VALIDATION OF UV-VIS SPECTROSCOPY ASSAY PROCEDURE 

Objective: 
1. To  validate a newly developed UV-Vis Assay Procedure for an active ingredient in 
a dosage form 
2. To familiarize oneself to the process involved in assay validation. 
 
Procedure: 
1. Assume  the  development  of  a  new  assay  procedure  for  Acetaminophen  tablet 
500 mg using UV-Vis Spectroscopy.  
2. Determine  the  accuracy,  precision,  specificity,  linearity,  and  range  of  the  newly 
developed assay procedure. 
a. For  accuracy,  nine  analyte  solutions  will  be prepared and assayed, with 3 
different  concentration  levels  (80%,  100%,  and  120%)  and three replicates 
of  each  concentration.  Compute  for  the  %  mean  recovery  and  interpret 
results. 
% recovery = recovered
added x 100% 
 
b. For  precision,  six  analyte  solutions  with  100%  concentration  will  be 
prepared  and  assayed.  Compute  for  the  relative  standard deviation and 
interpret results. 

√
N 2 σx
σx = ∑
(xi − x)
N −1
RSD = x  
i=1

 
c. For  specificity,  three  solutions  with  the  analyte  will  be  spiked  with 
acceptable  level  of  impurities  then  the  mean  assay  result  will  be 
compared with the assay result obtained on unspiked samples.  
d. For  linearity,  five  solutions  of  difference  concentration  will  be  prepared 
(80%,  90%,  100%,  110%,  and  120%)  and assayed.  Determine coefficient of 
determination,  r​2​,  using  a  statistical  software  and  compare  to  validation 
criteria.  The  correlation  coefficient,  y-intercept, slope of the regression line 
and  residual  sum  of  squares  should  be  submitted,  a  plot  of  the  data  with 
the regression line should be included in a separate sheet of paper. 
e. For  range,  it  will  be  established  by  confirming  that  the  analytical 
procedure  provides  an  acceptable  degree  of  linearity,  accuracy  and 
precision.  Minimum  specified  range  for  the  assay  of  an  active  substance 
 or  a  finished  product  is  normally  from  80%  to  120%  of  the  test 
concentration. 
 
Data Gathered: 
Accuracy 
80%  Added  Assay Result  % recovery 
Replicate 1  400.0 mg  398.1 mg  99.53 
Replicate 2  400.0 mg  401.9 mg  100.48 
Replicate 3  400.0 mg  397.8 mg  99.45 
100%       
Replicate 1  500.0 mg  498.3 mg  99.66 
Replicate 2  500.0 mg  495.6 mg  99.12 
Replicate 3  500.0 mg  497.1 mg  99.42 
120%       
Replicate 1  600.0 mg  594.0 mg  99.0 
Replicate 2  600.0mg  592.8 mg  98.8 
Replicate 3  600.0 mg  593.6 mg  98.93 
mean % recovery: ​99.38% 
 
 
Precision  Specificity 
100%  Assay Result    Assay  Assay Result 
Replicate 1  489.9 mg  Result  (Unspiked) 
(Spiked) 
Replicate 2  498.6 mg 
Replicate 1  490.0 mg  489.9 mg 
Replicate 3  496.7 mg 
Replicate 2  499.0 mg  498.6 mg 
Replicate 4  498.3 mg 
Replicate 3  495.9 mg  496.7 mg 
Replicate 5  495.6 mg 
 
Replicate 6  497.1 mg 
 
Linearity 
  Assay Result  
80%  398.5 mg 
90%  447.9 mg 
100%  499.2 mg 
110%  545.8 mg 
120%  597.7 mg 
 
 
 
 Group # 1 Member # 3 Class # 3 
Name AMBIDA, Patricia Camryne R. Section 3CPH 
 
 
Activity 2 
VALIDATION OF UV-VIS SPECTROSCOPY ASSAY PROCEDURE 
 
 
 
Analytical Performance Characteristics 
       

Parameter  Validation Criteria  Result  Interpretation 

   
  The procedure is accurate 
95.0% - 105.0% mean recovery  because the result is within 
Accuracy  99.38% 
the validation criteria. 
      The procedure is precise 
Precision  RSD is NMT 2%  0.64%  because the result is within 
the validation criteria. 
      The procedure is specific 
Specificity  RSD is NMT 2%  0.014%  because the result is within 
the validation criteria. 
      The procedure is linear 
Linearity  r​2 ​must be NLT 0.995  0.9998  because the result is within 
the validation criteria. 
    The range is 80.0% - 120.0% 
Range  80.0% - 120.0% of the  80.0% - 120.0%  calculated with accuracy, 
acceptance criteria  precision, and linearity. 
 
 
Disposition:  
Based  on  the  gathered  data,  the  results  computed  for  each  parameter  are  well  within 
the  validation  criteria.  Therefore,  the  new  assay  procedure  for  Acetaminophen  tablet 
500 mg using UV-Vis Spectroscopy is ​valid​. 
 
 
Show all computations.  
 
 
recovery
FOR ACCURACY: % recovery=​ added x 100% 
 
398.1mg 498.3mg 594.0mg
400mg x 100% = 99.53% 500mg x 100% = 99.66% 600mg x 100% = 99.0% 
 
401.9mg 495.6mg 592.8mg
400mg x 100% = 100.48% 500mg x 100% = 99.12% 600mg x 100% = 98.8% 
 
397.8mg 497.1mg 593.6mg
400mg x 100% = 99.45% 500mg x 100% = 99.42% 600mg x 100% = 98.93% 
 
 
99.53 + 100.48 + 99.45 + 99.66 + 99.12 + 99.42 + 99 + 98.8 + 98.93
% mean recovery =​ 9 = 99.38% 
 
80%  Added  Assay Result  % recovery 
Replicate 1  400.0 mg  398.1 mg  99.53 
Replicate 2  400.0 mg  401.9 mg  100.48 
Replicate 3  400.0 mg  397.8 mg  99.45 
100%       
Replicate 1  500.0 mg  498.3 mg  99.66 
Replicate 2  500.0 mg  495.6 mg  99.12 
Replicate 3  500.0 mg  497.1 mg  99.42 
120%       
Replicate 1  600.0 mg  594.0 mg  99.0 
Replicate 2  600.0mg  592.8 mg  98.8 
Replicate 3  600.0 mg  593.6 mg  98.93 
mean % recovery: ​99.38% 
 

√
N 2 σx
FOR PRECISION: σ x = ∑
(xi − x)
N −1
RSD = x
mean = 496.0333333 mg
i=1
∑ = 51.11333315  
 

√ √
N 2
(xi − x) 51.11333315
σx = ∑ N −1
= ∑ 6−1
​= 3.197290514 or​ ​3.2
i=1

σx 3.197290514
RSD = x = 496.0333333 X100% = ​0.64 %
 
 
 

√
N 2 σx
FOR SPECIFICITY: σx = ∑
(xi − x)
N −1
RSD = x
mean = 495.02 mg
i=1

x = 495.0 mg (spiked)
x = 495.1 mg (unspiked)

√
N 2 σx
σx = ∑
(xi − x)
N −1
= 0.070711 or 0
​ .1 RSD = x =0
​ .014%
i=1

 
FOR LINEARITY: 
    Label Claim    Concentration of Analyte  Assay Result 
80%  x    =  400 mg  398.5 mg 
90%  x    =  450 mg  447.9 mg 
100%  x 
500 mg  =  500 mg  499.2 mg 
110%  x  =  550 mg  545.8 mg 
120%  x  =  600 mg  597.7 mg 
        x-axis  y-axis 
Answer the following questions: 
 
1. Differentiate  Detection  and  Quantitation  Limits  and  state  the  conditions  when 
they are required for inclusion as a validation parameter. 
- The  LOD  is  the  lowest  analyte  concentration  that  can  be  distinguished  from 
the  assay  background,  while  the  LOQ  is  the  lowest  concentration  at  which 
the  analyte  can  be  quantitated  at  defined  levels  for  imprecision  and 
accuracy.  They  are  required  for  inclusion  as  a  validation  parameter  when 
using  an  analytical  method.  ​Failing  to  do  so,  might  end  up  with  erroneous 
results and waste time and resources. 
 
2. What is the difference between of validation and verification? 
- The  difference between validation and verification is that verification is known 
to  be  the  assessment  of  whether  the  procedure  can  be  used  for  its intended 
purpose,  it  also  has  the  objective  to  demonstrate  if  what  was  written  on  the 
pharmacopeia  is  really  appropriate  or  suitable  for  use.  On  the  other  hand, 
validation  is  all  about  the  process  or  the  act  by  which  to  confirm  that  the 
performance  characteristics  of an analytical procedure meet the designated 
requirements for its intended application. 
 
3. Define  “test  result”  and  is  it  always  the  same  as  the  observed  value  after 
performing a specified test method? Explain. 
- Test  result  can  be  defined  as  the  outcome  obtained  from  a  particular  test 
method  which  particularize  that  individual  measurements  and  their  average 
(or  median,  SD)  are  reported  as  the  result  of  the  test.  The  results  that  can  be 
obtained  from  a  test  is  not  always  the  same  as  the  observed  value  after 
performing  a  specific  test  method.  It  is  for  the  certain  reason  that  results 
obtained  from  a  test  can  vary  and  it  might be different to the desirable result 
from  the  test  which is intended to be achieved which is commonly caused by 
different errors done during the test procedures. 
 
4. Explain the three levels of precision. 
- Repeatability (Intra-assay precision) 
● It  is  the  type  of  precision  which  is  under  the  same  operating  procedure 
performed  within  a  short  period.  It  is  evaluated  using  9  determinations, 
which  are  triplicates  of  three  concentrations,  that  covers  a  particular 
range.  It  can  also  be  assessed  with  a  minimum  of  6  determinations  at 
100% concentration 
- Intermediate Precision (Ruggedness) 
● It  demonstrates  within-laboratory  variations  such  as  using  different 
equipment for testing on different days, by different analysts. 
- Reproducibility 
● It  is  evaluated  by  inter-laboratory  trials.  it  describes  precision  in 
laboratories  through  collaborative  studies  or  during  methodology 
standardization.  
 
 
 
 
 
 
 
Attach additional test results for linearity. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
a. Coefficient of Determination (r​2​) = ​0.9998 
b. Slope of Regression Line = ​0.9926 
c. Y-intercept = ​1.52