Jurnal Penelitian Karet, 2016, 34 (1) : 25-34

Indonesian J. Nat. Rubb. Res. 2016, 34 (1) : 25-34

PENCEGAHAN BROWNING FASE INISIASI KALUS

PADA KULTUR MIDRIB DAUN KLON KARET
(HEVEA BRASILIENSIS MUELL. ARG) PB 330

Browning Prevention on Callus Initiation Phase on Leaf Midrib of PB 330

Rubber Clone Culture (Hevea brasiliensis Muell. Arg)
1*) 2)
Lestari ADMOJO dan Ari INDRIANTO
1*)
Balai Penelitian Getas, Pusat Penelitian Karet
Jl. Pattimura KM 6 Salatiga Jawa Tengah
Email: tariadmojo@balitgetas.co.id
2)
Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada
Jl. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta

Diterima : 6 Januari 2016 / Direvisi : 30 Mei 2016 / Disetujui : 24 Juni 2016

Abstract Abstrak

Tissue culture is one of new efforts to Perbaikan teknik perbanyakan dan

improve of rubber Hevea brasiliensis Muell.
Arg clonal propagation. Nevertheless, one of
the major problems is lethal browning on
callus initiation. Browning caused by some
phenolic compound which accumulated
during wounding. This experiment was
conducted to investigate the effect of
antioxidant ascorbic acid, activated
charcoal+sucrose, repeated culture, in
combination under the dark and light culture
incubations in controlling lethal browning in
in-vitro culture of rubber clone PB 330 using
midrib leaf explant. Explant was planted on
callus initiation medium MS+2,4-D 5 ppm
using 10 bottles as replication, were planted
in each bottle. The observation covered the
early time of browning initiation, intensity of
browning, and number of explants browning
up to 35 Day After Culture (DAC). Data were
analyzed by Analysis of Variance of Factorial
Design and significant different among
treatment were compared by Duncan Multiple
Range Test. The results of the current study
revealed that the best treatment was soaked
on 100 mg/L ascorbic acid soluble sterile
treatment by 30 minutes before planted on
medium and culture placed under dark
condition, showed browning intensity of
explants was significantly controlled down to
7.5% and also number of browning explants
reduced up to 30%.
Keywords: Rubber clone; Hevea brasiliensis;
PB 330; browning; ascorbic acid
mutu bibit klonal karet (Hevea brasiliensis
Muell. Arg) dapat dilakukan melalui teknik
kultur jaringan. Kendala teknik tersebut
diantaranya masih tingginya intensitas
browning pada tahap inisiasi kalus.
Browning umumnya disebabkan oleh
senyawa fenolik yang biasanya muncul dan
terakumulasi ketika eksplan dilukai.
Penelitian ini bertujuan mengetahui metode
eliminasi browning yang efektif diantara
perlakuan perendaman eksplan dalam asam
askorbat, arang aktif+sukrosa, subkultur
berulang yang diinkubasi dalam ruang gelap
dan terang. Bahan eksplan yang digunakan
adalah eksplan midrib daun klon karet PB
330 yang ditanam pada media induksi kalus
MS+2,4-D 5 ppm. Masing-masing
menggunakan 10 botol sebagai ulangan dan
ditanam sebanyak 2 eksplan per botol.
Pengamatan meliputi waktu awal browning,
waktu rata-rata eksplan mengalami
browning, intensitas browning dan jumlah
eksplan browning hingga 35 hari setelah
tanam (HST). Data dari 10 eksplan untuk
masing-masing perlakuan selanjutnya
dianalisis dengan analisis ragam dari
Rancangan Faktorial dan uji lanjut dengan
Duncan Multiple Range Test untuk data yang
berbeda nyata. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa perendaman eksplan
dalam 100 mg/L asam askorbat steril
selama 30 menit, yang diinkubasi dalam
ruang gelap efektif menurunkan intensitas
browning hingga 7,5% dengan jumlah

25
 Admojo dan Indrianto
eksplan yang mengalami browning dapat
ditekan hingga 30%.
Kata kunci: Klon karet; Hevea brasiliensis;
PB 330; browning; asam
askorbat
PENDAHULUAN

Salah satu upaya perbaikan mutu
bibit klonal karet (Hevea brasiliensis Muell.
Arg) yang dapat dilakukan adalah melalui
teknik kultur jaringan. Teknik tersebut
membuka peluang untuk mengatasi
beberapa persoalan mutu bibit yang
diperbanyak secara konvensional. Persoalan
tersebut antara lain menurunnya juvenilitas
bibit dan inkompatibilitas yang mungkin
terjadi antara batang atas dan batang
bawah. Sejauh ini, masih terdapat beberapa
kendala dalam teknik kultur jaringan yang
perlu diatasi. Salah satu kendala yang
dihadapi adalah sulitnya meregenerasi
kalus dari eksplan tanaman klonal karena
masih tingginya tingkat browning pada fase
induksi kalus. Browning (pencoklatan) pada
jaringan merupakan salah satu
permasalahan yang sering terjadi pada
kultur tanaman berkayu. Browning
umumnya disebabkan oleh senyawa fenolik
yang biasanya muncul dan terakumulasi
ketika eksplan dilukai, yang biasanya
disebabkan oleh aktivasi dari enzim
Polyphenol oxidase (PPO). Pelukaan organ
dapat menyebabkan terjadinya
ketidakseimbangan metabolisme dari ROS
(Reactive Oxygen Species), peroksidasi pada
membran lipid, dan kehilangan integritas
membran sel yang dapat memicu over
akumulasi dari senyawa fenolik dan
menyebabkan terjadinya browning (Ru, Lai,
Xu, & Li, 2013). PPO dan peroxidase (POD)
diketahui banyak ditemukan pada family
Euphorbiaceae, Moraceae, dan
Anacardiaceae yang antara lain
berhubungan dengan kandungan getah
(lateks) yang tinggi (John, Bhat, & Prasada
Rao, 2003). Umumnya, pencoklatan
merupakan hasil dari interaksi antara
aktivitas enzim PPO dan kandungan
polifenol. Seperti diketahui, perubahan
permeabilitas membran menyebabkan
pelepasan enzim dan substrat pada sitosol
yang memicu pigmentasi atau pencoklatan
(Mellidou et al., 2014).
26
Upaya mengatasi browning pada
kultur tanaman berkayu dapat dilakukan
antara lain dengan penambahan senyawa
antioksidan seperti asam askorbat,
modifikasi lingkungan kultur dengan
menempatkan dalam ruang gelap total,
subkultur berulang atau pencelupan dalam
cairan seperti arang aktif dan sukrosa. Pada
beberapa kasus, satu jenis perlakuan
pencegahan browning seringkali tidak
cukup efektif sehingga kadang kala
kombinasi perlakuan perlu dilakukan. Pada
tanaman Sideritis trojana Bornm.,
penambahan antioksidan 100 mg/L asam
askorbat dan 50 mg/L asam sitrat pada
media, penyimpanan kultur dalam ruang
gelap dan subkultur secara cepat setiap
minggu lebih efektif dalam mencegah
browning dibandingkan dengan perlakuan
tunggal (Corduk & Aki, 2011). Pada tanaman
pir (Pyrus communis L.), kombinasi
antioksidan (100 mg/L asam askorbat dan
150 mg/L asam sitrat) sebagai pra
perlakukan selama 1 jam + Polyvinyl
pyrrlidone (PVP) 160 mg/L + arang aktif 200
mg/L yang ditambahkan pada media
signifikan mengurangi nekrosis dan
browning (Esmail et al., 2014). Pada
tanaman pisang spesies grand naine yang
bergetah, browning mampu ditekan dengan
penambahan asam askorbat dengan
kombinasi asam sitrat, arang aktif, cysteine,
dan sari jahe yang diberikan pada saat pra
perlakuan (Morfeine, 2013).
Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui metode paling efektif dalam
mencegah browning fase induksi kalus pada
kultur midrib (bagian pertulangan) daun
klon karet PB 330.
BAHAN DAN METODE

Penelitian dilakukan di
Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Biologi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, sejak
Juni hingga November 2014. Bahan dan
metode yang digunakan dalam penelitian
meliputi :
1. Bahan tanam dan sumber eksplan
Bahan tanam menggunakan bibit
polibag klon karet PB 330 pada stadia 1-2
payung daun. Bagian daun diambil dari
Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus Pada Kultur Midrib Daun Klon Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg) PB 330
tunas pada usia sekitar 5-8 hari setelah
flush. Daun yang diambil adalah yang telah
berwarna hijau segar (tidak lagi berwarna
coklat seperti fase awal flush) dan sehat.
Bibit klon karet PB 330 diperoleh dari Balai
Penelitian Getas, Salatiga, Jawa Tengah.
2. Penyiapan eksplan
Daun yang telah diambil sebagai
sumber eksplan selanjutnya disiapkan di
Laboratorium. Pra sterilisasi dilakukan
dengan pencucian daun dalam detergen cair
di bawah air mengalir. Setelah bersih, daun
dipotong sekitar 3-5 cm dan diletakkan di
dalam erlenmeyer kemudian disterilisasi di
dalam Laminar Air Flow. Daun disterilisasi
dengan merendam dalam alkohol 70%,
digojog 2-3 menit, kemudian dibilas dengan
akuades steril 2 kali. Selanjutnya daun
direndam dalam Clorox 2,25%, dikocok
selama 2-3 menit dan dibilas dengan
akuades steril 3 kali. Sebelum ditanam,
daun dipotong di bagian tepi (hingga tersisa
bagian midrib atau pertulangannya
daunnya) sepanjang 1 x 1,5 cm.
3. Perlakuan pencegahan browning
Pada perlakuan perendaman eksplan,
eksplan direndam dalam asam askorbat 100
mg/L steril dan arang aktif 2 g/L+sukrosa 8
g/L steril dan digoyang perlahan selama 30
menit, setelah itu langsung ditanam dalam
media. Larutan asam askorbat disterilkan
dengan milipore filter 0,2 µ dan larutan
sukrosa+arang aktif di dalam autoklaf
sebelum digunakan. Setelah eksplan
ditanam dalam media, selanjutnya
diinkubasi pada kondisi gelap dan di bawah
penyinaran. Perlakuan subkultur berulang
dengan memindah tanam eksplan baik
eksplan dengan perlakuan perendaman
Tabel 1. Kombinasi perlakuan pencegahanbrowning fase induksi kalus
Table 1. Combination of browning treatments on callus induction phase
Perlakuan
Treatment
Tanpa perlakuan (kontrol)
Rendam asam askorbat
Rendam sukrosa+arang aktif
Subkultur berulang
Subkultur berulang+ rendam asam askorbat
Subkultur berulang+rendam (sukrosa+arang aktif)
asam askorbat atau arang aktif+sukrosa
maupun tanpa perlakuan perendaman
setiap 7 hari sebanyak 2 kali pindah tanam
dalam media yang sama. Asam askorbat dan
arang aktif diperoleh dari Merck Jerman.
Matriks kombinasi perlakuan disajikan
dalam Tabel 1.
4. Kondisi kultur dan media tanam
Kultur selanjutnya ditempatkan pada
dua kondisi yaitu ruang gelap dan terang.
Ruang terang dengan menempatkan kultur
di bawah penyinaran lampu TL 1000 lux,
suhu 25oC dan kelembaban 60-70%. Media
tanam menggunakan media MS (Murashige
& Skoog) dengan penambahan auksin 2,4-D
5 ppm (2,4-Diclorophenoxy acetic acid). pH
medium sekitar 5,7-5,8 sebelum diautoklaf
pada suhu 121oC pada tekanan 1 atm.
Auksin diperoleh dari Merck Jerman.
5. Rancangan percobaan dan pengamatan
Percobaan disusun dengan
Rancangan Faktorial dengan 10 botol
sebagai ulangan, tiap botol ditanam
sebanyak 2 eksplan. Pengamatan dilakukan
terhadap waktu mulai terjadinya browning,
jumlah eksplan yang mengalami browning,
intensitas browning dan waktu terjadinya
lebih dari 50% total eksplan mengalami
browning yang diamati hingga 35 HST (hari
setelah tanam). Intensitas browning diukur
berdasarkan kategori dalam Tabel 2.
Perlakuan subkultur berulang diamati
setelah subkultur pertama atau 7 HST. Data
intensitas browning dianalisis dengan
analisis ragam dari Rancangan Faktorial dan
uji lanjut dengan Duncan Multiple Range Test
(DMRT) untuk data yang berbeda nyata pada
taraf nyata 5% menggunakan software SAS
9.1.
Kondisi inkubasi
Incubation
Terang Gelap
Light Dark
B1 B2
B3 B4
B5 B6
B7 B8
- B9
- B10
27
 Admojo dan Indrianto

Tabel 2. Penilaian intensitas browning

Table 2. Scoring of browning intensity

Skoring Keterangan
No.
Scoring Remarks
1. 0-0,24 0 - <1/4 bagian eksplan mengalami browning
2. 0,25-0,49 1/4 - <1/2 bagian eksplan mengalami browning
3. 0,50-0,74 1/2 - <3/4 bagian eksplan mengalami browning
4. 0,75-0,99 3/4 - <1 bagian eksplan mengalami browning
5. 1,00 Seluruh bagian eksplan mengalami browning

HASIL DAN PEMBAHASAN ruang gelap, yaitu berturut-turut pada 19

Secara umum seluruh perlakuan
menunjukkan hasil yang berbeda nyata
dengan kontrol, baik kontrol terang maupun
kontrol gelap. Hasil pengamatan yang
dilakukan hingga 35 hari setelah tanam
(HST) disajikan dalam Tabel 3. Waktu awal
kemunculan browning paling lama terjadi
pada perlakuan perendaman eksplan dalam
media sukrosa+arang aktif yang diinkubasi
di ruang gelap dan perendaman eksplan
dalam asam askorbat yang diinkubasi di
dan 17 HST, nilai ini lebih baik dibanding
kontrol gelap dan kontrol terang. Waktu
>50% eksplan mengalami browning
menunjukkan perlakuan subkultur
berulang yang diinkubasi di ruang terang
menunjukkan waktu yang lebih cepat, yaitu
13 HST dan nilai ini masih lebih baik
dibanding dengan kontrol gelap dan kontrol
terang yang masing-masing terjadi pada 7
HST. Perlakuan perendaman eksplan dalam
asam askorbat yang diinkubasi di ruang
gelap dan kombinasinya dengan subkultur

Tabel 3. Pengaruh beberapa perlakuan terhadap terjadinya browning

Table 3. Effect of each treatment on browning of explants.
Waktu
Waktu Persentase Persentase
Jumlah >50%
awal intensitas jumlah
Jumlah eksplan eksplan
browning browning eksplan
eksplan browning browning
(HST) browning
Kode Perlakuan (HST)
Percentage of
Code Treatments Number Number of
Early time browning Percentage
of browning Time of
of intensity of browning
explants explants >50%
browning (%) explants
explants
(DAC) (%)
browning
KT Kontrol terang 20 3 95,0a±10,5 20 100 7
KG Kontrol gelap 20 5 90,0a±10,4 20 100 7
Rendam asam
AA-T 20 12 45,0b±27,6 14 70 35
askorbat - terang
Rendam asam
AA-G 20 17 7,5c±2,6 6 30 -
askorbat - gelap
Rendam (sukrosa+
SA-T 20 15 52,5b±36,1 14 70 22
arang aktif) – terang
Rendam (sukrosa+
SA-G 20 19 45,0b±31,4 12 60 33
arang aktif) - gelap
Subkultur berulang
SK-T 20 3*) 90,0a±17,4 20 100 13*)
3x - terang
Subkultur berulang
SK-G 20 6*) 52,5b±30,5 14 70 29*)
3x - gelap
Subkultur berulang
SK-AA-G + rendam asam 20 4*) 10c±3,3 6 30 -
askorbat-gelap
Subkultur berulang
SK-SA-G + rendam (sukrosa + 20 5*) 45b±22,2 14 70 19*)
arang aktif)-gelap

28
Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus Pada Kultur Midrib Daun Klon Karet (hevea Brasiliensis Muell. Arg) PB 330

berulang menunjukkan tidak terjadi diantara seluruh perlakuan. Waktu awal

browning hingga 50% dari total jumlah
eksplan. Hasil tersebut menegaskan bahwa
perlakuan perendaman dalam larutan
antioksidan dan penempatan eksplan dalam
ruang gelap mampu memperlambat waktu
kemunculan browning. Rata-rata intensitas
browning terendah dicapai pada perlakuan
perendaman eksplan dalam asam askorbat
yang diinkubasi di ruang gelap dan
kombinasinya dengan perlakuan subkultur
berulang, yaitu berturut-turut sebanyak
7,5% dan 10% dan nilai ini nyata lebih
rendah daripada perlakuan lainnya. Jumlah
total eksplan yang mengalami browning juga
lebih rendah pada perlakuan perendaman
eksplan dalam asam askorbat yang
diinkubasi di ruang gelap atau dengan
kombinasi subkultur berulang yaitu
sebanyak 30%. Hasil percobaan ini juga
menunjukkan bahwa hampir seluruh
eksplan yang diperlakukan tanpa asam
askorbat mengalami browning lebih cepat
dengan intensitas yang lebih tinggi.
Gambar 1 menunjukkan perbedaan
waktu awal munculnya browning dengan
waktu >50% eksplan mengalami browning
kemunculan browning paling lama terjadi
pada perlakuan perendaman eksplan dalam
sukrosa+arang aktif yang diinkubasi di
ruang gelap (SA-G) yaitu pada 19 HST, nilai
ini tidak jauh berbeda dengan perlakuan
perendaman eksplan dalam asam askorbat
yang diinkubasi di ruang gelap (AA-G) yaitu
pada 17 HST. Kedua perlakuan tersebut
menunjukkan waktu awal browning yang
lebih lama dibandingkan dengan kontrol
gelap dan kontrol terang, yaitu berturut-
turut pada 3 dan 5 HST. Waktu >50%
eksplan mengalami browning tidak terjadi
pada perlakuan perendaman eksplan dalam
asam askorbat yang diinkubasi di ruang
gelap (AA-G) dan kombinasinya dengan
subkultur berulang (SK-AA-G), karena
eksplan yang mengalami browning kurang
dari 50%.
Gambar 2 menunjukkan perbedaan
persentase intensitas browning dan jumlah
eksplan yang mengalami browning diantara
seluruh perlakuan. Pada perlakuan yang
mengalami intensitas browning tinggi, juga
diikuti tingginya jumlah eksplan yang
mengalami browning. Intensitas browning

40 waktu awal
Waktu awal browning
35 browning
Early time of browning
30 Waktu >50% browning
Waktu (HST)
Time (DAC)

25 Time of >50% explants browning

20
15
10
5
0

Perlakuan
Treatments

Keterangan (Remarks) : HST:Hari Setelah Tanam (DAC:Day After Culture), KT:Kontrol Terang (Control of Light
treatment), KG:Kontrol Gelap (Control of Dark treatment), AA-T:Asam Askorbat-Terang (Ascorbic Acid-
Light treatment), AA-G:Asam Askorbat-Gelap (Ascorbic Acid-Dark treatment), SA-T:Sukrosa+Arang
aktif-Terang (Sucrose+Activated charcoal-light treatment), SA-G:Sukrosa+Arang aktif-Gelap
(Sucrose+Activated charcoal-dark treatment), SK-T:Subkultur berulang-Terang (Repeated subculture-
Light condition), SK-G:Subkultur berulang-Gelap (Repeated subculture-Dark condition), SK-AA-
G:Subkultur berulang-Asam Askorbat-Gelap (Repeated subculture-Ascorbic acid-Dark condition), SK-
SA-G:Subkultur berulang-Sukrosa+Arang aktif-Gelap (Repeated subculture-Sucrose+Activated
charcoal-Dark condition).
Gambar 1. Perbedaan antar perlakuan pada waktu awal browning dan waktu >50% eksplan
mengalami browning
Figure 1. Differences among treatments on early time of browning and time of >50% explants
browning

29
 Admojo dan Indrianto

120
a a a
100 b Intensitas browning
Browning intensity
b b b
Jumlah eksplan browning
80 b
Persentase
Percentage

Number of browning explants

60

40
c
c
20

Perlakuan
Treatment

Keterangan (Remarks) : HST:Hari Setelah Tanam (DAC:Day After Culture), KT:Kontrol Terang (Control of Light
treatment), KG:Kontrol Gelap (Control of Dark treatment), AA-T:Asam Askorbat-Terang (Ascorbic Acid-
Light treatment), AA-G:Asam Askorbat-Gelap (Ascorbic Acid-Dark treatment), SA-T:Sukrosa+Arang
aktif-Terang (Sucrose+Activated charcoal-light treatment), SA-G:Sukrosa+Arang aktif-Gelap
(Sucrose+Activated charcoal-dark treatment), SK-T:Subkultur berulang-Terang (Repeated subculture-
Light condition), SK-G:Subkultur berulang-Gelap (Repeated subculture-Dark condition), SK-AA-
G:Subkultur berulang-Asam Askorbat-Gelap (Repeated subculture-Ascorbic acid-Dark condition), SK-
SA-G:Subkultur berulang-Sukrosa+Arang aktif-Gelap (Repeated subculture-Sucrose+Activated
charcoal-Dark condition). Data yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf nyata 5%
(data followed by the same letter are not significantly different at P=0,05).

Gambar 2. Perbedaan intensitas browning dan jumlah eksplan yang mengalami browning
diantara seluruh perlakuan.
Figure 2. Differences among treatments on browning intensity and number of browning
explants

terendah dicapai pada perlakuan eksplan dalam asam askorbat terbukti

perendaman eksplan dalam asam askorbat
yang diinkubasi di ruang gelap (AA-G) yaitu
sebanyak 7,5% dengan jumlah eksplan yang
mengalami browning hanya 30%. Hasil
tersebut tidak berbeda nyata dengan
perlakuan subkultur berulang+perendaman
eksplan dalam asam askorbat yang
diinkubasi di ruang gelap (SK-AA-G) yaitu
10% dengan nilai jumlah eksplan yang
mengalami browning sama yaitu sebanyak
30%. Data tersebut menunjukkan hasil yang
berbeda nyata dengan kontrol terang dan
kontrol gelap.
Hasil pengamatan menunjukkan
perlakuan asam askorbat yang diinkubasi
dalam ruang gelap menunjukkan hasil
terbaik untuk keseluruhan respon. Waktu
terjadinya browning yang lama (17 HST),
intensitas browning lebih rendah (7,5%), dan
persentase eksplan yang mengalami
browning mampu ditekan hingga 30%. Hasil
tersebut menegaskan bahwa perendaman
cukup efektif menanggulangi browning fase
induksi kalus pada kultur midrib daun klon
karet PB 330. Perendaman eksplan asam
askorbat tidak hanya mengekspose eksplan
pada senyawa reduksi tetapi juga pada pH
rendah. Pada pH di bawah 4, diketahui
aktivitas enzim PPO (Polyphenol Oxidase)
menurun karena reduksi dari Cu2+ menjadi
mononuclear copper (Cu+) pada sisi aktifnya,
atau kehilangan rantai copper pada sisi
aktifnya, atau berhubungan dengan reduksi
senyawa quinon menjadi difenol (Arpita,
Subroto, Pinaki, & Bidyut, 2010). Pada
tanaman karet, aktivitas PPO terjadi pada
rentang pH 4-10, dengan aktivitas optimal
terjadi pada pH 6 (Muhamad,
Chirapongsatonkul, & Churngchow, 2012).
PPO dilaporkan terdapat pada fraksi lutoid
dan partikel Frey-Wyssling yang terdapat
pada pembuluh lateks, bahkan pada lutoid
ditemukan hingga 5–34 kali lebih tinggi
dibandingkan pada partikel Frey-Wyssling
(Sakdapipanich & Rojruthai, 2012). Seperti

30
Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus Pada Kultur Midrib Daun Klon Karet (hevea Brasiliensis Muell. Arg) PB 330
diketahui, pembuluh lateks ada di seluruh
bagian tanaman karet, termasuk pada
bagian midrib daun yang digunakan sebagai
eksplan. (PPO) diketahui terdapat pada
daun, biji dan suspensi sel dari tanaman
karet Hevea brasiliensis. dimana catechol
ditemukan paling banyak sebagai spesifik
substratnya (Muhamad et al., 2012).
Diantara inhibitor PPO yang diuji pada
tanaman rambutan (Nephelium lappaceum
L.), inhibitor yang efektif untuk catechol
sebagai substratnya adalah asam askorbat
(Haque, Al-Jassabi, Saad, & Satyakeerthy,
2014).
Mekanisme pencegahan browning
dapat dilihat pada Gambar 3. Seperti
diketahui, oksigen dibutuhkan dalam
aktivitas respirasi. Aktivitas respirasi dapat
Gambar 3. Mekanisme pencegahan browning
oleh senyawa antioksidan
Figure 3. Browning prevention mechanism
by antioxidant compound
Sumber (Source): Veltman & Peppelenbos,
2003
mengakibatkan munculnya radikal oksigen
bebas, yang dapat memicu
dekompartemenisasi (pecahnya vakuola dan
plastida di dalam sel) yang menyebabkan
aktifnya enzim PPO yang akhirnya
menyebabkan pencoklatan jaringan
(browning). Senyawa antioksidan berperan
dalam menangkap radikal oksigen bebas
sehingga mampu mencegah
dekompartemenisasi yang bisa
mengaktifkan enzim PPO (Veltman &
Peppelenbos, 2003). Asam askorbat
berperan dalam merubah radikal tocopheryl
menjadi semi-dehydroascorbic acid,
sehingga tidak berperan dalam membentuk
senyawa hidrogen peroksida yang bersifat
toksik (Gambar 4).
Pada kultivar tanaman pir,
penambahan 100 mg/L asam askorbat
peroxides:
RO-
Gambar 4. Interaksi antara AA (Asam
Askorbat) dan GSH (bentuk
reduksi dari glutathione) dalam
mengubah senyawa radikal
tocopheryl.
Figure 4. Interaction between AA (Ascorbic
Acid) and GSH (glutathione
reduction form) on changing of
radical tocopheryl.
31
 Admojo dan Indrianto

Tabel 4. Skor intensitas browning dari terendah hingga tertinggi

Table 4. Score of browning intensity from lowest to highest level

Skor Eksplan browning Keterangan

Score Browning explant Remarks
0-0,24 Browning tidak terjadi pada seluruh bagian
eksplan, atau hanya sedikit di bagian tertentu
saja, seperti bagian salah satu sisi daun, atau
bagian kecil dari tangkai daun yang meliputi
kurang dari seperempat bagian eksplan.

0,25-0,49 Browning terjadi pada sekitar seperempat

hingga kurang dari setengah bagian eksplan,
seperti sebagian kedua sisi daun, dan sebagian
kecil dari tangkai daun.

0,50-0,74 Browning terjadi pada setengah hingga lebih

dari setengah bagian eksplan, namun kurang
dari tiga perempat bagian eksplan, seperti
sebagian besar kedua sisi daun dan sebagian
kecil dari tangkai daun.

0,75-0,99 Browning terjadi pada tiga perempat atau lebih

dari tiga perempat bagian eksplan, namun
kurang dari seluruh bagian eksplan, seperti
hampir kseluruhan kedua sisi daun dan
sebagian besar dari tangkai daun, atau
sebaliknya.

1,00 Browning terjadi pada seluruh bagian eksplan,

seperti kedua sisi daun dan tangkai daun.

32
Pencegahan Browning Fase Inisiasi Kalus Pada Kultur Midrib Daun Klon Karet (hevea Brasiliensis Muell. Arg) PB 330
selama 15 menit sebelum sterilisasi terbukti
dapat mengurangi intensitas browning
(Jartoodeh, Davarynejad, Tehranifar, Kaveh,
& Bisheh, 2013). Eliminasi browning pada
eksplan tanaman B. huillensis
menggunakan bagian nodal, juga efektif
digunakan 200 mg/L asam askorbat
(Ndakidemi, Mneney, & Ndakidemi, 2014).
Pada tanaman leci (Litchi chinensis sonn.)
pencelupan eksplan dalam asam askorbat
setelah pelukaan, sangat efektif mengurangi
intensitas browning, sedangkan
penambahan arang aktif tidak berpengaruh.
Hal tersebut diduga karena arang aktif lebih
berpengaruh terhadap penyerapan nutrisi
media dibandingkan penyerapan polifenol
pada eksplan (Pankaj, Pandey, & Roy, 2014).
Senada dengan hasil review yang dilakukan
oleh Ionita (2013) pada beberapa tanaman,
urutan inhibitor yang paling efektif untuk
menghambat aktivitas PPO yaitu : asam
askorbat, asam sitrat, L-cysteine dan
sodium metabisulfit. Hasil penelitian pada
tanaman selada (Lactuca sativa L. cv
'Iceberg'), salah satu gen kunci yang
berperan dalam jalur biosintesis asam
askorbat, L-galactono-1,4-lactone
dehydrogenase (L-GalLDH), terekspresi.
Overekspresi dari L-GalLDH menyebabkan
akumulasi asam askorbat dan mengurangi
intensitas browning pada daun selada
setelah dipotong. Hal ini membuktikan,
adanya peran asam askorbat endogen
sebagai agen pencegah browning (Landi et
al., 2015).
Skoring intensitas browning
disajikan dalam Tabel 4. Pada beberapa
kasus, sekalipun eksplan mengalami
browning pada awal waktu, namun tidak
menghambat kemunculan kalus, dan ketika
browning semakin meningkat kalus tidak
mampu berkembang lebih lanjut yang
akhirnya turut mengalami browning.
KESIMPULAN DAN SARAN
Pencegahan browning fase induksi
kalus pada kultur midrib daun klon PB 330
berhasil dilakukan hingga 30% dengan
intensitas browning hanya 7,5% pada
perlakuan perendaman asam askorbat steril
100 mg/L selama 30 menit sebelum tanam
dan kultur diinkubasi dalam ruang gelap
hingga terbentuk kalus. Kalus friabel yang
telah terbentuk disarankan segera
disubkultur pada medium diferensiasi kalus
untuk mencegah terjadinya browning
susulan akibat terlalu lama berada dalam
medium yang sama.
DAFTAR PUSTAKA
Arpita, S., Subroto, D., Pinaki, B., & Bidyut,
B. (2010). Inhibition of polyphenol
oxidase in banana, apple and
mushroom by using different
antibrowning agents under different
conditions. Int. J. Chem. Sci., 8(5),
S550-S558. Diakses tanggal 7 Juni
2 0 1 6 d a r i
www.sadgurupublications.com/Conte
ntPaper/2010/62_Format.pdf
Corduk, N., & Aki, C. (2011). Inhibition of
browning problem during
micropropagation of Sideritis trojana
Bornm. an endemic medicinal herb of
Turkey. Romanian Biotechnological
Letters, 16(6), 6760-6765. Diakses
tanggal 6 Juni 2016 dari
www.researchgate.net/publication/2
59378783
Esmail, A. L. G., Haggag, L. F., Barakat, M.
N., Farag, K. M., Zayed, N. S., & Fouad,
A. A. (2014). Direct effect of medium
types, explant type and antioxidant
treatments on micropropagation of
Pyrus" Lecont”. Middle East Journal of
Agriculture Research, 3(3), 618-622.
Diakses tanggal 7 Juni 2016 dari
www.curresweb.com/mejar/mejar/20
14/608-622.pdf
Haque, A. M. T. E., Al-Jassabi, S., Saad, A., &
Satyakeerthy. (2014). Biochemical
studies on the characters of polyphenol
oxidase from rambutan (Nephelium
lappaceum L.) Peel. Middle-East
Journal of Scientific Research, 21(4),
623-627.doi:10.5829/idosi.mejsr.
2014.21.04.82430
Ionita, E. (2013). Plant polyphenol oxidases:
isolation and characterization.
Innovative Romanian Food
Biotechnology, 13, 1-10. Diakses
tanggal 6 Juni 2016 dari
http://www.bioaliment.ugal.ro/ejour
nal.html.
33
 Admojo dan Indrianto
Jartoodeh, S. V., Davarynejad, Gh. H.,
Tehranifar, A., Kaveh, H., & Bisheh, H.
A. (2013). Reducing browning problem
in micropropagation of three pear
cultivars; Sebri, Shekari and Natanz.
Curr. Opin. Agric. 2(1), 25–27. Diakses
tanggal 6 Juni 2016 dari
https://www.researchgate.net/public
ation/259530975
John, K. S., Bhat, S. G., & Prasada Rao, U. J.
S. (2003). Biochemical
characterization of sap (latex) of a few
indian mango varieties.
Phytochemistry, 62(1), 13–19. doi:
10.1016/S0031-9422(02)00441-7
Landi, M., Fambrini, M., Basile, A., Salvini,
M., Guidi, L., & Pugliesi, C. (2015).
Over expression of L-galactono-1,4-
lactone dehydrogenase (L-GalLDH)
gene correlates with increased
ascorbate concentration and reduced
browning in leaves of Lactuca sativa L.
after cutting. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture (PCTOC), 123, 109-120.
doi:10.1007/s11240-015-0819-y
Mellidou, I., Buts, K., Hatoum, D., Ho, Q. T.,
Johnston, J. W., Watkins, C. B.,
Schaffer, R. J., Gapper, N. E.,
Giovannoni, J. J., Rudell, D. R.,
Hertog, M. L. A. T. M., & Nicolai, B. M.
(2014). Transcriptomic events
associated with internal browning of
apple during postharvest storage. BMC
Plant Biology, 14, 328 (17p).
doi:10.1186/s12870-014-0328-x
Morfeine, E. A. (2013). Effect of anti-
browning on initiation phase of Musa
species grand naine in vitro. Journal of
Forest Products & Industries, 2(2), 45-
47. Diakses tanggal 7 Juni 2016 dari
researchpub.org/journal
/jfpi/number/vol2-no2/vol2-no2-
7.pdf
Muhamad, N., Chirapongsatonkul, N., &
Churngchow, N. (2012). Defense-
related polyphenol oxidase from Hevea
brasiliensis cell suspension:
purification and characterization.
Journal Applied Biochemistry and
Biotechnology, 167(1), 177-189. doi:
10.1007/s12010-012-9690-z
34
Ndakidemi, C. F., Mneney, E., & Ndakidemi,
P. A. (2014). Effects of ascorbic acid in
controlling lethal browning in in vitro
culture of Brahylaena huillensis using
nodal segments. American Journal of
Plant Sciences, 5(1), 187-191. doi:
10.4236/ajps.2014.51024
Pankaj, K., Pandey, S. K., & Roy, K. A. (2014).
Ascorbic and citric acids in
combination resolve the problems
encountered in micro-propagation of
litchi from shoot tips. Journal of Cell
and Tissue Research, 14(1), 4159-
4164. Diakses tanggal 6 Juni 2016 dari
www.tcrjournals.com/tr_pastabstract
.php?vid=35
Sakdapipanich, J. T., & Rojruthai, P. (2012)
Molecular structure of natural rubber
and its characteristics based on recent
evidence. In R. Sammour.
Biotechnology, molecular studies and
novel applications for improved quality
of human life. (p.213-238). Rijeka
Croatia: Intech.
Ru, Z., Lai, Y., Xu, C., & Li, L. (2013).
Polyphenol oxidase (PPO) in early stage
of browning of Phalaenopsis leaf
explants. Journal of Agricultural
S c i e n c e , 5 ( 9 ) . 5 7 - 6 4 .
doi:10.5539/jas.v5n9p57
Veltman, R. H., & Peppelenbos, H. W. (2003).
A proposed mechanism behind the
development of internal browning in
pears (Pyrus Communis cv.
Conference). Acta Hort, 600, 247-255.
doi: 10.17660/ActaHortic.
2003.600.32