje doze
– apatija, letargija, problemi sa govorom, ataksija,
slabost mišića
Litijum - klinički aspekti
• čak i u prisustvu normalne renalne funkcije i primenom

uobičajenih doza održavanja, javljaju se velike varijacije
u serumskoj koncentraciji
• praćenje serumskih koncentracija je neophodno za

vreme kontinuirane terapije litijumom kod lečenja
depresije i manijačno depresivnih poremećaja
64

ANTIMETABOLITI
• Metotreksat
• Tiopurini
65
Metotreksat
• Nespecifični citotoksin koji inhibira DNK sintezu tako što inhibira
dihidrofolat reduktazu i smanjuje dostupnost pirimidinskih baza
• Koristi se u hemoterapiji malignih oboljenja npr. osteogenog

sarkoma
• Neželjeni efekti koji ugrožavaju život mogu se izbeći davanjem

antidota leukovorina (citrovorum faktora) i preduzimanjem mera da
se poveća renala ekskrecija metotreksata
• Primena leukovorina se ne sme prekidati dok serumske

koncentracije metotreksata ne padnu ispod 0,10 μmol/L ili još bolje
0,01 μmol/L

Metotreksat - klinički aspekti
• redukcija u klirensu se pojavljuje u prisustvu bolesti

bibrega i jetre, a takođe i u aciduriji
• u slučaju ascitesa ili pleuralnog izliva uočava se

prolongirano poluvreme eliminacije
• stepen toksičnosti je određen više dužinom vremena u

okviri kog “treshold” vrednosti rastu, nego povećanjem
serumskih koncentracija metotreksata iznad
koncentracionog limita
67
IMUNOSUPRESIVI
• Ciklosporin
• Everolimus
• Sirolimus
• Takrolimus
68

Imunosupresivi
• Ciklosporin i takrolimus
• Kalcineurinski inhibitori, vrše inhibiciju aktivacije
T limfocita različitim mehanizmima
• Vd ciklosporin = 1,0 -1,6 L/kg; Vd takrolimus = 0,85 -1,67 L/kg
• Sirolimus i everolimus
• mTOR inhibitori
• Vd sirolimus = 5,6 -16,7 L/kg; Vd everolimus = 1,5 L/kg
Ciklosporin - klinički aspekti

• visoko efikasna imunosupresivna supstanca protiv
odbacivanja transplantiranih organa (bubrega, jetre,
srca, pankreasa,
k kkoštane
št srži)
ži)
• može uzrokovati ozbiljne hepatotoksične i neurotoksične
efekte - neželjeni efekti zavise od doze
• farmakokinetika ciklosporina pokazuje značajne intra- i
inerindividualne razlike
• kod pacijenata sa abnormalnom funkcijom jetre,
redukovanom resorpcijom i odloženom eliminacijom
postoji potreba za
a manjom do dozomom
• deca imaju veći klirens od odraslih
• merenje je preporučljivo u punoj krvi zbog brojnih
faktora, npr. temperature, koncentracije lipoproteina,
hematokrita, odnosa koncentracija krv/plazma
70

Ciklosporin - klinički aspekti
• za vreme rane postoperativne faze kod pacijenata sa
transplantiranim bubregom, jetrom ili srcem učestalost
praćenja
ć j nivoa
i ciklosporina
ikl i jje 4
4-7
7 merenja
j u nedelji
d lji
• kod pacijenata kod kojih nije došlo do komplikacija posle

transplantacije bubrega, koncentraciju treba pratiti
jednom mesečno za vreme prve godine, a nakon toga
svaka 1-3 meseca
• dodatna merenja su potrebna ako klinička situacija

zahteva promenu doze, kao i za vreme kombinovane
primene lekova za koje se zna da deluju na metabolizam
ciklosporina
71
Ciljevi imunosupresivne terapije
• sprečavanje akutnog i hroničnog odbacivanje

transplantata
• smanjenje incidencije i jačine nuspojava
imunosupresivnih lekova
• izbegavanje prekomerne imunosupresije koja
može dovesti do oportunističkih infekcija i
posttransplantacione limfoproliferativne bolesti
(PTLD)
• smanjenje upotrebe lekova protiv odbacivanja
transplantata (smanjenje troškova)
72

TDM: Imunosupresivni lekovi i nuspojave
• nefrotoksičnost,
• Cikl
Ciklosporin
i (CsA)
(C A) hipertenzija
hipertenzija,
• Takrolimus (FK-506) hepatotoksičnost,
neurotoksičnost,
poremećena
tolerancija glukoze
73
Smernice za TDM imunosupresivnih

lekova
• netačnost i nepreciznost metoda <±10%

• terapijski
t ij ki iintervali
t li za svaku
k vrstu
t ttransplantacije
l t ij
• određvanje oblika leka koji je odgovoran za
farmakološke učinke
• specifičan program osiguranja kvaliteta
74

Predloženi terapeutski opsezi
imunosupresiva
Vreme Bubrezi Jetra Srce ili pluća
Ciklosporin Inicijacija 150-250 (>1200) 250-350 (>1000) 250-350

(ng/mL) Održavanje 75-150 (800) 100-200 (600) 150-250
Takrolimus Inicijacija 10-15 10-20 15-20

(ng/mL) Održavanje 5-10 5-10 5-10
Sirolimus Inicijacija 5 - 15
(ng/mL) Održavanje
Everolimus Inicijacija 5 -15

(ng/mL) Održavanje 3-8 3 – 8, 3 - 12
IZBOR BIOLOŠKOG MATERIJALA

najčešće korišćeni biološki materijali u TDM
j
laboratorijama:
 plazma
 serum
 puna krv
 saliva
 urini

Plazma
 optimalni uzorak jer predstavlja tzv. centralni

prostor ili je deo centralnog prostora
prostor,
 podaci iz plazme su najpouzdaniji
 antikoagulans: heparin i to u obliku svoje

natrijumove, kalijumova ili litijumove soli
Serum
 manje pogodan
 na krvni koagulum mogu da se adsorbuju izvesne

količine lekova ili metabolita, što snižava njihove
ionako niske koncentracije;
 pri određivanju litijuma u terapiji

Krv
 puna krv – retko

 samo ako se lek selektivno nakuplja u krvnim
elementima, pre svega eritrocitima
Kada ne može u plazmi?
 koncentracija u plazmi veoma niska

 ekstravaskularna
k t k l raspodela
d l obilna
bil
 kada je često uzorkovanje krvi nepogodno za
bolesnika (u dece)
 uzorkovanje pljuvačke ili urina

Pljuvačka (saliva)
 jjednostavnijij način dobijanja

j j
 ukupna koncentracija proteina u pljuvački je manja od
1%, što znači da je pljuvačka praktično deproteinizovana
tečnost (ovo je jedna od prednosti pljuvačke znajući da
je upravo frakcija slobodnog leka u plazmi odgovorna za
biološki efekat, i da p
postojij sve veći interes za p
procenu
koncentracije slobodnog leka)
Pljuvačka (saliva)
 najčešće i sakuplja tzv. mešana saliva, jer je

najreprezentativniji uzorak
 koristi se u sledećim slučajevima:
 kod dece
 kod odraslih sa slabo dostupnim venama
 kod bolesnika kod kojih postoji poremećaj
u vezivanju za proteine plazme

Urin
 da nivoi u urinu odražavaju one u krvi tj. u
plazmi
 koncentracije lekova (kao i metabolita) su
obično više u urinu nego u krvi
 lako za dobijanje (najpraktičniji biološki
materijal)
Urin
 interindividualne razlike (diureza, funkcija

b brega)
bubrega)
 intraindividualne razlike (dnevni ritam s
obzirom na pH urina i brzinu metabolizma)
 pravilne krive izlučivanja u funkciji vremena
mogu se dobiti samo pod kontrolisanim
uslovima

SAKUPLJANJE I ČUVANJE BIOLOŠKOG
MATERIJALA
 utiče
tič na rezultat
lt t
 u epruvete koje nemaju svojstva adsorpcije leka
na svoje zidove
SAKUPLJANJE I ČUVANJE BIOLOŠKOG

MATERIJALA
 neki lekovi se mogu čuvati izvesno vreme i u

frižideru (+4 oC), ali je najbolje, ako se zamrzne
na –20 oC

1 IIgnjatović
1. j ić S.
S Praćenje
P ć j kkoncentracijeij llekova
k
u telesnim tečnostima. (slajdovi sa predavanja, pdf fajl)
2. Ignjatović S. Praćenje koncentracije lekova
u telesnim tečnostima. (tekst predavanja, pdf fajl)
87

MOLEKULARNA DIJAGNOSTIKA
Za podsećanje – prethodna znanja

Nukleinske kiseline
Molekule važne za
održanje života
Osnova nasleđa
svakog organizma
Predavanje iz kliničke hemije sa

NUKLEOTIDI
GRADIVNE JEDINICE DNK i RNK
• Nukleotidi su estri fosforne kiseline i nukleozida
• Nukleozid čine šećer pentoza i azotna baza, koji su između sebe

povezani glikozidnom vezom
• Azotne baze: purinske i pirimidinske baze

• Purinske baze DNK i RNK: adenin i guanin
• Pirimidinske baze DNK: citozin i timin
• Pirimidinske baze RNK: citozin i uracil
• Pentoza koja ulazi u sastav DNK: dezoksiriboza

• Pentoza koja ulazi u sastav RNK: riboza
DNK

DNK
DNK molekul je dugačak polimer koji je sastavljen od

nukleotida, jedinica koje se ponavljaju. Nukleotidi su
veoma male jedinice, međutim DNK molekule se
sastoji od miliona nukleotida, što čini ovaj molekul
veoma dugim. Najveći ljudski hromozom se sastoji od
440 miliona nukleotida, odnosno 220 miliona pari.
U živim organizmima, DNK molekul je sastavljen od
dva polinukleotidna lanca koji su spiralno uvijeni
jedan oko drugog. Baza koja je povezana sa šećerom
naziva se nukleozid, dok baza koja je povezana sa
šećerom i jednom ili više fosfatnih grupa se naziva
nukleotid. Kada je više nukleotida međusobno
povezano, kao npr. u DNK molekulu, taj polimer se
onda naziva polinukleotidni lanac.
DNK
Šećer u DNK molekulu je pentoza (nazvan tako jer
broji pet ugljenikovih atoma) 2-deoksiriboza (RNK
molekul se sastoji od šećera riboze, otuda i pun naziv
Ribonukleinska kiselina).
kiselina) Šećeri su međusobno
povezani fosfatnim grupama koje stvaraju
fosfodiestarsku vezu između trećeg i petog
ugljenikovog atoma šećernog prstena. Ove asimetrične
veze znače da oba polinukleotidna lanca koja čine
DNK molekul imaju svoj pravac. Kako oba lanca idu u
suprotnom pravcu, možemo da kažemo da je DNK
antiparalelan. Asimetrični krajevi DNK baza se
označavaju sa 5'(pet prim) i 3'(tri prim). Antiparalelnost
znači da jedan lanac može ići u pravcu 5'→ 3', dok
suprotan lanac ide u pravcu 3'→ 5'. Spiralni lanac koji
čini DNK se održava u tom obliku pomoću vodoničnih
veza među parovima dveju baza. U DNK molukulu
postoje četiri baze Adenin (A), Citozin (C), Guanin (G) i
Timin (T).
6

RNK
U izgradnji molekula RNK (ribonukleinske kiseline)

učestvuju pentozni šećer riboza, purinske baze adenin
i guanin i pirimidinske baze, citozin i uracil, koji je
karakterističan za ribonukleinske kiseline.
RNK su jednolančani molekuli koji nastaju tako što se
nukleotidi povezuju fosfodiestarskim vezama čineći
tako primarnu strukturu RNK. Priroda ovih veza je ista
kao u DNK, samo što umesto dezoksiriboze učestvuje
riboza. Unutar ovih jednolančanih molekula
komplementarne baze mogu da nagrade kraće ili duže
dvolančane spiralizovane delove spajajući se
dvolančane,
vodoničnim vezama (adenin je vezan dvostrukom
vodoničnom vezom sa uracilom, dok je guanin vezan
trostrukom vezom sa citozinom). Ti dvolančani delovi
čine sekundarnu strukturu RNK.
GEN
Gen je fizička i funkcionalna jedinica nasleđivanja, koja prenosi naslednu

poruku iz generacije u generaciju, a čini ga celovit deo DNK potreban za
sintezu jednog proteina ili jednog molekula RNK.
Geni su nanizani duž hromozoma.
Gen za određeno svojstvo uvek se nalazi na istom mestu na hromozomu koje
se naziva genski lokus.
Geni su linearno raspoređeni delovi hromozomske DNK.
Veličina gena (broj nukleotida DNK) i i raspored na hromozomima su strogo
određeni.
Građa gena je ustvari građa same DNK i ogleda se u tačno određenom
redosledu nukleotida (A(A, T
T, C i G)
G).
Promena redosleda nukleotida (manjak ili višak nukleotida) rezultira u promeni
funkcije gena i naziva se genska mutacija (tačkasta mutacija)

EGZONI I INTRONI
Skup svih gena u jednoj haploidnoj ćeliji je genom.

Količina DNK u genomu eukariota daleko premašuje zbir gena koji kodiraju sve
proteine prisutne u ćelijama.
Deo genoma sadrži nizove nukleotida koji ne nose šifru za sintezu proteina.
Segmenti gena koji sadrže informaciju za sintezu proteina su nazvani egzoni, a
nekodirajući nizovi između njih su introni.
Geni eukariota imaju mozaičku građu: deo gena koji nosi šifru ispresecan je
delovima koji ne nose šifru.
Kod prokariota introni ne postoje već su njihovi geni neprekinuti nizovi
kodirajućih
j nukleotida.
Biološki značaj introna i njihova funkcija su još uvek nerazjašnjeni.
Nekodirajući delovii genoma našli su praktičnu primenu u krimnologiji i sudskoj
medicini poznatu kao genetički otisci prstiju.
GEN
GEN
nematrični lanac
5’ 3’
DNK egzon 1 intron egzon 2
3’ 5’
matrični lanac
promotor RNK kodirajuća sekvenca terminator
mesto otpočinjanja mesto završetka

transkripcije transkripcije
Veličina g
gena Prosečno 10 – 15 Kb HISTON H4 ~ 1Kb,
1Kb DISTROFIN 2500Kb
BROJ EGZONA u korelaciji sa veličinom gena gen za distrofin 79
VELIČINA EGZONA prosečno 170 bp (apoB gen 7.6 Kb)
VELIČINA INTRONA u korelaciji sa veličinom gena (od 0.5 – 30 Kb)
10

VELIČINE GENA
PROSEČNA PROSEČNA
GEN VELIČINA BROJ VELIČINA VELIČINA
GENA U Kb EGZONA EGZONA U bp INTRONA U bp
11
HROMOZOMI
Hromozomi su telašca karakterističnog oblika koja se u jedru mogu uočiti

za vreme deobe. Najbolje se uočavaju za vreme metafaze mitoze pa se
tada i izučavaju i nazivaju metafazni hromozomi.
Broj hromozoma je stalan i karakterističan za svaku biološku vrstu i naziva
se kariotip.
Telesne (somatske) ćelije imaju diploidan (grč. diploos = dvostruk) broj
hromozoma [obeležava se kao 2n]. Telesna ćelija čoveka ima 46
hromozoma ili dve garniture po 23 hromozoma, pri čemu jedna garnitura
potiče od majke, a druga od oca pa se tako obrazuje 23 para homologih
hromozoma.
Polne ćelije ili gameti [kod čoveka su to spermatozoidi i jajna ćelija] sadrže
upola manji broj hromozoma u odnosu na telesne ćelije, nazvan haploidan
[grč. haploos = jednostruk] - obeležen kao n. Ako telesna ćelija ima dve,
onda će polna ćelija imati jednu garnituru hromozoma. Broj hromozoma u
polnim ćelijama čoveka je 23.
12

VRSTE HROMOZOMA
Po položaju centromere u hromozomu razlikuju se:

metacentrični hromozomi, kod kojih je centromera postavljena medijalno,
a p i q kraci su približno iste dužine. U obu grupu spadaju hromozomi 1, 2, i
3 (A grupa)
submetacentrični hromozomi, kod kojih je centromera postavljana nešto
niže nego što je to slučaj kod metacentričnih, pa je p krak nešto kraći od q
kraka. (B, C, E, F grupa)
akrocentrični hromozomi, kod kojih je centromera jako pomerena ka
jednom kraju hromozoma, a p krak daleko kraći od q kraka. (D i G grupa)
telocentrični hromozomi, kod kojih se centromera postavljena na samom
kraju hromozoma
hromozoma, odlikuje ih odsustvo p kraka.
kraka
13
Za podsećanje – prethodna znanja
A-T bazni par
C-G bazni p
par
1 bazni par = 1bp

1 kilobaza = 1kb = 1000bp
14/127
1 megabaza = 1Mb = 1000000bp

HUMANI KARIOTIP
Humani kariotip sačinjava 46 hromozoma koji su karakteristični za ljudsku
vrstu i ne menjaju se tokom života čoveka.
Kariotip svake eukariotske ćelije sastoji se od određenog broja hromozoma
koji je karakterističan za vrstu i nepromenljiv. Na konferenciji održanoj 1960.
godine u Denveru uvodi se pojam humanog kariotipa (kariotip čoveka).
Kariotip čoveka sastoji se od 23 para hromozoma (ili 46 hromozoma), od
kojih:
22 para čine autozomi i
jedan par su polni hromozomi (gonozomi).
Parovi autozoma u svim ćelijama jednog organizma su simetrični
(homologi). Par polnih hromozoma je homolog samo u ćelijama žena, u
kojima se sastoji od dva X hromozoma,
hromozoma dok je u ćelijama muškarca
asimetričan (nehomolog) i sastoji se od jednog X i jednog Y hromozoma.
Parovi autozoma u kariotipu obeležavaju se brojevima od 1 do 22 i to tako
što je par najvećih hromozoma označen kao par 1, a ostali parovi redom po
veličini (uz manja odstupanja) nose brojeve 2 do 22. Polni hromozomi se
označavaju sa X odnosno Y.
15
HUMANI KARIOTIP
16

METAFAZNI HROMOZOMI
6000 Mb
260 Mb
50 Mb
17
HUMANI KARIOTIP
18

BIOLOŠKA PROMENLJIVOST
FENOTIPSKA GENOTIPSKA
=99 9%
=99.9%
MUTACIJE REKOMBINACIJE
GENSKE EVOLUCIJA
BOLESTI
19
GENSKE MUTACIJE
TRAJNE, NASLEDNE PROMENE U SEKVENCI

DNK
Citogenetski
se vidi višak
ili manjak 4
Mb
Genske mutacije
se ne vide
analizom 20/127
kariotipa

POSLEDICE MUTACIJA
(Zavise od mesta gde se desila)
1. Izmenjeni protein
2. Neaktivni protein
3. Prekid sinteze proteina
4. Bez efekta
21
EFEKAT MUTACIJA NA FENOTIP

IZRAŽAVA SE U RAZLIČITIM PERIODIMA ŽIVOTA
na rodjenju (Tay-Sachs; cistična fibroza)
tokom života (ćelavost, Huntington horea)
SE RAZLIKUJE PO JAČINI
Č
letalan ; dovodi do steriliteta; nema efekta na

preživljavanje
SE ISPOLJAVA SAMO POD ODREDJENIM USLOVIMA

temperatura (propustljiva ili ograničavajuća)
G6PD deficijencija
SE ISPOLJAVA POSREDNO - MODIFIKATORI
pojačivači i supresori
DOMINANTAN ILI RECESIVAN 22

GERMINATIVNE MUTACIJE
- MUTACIJE NASTAJU U GERMINATIVNIM

ĆELIJAMA, SPERMATOZOIDIMA I JAJNIM ĆELIJAMA
- PRENOSE SE NA POTOMSTVO
SOMATSKE MUTACIJE
- MUTACIJE NASTAJU U TELESNIM (SOMATSKIM)

ĆELIJAMA
- NE PRENOSE SE NA POTOMSTVO
23
hromozom
a a A
a A A
hromozom
Mutacija dominantna 24

hromozom
A A a
A a a
hromozom
Mutacija recesivna 25
TIPOVI MUTACIJA
SUPSTITUCIJE – zamena jedne baze drugom
tranzicije
A G
T C
transverzije A T A C G T G C
INSERCIJE - umetanje baza
DELECIJE - gubitak baza
26

SUPSTITUCIJA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
C A T C A T C A T C A T C A T
G T A G T A G T A G T A G T A
C A T C A T T A T C A T C A T
G T A G T A A T A G T A G T A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
27
TRANZICIJA (AT GC)
5’... T C T C A A A A A T T T A C G …3’
3’... …5’
A G A G T T T T T A A A T G C
5’... T C T C A A G A A T T T A C G …3’
3’... …5’
A G A G T T C T T A A A T G C
TRANSVERZIJA (CG GC)
5’... T C T C A A A A A T T T A C G …3’
3’... A G A G T T T T T A A A T G C …5’
5’... T C T G A A A A A T T T A C G …3’ 28
3’... A G A C T T T T T A A A T G C …5’

INSERCIJA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
C A T C A T G C A T C A T C A T
G T A G T A C G T A G T A G T A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
29
DELECIJA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
C A T C A C A T C A T C A T
G T A G T G T A G T A G T A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
T
A 30

DELECIJA
NORMALNO Ile – Ile – Phe – Gly - Val
T ATC ATC TTT GGT GTT
T ATC AT- - - T GGT GTT

CISTIČNA
FIBROZA Ile – Ile – - - - – Gly - Val
 F508 izgubljena
amino
kiselina
fenilalanin
na položaju
508
31
ALEL
Jedan, dva ili više različitih oblika istog gena koji
zauzimaju jedan genski lokus, medjusobno mogu da se
razlikuju i po različitom uticaju na fenotip
2 ALELNA OBLIKA GENA A A1 I A2
MOGUĆI GENOTIPOVI
A1 A1 HOMOZIGOT A1
A2 A2 HOMOZIGOT A2
A1 A2 HETEROZIGOT
FENOTIPSKA SKALA
A1 A1 A2 A2
A1 A2 A1 A2 A1 A2
A1 dominantan Nema dominacije A2 dominantan

32/127

A DOMINANTAN ALEL
a RECESIVAN ALEL FENOTIP
DOMINANTAN
DOMINANTNI HOMOZIGOT HETEROZIGOT
RECESIVAN
33
RECESIVNI HOMOZIGOT
34

35
SRPASTA ANEMIJA 36

albinizam
37
ahondroplazija
38

ahondroplazija 39
Familijarna hiperholesterolemija
40

Duchenne-ova
mišićna distrofija
41
DETEKCIJA MUTACIJA
ekstremno male izmene u redosledu

nukleotida u molekulu DNK (najveći procenat
mutacija)
detektuju se tek nakon umnožavanja
(amplifikacije) onog dela molekula DNK koji
sadrži mutiranu sekvencu
42

METODA LANČANE REAKCIJE
POLIMERAZE
POLYMERASE CHAIN REACTION

PCR
brza, specifična i visoko osetljiva

amplifikaciju bilo kog željenog segmenta
molekula DNK
43
PCR je otkrio Kary Mullis 1983. godine

(Nobelova nagrada
nagrada, 1993
1993. godine)
visoko osetljiva i visoko specifična tehnika

koja omogućava detekciju samo jednog
molekula sa specifičnom DNK sekvencom u
preko 100 000 ćelija
44

Kary Mullis 1993. godine –
Nobelova nagrada
45
"Beginning with a single molecule of the genetic

material DNA, the PCR can generate 100 billion
similar molecules in an afternoon. The reaction is
easy to execute. It requires no more than a test
tube a few simple reagents and a source of heat.
tube, heat
The DNA sample that one wishes to copy can be
pure, or it can be a minute part of an extremely
complex mixture of biological materials. The DNA
may come from a hospital tissue specimen, from a
single
g human hair,, from a dropp of dried blood at the
scene of a crime, from the tissues of a mummified
brain or from a 40,000-year-old wooly mammoth
frozen in a glacier."
46

DNK molekul
rasplitanje DNK
molekula
nukleotid
stari lanac
novi lanac
47
parentalni razdvajanje lanaca komplementarno dva

molekul pri čemu će svaki sparivanje baza novonastala
DNK poslužiti kao molekula DNK
matrica za sintezu
novog lanca
48

PCR
dijagnostika naslednih i infektivnih oboljenja
metoda izbora za prenatalnu dijagnostiku
neurološke i hematološke bolesti
određivanje onkogena
detekcija HIV virusa, humanog citomegalo
virusa hepatitis virusa
virusa,
dijagnostikovanje bakterijskih i gljivičnih
patogena
49
PRINCIP PCR METODE
imitacija replikacije DNK procesa koji se

normalno odigrava u svim živim
organizmima
od jednog molekula DNK dobijaju se dva

nova identična molekula DNK
nova,
50

Jedan ciklus PCR reakcije čine:
j DNK matrice
denaturacija
hibridizacija prajmera sa matricom
elongacija
l ij prajmera
j
51
Šta je potrebno za PCR?
1. DNK matrica - jednolančana DNK

(denaturisana dupleks DNK koja se kopira)
2. prajmer - kratak oligonukleotid
komplementaran krajevima sekvence koja
se kopira
3. g
gradivni blokovi - nukleotidi
4. enzim koji katalizuje gradnju nukleotida -
DNK zavisna DNK polimeraza
52

Denaturacija DNK matrice
raskidanje vodoničnih veza između
dva
d kkomplementarna
l t DNK llanca, pod
d
uticajem temperature
odvija se inkubacijom DNK molekula

3 do 5 minuta na 95 C
53
Hibridizacija prajmera sa matricom

uspostavljanje vodoničnih veza
između prajmera i komplementarne
sekvence na matrici
odvija se na temperaturi od 4265 C

u zavisnosti
i ti od
dddužine
ži i nukleotidne
kl tid
sekvence prajmera
54

Elongacija prajmera
katalizovana DNK polimerazom
odvija se na 72 C
najčešće se koristi Taq polimeraza tj.

termostabilna DNK polimeraza
55
PCR
5’ 3’
denaturacija 3’ 5’
5’ 3’
hibridizacija
prajmera 3’ 5’
5’ 3’
elongacija
3’ 5’
X
106 56

KOMPONENTE PCR REAKCIJE
DNK
ENZIM Taq DNK-polimeraza

DNK polimeraza
NUKLEOTIDI
PRAJMERI
Mg JONI
PUFER
57
PCR
prajmeri Taq
dCTP
dATP
pufer dGTP
+ dTTP
Mg2+
x 30
94 oC
56-70 o C 72 o C
58

Dirigovana sinteza
sami biramo p j , tj.j kojij će deo

prajmere,
DNK biti sintetisan
imamo dirigovanu sintezu tačno
određenog dela DNK ograničenog
prajmerima koji se umnožava približno
228 puta
t iddaje
j preko
k milijardu
ilij d kkopija ij
59
LightCycler® System
“It features extremely rapid PCR of only 20 minutes

for 30 cycles for ideal time saving” 60

Uslovi za PCR
kompletna denaturacija DNK matrice pre

prvog ciklusa
ikl PCR-a
PCR je j veoma bit
bitna za
uspešnu amplifikaciju
ako je DNK parcijalno denaturisana
ponovo će se uspostaviti vodonične veze
što će imati za posledicu mali prinos
61
Uslovi za PCR
oštećenja DNK molekula visokom

t t
temperaturom d povećane
do ć d j
ugradnje
pogrešnih nukleotida
Taq polimeraza ima vreme poluživota od
40 minuta na 95 C
termostabilne DNK polimeraze čiji je
poluživot reda veličine nekoliko sati i na
97 C
62

Hibridizacija prajmera s
matricom
najkritičniji korak
u prvom ciklusu PCR-a prajmeri najpre pretražuju
kompletnu sekvencu DNK u potrazi za
komplementarnom sekvencom sa kojom će se
hibridizovati
dužina prajmera oko 20 nukleotida
optimizacija
p j temperature
p i vremena za
hibridizaciju
63
matricom
verovatnoća uspešne hibridizacije prajmera
g DNK u p
i target prvim ciklusima PCR-a jje
određena brojem kopija target sekvence i
datim vremenom za pronalaženje ove
sekvence
temperatura hibridizacije prajmera se
empirijski određuje
optimalna temperatura hibridizacije se
obično kreće u rasponu od 4265 C
64

matricom
pri najčešćim koncentracijama prajmera od
0,1 mol/L za hibridizaciju
j jje p
potrebno
nekoliko sekundi, tako da tipično vreme
ovog koraka traje od 20 sekundi do 1
minuta
traženje optimalne temperature
hibridizacije prajmera najduži korak u
nalaženju uslova za PCR
65
Elongacija prajmera
vreme trajanja elongacije prajmera zavisi od
dužine i koncentracije ciljne sekvence koju
želimo da umnožimo, kao i od temperature
optimalna temperatura za termostabilnu Taq
polimerazu iznosi 72 C pri čemu prosečna
brzina ugradnje nukleotida iznosi 35100
nukleotida u sekundi
elongacija prajmera u trajanju od 20 sekundi do
2 minuta najčešće daje zadovoljavajuće
rezultate i empirijski se utvrđuje
66

Denaturacija molekula DNK
zagrevanje uzorka na 95 C u trajanju od

30 s do 1 min jje najčešće
j j p
dovoljan period
za denaturaciju dvolančanog molekula
DNK, sintetisanog u prethodnom koraku
elongacije prajmera
neophodno je optimizovati vreme
denaturacije u odnosu na debljinu zida
mikroepruvete u kojoj se odvija PCR
reakcija, kao i prema temperaturnom profilu
koji postiže konkretni aparat koji koristimo
67
Broj ciklusa
obično se kreće od 25 do 35, a ne bi trebalo

da bude veći od 45
povećavanjem broja ciklusa PCR reakcije
može se izazvati pojava nespecifičnih
produkata amplifikacije, dok ukoliko je broj
ciklusa previše mali, može se očekivati
manjij p
prinos PCR p produkata
optimalni broj ciklusa zavisi najviše od
početne koncentracije molekula DNK
68

Finalna elongacija
najčešće se posle poslednjeg ciklusa PCR

smeša inkubira na temperaturi od 72 C pri
čemu dolazi do kompletiranja parcijalno
elongiranih proizvoda
posle optimizacije PCR reakcije, moguće je ovaj
korak i preskočiti i ostaviti mikroepruvete na
sobnoj temperaturi u periodu od oko pola sata
po završenom PCR-u mikroepruvete sa
amplifikovanim uzorcima mogu da se ostave na
4 C do analize, ili na –20 C nekoliko meseci
69
Taq polimeraza
DNK polimeraza iz bakterije Escherichia

coli
posle svakog koraka denaturacije treba da
se dodaje nova količina enzima pošto se
inaktivira na visokim temperaturama
otkriće termostabilnih DNK polimeraza
obezbedilo efikasnu in vitro DNK
amplifikaciju bez potrebe naknadnog
dodavanja novih količina enzima
70

Taq polimeraza
prvi predstavnik termostabilnih DNK

zavisnih DNK polimeraza koja je
izolovana iz bakterije Thermus aquaticus
koja živi u toplim izvorima Jeloustonskog
nacionalnog parka u SAD
71
Taq polimeraza
postoji još niz termostabilnih DNK

polimeraza izolovanih iz drugih bakterija
koje žive u toplim izvorima kao što su:
Thermus flavus, Thermus ruber i Thermus
thermophilus
optimalna
p količina enzima iznosi između
0,5 i 2,5 jedinica za finalnu zapreminu
smeše od 50 L
72

Uticaj koncentracije jona Mg2+ na
efikasnost PCR
utiču na aktivnost Taq polimeraze i na
vernost replikacije molekula DNK
DNK,
hibridizaciju prajmera, tačku topljenja
dvolančane DNK, specifičnost PCR
reakcije kao i na formiranje artefakata tzv.
dimer prajmera
da bi se nukleotidi ugradili u rastući lanac
tokom elongacije, oni moraju biti u formi
kompleksa sa jonima magnezijuma
73
Uticaj koncentracije dezoksiribonukleotid-

trifosfata (dNTP) na efikasnost PCR-a
optimalna koncentracija dNTP-a zavisi od

f
dužine fragmenta f
koji se amplifikuje,
koncentracije Mg2+ jona i koncentracije
prajmera
veliki višak nukleotida u smeši uklanja
slobodni magnezijum
magnezijum, čime se umanjuje
aktivnost enzima i smanjuje efikasnost
hibridizacije prajmera
74

Prajmeri
koriste se prajmeri dužine 1440 nukleotida,

sa GC sadržajem od 40 4050%
50%
pravila za dizajn prajmera
kada se istražuje prisustvo mutacije u nekom
genu, prajmeri se biraju iz regiona koji
oivičava traženu mutaciju ili, ako je u pitanju
detekcija nekog infektivnog agensa (HIV), bira
se stabilan region virusnog genoma
75
Prajmeri
pravila za dizajn prajmera
3’ krajevi prajmera ne bi smeli da budu

međusobno komplementarni, da bi se sprečila
njihova međusobna hibridizacija i formiranje
artefakata vezanih za prajmere
prajmeri ne bi smeli da imaju takvu sekvencu
koja će dati sekundarnu strukturu
76

Spreč
Sprečavanje isparavanja PCR smeše
isparavanjem se menja koncentracija

komponenti u PCR smeši što smanjuje prinos
pre početka zagrevanja u PCR reakcionu
smešu se dodaje mineralno ulje čime se
stvara sloj koji sprečava isparavanje
neki savremeni PCR aparati poseduju
specijalne poklopce koji, održavajući višu
temperaturu iznad mikroepruveta, sprečavaju
isparavanje PCR smeše
77
Spreč
Sprečavanje isparavanja PCR smeše
mikroepruvete sa specijalno dizajniranim

kapicama koje omogućavaju kondezaciju
isparene tečnosti i njeno vraćanje u smešu
čak i pri korišćenju aparata, dodavanje
mineralnog ulja generalno povećava
uspešnost PCR postupka
ukoliko je potrebno, mineralno ulje se nakon
završetka reakcije može ukloniti
ekstrakcijom hloroformom
78

BIOLOŠKI MATERIJAL ZA PCR METODU
Leukociti iz periferne krvi
dobijaju se uzimanjem venske krvi (dovoljno je

neinvazivno u poređenju sa biopsijom tkiva,
lumbalnom punkcijom i sl.)
1 mLL krvi
k i ima
i 4000
400011000
400011000
11000 l kk itit //LL krvi,
11000 leukocita
lleukocita/L
leukocita/ kkkrvi,
krvi ii
odnosno oko 40 g DNK što je dovoljno za
100400 PCR analiza
79
Epitel bukalne sluznice

uzimaju se brisom sterilnom špatulom;
dostupno i uzimanje manje neprijatno
Koren kose
iz ćelija folikula dlake kose može se izolovati
približno
ibliž 300 ng DNK;DNK d dostupno
t i uzimanje
i j
ne predstavlja nikakvu neprijatnost za
pacijenta
80

Amnionska tečnost
amniocentezom u drugom trimestru trudnoće
Horionske čupice
izoluju se iz trofoblasta fetusa u drugom
mesecu trudnoću; nije potrebno prethodno
k lti i
kultivisanje
j kkao sa ćelijama
ć lij amnionske
i k
tečnosti; skratilo vreme potrebno za prenatalne
genetske analize
81
Tkivo uzeto biopsijom ili autopsijom

za in situ PCR, za dokazivanje prisustva
f
određenih infektivnih agenasa u konkretnom
tkivu i za određivanje nivoa ekspresije
određenog gena
Urin
ćelije epitela mokraćnih kanala; sadržaj je
nizak i količina izolovane DNK nije dovoljna za
ponavljanje PCR analize; ponekad sadrži
supstance koje inhibiraju PCR
82

Semena tečnost
uzima se od davaoca ili u slučaju silovanja
brisom od žrtve
Sputum
za detekciju bakterijskih agenasa izazivača
respiratornih
i t ih iinfekcija;
f k ij prisustvo
i t KKohovog
h
bacila (Micobacterium tuberculosis)
83
Cerebrospinalna tečnost
sadrži manje od 5 ćelija/L; za dijagnostiku
nekih neuroloških oboljenja i treba uzeti bar 1
mL CSF a zatim prisutne ćelije istaložiti
centrifugiranjem i čuvati ih na -70 C do
izolacije DNK
Tkivo fiksirano u formalinu ili parafinu

najčešće se ne mogu amplifikovati sekvence
duže od 650 baz 84

Mrlje od krvi, semene tečnosti, pljuvačke
za kriminološka istraživanja, DNK se može

izolovati iz jako malih količina biološkog
materijala koji se može naći na mestu zločina
PCR jje upravo svojuj veliku
lik primenu
i našao
š u
ovoj oblasti
85
PCR U KLINIČKOJ DIJAGNOSTICI

NASLEDNE BOLESTI
osnovni cilj proučavanja humanog genoma je

razumevanje naslednih bolesti i unapređenje
njihove dijagnostike, prognoze i lečenja
od preko 30 000 bolesti čoveka, najmanje 40%
je direktno ili indirektno vezano za naslednu
osnovu
u populaciji belaca 3% novorođenčadi već na
rođenju ispoljava naslednu bolest, a u još kod
2% bolest se razvija tokom života
86

Dijagnostika naslednih bolesti
biohemijske metode koje detektuju izmenjene

metabolite ili određuju nedostatak enzimske
aktivnosti (otkriva više od 40 naslednih bolesti)
citogenetske metode koje se bave
morfološkom analizom hromozoma (otkrivanje
više od 60 naslednih bolesti)
analiza na nivou gena; broj naslednih bolesti je
značajno veći u odnosu na prethodne
navedene metode
87
ORGANIZACIJA LABORATORIJE ZA
MOLEKULARNU DIJAGNOSTIKU
Centralizacija ili decentralizacija?
• molekularne tehnike dobijaju sve veći značaj u kliničkoj
dijagnostici i njihova primena će biti sve zastupljenija
• poseban prostor za molekularna određivanja ili je
centralizovana molekularna laboratorija pogodniji model
• prednosti centralizacije - veća efikasnost zbog korišćenja
iste opreme, reagenasa, osoblja i prostora
• uvođenje molekularnih tehnika u oblasti kao što su
mikrobiologija ili dijagnoza naslednih bolesti zahteva
specifična specijalistička znanja i veštine
• dvojni sistem - molekularna genetika i molekularna
onkologija/molekularne tehnike u mikrobiologiji
88

ORGANIZACIJA PROSTORA LABORATORIJE
ZA MOLEKULARNU DIJAGNOSTIKU
• Adekvatan prostor i dizajn koji sprečava ili pomaže u
kontroli kontaminacije
• Primena PCR i drugih amplifikacionih tehnika može biti
izvor značajnih laboratorijskih grešaka u vidu kontaminacije
laboratorije sa amplikonima iz prethodnih reakcija
• Amplikoni mogu da se raznesu i kontaminiraju nove uzorke
i reagense kapljicama u vazduhu, rukavicama, kožom,
olovkama, papirom, i laboratorijskom opremom, kao
što su pipete
• Može dovesti do dobijanja pogrešnog
pogrešnog, obično lažno
pozitivnog rezultata
• Kontaminacija laboratorije amplikonima je ozbiljan problem
koji često zahteva sveobuhvatnu dekontaminaciju i treba
preduzeti sve mere opreza da se predupredi.
89
ORGANIZACIJA PROSTORA LABORATORIJE

ZA MOLEKULARNU DIJAGNOSTIKU
• Odvojene prostorije za pripremu i izvođenje reakcija

amplifikacije.
p j
• Sistem pozitivnog pritiska koji sprečava kretanje
vazduha iz prostorije gde se izvodi analiza ka ostalim
prostorijama.
• Ako nije moguće obezbediti posebne prostorije - komora
sa laminarnim tokom koje sadrže izvor UV zračenja.
• U toku rada ne treba pomerati reagense i opremu (npr.
pipete)
i t ) iz
i jedne
j d prostorije
t ij u drugu.
d
• Mantile koji se nose u u post-PCR prostoriji treba skinuti
i rukavice baciti pre ulaska u pre-PCR prostor.
90

Dokumentacija i čuvanje uzoraka
 Zahtevi za molekularnim određivanjima
 Informisani
I f i i pristanak
i t k za genetske
t k analize
li i
medicinska dokumentacija.
 Čuvanje dokumentacije/rezultata određivanja
 Čuvanje uzoraka
 Izdavanje rezultata
 Upotreba reagenasa specifičnih za analit
 Korelacija sa drugim rezultatima laboratorijskih
određivanja
91
Zahtev za molekularnim određivanjima
treba da sadrži:
 informacije o identitetu pacijenta
 ime i kontakt lekara koji traži analize
 vrsta uzorka
 vreme sakupljanja
 testove koje treba uraditi
 relevantnu
l t porodičnu
dič i t ij (esencijalne
istoriju ( ij l za
interpretaciju rezultata)
92

Informisani pristanak za genetske analize i
medicinska dokumentacija
 Zbog informacija značajnih za dijagnozu, ali koja

može da se odnosi i na članove porodice
pacijenta.
 Genetski testovi mogu da ukažu na veliku
verovatnoću razvoja simptomatske bolesti
kasnije u životu kod osobe koja izgleda zdrava u
vreme testiranja.
testiranja
 Do eventualne diskriminacije pacijenta i njegove
porodice pri zapošljavanju i kod osiguranja.
93
Čuvanje dokumentacije/rezultata određivanja
 Period čuvanja dokumentacije o

određivanjima,
d đi ji k j obuhvata
koja b h t i zapisei o
sprovedenoj kontroli kvaliteta,
kalibracijama, održavanju aparata,
regulisano je zakonom.
 U SAD taj period iznosi 2 godine.
94

Čuvanje uzoraka
 Pošto su zapremine uzoraka koji se koriste za

genetska određivanja veoma male (reda veličine
mikrolitara), mnoge laboratorije čuvaju uzorke
neograničeno dugo.
 U nekim državama je zakonom regulisano da se
uzorci na kojima su završena genetska
ispitivanja unište da bi se zaštitila privatnost
pacijenata.
95
Izdavanje rezultata
 Izveštaj o ispitivanju: detalje o metodama (sve
probe i restrikcione enzime),
enzime) lokus i mutaciju
koje su ispitivane, rezultate ispitivanja i njihovu
interpretaciju.
 Kada ispitivanje mutacija nije kompletno zato što
nisu ispitane sve moguće mutacije: napomena o
mogućnosti dobijanja lažno negativnih rezultata
 panell za screening
i nosilaca
il cistične
i tič fib
fibroze (25 od
d
>1000 poznatih mutacija i detektuje 80% do 85%
mutacija); verovatnoća lažno negativnih rezultata
15% do 20%;
96

Izdavanje rezultata
 Kod nekih genetskih bolesti, veza između genotipa i
fenotipa varira u zavisnosti od mutacije i obrasca
nasleđivanja (dominantno ili recesivno) i izveštaj
treba da sadrži i odgovarajuću diskusiju rezultata
relevantnih za prisutnu mutaciju
 delecija na genu CYP21 (gen za steroid 21‐hidroksilazu) je
povezana sa teškom, klasičnom kongenitalnom
adrenalnom displazijom
p j ((autozomno recesivni p
poremećaj),
j),
dok je druga mutacija ‐ V281L, na istom genu povezana sa
blažim simptomima viška androgena kod žena.
97
Izdavanje rezultata
 Opisati fenotip specifičan za mutaciju
 frekvenciju ispoljavanja kao procenat osoba
koji nosi mutaciju i koje imaju ispoljene
simptome bolesti (penetrance)
 način nasleđivanja
 napomena da se preporučuje genetsko
savetovanje pacijentu i njegovoj porodici
98

Upotreba reagenasa specifičnih za analit
 Pri upotrebi reagenasa specifičnih za analit koji

su napravljeni u laboratoriji neophodno je da se
na izveštaju to i naglasi kao napomena da je
test razvijen i ispitan u samoj laboratoriji.
99
Korelacija sa drugim rezultatima

laboratorijskih određivanja
 Kod ispitivanja u oblasti molekularne onkologije,
naslednih bolesti i postransplantacionog praćenja
p p gp j
prihvatanja grafta koštane srži, uobičajeno je
izvođenje i drugih analiza na istom uzorku, kao što su
morfološka ispitivanja, protočna citometrija ili
citogenetika.
 Kada je to moguće, rezultati molekularnog ispitivanja
bi trebalo da se uporede sa rezultatima drugih
testova da bi se proverilo slaganje rezultata. U
da bi se proverilo slaganje rezultata U
slučaju neslaganja, rezultate treba proveriti pre
izdavanja konačnog izveštaja.
100

Unutrašnja kontrola kvaliteta
 pažljivo pripremanje svih reagenasa (posebno su
j p j p )
osetljivi PCR prajmeri i Southern blot probe)
 da se uporede rezultati dobijeni novim lotom
reagensa sa onim dobijenim prethodnim, starim
lotom
 treba da budu uključene i poznate pozitivne i
negativne kontrole ili što više genotipova
 treba čuvati dokumentaciju o lokusu, sekvenci,
j , ,
poreklu, restrikcionoj mapi, prisustvu
polomorfizama, i drugim relevantnim informacijama
za svaku probu ili prajmer koji se koristi
101
Unutrašnja kontrola kvaliteta

 koristiti kontrolne uzorke za proveru preanalitičkih,
analitičkih i postanalitičkih procesa
analitičkih i postanalitičkih
 svaka reakcija amplifikacije treba da uključi i „blank“
kontrolu koja sadrži sve reagense ali ne i DNK za
amplifikaciju, da bi se detektovala kontaminacija
amplikonom
• treba da se koriste kontrolni materijali koji sadrže
poznate mutacije ili „wild type“ alela koji se redovno
ij ili ild “ l l k ji d
analiziraju da bi se potvrdilo da li analitička metoda
daje tačne rezultate
102

Spoljašnja kontrola kvaliteta
(Proficiency testing ‐ PT)
 zbog malog borja testova koji su obuhvaćeni u
g
organizovanim PT p
programima
g ‐ na neki drugi
g način
 razmena uzoraka sa drugim laboratorijama koje rade isto
određivanje
 analiza istog uzorka drugom metodom koja se primenjuje
u istoj laboratoriji ili istom metodom, ali da analizu izvede
drugi tehničar
 PT treba da obuhvati ceo proces ispitivanja –
ekstrakciju nukleinskih kiselina,
kiselina analizu uzorka,
uzorka
interpretacija rezultata, uključujući i Bayesovo
izračunavanje rizika
103
NASLEDNE BOLESTI
 Prva primena PCR 1985. godine ‐ za dijagnozu
anemije srpastih ćelija
anemije srpastih ćelija
 Pronalazak PCR ‐ ubrzano kompletiranje
Projekta humanog genoma (Human Genome
Project).
 Internet ubrzao razvoj ove discipline ‐ brza
razmena informacija i neograničenoj
i f ij i ič j
komunikaciji između istraživača širom sveta.
104

 Autozomno recesivne bolesti
 Cistična fibroza (CF)
 Autozomno dominantne bolesti
 Hantingtonova bolest (HD)
 Bolesti vezane za X hromozom
 Hemofilija A
 Bolesti mitohondrijalne DNK
 Kompleksne bolesti
 „Imprinting“
105
Autozomno recesivne bolesti

 osoba sa autozomno recesivnom bolešću je nasledila dva abnormalna alela
na određenom lokusu tako što je dobila po jedan mutirani alel od svakog
roditelja,
j kojij su nosioci bolesti
 gen na kome je došlo do mutacije se nalazi na jednom od autozoma (1 do
22), a ne na polnim hromozomima (X ili Y)
 obično roditelj, kao nosilac abnormalnog alela nema klinički ispoljenu bolest,
ali postoji rizik od 50% da prenese mutirani alel svom potomku
 ako su oba roditelja nosioci abnormalnog alela, verovatnoća je 25% da dete
ima oba normalna alela, 50% da nasledi jedan abnormalni alel i 25% da se
bolest ispolji
 pogođeni pacijent može biti homozigot za specifičnu mutaciju, kada je od
oba roditelja nasledio istu mutaciju, ili može biti složeni heterozigot, kada
nasledi različite mutacije u okviru istog gena od svakog roditelja
 bez obzira na mehanizam, krajnji rezultat je isti – pacijent ne poseduje
normalan alel
 specifične mutacije mogu da utiču na težinu simptoma bolesti
 u porodičnoj istoriji, bolest se javlja podjednako i kod muških i kod ženskih
članova
106

Cistična fibroza (CF) (1/8)
 Jedan od najčešćih autozomno recesivnih oboljenja u populaciji
severnoevropskog porekla.
 Multisistemski poremećaj koji pogađa pluća,
gastrointestinalne i reproduktivne organe.
 Fenotipska ekspresija bolesti je heterogena i kreće se od
mekonijumskog ileusa i teških respiratornih manifestacija kod
odojčadi, do blagih simptoma na plućima bez
gastrointestinalnih problema kod odraslih.
 Morbiditet i mortalitet bolesti zavise od akumulacije mukusa,
rekurentnih infekcija neuobičajenim patogenima, kao što je
k t ih i f k ij bič j i t i k št j
Pseudomonas aeruginosa; i izrazite inflamacije u plućima.
 Ranije je CF dovodila do smrti u ranom detinjstvu, ali danas je
prosečno preživljavanje 32,2 godine zahvaljujući uspešnim
transplantacijama organa, poboljšanoj ishrani i novim lekovima.
107
Cistična fibroza (2/8)

 Gen koji je odgovoran za CF se nalazi na dugom kraku hromozoma 7, traka
31 (7q31). Kodira CF transmembrane conductance regulator protein
(CFTR) – CF regulatorni protein transmembranske provodljivosti.
(CFTR) CF regulatorni protein transmembranske provodljivosti.
 Molekul se nalazi u lipidnom dvosloju, predominatno na apikalnoj
membrani sekretornih epitelijalnih ćelija gde ima ulogu cAMP‐aktiviranog
hloridnog kanala.
 Pored uloge u transportu hlorida, molekul je uključen u transport
natrijuma, kalijuma i ATP‐a iz intracelularnog kompartmenta na
ekstracelularnu površinu membrane.
 Određivanje koncentracije hlorida u znoju je neophodno za postavljanje
dijagnoze CF (< 60 mmol/L u detinjstvu, > 40 mmol/L kod starijih od 15
godina), iako neki pacijenti sa CFTR mogu imati granično visoke ili čak
normalne vrednosti.
108

 Dijagnoza se lako postavlja kod pacijenata sa karakterističnim
kliničkim simptomima i abnormalnom koncentracijom hlorida
u znoju.
 Kod pacijenata sa atipičnim simptomima, mutacije CFTR gena
ne mogu da se isključe bez kompletne analize sekvence tog
gena.
 Velika raznovrsnost kliničkih simptoma među pacijentima sa
CF je delom posledica različitih efekata više od 1000 do danas
identifikovanih mutacija CFTR gena na funkciju CFTR
identifikovanih mutacija CFTR gena na funkciju CFTR
proteina.
 „Neklasičan“ CF fenotip posledica uticaja drugih faktora pored
mutacije CFTR gena na funkciju proteina.
109

 Pacijenti mogu biti homozigoti, sa istom
mutacijom
t ij na oba alela ili složeni heterozigoti
b l l ili l ž i h t i ti
sa dve različite mutacije.
 Faktori sredine i slabije definisani
modifikatorski geni takođe imaju važnu ulogu
modifikatorski geni takođe imaju važnu ulogu
u modulaciji fenotipa bolesti.
110

Vrste mutacija na CFTR (5 klasa) (5/8)
 klasa 1: defekt u produkciji proteina (težak fenotip)
 klasa 2: defekt u posttranslacionoj obradi CFTR (težak
fenotip)
 klase 3 i 4: do ekspresije CFTR proteina na površini
membrane, ali aktivnost jonskog kanala je smanjena
(mutacije klase 3 su povezane sa težim fenotipom koji je
posledica defektne regulacije kanala, a mutacije klase 4
mogu biti blage i posledica su defektne provodljivosti
kanala)
kanala).
 klasa 5: abnormalno spajanje segmenata (splicing) iRNK
CFTR ( težak i blagi fenotip).
111
Cistična fibroza
Analiza DNK za identifikaciju CFTR mutacija (6/8)
 potvrda dijagnoze bolesti kod pacijenata sa dvosmislenim
rezultatima određivanja hlorida u znoju ili u slučajevima kada
se sakupi nedovoljno uzorka znoja za analizu
k i d lj k j li
 pomoć u prognozi jer ipak postoji korelacija između genotipa i
fenotipa u izvesnom stepenu
 u jednoj porodici omogućava preimplantacionu dijagnozu ili
prenatalno testiranje za sledeće trudnoće, identifikaciju
nosilaca ili dijagnostičko testiranje drugih članova porodice sa
rizikom
 screening novorođenčadi omogućava ranu dijagnozu i

intervenciju (manje ispoljavanje bolesti i duže preživljavanje)
112

 najkontroverznije DNK testiranje na CF je screening
p p p j
nosilaca kod parova pre začeća i kod parova koji
očekuju bebu
 heterogenost CFTR mutacija, testiranje na više od
1000 mutacija u ovoj populaciji bi bilo zametno
 predložen je osnovni panel od 25 mutacija i
predstavlja minimalni standard za screening nosilaca
CF
 uključene mutacije koje imaju prevalenciju od
najmanje 0,1%, pa se ovako detektuje oko 88%
nosilaca
113
Cistična fibroza – Problemi
ogroman broj mutacija ! (8/8)
(1) nemogućnost identifikacije CF nosilaca sa CFTR mutacijama
koje nisu uključene u 25 uključenih u screening panel
(2) genetsko savetovanje pacijenata pre pristanka na analizu
(3) pravilno razumevanje mogućnosti dobijanja lažno‐
negativnih rezultata
(4) stigmatizacija „nosilaca“ genetske bolesti
(5) poverljivost rezultata
(6) efekte na dobijanje zdravstvenog osiguranja
efekte na dobijanje zdravstvenog osiguranja
(7) moguć porast broja prekida trudnoće posle detekcije
prisustva mutacije kod fetusa
114

Autozomno dominantne bolesti
 samo jedan abnormalan alel je dovoljan da izazove oboljenje uprkos
prisustvu i jednog normalnog alela
 pogođena osoba može da nasledi abnormalan alel od roditelja ili mutirani
alel može da nastane de novo, kao nova mutacija u toku gametogeneze
 bolest je vezana za jedan od autozoma (1 do 22), a ne za polne
hromozome (X ili Y)
 pogođena osoba poseduje 50% rizika da prenese mutirani alel svom
potomstvu
 različite mutacije u okviru gena imaju različite efekte na protein, tako da kod
pogođenih pacijenata postoji varijabilnost u kliničkoj ekspresiji bolesti
 u nekim slučajevima, poznati nosioci mutantnog gena nemaju kliničke
simptome bolesti, fenomen koji se označava kao smanjena penetrencija
(
(penetrence),
t ) alili ipak
i k poseduju
d j 50% verovatnoće
t ć dad imaju
i j pogođenođ d t
dete
 razlike u fenotipskoj ekspresiji bolesti se najverovatnije objašnjavaju
efektom drugih gena (gena modifikatora) i/ili uticajima okoline
 u porodičnoj istoriji autozomno dominantnog nasleđivanja pogođene su i
žene i muškarci, a primećeno je i prenošenje po muškoj liniji
115
Hantingtonova bolest (HD)

 autozomno dominantan neurodegenerativni
poremećaj koji se kasno manifestuje (incidencija
1:10 000)
 progresivna bolest i karakterišu je česti nevoljni, brzi
pokreti (horea) i demencija sa prosečnim periodom
preživljavanja 15 – 18 godina od pojave simptoma
 ispoljava se između 35. i 44. godine, ali kod oko 25%
pacijenata
ij prvii simptomi
i i se obično
bič javljaju
j lj j poslel 50.
50
godine, a oko 10% pacijenata ima juvenilnu HD koja
se ispoljava pre 20. godine
116/127

Simptomi HD
 u prvih nekoliko godina, simptomi podrazumevaju promene

raspoloženja, kognitivni deficit, nespretnost i otežane voljne
pokrete
 sledeća faza bolesti je povezana sa nerazumljivim govorom
(disartrija), hiperrefleksijom, horeom, otežanim kretanjem i
poremećajima u ponašanju koji uključuju eksplozivnost,
apatiju, agresiju, alkoholizam, seksualnu disfunkciju i
devijantnost i povećan apetit
 kako bolest napreduje javljaju se bradikinezija,
bradikinezija rigiditet,
rigiditet
demencija, distonija i disfagija
 u kasnoj fazi bolesti dolazi do gubitka težine, poremećaja sna i
inkontinencije
117
Molekularna osnova HD
 gen čija je mutacija odgovorna za pojavu HD je kloniran i
označen je kao IT15
 ekspanzija
k ij ponavljanja
lj j t i kl tid
trinukleotida CAG koji
k ji kodira
k di
aminokiselinu glutamin
 normalno, broj CAG ponavljanja je od 10 do 27, od 28 do 35 se
smatra „mutabilnim“, a od 36 do 39 je povezano sa smanjenom
penetrencijom bolesti, a 40 i više uslovljava pojavu HD
 broj CAG ponavljanja je obrnuto proporcionalan uzrastu kada se
javljaju
l prvi simptomi
 kod pacijenata kod kojih se bolest javlja već u 2. godini imaju
100 ponavljanja, a kada se bolest kasno manifestuje, broj
ponavljanja se kreće od 36 do 39
118

Molekularna osnova HD
 nisu poznati faktori sredine ili genetski faktori
povezani sa penetrencijom/ispoljavanjem simptoma
povezani sa penetrencijom/ispoljavanjem simptoma
bolesti
 nove mutacije za HD, kod osoba koje nemaju
porodičnu istoriju bolesti, nastaju usled ekspanzije
CAG‐mutabilnih alela i prenose se skoro isključivo
ekspanzijom alela poreklom od oca
ekspanzijom alela poreklom od oca
119
Hantingtonova bolest
 pojava simptoma se javlja u sve mlađem
uzrastu
t u svakoj sledećoj generaciji pogođene
k j l d ć j iji đ
familije (anticipacija)
 dovodi do prisustva većeg broja CAG‐
ponavljanja kod potomka i manifestacije
bolesti u mlađem uzrastu
120

 proizvod HD gena je protein hantingtin koji je
prisutan u svim tkivima
prisutan u svim tkivima
 u neuronima je povezan sa sinaptičkim vezikulama i
mikrotubulima, a ima ga u velikoj količini u
dendritima i nervnim završecima
 hantingtin interaguje sa više proteina u
intracelularnom transportu i organizaciji citoskeleta
 precizan mehanizam progresije bolesti nije poznat
121
DNK testiranje
 PCR tehnika: određuje tačan broj CAG ponavljanja
 tačnost određivanja broja CAG-ponavljanja
CAG ponavljanja
kompromitovana uključivanjem polimorfnog CGG
ponavljanja koje se nalazi odmah ispod CAG ponavljanja
 kasnije je dizajniran novi prajmer koji je obuhvatio CAG
ponavljanje, a isključio problematično polimorfno CGG
ponavljanje i obezbedio tačnu procenu broja CAG
ponavljanja
 prvobitno
bit se za PCR koristio
k i ti prajmer
j obeležen
b l ž 125I
 danas se koriste fluorescentno obeleženi prajmeri
122

Pristup genetskom testiranju
 model prediktivnog testiranja za nasledne bolesti koje se kasno
ispoljavaju
 ispitivanju treba da se podvrgnu samo odrasle osobe i samo uz
potpisani informisani pristanak
 nedostatak testiranja: strah od saznanja da osoba poseduje
mutirani alel i da će se bolest u nekom trenutku manifestovati,
rizik od diskriminacije pri zapošljavanju i dobijanju zdravstvenog
osiguranja, briga da će se mutirani alel preneti potomstvu itd.
 u toku savetovanja i testiranja bolesnika treba da prati bliska
osobab
 dešavala se samoubistva ili pokušaji samoubistva posle
prediktivnog testiranja, obavezna je i psihijatrijska procena, kao
deo protokola testiranja
123
Deformacije jednog gena
nasleđuju se na jedan od sledećih načina:
autozomno dominantno
autozomno recesivno
X locirano
124

termini autozomno i X locirano odnose se

na lokaciju hromozoma koji prouzrokuje
bolest ili mutirani gen
u X lociranim deformacijama muškarci s

mutiranim genom imaju oboljenje, dok su
žene sa istim genom prenosioci i obično ne
oboljevaju. Primeri ovih oboljenja su:
Dišenova mišićna distrofija i hemofilija
125
dominantna oboljenja su ispoljena bilo da je

individua heterozigot ili homozigot
recesivna oboljenja su ispoljena samo kada je

pojedinac homozigot za mutirani gen i nosi dve
k ij defektnog
kopije d f kt gena
126

Ahondroplasia i Hantingtonova bolest su

autozomno dominantna oboljenja
cistična fibroza, srpasta anemija i
fenilketonurija autozomno recesivna oboljenja;
pojedinci koji su heterozigoti za ova recesivna
j di i k ji h t i ti i
oboljenja su prenosioci
127
PCR dijagnostikovanje Dišenove mišićne distrofije
jedna od najčešćih naslednih bolesti čija je
učestalost 1 u 3 500 muške novorođene dece i
učestalost 1 u 3 500 muške novorođene dece i
jedna trećina svih slučajeva je rezultat de novo
mutacije
praćena je degeneracijom mišićnih ćelija koja
vodi progresivnoj slabosti mišića i konačnoj
smrti obično oko 20 godine života
128

PCR dijagnostikovanje Dišenove mišićne
distrofije
mutacija na genu za distrofin
distrofin je mišićni protein koga kodira 79
egzona u genu za distrofin
ovaj gen ima dužinu preko dva miliona baznih
parova i sadrži bar 70 egzona
parcijalne intragenske delecije se javljaju u oko
p j g j j j j
60% slučajeva obolelih od DMD (delecije su
heterogene) i nalaze se u okolini dva specifična
regiona gena
129
PCR dijagnostikovanje Dišenove mišićne distrofije
moguće je koamplifikovati bar 9 različitih
regiona gena za distrofin u jednoj PCR reakciji
moguća identifikacija 80% svih do sada
opisanih delecija u genu za distrofin
40% DMD slučajeva ne ispoljavaju deleciju u
ovom genu i ovi slučajevi se dalje analiziraju
i i l č j i d lj li i j
Southern blot analizom
130

Hemofilija A
•poremećaj koagulacije krvi koji se nasleđuje recesivno i vezan
je za X hromozom
je za X hromozom
•uzrok je deficijencija VIII faktora koagulacije (FVIII) i javlja se
otprilike kod 1 od 10 000 muškaraca u celom svetu
•poznati su i slučajevi žena pogođenih bolešću ‐ razvija se težak
oblik bolesti usled inaktivacije jednog X hromozoma, a X
hromozom sa mutiranim FVIII genom nije inaktiviran; ili žena
ima dva mutirana FVIII gena na oba svoja hromozoma;
ima dva mutirana FVIII gena na oba svoja hromozoma;
•produženo krvarenje posle povrede ili operacije, ponovno
krvarenje pošto se inicijalno zaustavi i u težim slučajevima,
sponatno krvarenje u zglobove
131
Hemofilija A
• težina bolesti je određena prisutnom prokoagulantnom
aktivnošću FVIII u plazmi:
aktivnošću FVIII u plazmi:
– blaga ‐ 5‐30%
– umerena ‐ 1‐5%
– teška forma ‐ <1%
• kod pacijenta sa teškom ili umerenom formom hemofilije A,
aktivirano parcijalno tromboplastinsko vreme (aPTT) će biti
produženo, a ostali rutinski parametri koagulacije normalni
• kod blage hemofilije aPTT je normalno
132

Bolesti mitohondrijalne DNK
• svaka mitohondrija sadrži od 2 do 10 kopija mtDNK u svom matriksu
• po ćeliji postoji 103 do 104 kopija mtDNK ‐ u ć. mozga, mišića i srca je
koncentracija najveća
• veliki broj kopija mtDNK po ćeliji, zajedno sa malim genomom i jedinstvenim
veliki broj kopija mtDNK po ćeliji, zajedno sa malim genomom i jedinstvenim
interindividualnim varijacijama u sekvenci, čini analizu sekvence mtDNK
idelanom za forenzička ispitivanja
• MtDNK se nasleđuje od majke
• ako je majka nosilac mtDNK mutacije, ona će preneti svoj svojoj deci, a samo će
njene ćerke prenositi bolest dalje na svoje potomstvo
• muška mtDNK može da bude prisutna ukoliko nije došlo do kompletne
degradacije u spermatozoidu do koje obično dolazi u ranoj embriogenezi
degradacije u spermatozoidu, do koje obično dolazi u ranoj embriogenezi
• ako dodje do pojave mutacije na mtDNK, one postoje među normalnom mtDNK
‐ ova koegzistencija normalnih i mutantnih kopija mtDNK se naziva
heteroplazmija
• jedinstvena osobina mtDNK jeda se u toku deobe ćelije, odnos normalne i
mutantne mtDNK može da se menja kako se mitohondrije raspoređuju u ćerke
133
ćelije
Bolesti mitohondrijalne DNK

• odnos normalne i mutantne mtDNK može da varira među različitim ćelijama i tkivima u
jednom organizmu
• procenat mutantne mtDNK koji treba da bude prisutan u ćeliji, tkivu ili organu da bi
doveo do ispoljavanja patološkog fenotipa se naziva „efekat praga“ (treshold effect)
• prag za bolest varira od osobe do osobe
osobe, u zavisnosti od energetskih potreba tkiva i
mutacije mtDNK
• genetsko savetovanje za porodice sa poremećajima na nivou mtDNK je komplikovano
nemogućnošću da se tačno predvidi fenotip što je posledica fenomena hiperplazije i
efekta praga
• direktno sekvencioniranje mtDNK - zlatni standard za detekciju mutacija (može da
propusti da detektuje mali % mtDNK u heteroplazmatskom stanju)
• za detekciju heteroplazmatskih mutacija (4%) – temporalna temperaturno zavisna –
gradijent gel elektroforeza kuplovana sa PCR-om i sekvencioniranjem DNK
• mtDNK
tDNK mutacije
t ij su povezane sa procesom starenja,
t j a mitohondrijalna
it h d ij l di disfunkcija
f k ij jje
povezana sa neurodegenerativnim bolestima
• najverovatniji uzrok somatskih mtDNK mutacija je oštećenje slobodnim radikalima
kiseonika, koji nastaju kao sporedni produkti aerobnog metabolizma
134

„Imprinting“
• diferencijalno markiranje specifičnih alela nasleđenih od oca i
od majke u toku gametogeneze, što rezultuje diferencijalnom
d jk t k t št lt j dif ij l
ekspresijom ovih gena
• „imprinti“ DNK u toku gametogeneze moraju da se održavaju
u toku replikacije DNK u somatskim ćelijama potomstva,
moraju da budu reverzibilni iz generacije u generaciju i da
utiču na transkripciju
• metilacija DNK je primarni mehanizam genomskog
„imprintinga“
• promene u normalnim obrascima „imprintinga“ mogu dovesti
do pojave bolesti (Prader‐Willi i Angelman sindromi)
135
Kompleksne bolesti
• kompleksno ili multifaktorsko nasleđivanje ‐ interakcija jednog ili više gena sa
jednim ili više faktora sredine; nasleđivanje nije po Mendelu
• bolest može biti prisutna kod više članova jedne porodice zato što oni dele
p j p
slične alele koji su predispozicija za pojavu bolesti, imaju slične dnevne navike
i ishranu ‐ stepen genetskog i doprinosa sredine procesu razvoja bolesti varira
• teško je proceniti relativni značaj genetskih i uticaja sredine u razvoju bolesti ‐
ispitivanja blizanaca
• među blizancima koji su zajedno odrasli veće je slaganje u težini ispoljene
bolesti kod monozigotnih blizanaca, koji imaju iste sve gene, nego kod
heterozigotinh blizanaca koji imaju 50% istih gena
• slaganje bolesti <100% kod monozogotnih blizanaca je snažan dokaz da i
negentski faktori igraju važnu ulogu u nastansku bolesti
• primeri: diabetes tip 1, multipla skleroza, Parkinsonova bolest, hipertenzija,
alkoholizam i trombofilija
136

TROMBOFILIJE
•tromboza dubokih vena (deep vein thrombosis, DVT) (1 od 1 000
osoba)
•izaziva poremećaj normalne hemostaze izazvan interakcijom
i i ć j l h t i i t k ij
jednog ili više gena sa faktorima sredine i/ili stečenih stanja, kao
što su primena oralnih kontraceptiva, trauma, gojaznost,
nepokretnost, trudnoća, starost ili operacija
•najčešći genetički uzroci ‐ mutacije gena za faktor V i za
protrombin
•obe mutacije imaju povećan rizik od rekurentnih DVT i kod njih
b ć k d k h k d h
može biti potrebno primeniti drugačiji tertman u poređenju sa
osobama sa samo jednom mutacijom
•venska tromboza ilustruje nedostatak razumevanja uloge poznatih
i nekarakterističnih faktora rizika u postojanju predispozicije za
137
kompleksnu bolest
Nasledni kancer dojke

• Prisustvo mutacija na dva najvažnija gena odgovorna za kancer dojke, BRCA1 i
BRCA2, predstavlja predispoziciju za pojavu kancera dojke i ovarijuma (BRCA1)
i prostate i kolona (BRCA2).
• Incidencija ovih mutacija se kreće između 1:500 i 1:1000.
• Prisutne su u samo oko 20% slučajeva naslednog kancera dojke i povezane su
sa pojavom bolesti u mlađem uzrastu.
• Nedavne studije ukazuju da bolest brže napreduje kod žena koje su nosioci
mutiranih gena.
• Mutacije BRCA1 i BRCA2 gena se nasleđuju autozomno dominantno.
• Nasleđe ne znači i da će se sigurno razviti kancer dojke.
Nasleđe ne znači i da će se sigurno razviti kancer dojke
• Prosečan kumulativni rizik je oko 27% do 50. godine i 64% do 70. godine.
• U razvoju kancera dojke važnu ulogu imaju i faktori sredine i genetički faktori,
kao i vrsta mutacije na BRCA1 ili BRCA2 genu.
138

• Kliničko testiranje za BRCA1 i BRCA2 se primarno izvodi kod:
– žena sa kancerom dojke i porodičnom istorijom kancera dojke i/ili ovarijuma
– presimptomatskih žena sa porodičnom istorijom kancera dojke i/ili ovarijuma
presimptomatskih žena sa porodičnom istorijom kancera dojke i/ili ovarijuma
– kod kojih prethodno jeste ili nije identifikovana mutacija BRCA1 ili BRCA2
gena u porodici
• Verovatnoća da će se identifikovati BRCA1 ili BRCA2 mutacija se povećava na
10% i više ako:
– je kancer dojke dijagnostikovan kod dve žene u porodici pre 50. godine
– je kancer dojke dijagnostikovan kod žena u familiji pre 50. godine, a kancer
ovarijuma detektovan kod jedne ili više žena u porodici
ovarijuma detektovan kod jedne ili više žena u porodici
– kancer dojke dijagnostikovan posle 50. godine kod jedne žene u porodici i
kancer ovarijuma detektovan kod dve ili više žena
– kancer ovarijuma prisutan kod dva ili više članova porodice
– prisutan kancer dojke kod muškarca, i kancer dojke ili ovarijuma kod žene u
istoj porodici 139

•Kod testiranja presimptomatskih žena, neophodno je detaljno
genetsko savetovanje radi upoznavanja i sa pozitivnim i sa
mogućim negativnim aspektima genetskog testiranja
mogućim negativnim aspektima genetskog testiranja.
•Pacijentkinji treba da bude jasno da negativan rezultat ne može
da znaći nemogućnost da se detektuje specifična mutacija na
BRCA1 ili BRCA2 genu i da ne isključuje mogućnost prisustva
mutacije na drugom genu koja može biti prisutna u porodici.
•Kada se potvrdi prisustvo mutacije kod asimptomatske žene, ona
može da se odluči za profilaktičku bilateralnu mastektomiju
može da se odluči za profilaktičku bilateralnu mastektomiju,
ooforektomiju ili intenzivno praćenje i preventivne strategije.
140

UTVRĐIVANJE IDENTITETA
• koriste se varijacije prisutne u humanom genomu
• primenjuje se da bi se:
– potvrdilo ili opovrglo u forenzičkim ispitivanjima da uzorak
potiče od određene osobe
– odgovorilo na pitanje o identitetu kliničkog uzorka
– odabrali donori za recipijenta transplantacije da bi se
minimiziralo odbacivanje i produžilo funkcionisanje grafta,
posredstvom ispitivanja histokompatibilnosti
– procenilo da li su hematopoetske ćelije poreklom od donora
ili recipijenta posle transplantacije stem ćelija
– identifikovali roditelji deteta
141
MOLEKULARNE METODE U DIJAGNOZI I PRAĆENJU
INFEKTIVNIH BOLESTI
• razlika od metoda kultivisanja ‐
lik d t d k lti i j brze b (omogućavaju rano
( ć j
donošenje odluka o terapiji)
• detekcija patogena koji ne mogu lako da se detektuju
tradicionalnim metodama, kao što je kultivisanje,
detekcija antigena ili serologija
• brzom kvantifikacijom i sekvencioniranjem nukleinskih
j j
kiselina u patogenima, ove metode su promenile pristup
predviđanju i praćenju odgovora na terapiju, proceni
rizika od razvoja bolesti i određivanju prognoze bolesti
142

MOLEKULARNE METODE U DIJAGNOZI I PRAĆENJU
INFEKTIVNIH BOLESTI
• Razvoj molekularnih testova za infektivne bolesti

– Preanalitičke promenljive
p j
– Interne kontrole
– Kvantitativne molekularne metode
• Verifikacija testa
– Analitička verifikacija
– Klinička verifikacija
• Kontrola
l kvaliteta
k l
• Interpretacija rezultata
• Izdavanje rezultata
143
PCR dijagnostika infektivnih bolesti
u ovim slučajevima ekonomske prednosti su
velike u odnosu na klasične metode
pouzdanije informacije u pogledu osetljivosti i
specifičnosti i rezultate u istom danu za
dijagnoze koje su ranije zahtevale nekoliko
nedelja
144

posebna pažnja se obraća na način uzimanja,
pripremanja i čuvanja uzorka
amplifikacioni metod za dijagnozu
Mycobacterium sp. ne sme da sadrži materijale
kao što je pljuvačka (koja može da sadrži druge
patogene molekule)
patogene molekule)
korisni uzorci mogu biti: feces, urin i tkivo
145
mogućnost za grešku pri uzorkovanju je velika i glavni
je problem pripremanje uzorka
je problem pripremanje uzorka
kontaminacija predstavlja poseban problem kada se
detektuje organizam koji preživljava u spoljašnjoj
sredini; na primer, više od 50% prašine je sastavljeno
od deskvamovanih humanih ćelija; analize za humani
papiloma virus (HPV) imaju veliku mogućnost da se
papiloma virus (HPV) imaju veliku mogućnost da se
kontaminiraju iz takvih izvora
146

Razvoj molekularnih testova za
infektivne bolesti
• metode koje su razvili proizvođači in vitro dijagnostike i
testove koje su laboratorije same razvile
testove koje su laboratorije same razvile
• set reagenasa koje su razvili proizvođači sadrži reagense
kontrolisanog kvaliteta i obično obuhvataju reagense za
izolaciju nukleinskih kiselina, amplifikaciju i
detekciju/kvantifikaciju po specifičnom protokolu
• komercijalni testovi za dijagnozu polno prenosivih bolesti koje
izaziva Chlamidia trachomatis i/ili Neisseria gonorrhoeae, kao
izaziva Chlamidia trachomatis i/ili Neisseria gonorrhoeae kao
i reagensi za praćenje progresije bolesti kod pacijenata sa HIV‐
1 infekcijom kojima se kvantifikuje HIV‐1 RNK u uzorcima
plazme
147
COBAS® AMPLICOR Analyzer

Automated PCR System
• prvi “benchtop”
benchtop sistem za potpunu
automatizovanu amlifikaciju i
detekciju za PCR testiranje
• kombinuje 5 instrumenata u jedan –
termal sajkler, automatski pipetor,
inkubator, vošer i rider.
Features
Bar-coded data entry
48 sample capacity per run
Test-specific reagents
Multiplexing- up to 6 detections per amplified sample
AmpErase enzyme (uracil-N-glycosylase, UNG) provides selective amplification by
destroying deoxyuridine-containing amplicon and reducing the risk of cross-contamination 148

COBAS® AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5
The test is intended for use in conjunction

with clinical presentation and other
l b t
laboratory markers
k ffor prognostic
ti
assessment of HIV-1 infected patients, and
for monitoring the effects of anti-retroviral
therapy by serial measurement of plasma
of HIV-1 RNA for patients with baseline
viral loads equal to or greater than 25,000
copies of HIV-1 viral RNA/mL.
The COBAS® AMPLICOR HIV HIV-1

1
MONITOR Test, v1.5 is not intended to be
used as a screening test for blood or blood
products for the presence of HIV-1 or as a
diagnostic test to confirm the presence of
HIV-1 infection.
149
FARMAKOGENETIKA
• da se predvidi kako će osoba reagovati na lekove i druge potencijalno toksične ili
bioaktivne ksenobiotike na osnovu genetskih karakteristika ili da objasni zašto se
javljaju neželjeni efekti lekova
• zajedničke karakteristike farmakogenetskih testova su:
j d ičk k k i ik f k kih
– enzim od interesa je primarni put metabolizma leka
– promene u aktivnosti enzima koje su posledica genetskog polimorfizma imaju
značajan efekat na vezu između doze i koncentracije leka u plazmi
– efikasnost i/ili toksičnost leka korelira sa promenama koncentracije leka u
plazmi
– lekovi pogođeni farmakogenetskim varijabilnostima imaju uzak terapeutski
indeks
• primenjuje se na citostatike, imunosupresive, antidepresive,
antipsihotike, antikoagulantne lekove, antihipertenzive i
antilipemike
150

Dva pristupa za procenu kako će osoba
da metaboliše lek
• Fenotipizacija se postiže testiranjem metaboličke aktivnosti :
– davanjem pacijentu probnog leka, za koji se zna da ga
davanjem pacijentu probnog leka, za koji se zna da ga
metaboliše isti enzim ili metabolički put kao i terapeutski
lek
– merenjem aktivnosti enzima koji metaboliše terapeutski
lek u ćelijama periferne krvi, koje su surogat za
metabolizam u celom organizmu
• Farmakogenetika za predviđanje farmakodinamičkog
za predviđanje farmakodinamičkog
odgovora identifikovanjem naslednih genetskih
karakteristika koje su ili posledica razlika u fenotipu zbog
strukturnih promena ili su nesumnjivo povezani sa fenotipom
u kliničkim studijama
151
Genotipizacija
• Prednosti:
– niža cena
– veća repoducibilnost među laboratorijama
– ne podleže intraindividualnoj varijabilnosti zbog specifičnih
kliničkih stanja ili biološke varijacije
– manje invazivna
152

Genotipizacija
• Ograničenja:
– neki testovi koji koriste amplifikaciju mogu da daju lažno negativne
rezultate zato što se oslanjaju na prisustvo ili odsustvo PCR produkata
j j p p
– trenutno raspoložive tehnike genotipizacije ne mogu da detektuju sve
moguće varijante
– ne može uvek tačno da se predvidi funkcija eksprimiranog proteina
– specifične interakcije ciljnih proteina ili enzima i drugih lekova,
hemijskih supstanci
– neke vrste hrane mogu da promene fenotip tako što će konvertovati
„normalan
normalan“ ili brzi fenotip u fenotip sporog metabolizera (sok od
ili brzi fenotip u fenotip sporog metabolizera (sok od
grejpfruta inhibira CYP3A4, a mnogi antidepresivi se ponašaju i kao
supstrati i kao inhibitori CYP2D6)
153
Cytochrome P450 2D6 (CYP2D6)

• enzim hidroksilaza koji metaboliše više od 100 lekova i toksina
• opisano je više od 80 genetskih varijanti CYP2D6 gena
• varijante mogu da se grupišu na osnovu promena u funkciji
proteina
• grupe dobro korelišu sa 4 glavna fenotipa, koja se istorijski
opisuju kao:
– ekstenzivni (normalni) metabolizeri (EM)
– spori (poor) metabolizeri (PM)
p (p ) ( )
– intermedijerni metabolizeri (IM)
– ultrabrzi (brzi) metabolizeri (UM)
154

1. Killen AA. Design and operation of the molecular diagnostics
laboratory. U: Burtis CA, Ashwood, Bruns D. Tietz textbook of
clinical
li i l chemistry
h i t and d molecular
l l diagnostics.
di ti 2006;
2006 1451‐1456.
1451 1456
Elsevier Saunders, St. Louis, Missouri, USA
2. Vnencak‐Jones CL. Inherited disease. U: Burtis CA, Ashwood,
Bruns D. Tietz textbook of clinical chemistry and molecular
diagnostics. 2006; 1483‐1538. Elsevier Saunders, St. Louis,
Missouri, USA
3. Ignjatović S. Molekularna dijagnostika. (tekst predavanja, pdf
fajl)
4. Ignjatović S. Molekularna dijagnostika. (slajdovi sa predavanja,
pdf fajl)
155

10/26/2016
Primer molekularnog testiranja
Mayo Medical Laboratories
Algoritam za molekularno testiranje CF
1
10/26/2016
Opis metode za molekularno testiranje
CF
• 106‐Mutation panel includes the 23 mutations
recommended by the American College of
d d b th A i C ll f
Medical Genetics (ACMG).
Opis metode za molekularno testiranje CF
The multiplex PCR‐based assay utilizing the Agena Mass Array platform is used to detect 106
mutations, including the 23 mutations specified in the American College of Medical Genetics (ACMG)
standards for population‐based carrier screening. The mutations are as follows: deltaF508, deltaI507,
G542X, G85E, R117H, W1282X (TGG‐>TGA), 621+1 G‐>T, 711+1 G‐>T, N1303K (C‐>A), N1303K (C‐>G),
R334W, R347P, A455E, 1717‐1 G‐>A, R553X, R560T, G551D, 1898+1 G‐>A, 2184delA, 2789+5 G‐>A,
3120+1 G‐>A, R1162X, 3659delC, and 3849+10kb C‐>T, the deletion of exons 2‐3, 296+2 T‐>A, E60X,
R75X, 394_395delTT, 405+1 G‐>A, 406‐1 G‐>A, E92X, 444delA, 457TAT‐>G, R117C, Y122X, 574delA,
663delT, G178R, 711+5 G‐>A, 712‐1 G‐>T, H199Y, P205S, L206W, 852del22, 935delA, 936delTA,
deltaF311, 1078delT, G330X, T338I, R347H, R352Q, Q359K, T360K, 1288insTA, S466X (C‐>A), S466X
(C‐>G), G480C, Q493X, 1677delTA, C524X, S549N, S549R (T‐>G), Q552X, A559T, 1811+1.6kb A‐>G,
1812‐1 G‐>A, 1898+1 G‐>T, 1898+1 G‐>C, 1898+5G‐>T, P574H, 1949del84, 2043delG, 2055del9‐>A,
2105del13ins5, 2108delA, 2143delT, 2183_2184delAAinsG, 2184insA, R709X, K710X, 2307insA,
R764X, Q890X, 2869insG, 3171delC, 3199del6, R1066C, W1089X (TGG‐>TAG), Y1092X (C‐>G), Y1092X
(C‐>A) M1101K M1101R D1152H R1158X 3667del4 S1196X W1204X (TGG‐>TAG) 3791delC
(C‐>A), M1101K, M1101R, D1152H, R1158X, 3667del4, S1196X, W1204X (TGG‐>TAG), 3791delC,
Q1238X, 3876delA, S1251N, S1255X, 3905insT and 4016insT mutations are detected. Poly T
determination and confirmatory testing of homozygous results are performed as reflex tests when
appropriate.(Farkas DH, Miltgen NE, Stoerker J, et al: The suitability of matrix assisted laser
desorption/ionization time of flight mass spectrometry in a laboratory developed test using cystic
fibrosis carrier screening as a model. J Molec Diagn 2010;12:611‐619)
2
10/26/2016
Izveštajna lista
1/4
Informisani
pristanak za
g
genetsko
testiranje
3
10/26/2016
Izveštajna lista
2/4
Izveštajna lista
3/4
4
10/26/2016
Izveštajna lista
4/4
5
KLINIČKA VREDNOST
LABORATORIJSKIH ODREĐIVANJA
Robert S.Galen
S.Raymond Gambino
BeyondNormality
The Predictive Value
and Efficiency of
Medical Diagnoses
g
1
Zašto se koriste testovi?
• Prisustvo oboljenja
• Procena prognoze
• Poboljšanje kliničkog tretmana
• Praćenje kliničkog toka
Knottnerus et al.; BMJ 2002;324:477

2002;324:477–
–80
DIJAGNOSTIČKI PROCES
Istorija i fizički pregled
Određivanje
j
unapred
“pre-test”
“pre-test”verovatnoća
verovatnoća
vodiči
izbor
Dijagnostička ispitivanja
“post-test” verovatnoća
2
Evaluacija kliničkih karakteristika
laboratorijskih testova
koliko se dobro (pouzdano)

testom može da predvidi
oboljenje
OSETLJIVOST TESTA
govori o verovatnoći da test

bude pozitivan u slučaju
prisustva oboljenja
3
SPECIFIČNOST TESTA
govori o verovatnoći da test

bude negativan u slučaju
odsustva oboljenja
j j
kera
ncentracija mark
Kon
- OBOLJENJE +
4
RASPODELA ZDRAVE I BOLESNE POPULACIJE
TN = stvarno negativni
TP = stvarno pozitivni
FN = lažno negativni
FP = lažno pozitivni
DL = decision limit
ZDRAVI BOLESNI
y
TN TP
acijenti
pa
B
A FN FP
x
DL vrednosti testa
MOGUĆI REZULTATI ODREĐIVANJA

KOD BOLESNIH
• STVARNO POZITIVNI
(true positive, TP)
broj bolesnih pacijenata
koji su određivanjem pravilno klasifikovani
 LAŽNO POZITIVNI
(false positive, FP)
broj bolesnih pacijenata
koji su određivanjem pogrešno klasifikovani
5
MOGUĆI REZULTATI ODREĐIVANJA
KOD ZDRAVIH
 STVARNO NEGATIVNI
(true negative, TN)
broj zdravih pacijenata
koji su određivanjem pravilno klasifikovani
• LAŽNO NEGATIVNI
(false negative, FN)
broj zdravih pacijenata
koji su određivanjem pogrešno klasifikovani
OSETLJIVOST ILI POZITIVAN

KOD BOLESNIH
TP
OSETLJIVOST =
TP + FN
 kada osetljivost iznosi 1,00 (100%)
= kod svih bolesnih jje određivanjem
j dobijen
j TP rezultat
 dobrim određivanjem se uvek dobija

pozitivan rezultat kod bolesnih
6
Primer
Od 25 primljenih dijabetičara
dijabetičara, kod 23 je
testom potvrđena pozitivna glukoza u
urinu i kod 2 je dobijen negativan
rezultat.
Koliko iznosi osetljivost “skrining”-a urina?
23
 100  92%
23  2
SPECIFIČAN ILI NEGATIVAN

KOD ZDRAVIH
TN
SPECIFIČNOST =
TN + FP
 kada osetljivost iznosi 1,00 (100%)
= kod svih zdravih jje određivanjem
j dobijen
j TN rezultat
 dobrim određivanjem se uvek dobija

negativan rezultat kod zdravih
7
Primer
Šta predstavlja specifičnost bilo kog

pojedinačnog testa?
Sensitivity of
62% or 55%
8
Tačnost ECG-a
K >5
>5,0
0 K < 5,0
50
+vni 37 17
-vni 50 96
Ukupno 87 113
Osetljivost = 37/87 = 0,43 (43%)

Specifičnost = 96/113 = 0,85 (85%)
PREVALENCIJA
(eng. prevail: prevladati, pobediti)
point prevalence rate
broj slučajeva ili stanja određene bolesti ili

stanja KOJA POSTOJE u populaciji u
određenom vremenu na 100 osoba populacije
pod rizikom u datom vremenu
prevalencija ili prior probability of disease
9
INCIDENCIJA
(eng. incident ili event : koji se događa)
 incidence rate
broj NOVIH slučajeva određene bolesti
ili stanja u toku određenog vremena na
100 osoba prosečne populacije pod
rizikom u istom periodu vremena
PREDIKTIVNA VREDNOST
• ukazuje na verovatnoću kojom

se na osnovu rezultata testa
(bio on pozitivan ili negativan)
pacijent
ij t pravilno
il kl
klasifikuje
ifik j
10
Ukoliko se dobije pozitivan rezultat,

da li to znači da je pacijent bolestan?
TP
prediktivna vrednost pozitivnog testa (+PV) =
TP + FP
Ukoliko
Uk lik se dobije
d bij negativan
ti rezultat,
lt t
da li to znači da je pacijent zdrav?
TN
prediktivna vrednost negativnog testa (-PV) =
TN + FN
 odnosi se i na bolesnu i na zdravu populaciju

 kombinuje osetljivost, specifičnost i prevalenciju
 ograničenje: primena samo na definisanu populaciju
 prii datoj
d t j osetljivosti
tlji ti i specifičnosti
ifič ti raste
t (opada)
( d )
kako prevalencija bolesti opada (raste)
 posterior probability of disease
11
DIJAGNOSTIČKI PROCES
Istorija i fizički pregled
Određivanje
j
unapred
“pre-test” verovatnoća
“pre-test” verovatnoća
vodiči
izbor
Dijagnostička ispitivanja
“post-test” verovatnoća
Prediktivna vrednost
• p
podrazumeva p
prevalenciju
j određenog g
oboljenja
• količinu verovatnoće da je pozitivan test
povezan sa oboljenjem kod nasumice
izabrane individue
• alternativno da je negativan test povezan
alternativno,
sa zdravljem
12
Ilustracija
• Pretpostavimo
p da imamo novi marker za
karcinom jetre
• Testom se pravilno identifikuje 98 od 100
pacijenata sa potvrđenim karcinonom jetre
• Test je pozitivan kod 15 od 100 pacijenata
kod kojih nema dokaza da je karcinom
jetre prisutan
Ilustracija
• Testom se p pravilno identifikuje
j 98 od 100
pacijenata sa potvrđenim karcinonom jetre
(Šta je osetljivost?)
• Test je pozitivan kod 15 od 100 pacijenata
kod kojih nema dokaza da je karcinom
j t prisutan
jetre i t
(Šta je specifičnost?)
13
Karakteristike testa
• Osetljivost je 98% (0,98)

98/(98+2) x 100
• Specifičnost
S ifič t je
j 85% (0,85)
(0 85)
85/(85+15) x 100
Osetljivost i specifičnost direktno ne zavise od

prevalencije
• osetljivost
98 / 100 = 98% < Pr(T+|D+)
P (T |D ) >
• specifičnost
85 / 100 = 85% < Pr(T-|D-) >
oboljenje
prisutno odsutno
pozitivan 98 15 113
test
negativan 2 85 87
100 100 200
14
PPV i NPV direktno zavise od prevalencije
• pozitivna prediktivna vrednost

98 / 113 = 87% < Pr(D+|T+)
P (D |T ) >
• negativna prediktivna vrednost
85 / 87 = 98% < Pr(D-|T-) >
oboljenje
prisutno odsutno
pozitivan 98 15 113
test
negativan 2 85 87
100 100 200
DIJAGNOSTIČKA EFIKASNOST
udeo pravih (tj. tačnih, i pozitivnih i negativnih rezultata)

od svih rezultata
TP + TN
dijagnostička efikasnost = ukupan broj pacijenata
 izračunava se pri samo jednoj granici odlučivanja

(cut-off vrednosti)
 zavisi od prevalencije
 ista vrednost i cena stvarno pozitivnih i
stvarno negativnih rezultata
15
“LIKELIHOOD RATIO”
ODNOS MOGUĆNOSTI
pozitivan "likelihood ratio"(+LR) =

odnos mogućnosti za pozitivan ishod testa
negativan "likelihood ratio" (-LR) =

odnos mogućnosti za negativan ishod testa
“LIKELIHOOD RATIO”
ODNOS MOGUĆNOSTI
odnos između verovatnoće pojave poznatog rezultata
određivanja koji izražava da je bolest prisutna i
verovatnoće pojave istog rezultata ako je bolest odsutna
osetljivost
pozitivan "likelihood ratio"(+LR)
p ( )=
1
1-specifičnost
ifič t
1-osetljivost
negativan "likelihood ratio" (-LR) =
specifičnost
16
Likelihood ratio
• Zašto likelihood ratio?
• Primenjiv u situaciji sa više od 2 ishoda
• Direkna veza od pre-test verovatnoće

do post-test verovatnoće
Likelihood Ratio pozitivnog

testa
• Koliko će se češće javljati pozitivan
rezultat testa kod osoba sa target
oboljenjem u poređenju sa onima koji
nemaju target oboljenje
Pr(T  | D  )
LR  
Pr(T  | D  )
17
LR+
Pr(T  | D ) 98 / 100
LR     6,5
Pr(T  | D ) 15 / 100
oboljenje
prisutno odsutno
pozitivan 98 15 113
test
negativan 2 85 87
100 100 200
Likelihood ratio negativnog testa
• Koliko je manje verovatno da se dobije

negativan rezultat testa kod osoba sa
target oboljenjem u poređenju sa onim koje
nemaju targret oboljenje
Pr(T  | D)
LR 
Pr(T  | D)
18
LR-
Pr(T  | D ) 2 / 100
LR     0,02
Pr(T  | D ) 85 / 100
oboljenje
prisutno odsutno
pozitivan 98 15 113
test
negativan 2 85 87
100 100 200
Interpretacija LR
• LR
LR=11 ukazuje da nema dijagnostičke vrednosti
• LR+ >10 se obično odnosi na “jak” pozitivan test

rezultat
• LR- <0,1 se obično odnosi na “jak” negativan test
rezultat
• Ali zavisi koja je promena u verovatnoći potrebna

da se postavi dijagnoza
19
POSTAVLJANJE “PRAVE” DIJAGNOZE
SE ZASNIVA NA:
 ANAMNEZA
 FIZIČKI PREGLED
 ZNAKOVI
 SIMPTOMI
 REZULTATI JEDNOG ILI VIŠE BIOHEMIJSKIH,
ELEKTRIČNIH, RADIOLOŠKIH ILI
DRUGIH MERNIH ODREĐIVANJA
ŽELJENE KARAKTERISTIKE
ZA POTVRDU HIPOTEZE (“RULE IN”)
 VISOKA SPECIFIČNOST
 VISOKA + PV
 ŠTO MANJI BROJ LAŽNO POZITIVNIH
 NAJBOLJE KADA JE PREVALENCIJA BOLESTI
VISOKA
 ŠIROK NORMALNI OPSEG
KOJI FAVORIZUJE SPECIFIČNOST
20
ŽELJENE KARAKTERISTIKE
ZA ISKLJUČENJE HIPOTEZE (“RULE OUT”)
 VISOKA OSETLJIVOST
 VISOKA -PV
 ŠTO MANJI BROJ LAŽNO NEGATIVNIH
 NAJBOLJE KADA JE PREVALENCIJA BOLESTI
NISKA
 UZAK NORMALNI OPSEG
KOJI FAVORIZUJE OSETLJIVOST
DIJAGNOZA
cena:
cena: NEPOTREBNA
LEČENJE TERAPIJA
+ -
ODREĐIVANJE
- LAŽNO STVARNO
NEGATIVNI NEGATIVNI
= 100% ISPITANIKA
SA - ODREĐIVANJEM
100% 100%
cena: BOLESNI ZDRAVI cena:
NELEČENA ISPITANICI ISPITANICI
KOLIKO KOŠTA
BOLEST ODREĐIVANJE
21
Dijagnoza akutnog pankreatitisa
Specifičnost Osetljivost
1 1
08
0.8 08
0.8
0.6 0.6
0.4
1.0 0.99 0.98 0.4
0.98 0.95 0.90
0.2 0.2
0 0
LIP PAMY AMY LIP PAMY AMY
Pozitivna prediktivna vrednost
1 cut–off U/L
0.8
lipaza 656
0.6
0.4
0.99 0.97 0.90 pankreasna amilaza 182
amilaza 245
0.2
0
LIP PAMY AMY
OSETLJIVOST naspram
SPECIFIČNOSTI
Osetljivost i specifičnost su
inverznom odnosu
22
OSETLJIVOST naspram
SPECIFIČNOSTI
Kako se određuje najbolji

kompromis između osetljivosti i
specifičnosti?
ŠTA JE BOLJE?
visoka osetljivost ili visoka specifičnost?
NE MOŽE OBE! zavisi od:
 epidemiploških karakteristika ispitivane populacije

 broja dopuštenih FP i FN
 prevalencije bolesti
 težine oboljenja
 cene određivanja
 prednosti i mogućnosti ranog tretmana bolesti
23
VEĆA OSETLJIVOST (što bliže 1,0)
JE POŽELJNA U SLEDEĆIM SITUACIJAMA
 ozbiljna bolest koja ne sme da se propusti

i
 može da se leči
i
 lažno pozitivni rezultati ne dovode do ozbiljnih
fizioloških ili ekonomskim trauma kod pacijenta
primer: feohromocitom
VEĆA SPECIFIČNOST (što bliže 1,0)

JE POŽELJNA U SLEDEĆIM SITUACIJAMA
 ozbiljna bolest ali ne može da se leči

i
 utvrđivanje odsustva oboljenja koje ima fiziološki
ili javni značaj na zdravlje
i
 lažno pozitivni rezultati ne dovode do ozbiljnih
fizioloških ili ekonomskim trauma kod pacijenta
primer: multipla skleroza
24
kera
ncentracija mark
Kon
- OBOLJENJE +
SIMULIRANA RASPODELA ZDRAVE I BOLESNE POPULACIJE

TN = stvarno negativni
TP = stvarno pozitivni
FN = lažno negativni
FP = lažno pozitivni
DL = decision limit
cut-off
granica odlučivanja
ZDRAVI BOLESNI
y
TN TP
acijenti
pa
B
A FN FP
x
DL vrednosti testa
25
Klinički problem
• Dijagnostička vrednost određivanja B tip
natriuretičkog peptida (BNP)
• Da li se određivanjem BNP kod starijih osoba

mogu da razlikuju oni sa ventrikularnom
disfunkcijom (LVSD) od onih koji je nemaju?
• Smith et al. BMJ 2000; 320: 906.
Dijagnostičko ispitivanje
• Target populacija: starije osobe
• Indeks test: BNP
• Target stanje: LVSD
• Krajnja dijagnoza (referentni standard):
ehokardiografija – procena ventrikularne
funkcije koje uključuje merenje LV ejekcione
frakcije
26
REZULTATI BNP ISPITIVANJA
LVSD
Prisutno Odsutno
>=18,7 11 50 61
TP FP
BNP FN TN
<18,7 1 93 94
12 143 155
Mere izvođenja testa

• osetljivost
11 / 12 = 92% < Pr(T+|D+) >
• specifičnost
93 / 143 = 65% < Pr(T-|D-) >
LVSD
Prisutno Odsutno
>=18,7 11 50 61
BNP
<18,7 1 93 94
12 143 155
27
Mere izvođenja testa
• pozitivna prediktivna vrednost
11 / 61 = 18% < Pr(D+|T+) >
• negativna prediktivna vrednost
93 / 94 = 99% < Pr(D-|T-) >
LVSD
Prisutno Odsutno
>=18,7 11 50 61
BNP
<18,7 1 93 94
12 143 155
Promena cut-off vrednosti

i uticaj na osetljivost i specifičnost
Cut off Osetljivost S

Cut-off Specifičnost
ifič t
9999 0% 100%
26,7 75% 80%
19,8 83% 70%
18,7 92% 65%
0 100% 0%
28
Efekat treshold-a
Diagnostic Threshold
specificity=99%
specificity 99% sensitivity=71%
sensitivity 71%
Non-diseased Diseased
TN FN FP TP
Heterogeneity in Threshold
specificity=97% sensitivity=86%
TN FN FP TP
29
Promena cut-off (treshold)
TN FN FP TP

TN FN FP TP
30
TN FN FP TP
“Receiver Operating Characteristic” kriva

no pozitivni udeo
o
((osetljivost)
Stvarn
Lažno pozitivni udeo

1-specifičnost
31
RECEIVER OPERATING CHARACTERISTIC CURVE
ROC KRIVA
 grafička tehnika kojom se vrši

evaluacija karakteristika određivanja
 u formi dijagrama prikazuje odnos osetljivosti i
specifičnosti pri različitim granicama odlučivanja
(cut-off
(cut off vrednostima)
 relativni položaj dve ili više ROC krivih
omogućava kvalitativno poređenje
više određivanja
ROC KRIVA I ROC ANALIZA
 ROC
nema preklapanja raspodele rezultata dve grupe
osetljivost = 100% i specifičnost = 100%
identična raspodela rezultata dve grupe
osetljivost = 0% i specifičnost = 0%
32
ROC KRIVE TESTOVA A I B
1.0
0.80 A
ozitivni udeo (osetljivost)
0.60
B
0.40
stvarno po
0.20
0. 0
0.20 0.40 0.60 0.80 1.0
(1 - Specifičnost) lažno pozitivni udeo
ROC KRIVA I ROC ANALIZA
 ROC analiza
površina ispod krive (AUC) = najopštija

mera dijagnostičke tačnosti
Kairisto V, Poola A. Software for illustrative presentation of

basic clinical characteristics of laboratory tests - GraphRoc
for Windows. Scand J Clin Lab Invest 1995;Suppl. 222:43-60.
33
ROC ANALIZA
 statističko poređenje uz korišćenje ROC krivih

 površina ispod ROC krive (AUC)
- najopštija mera dijagnostičke tačnosti
 AUC = 1,0 - kompletno razdvajanje vrednosti
određivanja dve grupe
 AUC = 0,5 - nema razlike između vrednosti
određivanja dve grupe
 statističko poređenje AUC dve ROC krive
 izračunavanje P vrednosti
ROC ANALIZA
N = 1586
1.0
B N P = 50 (pg/m l)
B N P = 80 (pg/m l)
0.8
BN P = 100 (pg/m l)
Sensitivity
BN P = 125 (pg/m l)
0.6 B NP = 150 (pg/m l)
0.4 AUC = 0.91 (0.90-

(0.90-0.93)
0.2
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1-Specificity
34
USLOVI ZA KORIŠĆENJE
ROC KRIVE I ROC ANALIZE
 pravilno postavljeno kliničko pitanje;
 pravilna asimptomatska grupa
 pravilna klasifikacija ispitivanih grupa
(definitivno i nezavisno od određivanja)
 podac
podaci o p
prevalenciji
e a e c j bo
bolesti
es
 ukoliko nema "zlatnog standarda" -
primena konsenzusa, glavnih pravila,
mišljenja eksperata ili nekih drugih prilaza
KORIŠĆENJE ROC KRIVE I ROC ANALIZE

ZAHTEVA SLEDEĆE PODATKE
 program koji je korišćen za konstrukciju ROC krive

 granica odlučivanja ( cut-off vrednost)
 vrednost površine ispod krive (AUC)
 vrednost Sd AUC
 P vrednost ukoliko se porede dve ili više ROC krivih
35
PREDNOST ROC KRIVE
 jednostavno vizuelno predstavljanje

 sveobuhvatno predstavlja tačnost
(pri svim granicama odlučivanja)
 ne zavisi od prevalencije bolesti
 poređenje različitih određivanja na istoj skali
 ne zahteva rangiranje i grupisanje podataka
 lako određivanje osetljivosti i specifičnosti
NEDOSTACI ROC KRIVE
 "cut-off" vrednosti se ne vide (prikrivene su)

 ne vidi se broj pacijenata
 zametan postupak bez kompjuterskog softvera
36
ROC krive AMY, LIP, PAMY i PLA
pri razlikovanju pacijenata sa ANP od
pacijenata sa AAO u prvih 24 sata posle prijema
1.0
0.8
0.6
osetljivost
AMY, AUC = 0.9953, SE=0.0055

0.4
LIP, AUC = 0.9963, SE=0.0036
o
PAMY, AUC = 0.9898, SE=0.0076

0.2 PLA, AUC = 0.7873, SE=0.0687
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1-specifičnost
ROC krive IL-6 i TNF za razlikovanje pacijenata sa

ANP od pacijenata sa AEP u prva 3 dana posle prijema
1.0
0.8
0.6
osetljivost
0.4
IL6 AUC = 0
IL6, 0.8586,
8586 SE=0
SE=0.0442
0442
o
0.2 TNF, AUC = 0.5619, SE=0.0711
0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
1-specifičnost
37
KLINIČKA TAČNOST I
UPOTREBLJIVOST ODREĐIVANJA
TAČNOST ODREĐIVANJA
 najfundamentalnija osobina određivanja
 mogućnost pravilne klasifikacije pacijenata
u relevantne grupe
 mogućnost razlikovanja različitih stanja pacijenata
UPOTREBLJIVOST ODREĐIVANJA
 praktična vrednost
KOMPJUTERSKI SOFTVER ZA
ROC KRIVU I ROC ANALIZU
 CLINROC; ROC ANALYZER; ROCLAB; RULEMAKER;

SIGNAL. SYSTAT; TEP-UH
 GRAPHROC Kairisto V, Poola A.
Software for illustrative presentation of
basic clinical characteristics of laboratory tests -
GraphRoc for Windows
Windows. Scand J Clin Lab Invest 1995;
Suppl. 222:43-60.
 LABROC1, CLINROC, ROCFIT, COR-ROC
Charles E. Metz programi
38
KLJUČNA LITERATURA
1. Shultz EK. Analytical goals and clinical interpretation

of laboratory procedures. In: Burtis CA, Ashwood ER,
eds. Tietz textbook of clinical chemistry. Philadelphia:
W.B. Saunders company, 1994;485-507.
2. Zweig MH, Campbell G. Receiver-operating
characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation
tool in clinical medicine. Clin Chem 1993;39/4:561-577.
;
Erratum published in Clinical Chemistry 1993;39:1589.
3. Hanley JA, McNeil BJ. A method of comparing the areas
under receiver operating characteristic curves derived
from the same cases. Radiology; 1983;148:839-843.
LITERATURA ZA UČENJE
1. Slajdovi sa predavanja
2. Ignjatović S. Klinička vrednost laboratorijskih
određivanja (deo iz doktorata)
39

KHMD 2 Slajdovi 16-17 Prof. DR Svetlana Ignjatović Za Studente PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

KHMD 2 Slajdovi 16-17 Prof. DR Svetlana Ignjatović Za Studente PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

KLINIČKA HEMIJA SA

Prof. dr Svetlana Ignjatović

Katedra za medicinsku biohemiju, objekat A, 206

KLINIČKA HEMIJA SA MOLEKULARNOM

• Klinička hemija sa molekularnom

• Razumevanje biohemijske osnove humanih

Broj časova nastave

ЦЕНТАР ЗА МЕДИЦИНСКУ БИОХЕМИЈУ

Poliklinika, I sprat, tel. 3615631

Ukupan broj poena Krajnja ocena

Vežbe Mora da se urade sve 9 termina x 1 poena = 9 9 9

Ulazni Mora da se položi 9 termina x 0,45 poena= 4 2 4

Seminarski Algoriritmi, slučajevi , 1 termin x 5 poena = 5 0 5

Ukupno poena za predispitne aktivnosti 9+2+6=17 9+4+12+5=30

ZAVRŠNI ISPIT: 23 – 70 POENA

Usmeni Uslov za izlazak na usmeni ispit je položen test 8 40

Ukupno poena: predispitne aktivnosti + završni ispit 17+23=50 30+70=100

I Kontrola kvaliteta rada kliničke laboratorije; Interpretacija rezultata kliničke laboratorije; 6‐12 3 6

VII Klinička vrednost laboratorijskih određivanja; 2‐4 1 2

Ocena i broj poena za usmeni deo ispita:

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Sistematsko tj. greška u

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Cotlove ‐ Harris ‐ Fraser

Predavanja iz kliničke hemije sa

Biasanalitički < 0,25 x (KV2 unutar osobe + KV2 između osoba)1/2

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

• za praćenje promenljivih faktora

Predavanja iz kliničke hemije sa

postupak koji obuhvata:

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

• korišćenje kontrolnih materijala predstavlja osnovu

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

• svež “pool” seruma (zdravi!) ‐ za proteine i

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

Predavanja iz kliničke hemije sa

• iz izračunatih podataka za = i Sd za dva korišćena

• prvi par kontrolnih granica se izračunava kao (= 

Kontrola 1: parametar (jedinice)

Dani / broj kontrolnog merenja

Predavanja iz kliničke hemije sa

Dani / broj kontrolnog merenja

Predavanja iz kliničke hemije sa

Kontrolna pravila ‐ kriterijumi koji se primenjuju da

Najčešće se primenjuju dva kontrolna pravila:

 ako je vrednost kontrolnog uzorka unutar granica

 izdaju se takođe i kada je vrednost izvan ovih

Predavanja iz kliničke hemije sa

Formiranje Levey Jennings-ove kontrolne karte

235 245 255 265