TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 123-128

Khảo sát sự biểu hiện

DOI: của gen mã hóa GmHK07
10.15625/0866-7160/v37n1se.

KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN MÃ HÓA GmHK07

TRONG ĐÁP ỨNG HORMONE ABA VÀ STRESS HẠN
Ở HAI GIỐNG ĐẬU TƯƠNG CHỊU HẠN KHÁC BIỆT-DT51 VÀ MTD720

Nguyễn Bình Anh Thư, Đoàn Ngọc Hiếu, Nguyễn Phương Thảo*
Trường Đại học Quốc tế, ĐHQG HCM, *npthao@hcmiu.edu.vn

TÓM TẮT: Abscisic acid (ABA) là một phytohormone quan trọng tham gia đáp ứng chống chịu
stress phi sinh học ở thực vật. Nghiên cứu sự biểu hiê ̣n đáp ứng gen với ABA có thể giúp xác định
các gen tiềm năng có ứng dụng quan trọng trong công nghệ gen nhằm cải tạo tính chống chịu với
stress phi sinh học ở cây trồng. Trong nghiên cứu này, sự điều hòa biểu hiện của gen GmHK07
được xem xét ở hai giống đậu tương chịu hạn tốt DT51 và giống chịu hạn kém MTD720 dưới điều
kiện xử lý ABA và điều kiện hạn. Kết quả qRT-PCR của các mẫu thu từ cây đậu tương 12 ngày
tuổi được xử lý trong dung dịch ABA nồng độ 100 µM cho thấy GmHK07 có sự giảm biểu hiện
đáng kể cả ở mô chồi và rễ của giống MTD720 được xử lý ABA. Hơn nữa, GmHK07 còn có sự
tích lũy cao đáng kể, 158 và 85 lần, trong chồi của giống chịu hạn kém MTD720 ở điều kiện
thường và xử lý ABA 10 giờ so với giống chịu hạn tốt DT51. Kết quả tương tự được quan sát ở rễ,
GmHK07 tích lũy đáng kể tới 195 và 67 lần tương ứng ở giống MTD720 được xử lý ABA 0 và 10
giờ so với giống DT51. Dưới điều kiện hạn, GmHK07 cũng cho thấy sự tích lũy cao đáng kể trong
cả hai mô của MTD720 so với các mô tương ứng của DT51. Như vậy, ở đậu tương, GmHK07 là
nhân tố điều hòa âm tính tiềm năng không chỉ trong đáp ứng hạn mà còn trong đáp ứng với
hormone ABA và có thể ứng dụng để tăng tính chống chịu stress phi sinh học ở cây trồng nhờ công
nghệ gen.
Từ khóa: Abscisic acid, đậu tương, GmHK07, qRT-PCR, stress phi sinh học, stress hạn.

MỞ ĐẦU thực vật và môi trường thông qua mạng lưới

Hạn hán là một trong số những stress phi
sinh học chính tác động đến cây trồng, hơn nữa,
sự biến đổi khí hậu và sự suy giảm chất lượng
nước ngọt đang làm gia tăng mối lo ngại đáng
kể cho sản xuất nông nghiệp toàn cầu [1]. Đậu
tương (Glycine max) được biết là một trong
những cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao và
sản xuất đậu tương mang lại lợi ích kinh tế đáng
kể ở nhiều quốc gia trên thế giới do nhu cầu tiêu
dùng các sản phẩm từ đậu tương đang ngày một
gia tăng. Tuy nhiên, đậu tương cũng là một
trong những cây trồng bị tác động đáng kể bởi
hạn hán, thiê ̣t hại lên đến 40% năng suất [1]. Do
đó, nghiên cứu và phát triển các giống đậu
tương chịu hạn thông qua kỹ thuật di truyền là
một trong những chiến lược quan trọng trong
phát triển nông nghiệp và bảo đảm an ninh
lương thực.
Để chống chịu hạn, một trong những đáp
ứng sinh lý của thực vật là sự đóng mở khí
khổng. Hoạt động này của tế bào khí khổng
giúp điều hòa sư trao đổi khí và mất nước giữa
dẫn truyền tín hiệu. Cơ chế này không chỉ được
biết đến như đáp ứng của thực vật với hạn thông
qua sự gia tăng tích lũy hormone ABA mà còn
đáp ứng với các stress phi sinh học khác như
ánh sáng, mặn cũng như các stress sinh học 1].
Trong mạng lưới dẫn truyền tín hiệu stress, mặc
dù sự phosphoryl hóa được điều khiển bởi hệ
thống hai thành phần (TCS) là cơ chế chính
trong sự đóng khí khổng cảm ứng bởi ABA.
Tuy nhiên, vẫn không có nhiều bằng chứng về
chức năng của hệ thống này trong các tế bào khí
khổng [1]. Các thành phần thuộc hệ thống này
đã được xác định ở một số loài thực vật như
Arabidopsis, lúa và đậu tương bao gồm protein
tiếp nhận tín hiệu (HK-histidine kinase), protein
chuyển đổi gốc phospho (HP-phosphotransfer
protein) và nhân tố điều hòa đáp ứng (RR-
response regulator) [1]. Các nghiên cứu trước
đây của chúng tôi đã xác định vai trò điều hòa
tiềm năng của một số thành viên họ TCS dưới
điều kiện stress hạn trong những giống đậu
tương khác nhau [1]. Do đó, để xác định vai trò
của gen này trong điều hòa đáp ứng ABA và

123

đáp ứng hạn nhằm ứng dụng cho tăng cường
tính chống chịu stress phi sinh học ở đậu tương,
chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR định lượng để
xác định mức đô ̣ biểu hiện của GmHK07 ở
giống chịu hạn tốt DT51 và giống chịu hạn kém
MTD720 được xử lý ABA và xử lý hạn sinh lý.
Sự giảm biểu hiện đáng kể và sự tích lũy biểu
hiện thấp của GmHK07 ở rễ và chồi của giống
đậu tương chịu hạn kém khi xử lý ABA và dưới
điều kiện hạn là cơ sở cho việc xác định vai trò
điều hòa của gen này trong việc ứng dụng tạo
giống đậu tương chống chịu stress hạn cũng như
chống chịu các yếu tố bất lợi phi sinh học bằng
công nghệ gen.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu là hai giống đậu tương DT51 (được
cung cấp từ trung tâm nghiên cứu và phát triển
đậu đỗ) và MTD720 (được cung cấp từ Trung
tâm Nghiên cứu đậu tương, trường Đại học Cần
Thơ) đã được phân tích đặc điểm sinh lý tăng
trưởng trong nghiên cứu của [1].
Xử lý hormone ABA
Đâ ̣u tương được trồng trong điều kiện ánh
sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 28-30oC, quang kỳ 12
giờ tối/sáng. Sau giai đoạn 12 ngày tuổi, cây con
được thu nhận, rửa sạch đất và nuôi trong dung
dịch ABA nồng độ 100 µM trong 0 giờ và 10 giờ
(28oC, độ ẩm 60%, ánh sáng 200 µMm-2s-1).
Xử lý hạn
Đâ ̣u tương được trồng trong điều kiện ánh
sáng tự nhiên, nhiệt độ từ 28-30oC, quang kỳ 12
giờ tối/sáng. Sau giai đoạn 12 ngày tuổi, cây
Bảng 1. Trình tự mồi đặc trưng và hiệu quả khuếch đại của các gen được
sử dụng trong phân tích qRT-PCR
STT Gen Mồi xuôi (5'3')
1 Fbox AGATAGGGAAATTGTGCAGGT
2 GmHK07 TCTCATGCCTCATCACCAT
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
124
Nguyen Binh Anh Thu et al.
con được xử lý hạn bằng cách ngừng tưới
nước trong thời gian 15 ngày như nghiên cứu
trước đây 1-1,1].
Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA
Các mẫu rễ và chồi của hai giống từ 3 cây
được xử lý stress và 3 cây đối chứng (3 mẫu
sinh học) được thu nhận tách biệt và nghiền
trong nitơ lỏng. RNA tổng số được tách chiết và
thu nhận bằng bộ kit GenJET Plant RNA
Purification Mini Kit (Thermo Scientific), đồng
thời được tinh sạch loại bỏ DNA bằng DNaseI
(RapidOut DNA removal, thermo scientific).
Các mẫu RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy
đo quang phổ UV-Vis (Biotek, Hoa Kỳ) và
được tổng hợp cDNA một mạch từ 1 µg RNA
với bộ kit tổng hợp cDNA (thermo scientific).
Phân tích PCR định lượng
Trình tự mồi đặc hiê ̣u cho GmHK07 được
sử dụng theo nghiên cứu của 1]. Nồng độ mồi
là 0,4 µM trong thể tích phản ứng là 12,5 µl.
Gen Fbox được sử dụng làm gen tham khảo để
định lượng tương đối biểu hiện gen đích 1]. Chu
kỳ nhiê ̣t của phản ứng PCR định lượng là 10
phút ở 95°C, 40 chu kỳ của 95°C (15 giây) và
60°C (1 phút) (Realplex Eppendorf, Đức). Để
kiểm tra số lượng sản phẩm được khuếch đại,
thực hiện phân tích đường cong nóng chảy bằng
cách giữ 15 giây ở 95°C trước khi gia tăng từ
60°C lên 95°C. Phương pháp delta Ct được sử
dụng để so sánh tương đối mức độ biểu hiện
gen các mô, và giữa các điều kiện xử lý. Trình
tự và hiê ̣u quả khuếch đại phản ứng Real-time
(E) của hai că ̣p mồi Fbox và GmHK07 được
phân tích bằng phần mềm LinRegPCR 2012.0
(bảng 1).
Mồi ngược (5'3') E
CTAATGGCAATTGCAGCTCTC 1,9
GACCGTATTTGTTTCCCCA 1,9
Đánh giá sự biểu hiện gen GmHK07 trong
mô rễ và chồi của hai giống đậu tương DT51
và MTD720 dưới điều kiện hạn và xử lý ABA

Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi,
dựa trên sự đánh giá sinh lý rễ và chồi, chỉ số
chịu hạn và hàm lượng nước tương đối, DT51
và MTD720 đã được xác định như những giống
chịu hạn tốt và kém tương ứng trong số 14
giống đậu tương được khảo sát. Dựa trên hai
giống đậu tương này, chúng tôi tiếp tục phân
tích biểu hiện của gen GmHK07 dưới xử lý
hormone ABA vốn là hormone đóng vai trò
quan trọng trong điều hòa đáp ứng hạn để xác
định vai trò của gen này trong sự dẫn truyền tín
hiệu ABA. Kết quả cho thấy sự giảm biểu hiện
của GmHK07 được quan sát trong cả mô rễ (6,4
lần) và chồi (2,5 lần) của giống đậu tương chịu
hạn kém MTD720 dưới điều kiện xử lý ABA 10
giờ so với 0 giờ (hình 1A, 1B). Trong khi ở
giống đậu tương chịu hạn tốt DT51, GmHK07
không có sự thay đổi biểu hiện đáng kể ở mô rễ
và chồi được xử lý ABA ở 10 giờ so với 2 giờ.
Kết quả cũng cho thấy rằng, có sự tương quan
giảm biểu hiện của GmHK07 dưới điều kiện xử
lý ABA và mức độ chống chịu hạn kém của
giống đậu tương MTD720 được khảo sát. Dưới
Khảo sát sự biểu hiện của gen mã hóa GmHK07
điều kiện hạn, ở mô rễ và chồi của hai giống
không cho thấy sự thay đổi biểu hiện đáng kể
(hình 2). Dữ liê ̣u của Le et al. (2011) [3] cũng
cho thấy sự biểu hiê ̣n của gen GmHK07 ở mô rễ
của giống đâ ̣u tương Williams 82 được xử lý
mất nước ở 2 giờ và 10 giờ không có sự khác
biê ̣t so với đối chứng 0 giờ, tuy nhiên ở mô chồi
có sự khác biê ̣t đáng kể 2,5 lần khi xử lý 10 giờ
so với 0 giờ. Như vâ ̣y, cùng với nghiên cứu này,
chúng tôi ghi nhâ ̣n gen GmHK07 không có sự
biểu hiê ̣n đáp ứng với stress ở mô rễ. Sự biểu
hiê ̣n gia tăng của gen này ở mô chồi khi xử lý
mất nước cho thấy sự biểu hiê ̣n của gen này là
phụ thuô ̣c mô, phụ thuộc vào giống đâ ̣u tương
và phương pháp xử lý hạn.
Trong cơ chế đáp ứng hạn, thực vật có hai
con đường chính để dẫn truyền tín hiệu đến điều
hòa biểu hiện gen đích, bao gồm con đường phụ
thuộc ABA và con đường độc lập ABA [1].
Như vậy, dựa trên những kết quả trên, có thể
xác định GmHK07 là yếu tố phụ thuộc ABA do
sự biểu hiện thay đổi của nó dưới điều kiện xử
lý ABA.
Hình 1. Sự biểu hiện tương đối của
gene GmHK07 so với Fbox ở mô rễ
(a) và mô thân (b) của hai giống
MTD720 và DT51 dưới điều kiện xử
lý ABA 0 giờ và 10 giờ. Nồng độ
ABA là 100 µM được xử lý khi cây
tăng trưởng được 12 ngày tuổi. Sự
biểu hiện có ý nghĩa thống kê được
xác định với * (P < 0,05) và ** (P <
0,01).
Hình 2. Sự biểu hiện tương đối của
gene GmHK07 so với Fbox ở mô rễ
(a) và mô thân (b) của hai giống
MTD720 và DT51 dưới điều kiện xử
lý hạn. Thời gian xử lý hạn được bắt
đầu sau khi trồng 12 ngày tuổi. Sự
biểu hiện có ý nghĩa thống kê được
xác định với * (P < 0,05) và ** (P <
0,01).
125
 Nguyen Binh Anh Thu et al.

Sự tích lũy biểu hiện thấp đáng kể của gen
GmHK07 trong mô rễ và chồi của giống
DT51 so với mô tương ứng của giống MTD720
dưới điều kiện hạn và xử lý ABA
Để xác định vai trò điều hòa tiềm năng của
GmHK07, chúng tôi so sánh biểu hiện của gen
này trong các mô của hai giống đậu tương có
tính chịu hạn đối lập khi được xử lý ABA và xử
lý hạn. Xu hướng tích lũy biểu hiện thấp trong
giống đậu tương DT51 so với MTD720 đều
được quan sát trong cả mô chồi và mô rễ ở hai
điều kiện xử lý (bảng 2 và 3). Ở điều kiện xử lý
0 giờ, sự tích lũy của GmHK07 thấp đáng kể ở
DT51 so với MTD720, tương ứng 195,3 và
157,7 lần trong mô rễ và mô chồi. Khi được xử
lý ABA ở điều kiện 10 giờ, sự giảm biểu hiện
của gen này ở MTD720 đã tác động đáng kể
đến sự so sánh biểu hiện tích lũy khác biệt giữa
hai giống. Ở mô rễ được xử lý ABA 10 giờ,
DT51 có sự tích lũy thấp đáng kể 67,3 lần trong
khi ở mô chồi là 85,3 lần.
So sánh sự biểu hiện của GmHK07 giữa hai
giống dưới điều kiện thường và hạn cũng cho
thấy một xu hướng tương tự. Ở giống chịu hạn
tốt DT51, dưới điều kiện thường, GmHK07 có
sự tích lũy biểu hiện thấp hơn trong cả mô rễ và
chồi tương ứng 97,5 và 190,9 lần so với các mô
tương ứng của giống chịu hạn kém MTD720.
Tương tự, dưới điều kiện hạn, mô rễ và chồi của
DT51 có sự tích lũy thấp hơn MTD720 tương
ứng 125,9 và 296,8 lần. Do đó, dựa trên các kết
quả này, GmHK07 có thể được xem như là nhân
tố điều hòa âm tính tiềm năng trong đáp ứng với
stress hạn và ABA vì có sự giảm biểu hiện ở
các mô của giống chịu hạn kém MTD720, đồng
thời sự tích lũy của gen này cao đáng kể trong
các mô của MTD720 so với DT51.

Bảng 2. Sự biểu hiện khác nhau của gene GmHK07 ở mô rễ và mô chồi của giống MTD720 so với
DT51 dưới điều kiện xử lý ABA 0 giờ và 10 giờ. Nồng độ ABA là 100 µM được xử lý sau khi cây
được 12 ngày tuổi. Sự biểu hiện khác nhau giữa hai giống có ý nghĩa thống kê được xác định với P
< 0,05
Sự biểu hiện khác nhau (số lần) giữa MTD720 so với DT51
Mô xử lý
0h Giá trị P 10h Giá trị P
Rễ 195,3 0,01043 67,3 0,00878
Chồi 157,7 0,00001 85,3 0,01680
Bảng 3. Sự biểu hiện khác nhau của gene GmHK07 ở mô rễ và mô thân của giống MTD720 so với
DT51 dưới điều kiện xử lý hạn. Thời gian xử lý hạn được bắt đầu sau khi cây được 12 ngày tuổi. Sự
biểu hiện khác nhau giữa hai giống có ý nghĩa thống kê được xác định với p < 0,05
Sự biểu hiện khác nhau (số lần) giữa MTD720 so với DT51
Mô xử lý
Thường Giá trị P Hạn Giá trị P
Rễ 97,5 0,00264 125,9 0,00002
Chồi 190,9 0,00039 296,8 0,00723

KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO

Dưới điều kiện xử lý ABA và hạn, sự giảm
biểu hiện GmHK07 ở các mô rễ và chồi của
MTD720 cũng như sự tích lũy biểu hiện cao
trong các mô của MTD720 so với DT51 cho
thấy vai trò điều hòa âm tính của gen này trong
cơ chế đáp ứng với hormone ABA cũng như
stress hạn ở đậu tương và có thể được ứng dụng
trong kỹ thuật di truyền để tăng cường tính
chống chịu stress thông qua nghiên cứu ức chế
biểu hiện hoặc gây im lặng gen.
1. Hwang I., Chen H. C., Sheen J., 2002. Two-
component signal transduction pathways in
Arabidopsis. Plant Physiol., 129(2): 500-
515.
2. Le D. T., Aldrich D. L., Valliyodan B.,
Watanabe Y., Ha V. C., Nishiyama R.,
Guttikonda S. K., Quach T. N., Gutierrez-
Gonzalez J. J., Tran L-S. P., 2012.
Evaluation of candidate reference genes for
normalization of quantitative RT-PCR in

126

soybean tissues under various abiotic stress
conditions. PloS One, 7(9): e46487.
3. Le D. T., Nishiyama R., Watanabe Y.,
Mochida K., Yamaguchi-Shinozaki K.,
Shinozaki K., Tran L-S. P., 2011. Genome-
wide expression profiling of soybean two-
component system genes in soybean root
and shoot tissues under dehydration stress.
DNA Res., 18(1): 17-29.
4. Manavalan L. P., Guttikonda S. K., Tran L-
S. P., Nguyen H. T., 2009. Physiological
and molecular approaches to improve
drought resistance in soybean. Plant Cell
Physiol., 50(7): 1260-1276.
5. Mira-Rodado V., Veerabagu M., Witthöft J.,
Teply J., Harter K., Desikan R., 2012.
Identification of two-component system
elements downstream of AHK5 in the
stomatal closure response of Arabidopsis
thaliana. Plant Signal. Behav., 7(11): 1467-
1476.
6. Nishiyama R., Le D. T., Watanabe Y.,
Matsui A., Tanaka M., Seki M.,
Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K.,
Tran L-S. P., 2012. Transcriptome analyses
of a salt-tolerant cytokinin-deficient mutant
reveal differential regulation of salt stress
response by cytokinin deficiency. PloS One,
7(2): e32124.
7. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K.,
2007. Gene networks involved in drought
stress response and tolerance. J. Exp. Bot.,
58(2): 221-227.
8. Thao N. P., Thu N. B. A., Hoang X. L. T.,
Ha V. C., Tran L-S. P., 2013. Differential
EXPRESSION OF GmHK07 GENE IN RESPONSE TO ABA AND DROUGHT
TREATMENTS OF DROUGHT TOLERANT (DT51) AND SUSCEPTIVE
(MTD720) SOYBEAN VARIETIES
Nguyen Binh Anh Thu, Doan Ngoc Hieu, Nguyen Phuong Thao
International University, VNU, Hochiminh city
SUMMARY
Khảo sát sự biểu hiện của gen mã hóa GmHK07
expression analysis of a subset of drought-
responsive GmNAC genes in two soybean
cultivars differing in drought tolerance. Int.
J. Mol. Sci., 14(12): 23828-23841.
9. Thu N. B. A., Hoang X. L. T., Doan H.,
Nguyen T-H., Bui D., Thao N. P., Tran L-S.
P., 2014a. Differential expression analysis
of a subset of GmNAC genes in shoots of
two contrasting drought-responsive soybean
cultivars DT51 and MTD720 under normal
and drought conditions. Mol. Biol. Rep.,
41(9): 5563-5569.
10. Thu N. B. A., Nguyen Q. T., Hoang X. L.
T., Thao N. P., Tran L-S. P., 2014b.
Evaluation of drought tolerance of the
Vietnamese soybean cultivars provides
potential resources for soybean production
and genetic engineering. Biomed Res. Int.,
2014: 809736.
11. Nguyễn Bình Anh Thư, Hoàng Thị Lan
Xuân, Nguyễn Phương Thảo, 2014. Đánh
giá sự biểu hiện của các gen mã hóa nhân tố
phiên mã GmNAC092, GmNAC083 và
GmNAC057 trong đáp ứng hạn ở hai giống
đậu tu7ơng Williams 82 và MTD777-2. Tạp
chí Sinh học, 36(1se): 244-249.
12. Hoàng Thị Lan Xuân, Nguyễn Hồ Thủy
Dung, Nguyễn Bình Anh Thư, Nguyễn
Phương Thảo, 2014. Khảo sát sự biểu hiện
của gen GmHK06 và GmRR34 dưới điều
kiện thiếu nước ở hai giống đậu tương
MTD777-2 và DT20. Tạp chí Sinh học,
36(1se): 232-236.
127
 Nguyen Binh Anh Thu et al.

Abscisic acid (ABA) is an important phytohormone involving in plant adaptation to abiotic stress. Gene
expression study in response to ABA helps to identify the candidate genes for improvement of crop tolerance
genetic engineering. In this study, the regulatory role of GmHK07 was investigated in two soybean varieties
having contrasting phenotypes, including the drought-tolerant (DT51) and -sensitive (MTD720) phenotypes,
under ABA and drought stress treatment. The qRT-PCR results of 12-day-old plants subjected to 100 µM
ABA treatment showed that GmHK07 was repressed significantly in root and shoot tissues of MTD720.
Besides, the expression of this gene in MTD720 shoots was 158-folds and 85-folds higher than those of DT51
at normal condition and 10 hours of ABA treatment, respectively, whereas, this expression in MTD720 roots
was 195- and 67-folds higher than those of DT51. Under drought stress, high transcript of this gene was also
observed in both tissues of MTD720 relative to that of DT51. Together, GmHK07 is considered as a potential
negative regulator not only in drought tolerance but also in ABA response, and can be used in genetic
engineering approach to enhance plant adaptation to abiotic stresses.
Keywords: Abiotic stress, abscisic acid, drought, GmHK07, qRT-PCR, soybean.

Ngày nhận bài: 22-10-2014

128