Professional Documents
Culture Documents
KHƯU
Mã số: 9720206
Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Nguyễn Minh Đức
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tác giả
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của gen trnK. “Nguồn: Zhu, 2003” ................................................. 5
Hình 1.2. Cây phát sinh loài dựa trên kết hợp dữ liệu gen trnK và trình tự gen 18S
rRNA .............................................................................................................. 6
Hình 1.3. Khung cơ bản của các saponin và phần đường phổ biến của các saponin
thuộc chi Panax.............................................................................................. 9
Hình 1.4. Sự hình thành các ginsenosid trong quá trình chế biến (hấp). ..................... 15
Hình 1.5. Nhận diện và truyền tín hiệu lipopolysacharid (LPS) trong đại thực bào .. 23
Hình 1.6. Phần trên mặt đất (a) và phần dưới mặt đất (b) của Sâm VN ...................... 32
Hình 1.7. Các hợp chất polyacetylen phân lập từ phần dưới mặt đất của Sâm VN. ... 34
Hình 1.8. Cấu trúc của saponin phân lập từ Sâm VN .................................................. 35
Hình 3.9. Bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN ............................................................. 64
Hình 3.10. SKĐ SKLM của các bộ phận khác nhau của Sâm VN ................................ 64
Hình 3.11. SKĐ ELSD (a) và LC/MS (b) của rễ con Sâm VN ..................................... 66
Hình 3.12. SKĐ HPLC/ELSD đại diện cho 5 bộ phận khác nhau của Sâm VN. .......... 68
Hình 3.13. Hình ảnh đại diện Sâm VN tươi (A), sấy khô (B) và sau chế biến (C) ....... 74
Hình 3.14. SKĐ đại diện HPLC/ELSD phân tích các mẫu Sâm VN chưa chế biến (A)
và Sâm VN chế biến ở 8 giờ (B). ................................................................. 75
Hình 3.15. Sơ đồ quy trình chiết các cao từ dược liệu Sâm VN chế biến ..................... 76
Hình 3.16. Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao EA ................................................... 78
Hình 3.17. SKĐ HPLC/ELSD phân tích mẫu rễ con (a) và phân đoạn Bu1.25 (b)......... 80
Hình 3.18. Sơ đồ phân lập các thành phần từ cao Bu1 .................................................. 80
Hình 3.19. Quy trình phân lập các hợp chất từ cao chiết Bu2. ...................................... 82
Hình 3.20. Cấu trúc phần đường gắn vào vị trí C-20 của hợp chất 22 (a) và
notoginsenosid Q (b). ................................................................................ 101
Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất 22............................................................................ 102
Hình 3.22. Cấu trúc notoginsenosid D (hợp chất 23) .................................................. 105
Hình 3.23. SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 105 ℃ ........................... 109
Hình 3.24. SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 120 ℃ ........................... 110
vi
Hình 3.25. Độc tính trên tế bào đại thực bào phúc mạc............................................... 118
Hình 3.26. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của các yếu tố tham gia
đường truyền tín hiệu viêm thông qua NF-κB khi xử lý với LPS ............. 118
Hình 3.27. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên sự chuyển vị NF-κB vào nhân tế
bào .............................................................................................................. 119
Hình 3.28. Tác động của P-RT4 và OCT trên hoạt hóa NF-κB trong đại thực bào gây
bởi LPS ...................................................................................................... 119
Hình 3.29. Tác dụng của P-RT4 và OCT trên gắn kết LPS lên TLR4 ở đại thực bào
chuyển nhiễm với MyD88 siRNA ............................................................. 120
vii
Trang
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ so sánh hàm lượng các saponin chính nhóm PPT, PPD và OCT
trong các bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN. ........................................... 74
Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT và
OCT trong quá trình chế biến Sâm VN ở 105 ℃. ................................... 111
Biểu đồ 3.3. Sự thay đổi hàm lượng saponin phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃ . 112
Biểu đồ 3.4. Sự thay đổi hàm lượng saponin kém phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120
℃.............................................................................................................. 112
Biểu đồ 3.5. Hoạt tính chống gốc tự do DPPH của Sâm VN ở thời điểm chế biến khác
nhau tại 120 ℃ . ....................................................................................... 114
Biểu đồ 3.6. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃ trong
khoảng thời gian từ 2-20 giờ trên dòng tế bào ung thư phổi A549. ........ 115
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 120 ℃ trên
dòng tế bào ung thư phổi A549. .............................................................. 116
Biểu đồ 3.8. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃ trong 8 giờ so
với Sâm VN chưa chế biến trên dòng tế bào ung thư phổi A549. ........... 116
Biểu đồ 3.9. Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của các
saponin phân lập từ Sâm VN chế biến. ................................................... 117
viii
Bảng 3.25. Dữ liệu phổ 13C-NMR của các saponin hợp chất 17, 18 và 19 ................. 87
Bảng 3.26. Dữ liệu phổ 1H-NMR (H*, m (J, Hz)) của các saponin hợp chất 17, 18 và
19 ............................................................................................................... 88
Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (125
MHz, C5D5N, C**) của các hợp chất 2, 7, 11, 12, 13 và 26. ..................... 90
Bảng 3.28. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, C*, C5D5N) của các hợp chất 1a, 1b,
3a, 3b, 5, 6, 9, 10. ...................................................................................... 95
Bảng 3.29. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) của các hợp chất
1a, 1b, 3a, 3b, 5, 6, 9 và 10. ...................................................................... 96
Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C)
của hợp chất 20 và 21 so với G-Ra1 và N-R4 ............................................ 97
Bảng 3.31. Dữ liệu 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C**,)
của hợp chất 22 .......................................................................................... 99
Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C)
của hợp chất 23 ........................................................................................ 103
Bảng 3.33. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 4 và 24 .................................................. 105
Bảng 3.34. Thành phần saponin trong Sâm VN chế biến .......................................... 107
Bảng 3.35. Hàm lượng1) saponin Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃, 8 giờ ......... 108
Bảng 3.36. Chỉ số tương quan giữa thành phần hóa học saponin của các mẫu Sâm VN
chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃..................................................................... 113
Bảng 4.37. Cấu trúc các hợp chất saponin phân lập được từ Sâm VN chế biến........ 129
1
MỞ ĐẦU
Nhân sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) từ lâu đã được xem là vị thuốc hàng đầu trong
4 vị thuốc quý “Sâm, Nhung, Quế, Phụ” theo y học cổ truyền phương Đông. Vị “Sâm”
ở đây đươc hiểu là Nhân sâm, vì một số loài khác cùng chi Panax có tác dụng tương tự
cũng được gọi là sâm như Sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium L.), Sâm Nhật (Panax
japonicus C. A. Meyer), Tam thất (Panax notoginseng Burk. F.H. Chen)...
Hồng sâm là loại Nhân sâm được chế biến theo phương pháp cổ truyền bằng cách hấp
củ sâm tươi ở nhiệt độ cao có hay không có áp suất trong khoảng 2-6 giờ tùy theo tài
liệu [50],[65]. Cách chế biến này làm thay đổi về mặt thể chất của Nhân sâm giúp bảo
quản Sâm lâu dài hơn. Quá trình chế biến cũng làm thay đổi thành phần hóa học của
Nhân sâm, đặc biệt là thành phần ginsenosid. Các ginsenosid phân cực sẽ bị cắt đường
và khử nước tạo thành các ginsenosid mới không có trong bạch sâm như G-Rg3, -Rg5, -
Rg6, -Rh2, -Rh3, -Rh4, -Rs3…[50],[98]. Các thành phần mới này giúp tăng cường hoạt
tính sinh học của Hồng sâm với tác dụng phòng chống ung thư, kháng viêm, chống oxy
hóa…[102],[130]. Do vậy, tác dụng bổ dưỡng, tác dụng chữa bệnh tim mạch, suy
nhược thần kinh, bệnh đáo thái đường và đặc biệt hơn là tác dụng phòng chống ung
thư, kháng viêm và chống oxy hóa đã được chứng minh là mạnh hơn so với dạng Sâm
chưa chế biến [65],[102]. Do các biến đổi trên, trong hai dạng chế biến, Hồng sâm
được cho là tốt hơn, đắt tiền hơn và sử dụng phổ biến hơn bạch sâm [50].
Bên cạnh dạng chế biến phổ biến là Hồng sâm, hai dạng chế biến mới của Nhân sâm là
Thái dương sâm (Sun ginseng, hấp Sâm ở nhiệt độ cao hơn với áp suất cao) và Hắc
sâm (Black ginseng, hấp Sâm ở thời gian lâu hơn và nhiều lần hơn) đã được nghiên
cứu. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học thay đổi đáng kể [103]. Tóm lại, việc
chế biến đã làm tăng tác dụng điều trị, hiệu quả và giá trị kinh tế của Nhân sâm.
Sâm Việt Nam (Sâm VN, Panax vietnamensis Ha et Grushv.) được phát hiện từ năm
1973, đến nay đã được thế giới biết đến qua những nghiên cứu thành phần hóa học và
tác dụng dược lý của Sâm VN của các nhà khoa học Việt Nam với sự hợp tác với các
nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc và Ba Lan. Thành phần hóa học chủ yếu và quan
trọng nhất của các loài thuộc chi Panax là saponin hay còn gọi là ginsenosid (ginseng
saponin). Qua những nghiên cứu bước đầu của Nguyễn Thới Nhâm [80] và những
nghiên cứu sau này của Nguyễn Minh Đức, Trần Công Luận [59],[68] và Trần Lê
2
Quan [113],[112] đã xác định saponin là thành phần hóa học chính với 52 saponin và 8
polyacetylen được phân lập từ thân rễ và rễ củ của Sâm VN. Bên cạnh đó, Võ Duy
Huấn đã phân lập một số saponin từ lá Sâm VN, trong đó có 8 ginsenosid mới [115].
Saponin có aglycon thuộc khung PPD và PPT, thành phần saponin chính có trong các
loài thuộc chi Panax khác, hiện diện trong Sâm VN với hàm lượng cao hơn, đồng thời
saponin có aglycon thuộc khung OCT có trong Sâm VN với hàm lượng rất cao mà
không có hoặc với hàm lượng thấp trong các loài thuộc chi Panax khác. Sự khác biệt
này tạo nên sự khác biệt về tác dụng sinh học cho Sâm VN và hứa hẹn rất nhiều tác
dụng mới cần được nghiên cứu. Do đó, việc phân tích thành phần hóa học của Sâm VN
rất cần thiết nhằm bổ sung dữ liệu về thành phần và hàm lượng các saponin có trong
Sâm VN.
Trong một nghiên cứu gần đây, thành phần hóa học saponin của Sâm VN chế biến
bằng nhiệt (heating processing) đã được khảo sát. Quá trình chế biến Sâm VN tương tự
theo cách của Hồng sâm cho thấy có sự thay đổi của thành phần ginsenosid, thành phần
ginsenosid kém phân cực được gia tăng hoặc mới hình thành trong khi các thành phần
ginsenosid phân cực bị thay đổi trong quá trình chế biến [45].
Mục đích nghiên cứu dạng Sâm VN chế biến nhằm tạo ra một sản phẩm có chất lượng
điều trị tốt và gia tăng giá trị sử dụng cho Sâm VN. Chính vì vậy, việc nghiên cứu
thành phần hóa học và tác dụng của Sâm VN chế biến là cần thiết. Với những lý do
trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý của Sâm VN chế
biến” được thực hiện với các mục tiêu sau:
1. Phân tích, phân lập và xác định thành phần hóa học saponin trong Sâm VN.
2. Phân lập và xác định cấu trúc thành phần saponin trong Sâm VN chế biến và khảo
sát sự thay đổi thành phần hóa học saponin qua quá trình chế biến Sâm VN.
3. Khảo sát tác dụng sinh học của Sâm VN chế biến và các thành phần saponin trong
Sâm VN:
+ Khảo sát sự thay đổi tác dụng kháng phân bào và chống oxy hóa của Sâm VN do
quá trình chế biến.
+ Khảo sát tác dụng kháng viêm của các saponin có aglycon thuộc khung OCT.
3
đồng với nhóm II. Chính vì vậy, P. pseudoginseng Wall. được xem là loài chuyển
tiếp tiến hóa giữa hai nhóm [147].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Panax trên thế giới
J. Wen & Zimmer (1996) C. Lee & J.Wen Catalogue of Life The Plant list
STT
[129] (2004) [24] [151] [150]
1 P. ginseng C. A. Meyer P. ginseng P. ginseng P. ginseng
2 P. japonicus C. A. Meyer P. japonicus P. japonicus P. japonicus
3 P. notoginseng (Burkill) F. P. notoginseng P. notoginseng P. notoginseng
H. Chen ex C. Chow & W.
G. Huang
4 P. pseudoginseng Wallich P. pseudoginseng P. pseudoginseng P. pseudoginseng
5 P. quinquefolius L. P. quinquefolius P. quinquefolius P. quinquefolius
6 P. stipuleanatus H. T. Tsai et P. stipuleanatus P. stipuleanatus P. stipuleanatus
K. M. Feng
7 P. zingiberensis C.Y. Wu et P. zingiberensis P. zingiberensis P. zingiberensis
K .M. Feng
8 P. wangianus S.C.Sun. P. wangianus P. wangianus P. wangianus
9 P. trifolius L. P. trifolius P. trifolius P. trifolius
10 P. vietnamensis Ha et P. vietnamensis P. vietnamensis
Grushv.
11 P. bipinnatifidus P. bipinnatifidus
Seem
12 P. bipinnatifidus Seem. P. bipinnatifidus P. bipinnatifidus
var. angustifolius Seem. var. Seem. var.
(Burkill) J. Wen Angustifolius angustifolius
13 P. variabilis J. Wen P. bipinnatifidus
var.bipinnatifudus
14 P. assamicus R.N. P. assamicus
Banerjee
15 P. sinensis J. Wen P. sinensis P. sokpayensis Shiva P. sokpayensis
K. Sharma et Pandit
16 P. omeiensis J. Wen P. omeiensis
17 P. major Ting P. major
18 P. elegantior (Burkill)
J. Wen
19 P. shangianus J. Wen
(*) Ghi chú: P. japonicus được Flora of China chia thành 4 thứ (var.) bao gồm var. japonicus (T.Nees)
C. A. Meyer; var. angustifolius (Burkill) C. C. Cheng & Chu; var. major (Burkill) C. Y. Wu & Feng;
var. bipinnatifidus (Seemann) C. Y. Wu & K. M. Feng. P. bipinnatifidus Seem được Catalog of Life
[151] chia thành 2 thứ gồm P. bipinnatifidus var. angustifolius và P. bipinnatifidus var. bipinnatifudus.
Tuy nhiên Yang (1981) cho rằng P. ginseng và P. quinquefolius không thể được xem là
loài nguyên thủy nhất của chi Panax, do bởi NST của chúng là đa bội (tứ bội) (2n = 48
hoặc 44). Yang đề nghị P. japonicus là loài nguyên thủy nhất của chi bởi vì bộ nhiễm
sắc thể lưỡng bội (diploid, 2n=24) và phân bố địa lý khá rộng dù P. notoginseng và P.
5
Hình 1.1. Cấu trúc của gen trnK. “Nguồn: Zhu, 2003”
Trình tự gen 18S rRNA có độ dài 1808-1809 bps, chỉ có 9 loại trình tự gen 18S rRNA
đã được quan sát ở trong 13 taxa. Phân tích mối liên hệ họ hàng của dữ liệu kết hợp
trình tự gen trnK-18S rRNA cung cấp thông tin để giải quyết vấn đề phát sinh loài giữa
các loài thuộc chi Panax trong 3 nhánh chính. P. pseudoginseng và P. stipuleanatus có
mối quan hệ họ hàng gần gũi với nhau [147]. Dựa vào trình tự trực tiếp của gen trnK và
gen 18S rRNA của 53 mẫu thuộc 13 Panax taxa, cho thấy trình tự của trnK cũng như
trình tự đoạn gen matK có nhiều khả năng trong giải quyết vấn đề phát sinh loài và
phân loại thực vật trong chi này (Hình 1.2) [146]. Kết hợp dữ liệu của trình tự gen
trnK-18S rRNA cung cấp thêm thông tin cho việc phân loại chính xác hơn là tách biệt
dữ liệu [146].
6
Hình 1.2. Câyphát sinh loài dựa trên kết hợp dữ liệu gen trnK và trình tự gen 18S rRNA
Chú thích: PPH: P. pseudoginseng subsp. Himalaicus “Nguồn: Komatsu, 2001” [41]
Năm 2002, Zou và CS đã công bố thành phần hóa học của P. japonicus var major (tên
địa phương là Ye-sanchi) thu thập tại tỉnh Vân Nam, Trung Quốc [148],[149]. Tuy
nhiên, thành phần hóa học của loài này hoàn toàn khác biệt với P. japonicus đã được
công bố trước đây [63],[64].
Năm 2003, Zhu và CS (đồng tác giả với 2 bài báo trên) báo cáo một thứ mới với tên
P. vietnamensis Ha & Grushv. var. fuscidiscus K.Komatsu, S. Zhu & S.Q. Cai (Ye-
sanchi, Dã tam thất) được tìm thấy ở tỉnh Vân Nam, Trung Quốc. Tác giả cũng khẳng
định trình tự của gen 18S rRNA và trnK của loài này có tương đồng với Sâm VN (P.
vietnamensis Ha et Grushv.) và khác với những mẫu P. japonicus thu thập tại Nhật Bản
[146]. Đây chính là loài đã được công bố trong nghiên cứu hóa học bởi Zou và CS
(2002) với tên P. japonicus do sự nhầm lẫn về mặt hình thái thực vật.
Dã tam thất và Sâm VN có cùng trình tự tại các nucleotid ở vị trí 357, 396, 606, 1205
và 1416 nhưng khác nhau ở vị trí 104 và 1043 [147]. Điều này cho thấy P.
vietnamensis var. fuscidiscus có mối quan hệ gần gũi với P. vietnamensis ở đặc điểm
thực vật và bằng chứng phân tử và được xác định là một thứ của P. vietnamensis.
Năm 2014, Phan Kế Long và CS cũng đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền của hai loài
Panax tại Lai Châu là P. vietnamensis var. fuscidiscus và P. stipuleanatus so với Sâm
VN (P. vietnamensis) trên cơ sở trình tự nucleotid vùng matK và ITS-rDNA [6].
Năm 2016, Nông Văn Duy và CS công bố thứ mới của Sâm VN tại núi Langbiang,
7
Lâm Đồng ở độ cao 1800-1900 m. Dựa vào trình tự ITS1-5.8S-ITS2, thứ này khác với
Dã tam thất (P. vietnamensis var. fuscidiscus) ở 8 vị trí 217, 384, 465, 532, 562, 589,
590, 598 và khác với P. vietnamensis ở 5 vị trí 384, 465, 554, 590, 598 [82].
Trình tự hoàn chỉnh của genome lục lạp của P. vietnamensis (Ngân hàng gen số
KP036471) đã được xác định. Genome lục lạp của P. vietnamensis cho thấy 99,1%;
99,2% và 99,1% tương tự ở mức độ trình tự nucleotid lần lượt với các loài thuộc chi
Panax như P. ginseng, P. quinquefolius và P. notoginseng. Tương tự với các nghiên
cứu trước đây, dựa vào cây phát sinh loài cho thấy P. vietnamensis có liên quan gần gũi
với P. notoginseng hơn P. ginseng và P. quinquefolius [24],[146],[147].
1.1.3. Phân bố các loài thuộc chi Panax
Hầu hết các loài thuộc chi Panax hoang dã được tìm thấy ở Himalaya và Trung Quốc.
Trước đây, phía Nam tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và các tỉnh phía Bắc Việt Nam ở
gần biên giới Trung Quốc - Việt Nam thuộc vào vĩ độ 23o Bắc vốn được xem là giới
hạn phân bố của các loài thuộc chi Panax Châu Á. Tuy nhiên, Sâm VN lại tìm được ở
vĩ tuyến 15o Bắc, xa hơn về phía Nam so với giới hạn dự đoán trước đây của các loài
thuộc chi Panax (Bảng 1.2.).
Bảng 1.2. Phân bố một số loài Panax trên thế giới
STT Loài Tên thông dụng Phân bố
1. P. ginseng Nhân sâm Mọc hoang (hiếm) và trồng trọt rộng rãi tại
(Korean ginseng) Đông Bắc Á (Hàn Quốc, Triều Tiên, Trung
Quốc)
2. P. japonicus Sâm Nhật Mọc hoang và trồng tại Nhật Bản và phía Nam
(Japanese ginseng) Trung Quốc
3. P. notoginseng Tam thất Vân Nam, Trung Quốc
(Sanchi ginseng)
4. P. pseudoginseng San-qi Nepal và Đông Himalayas
5. P. quinquefolius Sâm Mỹ Mọc hoang và trồng tại Bắc Mỹ từ Mine đến
(American ginseng) Minnesota, Nam Florida, Tây Oklahoma và
Nam Canada.
6. P. stipuleanatus Tam thất hoang Mọc hoang ở phía Bắc Việt Nam.
Cho đến nay ở Việt Nam có 4 loài thuộc chi Panax đã được công bố: P. bipinnatifidus
Seem (Sâm vũ diệp); P. notoginseng (Tam thất): loài di thực trồng ở phía Bắc VN; P.
stipuleanatus (Tam thất hoang) và P. vietnamensis (Sâm VN) [7]. Hai thứ của Sâm VN
còn được phát hiện ở Vân Nam (Trung Quốc) và Lai Châu (Việt Nam) [6] (P.
vietnamensis var. fuscidiscus) và ở vùng núi Langbiang, cao nguyên Lâm Viên, Lâm
Đồng (P. vietnamensis var. langbianensis) [82].
1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX
Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Panax có thể phân thành 4 nhóm chính:
Saponin, polyacetylen, polysaccharid và flavonoid [22].
1.2.1. Saponin
Các nhà khoa học Nga lần đầu nghiên cứu saponin trong Panax ginseng và phân lập
các hợp chất có gắn đường đặt tên là panaxoside A, B (1962) và panaxoside C-F
(1964). Cùng lúc nhóm nghiên cứu của GS Shibata (Nhật Bản) đã phân lập và mô tả
các saponin tương tự và đặt tên là ginsenosid và thuật ngữ này được chấp nhận và dung
rộng rãi cho đến nay [22]. Cho đến nay, có khoảng hơn 300 saponin đã được phân lập
từ các loài thuộc chi Panax. Những nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác
dụng sinh học, tác dụng dược lý của các loài thuộc chi Panax cho thấy rằng thành phần
saponin triterpenoid trong đó chủ yếu các ginsenosid đóng vai trò quan trọng đối với
các tác dụng liên quan được công bố [135].
PPD PPT
Hình 1.3. Khung cơ bản của các saponin và phần đường phổ biến của các saponin
thuộc chi Panax
1.2.1.2. Phân bố của saponin chính trong các loài thuộc chi Panax
Các ginsenosid được phân bố trong các bộ phận khác nhau của các loài thuộc chi
Panax, từ rễ củ, thân rễ cho đến lá, hoa, hạt. Tùy vào các loài khác nhau, việc phân bố
các loại ginsenosid cũng như hàm lượng của chúng trong các bộ phận này cũng tương
10
trọng lượng phân tử thay đổi từ 20.000 đến khoảng 1.900.000 Da đã được báo cáo
trong rễ, thân và lá của các loài thuộc chi Panax khác nhau. Một số polysaccharid đã
được phân lập như sanchinan A (1.500.000 Da), hetero-polysaccharid PN (1.900.000
Da), ginsenan PA (160.000 Da), ginsenan PB (55.000 Da) đã được phân lập từ các bộ
phận khác nhau như rễ củ, thân, lá của các loài Panax [22].
Đặc biệt các peptidoglycan phân tử lượng cao được đặt tên là panaxan A-U có khối
lượng phân tử từ 10.000 - 1.800.000 Da gồm các đơn vị D-glucopyranose liên kết
(1→6) với các nhánh liên kết vị trí 1→3 [22]. Cho đến nay có khoảng 35 hợp chất
polysaccharid đã được phân lập và xác định cấu trúc từ các bộ phận khác nhau của P.
ginseng [106].
Polyacetylen: Nhóm hợp chất hữu cơ với nối đôi và nối ba liên hợp. Thành phần
polyacetylen chính của một số loài Panax là panaxynol (falcarinol) và falcarintriol
(panaxytriol). Panaxynol (heptadeca-1,9-diene-4,6-diyne-3-ol) là cấu trúc polyacetylen
lần đầu được phân lập từ P. ginseng bởi Takahashi và CS [109].
Flavonoid: Bên cạnh nhóm hợp chất liệt kê trên, một vài flavonoid đã được phân lập
và định danh từ các loài thuộc chi Panax. Kaempferol, trifolin và panasenosid đã được
phân lập từ P. ginseng. Quercetin-3-O-sophorosid được phân lập từ lá của P.
notoginseng. Kaempferol-3,7-dirhamnosid và kaempferol-3-gluco-7-rhamnosid cũng
được phân lập từ P. trifolium [98].
Tinh dầu: Thành phần chính của tinh dầu trong các loài thuộc chi Panax thuộc nhóm
sesquiterpen hydrocarbon (β-panasinsen, α-panasinsen, α-neocloven,
bicyclogermacren, β-farnesen, aromadendren và (E)-caryophyllen) và sesquiterpen
alcol (spathulenol, ginsenol, panasinsenol A và panasinsenol B). Tinh dầu của các loài
Panax khác nhau chủ yếu ở thành phần sesquiterpen hydrocarbon và các monoterpen.
Hàm lượng của các thành phần như α-cadinol, α-bisabolol, thujopsen và acid n-
hexadecanoic tăng lên đáng kể với độ tuổi của sâm [21].
Hàm lượng và thành phần tinh dầu của 4 loài Panax gồm P. notoginseng, P.
stipulenatus, P. japonicus và P. vietnamensis cũng đã được phân tích bằng LC/MS. Kết
quả cho thấy 1,2,4-trimethyl-benzen, octanal, acid nonanoic, 2-methyl-naphthalen, 1,7-
dimethylnaphthalene, acid lauric, heneicosan, acid phthalic diisobutyl ester, methyl
hexadecanoat, falcarinol, octadecanoic acid-methyl ester và erucylamid là thành phần
chính của 4 loài Panax này [131].
13
1.3. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC TỪ CÁC DẠNG
CHẾ BIẾN KHÁC NHAU CỦA CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX
1.3.1. Phương pháp chế biến Nhân sâm
Phương pháp chế biến truyền thống
Bên cạnh dạng dùng phổ biến là Sâm tươi, Nhân sâm chủ yếu được chế biến thành các
dạng phổ biến như Bạch sâm và Hồng sâm.
Bạch sâm: Nhân sâm được phơi sấy khô thông thường, có hay không tẩm đường.
Hồng sâm: Nhân sâm ở dạng khô hay tươi được hấp ở nhiệt độ cao 98-105 ℃ trong
thời gian khác nhau (50-90 phút hay 2-3 giờ). Nhân sâm sau khi hấp được phơi sấy.
Việc chế biến này trước đây nhằm mục đích tăng thời gian bản quản cho Nhân sâm vì
sau khi hấp và sấy khô, tinh bột trong củ sâm bị hồ hóa, làm tăng thể chất rắn chắc,
giúp bảo quản lâu dài hơn.
Phương pháp chế biến mới
Các phương pháp chế biến mới Nhân sâm nhằm mục đích thay đổi thành phần hóa học
hướng đến sự thay đổi/ gia tăng tác dụng sinh học. Điều kiện chế biến được thay đổi
các tác nhân vật lý và tác nhân hóa học.
Tác nhân vật lý: Thường là thay đổi nhiệt độ hoặc áp suất khi chế biến. Các tác giả
nghiên cứu thay đổi nhiệt độ chế biến từ 110-180 ℃ từ 0,5-20 giờ [33]. Với phương
pháp chế biến này, hàm lượng G-Rg3 và G-Rg5 tăng lên đáng kể.
Phương pháp chế biến thay đổi bằng tăng lượng khí O2 (50%) nhằm tăng tốc độ phản
ứng (browning reaction) và có thể giảm thời gian chế biến. Với phương pháp chế biến
này cho thấy tác dụng chống oxy hóa tăng lên đáng kể.
Một trong hai dạng chế biến theo phương pháp trên gần đây đã được nghiên cứu và
thương mại hóa sản phẩm là “Sun ginseng” và “Black ginseng”.
Thái dương sâm (Sun ginseng): Là dạng chế biến Nhân sâm ở nhiệt độ cao hơn 120
– 150 ℃ so với điều kiện chế biến Hồng sâm. Với dạng chế biến này, các thành phần
ginsenosid có trong Hồng sâm tăng lên nhiều lần, đồng thời tạo nên một số thành phần
ginsenosid mới với các tác dụng được tăng cường [39],[89].
Hắc sâm (Black ginseng): đây là dạng chế biến mới bằng cách hấp và sấy Nhân sâm
9 lần. Quy trình hấp và sấy 9 lần ở nhiệt độ từ 88-96 ℃ trong khoảng 2,5-4 giờ [103].
Cách chế biến này mang lại cho Nhân sâm có màu đen đồng thời thành phần hóa học
14
1.3.2. Sự thay đổi thành phần hóa học qua quá trình chế biến
1.3.2.1. Sự thay đổi thành phần ginsenosid
Quá trình chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ cao đã làm biến đổi các ginsenosid trong
Nhân sâm cũng như của các loài thuộc chi Panax khác. Ở dạng chưa chế biến, thành
phần hóa học ginsenosid của Nhân sâm chủ yếu là các ginsenosid phân cực có aglycon
thuộc khung PPD như G-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd và PPT như G-Re, -Rg1 và -Rg2. Ở dạng
Sâm chế biến như Hồng sâm, Thái dương sâm hay Hắc sâm, các thành phần ginsenosid
phân cực này được chuyển hóa thành các ginsenosid kém phân cực hơn.
Quá trình hình thành các ginsenosid thông qua việc cắt đường ở vị trí C-20, C-3 hay C-
6 (khó hơn) và khử nước tại vị trí C-20 của –OH tự do để hình thành nên các
ginsenosid kém phân cực (Hình 1.4.)
15
R2O HO
OH OH
20 20
12 12
3 3
6 6
R1O R1 O
R3 R3
R1 R2 R3 R1 R3
G-Rb1 -Glc-Glc -Glc-Glc H 20(S,R) G-Rg3 -Glc-Glc H
G-Rb2 -Glc-Glc -Glc-Ara(p) H G-Rs3 -Glc-Glc-Ac H
G-Rc -Glc-Glc -Glc-Ara(f) H 20(S,R) G-Rh1 H -OGlc
G-Rd -Glc-Glc -Glc H 20(S,R) G-Rg2 H -OGlc-Rha
G-Rg1 H -Glc -OGlc
G-Re H -Glc -OGlc-Rha
OH OH
20 20
12 Khử nước ở vị trí C-20 12
3 3
6 6
R1 O R1O
R3 R3
R1 R3 R1 R3
DHPPD II H H DHPPD I H H
G-Rk1 -Glc-Glc H G-Rg5 -Glc-Glc H
G-Rk2 -Glc H G-Rh3 -Glc H
G-Rs5 -Glc-Glc-Ac H G-Rs4 H -OGlc-Rha
DHPPT II H OH DHPPT II H - OH
G-Rg6 H -OGlc-Rha G-F4 H -OGlc-Rha
G-Rs7 H -OGc-Ac G-Rh4 H -OGlc
G-Rk3 H -OGlc G-Rs6 H -OGlc-Ac
Hình 1.4. Sự hình thành các ginsenosid trong quá trình chế biến (hấp).
Với các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD, các ginsenosid mới được hình
thành như 20(S) và 20(R) G-Rg3, -Rg5, -Rg6, -Rk1, -Rs1, -Rs7...
Các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT mới được hình thành hoặc gia tăng
hàm lượng như như: 20(S) và 20(R) Rg2, và -Rk3, 20(S) và 20(R) G-Rh1, -Rh2, -Rh4...
Một lượng rất nhỏ G-Rh2 hiện diện cho thấy việc khử đường ở vị trí C-3 tương đối khó
trong quá trình chế biến. G-Rg3 là một trong những thành phần phát sinh (artefact)
quan trọng nhất của Hồng sâm và các sản phẩm Nhân sâm chế biến khác. Để tiêu
chuẩn hóa cho các chế phẩm chế biến như Hồng sâm, bên cạnh hai ginsenosid đại diện
cho nhóm PPD và PPT là G-Rb1 và -Rg1, người ta cũng thường dùng G-Rg3 làm tiêu
chuẩn.
16
Các malonyl ginsenosid Rb1, -Rb2, -Rc và -Rd là thành phần đặc trưng cho Sâm tươi
hay Bạch sâm. Các malonyl ginsenosid này kém bền ở nhiệt độ cao, do vậy qua quá
trình gia nhiệt khi hấp, các ginsenosid có gắn các malonyl ở vị trí C-6″ đường glucose
sẽ phóng thích nhóm malonyl và tiếp tục cắt một phần đường ở vị trí C-20 để tạo thành
các ginsenosid thứ sinh như G-Rh1, -Rg3 và -Rh2.
Bên cạnh P. ginseng, các loài thuộc chi Panax khác cũng đã được nghiên cứu chế biến
tương tự. Qua quá trình chế biến, các ginsenosid PPD và PPT phân cực bị cắt đường
hoặc khử nước để chuyển thành các ginsenosid PPD và PPT kém phân cực và có thời
gian lưu lâu hơn trên sắc ký đồ HPLC.
Cấu trúc các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến [98] được trình bày
trong Bảng 1.4.
OH
R
12 HO
a b
HO
OOH
e
3 HO OH
6
R1O c d
R2
Bảng 1.4. Các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến P. ginseng
STT Saponin Khung R1 R2 CTPT Nguồn
Aglycon là PPD
1 20(S)-Ginsenosid Rg3 (a) -Glc2-Glc -H C42H72O13 P. ginseng
2 20(R)-Ginsenosid Rg3 (a) -Glc2-Glc -H C42H72O13 P. ginseng
2 6
3 Ginsenosid Rs3 (a) -Glc -Glc -Ac -H C44H74O14 P. ginseng
4 Ginsenosid Rh2 (a) -Glc -H C36H62O8 P. ginseng
Aglycon là Dehydro PPD I (c) -H -H C30H50O2 P. ginseng
5 Ginsenosid Rh3 (c) -Glc -H C36H60O7 P. ginseng
6 Ginsenosid Rs4 (c) -Glc2-Glc6-Ac -H C44H72O13 P. ginseng
7 Ginsenosid Rg5 (c) -Glc2-Glc -H C42H70O12 P. ginseng
Aglycon là Dehydro PPD II (b) -H -H C30H50O2 P. ginseng
2
8 Ginsenosid Rk1 (b) -Glc -Glc -H C42H70O12 P. ginseng
9 Ginsenosid Rk2 (b) -Glc2-Glc -H C36H60O7 P. ginseng
2 6
10 Ginsenosid Rs5 (c) -Glc -Glc -Ac -H C44H72O13 P. ginseng
Aglycon là PPT
11 20(S)-Ginsenosid Rh1 (a) -H -Glc C36H62O9 P. ginseng
12 20(R)-Ginsenosid Rh1 (a) -H -Glc C36H62O9
13 20(S)-Ginsenosid Rg2 (a) -H -Glc2-Rha C42H72O13 P. ginseng
14 20(R)- Ginsenosid Rg2 (a) -H -Glc2-Rha C42H72O13 P. ginseng
15 Ginsenosid SL1 (d) -H -Glc C36H62O11 Lá, P. ginseng
16 Ginsenosid ST2 (e) -H -Glc C36H62O10 Lá, P. ginseng
17
chính) và Hồng sâm là 4,7% (rễ con) và 7,5% (rễ chính). Sự gia tăng hàm lượng này là
do sự thoái giáng của các thành phần đường trong quá trình chế biến bằng cách hấp và
sấy Sâm tươi [50]. Polysaccharid trong Sâm có rất nhiều tác dụng như điều hòa hệ
miễn dịch, chống mệt mỏi (anti-fatigue), kháng khối u (antitumor), chống kết tập tiểu
cầu, chống oxy hóa, chống loét (antiulcer), chống bức xạ, bảo vệ gan, hạ đường huyết
và hoạt tính hạ lipid [105],[106],[122],[124].
Thành phần polyacetylen
Thành phần polyacetylen chủ yếu của P. ginseng là panaxynol và panaxydol. Trong
quá trình chế biến, panaxydol bị chuyển thành panaxytriol do hydrat hóa ở vòng epoxy
do nhiệt hoặc acid. Đây cũng là thành phần polyacetylen đặc trưng của P. ginseng chế
biến.
1.3.3. Sự thay đổi tác dụng sinh học của các loài thuộc chi Panax và các
thành phần ginsenosid sau chế biến
Sự thay đổi thành phần hóa học sau chế biến, đặc biệt là thành phần saponin đã làm
thay đổi hoạt tính sinh học của Hồng sâm và các dạng chế biến của các loài thuộc chi
Panax. Đa số các tác dụng sinh học như tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng tế bào
ung thư, tác dụng bảo vệ gan,… đều tăng lên so với dạng chưa chế biến là Bạch sâm.
Tỉ lệ hấp thu qua màng tế bào của các ginsenosid trên tế bào ung thư có thể giảm với sự
gia tăng số lượng phân tử đường, do giảm tính kỵ nước [20].
Cấu trúc ginsenosid thuộc khung PPD và PPT khác nhau ở vị trí gắn đường. Vị trí
nhóm thế ở C-6 làm nên sự khác nhau về cấu trúc của PPD và PPT. Sự khác nhau ở vị
trí liên kết phân tử đường cũng có thể ảnh hưởng đến đáp ứng hoạt tính sinh học. G-
Rh2 (PPD) và G-Rh1 (PPT) có cấu trúc tương tự nhau, khác nhau ở vị trí gắn đường
glucose vào vị trí C-3 và C-6. Tác dụng của G-Rh2 còn được tìm thấy có tác dụng
tương tự với 20(S)-PPD và 20(S)-PPT, trong khi tác dụng của 20(S) G-Rh1 thấp hơn 10
lần. Điều này cho thấy rằng vị trí gắn đường tại C-3 hoặc C-6 luôn đóng vai trò quan
trọng trong tác dụng kháng ung thư của ginsenosid [92],[127].
Với phân tử đường ở vị trí C-6, hoạt tính kháng ung thư sẽ giảm so với liên kết đường
ở C-3 hoặc C-20. Những thí nghiệm với mô hình phân tử và docking xác nhận rằng sự
hiện diện của phân tử đường ở vị trí C-6 gia tăng sự cản trở phân tử trong không gian
vào liên kết tế bào ngoại bào nên làm giảm hoạt tính kháng ung thư đáng kể.
Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549
(non-small cell lung cancer, NSCLC) của Nhân sâm
Các nghiên cứu Nhân sâm với tế bào ung thư phổi A549
Nhân sâm và ginsenosid đã được nghiên cứu rất nhiều với tác dụng kháng phân bào của
các dòng tế bào ung thư. Các ginsenosid được phân lập từ Nhân sâm hoặc sâm chế biến
như G-Rh2, -Rg3, 25-OCH3-PPD, 20(S)-PPD,…thể hiện tác dụng kháng phân bào trên
dòng tế bào A549 thông qua nhiều cơ chế khác nhau như G-Rh2 tăng biểu hiện của p53
và giảm biểu hiện của Bcl-2 [142] hay thay đổi miRNA [15], [125] hoặc tăng cường
quá trình chết tế bào thông qua giảm biểu hiện của con đường truyền tín hiệu PI3K/Akt
ở dòng tế bào A549. 20(S)-PPD hứa hẹn là tác nhân trị liệu ung thư phổi được phân lập
từ P. quinquefolius [36],[141].
sạch tổ chức viêm, phản ứng viêm giảm, tế bào sợi được hoạt hóa để thành lập collagen
tạo thành sẹo làm lành vết thương [96].
Trong một số trường hợp viêm mạn tính kéo dài, các vị trí viêm không lành, có thể xuất
hiện thêm các tổn thương thứ phát do sản xuất các enzym tiêu đạm (do vi khuẩn gây
viêm tiết ra), necrosin, các gốc tự do (do các tế bào viêm tiết ra) gây các rối loạn, có thể
dẫn đến bệnh lý [96].
Vai trò của đại thực bào trong phản ứng viêm: Chức năng chính của các tế bào miễn
dịch bẩm sinh là phát hiện và nhận diện các chất lạ/ chất gây hại thúc đẩy phản ứng
phòng vệ. Các đại thực bào (macrophage) tham gia tích cực vào tất cả các giai đoạn của
quá trình viêm. Đại thực bào là những tế bào bạch cầu, phân nhóm thực bào, có vai trò
quan trọng trong hệ miễn dịch không đặc hiệu cũng như hệ miễn dịch đặc hiệu ở động
vật có xương sống với vai trò chính là thực bào các thành phần cặn bã của tế bào và các
tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, chúng còn đóng vai trò các tế bào trình diện kháng
nguyên, khởi động đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cơ thể. Do đó, đại thực bào liên
quan đến một số tình trạng bệnh lý miễn dịch.
Các đại thực bào tham gia vào quá trình hình thành u hạt (granuloma) hay các tổn
thương viêm do nhiều nguyên nhân khác nhau. Trong hội chứng đáp ứng viêm hệ
thống và trong nhiễm trùng huyết, đại thực bào giải phóng các cytokin gây viêm mạnh.
Các cytokin chính được phóng thích bởi đại thực bào gồm: interleukin-1 (IL-1), yếu tố
họai tử khối u TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12, IFN-γ, nitric oxid (NO) vàc các phân tử dính
kết tế bào dẫn đến làm tăng quá trình viêm. Do đó, việc kiểm soát sản xuất các chất này
có thể làm giảm khả năng viêm [10],[96].
Đại thực bào là tế bào có kích thước tương đối lớn và có khả năng đáp ứng nhanh với
các kích thích viêm tạo ra bởi lipopolysacharid (LPS). Ngoài ra, các thụ thể Toll- like
(TLR, Toll like receptor) ở đại thực bào được biểu hiện mạnh hơn so với các tế bào
bạch cầu khác nên nó thường được lựa chọn trong các mô hình sàng lọc và nghiên cứu
cơ chế kháng viêm in vitro. CD14 và moesin được biểu hiện trên màng tế bào đại thực
bào. Sự kích hoạt LPS gây ra phosphoryl hóa moesin, gắn kết lên thụ thể TLR4 và
MD-2 hoạt hóa MyD88. Sự truyền tín hiệu qua cơ chế này dẫn đến việc tạo ra các
cytokin tiền viêm (Zawawi và CS, 2010) [13].
TLR là một protein màng, có thể nhận dạng ra các phân tử có sẵn ở trên mầm bệnh.
Trong động vật có vú, họ thụ thể TLR bào gồm ít nhất 10 loại khác nhau. Chúng có
23
một vai trò cơ bản tới nhận dạng các phối tử có nguồn gốc từ mầm bệnh.
TLR2 có thể nhận dạng các lipoprotein các gốc đường có gắn lipid
(lipoarabinomannan, một loại glycolipid) từ thành tế bào của vi khuẩn và nấm.
TLR4 nhận dạng lipopolysaccharid (LPS) từ thành tế bào của vi khuẩn Gram âm.
TLR9 có thể nhận dạng deoxycytidylat-phosphat-deoxyguanylat (CpG) có trong
deoxyribonucleic acid (DNA) của vi khuẩn [13].
Một vi sinh vật có thể được nhận bởi rất nhiều TLR. Thực tế, tổ hợp của TLR có thể
tham gia vào các đáp ứng viêm do đại thực bào hoặc tế bào tua (dendritic cells) sinh ra
trong quá trình cơ thể bị nhiễm mầm bệnh. TLR bao gồm một đoạn nằm bên trong tế
bào được gọi là thụ thể Toll/IL-1 (TIR). Quá trình nhận dạng mầm bệnh của TLR2 sẽ
kích thích quá trình hoạt động của yếu tố hoạt động nhân tế bào là NF-B và sản xuất
ra các cytokin tiền viêm như TNF-α thông qua đoạn TIRAP và đoạn MyD88. Tuy
nhiên, quá trình nhận dạng của TLR4 lại kích thích hoạt động của NF-κB thông qua
TIRAP, MyD88 và kích thích hoạt động của đoạn phiên mã của interferon (IFN) giống
như quá trình sản xuất IFN kiểu 1. Do vậy trong số các thụ thể TL, TLR4 được nghiên
cứu nhiều nhất [13].
Hình 1.5. Nhận diện và truyền tín hiệu lipopolysacharid (LPS) trong đại thực bào
[10]. “Nguồn: Hasturk Hatice, 2012”
Các mô hình thử nghiệm phản ứng
Các nghiên cứu trước đây thường sử dụng mô hình gây viêm in vivo trên thực nghiệm
gây viêm ở chuột bằng các tác nhân gây viêm như:
Mô hình gây phù chân chuột bằng tác nhân gây viêm carrageenan, một loại
polysaccharid phân lập từ tảo đỏ để đánh giá mức độ phù chân chuột bằng dụng cụ
đo thể tích thích hợp. Hoặc gây viêm xoang bụng bằng cách tiêm carrageenan vào
bụng chuột. Lượng dịch viêm trong xoang bụng sẽ được thu lại và so sánh với đối
24
chứng về thể tích cũng như số lượng bạch cầu và protein trong dịch [96].
Gây viêm mạn bằng cách tiêm carrageenan vào phần cơ chuột để tạo khối u, đánh
giá khối lượng khô của khối u so với mẫu chứng [96].
Đánh giá khả năng gây phù trên tai chuột bằng một số tác nhân như croton oil, 12-
tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA), acid arachidonic (AA), ethyl phenylpropiolat
(EPP) bằng cách tiêm tác nhân gây viêm vào tai phải của chuột và đánh giá độ phù
dựa vào sự khác biệt của độ dày tai phải so với tai trái [96].
Mô hình gây tăng tính thấm thành mạch bằng cách tiêm vào cơ thể chuột chất chỉ thị
màu trộn với acid. Acid sẽ làm tăng tính thấm thành mạch làm cho chất chỉ thị màu
thấm vào nội tạng. Đo màu dịch nội tạng chuột để đánh giá mức độ gây viêm .
Hiện nay, mô hình gây viêm với tác nhân gây viêm mạnh như zymosan (phân lập từ
nấm) được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Đánh giá hàm lượng chất
trung gian tiết ra trong quá trình tiền viêm cũng như những yếu tố tham gia vào đường
truyền tín hiệu viêm như cytokin, chemokin tiền viêm (TNF-a; IL-6, IL-8) và kháng
viêm (IL-10), interferon, quá trình phospho hóa các yếu tố tự phân bào protein kinase
(MAPKs) hay phản ứng oxy hóa. Với mô hình in vivo này, tác dụng kháng viêm của
chất phân tích sẽ chính xác và chi tiết hơn ở mức độ phân tử [14].
Mô hình ex vivo sử dụng LPS: Chuột được tiêm natri thioglucolat 4%, thu đại thực
bào phúc mạc, nuôi cấy đại thực bào và xử lý với LPS. Đánh giá hoạt tính và cơ chế
kháng viêm thông qua các yếu tố tham gia vào đường truyền tín hiệu viêm [83].
Tác dụng kháng viêm của Hồng sâm và thành phần ginsenosid
Rất nhiều ginsenosid thể hiện biểu hiện của iNOS và COX-2 và ức chế sản sinh NO và
PGs ở đại thực bào cũng như ức chế yếu tố nhân kappa B hoặc điều hòa biểu hiện gen
của iNOS và COX-2. Các ginsenosid như G-Rh1, -Rh2 và 20(S)-PPT, chất chuyển hóa
của G-Rh1 hoặc G-Rg1 và chất K là chất chuyển hóa của G-Rb1, được báo cáo là ức chế
sản sinh NO, PGE2 và ức chế NF-B. Chất K cũng thể hiện sự ức chế biểu hiện của
NF-B và COX-2 ở chuột. Nhiều nghiên cứu cũng chứng minh các ginsenosid có tác
dụng ức chế sự biểu hiện của NF-B và COX-2 [87].
1.4. PHÂN TÍCH SAPONIN TRONG CÁC LOÀI THUỘC CHI PANAX
Việc chế biến sâm bằng phương pháp hấp (heating processing) làm thay đổi thành phần
hóa học của Sâm, đặc biệt là thành phần saponin. Các saponin mới hình thành sau chế
25
biến thường bị cắt mất một đến vài phân tử đường (deglycosylat) hoặc bị khử nước tạo
thành nối đôi (dehydrat) ở mạch nhánh C17 làm giảm độ phân cực của saponin. Chính
vì vậy, việc phân tích toàn bộ thành phần saponin trong sâm chế biến bao gồm cả
saponin phân cực và kém phân cực dẫn đến mức độ phức tạp cho các phương pháp
phân tích. Sau đây là một số phương pháp phân tích định tính và định lượng được dùng
trong phân tích saponin của sâm.
Định danh cấu trúc dựa vào thư viện phổ khối:
Thách thức trong xác định dấu vân tay chất chuyển hóa thực vật là xác định chất
chuyển hóa thứ cấp. Tuy nhiên, có rất nhiều thành phần không dễ dàng phân lập và các
chất đối chiếu không có sẵn trong phòng thí nghiệm. Kỹ thuật kết nối HPLC/MS giúp
định danh cấu trúc trực tiếp và nhanh chóng xác định các chất trong hỗn hợp cao chiết
phức tạp của dược liệu. Ứng dụng kỹ thuật IT-TOF-MS hoặc Q-TOF-MS là bước tiến
trong định danh các thành phần trực tiếp trong các mẫu sâm. Cơ chế phân mảnh và dự
đoán ion từ các tài liệu tham khảo là cần thiết cho việc sàng lọc các chất đã biết và
chưa biết trong cao chiết Nhân sâm. Kỹ thuật định danh cấu trúc online được sử dụng
26
ra khỏi bản mỏng, saponin sẽ được cho phản ứng với vanillin trong dung dịch
CH3COOH-HClO4, dung dịch được định lượng ở 560 nm với chuẩn đối chiếu là
panaxadiol. Phương pháp này cũng được ứng dụng trong định lượng saponin trong P.
ginseng để đánh giá tác động của sóng siêu âm trong việc tích lũy saponin [57].
Để định lượng các chất đánh dấu, cần có các ginsenosid có hàm lượng cao. Trong các
phương pháp định lượng, việc thiếu chất chuẩn cũng ảnh hưởng đến việc đánh giá các
sản phẩm sâm. Một số chuẩn ginsenosid được thương mại hóa, nhưng giá thành cao và
giới hạn cung cấp nên không thể đáp ứng nhu cầu trên toàn thế giới.
Hầu hết các chất trong dược liệu có khung cấu trúc tương tự nhau, các nhà nghiên cứu
đã phát triển phương pháp sử dụng một chất vạn năng để xây dựng đường chuẩn cho
các chất có cấu trúc tương tự nhau. Trong Nhân sâm, thành phần hóa học chính là các
saponin cấu trúc dammaran thuộc nhóm PPD hay PPT. Một nghiên cứu sử dụng G-Rb1
và -Rg1 để xác định hàm lượng PPD và PPT ginsenosid. Bởi vì chất có hoạt tính chưa
được xác định, các phương pháp chung sử dụng một hay vài ginsenosid chính như G-
Rb1 hay -Rg1 như là chất đánh dấu hoặc chất có hoạt tính. Phương pháp này được gọi là
QAMS (quantitative analysis of multi-components with single marker) đã được thiết
lập và thẩm định để xác định đồng thời 9 ginsenosid gồm (G-Rb1, -Rc, -Rb2, -Rb3 –Rd,
-Re, -Rf, - Rg1 và -Rh1,) có trong P. ginseng và 4 ginsenosid (G-Rb1, -Rd, -Rg1 và -
Rh1,) trong P. notoginseng. Trong phương pháp này, một ginsenosid sẽ được dùng làm
chất chuẩn để định lượng cho các ginsenosid còn lại dựa vào hệ số RCF (relative
correction factors) của các ginsenosid còn lại so với chuẩn. Phương pháp này được tiến
hành với hệ thống HPLC đầu dò PDA, trong khoảng tuyến tính, hệ số RCF của G-Rb1
với G-Rg1, -Re, -Rf, -Rh1, -Rc, -Rb2, -Rb3 và -Rd lần lượt là 1,400; 1,215; 1,517;
1,801; 0,944; 1,012, 1,143 và 1,135. Hệ số RCF có độ lặp lại tốt với hệ thống sắc ký
khác nhau, hay cột khác nhau với %RSD 0,30% - 3,90% [144].
Phương pháp này cũng đang được nghiên cứu rộng rãi và thông thường, một đến hai
chuẩn sẽ được chọn để định lượng cho các ginsenosid. Một lựa chọn hợp lý hơn là sử
dụng ginsenosid có cấu trúc đại diện ví dụ như G-Rb1 cho các ginsenosid có aglycon
thuộc khung PPD và Rg1 cho ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT. Đầu dò ELSD
cũng được nghiên cứu sử dụng trong phương pháp này [49].
Tổng hợp một số phương pháp chiết xuất và phân tích được ứng dụng trong nghiên cứu
phân tích các ginsenosid trong một số loài phổ biến thuộc chi Panax được thể hiện
trong Phụ lục 1.
1.4.3. Kiểm nghiệm sâm theo các chuyên luận dược điển
Trong chuyên luận phân tích các loài sâm của dược điển các nước như Mỹ (USP 38-
NF33), Hàn quốc (KP), Anh (BP 2016), Nhật (JP XIV) việc phân tích thường tập trung
29
vào các thành phần chính như G-Rb1, -Rd, -Rg1 mà không phân tích hàm lượng từng
thành phần saponin vì vấn đề phức tạp trong các chất chuẩn và vấn đề chi phí. Bảng
1.5 trình bày các chỉ tiêu phân tích sâm trong các chuyên luận Dược điển.
Bảng 1.5. Tóm tắt chỉ tiêu phân tích trong các chuyên luận Dược điển của các loài
Panax phổ biến
Đối tượng Dược điển Chỉ tiêu thông thường Định tính Định lượng Hàm lượng
Panax ginseng EP 8.0 Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử G-Rg1 + G-Rb1
tinh khiết, mất khối lượng ≥ 0,40%
SKLM HPLC
do làm khô, tro toàn phần,
tro không tan trong HCl.
USP 38- Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử G-Rg1 ≥ 0,20%
NF33 tinh khiết, mất khối lượng SKLM HPLC G-Rb1 ≥ 0,10%
do làm khô.
JP 17 Mô tả, soi bột, thử tinh Phản ứng hóa G-Rg1 ≥ 0,10%
khiết, mất khối lượng do học HPLC G-Rb1 ≥ 0,20%
làm khô, tro toàn phần. SKLM
CP 2015 Mô tả, vi phẫu, soi bột, dư G-Rg1 + G-Re
lượng thuốc trừ sâu, mất ≥0,30%
SKLM HPLC
khối lượng do làm khô, tro G-Rb1 ≥0,20%
toàn phần.
KR X Mô tả, vi phẫu, soi bột, thử Phản ứng hóa G-Rg1 ≥ 0,10%
tinh khiết, mất khối lượng học HPLC G-Rb1 ≥ 0,20%
do làm khô, tro toàn phần. SKLM
DĐVN IV Mô tả, vi phẫu, soi bột, , G-Rg1 + G-Re
Phản ứng hóa
mất khối lượng do làm khô, ≥ 0,30%
học HPLC
tro toàn phần, tro không tan G-Rb1 ≥0,20%
SKLM
trong acid.
Panax USP 38- Mô tả, vi phẫu, , soi bột, Saponin toàn
quinquefolius NF33 thử tinh khiết, mất khối SKLM HPLC phần ≥ 4%
lượng do làm khô G-Rb1 ≥ 0,20%
Panax CP 2015 Mô tả, soi bột, dư lượng Không ít hơn
Hàm lượng
notoginseng thuốc trừ sâu, mất khối 16% dược liệu
chất chiết
lượng do làm khô, tro toàn SKLM khô kiệt.
được
phần, tro không tan trong G-Rg1 + G-Rb1
HPLC
acid + N-R1 ≥ 5%
DĐVN IV Mô tả, vi phẫu, soi bột, , Phản ứng hóa Hàm lượng Không ít hơn
mất khối lượng do làm khô, học chất chiết 16% dược liệu
tro toàn phần. SKLM được khô kiệt.
Panax DĐVN IV Mô tả, vi phẫu, soi bột, ,
Phản ứng hóa
vietnamensis mất khối lượng do làm khô,
học
tro toàn phần, tỷ lệ vụn nát,
SKLM
tạp chất.
30
Gần đây, một số tác giả đề xuất việc phân tích nhóm dựa trên một số thành phần
ginsenosid cơ bản để đánh giá hàm lượng saponin từng thành phần cũng như sơ bộ hàm
lượng saponin toàn phần. Mặc dù đa số các chuyên luận Dược diển trên thế giới định
lượng dựa trên thành phần G-Rb1 và -Rg1, tuy nhiên hàm lượng hai thành phần này bị
giảm trong các dạng sâm chế biến. Do vậy, Kim và CS đề xuất phân tích thêm 2
ginsenosid 20(S) G-Rg3 và 20(R)-Rg3 vì đây là thành phần đặc trưng cho các dạng sâm
chế biến [34]. Hơn nữa, các sản phẩm Nhân sâm trên thị trường đa số được sử dụng
dưới dạng chế biến (processing), như vậy các ginsenosid phân cực hàm lượng giảm
đáng kể, trong khi thành phần ginsenosid kém phân cực tăng lên. Do vậy chỉ đánh giá
các G-Rd, -Rb1 và -Rg1 là không đủ và đôi khi lại không đúng cho dược liệu phân tích.
Thân: Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng, màu xanh hoặc tím nhạt, đường kính từ 5-8
mm, thân thường lụi tàn trong thời gian ngủ đông, đôi khi 2-3 thân mọc cùng lúc do
thân cũ không lụi tàn [8].
Lá: Lá đính vào thân, đa số mang 3-5 lá kép chân vịt mọc vòng, đôi khi có đến 6-7 lá.
Cuống lá dài 6-12 cm. Mỗi lá kép có 5 lá chét (đôi khi có 3, 6 hoặc 7 lá chét). Lá chét ở
giữa to nhất và hai lá gần sát cuống lá nhỏ nhất. Lá chét hình trứng ngược hoặc hình
mác, dài 6-15 cm, rộng 3-5 cm, gốc hình nêm, đầu thuôn dài thành mũi nhọn, mép khía
răng nhỏ. Tuy nhiên, ở sâm từ 1-2 tuổi thì chỉ có 1 lá với 3-5 lá chét [8].
Cụm hoa: Cây 3-4 tuổi bắt đầu ra hoa. Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, có
cuống dài, hoa nhiều màu, đài có 5 răng dài, nhị 5, chỉ nhị hình sợi, bầu thượng 1 ô.
Cụm hoa có đường kính khoảng 2,5-4 cm với 50-120 hoa. Cuống hoa mảnh, dài 1-1,5
cm. Hoa màu xanh lá nhạt, đường kính 3-4 mm, 5 lá đài [8].
Quả: Quả hạch, màu đỏ tươi, có một chấm đen ở đỉnh, dài 0,8 - 1 cm và rộng khoảng
0,5-0,6 cm, có 1-2 hạt hình thận, màu trắng hay vàng nhạt. Mùa hoa tháng 4-7, mùa
quả tháng 9-10 [8].
Thân rễ: Ở sâm mọc tự nhiên, bộ phận dưới mặt đất chủ yếu là thân rễ nạc, mọc bò
ngang, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30-40 cm, có thể hơn, đường kính 1-3,5
cm, có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt,
ruột trắng ngà, phần cuối là rễ củ hình con quay, hình cầu hay có dạng ngoài như củ
Nhân sâm [8].
Rễ củ: Ở sâm trồng bộ phận rễ củ phát triển hơn, từ một vị trí trên thân rễ có thể mọc ra
nhiều rễ củ, hình con quay, màu vàng nhạt [8].
Sâm VN sinh trưởng mạnh trong mùa xuân-hè, mùa hoa quả từ tháng 5 đến tháng 10.
Quả chín rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông khoảng 4 tháng sẽ nảy mầm đầu mùa
xuân năm sau. Phần thân trên mặt đất lụi tàn hàng năm, để lại vết sẹo rõ. Thường mỗi
năm, từ đầu mầm thân rễ (kể cả phần thân rễ phân nhánh) mọc lên một thân mang lá.
Dựa vào các vết sẹo ở thân rễ, người ta có thể tính được tuổi của các cây Sâm VN [2].
32
a b
Hình 1.6. Phần trên mặt đất (a) và phần dưới mặt đất (b) của Sâm VN
1.5.3. Phân bố, sinh thái
Sâm VN là loài đặc hữu của Việt Nam, sinh trưởng ở vùng núi Ngọc Linh thuộc hai
tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Đây cũng là giới hạn xa nhất về phía Nam của bản đồ
phân bố chi Panax trên thế giới cho đến nay [30].
Sâm VN mọc tự nhiên ở độ cao 1.500-2.200 m, chủ yếu tập trung ở 1.800-2.000 m,
vùng núi Ngọc Linh thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (Kon Tum) và Trà My
(Quảng Nam). Về giới hạn cũng như mức độ phân bố của loài sâm này ở núi Ngọc
Linh nay đã có nhiều thay đổi [3],[4].
Sâm VN là cây thảo đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác hay tập trung thành từng
đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, môi trường rừng luôn ẩm ướt,
thường xuyên có mây mù. Nhiệt độ trung bình từ 15-18 °C, lượng mưa xấp xỉ 3000
mm/năm. Đất rừng được tạo thành do lá cây mục lâu ngày, màu nâu đen, tơi xốp, hàm
lượng mùn cao [8].
Năm 2003, Zhu và CS đã mô tả loài P. vietnamensis var. fuscidiscus như là một thứ
mới của Sâm VN. Loài này lần đầu được tìm thấy ở huyện Cẩm Bình (Jinping) thuộc
phía nam của tỉnh Vân Nam (Yunnan), Trung Quốc. Ngoài ra, còn được tìm thấy ở hai
huyện Yuanyang và Lvchun. Gần đây, Phan Kế Long và CS công bố tìm thấy thứ này
tại vùng núi huyện Mường Tè và Sìn Hồ, tỉnh Lai Châu gần biên giới Trung Quốc, ở độ
cao trên 1.400-1.900 m [91].
Sâm VN tự nhiên đã bị khai thác ồ ạt và có đe dọa bị tuyệt chủng nếu không có biện
pháp bảo vệ. Hai tỉnh Quảng Nam và Kon Tum đã kiên trì đầu tư để duy trì bảo tồn
giống và đã có khoảng 200.000 cây Sâm VN ở các lứa tuổi khác nhau. Cây trồng bán
tự nhiên từ hạt dưới tán rừng, ở độ cao 1.800 m cho kết quả tốt, sau 3-4 năm bắt đầu
33
cho hạt giống tốt để gieo trồng. Đồng thời, cây Sâm VN cũng đã được di thực để trồng
ở các vùng núi khác nhau với độ cao thấp hơn cũng cho một số kết quả khả quan ở các
địa điểm di thực. Trong khi đó, nghiên cứu nhân giống in vitro Sâm VN vẫn chưa có
nhiều kết quả. Việc bảo vệ cây Sâm VN và nghiên cứu nhân trồng tại chỗ loài cây
thuốc đặc biệt quý hiếm này hiện vẫn là nhiệm vụ hàng đầu trong công tác bảo tồn cây
thuốc ở Việt Nam [8].
Hình 1.7. Các hợp chất polyacetylen phân lập từ phần dưới mặt đất của Sâm VN.
Pv1 = panaxynol, Pv2 = 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol, Pv3 = stereoisomer của Pv5, Pv4 = dẫn xuất của Pv5,
Pv5 = heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol, Pv6=heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol, Pv7=Heptadeca-1,8(E),
10(E)-trien-4,6-diyn-3,12-diol.
Bên cạnh đó, nhiều thành phần khác trong bộ Sâm VN đã được nghiên cứu và xác định
như thành phần acid amin, acid béo, thành phần nguyên tố đa vi lượng.
OH
R e
g
12
a c
b
3 d f h
R1O R2
R2
(A)
O
OH
21
HO
(C) (B) OR1 (E) (F)
(D)
Hình 1.8. Cấu trúc của saponin phân lập từ Sâm VN
Bảng 1.6. Các saponin được phân lập từ Sâm VN
Khối lượng Monoisotopic
STT Saponin Khung R1 R2 R3 CTPT Phân bố TLTK
phân tử mass
Aglycon là PPD
1. Ginsenosid F2 A-(a) -Glc -H -Glc C42H72O13 785,01 784,4973 Lá [115]
2. Ginsenosid Rb1 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-1Glc C54H92O23 1109,29 1108,6029 Thân rễ và rễ củ [72]
3. Ginsenosid Rb2 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-1Ara(p) C52H92O25 1079,27 1078,5924 Thân rễ và rễ củ [72]
4. Ginsenosid Rb3 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-1Xyl C53H90O22 1079,27 1078,5924 Lá, thân rễ và rễ củ [72],[115]
5. Ginsenosid Rc A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-1Ara(f) C53H90O22 1079,27 1078,5924 Thân rễ và rễ củ [71]
6. Ginsenosid Rd A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc C48H82O18 947,15 946,5501 Lá, thân rễ và rễ củ [72],[115]
Gypenosid IX
7. A-(a) -Glc -H -Glc6-1Xyl C47H80O17 917,13 916,5395 Lá, thân rễ và rễ củ [69],[115]
(Notoginsenosid Fd)
8. Gypenosid XVII A-(a) -Glc -H -Glc6-1Glc C48H82O18 947,16 946,5501 Thân rễ và rễ củ [71]
9. Pseudoginsenosid RC1 A-(a) -Glc2-1Glc6-Ac -H -Glc C50H84O19 989,19 988,5607 Thân rễ và rễ củ [72]
36
Bảng 1.7. Các tác dụng dược lý của Sâm VN đã nghiên cứu và công bố
trước và sau chế biến cho thấy sự khác nhau. Kết quả SKLM cho thấy có xuất hiện một
số vết mới trên SKĐ. Hơn nữa, độ đậm màu và kích thước các vết này tăng dần theo
thời gian hấp các mẫu sâm, chứng tỏ có sự thay đổi về thành phần saponin trong quá
trình chế biến. Kết quả HPLC sơ bộ cho thấy có sự giảm hàm lượng của các ginsenosid
phân cực như G-Rg1 và G-Rb1 và một pic mới khi phát hiện với đầu dò RI [75].
Tiếp theo, Sâm VN được tiến hành nghiên cứu chế biến ở nhiệt độ 105 ℃ trong những
khoảng thời gian khác nhau từ 2, 4, 6 và 8 giờ. Kết quả SKLM cho thấy trên SKĐ có
một số vết mới và cường độ vết này tăng dần theo thời gian chế biến. Kết quả
HPLC/PDA cũng cho thấy thành phần saponin trong Sâm VN có sự thay đổi trong suốt
quá trình hấp: hàm lượng các ginsenosid chính như G-Rb1, -Rd, -Rg1 giảm đáng kể,
thay vào đó là sự xuất hiện của các pic mới và thể hiện rõ nhất ở mẫu Sâm VN chế biến
trong 8 giờ. Kết quả nghiên cứu còn phân lập được hai đồng phân 20(R) và 20(S) G-
Rh1 với hiệu suất cao; cho thấy sự tăng hàm lượng này là kết quả của sự thay đổi thành
phần hóa học saponin qua quá trình chế biến [45].
Máy HPLC Alliance 2695 XE (Waters, Mỹ), đầu dò PDA 2996 (Waters, Mỹ).
Cột sắc ký: Cột cổ điển kích thước khác nhau.
44
Cột HPLC: SunfireTM C18 (250 × 4,6 mm; 5 m), tiền cột Sunfire C18 (12,5 × 4,6
mm; 5 µm); cột Phenomenex Germini C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) (Mỹ).
Cột UPLC: Waters Acquity BEH C18 (100 × 2,1 mm; 1,7 µm) (Mỹ).
Máy sắc ký lỏng trung bình MPLC Bio-rad (Mỹ)
Sắc ký lỏng bán điều chế Waters Pump 510 kết hợp đầu dò Waters 486 UV.
Cột điều chế: Phenomenex Gemini C18 (250 10 mm; 5 μm).
Máy sắc ký lỏng Perkin Elmer 200 (Waltham, MA, Mỹ) kết nối với đầu dò ELSD
(Alltech ELSD 2000, Alltech, Deerfield, IL, Mỹ) và ELSD (Sedex) và Waters Acquity
UPLC (Waters, Mỹ).
Máy khối phổ MicroTOF-Q II (Brüker Daltonics, Đức) được dùng cho phân tích
LC/MS.
Máy đo khối phổ Micromass Quattro micro API (Waters, Mỹ).
Các thiết bị phổ
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Brüker - AV - 500 MHz, tại Viện hóa
học thuộc Trung tâm Khoa học công nghệ Việt Nam - Hà Nội.
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Jeol (400 MHz), Brüker - AV – 500
MHz và 600 MHz tại Khoa Dược, đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
Các hóa chất, dung môi, dụng cụ và thiết bị trong thử nghiệm sinh học
Dòng tế bào ung thư phổi A549, American Type Culture Collection (ATCC, Mỹ).
Môi trường DMEM/F12, huyết thanh nhau thai bò, kháng sinh
penicillin/streptomycin, đệm phosphate buffer saline (PBS) (Grand Island, Mỹ).
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Amresco,
Mỹ).
2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), DMSO (Sigma Aldrich, Mỹ).
Máy đọc SpectraMax 340PC384 Microplate Reader (Molecular Devices, Mỹ).
Peptidoglycan được phân lập từ Streptococcus aureus, LPS được phân lập từ
Escherichia coli O111:B4, Na thioglycolat và RPMI 1640 (Sigma, Mỹ).
Động vật thử nghiệm: Chuột nhắt đực ICR (20-23 g, 6 tuần tuổi, RaonBio Inc., Hàn
Quốc).
45
Kháng thể cho COX-2, iNOS, p65, p-p65, IRAK1, TAK1, p-TAK1, p-IRAK1,
IκBα, p-IκBα, và β-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Mỹ). Bộ kit
ELISA được mua từ R&D Systems (Minneapolis, MN, Mỹ). Kháng thể biotin-labeled
antimouse F4/80 và hạt từ tính streptoviridin mua từ Invitrogen (Carlsbad, CA, Mỹ).
Dụng cụ nghiên cứu khác
Bình lắng gạn, bình định mức, bình nón nút mài, micro pipette, pipette chính xác, ống
nghiệm có nắp 15 ml, ống thép không rỉ (20 ml), đĩa 96 giếng...và các dụng cụ thông
thường khác trong phòng thí nghiệm.
Mẫu thử: Dịch chiết MeOH của các bộ phận thân rễ, rễ củ, rễ con.
Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới)
Phát hiện: H2SO4 5%/EtOH và UV 365 nm.
2.3.1.3. Phân tích định tính bằng LC/MS
Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử chuẩn bị ở Mục 2.3.1.2 được làm khô bằng dòng khí N2 và hòa
lại dung môi MeOH HPLC để đạt nồng độ khoảng 150 ppm, lọc qua màng lọc 0,2 µm
trước khi phân tích.
Điều kiện phân tích:
Hệ thống sắc ký lỏng: Waters 2795 (Milford, Mỹ) kết hợp máy khối phổ Quattro
microTM (Micromass UK Limited, Manchester, Anh).
Cột: Phenomenex Gemini C18 (150 × 4,6 mm; 5 m).
Pha động: Chương trình gradient của HCOOH 0,1% (A) và HCOOH 0,1%/ ACN (B):
0-11 phút (21% B); 11-25 phút (21→32% B); 25-35 phút (32→40% B); 35-40 phút
(40→95% B); 40-60 phút (95% B); 60-61 phút (95→21% (B) và 61-71 phút (21% B).
Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút. Thể tích tiêm mẫu: 5 µL
Điều kiện MS: Chế độ tạo ion âm, điện thế phân mảnh 250 V, nhiệt độ dòng khí 300
o
C, điện thế mao quản 3500 V, áp suất đầu phun 45 psi. Tốc độ dòng khí 5 L/phút.
Thời gian lưu của các pic và dữ liệu LC/MS được dùng để định tính saponin trên SKĐ.
Bản mỏng chế hóa: Silica gel 60 F254 (2 mm, 20 20 cm) tráng thủy tinh.
Hệ dung môi khai triển: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới).
Mẫu: Dịch chiết rễ con trong MeOH.
Phát hiện: H2SO4 5%/ EtOH và nước cất.
Bản mỏng sau khi khai triển được cắt thành 4 phân đoạn PĐ1-PĐ4. Các phân đoạn này
được kiểm tra bằng SKLM.
47
LC/MS
Các phân đoạn PĐ1-PĐ4 được phân tích bằng LC/MS với điều kiện ở Mục 2.3.1.3.
Thời gian lưu của các pic và dữ liệu LC/MS được dùng để định tính saponin trên SKĐ.
Prep-HPLC
Phân đoạn PĐ1 được tiếp tục phân tích bằng prep-HPLC để thu lấy các pic mới u1, u2,
u3, u4 và u5 trên SKĐ.
Q-TOF-MS
Các pic mới u1, u2, u3, u4 và u5 thu được từ prep-HPLC được tiếp tục phân tích bằng
Q-TOF-MS.
Điều kiện phân tích:
Hệ thống sắc ký lỏng: Waters Acquity UPLC (Milford, Mỹ) kết hợp đầu dò Micro
TOF-QII MS (Brüker Daltonics, Đức).
Cột sắc ký: Waters Acquity BEH C18 (100 × 2,1 mm; 1,7 µm).
Pha động: Chương trình gradient của HCOOH 0,1% (A) và HCOOH 0,1%/ ACN (B):
0-11 phút (21% B); 11-25 phút (21→32% B); 25-35 phút (32→40% B); 35-40 phút
(40→95% B); 40-60 phút (95% B); 60-61 phút (95→21% (B) và 61-71 phút (21% B).
Tốc độ dòng: 0,3 ml/ phút.
1
H- NMR
Các phân đoạn chứa pic mới này được cô thu hồi dung môi, hòa tan lại trong dung môi
C5D5N để đo phổ 1H-NMR.
2.3.1.5. Xây dựng quy trình định lượng Sâm VN bằng HPLC
Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu
Dung môi chiết xuất
So sánh hiệu quả chiết xuất của các dung môi MeOH 50%, 70% và 100%.
Tiến hành: Cân chính xác 100 mg bột Sâm VN cho vào ống nghiệm 12 ml, thêm chính
xác 10 ml dung môi MeOH 50% hoặc 70% hoặc 100%, đậy chặt nắp, siêu âm trong 30
phút ở 30 °C, ly tâm ở 1000 vòng/phút, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích
bằng HPLC theo điều kiện đã khảo sát. So sánh diện tích đỉnh của các saponin chính
G-Rb1, -Rd, -Rg1 và M-R2 trong dung môi khảo sát. Kết quả thực nghiệm cho thấy
MeOH 70% cho hiệu quả chiết xuất tốt nhất với độ lặp lại cao. Do vậy MeOH 70%
48
Đánh giá quy trình định lượng theo hướng dẫn ICH với điều kiện sắc ký ở mục 2.2.1.6
Tính tương thích hệ thống: Được xác định trên giá trị và độ lặp lại của các thông số
kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành thực hiện quy trình trên mẫu chuẩn với 6 lần tiêm
mẫu liên tiếp.
Pha hỗn hợp chuẩn G-Rb1, -Rd, -Re, -Rg1, N-R1, M-R2, P-RT4, V-R2 và V-R11 trong
MeOH 70%.
Pha dung dịch thử: Cân chính xác 100 mg bột rễ Sâm VN, cho vào ống nghiệm 12 ml,
thêm chính xác 10 ml MeOH 70%, siêu âm trong 40 phút ở nhiệt độ 30 ℃, ly tâm ở
49
1000 vòng/phút. Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tính tương thích của hệ thống HPLC được khảo sát với các thông số sắc ký như: Thời
gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), hiệu lực cột (N), hệ số phân giải (RS > 1,5), hệ số bất
đối (AF: 0,8-1,2), độ chọn lọc (: 1,05-2). Quy trình đạt tính tương thích hệ thống khi
các thông số sắc ký trong mẫu chuẩn có %RSD 2%.
Tính đặc hiệu: Tiến hành sắc ký dung dịch hỗn hợp chuẩn, dung dịch thử, dung dịch
thử thêm chuẩn và dung môi pha mẫu là MeOH 70%. Quan sát thời gian lưu và diện
tích pic.
Yêu cầu: Thời gian lưu của các pic hoạt chất trong các dung dịch được bơm vào máy
tương đương nhau. Dung môi pha mẫu không cho pic của hoạt chất. Khi thêm 1 lượng
chất đối chiếu vào mẫu thử, diện tích đỉnh của hợp chất cần định lượng phải tăng lên so
với trước khi thêm chất đối chiếu.
Giới hạn phát hiện: Giới hạn phát hiện được tính tương ứng với tín hiệu của mẫu
chuẩn gấp 2 – 3 lần tín hiệu mẫu trắng.
Giới hạn định lượng: Giới hạn định lượng được tính tương ứng với tín hiệu của mẫu
chuẩn gấp 10 lần tín hiệu mẫu trắng.
Tính tuyến tính: Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau. Xây
dựng đường biểu diễn tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ.
Bảng 2.8. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-ELSD (mg/ml)
STT G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd G-Re N-R1 V-R2 V-R11 P-RT4
1 0,96 1,22 0,99 1,00 0,54 0,52 0,57 1,69 0,56
2 0,48 0,61 0,50 0,50 0,27 0,26 0,28 0,85 0,28
3 0,24 0,31 0,25 0,25 0,10 0,10 0,11 0,42 0,14
4 0,12 0,15 0,12 0,12 0,05 0,05 0,06 0,21 0,07
5 0,06 0,08 0,06 0,06 0,03 0,03 0,03 0,11 0,04
6 0,03 0,04 0,03 0,03 0,01 0,01 0,01 0,05 0,02
Phương trình hồi quy thu được có dạng: lg(y) = b × lg(x) + b0.
Bảng 2.9. Nồng độ giai mẫu xây dựng đường tuyến tính HPLC-UV (mg/ml)
STT G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd
1 0,96 2,44 0,50 0,50
2 0,48 1,22 0,25 0,25
3 0,24 0,61 0,12 0,13
4 0,12 0,31 0,06 0,06
5 0,06 0,15 0,03 0,03
6 0,03 0,08 0,02 0,02
50
Sử dụng "phân tích hồi quy" với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong
phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi
quy.
Trắc nghiệm thống kê:
Giả thuyết:
H0: Bj = 0 “Hệ số Bj không có ý nghĩa thống kê”
HA: Bj ≠ 0 “Hệ số Bj có ý nghĩa thống kê”
B
Giá trị thống kê: t
SB
S
SB
N 2 N 2
X X / N
i1 i i1 i
Trong đó: N: cỡ mẫu. Bậc tự do của giá trị t: = N – 2.
Biện luận:
2
Sf Sf2 : Phương sai của yếu tố khảo sát
F
2
Sr S 2r : Phương sai của yếu tố ngẫu nhiên
F0,05 = FINV (0,05; 1 ; 2 )
Với 1 = 1 ; 2 = N – 2.
Biện luận:
Độ đúng
Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng, lượng chất chuẩn tương ứng là 80%,
100% và 120%. Mỗi mức nồng độ chuẩn bị 3 dung dịch. Tổng cộng có 9 dung dịch.
Tiến hành đo theo cùng điều kiện phân tích. Mỗi dung dịch tiêm 1 lần.
Tỷ lệ phục hồi (%): Trong đó:
Xt Y: tỉ lệ phục hồi (%).
Y 100 % (1) Xt: lượng chất chuẩn tìm thấy (mg)
Xa
Xa: lượng chất chuẩn thêm vào (mg)
2.3.1.6. Định lượng định tính và định lượng saponin trong các bộ phận rễ củ,
thân rễ, thân và lá của Sâm VN bằng HPLC
Chuẩn bị mẫu thử
Cân chính xác 100 mg bột Sâm VN của các bộ phận tương ứng cho vào ống nghiệm 12
ml, thêm chính xác 10 ml dung môi MeOH 70% đậy chặt nắp, siêu âm trong 40 phút ở
30 ℃, ly tâm ở 1000 vòng/phút. Dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi
bơm vào hệ thống HPLC.
Mẫu lá và thân
Cân chính xác 100 mg bột Sâm VN của mỗi bộ phận tương ứng cho vào ống nghiệm
12 ml, thêm chính xác 10 ml dung môi MeOH 70% đậy chặt nắp, siêu âm trong 40
phút ở 30 ℃, ly tâm ở 1000 vòng/phút. Lấy 3 ml dịch chiết làm khô dưới dòng khí nitơ,
sau đó được hòa trong 3 ml nước. Dịch nước được cho lên cột SPE trước đó đã được
hoạt hóa bằng 6 ml MeOH và 6 ml nước. Cột SPE lần lượt được rửa giải lần lượt với 9
ml MeOH 20% và 5 ml MeOH. Dịch MeOH được sấy khô bằng khí nitơ và được hòa
tan lại trong 1 ml MeOH 70%, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi bơm vào hệ thống
HPLC.
+ Hệ thống sắc ký: Perkin Elmer series 200 HPLC (Perkin Elmer, Mỹ) kết hợp đầu dò
ELSD (Sedex 80LT-ELSD, Pháp).
+ Cột: Phenomenex Gemini C18 (150 × 4,6 mm; 5 m).
+ Pha động: Nước (A) và ACN (B): 0-11 phút (21% B); 11-25 phút (21→32% B); 25-
35 phút (32→40% B); 35-40 phút (40→95% B); 40-60 phút (95% B); 60-61 phút
(95→21% B) và 61-71 phút (21% B).
52
Trong đó:
S: diện tích đỉnh thu được
b0, b: hệ số của phương trình hồi quy nồng độ theo lg diện tích đỉnh
m: khối lượng dược liệu khô (mg).
2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học saponin của Sâm VN chế biến
2.3.2.1. Kiểm nghiệm nguyên liệu
Nguyên liệu thân rễ và rễ củ Sâm VN tươi (SVN2, 10 kg) được rửa sạch, ghi mã số,
cân khối lượng và chia ngẫu nhiên thành 9 lô (L1-L9). Từng củ được trích mẫu (100
mg) và kiểm tra bằng SKLM (điều kiện SKLM ở Mục 2.3.1.1. ) đạt tiêu chuẩn trong
chuyên luận Dược điển VN IV. Ngoài ra, các mẫu còn được kiểm tra vi học (đại diện
một số mẫu).
Lô L1 được sấy theo chu trình nhiệt 45 ℃-60 ℃-45 ℃ cho đến khô (độ ẩm dưới 13%).
Dược liệu sau khi sấy khô được xay nhỏ và rây qua rây kích thước 355-450 μm.
Phân lập và tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC)
Phân đoạn EA4.3.2, EA4.5.4, EA4.8.4 và EA7.4 được phân tách bằng prep-HPLC với điều
kiện sau:
+ Hệ thống HPLC: LC-8A Shimadzu kết hợp đầu dò SPD-20A (UV-Vis detector).
+ Cột: Discovery HS C18 (25 cm × 21,2 mm; 10 μm).
+ Tốc độ dòng: 15 ml/ phút.
+ Nhiệt độ cột: 30 ℃.
+ Pha động: MeOH-H2O/ ACN-H2O.
+ Mẫu thử: Các cao phân đoạn được hòa tan trong pha động.
+ Thể tích tiêm mẫu: 10 ml.
2.3.2.5. Phân lập các thành phần trong cao Bu1
Cao Bu1 được phân lập bằng SKC với dung môi rửa giải EtOAc–MeOH (50:1; 25:1; 15:1;
10:1; 5:1; 2:1; 1:1). Kết quả thu được 27 phân đoạn Bu1.1 - Bu1.27. Các phân đoạn này
được tiếp tục phân lập và tinh chế bằng SKC với pha tĩnh là silica gel pha thuận hoặc
pha đảo RP-18, sắc ký lỏng áp suất trung bình (MPLC), sắc ký lỏng bán điều chế
(semiprep-HPLC) và điều chế (prep-HPLC) và tinh chế bằng phương pháp kết tinh
trong các dung môi khác nhau.
Phân lập và tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế (Prep-HPLC)
Phân đoạn Bu1.14 được phân tách bằng prep-HPLC với điều kiện tương tự trong Mục
2.3.2.4.
Phân lập và tinh chế bằng sắc ký lỏng trung bình (MPLC)
Phân đoạn Bu1.17 được phân tách bằng MPLC với điều kiện sau:
+ Hệ thống MPLC: Bio-rad (Mỹ) kết hợp đầu dò PDA (203 nm).
+ Cột sắc ký: 5 50 cm.
+ Pha tĩnh: 250 g RP-18 (40-63 μm, Merck).
+ Pha động: gradient MeOH (A)-H2O (B): 0-2 phút (30%A); 2-102 phút (30-45%A);
102-130 phút (45%A); 130-232 phút (45-55%A); 232-252 phút (55%A); 252-412
55
2.3.2.8. Điều chế và phân lập aglycon của saponin cấu trúc ocotillol (OCT)
Cao Bu1 có thành phần chủ yếu là các saponin có aglycon thuộc khung OCT được sử
dụng để phân lập genin khung OCT. Cao Bu1 (15 g) được đun hồi lưu trong dung dịch
acid sulfuric 5%/ EtOH 30% trong 5 giờ. Dung dịch sau đó được làm nguội, chiết phân
bố với EtOAc thu được 5 g cao phân đoạn EtOAc. Sử dụng hệ thống SKC với hệ dung
môi CH2Cl2-MeOH (10:1) thu được 5 phân đoạn. Tiếp tục tinh chế phân đoạn giàu
OCT bằng SKC với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH (15:1).
H2SO4 5%/EtOH và UV 365 nm, có hay không so sánh với các chất chuẩn. Với các hệ
dung môi sau:
CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới): Kiểm tra các saponin phân cực trung bình.
EtOAc-MeOH (10:1): Kiểm tra saponin kém phân cực và genin.
CHCl3-MeOH-H2O (15:10:2,5): Kiểm tra các saponin phân cực.
Phương pháp HPLC
Các chất sau đó được kiểm tra tiếp tục bằng HPLC với đầu dò ELSD hoặc UV (203
nm, 196 nm) trước khi xác định cấu trúc.
+ Điều kiện HPLC: Perkin Elmer series 200 HPLC/ELSD (Alltech ELSD 2000); Cột:
Waters SunfireTM C18 (250 × 4,6 mm; 5 m).
+ Pha động: Nước (A) và ACN (B): 0-1 phút (18% B), 1-5 phút (18→25% B), 5-25
phút (25→32% B), 25-29 phút (32% B), 29-40 phút (32→38% B), 40-45 phút
(38→49,5% B), 45-59 phút (49,5→100% B), 59-69 phút (100% B).
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
+ Thể tích bơm: 10 l.
+ Đầu dò: ELSD, nhiệt độ hóa hơi: 50 ℃, áp lực khí nitơ 3,8 bar.
2.3.2.10. Xác định cấu trúc các chất phân lập
Chất tinh khiết được phân tích bằng phương pháp phổ khối (MS), NMR (1H, 13
C-
NMR) đồng thời so sánh đối chiếu với các dữ liệu về phổ NMR, MS của các saponin
đã công bố trong tài liệu.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Brüker-AV-500 (MHz), tại Viện
hóa học thuộc Trung tâm Khoa học công nghệ Việt Nam – Hà Nội và máy Brüker-AV-
500 và 600 (MHz) tại Khoa Dược, Đại học quốc gia Seoul, Hàn Quốc. Mẫu được hòa
tan trong C5D5N (cho hợp chất saponin) hoặc CDCl3 (cho hợp chất polyacetylen) với
TMS là chất chuẩn nội. Phổ proton (1H-NMR) được đo ở 500/600 MHz, phổ carbon
(13C-NMR) được đo ở 125/150 MHz. Độ dịch chuyển hóa học được tính theo thang
ppm (δTMS = 0) với chuẩn là tín hiệu của tetramethylsilan (TMS). Các hằng số ghép (J)
tính bằng Hertz (Hz).
2.3.2.11. Phân tích thành phần saponin của Sâm VN chế biến ở 8 giờ, 105 ℃
Phân tích SKLM
Mẫu thử: 100 mg các mẫu Sâm VN chưa chế biến lô L1, Sâm VN chế biến (105 ℃, 8
57
giờ) ở lô L2-L10 siêu âm với 10 ml dung môi MeOH ở 40 ℃ trong 30 phút. Mẫu sau
khi chiết được lọc, chấm đồng lượng.
Điều kiện SKLM:
Bản mỏng: Silica gel F254 tráng sẵn.
Hệ dung môi khai triển: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới).
Phát hiện: H2SO4 5%/ EtOH.
Phân tích định tính HPLC/UV/ELSD và LC/MS thành phần saponin trong Sâm
VN chế biến
Mẫu thử: Lấy chính xác 2 ml dịch chiết MeOH của mẫu thử đã chuẩn bị ở phần SKLM
và làm khô dưới dòng khí nitơ, cắn được hòa tan trong 1 ml MeOH lọc qua màng lọc
0,2 µm trước khi phân tích HPLC/UV/ELSD. Mẫu được pha loãng ở nồng độ 150 pp
cho phân tích LC/MS.
Mẫu chuẩn: Các chuẩn saponin M-R1; M-R2; P-RT4; G-Rb1; G-Rb2; G-Rd; G-Re; G-
Rg1; 20(S) G-Rh1; 20(R) G-Rh1; G-Rk3; G-Rh4; 20(S) G-Rg3; 20(R) G-Rg3; G-Rk1; G-
Rg5, V-R2; -R11 được pha trong dung môi MeOH ở nồng độ 5-10 ppm cho phân tích
LC/MS và 100-300 ppm cho phân tích HPLC/UV/ELSD.
Phân tích HPLC/UV/ELSD: Mẫu thử và thử thêm chuẩn được phân tích nhằm so sánh
thời gian lưu của các pic thử và chuẩn.
Phân tích LC/MS: Phân tích dựa vào dữ liệu phổ MS của mảnh [M-H]- và so sánh đối
chiếu với các dữ liệu phổ MS của các saponin trong các tài liệu tham khảo.
Phân tích định lượng HPLC/ELSD
Chuẩn bị mẫu
Mẫu thử: Cân chính xác 100 mg bột Sâm VN (< 355 μm) của lô L1 và các lô chế biến
L2-L10 (105 ℃, 8 giờ) và chiết siêu âm lần lượt trong 1,5 giờ, 1 giờ và 0,5 giờ sử dụng
lần lượt 10 ml, 10 ml và 5 ml MeOH ở 65 ℃. Dịch chiết sau khi ly tâm cho vào bình
định mức, thêm MeOH cho vừa đủ 25 ml.
Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn của các ginsenosid: G-Rb1, G-Rg1,
20(S) G-Rg3, M-R2 và V-R2 được pha trong MeOH có nồng độ từ 15-500 ppm.
Điều kiện HPLC
Hệ thống sắc ký: Perkin Elmer 200 HPLC (Waltham, Mỹ) cùng với đầu dò ELSD
58
Trong đó:
S: Diện tích đỉnh thu được
b0, b: Hệ số của phương trình hồi quy nồng độ theo lg diện tích đỉnh
m: Khối lượng dược liệu khô (mg).
2.3.3. Phân tích sự thay đổi thành phần hóa học saponin của Sâm VN
qua quá trình chế biến
2.3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Bột Sâm VN (355 – 450 μm) của lô L1 được sử dụng để chế biến theo điều kiện sau:
Cân chính xác 100 mg bột Sâm VN cho vào ống thép không rỉ, thêm 1,5 ml nước cất,
cài chặt và hấp lần lượt trong khoảng từ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 và 20 giờ ở nhiệt
độ 105 ℃ (n=3) và 120 ℃ (n=3). Sau đó, các mẫu chế biến sẽ được đông khô đến dạng
bột khô. Tiếp theo mẫu Sâm VN chưa chế biến (0 giờ) và các mẫu sâm sau khi đông
khô tiếp tục được chiết siêu âm ở 65 ℃ sử dụng lần lượt 10 ml, 10 ml và 5 ml MeOH
tương ứng trong 1,5 giờ; 1 giờ và 0,5 giờ. Dịch chiết được ly tâm và cho vào bình định
mức, thêm MeOH cho vừa đủ 25 ml. Dịch chiết này được sử dụng cho phân tích HPLC
và thử nghiệm sinh học.
2.3.3.2. Khảo sát sự thay đổi thành phần saponin bằng phương pháp
HPLC/ELSD
Mẫu thử: Lấy chính xác 2 ml dịch chiết MeOH của mẫu thử đã chuẩn bị ở Mục 2.3.3.1
59
và làm khô dưới dòng khí nitơ, cắn được hòa tan trong 1 ml MeOH lọc qua màng lọc
0,45 µm trước khi phân tích HPLC.
Dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn của các ginsenosid: G-Rb1, G-Rg1,
20(S) G-Rg3, M-R2 và V-R2 được pha trong MeOH có nồng độ từ 15-500 ppm.
Điều kiện HPLC 1: Dùng trong phân tích các mẫu sâm ở điều kiện chế biến 105 ℃.
Hệ thống sắc ký: Perkin Elmer series 200 HPLC (Waltham, Mỹ) cùng với đầu dò
ELSD (Alltech ELSD 2000, Mỹ).
Cột: Waters SunfireTM C18 (250 × 4,6 mm; 5 m).
Pha động: Hệ dung môi gradient gồm nước (A) và ACN (B): 0-1 phút (18% B), 1-5
phút (18→25% B), 5-25 phút (25→32% B), 25-29 phút (32% B), 29-40 phút
(32→38% B), 40-45 phút (38→49,5% B), 45-59 phút (49,5→100% B), 59-69 phút
(100% B).
Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích bơm: 10 l.
Đầu dò: ELSD, nhiệt độ hóa hơi: 80 ℃, dòng khí N2: 1,5 lít/phút.
Điều kiện HPLC 2: Dùng trong phân tích các mẫu sâm ở điều kiện chế biến 120 ℃.
Hệ thống sắc ký: Perkin Elmer series 200 HPLC (Waltham, Mỹ) cùng với đầu dò
ELSD (Alltech ELSD 2000, Mỹ)
Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 4,6 mm; 5 m)
Pha động: ACN 5% (A) và ACN 95% (B): 0-20 phút (15→20% B); 20-45 phút
(20→47,5% B); 45-55 phút (47,5→100% B); 55-65 phút (100% B).
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 20 l.
Đầu dò: ELSD, nhiệt độ hóa hơi: 80 ℃, dòng khí N2: 1,5 lít/phút.
Hàm lượng các saponin (mg/g) trong dược liệu được tính theo công thức sau:
Trong đó:
S: diện tích đỉnh thu được
b0, b: hệ số của phương trình hồi quy nồng độ theo lg diện tích đỉnh
m: khối lượng dược liệu khô (mg).
60
2.3.3.3. So sánh sự tương quan về sự thay đổi thành phần saponin giữa điều kiện
chế biến 105 ℃ và 120 ℃.
So sánh sự tương quan giữa hai điều kiện chế biến 105 ℃ và 120 ℃ và thời gian chế
biến từ 2 giờ đến 20 giờ dựa vào chỉ số tương quan (similarity index, SI) theo công
thức sau:
SI = 1 -
Trong đó:
Csi và Cti lần lượt là nồng độ của saponin i trong mẫu được chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃.
2.3.4. Tác dụng sinh học của Sâm VN chế biến
2.3.4.1. Khảo sát sự thay đổi tác dụng chống oxy hóa qua quá trình chế biến
Hoạt tính chống oxy hóa của Sâm VN chế biến ở điều kiện khác nhau được thực hiện
với thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do DPPH.
Mẫu: Dịch chiết MeOH toàn phần của Sâm VN chưa chế biến và chế biến ở nhiệt độ
120 ℃ trong thời gian khác nhau đã được chuẩn bị ở Mục 2.3.3.1. Nồng độ mẫu thử
nghiệm được pha tương đương với 6 mg bột Sâm VN /ml MeOH.
DPPH được pha với nồng độ 0,25 mg/ml. Chứng dương là dung dịch vitamin C 8 µM.
Tiến hành: Phương pháp thử nghiệm dựa theo quy trình được công bố trong tài liệu
[16]. 100 µl dịch chiết MeOH của Sâm VN ở nồng độ khác nhau được cho phản ứng
với 100 µl dung dịch DPPH (0,25 mg/ml MeOH). Để yên trong 30 phút trong bóng tối
và lắc khoảng 30 giây trước khi đo. Hỗn hợp phản ứng được đo tại bước sóng 520 nm.
Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu thử Sâm VN được tính bằng công thức sau:
I (%) = [1-(Si–Bi)/(C-Bi)] ×100
Trong đó:
Si: Độ hấp thu của mẫu thử (dịch chiết + DPPH).
Bi: Độ hấp thu của mẫu trắng (dịch chiết + MeOH).
C: Độ hấp thu của mẫu chứng (DPPH + MeOH).
2.3.4.2. Hoạt tính ức chế tự tăng trưởng tế bào
Mục đích:
Đánh giá sự thay đổi hoạt tính ức chế tăng trưởng trên dòng tế bào ung thư phổi A549
của Sâm VN chưa chế biến và Sâm VN chế biến so với theo điều kiện nhiệt độ (105 ℃
và 120 ℃) và thời gian khác nhau (2-20 giờ). Đồng thời, đánh giá hoạt tính ức chế tăng
61
trưởng tế bào của Sâm VN chế biến (ở điều kiện 105 ℃ và 8 giờ) và các hợp chất
saponin phân lập từ Sâm VN chế biến.
Chuẩn bị mẫu:
Dịch chiết MeOH toàn phần theo Mục 2.3.3.1. của Sâm VN, Sâm VN chế biến được
loại dung môi MeOH bằng dòng khí nitơ. Cao chiết được hòa tan trong
DMEM/F12 (1% kháng sinh) chứa 0,1% DMSO để thu được nồng độ khác nhau
(n=3).
Các hợp chất saponin có aglycon thuộc khung PPD (G-Rg3), PPT (G-Re) và OCT
(M-R1, M-R2, V-R2 và OCT) được pha trong DMEM/F12 chứa 0,1% DMSO ở
nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 và 125 µg/ml).
Tiến hành:
Dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ A549 được nuôi cấy trong môi trường
DMEM/F12 bổ sung 10% huyết thanh thai bò và 1% kháng sinh
(penicillin/streptomycin) trong điều kiện 5% CO2 ở 37 °C.
Hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào được thực hiện theo phương pháp của Lee và CS
[47]: 200 μl của tế bào A549 ở mật độ 1 104 tế bào/giếng được nuôi trong đĩa 96
giếng và được ủ trong 24 giờ. Tiếp theo đó, môi trường cũ được thay bằng 200 l dịch
chiết Sâm VN được pha trong môi trường DMEM/F12 hoàn chỉnh mới chứa 0,1%
DMSO được thêm vào mỗi giếng. Sau khi ủ 24 giờ, môi trường nuôi cấy sẽ được loại
bỏ và thêm vào mỗi giếng 50 l MTT nồng độ 4 mg/ml pha trong PBS và tiếp tục được
ủ trong 60 phút. Lớp dịch được loại bỏ và thêm 100 l DMSO vào mỗi giếng, ủ trong
30 phút để hòa tan tinh thể tím formazan được hình thành. Độ hấp thu của mỗi giếng
được đo ở bước sóng 570 nm bằng máy đọc đĩa ELISA.
Tỷ lệ ức chế tăng trưởng tế bào được tính theo công thức:
I%=(C-S)*100/C
Trong đó:
C: Độ hấp thu của mẫu chứng
S: Độ hấp thu của mẫu thử
Số liệu được thể hiện ở giá trị trung bình độ lệch chuẩn (mean ± standard deviation).
62
Dữ liệu được phân tích bằng Student’s t-test cho so sánh 2 nhóm sử dụng phần mềm
SPSS ver. 21.0. Giá trị p < 0,05 (*); 0,01 (**) hoặc 0,001 (***) được xem là có ý nghĩa
thống kê, thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Thu và nuôi cấy đại thực bào từ ổ phúc mạc chuột: Chuột được nuôi thích nghi 7
ngày trước khi thử nghiệm. Chuột được tiêm tĩnh mạch natri thioglycolat 4% (2 ml)
và giết sau 4 ngày tiêm. Thu dịch ổ bụng, trộn với RPMI 1640 (10 ml) và ly tâm 10
phút x 200 vòng. Các tế bào lắng xuống được rửa trong RPMI 1640 và chuyển vào
đĩa 12 giếng, ủ ở 37 °C. Sau 1 giờ, tế bào được rửa 3 lần và các tế bào không bám
dính được loại bỏ. Đại thực bào được thu lấy bằng cách sử dụng kháng thể F4/80.
Đại thực bào (1 106 tế bào/giếng) được nuôi cấy trong đĩa 12 giếng trong môi
trường RPMI 1640 chứa 10% FBS trong 24 giờ ở 37 °C, 5% CO2 để đánh giá độc
tính trên tế bào và tác động kháng viêm của mẫu thử.
Khảo sát độc tính của các mẫu thử M-R2, P-RT4, OCT và V-R2 lên đại thực bào sau
48 giờ bằng test MTT: Đại thực bào được nuôi cấy ở nồng độ 3 × 105 tế bào/giếng
trong môi trường RPMI 1640 chứa 10% FBS ở 37 °C, 5% CO2. Độc tính của các
mẫu thử được khảo sát ở nồng độ 20 µM trong 48 giờ. Tỉ lệ tế bào sống được đánh
giá bằng phương pháp trypan blue.
Khảo sát tác dụng kháng viêm: Đại thực bào (0,5 × 106) được xử lý với tác nhân gây
viêm LPS (100 ng/ml) có hoặc không bổ sung M-R2, P-RT4 và OCT ở nồng độ 10
và 20 μM trong 90 phút để đánh giá khả năng ức chế hoạt hóa các yếu tố tham gia
đường truyền tín hiệu qua NF-κB (TLR4, IRAK1, p-IRAK1, TAK1, p-TAK1, IKK-
β, p-IKK-β, IκB-α, p-IκB-α, p65 và p-p65) hoặc trong 20 giờ để đánh giá biểu hiện
của các enzym COX2, iNOS. Sau đó, ly giải tế bào với đệm RIPA ở 4 C chứa 1%
protease inhibitor và 1% phosphatase inhibitor, ly tâm 2000 vòng 10 phút, thu dịch
63
trong.
+ Khảo sát tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên nồng độ của các cytokin được
phóng thích ra môi trường nuôi cấy bằng phương pháp Elisa: Dịch trong được
chuyển lên đĩa ELISA 96 giếng, định lượng cytokin bằng kit ELISA (R&D Systems,
Minneapolis, MN, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
+ Khảo sát tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên biểu hiện của các enzym COX2,
iNOS và các yếu tố TLR4, IRAK1, p-IRAK1, TAK1, p-TAK1, IKK-β, p-IKK-β, IκB-α,
p-IκB-α, p65 và p-p65 bằng kỹ thuật Western blot: Dịch trong được thêm vào dung
dịch 10% sodium dodecyl sulfate−polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE)
và chuyển màng polyvinyliden difluorid (Joh et al., 2011). Màng được block trong
đệm PBS với 5% protein sữa không béo và 0,05% tween 20 (PBST), sau đó dò với
iNOS, COX-2, IRAK1, p-IRAK1, TAK1, p-TAK1, p-IκBα, IκBα, p65, p-p65, hoặc
kháng thể β-actin. Sau khi rửa với PBST, protein được phát hiện với kháng thể thứ
cấp liên kết với HRP (horseradish peroxidase-conjugated) trong 50 phút. Băng
protein được hiện màu với kit phát quang hóa học (Millipore Cooperation, Billerica,
MA).
Khảo sát tác động của M-R2, P-RT4 và OCT lên quá trình chuyển vị NF-κB vào
nhân đại thực bào và khả năng gắn kết LPS với thụ thể TLR4 bằng:
+ Kỹ thuật nhuộm huỳnh quang miễn dịch: Đại thực bào (3 × 105 tế bào/giếng) được
nuôi cấy trên đĩa 24 giếng trong 2 ngày trước khi chuyển gen (siRNA). Tế bào được
chuyển với nồng độ 100 nM siRNA với protein đáp ứng tế bào tủy biệt hóa sơ
cấp MyD88 (Santa Cruz Biotechnology) sử dụng LipofectamineTM 2000 (Invitrogen,
Carlsbad, CA, Mỹ) theo quy trình nhà sản xuất. Các đại thực bào được ủ với LPS
kết hợp Alexa Flour 594 (100 ng/ml) trong 30 phút có hoặc không bổ sung mẫu thử
ở nồng độ 10, 20 µM. Sau đó khả năng gắn kết LPS lên bề mặt TLR4 có/không có
chuyển nhiễm MyD88 siRNA được đo bằng kính hiển vi đồng tiêu (confocal
microscope).
+ Kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào (flow cytometry): Đại thực bào được ủ với LPS
kết hợp Alexa Flour 488 (1 μg/ml) từ 0 đến 30 phút [11]. Tế bào được cố định trong
paraformaldehyde 4% và sucrose 3% trong 20 phút và rửa bằng PBS. Tế bào tiếp tục
ủ với propidium iodid (10 μg/ml) trong 10 phút và phân tích bằng kỹ thuật dòng
chảy tế bào (C6 Flow Cytometer® System, Ann Arbor, MI, Mỹ).
64
Thân rễ
Rễ con
Rễ chính
1 2 3 4
Hình 3.9. Bộ phận dưới mặt đất của Hình 3.10. SKĐ SKLM của các bộ phận
Sâm VN khác nhau của Sâm VN
Điều kiện SKLM: Bản mỏng: Silica gel F254
Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10; lớp dưới)
Thuốc thử: H2SO4 5%/EtOH.
Chú thích: 1. Thân rễ 2. Rễ con 3. Rễ củ 4. Hỗn hợp chuẩn: G-Rb1, -Rd, -Rg1, N-R1, M-R2
Dựa vào SKĐ SKLM cho thấy thành phần hóa học của thân rễ, rễ củ và rễ con tương
đối giống nhau về số vết, tuy nhiên cường độ vết tương đối khác nhau. Mẫu rễ con (2)
cho các vết có Rf thấp trong khi vết này không thấy ở rễ củ (1) và thân rễ (3).
65
Sắc ký đồ HPLC/ELSD và LC/MS của rễ con Sâm VN được trình bày trong Hình 3.11.
5 7 u1
100 A
u2 9
50 u4
4 u3
1 3 6 u5
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
0
7
5
u1
u2
4
u3
6 u4 u5
1 3
2
Hình 3.11. SKĐ ELSD (a) và LC/MS (b) của rễ con Sâm VN
Pha động cho HPLC/ELSD: Nước (A) và ACN (B): 0-11 phút, 21% (B); 11-25 phút, 21-32% (B); 25-35 phút, 32-40% (B); 35-40 phút, 40-95% (B); 40-60
phút, 95% (B); 60-61 phút, 95-21% (B) và 61-71 phút, 21% (B). Chú thích: N-R1 (1), M-R1 (2), G-Rg1 (3), G-Re (4), M-R2 (5), V-R11 (6),
V-R1 + V-R2 (7), N-R2 (8), G-Rb1 (9), G-Rb2 (10), G-Rd (11) và 5 pic chưa xác định (u1-u5).
67
Pha động: Nước (A) và ACN (B): 0-11 phút (21% B); 11-25 phút (2132% B); 25-35
phút (3240% B); 35-40 phút (4049% B); 40-60 phút (95% B); 60-61 phút
(9521% B); 61-71 phút (21% B). Điều kiện này cho các pic tách nhau tốt trên SKĐ,
đặc biệt là hai pic G-Rg1 và -Re, độ nhiễu đường nền thấp, thời gian phân tích ngắn.
Đầu dò:
+ Đầu dò UV: Phân tích ở bước sóng 196 nm.
+ Đầu dò ELSD: Các thông số áp lực khí nitơ, nhiệt độ hóa hơi được điều chỉnh để đạt
được phương pháp phân tích tốt nhất. Áp lực 3,8 bar cho độ lặp lại của các pic tốt
hơn (%RSD 2%) so với áp lực 3,5 bar (%RSD 10%).
68
Hình 3.12. SKĐ HPLC/ELSD đại diện cho 5 bộ phận khác nhau của Sâm VN.
(A) Thân rễ; (B) Rễ củ; (C) Rễ con; (D) Lá; và (E) Thân (Nồng độ phân tích của mẫu Thân và Lá cao gấp 3 lần các
mẫu khác). Chú thích: N-R1 (1), M-R1 (2), G-Rg1 (3), G-Re (4), M-R2 (5), P-RT4 (6), V-R11 (7), V-R1 + V-R2
(8), N-R2 (9), G-Rb1 (10), G-Rb2 (11), G-Rd (12) và 5 pic chưa xác định (u1-u5). Điều kiện sắc ký: Cột:
Phenomenex Gemini C18 (150 × 4,6 mm; 5 m). Pha động: nước (A) và ACN (B): 0-11 phút, 21% (B); 11-25
phút, 2132% (B); 25-35 phút, 3240% (B); 35-40 phút, 4095% (B); 40-60 phút, 95% (B); 60-61 phút,
9521% (B) và 61-71 phút, 21% (B).
69
Bảng 3.11. RSD (%) của diện tích đỉnh các saponin chính ở điều kiện áp lực 3,5 và 3,8
bar (n=6).
RSD (%)
Áp lực
G-Rg1 M-R2 G-Rb1 G-Rd
3,5 bar 9,55 6,88 5,81 6,16
3,8 bar 2,95 2,86 2,72 3,12
3.2.4.2. Đánh giá quy trình định lượng bằng phương pháp HPLC/UV/ELSD
Tính tương thích hệ thống: Được khảo sát trên các saponin chính của Sâm VN như
G-Rb1, -Rd, -Rg1 và M-R2 trên cả hai đầu dò UV và ELSD. Quy trình cho độ lặp lại tốt
về thời gian lưu (%RSD 2%) và diện tích đỉnh (%RSDELSD 2,28%; RSDUV
1,62%). Các pic có độ phân giải tốt Rs ≥ 1,5.
Tính đặc hiệu: Quy trình đạt độ chọn lọc.
Tính tuyến tính, LOD và LOQ: Dựa vào điều kiện sắc ký đã chọn, tất cả đường tuyến
tính của cả hai đầu dò đều thể hiện tuyến tính tốt như thể hiện trong Bảng 3.13. Đối với
cả hai đầu dò UV và ELSD đều thể hiện tính tuyến tính tốt (R2 ≥ 0,9977 đối với đầu dò
ELSD và R2 ≥ 0,9997 đối với đầu dò UV). Đầu dò UV cho độ nhạy tốt hơn (LOQ:
0,001-0,002 mg/ml và LOD: 0,0002-0,0004 mg/ml) ngoại trừ M-R2 (LOQ: 0,04 mg/ml
và LOD 0,001 mg/ml). Tuy nhiên, LOQ và LOD của đầu dò ELSD thấp hơn 10-15 lần
so với đầu dò UV (Bảng 3.13). Hơn nữa, với đầu dò ELSD các saponin nhóm OCT cho
tín hiệu tốt, nhưng các ginsenosid nhóm PPT như N-R1 và G-Re lại rất thấp do có độ
nhạy thấp hơn so với đầu dò UV.
Độ đúng và độ chính xác: Bảng 3.14 thể hiện độ hồi phục của HPLC/UV/ELSD với
%RSD của từng hợp chất saponin. Ở đầu dò UV, độ lặp lại trong ngày và liên ngày lần
lượt là 2% và 6%, trong khi với đầu dò ELSD dưới 4%. Phương pháp phân tích cho độ
đúng cao với tỉ lệ phục hồi 89,4 -107% với đầu dò ELSD và 96-106,3% với đầu dò UV
ngoại trừ G-Re với độ hồi phục thấp 81-84%.
71
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của 9 saponin chính trong Sâm VN
ELSD UV
Saponin Original Thêm vào Tìm thấy Tỉ lệ hồi phục R.S.D Original Thêm vào Tìm thấy Tỉ lệ hồi phục R.S.D
(mg/g) (mg/g) (mg/g) (%) (%) (mg/g) (mg/g) (mg/g) (%) (%)
0,09 0,24 98 6,9
N-R1 0,15
0,11 0,26 97,8 5,7
2,4 5,95 94,8 3,27 2,4 6,11 99,5 1,66
G-Rg1 3,66 3,72
3,02 6,69 100,2 1,18 3,02 6,83 100,2 1,14
0,1 0,17 81,6 0,3
G-Re 0,09
0,12 0,19 84,5 0,4
3,98 10,17 94,3 4,15
M-R2 6,41 N.D1)
4,98 11,21 96,5 0,4
1,02 2,72 98,5 4,49
P-RT4 1,71 N.D
1,23 2,81 89,4 0,9
0,52 1,17 111,5 4,06
V-R11 0,67 N.D
0,62 1,31 102,3 0,42
0,08 0,25 103,7 5,4
V-R2 0,17 N.D
0,1 0,28 101 6,36
1,0 1,98 97 2,3 1,0 2,01 101 1,62
G-Rb1 1,01 1,01
1,2 2,12 92 7,63 1,2 2,15 96 5,75
0,52 1,05 95 0,96 0,52 1,1 106,3 2,86
G-Rd 0,56 0,56
0,63 1,13 90 3,07 0,63 1,19 98 6,45
Bảng 3.13. Đường tuyến tính của 9 saponin chính với đầu dò ELSD và UV
ELSD UV
Saponin Khoảng tuyến LOQ LOD Khoảng tuyến LOQ LOD
Phương trình hồi quy R2 Phương trình hồi quy R2
tính (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) tính (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
N-R1 y = 16.095.158x1,6081 0,9985 0,013-1,040 0,0220 0,0060 y =8.225.894x – 12,872 1 0,0004-1,0400 0,0020 0,0004
G-Rg1 y = 14.505.168x1,5687 0,9983 0,007-0,955 0,0220 0,0070 y =9.069.242x + 12,434 0,9997 0,0019-1,9100 0,0018 0,0004
G-Re y = 15.540.853x1,6196 0,9977 0,013-1,075 0,0220 0,0070 y =9.069.242x + 12,434 0,9997 0,0019-1,9100 0,0018 0,0004
M-R2 y = 20.958.157x1,6685 0,9984 0,019-0,61 0,0190 0,0040 y =188.174,90x – 166,66 1 0,009-2,4400 0,04 0,0010
72
ELSD UV
Saponin Khoảng tuyến LOQ LOD Khoảng tuyến LOQ LOD
Phương trình hồi quy R2 Phương trình hồi quy R2
tính (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) tính (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
P-RT4 y = 20.123.608x1,6351 0,9990 0,009-0,56 0,0160 0,0065 N.D1) N.D N.D N.D N.D
V-R11 y= 4.707.057x1,6007 0,9994 0,055-1,69 0,0550 0,0260 N.D N.D N.D N.D N.D
V-R2 y = 22.774.081x1,6510 0,9994 0,007-0,56 0,0130 0,0035 N.D N.D N.D N.D N.D
G-Rb1 y = 30.016.270x1,6916 0,9991 0,007-0,495 0,0130 0,0038 y=6.675.167x – 221 0,9999 0,00097-0,9900 0,0010 0,0002
G-Rd y = 28.974.603x1,7116 0,9993 0,007-0,495 0,0120 0,0039 y=7.278.735x + 1,457 1 0,00098-1,0000 0,0010 0,0002
Bảng 3.14. Độ lặp lại trong ngày và liên ngày của phương pháp HPLC-ELSD-UV
ELSD UV
Trong ngày Liên ngày Trong ngày Liên ngày
Saponin Hàm lượng (mg/g) %R.S.D Hàm lượng (mg/g) %R.S.D Hàm lượng %R.S.D Hàm lượng (mg/g) %R.S.D
(mg/g)
N-R1 1,5 ± 0,03 2,01 1,5 ± 0,11 2,24
G-Rg1 35,8 ± 0,2 0,75 36,6 ± 1,1 3,03 37,3 ± 0,1 0,27 37,2 ± 0,14 0,378
G-Re 0,89 ± 0,01 1,53 0,9 ± 0,05 5,91
M-R2 62,8 ± 0,3 0,51 64,1 ± 1,5 2,43 65,1 ± 1,3 1,99 66,8 ± 1,4 2,20
1)
P-RT4 16,8 ± 0,2 1,4 17,6 ± 0,6 3,78 N.D N.D N.D N.D
VR11 6,7 ± 0,2 3,03 7,7 ± 0,18 2,37 N.D N.D N.D N.D
VR2 1,5 ± 0,05 3,77 1,7 ± 0,06 3,87 N.D N.D N.D N.D
G-Rb1 10,1 ± 0,00 0,09 10,5 ± 0,3 2,96 10,1 ± 0,02 0,2 10,1 ± 0,07 0,75
G-Rd 5,6 ± 0,06 1,14 5,6 ± 0,12 2,26 5,6 ± 0,01 0,27 5,6 ± 0,026 0,46
1)
N.D: không phát hiện
73
lượng của u1-u5 được tính toán dựa vào đáp ứng với đầu dò ELSD so với G-Rb1.
3) PPD: G-Rb , -Rb , -Rd và u1-u5. 4) PPT: G-Re, -Rg , N-R1 và N-R2. 5) Được tính cho V-R2
1 2 1
6) OCT: M-R1, M-R2, P-RT , V-R1, V-R2 và V-R11. 7) N.D: không phát hiện.
4
Hàm lượng saponin toàn phần của Sâm VN ở các bộ phận thân rễ, rễ củ và rễ con lần
74
lượt là 195,2; 155,9; 139,3 mg/g dược liệu khô. Tỉ lệ hàm lượng saponin có aglycon
thuộc khung PPT:PPD:OCT trong các bộ phận thân rễ là 1 : 1,7 : 7,8; rễ củ là 1 : 1,6 :
5,5 và rễ con là 1 : 4,8 : 3,3 được thể hiện trong Biểu đồ 3.1.
Thân rễ Rễ củ Rễ con
Biểu đồ 3.1. Biểu đồ so sánh hàm lượng các saponin chính nhóm PPT, PPD và OCT
trong các bộ phận dưới mặt đất của Sâm VN.
3.3. THÀNH PHẦN SAPONIN CỦA SÂM VN CHẾ BIẾN
3.3.1. Chế biến Sâm VN
8 lô Sâm VN được chế biến ở điều kiện nhiệt độ 105 ℃ trong 8 giờ theo quy trình mô
tả ở Mục 2.3.2.2.
B C
A
Hình 3.13. Hình ảnh đại diện Sâm VN tươi (A), sấy khô (B) và sau chế biến (C)
75
Khối lượng trước và sau chế biến của 9 lô Sâm VN được thể hiện trong Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Khối lượng các lô Sâm VN trước và sau chế biến
Khối lượng trước Khối lượng sau khi % khối lượng dược
STT Lô Số củ
khi chế biến (g) chế biến/sấy (g) liệu khô/tươi
1 L1 1015 12 270 26,6%
2 L2 1060 13 237 22,4%
3 L3 1020 13 260 25,5%
4 L4 1020 13 228 22,4%
5 L5 1060 11 229 21,6%
6 L6 1030 12 231 22,4%
7 L7 1040 13 207 19,9%
8 L8 1040 13 231 22,2%
9 L9 966 12 237 24,5%
300
200
100
0
350
300
250
200
150
100
50
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Hình 3.14. SKĐ đại diện HPLC/ELSD phân tích các mẫu Sâm VN chưa chế biến (A)
và Sâm VN chế biến ở 8 giờ (B).
Cột sắc ký: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5 m). Pha động: ACN 5% (A) và ACN 95% (B): 0-
20 phút (1520% B); 20-45 phút (2047,5% B); 45-55 phút (47,5100% B); 55-65 phút (100%
B).
Dựa vào SKĐ HPLC/ELSD cho thấy ở mẫu Sâm VN sau chế biến xuất hiện các pic mới
kém phân cực với thời gian lưu sau 50 phút, cường độ các pic saponin ở mẫu Sâm VN
chưa chế biến giảm rõ rệt.
76
Hình 3.15. Sơ đồ quy trình chiết các cao từ dược liệu Sâm VN chế biến
Kết quả chiết xuất các cao chiết của Sâm VN chế biến được tổng hợp trong Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Kết quả chiết xuất các cao chiết của Sâm VN chế biến
STT Cao chiết Dung môi chiết Phương pháp chiết Khối lượng (g)
1 Diethyl ether (Et) Diethyl ether Soxhlet 13
2 MeOH toàn phần (ME) MeOH Soxhlet 645
3 Cao EtOAc (EA) EtOAc Chiết phân bố 60
4 n-BuOH (Bu1) n-BuOH Chiết phân bố 225
Các phân đoạn được kiểm tra SKLM và HPLC/UV/ELSD nhằm phân tích thành phần
77
Phân đoạn EA3 (5,44 g) được kết tinh lại trong hỗn hợp MeOH-H2O và được tinh
chế bằng SKC với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (85:15:0,1) thu được 20 mg hợp
chất 4 (4).
Phân đoạn EA4 (12,6 g) được phân lập bằng SKC pha thuận với dung môi khai triển:
EtOAc-MeOH (50:1; 40:1; 30:1; 25:1; 1:1) thu được 8 phân đoạn chính.
+ Phân đoạn EA4.3 (1,29 g) được phân lập bằng SKC với dung môi khai triển EtOAc–
MeOH (9:1) thu được 5 phân đoạn, trong đó phân đoạn EA4.3.2 (183 mg) được tinh
chế bằng sắc ký lỏng điều chế với pha động MeOH-H2O (60:40). Thu được 2 phân
đoạn, cô thu hồi dung môi thu được 36 mg hợp chất 5 (5) và 18 mg hợp chất 6 (6).
+ Phân đoạn EA4.5 (1,8 g) được phân lập bằng SKC với dung môi khai triển EtOAc–
MeOH (25:1) thu được 8 phân đoạn. Phân đoạn EA4.5.4 (625 mg) được tiếp tục tinh
chế bằng sắc ký lỏng điều chế với hệ dung môi MeOH-H2O (65:35) thu được 132
mg hợp chất 3a (3a) và 290 mg hợp chất 3b (3b). Phân đoạn EA4.5.7 (500 mg) được
kết tinh trong hỗn hợp dung môi EtOAc–MeOH thu được 400 mg kết tinh hình kim,
không màu của hợp chất 7 (7).
+ Phân đoạn EA4.7 (2,05 g) được kết tinh nhiều lần trong MeOH-H2O thu được 1035
mg kết tinh hình kim, không màu của hợp chất 2.
+ Phân đoạn EA4.8 (1,71 g) được kết tinh nhiều lần trong MeOH-H2O thu được 130
mg kết tinh vô định hình hợp chất 1a (1a). Phần dịch ót (1,54 g) được phân lập
bằng SKC CHCl3– MeOH–H2O (85:15:0,1) thu được 6 phân đoạn. Phân đoạn
EA4.8.4 (320 mg) tiếp tục được tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế với hệ dung môi
ACN-H2O (44:56) thu được 30 mg hợp chất 1b (1b).
Phân đoạn EA7 (1,9 g) được kết tinh trong hỗn hợp dung môi MeOH-H2O thu được
24 mg hợp chất 1a. Phần ót (1,76 g) tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột cổ điển với
dung môi khai triển: EtOAc-MeOH (30:1; 20:1; 10:1; 5:1; 1:1). Kết quả thu được 8
phân đoạn trong đó phân đoạn EA7.4 (138 mg) cho kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi
EtOAc-MeOH. Trên SKLM cho 1 vết và 2 pic trên SKĐ HPLC. Tinh chế bằng HPLC
điều chế với pha động ACN-H2O (40:60) thu được 18 mg hợp chất 8 (8).
Kết quả phân lập các thành phần từ cao EA được tóm tắt trong Hình 3.16.
78
Phân đoạn Bu1.13 (8 g) có kết tủa, lọc và kết tinh lại trong hỗn hợp dung môi MeOH-
H2O thu được 300 mg hợp chất 1a.
Phân đoạn Bu1.14 (18,2 g) được được tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế với dung
môi MeOH – H2O (5:5) thu được 10,5 g hợp chất 12 (12) và 500 mg hợp chất 14 (14).
Phân đoạn Bu1.16 (4,6 g) được kiểm tra HPLC/ELSD cho chủ yếu 1 vết tương ứng
với hợp chất 11 (11).
79
Phân đoạn Bu1.17 (6 g) được tiếp tục phân lập bằng sắc ký lỏng áp suất trung bình
(MPLC) với điều kiện trình bày trong Mục 2.3.2.5. Kết quả thu được 3 phân đoạn
chính Bu1.17.3, Bu1.17.6 và Bu1.17.7.
+ Phân đoạn Bu1.17.3 (1,26 mg) cho 2 vết trên SKLM và tiếp tục được tinh chế bằng
SKC với hệ dung môi CHCl3-MeOH (3:1) thu được 700 mg hợp chất 15 (15).
+ Phân đoạn Bu1.17.6 (1,21 mg) cho 3 vết trên SKLM và tiếp tục được tinh chế bằng
SKC với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (70:30:0,1) thu được 668 mg phân đoạn
Bu1.17.6.1, phân đọan này được tiếp tục tinh chế bằng prep-HPLC được trình bày
trong Mục 2.3.2.5.với pha động: ACN-H2O (21:79) thu được 350 mg hợp chất 16
(16).
+ Phân đoạn Bu1.17.7 được kiểm tra SKLM cho thấy có 1 vết trên SKĐ và tinh khiết
HPLC thu được 300 mg hợp chất 17 (17).
Dựa vào kết quả phân tích HPLC các bộ phận khác nhau của Sâm VN cho thấy có ít
nhất 5 pic mới trên SKĐ HPLC/ELSD/UV. Do vậy các phân đoạn phân cực được phân
tách từ SKC cao Bu1 được kiểm tra HPLC/ELSD/UV so sánh với dịch chiết MeOH
mẫu rễ con Sâm VN. Kết quả phân tích SKLM và HPLC/ELSD/UV cho thấy phân
đoạn Bu1.25 có các pic có thời gian lưu trùng với các pic mới trên SKĐ phân tích mẫu rễ
con Sâm VN (Hình 3.17). Do vậy, phân đoạn Bu1.25 được sử dụng để phân lập các
thành phần saponin phân cực này. Kết quả thu được 5 phân đoạn chính Bu1.25.1 -
Bu1.25.5. Các phân đoạn này được tiếp tục tinh chế bằng sắc ký lỏng điều chế hoặc SKC
pha đảo. Phân đoạn Bu1.25 (1,35 g) được phân lập bằng SKC với dung môi CHCl3-
MeOH-H2O (15:6,5:1; 15:10:2,5) thu được 5 phân đoạn chính. Các phân đoạn Bu1.25.1 -
Bu1.25.4 được tinh chế bằng semiprep-HPLC với điều kiện trình bày trong Mục 2.3.2.5.
+ Phân đoạn Bu1.25.1 (22 mg) được tinh chế bằng semiprep-HPLC với pha động ACN-
H2O (33:67). Kết quả thu được 10 mg hợp chất 18 (18).
+ Phân đoạn Bu1.25.2 (29 mg) được tiếp tục tinh chế bằng semiprep-HPLC với pha
động ACN-H2O (32,5:67,5) thu được 16 mg hợp chất 19 (19).
+ Phân đoạn Bu1.25.3 (65 mg) được tiếp tục tinh chế semiprep-HPLC với pha động
ACN-H2O (32:68) thu được 20 mg hợp chất 19 và 18 mg hợp chất 20 (20).
+ Phân đoạn Bu1.25.4 (80 mg) được tiếp tục tinh chế bằng semiprep-HPLC với pha
động ACN-H2O (32:68) thu được 36 mg hợp chất 21 (21) và 22 mg hợp chất 22
(22).
+ Phân đoạn Bu1.25.5 (100 mg) được tiếp tục tinh chế bằng SKC pha đảo RP-18, dung
80
môi rửa giải MeOH-H2O (5:5; 6:5; 7:3) thu được 50 mg hợp chất 23 (23).
400 M-R2
350
300
250
200
150
100
50
0
(a)
800
600
400
200
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
(b)
30 32 34 36 38 40
Hình 3.17. SKĐ HPLC/ELSD phân tích mẫu rễ con (a) và phân đoạn Bu1.25 (b).
Kết quả phân lập các thành phần từ cao Bu1 được trình bày ở Hình 3.18 và Bảng 3.20.
Hình 3.19. Quy trình phân lập các hợp chất từ cao chiết Bu2.
Bảng 3.21. Kết quả phân lập từ các phân đoạn của cao Bu2
Phân Phương pháp
STT Thành phần và khối lượng các chất phân lập
đoạn phân lập
1 MeOH-H2O
Bu2.1 Hợp chất 26 (52 mg)
(kết tinh)
2 RP-18 Hợp chất 2 (246 mg); hợp chất 7 (18,8 mg); hợp chất
Bu2.6
MeOH-H2O 9 (40,5 mg) và hợp chất 10 (42,1 mg)
3 RP-18 Hợp chất 11 (270 mg), hợp chất 12 (300 mg) và hợp
Bu2.8
MeOH-H2O chất 13 (50 mg)
3.3.4.6. Điều chế và phân lập genin của saponin cấu trúc ocotillol (OCT)
15 g cao Bu1 được thủy phân để thu được 5 g cao phân đoạn EtOAc giàu genin của
saponin cấu trúc khung OCT. Tinh chế bằng SKC thu được 1,3 g hợp chất 26 (26) dạng
tinh thể không màu.
3.3.6.2. Cấu trúc của các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT
Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất 8, 14, 15, 16 và N-R2 được trình bày
trong Bảng 3.23. (Phổ NMR được trình bày trong Phụ lục 8.1).
Bảng 3.23. Dữ liệu phổ 13C-NMR (C, 125 MHz) của hợp chất 8, 14, 15, 16 và N-R2
Vị trí C 14 (MeOD) 15 (MeOD) 16 (MeOD) 8 (C5D5N) N-R2 (C5D5N) [97]
1 40,2 40,2 40,2 39,4 39,5
2 27,6 27,5 27,5 26,8 27,8
3 79,1 77,6 78,2 78,7 78,8
4 40,5 40,5 40,3 40,1 40,3
5 61,8 61,9 61,4 61,3 61,4
6 78,3 79,3 74,9 79,4 80,3
7 45,3 45,2 46,1 45,0 45,3
8 42,0 41,9 41,9 41,1 41,2
9 50,7 50,6 50,2 50,1 50,2
10 40,4 40,4 40,2 39,6 39,7
11 31,4 31,4 31,9 32,1 32,1
12 71,3 71,2 70,2 71,0 71,1
13 50,7 49,5 49,5 48,2 48,3
14 52,4 52,5 52,4 51,6 51,8
15 31,0 31,0 30,9 31,2 31,3
16 27,2 27,3 27,2 27,7 27,8
17 53,1 53,1 53,1 54,7 54,8
18 17,9 18,0 17,7 17,3 17,7
19 17,6 17,1 17,4 17,6 17,8
20 84,9 84,9 84,9 73,0 73,1
21 22,9 22,8 22,8 26,9 25,9
22 36,7 36,6 36,6 35,7 35,9
23 24,2 24,2 24,2 22,9 23,1
24 125,9 125,9 125,8 126,3 126,4
25 132,3 132,3 132,3 130,7 130,9
26 25,8 25,9 25,9 25,5 27,1
27 17,8 17,7 17,9 17,6 17,4
28 31,6 31,6 32,0 31,7 31,8
29 16,1 17,8 17,2 16,7 16,8
30 17,2 16,5 17,2 16,8 16,9
6-Glc 1′ 105,6 103,9 101,6 103,5 103,6
2′ 75,6 79,7 79,4 80,2 79,9
3′ 80,9 78,3 77,9 78,8 78,1
4′ 71,8 71,7 71,9 71,7 71,8
5′ 79,9 80,1 78,1 79,3 79,5
6′ 62,7 62,6 62,5 62,9 63,0
Xyl 1′′ 103,9 104,8 104,9
2′′ 75,6 75,8 75,9
3′′ 78,3 79,8 79,0
4′′ 71,9 71,2 71,3
5′′ 67,0 67,2 67,3
Rha 1′′ 101,6
2′′ 72,2
3′′ 72,4
4′′ 74,0
5′′ 69,6
86
Dữ liệu phổ 1H-NMR của hợp chất 14, 15, 16, 8 và N-R2 được trình bày trong Bảng
3.24.
Bảng 3.24. Dữ liệu phổ 1H-NMR H, m (J, Hz) của hợp chất 14, 15, 16, 8 và N-R2
Proton 14 (C5D5N)* 15 (C5D5N)* 16 (C5D5N)* 8 (C5D5N)** N-R2 (C5D5N) [97]
C-18 1,14 (3H, s) 1,11 (3H, s) 1,16 (3H, s) 1,13 (3H, s) 1,15 (3H, s)
C-19 1,01 (3H, s) 0,94 (3H, s) 0,95 (3H, s) 0,93 (3H, s) 0,95 (3H, s)
C-21 1,58 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,37 (3H, s) 1,39 (3H, s)
C-26 1,61 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,63 (3H, s) 1,66 (3H, s)
C-27 1,58 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,58 (3H, s) 1,60 (3H, s) 1,63 (3H, s)
C-28 2,06 (3H, s) 2,06 (3H, s) 2,10 (3H, s) 2,05 (3H, s) 2,04 (3H, s)
C-29 1,58 (3H, s) 1,45 (3H, s) 1,35 (3H, s) 1,43 (3H, s) 1,44 (3H, s)
C-30 0,79 (3H, s) 0,77 (3H, s) 0,93 (3H, s) 0,77 (3H, s) 0,80 (3H, s)
6-Glc 1′ 4,98 4,91 (d; 7,6 Hz) 5,20 (d; 6,4 Hz) 4,91 (d; 7,0 Hz) 4,91 (d; 7,2 Hz)
Xyl 1″ 5,77 (d; 7,2 Hz) 5,75 (d; 7,0 Hz) 5,73 (d; 7,5 Hz)
Rha 1″ 6,49 (brs)
20-Glc 1‴ 5,17 (d; 7,6 Hz) 5,16 (d; 8 Hz) 5,16 (d; 8 Hz)
* ppm, 400 MHz; ** ppm, 500 MHz
Dữ liệu phổ 1H và 13
C-NMR của hợp chất 8, 14, 15 và 16 cho thấy đây là các
ginsenosid có khung cấu trúc 20(S) PPT dựa vào các đặc điểm sau: tín hiệu singlet của
8 nhóm methyl trong khung cấu trúc, trong đó H của proton C-28 > 2,0. Do hiệu ứng
của 6-OH nên proton C-28 ở ginsenosid PPT cho singlet với H > 2,0 trong khi đó
proton C-28 của PPD chỉ cho giá trị H > 1,25-1,27 [70]. Ngoài ra, tín hiệu proton của
C-17, C-21 dịch chuyển về trường thấp và tín hiệu proton của C-22 dịch chuyển về
phía trường cao là thông tin giúp nhận định đồng phân 20(S). Hợp chất 8 thu được ở
dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ ESI-MS+ cho tín hiệu của [M+Na]+ ở m/z 793
và tín hiệu [M-H]- ở m/z 769 được xác định công thức phân tử C41H70O13. Ngoài tín
hiệu của 8 nhóm methyl, phổ 1H-NMR còn cho 1 tín hiệu proton olefin ở 5,31 t (7,0).
Thêm vào đó, có 2 tín hiệu proton anomer do 2 nối β-glucosidic tại 4,91 d (7,0) và tại
5,75 d (7,0). Tín hiệu của hai carbon olefin tại δC 126,3 và 130,7 của nối đôi trên dây
nhánh trong cấu trúc. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 8 phù hợp với
cấu trúc của notoginsenosid-R2 trong tài liệu tham khảo [97]. Vì thế, hợp chất 8 được
87
xác định là notoginsenosid-R2 thuộc nhóm ginsensosid có aglycon thuộc khung PPT
được lần đầu phân lập từ Sâm VN.
So sánh dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR với các tài liệu đã công bố, hợp chất 14, 15 và 16
lần lượt được xác định là ginsenosid-Rg1 (G-Rg1), notoginsenosid-R1 (N-R1) và
ginsenosid-Re (G-Re) đã được công bố trong Sâm VN [67].
OH
R3O R1 R2 R3
Notoginsenosid R2 (8) -H -OGlc2-Xyl -H
12
Ginsenosid Rg1 (14) -H -OGlc -Glc
Notoginsenosid R1 (15) -H -OGlc2-Xyl -Glc
3
Ginsenosid Re (16) -H -OGlc2-Rha -Glc
R1O
R2
Bảng 3.26. Dữ liệu phổ 1H-NMR (H*, m (J, Hz)) của các saponin hợp chất 17, 18 và
19
Phần Aglycon Phần đường
17 18 19 Proton 17 18 19
Proton
(MeOD) (C5D5N) (C5D5N) (MeOD) (C5D5N) (C5D5N)
0,87 0,93 0,94 4,44 4,89
C-18 3-Glc 1′ 4,89 m
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (d; 7,5 Hz) (d; 7,8 Hz)
0,93 0,79 0,79 4,61 5,35 5,35
C-19 3-Glc 1′′
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (d; 7,5 Hz) (d; 7,8 Hz) (d; 7,3 Hz)
0,93 1,62 1,63 4,68 5,11 5,10
C-21 20-Glc1′′′
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (d; 8,0 Hz) (d; 7,7 Hz) (d; 7,8 Hz)
1,0 1,60 1,58 Ara(p) 4,98 5,07
C-26
(3H, s) (3H, s) (3H, s) /Glc 1′′′′ (d; 5,9 Hz) (d; 7,8 Hz)
1,0 1,64 1,63
C-27
(3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,3 1,26 1,25
C-28
(3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,63 1,08 1,08
C-29
(3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,6 0,93 0,94
C-30
(3H, s) (3H, s) (3H, s)
* ppm, 500 MHz
Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 17, 18 và 19 cho thấy đây là các ginsenosid
có khung cấu trúc 20(S) PPD dựa vào các đặc điểm sau: 8 nhóm methyl trong khung
cấu trúc với tín hiệu singlet của methyl C-28 (H < 2,0). Ngoài ra, tín hiệu của C-17, C-
21 có C dịch chuyển về trường thấp và tín hiệu C-22 có C dịch chuyển về phía trường
cao là thông tin giúp nhận định đồng phân 20(S). So sánh dữ liệu phổ 1H và 13C của
hợp chất 17, 18 và 19 với các tài liệu đã công bố [67], các hợp chất này lần lượt được
xác định là ginsenosid Rd (G-Rd), ginsenosid Rb2 (G-Rb2) và ginsenosid Rb1 (G-Rb1)
là các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD đã được công bố trong Sâm VN.
R 3O R1 R2 R3
OH
Ginsenosid Rd (17) -Glc2-Glc -H -Glc
12 Ginsenosid Rb2 (18) -Glc2-Glc -H -Glc6-Ara(p)
Ginsenosid Rb1 (19) -Glc2-Glc -H -Glc6-Glc
3
R1O
R2
89
O O
OH OH
12 12
3 3
6
HO
HO
(a) OR1 (b)
OR
Khung R/R1
Vina-ginsenosid R2 (2) (a) [6-Ac]-Glc-Xyl
Pseudo-ginsenosid RT4 (7) (a) -Glc
Majonosid R1 (11) (a) -Glc2-Glc
Majonosid R2 (12) (a) -Glc2-Xyl
Vina-ginsenosid R11 (13) (b) -Glc2-Xyl
20(S) protopanaxatriol oxid II (26) (a) -H
90
Bảng 3.27. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (125
MHz, C5D5N, C**) của các hợp chất 2, 7, 11, 12, 13 và 26.
2 7 11 12 13 26
Vị trí C
δC δH δC δH δC δH δC δH δC δH δC δH
1 39,1 39,5 39,6 39,5 39,5 39,3
2 27,2 27,8 27,8 27,7 28,0 28,14
3 78,3 78,5 78,1 77,9 78,5 78,4
4 39,6 40,3 40,2 40,1 40,2 40,35
5 60,9 61,4 61,6 61,3 61,4 61,90
6 79,5 80,0 79,8 79,3 79,4 79,7
7 44,8 45,0 44,9 44,8 44,8 47,50
8 40,7 40,9 41,1 40,9 41,1 41,11
9 49,8 50,3 50,3 50,2 50,0 50,24
10 39,2 39,4 39,6 39,5 39,5 39,46
11 31,7 32,4 32,5 32,1 31,6 32,2
12 70,4 70,8 70,8 70,7 70,5 69,94
13 48,6 49,0 49,2 49,3 48,9 49,11
14 51,8 52,1 52,3 52,1 52,0 52,18
15 32,1 32,4 32,7 32,4 32,1 32,58
16 25,4 25,7 25,8 25,7 27,6 25,74
17 49,0 49,4 49,5 49,4 52,2 49,47
1,27 1,19 1,19 1,19 1,14 1,15
18 17,4 17,1 17,8 17,7 17,2 17,78
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,03 1,02 0,97 0,98 0,95 1,04
19 16,6 17,7 17,2 17,0 17,6 18,07
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
20 86,7 87,0 87,1 86,9 77,9 87,0
1,31 1,25 1,26 1,26 1,29 1,29
21 26,4 28,9 27,0 26,8 26,3 26,97
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
22 31,9 32,1 32,5 32,5 27,8 32,64
23 28,2 28,6 29,0 28,6 25,9 28,64
24 87,9 88,3 88,4 88,3 74,4 88,4
25 69,7 70,0 70,0 69,9 80,0 67,73
1,32 1,3 1,29 1,30 1,42 1,30
26 26,0 26,4 26,6 26,4 23,2 26,56
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,40 1,44 1,42 1,43 1,49 1,43
27 28,5 26,8 29,0 28,9 29,9 28,97
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,45 1,57 1,45 1,45 1,64 1,43
28 31,3 31,6 32,0 31,5 31,7 31,9
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
2,04 2,03 2,05 2,05 2,04 2,00
29 16,5 16,2 16,7 16,6 16,7 16,45
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
0,88 0,74 0,75 0,75 0,76 0,93
30 17,5 17,7 17,8 17,7 17,7 17,23
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
5,74 4,99 4,91 4,93 4,91
6-O-Glc
102,8 (d; 6,0 105,8 (d; 7,5 103,8 (d; 6,5 103,4 (d; 6,1 103,4 (d; 5,7
1′
Hz) Hz) Hz) Hz) Hz)
2′ 78,6 75,3 79,9 80,1 80,2
3′ 78,3 79,4 78,6 78,7 78,7
4′ 70,7 71,7 71,7 71,1 71,2
5′ 75,4 78,0 79,9 79,7 79,8
6′ 64,6 62,9 63,0 62,8 62,9
6-O-Glc 103,9 5,89
91
Vị trí C 2 7 11 12 13 26
1′′ (d; 6,1
Hz)
2′′ 76,1
3′′ 78,6
4′′ 72,4
5′′ 78,6
6′′ 63,4
5,0 5,73 5,72
Xyl 1′′ 104,2 (d; 6,9 104,7 (d; 6,1 104,8 (d; 5,8
Hz) Hz) Hz)
2′′ 75,1 75,7 75,8
3′′ 78,1 78,6 78,8
4′′ 70,5 71,6 71,7
5′′ 66,7 67,1 67,2
2,09
CH3CO 20,6
(3H, s)
CH3CO 170,6
* ppm, 500 MHz; ** ppm, 125 MHz
3.3.6.5. Cấu trúc của các hợp chất 9, 10, 1a và 1b
Dữ liệu phổ của các hợp chất 1a, 1b, 9 và 10 được trình bày trong Bảng 3.28. (Phổ
NMR được trình bày trong Phụ lục 8.4)
Hợp chất 1a thu được ở dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ MS với pic
[M+Na]+ tại m/z = 807,4 và pic ion [M-H]- tại m/z = 783,4 cho công thức phân tử
C42H70O13 ( = 7). Phổ 1H-NMR cho 8 tín hiệu proton nhóm methyl lần lượt tại H
0,81; 0,97; 1,00; 1,11; 1,29; 1,38; 1,64 và 1,67 (3H, s) và hai tín hiệu proton anomer
của liên kết β-glucosic tại δH 4,93 (d; 7,5 Hz; H-1′) của đường glucose liên kết tại C-3
và tại δH 5,36 (d; 7,5 Hz; H-1″) của đường glucose ở C-3 khung aglycon.
Tương tự hợp chất 1b cũng cho pic ion phân tử m/z = 783,95 [M-H]-; cho thấy tương
ứng với M = 784 có công thức nguyên C42H72O13 ( = 7). Phổ 1H-NMR cho 8 tín hiệu
proton methyl lần lượt tại H 0,79; 0,94; 0,95; 1,09; 1,28; 1,41; 1,61; 1,63 (3H, s) và hai
tín hiệu proton anomer tại liên kết β-glucosic tại δH 4,91 (d; 7,7; H-1′) của glucose tại
C-3 của khung aglycon và tại δH 5,36 (d; 7,8; H-1″) của glucose tại C-3 của khung
aglycon.
Phổ 13C-NMR của hai hợp chất này phù hợp với dữ liệu phổ của G-Rg3 trong tài liệu
tham khảo [134]. Hơn nữa, dựa vào các tài liệu tham khảo, việc phân biệt 2 đồng phân
20(S) và 20(R) có thể dựa vào các carbon kế cận với C-20 [134]. Độ dịch chuyển C
của C-17, C-21 và C-22 ở phổ 13C-NMR của hợp chất 1a lần lượt là 50,6; 22,8 và 43,3;
92
và của hợp chất 1b lần lượt là 54,8; 27,1 và 39,5. Dữ liệu 1H-NMR và 13C-NMR của 2
hợp chất 1a và 1b phù hợp với dữ liệu phổ của 20(R) và 20(S) ginsenosid-Rg3 trong tài
liệu tham khảo. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 1a được xác định là 20(R) ginsenosid-
Rg3 và hợp chất 1b chính là 20(S) ginsenosid-Rg3 lần đầu được phân lập từ Sâm VN
chế biến.
Phổ MS của hợp chất 9 cho pic ion [M-H]- tại m/z =765,48 và pic ion [M+H3SiO2-H]-
tại m/z =828,47 dự đoán là pic do ion [M-H]- kết hợp với silica gel. Phổ MS của hợp
chất 9 cho pic ion [M+Na]+ tại m/z =789,48 và pic ion [M-H2O+H]+ tại m/z =749,48
cho công thức phân tử là C42H70O12 (Δ = 8). Phổ 1H-NMR của hợp chất 9 cho tín hiệu
proton của 7 nhóm -CH3 tại H 0,78; 0,94; 0,99; 1,08; 1,26; 1,57 và 1,64 (3H, s) lần
lượt gán cho các proton H-19, H-30, H-18, H-29, H-28, H-27, H-26. Hai tín hiệu của
hai proton anomer của liên kết β-glucosic tại H 4,89 (1H, m) và 5,33 (d; 7,4) tại vị trí
C-3 của khung aglycon.
Phổ MS của hợp chất 10 cho pic ion [M+Na]+ tại m/z =789,47 và [M-H2O+H]+ tại m/z
= 794,47 cho cùng công thức phân tử là C42H70O12 (Δ = 8) so với hợp chất 9. Phổ 1H-
NMR của hợp chất 10 cho tín hiệu proton của 8 nhóm -CH3 lần lượt tại H 0,79; 0,93;
0,99; 1,09; 1,27; 1,56; 1,60; 1,80 (3H, s) lần lượt gán cho các proton H-19, H-30, H-18,
H-29, H-28, H-27, H-26, H-21. Tín hiệu H của hai proton anomer tại liên kết β-
glucosic 4,91 (1H; d; 7,5) và 5,35 (1H, d, 7,5) gắn tại vị trí C-3.
Các tín hiệu carbon tại C 108,1; 125,3; 131,1 và 155,4 của hợp chất 9 và các tín hiệu
C 123,2; 123,5; 131,2 và 140,2 của hợp chất 10 đề nghị rằng có hai lên kết đôi tại C-
20(22) và C-24(25) trong công thức phân tử. Ngoài ra, trong phổ 1H-NMR của hợp
chất 10 không thấy xuất hiện hai tín hiệu cộng hưởng tại H 4,80 (1H, s) và 5,09 (1H, s)
của hai proton bất đối tại C-21 trên phổ 1H-NMR của hợp chất 9; thay vào đó là sự xuất
hiện của một mũi 3 (triplet) tại H 5,44 do sự cộng hưởng của hai proton methylen tại
C-23 với 1 proton của C-22 của hợp chất 10.
Dựa vào dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của 2 hợp chất 9 và 10 cho thấy sự phù hợp
dữ liệu phổ với ginsenosid Rk1 (G-Rk1) và ginsenosid Rg5 (G-Rg5) là hai ginsenosid có
aglycon thuộc khung PPD kém phân cực được hình thành do mất nước tại vị trí C-20.
Đồng thời G-Rk1 và G-Rg5 chỉ khác nhau ở vị trí nối đôi exo- hoặc endo- ở C-20.
Chính vì vậy trên phổ 13C-NMR độ dịch chuyển của C17, C21, C22 của hợp chất 9 tại
C 50,6; 22,8; 43,3 và của hợp chất 10 tại 54,8; 27,1 và 35,9.
93
Như vậy từ những dữ liệu phổ nêu trên có thể kết luận hợp chất 9 chính là ginsenosid
Rk1 (3β,12β-dihydroxydammar-20(21),24-diene-3-O-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-
glucopyranosid) và hợp chất 10 chính là ginsenosid Rg5 ((3,12,20E)-12-
hydroxydammara-20(22),24-dien-3-yl 3-O--D-glucopyranosyl--D-glucopyranosid)
lần đầu được phân lập từ Sâm VN chế biến.
1,56; 1,64; 2,03 (3H, s) của 7 nhóm methyl gắn trên khung aglycon. Các tín hiệu tại C
155,3; 131,1; 125,3; 108,0 tương ứng với tín hiệu của hai nối đôi C-20(21) và C-24(25)
trên dây nhánh. Hợp chất 5 cho 1 tín hiệu carbon anomer tại C 105,9 của đường
glucose gắn vào vị trí C-6.
Tương tự, hợp chất 6 cho cùng Rf trên SKLM với hợp chất 5. Phổ MS cho pic ion phân
tử [M+Na]+ tại m/z = 643, cho cùng công thức nguyên là C36H60O8 (∆=7). Phổ 1H-NMR
cho 8 tín hiệu proton tại H 0,80; 1,00; 1,20; 1,54; 1,57; 1,58; 1,78; 2,30 (3H, s) của 8
nhóm methyl trên khung aglycon. Các tín hiệu tại C 134,0; 131,1; 123,7; 123,4 thể
hiện hai lên kết đôi tại C-20(22) và C-24(25) trong công thức phân tử. Ngoài ra, trong
phổ 1H-NMR của hợp chất 6 không thấy xuất hiện hai tín hiệu cộng hưởng tại H 4,80
(1H, s) và 5,09 (1H, s) của hai proton bất đối tại C-21 trên phổ 1H-NMR của hợp chất
5; thay vào đó là sự xuất hiện của một mũi 3 (triplet) tại H 5,44 do sự cộng hưởng với
hai proton methylen tại C-22 của hợp chất 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất 6 cho 1 tín
hiệu carbon anomer tại C 105,9 của đường glucose gắn vào vị trí C-6. Dữ liệu phổ 1H-
NMR và 13C-NMR của hợp chất 5 và 6 lần lượt phù hợp với dữ liệu phổ của G-Rk3 và
G-Rh4 [97]. Do đó hợp chất 5 và 6 lần lượt được xác định là ginsenosid Rk3
(3β,6α,12β-trihydroxydammar-20(21),24-diene-6-O-β-D-glucopyranosid) và ginsenosid
Rh4 (3β,6α,12β-trihydroxydammar-20(22),24-diene-6-O-β-D-glucopyranosid) lần đầu
được phân lập từ Sâm VN chế biến.
OH
R
12 HO
A B
3
6
R1O C
R2
Khung R1 R2
20(R) ginsenosid Rg3 (1a) A -Glc2-Glc -H
20(S) ginsenosid Rg3 (1b) A -Glc2-Glc -H
20(S) ginsenosid Rh1 (3a) A -H -OGlc
20(R) ginsenosid Rh1 (3b) A -H -OGlc
Ginsenosid Rk3 (5) B -H -OGlc
Ginsenosid Rh4 (6) C -H -OGlc
Ginsenosid Rk1 (9) B -Glc2-Glc -H
Ginsenosid Rg5 (10) C -Glc2-Glc -H
95
Bảng 3.28. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, C*, C5D5N) của các hợp chất 1a, 1b, 3a,
3b, 5, 6, 9, 10.
Phần aglycon
Vị trí C 9 10 1a 1b 3a 3b 5 6
1 39,2 39,2 39,1 39,1 39,4 39,4 39,4 39,4
2 26,7 26,7 26,6 26,7 27,9 27,9 27,8 27,8
3 88,9 88,9 88,9 88,9 78,6 78,6 78,5 78,5
4 39,6 40,2 39,7 39,7 40,4 40,4 40,3 40,3
5 56,3 56,4 56,4 56,4 61,4 61,4 61,4 61,3
6 18,4 18,4 18,5 18,4 78,1 78,2 80,0 80,0
7 35,3 35,3 35,2 35,2 45,2 45,2 45,2 45,2
8 40,1 39,7 40,0 40,0 41,1 41,1 41,2 41,2
9 48,2 50,7 50,4 50,4 50,2 50,2 50,6 50,5
10 36,9 37,0 36,9 36,9 39,7 39,7 39,6 39,6
11 32,6 32,2 31,4 31,3 32,1 32,2 32,6 32,2
12 72,4 72,5 70,9 71,0 71,0 70,9 72,4 72,5
13 52,4 50,4 49,2 48,6 48,3 48,9 52,0 50,6
14 51,1 50,9 51,8 51,7 51,6 51,7 51,1 50,7
15 32,5 32,6 32,2 32,1 31,2 31,3 32,4 32,4
16 30,7 28,1 26,7 26,8 27,0 26,6 30,6 28,7
17 50,8 51,0 50,6 54,8 54,8 50,6 48,2 50,3
18 15,7 15,8 15,8 16,6 17,7 17,6 17,3 17,3
19 16,4 16,6 16,4 15,8 17,6 17,7 17,7 17,6
20 155,4 140,2 73,0 72,9 72,9 73,0 155,3 140,0
21 108,1 13,1 22,8 27,1 26,8 22,6 108,0 13,1
22 33,8 123,2 43,3 35,9 35,8 43,2 33,6 123,4
23 27,0 27,4 22,6 23,0 23,0 22,7 27,0 27,3
24 125,3 123,5 126,1 126,7 126,3 126,0 125,3 123,7
25 131,1 131,2 130,8 130,7 130,7 130,8 131,1 131,1
26 25,7 25,7 25,8 25,8 25,8 25,8 25,7 25,6
27 17,7 17,7 17,3 17,7 17,4 17,4 17,3 17,6
28 28,0 28,8 28,1 28,1 31,7 31,7 31,6 31,6
29 16,5 16,4 16,5 16,3 16,4 16,4 16,3 16,3
30 16,9 17,0 17,6 17,0 16,8 17,1 16,7 16,7
Phần đường
3-O-Glc-1′ 105,0 105,1 105,1 105,1
2′ 83,4 83,4 83,5 83,5
3′ 77,9 78,2 78,0 78,4
4′ 71,6 71,5 71,6 71,6
5′ 78,2 77,9 78,3 78,1
6′ 62,8 62,7 62,9 62,9
3-O-Glc-1′′ 106,0 106,0 106,1 106,1
2′′ 77,0 77,1 77,2 77,2
3′′ 78,3 78,3 78,3 78,2
4′′ 71,5 71,6 71,7 71,7
5′′ 78,0 78,1 78,1 78,0
6′′ 62,7 62,8 62,7 62,7
6-O-Glc-1′ 106,0 105,9 105,9 105,9
2′′ 75,5 75,4 75,3 75,5
3′′ 79,6 79,5 79,5 80,1
4′′ 71,9 71,7 71,7 71,9
5′′ 80,0 78,0 78,0 79,7
6′′ 63,1 63,0 63,0 63,1
* ppm, 125 MHz
96
Bảng 3.29. Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, C5D5N, H* (m; J, Hz)) của các hợp chất
1a, 1b, 3a, 3b, 5, 6, 9 và 10.
Proton 9 10 1a 1b 3a 3b 5 6
3,49
3,28 3,28 3,50
3,57 (1H; dd; 3,94
3 (1H; dd; 4,1 (1H; dd; 4,1 (1H; dd; 11,5
(1H, m) 11,5 Hz; 4,6 (1H, m)
Hz; 11,7 Hz)Hz; 11,7 Hz) Hz; 4,6 Hz)
Hz)
2,50
0,67 0,67 2,51
(1H; dd;
5 (1H; d; 11,5 (1H; d; 11,5 (1H; dd; 12,8
12,84 Hz;
Hz) Hz) Hz; 3,8 Hz)
2,8 Hz)
0,99 0,99 0,97 0,94 1,01 1,20 1,20 1,05
18
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
0,78 0,79 0,81 0,79 1,38 1,01 1,00 1,38
19
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
4,86
1,80 1,38 1,41 1,17 (1H, s) 1,78 1,17
21
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) 5,09 (3H, s) (3H, s)
(1H, s)
5,31 5,27
5,18 5,29
24 (1H; t; 7,0 (1H; t; 6,84
(1H, br.t) (1H; t; 6,8)
Hz) Hz)
1,64 1,60 1,67 1,63 1,64 1,64 1,58 1,68
26
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,57 1,56 1,64 1,61 1,61 1,56 1,57 1,62
27
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,26 1,27 1,29 1,28 2,07 2,03 2,03 2,07
28
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
1,08 1,09 1,11 1,09 1,59 1,56 1,54 1,60
29
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
0,94 0,93 1,00 0,95 0,81 0,80 0,8 0,86
30
(3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s) (3H, s)
4,91
3-O- 4,88 4,93 4,91
(d; 7,5
Glc-1′ (m) (d; 7,5 Hz) (d; 7,4 Hz)
Hz)
5,33 5,36
3-O- 5,36 5,36
(d; 7,4 (d; 7,5
Glc-1’′ (d; 7,5 Hz) (d; 7,8 Hz)
Hz) Hz)
5,04
20-O- 5,03 5,00 5,00
(1H; d; 7,8
Glc-1′’ (d; 7,8 Hz) (d; 7,8 Hz) (d; 7,8 Hz)
Hz)
Bảng 3.30. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C) của
hợp chất 20 và 21 so với G-Ra1 và N-R4
20 G-Ra1 [18] 21 N-R4 [61]
Vị trí 13C
δ δ 13C 13C
δ δ 13C
C δ 1H δ 1H
(150 MHz, (25 MHz, (150 MHz, (125 MHz,
(600 MHz, ppm) (600 MHz, ppm)
ppm) ppm) ppm) ppm)
1 39,2 39,4 39,2 39,0
2 26,6 26,6 26,7 26,6
88,8 3,24 (dd; 4,1 Hz; 3,24 (dd; 4,14
3 89,1 88,9 89,2
11,5 Hz) Hz; 11,5 Hz)
4 39,5 39,6 39,7 39,5
5 56,2 56,4 56,4 56,3
6 18,2 18,3 18,4 18,4
7 35,1 35,1 35,1 35,1
8 39,9 39,9 40,0 39,9
9 50,1 50,1 50,2 50,0
10 36,7 36,8 36,9 36,7
11 30,5 30,7 30,8 30,6
12 70,0 70,1 70,1 70,0
13 49,5 49,4 49,5 49,2
14 51,2 51,3 51,5 51,3
15 30,8 30,7 30,7 30,6
16 26,5 26,4 26,6 26,6
17 51,3 51,6 51,4 51,3
18 16,1 0,93 (3H, s) 16,2 16,2 0,93 (3H, s) 16,1
19 15,9 0,79 (3H, s) 15,9 16,0 0,79 (3H, s) 15,9
20 83,3 83,5 83,5 83,5
21 22,1 1,63 (3H, s) 22,2 22,3 1,62 (3H, s) 22,3
22 36,2 36,3 36,2 36,1
23 23,0 23,1 23,1 22,8
24 125,8 5,28 125,8 126,0 5,28 125,7
25 131,0 131,0 131,0 130,9
26 25,6 1,59 (3H, s) 25,8 25,8 1,58 (3H, s) 25,7
27 17,7 1,61 (3H, s) 17,9 17,9 1,62 (3H, s) 17,8
28 27,9 1,25 (3H, s) 28,0 28,1 1,26 (3H, s) 27,9
29 16,4 1,08 (3H, s) 16,5 16,6 1,08 (3H, s) 16,5
30 17,3 0,95 (3H, s) 17,3 17,4 0,95 (3H, s) 17,3
C-1′ 104,9 4,9 (d; 6,9 Hz) 104,9 105,4 4,9 (d; 6,9 Hz) 105
2′ 83,3 83,0 83,4 82,6
3′ 77,8 78,0 78,3 77,7
4′ 71,5 71,5 71,6 71,4
5′ 78,3 78,0a) 78,2 77,7
6′ 62,5 62,7 62,9 62,6
C1″ 105,9 5,09 (d; 7,4 Hz) 105,6 106,0 5,10 (d; 5,5 Hz) 105,2
2″ 76,7 76,8 77,1 76,5
3″ 78,6 79,1 a) 79,3 78,6
4″ 71,5 71,5 71,6 71,4
5″ 78,2 78,0 a) 78,2 77,7
6″ 62,7 62,7 62,7 62,6
C1‴ 97,9 5,35 (d; 7,8 Hz) 97,9 98,0 5,34 (t) 97,8
2‴ 74,7 74,7 75,0 74,7
3‴ 79,1 79,1 a) 78,1 77,7
4‴ 71,7 71,5 71,5 71,4
5‴ 77,0 76,8 76,9 76,5
6‴ 69,7 69,7 71,1 71,2
98
Phổ Q-TOF-MS của hợp chất 20 cho tín hiệu của pic ion [M+Na]+ tại m/z = 1233,6271
và [M-H]- tại m/z = 1209,6313 được xác định công thức phân tử là C58H98O26 (∆=10).
Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton của 8 nhóm methyl lần lượt tại H 0,79; 0,93; 0,95;
1,08; 1,25; 1,59; 1,61; 1,63 (3H, s) và một tín hiệu proton olefin tại H 5,29 (1H, t). Phổ
13
C-NMR cho tín hiệu của hai carbon olefin tại δC 125,91 và 131,06 của nối đôi trên
dây nhánh trong cấu trúc cho thấy hợp chất 20 có aglycon thuộc khung PPD. Dựa vào
dữ liệu phổ MS và 1H-NMR chứng tỏ trong phân tử của hợp chất 20 có 5 phân tử
đường gồm 4 hexose và 1 pentose: 5 tín hiệu proton anomer do 4 nối β-glucosid gồm 3
phân tử đường β-D-glucopyranosyl tạiH 4,9 (d; 6,9 Hz); 5,09 (d; 7,4 Hz); 5,35 (d; 7,8
Hz); 1 phân tử đường arabinose tại 5,09 (d; 7,8 Hz); và 1 phân tử đường β-D-
xylopyranosyl tại H 4,9 (d; 6,9 Hz). Khi so sánh dữ liệu phổ của hợp chất 20 và
ginsenosid Ra1 [18] có cùng khối lượng phân tử (MW= 1211.396) cho thấy có sự phù
hợp về dữ liệu phổ, do vậy hợp chất 20 được xác định là ginsenosid Ra1 lần đầu được
phân lập từ Sâm VN chế biến.
Phổ Q-TOF-MS của hợp chất 21 cho tín hiệu của pic ion [M+Na]+ tại m/z = 1263,6369
và [M-H]- tại m/z = 1239,6357 được xác định công thức phân tử là C59H100O27 (∆=10).
Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton của 8 nhóm methyl lần lượt tại H 0,79; 0,93; 0,95;
1,08; 1,26; 1,58; 1,62; 1,62 (3H, s) và một tín hiệu proton olefin tại H 5,28. Phổ 13C-
NMR cho tín hiệu của hai carbon olefin tại δC 125,97 và 130,98 của nối đôi trên dây
nhánh trong cấu trúc cho thấy hợp chất 21 có aglycon thuộc khung PPD. Dựa vào dữ
liệu phổ MS và 1H-NMR chứng tỏ trong phân tử của hợp chất 21 có 5 phân tử đường
gồm 3 hexose và 2 pentose: 5 tín hiệu proton anomer do 5 nối β-glucosid gồm 4 phân
99
tử đường β-D-glucopyranosyl tại H 4,9 (d; 6,9 Hz); 5,10 (d; 5,5 Hz); 5,34 t; 4,78 (d;
11,0 Hz) và 1 phân tử đường β-D-xylopyranosyl tại H 4,73 (d; 11,0 Hz). Khi so sánh
dữ liệu phổ của hợp chất 21 và notoginsenosid R4 [61] có cùng khối lượng phân tử
(MW=1241,41) cho thấy có sự phù hợp về dữ liệu phổ, do vậy hợp chất 21 được xác
định là notoginsenosid R4 lần đầu được phân lập từ Sâm VN chế biến.
R3O
OH
R1 R2 R3
12 2
Notoginsenosid Ra1 (20) -Glc - -Glc6-
-H
Glc Ara4-Xyl
3
Notoginsenosid R4 (21) -Glc2- -H
-Glc6-
Glc Glc6-Xyl
R1O
R2
Bảng 3.31. Dữ liệu 1H-NMR (C5D5N, H* (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C**) của
hợp chất 22
Vị trí 22 Notoginsenosid Q [137]
C DEPT C H COSY HMBC C H
1 CH2 39,2 0,73; 1,54 39,3
2 CH2 26,7 1,81; 2,17 26,7
3,26
3 CH 88,9 C-1′ 89,1
(dd; 3,8 Hz; 10,5 Hz)
4 C 39,7 39,8
5 CH 56,4 0,66 56,5
6 CH2 18,4 1,34; 1,47 18,5
7 CH2 35,1 1,17; 1,44 35,2
8 C 40,0 40,1
9 CH 50,2 1,34 50,3
10 C 36,9 37
11 CH2 30,9 1,49; 1,93 30,9
12 CH 70,1 70,2
13 CH 49,5 1,96 49,7
14 C 51,4 51,5
15 CH2 30,8 0,97; 1,54 30,8
16 CH2 26,6 1,30; 1,81 26,8
17 CH 51,4 2,54 51,7
18 CH3 16,0 0,93 (3H, s) 16,1 0,96 (3H, s)
19 CH3 16,2 0,78 (3H, s) 16,3 0,81 (3H, s)
20 C 83,4 83,5
21 CH3 22,2 1,63 (3H, s) 22,3 1,62 (3H, s)
22 CH2 36,2 1,79; 2,38 36,2
23 CH2 23,1 2,36; 2,57 23,2
C-23; C-
24 CH 125,9 5,29 H-23 126,1
26;C-22
25 C 131,1 131
100
liệu phổ MS và 1H-NMR chứng tỏ trong phân tử của hợp chất 22 có 6 phân tử đường
gồm 3 hexose và 3 pentose: 6 tín hiệu proton anomer do 6 nối β-glucosid gồm 3 phân
tử đường β-D-glucopyranosyl lần lượt tại H 4,9 ppm (d; 7,6 Hz; H1′); 5,09 (d; 7,35 Hz,
H′‴); 5,49 (m; H1″) và của 3 phân tử đường β-D-xylopyranosyl tại H 4,91 (d; 6,25 Hz,
H″‴) và 5,09 (d; 7,35 Hz, H‴‴); 5,39 (d; 6,6 Hz; H1‴). Khi so sánh dữ liệu phổ của hợp
chất 22 và notoginsenosid Q có cùng khối lượng phân tử (MW=1342) thấy rằng mạch
đường nối C-3-O-triglycosid của hợp chất 22 tương ứng với hợp chất notoginsenosid
Q, trong khi tin hiệu carbon của mạch đường C-20 cho thấy C C1‴‴ của
notoginsenosid Q là 103,8 trong khi của hợp chất 22 là 106,95 (Hình 3.20) [137].
[137][137][123]Phổ HMBC của hợp chất 22 cho tương tác xa của proton H1‴ và C2″;
H1″ và C1′; H1′ và C3; H1‴‴ và C3‴″; H1‴″ và C6″″; H1″″ và C20. Điều này cho thấy
cấu trúc hợp chất 22 khác với notoginsenosid Q ở vị trí gắn đường xylopyranosyl
(1→3) thay vì (1→4). Do vậy cấu trúc hợp chất 22 được xác định là 3-O-β-D-
xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl-20(S)-
protopanaxadiol 20-O-β-D-xylopyranosyl (1→3)- β -D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosid (Hình 3.21).
H
H O
O HO O
HO O
HO OH 105,1
107,0
OH 69,8 H
H H O O
H
HO (a)
HO
20(S)
98,0
H OH
H O H
O O O
HO HO
HO 103,8 OH 105,5
OH 69,78 (b)
H
H H O O
H
HO
HO
20(S)
98,1
OH
H
Hình 3.20. Cấu trúc phần đường gắn vào vị trí C-20 của hợp chất 22 (a) và
notoginsenosid Q (b).
102
H
H O
O HO O
HO O
HO OH 105,1
107,0
OH 69,8 H
H H O O
H
HO
HO 98,0
OH OH
H 20
OH
62,8 H 3
O O
HO
HO
104,7
OH
O H
63,0 H
O
HO
HO 103,1
Tương tác H-H trong COSY
H O H
O
HO
Tương tác xa H-C trong HMBC
HO
OH 106,4
H
Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất 22
3.3.6.9. Cấu trúc của các hợp chất 23
Dữ liệu phổ của hợp chất 23 và notoginsenosid D được trình bày trong Bảng 3.32. (Phổ
NMR được trình bày trong Phụ lục 8.8)
Hợp chất 23 được phân lập ở dạng bột vô định hình màu trắng, tan tốt trong MeOH-
H2O. Q-TOF-MS của hợp chất 23 cho tín hiệu của pic ion [M+Na]+ ở m/z = 1395,7134
và [M-H]- ở m/z = 1371,6835 được xác định công thức phân tử C64H108O31 (∆=11). Phổ
1
H-NMR cho tín hiệu proton của 8 nhóm methyl lần lượt tại H 0,78; 0,93; 0,94; 1,08;
1,25; 1,58; 1,62 và 1,63 (3H, s) và một tín hiệu proton olefin tại H 5,29 (1H; t; 7,0).
Phổ 13C-NMR cho tín hiệu của hai carbon olefin tại δC 126,0 và 131,0 của nối đôi trên
dây nhánh trong cấu trúc. Điều này chứng tỏ hợp chất 23 có aglycon thuộc khung PPD.
Dựa vào dữ liệu phổ MS và 1H-NMR chứng tỏ trong phân tử của hợp chất 23 có 6 phân
tử đường gồm 4 đường hexose và 2 đường pentose với 6 tín hiệu proton anomer do 6
nối β-glucosid gồm 4 phân tử đường β-D-glucopyranosyl tại H 4,9 (d; 7,7 Hz); 5,48 (d;
7,3 Hz); 5,38 (d; 6,9 Hz); 5,01 (d; 7,8 Hz); và 2 phân tử đường β-D-xylopyranosyl tại
5,1 (d; 7,3 Hz); 4,92 (d; 7,3 Hz). So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 23 và
103
notoginsenosid D có cùng khối lượng phân tử (M=1372) thấy có sự phù hợp dữ liệu về
phổ. Tuy nhiên, có sự nhầm lẫn ở notoginsenosid D khi gán giá trị của 2 proton anomer
tạiH 5,52 (d; 7,2 Hz; H1′) 4,92 (d; 7,9 Hz; H-2′). Do sự phù hợp về dữ liệu phổ, hợp
chất 23 được xác định là notoginsenosid D (3-O-[β-D-xylopyranosyl (1→2)-β-D-
glucopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl]-20-O-[β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-
glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl] 20(S)-protopanaxadiol) (Hình 3.22).
Bảng 3.32. Dữ liệu phổ 1H-NMR (C5D5N, H (m; J, Hz)) và 13C-NMR (C5D5N, C) của
hợp chất 23
23 Notoginsenosid D [140]
Vị trí δC δH δC
C δH
DEPT (150 MHz, (600 MHz, HMBC COSY (125 MHz,
(500 MHz, ppm)
ppm) ppm) ppm)
1 CH2 39,2 0,73; 1,54 39,2
2 CH2 26,8 1,81; 2,17 26,7
CH 3,26 (dd; 3,66 3,29 (dd; 3,3 Hz;
3 88,9 89
Hz; 11,46 Hz) 10,4 Hz)
4 C 39,7 39,7
5 CH 56,4 0,66 56,5
6 CH2 18,4 1,34; 1,47 18,5
7 CH2 35,1 1,17; 1,44 35,2
8 C 40,0 40,1
9 CH 50,2 1,34 50,3
10 C 36,9 36,9
11 CH2 30,8 1,49; 1,93 30,8
12 CH 70,1 4,16 70,2
13 CH 49,5 1,96 49,5
14 C 51,4 51,4
15 CH2 30,7 0,97; 1,54 30,8
16 CH2 26,6 1,30; 1,81 26,7
17 CH 51,5 2,54 51,6
18 CH3 16,0 0,93 (3H, s) 16 0,95 (3H, s)
19 CH3 16,3 0,78 (3H, s) 16,3 0,8 (3H, s)
20 C 83,4 83,5
21 CH3 22,3 1,63 (3H, s) 22,4 1,66 (3H, s)
22 CH2 36,2 1,7864 36,3
23 CH2 23,1 2,38 23,2
24 CH 126,0 5,29 126
25 C 131,0 131
26 CH3 25,8 1,58 (3H, s) 25,8 1,62 (3H, s)
27 CH3 17,9 1,62 (3H, s) 18 1,66 (3H, s)
28 CH3 28,1 1,25 (3H, s) 28,1 1,28 (3H, s)
29 CH3 16,6 1,08 (3H, s) 16,7 1,11 (3H, s)
30 CH3 17,4 0,94 (3H, s) 17,5 0,98 (3H, s)
C-1′ 104,7 4,9 (d; 7,7 Hz) C-3 H-2′ 105,2 5,52 (d; 7,2 Hz)
2′ 83,0 4,07 83,1
3′ 78,7
4′ 71,6
5′ 78,7
6′ 62,8 4,33; 4,54 63,3
104
23 Notoginsenosid D [140]
Vị trí δC δH δC
C δH
DEPT (150 MHz, (600 MHz, HMBC COSY (125 MHz,
(500 MHz, ppm)
ppm) ppm) ppm)
5,48 4,92
C-1″ 103,2 C-2' H-2″ 103,5
(d; 7,3 Hz) (d; 7,9 Hz)
C-1'', C-
2″ 84,5 4,17 85
1'''
3″ 78,1 4,26 C-2'' 78,1
C-3'', C-
4″ 71,1 72,3
2''
5″ 78,3
6″ 63,0 4,33; 4,45 63,3
5,38 C-2'', C- 5,38
C-1‴ 106,4 H-2‴ 106,8
(d; 6,9 Hz) 5‴ (d; 7,0 Hz)
2‴ 75,9 4,08 H-1''' 76,3
3‴ 79,6
4‴ 71,1 4,17 72
5‴ 67,4 3,64; 4,28 H-4‴ 67,5
5,1 C-20, C- 5,12
C-1′‴ 98,0 H-2′‴ 98,5
(d; 7,3 Hz) 5''''; C-2'''' (d; 7,6 Hz)
2′‴ 74,8 (1) 3,87 C-1'''' 75,3
3′‴ 78,3
4′‴ 72
5′‴ 76,9 77,4
6′‴ 70,3 4,29; 4,73 C-1''''' 70,8
5,01 5,02
C-1″‴ 105,4 C-6'''' H-2″‴ 105,8
(d; 7,8 Hz) (d; 7,6 Hz)
2″‴ 75,0 3,95 C1''''' 75,5
3″‴ 78,7
4″‴ 71,6
5″‴ 77,4
6″‴ 69,9 4,27; 4,78 C-1‴‴ 70,3
4,92 4,94
C-1‴‴ 105,9 C-6''''' H-3‴‴ 106,3
(d; 7,3 Hz) (d; 8,5 Hz)
2‴‴ 74,8 (2) 4,01 C-1'''''’ 75,3
3‴‴ 79,1
4‴‴ 71,2
5‴‴ 67,1 3,64; 4,29 67,8
105
H
O
HO O
HO 105,9
OH
69,9 H
H O
HO O
HO
OH 105,4
70,3 H
H O O
HO
HO 98,0
OH OH
H 20
OH
62,8 H 3
O O
HO
HO
104,7
OH
O H
63,0 H
O
HO
HO 103,2 Tương tác H-H trong COSY
H O H Tương tác xa H-C trong HMBC
O
HO
HO
OH 106,4
H
4 (C5D5N) 24 (CDCl3)
Vị trí
Vị trí C δ 13C (125 δ 1H δ 13C (125 MHz, ppm) δ 1H
C
MHz, ppm) (500 MHz, ppm) (500 MHz, ppm)
8 32,1 8 17,6 3,01 (2H, dd)
9 50,4 9 121,9 5,21 (1H, d)
10 36,9 10 133,0 5,49 (m)
11 21,3 11 27,2 2,01 (m)
12 39,4 12 29,2 1,32 (m)
13 42,5 13 29,1 1,23 (8H, m)
14 56,8 14 29,1 1,23 (8H, m)
15 24,5 15 31,8 1,23 (8H, m)
16 28,6 16 22,6 1,23 (8H, m)
17 56,3 17 14,1 0,85 (3H, t)
18 12 0,64 (3H, s)
19 19,4 0,92 (3H, s)
20 36,4
21 19 0,97 (3H, m)
22 34,2
23 26,4
24 46,1
25 29,5
26 19,2 0,88 (3H, m)
27 20 0,86 (3H, m)
28 23,4
29 12,2 0,85 (3H, m)
C1′ 102,6 5,06 (d; 7,6 Hz)
C2′ 75,4 4,06 (1H)
C3′ 78,1 3,94
C4′ 71,7 4,28 (1H)
C5′ 78,5 3,97
C6′ 62,9 4,56 (d; 4,4 Hz)
Hợp chất 4 thu được ở dạng tinh thể hình kim không màu. Phổ 1H-NMR cho thấy tín
hiệu của 1 proton olefin H tại 5,33 ppm (d; 18,0 Hz, H-6) và 6 nhóm methyl (CH3) lần
lượt là 0,66 (3H, s, Me-18); 0,94 (3H, s, Me-19); 0,97 (3H, d, J=6,3 Hz, Me-21); 0,87
(3H, d, Me-26); 0,85 (3H, d, Me-27) và 0,87 (3H, m, Me-29). Tín hiệu doublet của
13
proton anomeric H tại 5,06 (d, J=7,7 Hz). Phổ C-NMR cho tín hiệu của 35 carbon
trong cấu trúc. Trong đó, 6 tín hiệu carbon của nhóm glycosid tương ứng với đường
hexose, 29 tín hiệu carbon còn lại của khung aglycon tương ứng với khung sitosterol.
So sánh dữ liệu phổ trong tài liệu tham khảo [104] cho thấy hợp chất 4 chính là -
sitosterol 3-O--D-glucopyranosid (daucosterol).
Hợp chất 24 được phân lập dưới dạng lỏng, sánh, màu vàng, tan tốt trong dung môi hữu
cơ kém phân cực. Dữ liệu 1H và 13C-NMR của hợp chất 24 được trình bày trong Bảng
3.33. So sánh với dữ liệu NMR của panaxynol trong tài liệu tham khảo [109] cho thấy
sự trùng khớp, do vậy hợp chất 24 được xác định là panaxynol.
107
Hợp chất 25 được phân lập dưới dạng tinh thể không màu hình kim, tuy nhiên sau khi
xác định phổ khối và dữ liệu 1H và 13C-NMR, hợp chất 25 được xác định là hỗn hợp
của stigmasterol và sitosterol (Phụ lục 8.10).
3.4. NGHIÊN CỨU SỰ THAY ĐỔI THÀNH PHẦN HÓA HỌC
SAPONIN TRONG QUÁ TRÌNH CHẾ BIẾN SÂM VN
3.4.1. Phân tích định tính các thành phần saponin trong Sâm VN chế
biến
Thành phần saponin trong Sâm VN chế biến được phân tích bằng phương pháp LC/MS
và HPLC/UV/ELSD kết hợp phương pháp thử thêm chuẩn. Kết quả phân tích định
danh các thành phần saponin trong Sâm VN chế biến được thể hiện trong Bảng 3.34.
Bảng 3.34. Thành phần saponin trong Sâm VN chế biến
STT Saponin Cách xác định UV 203 nm Khung MW (dự đoán)
1. N-R1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 932
2. M-R1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Không hấp thu OCT 816
3. G-Re Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 946 (Re),
+ G-Rg1 800(Rg1)
4. M-R2 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Không hấp thu OCT 786
5. V-R11 Q-TOF-MS+ Chất chuẩn Hấp thu OCT 700
6. P-RT4 Q-TOF-MS+ Chất chuẩn Hấp thu OCT 800
7. V-R1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Không hấp thu OCT 842(V-R1),
+ V-R2 828(V-R2)
8. N-R2 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 770
9. Pic u1* Hấp thu PPD/PPT
10. G-Rb1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 1108
11. 20(S)-Rh1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 638
12. Pic u2 Q-TOF-MS + Thứ tự rửa giải Hấp thu PPD 1210(G-Ra1/-
Ra2)
13. 20(R)-Rh1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 638
14. G-Rb2 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 1078
15. G-Rd Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 946
16. G-Rk3 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 620
17. G-Rh4 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPT 620
18. 20(S)-Rg3 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 784
19. 20(R)-Rg3 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 784
20. G-Rk1 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 766
21. G-Rg5 Q-TOF-MS + Chất chuẩn Hấp thu PPD 766
* Các pic u1, u2 là các pic saponin chưa xác định.
3.4.2. Khảo sát hàm lượng saponin trong Sâm VN chế biến ở điều kiện
105 ℃, 8 giờ
Kết quả hàm lượng saponin trong Sâm VN chưa chế biến, Sâm VN chế biến lô L2-L10
được thể hiện trong Bảng 3.35.
108
Bảng 3.35. Hàm lượng1) saponin Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃, 8 giờ
Saponin 0h 8h-1 8h-2 8h-3 8h-4 8h-5 8h-6 8h-7 8h-8 8h-9
M-R1 1,61 1,43 1,28 0,97 1,32 1,64 2,08 1,88 2,01 1,10
G-Rg1+-Re 1,52 0,64 0,68 0,59 0,68 0,66 0,63 0,66 0,75 0,61
M-R2 2,11 2,81 3,00 2,83 2,90 2,36 2,18 3,00 2,71 3,00
V-R11+P-RT4 0,33 0,44 0,38 0,38 0,47 0,43 0,40 0,49 0,48 0,43
V-R2 (+V-R1) 1,28 1,41 1,52 1,27 1,51 1,09 1,10 1,59 1,52 1,58
N-R2 0,41 0,28 0,32 0,33 0,30 0,31 0,26 0,33 0,26 0,25
G-Rb1 0,86 0,53 0,60 0,46 0,61 0,58 0,57 0,67 0,60 0,43
G-Rc 0,16 0,27 0,30 0,29 0,22 0,25 0,21 0,34 0,24 0,32
G-Rb2 0,45 0,28 0,36 0,27 0,31 0,31 0,27 0,28 0,30 0,27
20(S) G-Rh1 0,23 0,65 0,64 0,57 0,68 0,61 0,66 0,68 0,70 0,68
20(R) G-Rh1 N.D.2) 0,34 0,35 0,28 0,35 0,33 0,35 0,42 0,38 0,34
G-Rd 0,29 0,23 0,29 0,19 0,29 0,25 0,20 0,24 0,26 0,20
G-Rk3 N.D 0,23 0,25 0,19 0,24 0,22 0,23 0,27 0,25 0,22
G-Rh4 N.D 0,28 0,30 0,23 0,28 0,28 0,28 0,32 0,31 0,28
20(S) G-Rg3 N.D 0,26 0,27 0,22 0,27 0,26 0,27 0,29 0,26 0,25
20(R) G-Rg3 N.D 0,19 0,20 0,17 0,20 0,19 0,20 0,22 0,19 0,18
G-Rk1 N.D 0,14 0,16 0,14 0,15 0,14 0,14 0,16 0,14 0,14
G-Rg5 N.D 0,15 0,18 0,14 0,17 0,16 0,15 0,17 0,15 0,15
1)
Hàm lượng được tính theo giá trị mg/g dược liệu khô Sâm VN
1)
N.D: không phát hiện được
Chú thích: 0h: mẫu Sâm VN chưa chế biến
8h-1: hỗn hợp mẫu Sâm VN chế biến của lô L2-L9.
ơ
8h-2 ― 8h-9: mẫu Sâm VN chế biến của lô L2-L9.
3.4.3. Khảo sát sự thay đổi thành phần saponin của Sâm VN sau chế biến
Sâm VN được khảo sát sự thay đổi thành phần saponin ở hai điều kiện chế biến 105 ℃
và 120 oC. SKĐ HPLC/ELSD đại diện của điều kiện 105 ℃ và 120 ℃ được thể hiện
trong Hình 3.23 và 0. Sau khi chế biến, các thành phần phân cực có aglycon thuộc
khung PPD, PPT như G-Rb1, -Rd, -Re và -Rg1 có thời gian lưu ở trước 40 phút bị giảm
và chuyển hóa thành các ginsenosid cấu trúc kém phân cực hơn và thời gian lưu trên
SKĐ HPLC ở sau 40 phút như G-Rh1, -Rk3, -Rh4, -Rk1, -Rg3, -Rg5.
109
3 4 5
400
200
11
2 9 13 15
1 67 10 12
16
A
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
B
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
C
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
18 19
14 17 20
21 22 D
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
E
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
F
F
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
400
200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Hình 3.23. SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 105 ℃
Sâm VN chưa chế biến (A), các mẫu chế biến ở 105 ℃, 2 giờ (B), 4 giờ (C), 8 giờ (D), 12 giờ (E),
16 giờ (F) và 20 giờ (G). Chú thích các pic: 1. pic 1; 2. pic 2; 3. M-R1; 4, G-Rg1+-Re; 5. M-R2; 6.
V-R11; 7. P-RT4; 8. V-R2 +V-R1; 9. pic 3; 10. pic 4; 11. G-Rb1; 12. 20(S) G-Rh1; 13. pic 5; 14.
20(R) G-Rh1; 15. G-Rb2; 16. G-Rd; 17. G-Rk3; 18. G-Rh4; 19. 20(S) G-Rg3; 20. 20(R) G-Rg3; 21.
G-Rk1; 22. G-Rg5.
110
3
500
500
450
5
400
400
2 7
350
1
300
300
250
200
200 6 8
150 9
12
100
100
4 10
50
A
0
0
450
400
400
350
300
300
250
200
200
150
100 11 15
14
100
50 13 16 1718 B
0
0
450
400
400
350
300
300
250
200
200
150
100
100
50 C
0
400
400
350
300
300
250
200
200
150
100
100
50 D
0
350
0
300
300
250
200
200
150
100
100
50
E
0
350
3
300
300
250
1
200
5 15 16
18
200
150
11 14
4 17
100
100
10 13
F
50
0
0
300
300
250
200
200
150
100
100
50
G
0
0
00 55 10
10 15
15 20
20 25
25 30
30 35
35 40
40 45
45 50
50 55
55 60
60
Hình 3.24. SKĐ HPLC/ELSD đại diện Sâm VN chế biến ở 120 ℃
Sâm VN chưa chế biến (A), 2 giờ (B), 4 giờ (C), 8 giờ (D), 12 giờ (E), 16 giờ (F) và 20 giờ (G). Chú thích
các pic: 1. M-R1; 2. G-Rg1+-Re; 3. M-R2; 4. pic 1; 5. V-R1+V-R2; 6. pic 2; 7. G-Rb1; 8. G-Rc; 9. G-Rb2; 10.
20(S)-Rh1; 11. 20(R)-Rh1; 12. G-Rd; 13. G-Rk3; 14. G-Rh4; 15. 20(S)-Rg3; 16. 20(R)-Rg3; 17. G-Rk1; 18. G-
Rg5.
111
Nhận xét: Dựa vào SKĐ HPLC/ELSD của sâm VN chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃ cho
thấy các ginsenosid kém phân cực được phát hiện sau 2 giờ chế biến và cường độ tăng
dần sau chế biến.
Kết quả thay đổi hàm lượng qua quá trình chế biến điều kiện 105 ℃ và 120 ℃ được thể
hiện trong Biểu đồ 3.2.
140
Hàm lượng
Content (mg/
(mg/g) g)
120
PPD (1)
PPT (1)
100 PPD (2)
PPT (2)
OCT
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Thời gian (giờ)
Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT
và OCT trong quá trình chế biến Sâm VN ở 105 ℃.
PPD (1): G-Rb1, G-Rb2, and G-Rd PPT (1): G-Re và G-Rg1 OCT: M-R1, M-R2, V-R1 và V-R2.
PPD (2): 20(S) G-Rg3, 20(R) G-Rg3, G-Rk1 và G-Rg5. PPT (2): 20(S) G-Rh1, 20(R) G-Rh1, G-Rk3 và G-Rh4.
Nhận xét: Saponin có aglycon thuộc khung OCT có hàm lượng cao nhất trong Sâm VN
so với các ginsenosid phân cực PPD và PPT. Dựa vào Biểu đồ 3.2 cho thấy ở nhiệt độ
chế biến 105 ℃, hàm lượng của saponin có aglycon thuộc khung OCT không thay đổi
đáng kể dù thời gian chế biến đến 20 giờ, trong khi đó hàm lượng của ginsenosid phân
cực có aglycon thuộc khung PPD và PPT giảm rõ rệt. Sau 12 giờ chế biến, ginsenosid
có aglycon thuộc khung PPT chuyển hóa hoàn toàn thành các ginsenosid kém phân
cực. Đối với ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD vẫn còn phát hiện sau 20 giờ chế
biến. Các ginsenosid kém phân cực hình thành sau chế biến có aglycon thuộc khung
PPD và PPT cũng tăng dần và đạt cực đại sau 12 giờ chế biến ở 105 ℃.
Sự thay đổi hàm lượng saponin phân cực và kém phân cực của Sâm VN chế biến ở 120
℃ được thể hiện trong Biểu đồ 3.3 và Biểu đồ 3.4.
112
50 Hàm lượng
Content (mg/ g)
(mg/g)
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
ThờiTime
gian(hr)
(giờ)
MR1 MR2 Rd Rg1+Re
Rb1 Rc Rb2 VR1+VR2
Biểu đồ 3.3. Sự thay đổi hàm lượng saponin phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃
Nhận xét: M-R1, M-R2 và V-R2 là các saponin chính có aglycon thuộc khung OCT.
Hàm lượng các saponin này thay đổi giảm dần khi chế biến ở nhiệt độ 120 ℃ nhưng
không đáng kể so với các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD và PPT như G-Rb1,
-Rb2, -Rc, -Rd và -Rg1,. Các ginsenosid này không còn phát hiện ở 8-10 giờ sau chế
biến ở nhiệt độ 120 ℃.
20 Content (mg/g)
Hàm lượng (mg/ g)
18
16
14
12
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Thời gian(hr)
Time (giờ)
20(S)-Rh1 20(R)-Rh1 Rh4 Rk3
20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5
Biểu đồ 3.4. Sự thay đổi hàm lượng saponin kém phân cực khi chế biến Sâm VN ở 120 ℃
113
Nhận xét: 20(S) G-Rh1 hiện diện trong Sâm VN chưa chế biến với hàm lượng khoảng 6
mg/g và tăng dần sau 4 giờ chế biến ở 120 ℃ và giảm mạnh cho đến 20 giờ chế biến,
trong khi đó đồng phân 20(R) G-Rh1 không hiện diện ở Sâm VN chưa chế biến và hàm
lượng tăng dần sau 4 giờ và thay đổi không đáng kể sau đó. Hàm lượng các ginsenosid
kém phân cực mới được hình thành sau chế biến như G-Rk3, -Rh4, -Rg3, -Rk1 và -Rg5
tăng dần và đạt cực đại sau 12 giờ chế biến.
So sánh sự thay đổi hàm lượng và thành phần saponin ở điều kiện 105 ℃ và 120 ℃
bằng hệ số tương quan SI (similarity index) được thể hiện trong Bảng 3.36.
Bảng 3.36. Chỉ số tương quan giữa thành phần hóa học saponin của các mẫu Sâm VN
chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃.
Nhiệt độ-
120-0 120-2 120-4 120-6 120-8 120-10
Thời gian
105-0 0,903 0,693 0,530 0,468 0,420 0,421
105-2 0,902 0,753 0,585 0,525 0,480 0,478
105-4 0,837 0,861 0,687 0,632 0,592 0,585
105-6 0,789 0,903 0,743 0,691 0,652 0,635
105-8 0,774 0,918 0,774 0,722 0,683 0,664
105-10 0,663 0,819 0,883 0,835 0,796 0,772
105-12 0,628 0,785 0,903 0,877 0,836 0,815
105-14 0,602 0,780 0,900 0,905 0,872 0,851
105-16 0,601 0,774 0,902 0,906 0,868 0,852
105-18 0,594 0,762 0,901 0,906 0,863 0,857
105-20 0,596 0,770 0,901 0,909 0,881 0,869
Chú thích: 105, 120: tương ứng với nhiệt độ chế biến ở 105 ℃ và 120 ℃. 0-2-4,…-20:
tương ứng với thời gian chế biến 0 giờ (Sâm VN chưa chế biến), 2, 4,…, 20 giờ.
Nhận xét: Chỉ số tương quan SI phản ánh mức độ tương quan giữa các điều kiện chế
biến khác nhau về thời gian và nhiệt độ. Chỉ số tương quan càng lớn (tiệm cận 1) phản
ánh điều kiện chế biến cho kết quả về sự thay đổi thành phần hóa học tương tự nhau.
Kết quả ở Bảng 3.33 cho thấy ở điều kiện chế biến 120 ℃ trong 2 giờ cho kết quả
tương tự ở điều kiện chế biến 105 ℃ trong 6 giờ hay chế biến ở 120 ℃ trong 4 giờ cho
kết quả tương tự ở điều kiện chế biến 105 ℃ trong 12 giờ.
3.5. SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA SÂM VN QUA QUÁ
TRÌNH CHẾ BIẾN
3.5.1. Tác dụng chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa của Sâm VN chưa chế biến (0 giờ) và Sâm VN chế biến từ 2-
114
60 * ** ***
Hoạt *
tính
50
chống
gốc
tự 40
**
do *
DPPH 30
(%) * *
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Thời gian
Biểu đồ 3.5. Hoạt tính chống gốc tự do DPPH của Sâm VN ở thời điểm chế biến
khác nhau tại 120 ℃ .
Nồng độ thử nghiệm: 6 mg bột Sâm VN/ ml. Kết quả được thể hiện bằng giá trị trung bình
± SD (n=3). *p<0,05; **p<0,01 và ***p<0,001 so với mẫu Sâm VN chưa chế biến
(Student’s t-test).
Nhận xét: Thời gian chế biến càng tăng, hoạt tính chống oxy hóa của Sâm VN càng
tăng và tăng cực đại đến 20 giờ sau chế biến ở 120 ℃. Ở nhiệt độ chế biến 105 ℃, tác
dụng này không thay đổi đáng kể sau quá trình chế biến.
100
** ** ** ** ** **
80
*
40
20
3 mg/ml 1,5 mg/ml 0,75 mg/ml
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Timegian
Thời (hr)
Biểu đồ 3.6. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở điều kiện 105 ℃
trong khoảng thời gian từ 2-20 giờ trên dòng tế bào ung thư phổi A549.
Kết quả được thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (n=3), *p<0,05; **p<0,01 và
***p<0,001 so với mẫu Sâm VN chưa chế biến (Student’s t-test). Nồng độ mẫu được tính
trên mg bột Sâm VN/ ml môi trường.
Nhận xét: Ở điều kiện nhiệt độ chiết biến 105 ℃, Sâm VN chưa chế biến không thể
hiện tác dụng kháng phân bào ở nồng độ thấp 0,75 mg và 1,5 mg/ml. Tuy nhiên, nồng
độ thử nghiệm 3 mg bột Sâm VN/ml là quá cao. Tác dụng ức chế phân bào trên dòng tế
bào ung thư phổi A549 tăng dần theo thời gian chế biến và đạt cực đại ở khoảng 10-12
giờ sau chế biến.
- Điều kiện chế biến 120 ℃:
Kết quả thử nghiệm tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào của Sâm VN chế biến ở điều
kiện 120 ℃ trong khoảng thời gian từ 2-20 giờ trên dòng tế bào ung thư phổi A549
được thể hiện trong Biểu đồ 3.7.
116
100
*
80
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Thời gian
3 mg/mL 1 mg/mL 0.5 mg/mL
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 120
℃ trên dòng tế bào ung thư phổi A549.
Kết quả được thể hiện bằng giá trị trung bình ± SD (n=3), *p<0,05; **p<0,01 và ***p<0,001
so với mẫu Sâm VN chưa chế biến (Student’s t-test). Nồng độ mẫu được tính trên mg bột Sâm
VN/ ml môi trường.
Nhận xét: Ở mẫu Sâm VN chế biến ở điều kiện nhiệt độ cao hơn là 120 ℃, với nồng độ
mẫu thử là 1 mg/ml cho kết quả ức chế hơn 50% sau 2 giờ chế biến, trong khi đó, ở
nồng độ mẫu thấp hơn là 0,5 mg/ml, Sâm VN ức chế sự phát triển tế bào ung thư phổi
A549 đạt cực đại sau khoảng 12-14 giờ chế biến.
3.5.2.2. Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃
trong 8 giờ
Sâm VN chế biến (lô L2-L10) ở 105 ℃ trong 8 giờ được đánh giá hoạt tính ức chế tăng
trưởng tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 so sánh với Sâm VN chưa chế biến.
100
80
%
ức 60
chế
40 0h
8h
20
-20
-40
0 1 2 3 4 5
Nồng độ mẫu (mg bột sâm VN/ml)
Biểu đồ 3.8. Tác dụng kháng phân bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃ trong 8
giờ so với Sâm VN chưa chế biến trên dòng tế bào ung thư phổi A549.
117
Nhận xét: Giá trị IC50 của Sâm VN chưa chế biến và Sâm VN chế biến lần lượt 2,93
và 1,72 mg (dược liệu)/ ml. Kết quả cho thấy Sâm VN chế biến ở thời gian 8 giờ, 105
℃ cho hoạt tính kháng phân bào mạnh hơn Sâm VN chưa chế biến.
3.5.2.3. Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào một số saponin phân lập từ Sâm VN
chế biến
Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào được khảo sát trên một số saponin đại diện cho các
aglycon thuộc khung PPD (G-Rg3), PPT (G-Re) và OCT (M-R1, M-R2, V-R2 và OCT
genin) được phân lập từ Sâm VN chế biến nhằm đánh giá vai trò hoạt tính của các
saponin này trong Sâm VN chế biến. Nồng độ mẫu thử của các saponin lần lượt là 20,
40, 60, 80, 100 và 125 µg/ml.
100
80
% 60
ức
chế 40 M-R2
M-R1
V-R2
20 OCT
G-Rg3
G-Re
0
-20
-40
0 20 40 60 80 100 120 140
Nồng độ (µg/ml)
Biểu đồ 3.9. Tác dụng kháng phân bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549 của
các saponin phân lập từ Sâm VN chế biến.
Nhận xét: Tương tự như G-Re có aglycon thuộc khung PPT phân cực, các saponin có
aglycon thuộc khung OCT không thể hiện hoạt tính kháng phân bào in vitro (ngoại trừ
V-R2). Trong khi đó, G-Rg3 (có aglycon thuộc khung PPD kém phân cực, ginsenosid
được hình thành do quá trình chế biến) thể hiện tác dụng kháng phân bào mạnh hơn các
saponin khác.
% tế bào sống
OCT
P-RT4
M-R2
V-R2
Hình 3.25. Độc tính trên tế bào đại thực bào phúc mạc
3.5.3.2. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của các yếu tố tham
gia đường truyền tín hiệu viêm thông qua NF-κB và sự chuyển vị NF-κB.
Ở nồng độ 10 và 20 µM, các saponin M-R2, P-RT4 và OCT ức chế con đường hoạt hóa
NF-κB. Đồng thời, P-RT4 và OCT thể hiện tác động ức chế biểu hiện của các yếu tố p-
p65, p65, iNOS, COX2 mạnh hơn so với M-R2 (Hình 3.27).
Hình 3.26. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của các yếu tố tham gia
đường truyền tín hiệu viêm thông qua NF-κB khi xử lý với LPS
Kết quả nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho thấy LPS làm tăng sự chuyển vị của NF-
κB vào nhân đại thực bào. Khi xử lý với P-RT4 và OCT ở nồng độ 10 µM, kết quả thể
hiện hoạt tính ức chế chuyển vị của NF-κB vào nhân tế bào (Hình 3.27).
119
PI
p65
Merge
e
LPS - + + + +
Saponin (10 µM) - - M-R2 P-RT4 OCT
Hình 3.27. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT lên sự chuyển vị NF-κB vào nhân tế bào
3.5.3.3. Tác dụng của M-R2, P-RT4 và OCT trên biểu hiện của cytokin tiền viêm
P-RT4 và OCT ức chế biểu hiện của cytokin tiền viêm như TNF-α, IL-1β và IL-6 gây ra
do LPS trên đại thực bào (Hình 3.28 A). Hai saponin này còn ức chế biểu hiện COX-2
và iNOS gây viêm bởi LPS. Tác động của P-RT4 và OCT được khảo sát trên quá trình
phosphoryl hóa IRAK1, TAK1 và IκBα gây bởi LPS trên đại thực bào (Hình 3.28 B).
LPS gây giảm phosphoryl hóa của phân tử này. Sự có mặt của P-RT4 và OCT trong
môi trường nuôi cấy ức chế quá trình này một cách đáng kể.
(A) (B)
Hình 3.28. Tác động của P-RT4 và OCT trên hoạt hóa NF-κB trong đại thực bào gây bởi LPS
(A) Tác dụng trên biểu hiện của cytokin tiền viêm (B) Tác dụng hoạt hóa TLR4-NF-κB
gây bởi LPS
120
So sánh tác dụng của các saponin cho thấy tác dụng ức chế con đường truyền tín hiệu
của NF-κB giảm dần theo thứ tự OCT > P-RT4 > M-R2.
3.5.3.4. Tác dụng của P-RT4 và OCT trên gắn kết LPS với receptor TLR4
P-RT4 và OCT ức chế phosphoryl hóa IRAK1, TAK1 và hoạt hóa NF-κB gây viêm bởi
LPS trên đại thực bào. Vì thế để nhận diện phân tử đích của P-RT4 và OCT, khảo sát sự
gắn LPS (Alexa Fluor 488-conjugated LPS, Calbiochem Co., San Diego, CA, Mỹ) lên thụ
thể TLR4 theo thời gian của đại thực bào bằng kỹ thuật phân tích dòng chảy tế bào.
Ngoài ra, Hình ảnh quan sát dưới kính hiển vi đồng tiêu cũng cho thấy sự hiện diện của P-
RT4 và OCT ức chế đáng kể sự gắn Alexa Fluor 594-conjugated LPS lên thụ thể TLR4
trong đại thực bào. Quan sát này phù hợp với kết quả thu được trong thử nghiệm trên đại
thực bào được chuyển nhiễm với MyD88 siRNA trong 48 giờ. Trên đại thực bào được
knockdown MyD88 với hiệu suất 93%, P-RT4 hoặc OCT cũng thể hiện tác dụng ức chế sự
gắn kết LPS với thụ thể TLR4 (Hình 3.29).
DAPI
TLR4
LPS
Merge
MyD88 siRNA
A594-LPS
Saponin
Saponin
Hình 3.29. Tác dụng của P-RT4 và OCT trên gắn kết LPS lên TLR4 ở đại thực bào
chuyển nhiễm với MyD88 siRNA
121
được hàm lượng các saponin có trong Sâm VN. Đầu dò UV ở bước sóng 203 nm
thường được sử dụng cho phân tích định tính/ định lượng các ginsenosid có aglycon
thuộc khung PPD và PPT. Riêng đối với saponin có aglycon thuộc khung OCT việc
phát hiện thường dựa vào đầu dò RI [70] hoặc UV ở bước sóng 196 nm [5],[9],[46].
Với hai đầu dò này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) khá cao,
do vậy chỉ phát hiện và định lượng được thành phần saponin chính là M-R2. Hơn nữa,
với đầu dò RI, chế độ dung môi là đẳng dòng nên cũng chỉ phân tích được một số thành
phần chính do khả năng phân tách kém [1]. Saponin có aglycon thuộc khung OCT là
thành phần saponin chính của Sâm VN, ngoài thành phần M-R2, các saponin có
aglycon thuộc khung OCT khác cũng có hàm lượng lớn như M-R1, V-R2 [67] chưa
được phát hiện cũng như định lượng trong các nghiên cứu trước đây. Trong nghiên cứu
này sử dụng đầu dò ELSD, các thành phần saponin có aglycon thuộc khung OCT đã
được phát hiện và định lượng.
G-Rg1 -> G-Re), kế đến là các saponin có aglycon thuộc khung OCT (M-R1 ->M-R2 -
> P-RT4 ->V-R1, V-R2), các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD (G-Rd, G-Rb1,
G-Rc, G-Rb2)có thời gian rửa giải sau cùng. Việc dựa vào thời gian rửa giải trên SKĐ
HPLC cũng giúp sơ bộ định tính các thành phần saponin trong Sâm. Điều này phù hợp
trong các công bố trước đây khảo sát ảnh hưởng của loại pha tĩnh, kích thước hạt và
dung môi đối với thời gian rửa giải của các ginsenosid bởi Kanazawa và CS (1993)
[32].
Ứng dụng phương pháp phân tích HPLC kết hợp đầu dò ELSD và LC/MS các thành
phần saponin chính của Sâm VN đã được phân tích. Hình 3.12 thể hiện SKĐ HPLC
của các bộ phận dưới mặt đất (thân rễ, rễ củ) và bộ phận trên mặt đất (thân, lá). Kết quả
phân tích cho thấy SKĐ bộ phận trên mặt đất và dưới mặt đất rất khác nhau. Điều này
cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đây của Võ Duy Huấn và CS trong
nghiên cứu thành phần hóa học của lá Sâm VN [115].
Có 5 pic mới (u1-u5) được phát hiện trên SKĐ dựa vào kết quả LC/MS. Các pic này
chủ yếu hiện diện trong SKĐ của rễ con Sâm VN. Sử dụng phương pháp TLC điều chế
kết hợp semi prep-HPLC, 5 pic mới trên SKĐ HPLC được phân lập và phân tích Q-
TOF-MS. Độ phân giải cao của phương pháp Q-TOF-MS giúp xác định chính xác công
thức phân tử của các ginsenosid với độ lệch khối rất thấp. Các pic mới này lần lượt
được xác định công thức phân tử C64H108O31, C59H100O27, C59H100O27, C63H106O30 và
C58H98O26. Đây là các ginsenosid với số khối khá cao, lần đầu được xác định trong Sâm
VN. Các thành phần này cho hấp thu ở UV 203 nm, đồng thời kết quả phân tích 1H-
NMR cho thấy đây là các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD có từ 4-6 phân tử
đường trong cấu trúc.
SKĐ HPLC của thân rễ và rễ củ tương đối giống nhau được thể hiện trong Hình 3.12.
M-R2 là pic chính được thể hiện trong SKĐ HPLC. Nồng độ của thành phần này chiếm
đến 93,5 mg/g trong thân rễ (48%) và 70,6 mg/g (45%) trong rễ củ. Thành phần chính
thứ hai là V-R2. Mặc dù V-R1 và V-R2 không tách nhau trên SKĐ, tuy nhiên kết quả
LC/MS cho thấy thành phần của pic này chủ yếu là V-R2. Trong rễ con, hai pic M-R2
và V-R2 (+ V-R1) cũng là hai thành phần chính trên SKĐ HPLC nhưng với hàm lượng
thấp hơn nhiều so với thân rễ và rễ củ. Ngược lại, hai pic u1 và u2 trên SKĐ chiếm
hàm lượng lớn. Hơn nữa các pic u1, u3 và u4 chỉ được phát hiện trong bộ phận rễ con
và đóng vai trò trong sự khác nhau về hàm lượng của các ginsenosid có aglycon thuộc
khung PPD trong rễ con (77,4 mg/g) so với thân rễ (31,2 mg/g) và rễ củ (31,3 mg/g).
124
Hàm lượng ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT không khác nhau nhiều trong thân
rễ, rễ củ và rễ con. Tuy nhiên, hàm lượng của các saponin có aglycon thuộc khung
OCT khác nhau rất nhiều trong thân rễ (145,5 mg/g), rễ củ (105,4 mg/g) và rễ con (50,7
mg/g).
Mặc dù hàm lượng ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD và PPT trong rễ con cao
hơn trong thân rễ và rễ củ, hàm lượng saponin tổng số lại thấp nhất do hàm lượng
saponin có aglycon thuộc khung OCT trong rễ con thấp. Điều đặc biệt là hàm lượng
saponin trong rễ con của Sâm VN thấp hơn so với thân rễ và rễ củ, trong khi đó ở các
loài Panax khác như P. ginseng và P. quiquefolius, hàm lượng saponin trong rễ con là
cao nhất [22].
Tỉ lệ hàm lượng của ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT:PPD:OCT trong thân rễ là
1:1,7:7,8; trong rễ củ 1:1,6:5,5 và rễ con là 1:4,8:3,3. Rễ con có hàm lượng ginsenosid
có aglycon thuộc khung PPD cao nhất và OCT thấp nhất. Hàm lượng saponin có
aglycon thuộc khung OCT chiếm lần lượt khoảng 74%, 67% và 36% trong thân rễ, rễ
củ và rễ con so với saponin tổng góp phần lớn cho sự khác nhau về hàm lượng saponin
toàn phần của từng bộ phận.
Một điều đáng ghi nhận là hàm lượng tổng số 17 saponin trong bộ phận thân rễ, rễ củ
và rễ con của Sâm VN lần lượt là 195, 156 và 139 mg/g cao hơn gấp nhiều lần so với
các loài Panax khác [38],[116],[118].
Các nghiên cứu cho thấy hoạt tính sinh học của saponin có aglycon thuộc khung PPD,
PPT và OCT tương đối khác nhau. Ví dụ, về hoạt tính kháng tế bào ung thư, saponin có
aglycon thuộc khung PPD mạnh hơn PPT hay hoạt tính trên sự hình thành mạch máu
(angiogenesis) thì saponin có aglycon thuộc khung PPD có tác dụng ức chế tăng sinh
mạch, trong khi saponin có aglycon thuộc khung PPT thể hiện hoạt tính tiền tăng sinh
mạch. Chính vì vậy việc đánh giá thành phần, hàm lượng các saponin thuộc các nhóm
này rất quan trọng và định hướng cho các nghiên cứu về tác dụng sinh học và dược lý.
Kết quả phân tích cho thấy Sâm VN khác các loài Sâm khác ở thành phần saponin cũng
như hàm lượng saponin cao hơn gấp nhiều lần [135].
Sử dụng phương pháp TLC điều chế, prep-HPLC phân tích lượng nhỏ mẫu kết hợp kỹ
thuật xác định phổ khối Q-TOF-MS hiện đại, các ginsenosid mới trong Sâm VN đã
được xác định. Phương pháp này rất hiệu quả, đơn giản và nhanh chóng, giúp định
hướng cho việc phân lập các ginsenosid mới chưa được xác định cấu trúc trong Sâm
125
VN, phương pháp này tương tự với nghiên cứu của Yang và CS (2012) xác định các
ginsenosid mới trong 3 loài Panax chính [136]. Kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy
một số ginsenosid mới với khối lượng phân tử lớn tương đương với 5-6 đường trong
cấu trúc hiện diện chủ yếu trong rễ con Sâm VN, chưa được phân lập và xác định cấu
trúc.
khoảng thời gian khác nhau từ 2 đến 20 giờ, đồng thời so sánh sự tương quan ở hai
nhiệt độ chế biến.
4.2.1. Phân lập và xác định thành phần hóa học của Sâm VN chế biến
Dựa vào kết quả sơ bộ trong các nghiên cứu ban đầu về sự thay đổi thành phần của
Sâm VN chế biến [45], ở điều kiện chế biến ở 105 ℃ với thời gian 8 giờ cho thấy có sự
thay đổi nhiều về thành phần hóa học saponin, do vậy chúng tôi chọn điều kiện này để
chế biến và nghiên cứu phân lập các thành phần saponin của Sâm VN chế biến.
Sử dụng các phương pháp chiết xuất và phân lập thường quy, kết hợp các phương pháp
MPLC, semi-prep HPLC và prep HPLC, đề tài đã phân lập được 28 hợp chất: 25
saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT và OCT, 1 polyacetylen (panaxynol), hỗn
hợp sistosterol và stigmaterol và daucosterol.
Các ginsenosid mới được tạo thành qua quá trình chế biến đa số là các cặp đồng phân
20(S) và 20(R) do quá trình khử đường (deglycosylation) của ginsenosid có aglycon
thuộc khung PPD/PPT phân cực [86]. Trên SKLM, các ginsenosid này không táctoh
nhau do vậy không thể sử dụng kỹ thuật SKC thông thường. Do vậy việc phân tách các
ginsenosid này cũng khá phức tạp. Nghiên cứu này sử dụng kỹ thuật SKC cổ điển kết
hợp HPLC điều chế để phân lập các đồng phân ginsenosid được hình thành do quá
trình chế biến Sâm VN. Phương pháp HPLC điều chế cho thấy sự hiệu quả trong phân
lập 4 cặp đồng phân như G-Rk3 và -Rh4; G-Rk1 và -Rg5; 20(S) G-Rh1 và 20(R)-Rh1;
20(S) G-Rg3 và 20(R)-Rg3.
Đồng phân 20(S) G-Rg3 và 20(R) G-Rg3: Đây là thành phần ginsenosid đặc trưng
của Hồng sâm, cả hai ginsenosid này không hiện diện trong Sâm VN chưa chế biến và
được hình thành do quá trình cắt phân tử đường tại vị trí C-20 của các ginsenosid có
aglycon thuộc khung PPD phân cực. Đồng phân 20(R) G-Rg3 kém tan trong MeOH hay
MeOH-H2O, trong khi đồng phân 20(S) G-Rg3 lại tan tốt trong MeOH, EtOH, MeOH-
H2O, H2O [35]. Có thể sử dụng tính chất này để tinh chế thu lấy đồng phân 20(R) G-
Rg3 bằng cách hòa tan nhiều lần trong dung môi MeOH. Phần tủa của đồng phân 20(R)
G-Rg3 tan tốt trong hỗn hợp dung môi CHCl3-MeOH-H2O được lọc và kết tinh lại.
Dịch lọc chứa chủ yếu đồng phân 20(S) G-Rg3 được tinh chế bằng phương pháp HPLC
điều chế. Sự xuất hiện G-Rg3 trong Sâm VN chế biến rất quan trọng bởi vì ngoài G-Rg5
và -Rh2, G-Rg3 cũng thể hiện tác dụng chống ung thư rất mạnh. Bên cạnh đó, 2 đồng
phân cũng có sự khác nhau về tác động dược lý: trong khi 20(S) G-Rg3 được cho là có
127
tác dụng chống gốc tự do tốt hơn so với 20(R) G-Rg3 thì 20(R) G-Rg3 mặc dù không tác
động trực tiếp lên các tế bào ung thư, nhưng nó ức chế sự di căn của các tế bào ung thư
[62].
Đồng phân G-Rk1 và G-Rg5: Đây là hai đồng phân được tạo thành từ ginsenosid Rg3
bởi sự mất nước ở vị trí C-20 và chỉ khác nhau ở vị trí nối đôi exo- hoặc endo- ở C-20.
G-Rg5 hiện diện một lượng rất nhỏ trong Hồng sâm trong khi G-Rk1 chỉ được phân lập
trong Thái dương sâm [39]. Hai ginsenosid này lần đầu tiên được phân lập trong Sâm
VN chế biến theo kiểu Hồng sâm với hiệu suất cao. Cả hai ginsenosid này đóng vai trò
quan trọng làm gia tăng tác dụng dược lý của Nhân sâm chế biến, đặc biệt gia tăng tác
dụng hỗ trợ điều trị ung thư.
Đồng phân 20(S) G-Rh1 và 20(R) G-Rh1: Trong những nghiên cứu trước đây của
Nguyễn Minh Đức, G-Rh1 được phân lập trong Sâm VN chưa chế biến với hiệu suất
thấp (20(R) G-Rh1 là 0,008% và 20(S) G-Rh1 là 0,021%). Theo các nghiên cứu trong
Hồng sâm cho thấy G-Rh1 được tạo ra do cắt đường tại vị trí C-20 từ G-Rg1 và G-Re
[39]. Phân tích thành phần hóa học trong Sâm VN chưa chế biến bằng LC/MS cho thấy
có sự hiện diện của đồng phân 20(S) G-Rh1 với hàm lượng thấp và không phát hiện
được đồng phân 20(R) G-Rh1. Trong Sâm VN chế biến, hàm lượng 20(R) G-Rh1 sau
chế biến tăng lên điều này chứng tỏ đồng phân 20(R) G-Rh1 không phải là ginsenosid
nguyên thủy có trong Sâm VN mà được hình thành sau quá trình chế biến. Do vậy có
thể đồng phân 20(R) G-Rh1 được phân lập trong các nghiên cứu trước đây được hình
thành do tác động của nhiệt trong quá trình chiết xuất và phân lập [112].
Đồng phân G-Rk3 và G-Rh4: Đây là cặp đồng phân được hình thành do quá trình
khử nước tại vị trí C-20 của phân tử ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT phân cực.
G-Rk3 và G-Rh4 là hai đồng phân của nhau được tạo thành từ G-Rh1 bởi sự mất nước ở
C-20 và chỉ khác nhau về vị trí nối đôi exo- hoặc endo- ở C-20; chính vì vậy trong các
bài báo trước đây đã có sự nhầm lẫn về dữ liệu phổ vì không tách được G-Rh4 và G-
Rk3 hoặc phải sử dụng nhiều bước và nhiều kỹ thuật sắc ký để tách riêng G-Rk3 và G-
Rh4 [17],[85]. G-Rk3 là một ginsenosid được phân lập lần đầu tiên trong Thái dương
sâm (Nhân sâm được hấp ở 120 ℃) mà chưa thấy xuất hiện trong Hồng sâm và hiệu
suất phân lập được từ Thái dương sâm rất thấp [39]. Tuy nhiên trong Sâm VN khi được
chế biến theo phương thức tương tự như Hồng sâm đã có thể phân lập được G-Rk3 với
hiệu suất đến 0,07%. G-Rh4 trước đây cũng được Trần Lê Quan phân lập từ Sâm Việt
nam (chưa qua chế biến) với hiệu suất 0,014% [112] thấp hơn nhiều so với hiệu suất
128
0,13% mà đề tài phân lập được từ Sâm VN chế biến. Hơn nữa dựa vào kết quả LC/MS
cho thấy G-Rh4 chính là chất thứ sinh được tạo ra do quá trình chế biến.
Bên cạnh các ginsenosid kém phân cực được hình thành do quá trình chế biến được
phân lập nêu trên, đề tài cũng phân lập được các saponin khác như:
4 ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khung PPT gồm: G-Re, -Rg1, N-R1, N-R2
với thu suất thấp. Trong đó N-R2 là ginsenosid lần đầu được phân lập trong Sâm VN.
Điều này cho thấy saponin có aglycon thuộc khung PPT kém bền và bị chuyển hóa
thành các ginsenosid kém phân cực khác có khung PPT. Kết quả hiệu suất phân lập phù
hợp với kết quả phân tích HPLC.
10 ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khung PPD gồm: G-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd là
các thành phần ginsenosid chính có trong Sâm VN chưa chế biến. Bên cạnh các
ginsenosid trên, đề tài còn phân lập được 4 ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD rất
phân cực trong cấu trúc có từ 5-6 đường từ Sâm VN chế biến gồm notoginsenosid D
(N-D), N-R4, G-Ra1 và hợp chất 22 được xác định là 3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-
D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxadiol 20-O-β-D-
xylopyranosyl (1→3)-β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosid. Điều này chứng
tỏ ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD khá bền so với khung PPT. Ở nhiệt độ chế
biến 105 ℃ trong vòng 8 giờ, các thành phần ginsenosid phân cực có aglycon thuộc
khung PPD vẫn còn hiện diện và được phân lập từ Sâm VN chế biến. Như vậy chứng
tỏ ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD phân cực tương đối bền ở nhiệt độ chế biến
của Hồng sâm và thời gian chế biến 8 giờ.
6 saponin có aglycon thuộc khung OCT gồm: M-R1, M-R2, P-RT4, V-R2, V-R11 và
OCT genin. Ở Sâm VN chế biến, các thành phần ginsenosid phân cực có aglycon thuộc
khung PPD và PPT bị chuyển hóa một phần thành các ginsenosid kém phân cực hơn.
Các thành phần mới này có giá trị Rf cao hơn (SKLM) hoặc thời gian rửa giải Rt lâu
hơn (HPLC). Trong khi đó saponin có aglycon thuộc khung OCT hầu như không thay
đổi nhiều qua quá trình chế biến. Trước đây việc phân lập saponin có aglycon thuộc
khung OCT như M-R2 thường phải sử dụng sắc ký lỏng điều chế do hai thành phần M-
R2 và G-Rg1 khó phân tách nhau trên SKC pha thuận hay pha đảo. Đồng thời việc sử
dụng đầu dò UV ở bước sóng 203 nm để phát hiện cũng có nhiều hạn chế. Do vậy để
phân lập các saponin có aglycon thuộc khung OCT, đặc biệt là thành phần chính M-R2,
cao nước sau khi lắc phân bố với EtOAc đã được tiếp tục hấp nhằm mục đích chuyển
129
hóa hoàn toàn các ginsenosid cấu trúc phân cực PPT như G-Re, -Rg1 thành các
ginsenosid kém phân cực giúp cho quá trình phân lập các saponin có aglycon thuộc
khung OCT một cách dễ dàng. Chỉ với phương pháp SKC cổ điển sử dụng pha đảo RP-
18, các saponin có aglycon thuộc khung OCT đã được phân lập với số lượng lớn, đơn
giản và hiệu quả. Một lượng nhỏ aglycon thuộc khung OCT được phân lập trong cao
nước sau khi được tiếp tục chế biến bằng cách hấp ở nhiệt độ 120 ℃ trong 8 giờ.
Đề tài cũng phân lập được thành phần polyacetylen có trong Sâm VN chế biến với
hiệu suất tương đối cao. Đây là thành phần rất kém bền sau khi phân lập, nhưng vẫn
bền trong Sâm VN sau khi chế biến. Các thành phần polyacetylen đã được chứng minh
có hoạt tính kháng phân bào mạnh trong rất nhiều nghiên cứu. Việc chế biến Sâm VN
theo kiểu Hồng sâm không làm ảnh hưởng đáng kể đến thành phần polyacetylen, đặc
biệt là panaxynol, một thành phần polyacetylen chính của Sâm VN cũng như P.
ginseng có tác dụng sinh học mạnh.
OH
R
12 20 R/S a b
c
3
R2
R1O
R2 A
O
OH
21
HO
B OR1 C
Bảng 4.37. Cấu trúc các hợp chất saponin phân lập được từ Sâm VN chế biến
STTSaponin Đánh số Khung R1 R2 R3 CTPT
Aglycon là PPD
1. Ginsenosid Ra1 20 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-Ara4-Xyl C59H100O27
2. Ginsenosid Rb1 19 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-Glc C54H92O23
3. Ginsenosid Rb2 18 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc6-Ara(p) C52H92O25
4. Ginsenosid Rd 17 A-(a) -Glc2-Glc -H -Glc C48H82O18
23 -Glc2-Ara(p)-
5. Notoginsenosid D A-(a) -H -Glc6-Glc C64H104O31
Xyl
130
4.2.2. Sự thay đổi thành phần và hàm lượng saponin trong Sâm VN qua
quá trình chế biến
Sự thay đổi hàm lượng saponin của Sâm VN chế biến ở nhiệt độ 105 ℃ và 120 ℃ trong
khoảng từ 2-20 giờ được khảo sát bằng kỹ thuật HPLC với đầu dò ELSD. Kết quả SKĐ
HPLC/ELSD chế biến ở 105 ℃ được thể hiện trong Hình 3.23.
Thứ tự rửa giải trong mẫu Sâm VN chế biến lần lượt là các pic saponin phân cực có
aglycon thuộc khung PPT có 2 phân tử đường (N-R1, G-Rg1, -Re), kế đến là OCT (M-
R1, M-R2, P-RT4, V-R2 và V-R11) và PPD (G-Rb1, -Rd) (ngoại trừ N-R2 có 1 phân tử
đường xuất hiện ở sau pic V-R2). Các thành phần phân cực này xuất hiện ở trước 45
phút và giảm dần cường độ pic sau khi chế biến. Ở thời gian lưu sau 45 phút xuất hiện
các pic mới là các thành phần ginsenosid kém phân cực do bị cắt đường hoặc khử nước
có aglycon thuộc khung PPD (G-Rg3, -Rk1 và -Rg5) và PPT (G-Rk3 và -Rh4, ngoại trừ
G-Rh1 rửa giải trước). Trong một công bố gần đây phân tích thành phần ginsenosid
trong cao chiết Hồng sâm bằng LC/MS, thứ tự rửa giải của các ginsenosid cho thấy
131
đồng phân 20(S) luôn rửa giải trước đồng phân 20(R) như 25-OH-20(S) G-Rh1 > 25-
OH-20(R)-Rh1, 20(S)-Rg2 > 20(R)-Rg2, 20(S)-Rh1 > 20(R)-Rh1, 20(S)-acetyl-Rg2 >
20(R)-acetyl-Rg2, 25-OH-20(S)-Rg2 > 25-OH-20(R)-Rg2, 20(S)-Rg3 > 20(R)-Rg3,
20(S)-Rh2 > 20(R)-Rh2 và 20(S)-acetyl-Rh2 > 20R-acetyl-Rh2. Thêm vào đó, các
ginsenosid phân tích đều rửa giải trước các đồng phân có nối đôi 20(11) sẽ rửa giải
trước đồng phân có nối đôi 20(22) như G-Rk3 > -Rh4, G-Rk1 > -Rg5. Điều này cũng
phù hợp trong SKĐ phân tích mẫu Sâm VN sau chế biến, thứ tự rửa giải của thành
phần ginsenosid kém phân cực này lần lượt là 20(S) G-Rh1 > 20(R) G-Rh1 > G-Rk3 >
G-Rh4 > 20(S) G-Rg3 > 20(R) G-Rg3 > G-Rk1 > G-Rg5. Dữ liệu này giúp dự đoán thành
phần ginsenosid, giúp định hướng phân lập, tinh chế và xác định đồng phân của các
ginsenosid đã biết [12]. Đồng thời cường độ các pic này tăng dần theo thời gian chế
biến. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây ở các loài Panax khác
[43],[44],[120].
Dựa vào biểu đồ thay đổi các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD, PPT và saponin
có aglycon thuộc khung OCT ở Biểu đồ 3.2 cho thấy các ginsenosid có aglycon thuộc
khung PPT như G-Rg1 và -Re bị thoái giáng nhanh hơn saponin có aglycon thuộc
khung PPD. Sau 12 giờ chế biến ở 105 ℃, không còn phát hiện saponin này trên SKĐ
trong khi hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung PPT kém phân cực đạt cực đại.
Giữa các ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khung PPD, G-Rd tương đối bền hơn
so với G-Rb1 và -Rb2. G-Rd vẫn còn được phát hiện sau 20 giờ chế biến và các
ginsenosid kém phân cực có aglycon thuộc khung PPD vẫn tiếp tục tăng lên sau 20 giờ.
Saponin có aglycon thuộc khung OCT là saponin cấu trúc đặc trưng cho Sâm VN. Theo
kết quả phân tích thành phần saponin trong Sâm VN cho thấy thành phần này chiếm
hơn 50% saponin toàn phần. Dựa vào kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng saponin
có aglycon thuộc khung OCT thay đổi không nhiều sau quá trình chế biến do có liên
kết glycosid bền tại vị trí C-6. Khoảng 84% saponin có aglycon thuộc khung OCT còn
lại sau 20 giờ chế biến. P-RT4 là saponin có aglycon thuộc khung OCT đã được phân
lập trong Sâm VN với thu suất 0,065% [67]. Hàm lượng saponin này tăng lên 70% sau
20 giờ chế biến. Điều này có thể thấy rằng P-RT4 có thể được tạo thành do quá trình
deglycosyl hóa của M-R1, M-R2 và V-R2 tại vị trí C-6.
Ở nhiệt độ chế biến 105 ℃, hàm lượng saponin tổng trong Sâm VN giảm từ 25,68%
xuống còn 19,03% sau 20 giờ chế biến. Điều này có thể lý giải là do sự giảm khối
132
lượng phân tử do mất các phân tử đường trong cấu trúc hoặc thoái giáng thành các
saponin khác.
Trong khi đó, ở nhiệt độ chế biến cao hơn là 120 ℃, tương tự điều kiện chế biến Thái
dương sâm, hàm lượng của các ginsenosid phân cực có aglycon thuộc khung PPD và
PPT như G-Rb1, -Rb2, -Rc, -Rd, -Re và -Rg1 giảm nhanh trong quá trình chế biến thể
hiện trong SKĐ HPLC/ELSD ở 0. Tổng hàm lượng của các ginsenosid cấu trúc phân
cực này giảm từ 85,4 mg/g xuống còn 44,2 mg/g sau 2 giờ và 12,5 mg/g sau 4 giờ chế
biến. Tương tự như kết quả ở 105 ℃, ginsenosid có aglycon thuộc khung PPT là G-Rg1
và -Re kém bền hơn saponin có aglycon thuộc khung PPD. Chỉ có 39% ginsenosid có
aglycon thuộc khung PPT còn lại sau thời gian chế biến 2 giờ và 4% sau thời gian chế
biến 4 giờ trong khi có 59% và 20% ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD còn lại ở
cùng điều kiện.
Đối với các saponin có aglycon thuộc khung OCT: V-R2 (+V-R1) giảm đến 40% và
59% sau 8 giờ và 20 giờ chế biến. Trong khi đó, M-R1 và M-R2 lần lượt giảm 40% và
41% sau 20 giờ chế biến. Điều này cho thấy V-R2 (+V-R1) là saponin có liên kết
acetyl gắn vào mạch đường ở vị trí C-6 kém bền hơn và dự đoán khả năng chuyển hóa
thành M-R2. Như vậy, saponin có aglycon thuộc khung OCT như M-R1, M-R2, V-R1
và V-R2 lại tương đối bền ngay cả sau 20 giờ chế biến ở 120 ℃. Điều này thêm khẳng
định saponin có aglycon thuộc khung OCT bền với nhiệt do không có nhóm glycosid
tại vị trí C-20.
Hàm lượng các ginsenosid kém phân cực được hình thành sau chế biến tăng lên nhanh
chóng ở khoảng 4 giờ sau chế biến, sau đó tăng chậm dần và đạt cực đại tại 10-12 giờ ở
nhiệt độ chế biến 120 ℃. Tuy nhiên hàm lượng của đồng phân 20(S) G-Rh1 tăng cực
đại tại 4 giờ và giảm dần sau đó bằng cách tiếp tục khử nước tại vị trí C-20 để hình
thành G-Rh4 hoặc -Rk3. Hàm lượng G-Rh4 và -Rk3 tăng dần sau 12 giờ chế biến.
Hàm lượng saponin tổng trong Sâm VN trước khi chế biến là 212,4 mg/g và giảm còn
144,2 mg/g sau 20 giờ chế biến ở nhiệt độ 120 ℃.
So sánh sự tương quan ở nhiệt độ chế biến 105 ℃ và 120 ℃.
Chế biến sâm VN bằng cách hấp có hơi nước ở nhiệt độ 105 ℃ cho thấy xu hướng thay
đổi tương tự như ở 120 ℃ về sự hình thành các ginsenosid ít phân cực ngoại trừ tốc độ
chậm hơn.
Sự thay đổi ginsenosid của Sâm VN chế biến ở 120 ℃ trong 2 giờ (120-2) tương tự chế
133
biến ở 105 ℃ trong khoảng 4 - 8 giờ (105-4, 105-6 và 105-8). Ginsenosid pattern của
Sâm VN chế biến ở 120 ℃ trong 4 giờ và 6 giờ tương tự ở 105 ℃ trong khoảng 10 -
12 giờ và 14 ~ 20 giờ. Tốc độ phản ứng tăng từ 2-3 lần khi nhiệt độ tăng 10 ℃. Hiện
tượng này cũng được quan sát trong nghiên cứu này. Tốc độ thoái giáng của ginsenosid
tăng lên khoảng 3 lần khi nhiệt độ chế biến tăng thêm 15 ℃.
G-Rh1 và G-Rg3 đều có 2 dạng đồng phân 20(S) và 20(R). Dạng 20(S) của G-Rh1
nguyên thủy có trong Sâm VN trong khi dạng 20(R) được hình thành và tăng dần sau
thời gian chế biến. Tỉ lệ đồng phân 20(R)/20(S) của G-Rh1 là 0,36 lần ở 2 giờ và tăng
lên 0,83 lần sau 20 giờ chế biến ở 105 ℃. G-Rg3 cũng cho kết quả tương tự. Tỉ lệ đồng
phân 20(R)/20(S) của G-Rg3 là 0,55 ở 2 giờ và tăng lên 0,78 sau 20 giờ chế biến. Kết
quả tương tự ở nhiệt độ chế biến 120 ℃, tỉ lệ 20(R)/20(S) G-Rh1 sau 2 giờ chế biến là
0,52 tăng lên 1,98 lần sau 20 giờ. Tỉ lệ 20(R)/20(S) G-Rg3 sau 2 giờ ở nhiệt độ chế biến
120 ℃ là 0,78 và tăng lên đến 1,11 lần sau 20 giờ chế biến. Điều này cho thấy nhiệt độ
chế biến càng tăng và thời gian chế biến càng dài thì càng gia tăng hàm lượng của đồng
phân dạng 20(R). Trong khi đó tỉ lệ của hai cặp đồng phân lập thể G-Rk1/G-Rg5 và G-
Rk3/G-Rh4, không thay đổi nhiều khi thời gian hoặc nhiệt độ chế biến tăng lên.
4.3. SỰ THAY ĐỔI TÁC DỤNG SINH HỌC DO QUÁ TRÌNH CHẾ
BIẾN SÂM VN
4.3.1. Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào
Sự thay đổi tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào của Sâm VN chế biến ở 105 ℃ và 120
℃ được khảo sát trên dòng tế bào ung thư phổi A549. Tác dụng ức chế tăng trưởng tế
bào tăng lên có ý nghĩa khi thời gian chế biến tăng. Tác dụng kháng phân bào đạt cực
đại sau 12 giờ chế biến ở cả 105 ℃ và 120 ℃. Điều đáng kể là tổng hàm lượng các
ginsenosid kém phân cực được hình thành do quá trình chế biến cũng đạt cực đại sau
12 giờ chế biến. Giữa các ginsenosid kém phân cực này, các ginsenosid có aglycon
thuộc khung PPD như G-Rg3, -Rg5 và -Rk1 là những ginsenosid được chứng minh có
tác dụng kháng phân bào mạnh hơn các ginsenosid PPT kém phân cực khác như G-Rh1,
-Rk3 và -Rh4 và các ginsenosid phân cực khác trong các dòng tế bào ung thư. Hàm
lượng các ginsenosid này cũng đạt cực đại khoảng từ 12-14 giờ sau quá trình chế biến.
Điều này chứng tỏ có mỗi quan hệ giữa tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào và hàm
lượng của các ginsenosid kém phân cực, đặc biệt là G-Rg3, -Rg5 và -Rk1
[40],[62],[100],[132].
134
Mặc dù hoạt tính kháng phân bào và hàm lượng các ginsenosid PPD kém phân cực có
mối quan hệ mật thiết, song ở nồng độ mẫu trong thử nghiệm hoạt tính ức chế tăng
trưởng tế bào in vitro 0,5 mg (dược liệu khô)/ml, cho thấy có thể có yếu tố ảnh hưởng
đến hoạt tính này. Nồng độ 1 mg/ml và 3 mg/ml (đối với mẫu chế biến ở 120 ℃) và
nồng độ 1,5 mg/ml và 3 mg/ml (đối với mẫu chế biến ở 105 ℃) là khá cao trong thử
nghiệm, hơn nữa ngay cả ở mẫu Sâm VN chưa chế biến đã ức chế phân bào đến 70%.
Hoạt tính ức chế tăng trưởng tế bào cũng đã được đánh giá trên các thành phần saponin
tinh khiết phân cực và kém phân cực có aglycon thuộc khung PPD, PPT và OCT. Kết
quả cho thấy ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD và PPT phân cực không thể hiện
hoạt tính. Các saponin có aglycon thuộc khung OCT như M-R1, M-R2 và OCT genin
(ngoại trừ V-R2) cũng không thể hiện hoạt tính khi so với G-Rg3. Điều này có thể cho
thấy rằng hoạt tính chống tăng trưởng tế bào in vitro gia tăng sau quá trình chế biến là
do sự hình thành các ginsenosid kém phân cực có tác dụng.
Rất nhiều nghiên cứu cho thấy quá trình chế biến Nhân sâm làm gia tăng tác dụng ức
chế tăng trưởng tế bào. Nghiên cứu so sánh tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào của P.
quinquefolius trước và sau khi chế biến ở điều kiện 100 – 120 ℃ trong 1 giờ và 120 ℃
trong 0,5 – 4 giờ trong 3 dòng tế bào ung thư SW-480, HT-29, NSCLC. Kết quả cho
thấy tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào của P. quinquefolius sau khi chế biến gia tăng
khi thời gian chế biến tăng. Đồng thời thành phần ginsenosid kém phân cực thay đổi,
đặc biệt là thành phần G-Rg3 gia tăng sau quá trình chế biến. Hoạt tính ức chế tăng
trưởng tế bào của P. quinquefolius chế biến tương ứng với hàm lượng G-Rg3 gia tăng
qua quá trình chế biến [120].
Kết quả tương tự với P. notoginseng, quá trình chế biến làm tăng hàm lượng của các
ginsenosid kém phân cực đặc biệt là thành phần G-Rg3. Hàm lượng G-Rg3 gia tăng gấp
5,23 lần ở nhiệt độ 120 ℃ so với hấp ở 100 ℃ trong 2 giờ và 3,22 lần khi hấp ở 4 giờ
so với 1 giờ ở 120 ℃. Hoạt tính kháng phân bào của P. notoginseng được đánh giá trên
dòng tế bào ung thư ruột kết SW-480 với nồng độ IC50 của cao chiết P. notoginseng
chế biến trong khoảng 1, 2, 4 và 6 giờ ở 120 ℃ lần lượt là 259,2; 131,4; 123,7 và
127,1 µg/ml [111].
chống oxy hóa của Thái dương sâm, Hồng sâm và Bạch sâm. Hoạt tính chống oxy hóa
của Nhân sâm được gia tăng sau khi chế biến. Thái dương sâm mạnh hơn so với Hồng
sâm trên hoạt tính chống oxy hóa gốc tự do O2−, ONOO− và ·OH. Maltol là sản phẩm
của phản ứng Maillard và nồng độ của chất này gia tăng đáng kể trong quá trình chế
biến nhân sâm theo khuynh hướng phụ thuộc nhiệt độ chế biến.
Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro của Nguyễn Thị Thu Hương và CS cho
thấy Sâm VN có tác dụng chống oxy hóa bởi các gốc tự do [76]. Tác dụng chống gốc
oxy hóa DPPH cũng tăng dần theo thời gian chế biến Sâm VN. Tuy nhiên khác với tác
dụng ức chế tăng trưởng tế bào do các thành phần chính là các ginsenosid, trong khi tác
dụng chống oxy hóa được cho là xuất phát từ các hợp chất phenolic và sản phẩm của
phản ửng Maillard. Các nghiên cứu cho thấy khi chế biến Nhân sâm cho thấy hoạt tính
chống oxy hóa tăng lên rõ rệt và cũng được chứng minh là do sản phẩm của phản ứng
Maillard.
thụ thể TLR4, là thụ thể nhận diện kiểu mẫu đáp ứng của LPS ở đại thực bào phúc mô
thông qua có/ không có transfected MyD88 siRNA, giống như G-Re có aglycon thuộc
khung PPT đã được công bố trước đó. Tuy nhiên, những chất chuyển hóa này không
ảnh hưởng đến biểu hiện của thụ thể TLR4 trên đại thực bào phúc mạc gây bởi LPS.
G-Rg1 có aglycon thuộc khung PPT có khung tương tự với saponin có aglycon thuộc
khung OCT như P-RT4 và OCT (nhóm hydroxyl gắn vào vị trí C-6) ức chế con đường
truyền tín hiệu NF-κB ở tế bào NF108-15 neuroglial chuột. G-Rh1, chất chuyển hóa của
G-Rg1 cũng ngăn chặn IgE kích thích phản vệ da thụ động ở chuột bằng cách ức chế
NF-κB và ổn định màng tế bào. Tuy nhiên, chất chuyển hóa K của ginsenosid có
aglycon thuộc khung PPD lại ức chế phản ứng viêm bằng cách ngăn chặn quá trình
phosphoryl hóa IRAK1. Từ những kết quả này cho thấy chất chuyển hóa P-RT4 và
OCT có thể ngăn chặn biểu hiện các cytokine tiền viêm gây bởi LPS và kích hoạt yếu
tố transcription NF-κB bằng cách ức chế gắn kết LPS với thụ thể TLR4 trên tế bào
miễn dịch cũng như tế bào đại thực bào.
Phản ứng viêm rất phức tạp, gồm hàng loạt các phản ứng có trình tự bởi một loạt các
kích thích bao gồm các mầm bệnh và thường được quy định chặt chẽ bởi các trung gian
gây viêm, các cytokine tiền viêm đặc biệt được sản xuất bởi bạch cầu trung tính, bạch
cầu đơn nhân, và tế bào lympho [30,31]. Các cytokin được thể hiện thông qua sự kích
hoạt của NF-κB. Nhiều yếu tố, bao gồm cả LPS, kích hoạt NF-κB. LPS gây ra biểu
hiện IL-1β và TNF-α in vitro và in vivo trong các tế bào miễn dịch qua TLR4 liên kết
con đường truyền tín hiệu NF-κB, qua đó thúc đẩy sự viêm sưng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng sử dụng đường uống hợp chất V-R2, M-R2 từ Sâm
VN có thể được chuyển hóa thành P-RT4, giúp cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức
chế gắn kết LPS vào thụ thể TLR4 trên đại thực bào.
137
KẾT LUẬN
Sau quá trình thực hiện, luận án đã hoàn thành các nội dung nghiên cứu và đạt được tất
cả các mục tiêu đề ra ban đầu.
1. Phân tích thành phần saponin trong Sâm VN
Xây dựng quy trình định tính và định lượng 17 saponin trong các bộ phận thân rễ, rễ củ
và rễ con của Sâm VN bằng kỹ thuật HPLC/ELSD. Kết quả phân tích định tính cho
thấy SKĐ của thân rễ và rễ củ tương tự nhau, tuy nhiên ở rễ con lại khác nhau. Có ít
nhất 5 pic mới trên SKĐ HPLC của bộ phận dưới mặt đất, trong đó có vài pic mới với
cường độ cao ở SKĐ HPLC của rễ con mà không hiện diện trong thân rễ và rễ củ.
Sử dụng kỹ thuật Q-TOF-MS kết hợp 1H-NMR các pic này được xác định là các
ginsenosid mới có số khối tương ứng với các ginsenosid có 4-6 phân tử đường trong
cấu trúc và được xác định là các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD.
Hàm lượng của tổng các saponin này trong thân rễ, rễ củ và rễ con lần lượt là 195, 156
và 139 mg/g, cao hơn rất nhiều trong các loài Panax khác. Tỉ lệ của PPT:PPD:OCT lần
lượt ở bộ phận thân rễ là 1:1,7:7,8; ở rễ củ là 1:1,6:5 và ở rễ con là 1:4,8:3,3.
2. Thành phần hóa học saponin có trong sâm VN chế biến
Tổng cộng 28 thành phần đã được phân lập và xác định cấu trúc từ Sâm VN chế biến.
Ngoài các saponin G-Rb1, -Rb2, -Rd, -Re, -Rg1, N-R1, M-R1, M-R2, V-R2, P-RT4, V-
R11 và V-R10 đã được công bố trong Sâm VN trong các đề tài trước đây, đề tài đã
phân lập và xác định cấu trúc các saponin mới gồm:
4 cặp đồng phân của saponin được hình thành do quá trình chế biến như: 20(S) và
20(R) G-Rh1, 20(S) và 20(R) G-Rg3, -Rk3, -Rh4, -Rg1 và -Rg5 bằng các kỹ thuật sắc ký
thông thường, sắc ký pha đảo và prep-HPLC.
5 ginsenosid mới lần đầu được phân lập từ Sâm VN chế biến gồm 1 ginsenosid có
aglycon thuộc khung PPT là notoginsenosid R2 và 4 ginsenosid có aglycon thuộc
khung PPD có từ 5-6 phân tử đường trong cấu trúc là G-Ra1, notoginsenosid R4,
notoginsenosid D và một hợp chất chưa công bố trước đây là 3-O-β-D-xylopyranosyl-
(1→2)-β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranosyl-20(S)- protopanaxadiol 20-O-β-
D-xylopyranosyl (1→3)-β-D-xylopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosid (theo
SciFinder, tham khảo ngày 08-10-2017). Cả 5 ginsenosid này đều được xác định trên
138
SKĐ LC/MS ở mẫu Sâm VN chưa chế biến, do vậy, có thể khẳng định 5 ginsenosid
mới được phân lập từ Sâm VN.
Luận án thiết lập phương pháp phân lập các thành phần saponin có aglycon thuộc
khung OCT đơn giản, hiệu quả và hiệu suất cao. Luận án góp phần xây dựng dữ liệu
phổ NMR của các saponin có aglycon thuộc khung PPD, PPT và OCT trong Sâm VN.
Khảo sát sự thay đổi hàm lượng saponin quá trình chế biến
Dựa trên cách chế biến của Hồng Sâm và Thái dương sâm của P. ginseng, đề tài thực
hiện nghiên cứu chế biến Sâm VN ở điều kiện tương tự nhằm theo dõi sự thay đổi của
thành phần hóa học saponin khi thay đổi thời gian (2-20 giờ) hoặc nhiệt độ chế biến
(105 ℃ và 120 ℃). Quá trình chế biến Sâm VN ở 105 ℃ và 120 ℃ cho khuynh hướng
thay đổi thành phần hóa học saponin tương tự nhau, tuy nhiên tốc độ thay đổi ở 105 ℃
chậm hơn so với 120 ℃ khoảng 1/3 lần. So với saponin có aglycon khung PPD và PPT,
saponin khung OCT bền hơn, hầu như không thay đổi nhiều sau quá trình chế biến.
Điều này có thể giải thích do OCT saponin không có liên kết kém bền tại vị trí C-20.
3. Tác dụng sinh học của Sâm VN
Sự thay đổi tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi A549
Tác dụng ức chế tăng trưởng tế bào tăng lên khi thời gian chế biến tăng và đạt cực đại ở
thời gian chế biến 12 giờ. Tác dụng này được cho là có liên quan đến sự thay đổi nồng
độ của các ginsenosid được hình thành do quá trình chế biến là G-Rg3, -Rg5, -Rk1 là
các ginsenosid được chứng minh qua rất nhiều công trình nghiên cứu đối với tác dụng
kháng ung thư [130].
Sự thay đổi tác dụng chống oxy hóa
Tác dụng chống oxy hóa cũng đã được khảo sát và cho thấy quá trình chế biến làm tăng
tác dụng chống oxy hóa trên thử nghiệm DPPH đặc biệt khi chế biến ở nhiệt độ 120 ℃.
Tác dụng kháng viêm
Ở nhiệt độ chế biến cao hơn như ở 120 ℃, hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung
OCT như M-R2 và V-R2 giảm dần trong khi hàm lượng P-RT4 tăng lên, điều này cho
thấy P-RT4 chính là chất chuyển hóa của M-R2 do mất đi một phần đường glucose ở vị
trí C-6 khá bền với nhiệt. M-R2 và V-R2 cũng cho thấy được chuyển hóa thành P-RT4
và OCT qua đường uống. P-RT4 và OCT ức chế quá trình phosphoryl hóa của IRAK1,
TAK1 và IκBα, cũng như hoạt hóa NF-κB trong gắn kết LPS với đại thực bào phúc
139
mạc. Những hoạt chất này cũng ức chế mạnh biểu hiện của các yếu tố TNF-α, IL-1β,
COX-2 và iNOS trong gắn kết LPS với đại thực bào phúc mạc. Hơn nữa P-RT4 và OCT
ức chế gắn kết LPS với thụ thể TLR4, là thụ thể nhận diện kiểu mẫu đáp ứng của LPS
ở đại thực bào phúc mô thông qua có/ không có transfected MyD88 siRNA, giống như
G-Re có aglycon thuộc khung PPT đã được công bố trước đó.
Từ những kết quả này cho thấy chất chuyển hóa P-RT4 và OCT có thể ngăn chặn biểu
hiện các cytokin tiền viêm gây bởi LPS và kích hoạt yếu tố transcription NF-κB bằng
cách ức chế gắn kết LPS với thụ thể TLR4 trên tế bào miễn dịch cũng như tế bào đại
thực bào.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng đường uống hợp chất V-R2, M-R2 từ Sâm VN có
thể được chuyển hóa thành P-RT4, giúp cải thiện tình trạng viêm bằng cách ức chế gắn
kết LPS vào thục thể TLR4 trên đại thực bào.
KIẾN NGHỊ
Các kết quả đạt đươc nêu trên là cơ sở khoa học để thực hiện các hướng nghiên cứu
tiếp theo cho Sâm VN:
1. Trên kết quả phân tích thành phần và hàm lượng saponin của các bộ phận dưới mặt
đất Sâm VN cho thấy thành phần saponin của Sâm VN khác biệt so với các loài Panax
khác. Hàm lượng saponin có aglycon thuộc khung OCT chiếm đến hơn từ 36 ~ 75%
saponin toàn phần của Sâm VN, hơn nữa hoạt tính của saponin có aglycon thuộc khung
OCT, PPD và PPT cơ bản khác nhau và chưa có nhiều nghiên cứu. Chính vì vậy, kết
quả này làm tiền đề cho các nghiên cứu về xây dựng tiêu chuẩn cho Sâm VN, đồng thời
để thử nghiệm tác dụng sinh học của Sâm VN.
2. Kết quả nghiên cứu dạng chế biến mới của Sâm VN cho thấy sự thay đổi đáng kể về
thành phần hóa học sau chế biến. Do vậy, cần thêm các thử nghiệm in vitro trên các
dòng tế bào ung thư khác để đánh giá hoạt tính kháng ung thư của Sâm VN chế biến.
Khảo sát thêm một số tác dụng sinh học của Sâm VN chế biến, đồng thời so sánh với
Sâm VN chưa chế biến. Khảo sát điều kiện chế biến tối ưu cho một số tác dụng sinh
học.
3. Nghiên cứu quy trình phân tích định tính và định lượng saponin trong Sâm VN với
đầu dò MS nhằm xác định không chỉ các ginsenosid có aglycon thuộc khung PPD, PPT
mà còn có các saponin có aglycon thuộc khung OCT.
140
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Như Chính, Nguyễn Hữu Đồng, Đặng Ngọc Phái, Nguyễn Minh Đức, Nguyễn
Minh Cang, Nguyễn Đức Hạnh, et al. (2009), "Đánh giá chất lượng Sâm Việt nam di
thực", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 13 (1), tr. 96-102.
2. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt
Nam và một số cây thuốc thuộc họ Nhân sâm, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.
69-70, 119-126, 141.
3. Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Viết Tựu, Võ Văn Chín (1998), "Khảo sát so sánh Sâm
Việt nam từ nguồn thiên nhiên và trồng trọt - Thông báo số 1", Tạp chí Dược liệu, 3
(1), tr. 3.
4. Nguyễn Minh Đức, Nguyễn Viết Tựu, Nguyễn Thị Hồng Hoa, Võ Duy Huấn,
Yamasaki Kazuo, Kasai Ryoji (1999), "Khảo sát so sánh sánh Sâm Việt nam từ nguồn
thiên nhiên và trồng trọt - Thông báo số 2: Cấu trúc hóa học các saponin trong cây sâm
trồng", Tạp chí Dược liệu, 4 (1), tr. 7.
5. Vũ Bình Dương, Đào Văn Đôn, Nguyễn Văn Long, Hoàng Văn Lương, Trịnh Văn
Lẩu (2008), "Nghiên cứu định lượng một số ginsenosid chính trong sinh khối Sâm
Ngọc Linh bằng phương pháp HPLC", Tạp chí Dược học, 390 (48), tr. 41-43.
6. Phan Kế Long, Vũ Đình Duy, Phan Kế Lộc, Nguyễn Giang Sơn, Nguyễn Thị Phương
Trang, Lê Thị Mai Linh, et al. (2014), "Mối quan hệ di truyền của các mẫu sâm thu ở
lai châu trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng matk và ITS – rDNA", Tạp Chí
Công Nghệ Sinh Học, 12 (2), tr. 327-337.
7. Nguyễn Tập (2005), "Các loài thuộc chi Panax L. ở Việt Nam", Tạp chí Dược liệu, 3,
tr. 71-76.
8. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 704-706.
9. Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận (2011), "Xây dựng phương pháp định lượng G-Rb1,
G-Rg1 và M-R2 trong Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ", Tạp
chí Dược liệu, 16 (1+2), tr. 44-50.
TIẾNG ANH
10. Hasturk Hatice, Kantarci Alpdogan, Van Dyke Thomas (2012), "Oral inflammatory
diseases and systemic inflammation: Role of the macrophage", Frontiers in
Immunology, 3 (118),
11. Joh E. H., Lee I. A., Jung I. H., Kim D. H. (2011), "Ginsenoside Rb1 and its
metabolite compound K inhibit IRAK-1 activation--the key step of inflammation",
Biochem Pharmacol, 82 (3), pp. 278-286.
12. Yang H., Lee D. Y., Kang K. B., Kim J. Y., Kim S. O., Yoo Y. H., et al. (2015),
"Identification of ginsenoside markers from dry purified extract of Panax ginseng by a
dereplication approach and UPLC-QTOF/MS analysis", J Pharm Biomed Anal, 109,
pp. 91-104.
13. Zawawi K. H., Kantarci A., Schulze-Spate U., Fujita T., Batista E. L., Jr., Amar S., et
al. (2010), "Moesin-induced signaling in response to lipopolysaccharide in
macrophages", Journal Periodontal Research, 45 (5), pp. 589-601.
14. Zhang Y. G., Zhang H. G., Zhang G. Y., Fan J. S., Li X. H., Liu Y. H., et al. (2008),
"Panax notoginseng saponins attenuate atherosclerosis in rats by regulating the blood
lipid profile and an anti-inflammatory action", Clin Exp Pharmacol Physiol, 35 (10),
pp. 1238-1244.
15. An I. S., An S., Kwon K. J., Kim Y. J., Bae S. (2013), "Ginsenoside Rh2 mediates
changes in the microRNA expression profile of human non-small cell lung cancer
A549 cells", Oncology Reports, 29 (2), pp. 523-528.
16. Bae Hye-Min, Kim Sung-Soo, Cho Chang-Won, Yang Deok-Chun, Ko Sung Kwon,
Kim Kyung-Tack (2012), "Antioxidant activities of ginseng seeds treated by
autoclaving", Journal of Ginseng Research, 36 (4), pp. 411-417.
17. Baek Nan In, Kim Dong Seon., Lee Youn Hyung, Park Jong Dae., Lee Chun Bae, Kim
Shin Il. (1996), "Ginsenoside Rh4, a genuine dammarane glycoside from Korean red
ginseng", Planta Medica, 62 (1), pp. 86-87.
18. Besso Hiromichi, Kasai Ryoji, Saruwatari Yuhichiro, Fuwa Tohru, Tanaka Osamu
(1982), "Ginsenoside Ra1 and Ginsenoside Ra2, new dammarane saponins of ginseng
roots", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 30, pp. 6.
19. Chan H. H., Hwang T. L., Reddy M. V., Li D. T., Qian K., Bastow K. F., et al. (2011),
"Bioactive constituents from the roots of Panax japonicus var. major and development
of a LC-MS/MS method for distinguishing between natural and artifactual
compounds", Journal of Natural Product, 74 (4), pp. 796-802.
20. Chen R. J., Chung T. Y., Li F. Y., Lin N. H., Tzen J. T. (2009), "Effect of sugar
positions in ginsenosides and their inhibitory potency on Na+/K+-ATPase activity",
Acta Pharmacol Sin, 30 (1), pp. 61-69.
21. Cho In Hee (2015), "Volatile compounds of ginseng (Panax sp.): a review", Journal of
the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 58 (1), pp. 67-75.
22. Christensen L. P. (2009), "Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and
potential health effects", Advance in Food and Nutrition Research, 55, pp. 1-99.
23. Christensen L. P., Jensen M., Kidmose U. (2006), "Simultaneous determination of
ginsenosides and polyacetylenes in American ginseng root (Panax quinquefolium L.)
by high-performance liquid chromatography", Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 54 (24), pp. 8995-9003.
24. Chunghee Lee , Jun Wen (2004), "Phylogeny of Panax using chloroplast trnC–trnD
intergenic region and the utility of trnC–trnD in interspecific studies of plants",
Molecular Phylogenetics and Evolution, 31, pp. 894-903.
25. Corbit R. M., Ferreira J. F., Ebbs S. D., Murphy L. L. (2005), "Simplified extraction of
ginsenosides from American ginseng (Panax quinquefolius L.) for high-performance
liquid chromatography-ultraviolet analysis", Journal of Agriculture and Food
Chemistry, 53 (26), pp. 9867-9873.
26. Corthout J., Naessens T., Apers S., Vlietinck A. J. (1999), "Quantitative determination
of ginsenosides from Panax ginseng roots and ginseng preparations by thin layer
chromatography-densitometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,
21 (1), pp. 187-192.
27. Court Williams E. (2000), Ginseng The genus Panax, CRC Press pp.
28. Gazdar Adi F., Girard Luc, Lockwood William W., Lam Wan L., Minna John D.
(2010), "Lung Cancer Cell Lines as Tools for Biomedical Discovery and Research",
JNCI Journal of the National Cancer Institute, 102 (17), pp. 1310-1321.
29. Guan J., Lai C. M., Li S. P. (2007), "A rapid method for the simultaneous
determination of 11 saponins in Panax notoginseng using ultra performance liquid
chromatography", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44 (4), pp.
996-1000.
30. Ha Thi Dung, Grushvisky IV (1985), "A new species of the genus Panax L.,
Araliaceae in Vietnam: Panax vietnamensis Ha et Grushv. ", Journal of Vietnam
Botany, 70, pp. 518-522.
31. Jeong S. M., Lee, J. H., Kim, J. H., Lee, B. H.,Yoon,I. S., Kim, D. H. (2004),
"Stereospecificity of ginsenoside Rg3 action on ion channels", Molecules and Cells,
18, pp. 383–389.
32. Kanazawa Hideko, Nagata Yoshiko, Kurosaki Emi, Matsushima Yoshikazu, Takai
Nobuharu (1993), "Comparison of columns of chemically modified porous glass and
silica in reversed-phase high-performance liquid chromatography of ginsenosides",
Journal of Chromatography A, 632 (1), pp. 79-85.
33. Kang S.Y., Kim J.M., KIM N.D.S.A., Kim W.Y., Park J.H., PARK M.K.S.A.
Processes for preparation of G-Rg3 and G-Rg5 ginsenosides. Google Patents; 2004. pp.
34. Kim Il-Woung, Cha Kyu-Min, Wee Jae Joon, Ye Michael B., Kim Si-Kwan (2013),
"A new validated analytical method for the quality control of red ginseng products",
Journal of Ginseng Research, 37 (4), pp. 475-482.
35. Kim Il-Woung, Sun Won Suk, Yun Bong-Sik, Kim Na-Ri, Min Dongsun, Kim Si-
Kwan (2013), "Characterizing a full spectrum of physico-chemical properties of
(20S)- and (20R)-ginsenoside Rg3 to be proposed as standard reference materials",
Journal of Ginseng Research, 37 (1), pp. 124-134.
36. Kim K. H., Choi I., Lee Y. W., Cho C. K., Yoo H. S., Lee S. B., et al. (2014), "Target
genes involved in antiproliferative effect of modified ginseng extracts in lung cancer
A549 cells", Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 46 (6), pp. 441-449.
37. Kim Mi Hyun, Lee Young Chul, Choi Sang Yoon, Cho Chang-Won, Rho Jeonghae,
Lee Kwang-Won (2011), "The changes of ginsenoside patterns in red ginseng
processed by organic acid impregnation pretreatment", Journal of Ginseng Research,
35 (4), pp. 497-503.
38. Kim S. N., Ha Y. W., Shin H., Son S. H., Wu S. J., Kim Y. S. (2007), "Simultaneous
quantification of 14 ginsenosides in Panax ginseng C.A. Meyer (Korean red ginseng)
by HPLC-ELSD and its application to quality control", Journal of pharmaceutical and
biomedical analysis, 45 (1), pp. 164-170.
39. Kim W. Y., Kim J. M., Han S. B., Lee S. K., Kim N. D., Park M. K., et al. (2000),
"Steaming of ginseng at high temperature enhances biological activity", Journal of
Natural Product, 63 (12), pp. 1702-1704.
40. Kim Y. J., Kwon H. C., Ko H., Park J. H., Kim H. Y., Yoo J. H., et al. (2008), "Anti-
tumor activity of the ginsenoside Rk1 in human hepatocellular carcinoma cells
through inhibition of telomerase activity and induction of apoptosis", Biological &
Pharmaceutical Bulletin, 31 (5), pp. 826-830.
41. Komatsu K, Zhu S , Fushimi H, Qui TK, Cai S, Kadota S (2001), "Phylogenetic
analysis based on 18S rRNA gene and matK gene sequences of Panax vietnamensis
and five related species.", Planta Medica, 67 (5), pp. 461-465.
42. Konoshima Takao, Takasaki Midori, Ichiishi Eiichiro, Murakami Teruo, Tokuda
Harukuni, Nishino Hoyoku, et al. (1999), "Cancer chemopreventive activity of
majonoside-R2 from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis", Cancer Letters, 147
(1–2), pp. 11-16.
43. Lau A. J., Seo B. H., Woo S. O., Koh H. L. (2004), "High-performance liquid
chromatographic method with quantitative comparisons of whole chromatograms of
raw and steamed Panax notoginseng", Journal of Chromatography A, 1057 (1-2), pp.
141-149.
44. Lau A. J., Woo S. O., Koh H. L. (2003), "Analysis of saponins in raw and steamed
Panax notoginseng using high-performance liquid chromatography with diode array
detection", Journal of Chromatography A, 1011 (1-2), pp. 77-87.
45. Le Thi Hong Van, Nguyen Ngoc Khoi, Nguyen Minh Duc (2011), "Isolation of
ginsenoside-Rh1 in higher yield from process Vietnamese ginseng", Tạp chí dược liệu,
16 (3), pp. 187.
46. Le Thi Hong Van, Nguyen Thi Minh Thao, Nguyen Ngoc Khoi, Nguyen Duc Tuan,
Nguyen Minh Duc (2012), "Simultaneous quantitative analysis of major saponins in
vietnamese ginseng by HPLC", Tạp Chí Dược học, 17 (1), pp. 42-47.
47. Lee Hyejin, Kim Jinhee, Lee Seo Young, Park Jeong Hill, Hwang Gwi Seo (2012),
"Processed Panax ginseng, sun ginseng, decreases oxidative damage induced by tert-
butyl hydroperoxide via regulation of antioxidant enzyme and anti-apoptotic
molecules in hepg2 cells", Journal of Ginseng Research, 36 (3), pp. 248-255.
48. Lee IK, Kang KA, Lim CM, Kim KC, Kim HS, Kim DH, et al. (2011), "Compound K,
a metabolite of ginseng saponin, induces mitochondria-dependent and caspase-
dependent apoptosis via the generation of reactive oxygen species in human colon
cancer cells", International Journal of Molecular Science, 11, pp. 4916 - 4931.
49. Lee Jeong Hee, Lee Gwang Jin, Kwon Sung Won, Park Jeong Hill, editors. Factor
influencing the detection sensitivity of ginsenosides with evaporative light scattering
detector. The 11th International Symposium on Ginseng: Evidence-based Efficacy of
Ginseng; 2014; Seoul, Korea pp. P-157.
50. Lee Sang Myung, Bae Bong-Seok, Park Hee-Weon, Ahn Nam-Geun, Cho Byung-Gu,
Cho Yong-Lae, et al. (2015), "Characterization of Korean Red Ginseng (Panax
ginseng Meyer): History, preparation method, and chemical composition", Journal of
Ginseng Research, 39 (4), pp. 384-391.
51. Lee Yoon-Mi, Yoon Haelim, Park Hyun-Min, Song Byeng Chun, Yeum Kyung-Jin
(2016), "Implications of red Panax ginseng in oxidative stress associated chronic
diseases", Journal of Ginseng Research,
52. Li B., Zhao, J.,Wang, C. Z., Searle, J., He, T. C., Yuan, C. S., and Du, W. (2011),
"Ginsenoside Rh2 induces apoptosis and paraptosis-like cell death in colorectal cancer
cells through activation of p53.", Cancer Letters, 301, pp. 185–192.
53. Li L., Zhang J. L., Sheng Y. X., Guo D. A., Wang Q., Guo H. Z. (2005),
"Simultaneous quantification of six major active saponins of Panax notoginseng by
high-performance liquid chromatography-UV method", Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis, 38 (1), pp. 45-51.
54. Li W., Fitzloff J. F. (2001), "Determination of 24(R)-pseudoginsenoside F(11) in
North American ginseng using high performance liquid chromatography with
evaporative light scattering detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 25 (2), pp. 257-265.
55. Liang Chun, Ding Yan, Nguyen Huu Tung, Kim Jeong-Ah, Boo Hye-Jin, Kang Hee-
Kyoung, et al. (2010), "Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their
anticancer activities", Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 20 (23), pp. 7110-
7115.
56. Lieber Michael, Todaro George, Smith Barry, Szakal Andras, Nelson-Rees Walter
(1976), "A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of
type II alveolar epithelial cells", Internaltional Journal of Cancer, 17 (1), pp. 62-70.
57. Liu S., Zhong J. J. (1998), "Phosphate effect on production of ginseng saponin and
polysaccharide by cell suspension cultures of Panax ginseng and Panax
quinquefolium", Process Biochemistry, 33 (1), pp. 69-74.
58. Lutomski Habil Jerzy, Nguyen Thoi Nham (1976), "Study on species of Panax
growing in Vietnam. I. Comparative study on the saponins from Panax K5VN and
Panax ginseng by TLC", Herbal Polonica, 1, pp. 23-27.
59. Lutomski Habil Jerzy, Tran Cong Luan (1992), "Polyacetylenes in the Araliaceae
family. Part IV - The antibacterrial and antifungal activities of two main
polyacetylenes from Panax vietnamensis Ha et Grushv. and Polyscias fruticosa (L.)
Harms", Herba Polonica, XXXVIII (3), pp. 137-140.
60. Ma Wei Guang, Mizutani Masanori, Malterud Karl Egil, Lu Shao Long, Ducrey
Bertrand, Tahara Satoshi (1999), "Saponins from the roots of Panax notoginseng",
Phytochemistry, 52 (6), pp. 1133-1139.
61. Matsuura Hiromichi, Kasai Ryoji, Tanaka Osamu, Saruwatari Yuhichiro, Fuwa Tohru,
Zhou Jun. (1983), "Further Studies on Dammarane-Saponins of Sanchi-Ginseng",
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 31 (7), pp. 2281-2287.
62. Mochizuki Mami, Yoo YungChoon, Matsuzawa Kaori, Sato Katsuaki, Saiki Ikuo,
Tono-Oka Shuichi, et al. (1995), "Inhibitory effect of tumor metastasis in mice by
saponins, ginsenoside Rb2, 20(R)- and 20(S)-ginsenoside Rg3, of red ginseng.",
Biological & Pharmaceutical Bulletin, 18, pp. 1197–1202.
63. Morita Toshinobu, Kasai Ryoji, Kohda Hiroshi, Tanaka Osamu, Zhou Jun, Yang
Tsungren (1983), "Chemical and Morphological Study on Chinese Panax japonicus C.
A. Meyer (Zhujie-Shen)", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 31 (9), pp. 3205-
3209.
64. Morita Toshinobu, Tanaka Osamu, Kohda Hiroshi (1985), "Saponin composition of
rhizomes of Panax japonicus collected in South Kyushu, Japan, and its significance in
oriental traditional medicine", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 33 (9), pp. 3852-
3858.
65. Nam Ki Yeul (2005), "The Comparative Understanding between Red Ginseng and
White Ginsengs, Processed Ginsengs (Panax ginseng C. A. Meyer)", Journal of
Ginseng Research, 29 (1), pp. 1-18.
66. Nguyen Huu Tung, Tran Hong Quang, Nguyen Thi Thanh Ngan, Chau Van Minh, Bui
Kim Anh, Pham Quoc Long, et al. (2011), "Oleanolic triterpene saponins from the
roots of Panax bipinnatifidus", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 59 (11), pp.
1417-1420.
67. Nguyen Minh Duc. Chemical study on the saponin composition of Vietnamese
ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv.: Institute of Pharmaceutical Sciences,
Hiroshima University School of Medicine; 1994.
68. Nguyen Minh Duc, Kasai Ryoji, Ohtani Kazuhiro, Ito Aiko, Yamasaki Kazuo, Nguyen
Thoi Nham, et al. (1996), "New saponins from Vietnamese ginseng: highlights on
biogenesis of dammarane triterpenoids.", Advances in Experimental Medicine and
Biology, 404, pp. 129-149.
69. Nguyen Minh Duc, Kasai Ryoji, Yamasaki Kazuo, Nguyen Thoi Nham, Tanaka
Osamu. New dammarane saponins from Vietnamese ginseng. In: Chong-Ren Yang,
Osamu Tanaka, editors. Studies in Plant Science. 6: Elsevier; 1999. pp. 77-82.
70. Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu Trang, editors.
Quantitative determination of major saponin contents of cultivated vietnamese ginseng
– Panax vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC. Pharma Indochina; 2001;
Ho Chi Minh city, Vietnam pp. 247-251.
71. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai Ryoji, Ito Aiko, Yamasaki Kazuo,
Tanaka Osamu (1994), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha
et Grushv. collected in central Vietnam. III.", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 42
(3), pp. 634-640.
72. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai Ryoji, Ito Aiko, Yamasaki Kazuo,
Tanaka Osamu (1993), "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha
et Grushv. Collected in central Vietnam. I.", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 41
(11), pp. 2010-2014.
73. Nguyen Minh Duc, Nguyen Thoi Nham, Kasai Ryoji, Ito Aiko, Yamasaki Kazuo,
Tanaka Osamu (1994), "Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha
et Grushv. Collected in central Vietnam. II.", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 42
(1), pp. 115-122.
74. Nguyen Ngoc Khoi, Dao Xuan Son, Nguyen Minh Duc (2008), "Majonoside R2
Modulates Anxiety- and Depression-like Behaviours in Mice", Journal of Medicinal
materials, 5, pp. 240-244.
75. Nguyen Ngoc Khoi, Le Thi Hong Van, Nguyen Minh Duc (2009), "The effect of
steaming on saponin components and endurance swimming capacity of Vietnamese
ginseng Panax vietnamesis Ha et Grushv.", Tạp chí Dược liệu, 14 (5), pp. 288-293.
76. Nguyen Thi Thu Huong, Matsumoto Kinzo, Kasai Ryoji, Yamasaki Kazuo, Watanabe
Hiroshi (1998), "In vitro antioxidant activity of Vietnamese ginseng saponin and its
components.", Biological & Pharmaceutical Bulletin, 21 (9), pp. 978-981.
77. Nguyen Thi Thu Huong, Matsumoto Kinzo, Yamasaki Kazuo, Nguyen Minh Duc,
Nguyen Thoi Nham, Watanabe Hiroshi (1996), "Effects of Vietnamese ginseng on
opioid agonist — and conditioned fear stress-induced antinociception",
Phytomedicine, 3 (1), pp. 33-39.
78. Nguyen Thi Thu Huong, Matsumoto Kinzo, Yamasaki Kazuo, Watanabe Hiroshi
(1997), "Majonoside-R2 reverses social isolation stress-induced decrease in
pentobarbital sleep in mice: Possible involvement of neuroactive steroids", Life
Sciences, 61 (4), pp. 395-402.
79. Nguyen Thi Thu Huong, Yukihisa Murakami, Michihisa Tohda, Hiroshi Watanabe,
Kinzo Matsumoto (2005), "Social isolation stress-induced oxidative damage in mouse
brain and its modulation by majonoside-R2, a Vietnamese ginseng saponin", Chemical
& Pharmaceutical Bulletin, 28 (8), pp. 1389-1393.
80. Nguyen Thoi Nham, Phan Van De, Tran Cong Luan, Nguyen Minh Duc, Shibata S,
Tanaka Osamu, et al. (1995), "Pharmacognostical and Chemical Studies on
Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv. (Araliaceae).", Journal of
Japanese Botanical, 70, pp. 1-10.
81. Nguyen Tuan Dung, Villard Pierre Henri, Barlatier A., Elsisi A. E., Jouve Elisabeth,
Nguyen Minh Duc, et al. (2000), "Panax vietnamensis protects mice against carbon
tetrachloride-induced hepatotoxicity without any modification of CYP2E1 gene
expression", Planta Medica, 66 (8), pp. 714-719.
82. Nong Van Duy, Le Ngoc Trieu, Nguyen Duy Chinh, Van Viet Tran (2016), "A new
variety of Panax (Araliaceae) from Lam Vien Plateau, Vietnam and its molecular
evidence", Phytotaxa, 277 (1), pp. 47-58.
83. Oh G. S., Pae H. O., Choi B. M., Seo E. A., Kim D. H., Shin M. K., et al. (2004),
"20(S)-Protopanaxatriol, one of ginsenoside metabolites, inhibits inducible nitric oxide
synthase and cyclooxygenase-2 expressions through inactivation of nuclear factor-κB
in RAW 264.7 macrophages stimulated with lipopolysaccharide", Cancer Letters, 205
(1), pp. 23-29.
84. Park Hee-Won, In Gyo, Han Sung-Tai, Lee Myoung-Woo, Kim So-Young, Kim
Kyung-Tack, et al. (2013), "Simultaneous determination of 30 ginsenosides in Panax
ginseng preparations using ultra performance liquid chromatography", Journal of
Ginseng Research, 37 (4), pp. 457-467.
85. Park I. H., Kim N. Y., Han S. B., Kim J. M., Kwon S. W., Kim H. J., et al. (2002),
"Three new dammarane glycosides from heat processed ginseng", Archive
Pharmaceutical Research, 25 (4), pp. 428-432.
86. Park Il Ho, Kwon Sung Won, Lee Young Yae, Cho Sool Yeon, Park Man Ki, Park
Jeong Hill (2002), "Cytotoxic dammarane glycosides from processed ginseng",
Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 50 (4), pp. 538-540.
87. Park J., Cho, J. Y. (2009), "Antiinflammatory effects of ginsenosides from Panax
ginseng and their structural analogs.", African Journal of Biotechnology, 8, pp. 3682–
3690.
88. Park M.H. Method for processing ginseng and the uses of extract of processed
ginseng. Google Patents; 2009. pp.
89. Park M.H.E.T.P., inventor; Google Patents, assignee. Method for processing ginseng
and the uses of extract of processed ginseng2004.
90. Park Man Ki, Park Jeong Hill, Han Sang Beom, Shin Young Geun, Park Il Ho (1996),
"High-performance liquid chromatographic analysis of ginseng saponins using
evaporative light scattering detection", Journal of Chromatography A, 736 (1–2), pp.
77-81.
91. Phan Ke Long, Le Thanh Son , Phan Ke Loc , Vu Dinh Duy, Pham Van The, editors.
Lai Chau ginseng Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu, S.Zhu&S.Q.Cai.I.
Morphology, ecology, distribution and conservation status. Proceeding of the 2nd
VAST-KAST workshop on biodiversity and bio-active compounds; 2013; Vietnam pp.
65-73.
92. Popovich David G. Kitts, David D. (2002), "Structure–function relationship exists for
ginsenosides in reducing cell proliferation and inducing apoptosis in the human
leukemia (THP-1) cell line", Archives of Biochemistry and Biophysics, 406 (1), pp. 1-
8.
93. Qi L. W., Wang C. Z., Yuan C. S. (2011), "Isolation and analysis of ginseng: advances
and challenges", Natuaral Product Research, 28 (3), pp. 467-495.
94. Qian Z. M., Lu J., Gao Q. P., Li S. P. (2009), "Rapid method for simultaneous
determination of flavonoid, saponins and polyacetylenes in folium ginseng and radix
ginseng by pressurized liquid extraction and high-performance liquid chromatography
coupled with diode array detection and mass spectrometry", Journal of
Chromatography A, 1216 (18), pp. 3825-3830.
95. Qu Chenling, Bai Yuping, Jin Xiangqun, Wang Yutang, Zhang Kun, You Jingyan, et
al. (2009), "Study on ginsenosides in different parts and ages of Panax quinquefolius
L", Food Chemistry, 115 (1), pp. 340-346.
96. Ríos J. L., Recio M. C., Maáñez S., Giner R. M. Natural Triterpenoids as Anti-
Inflammatory Agents. In: Atta ur Rahman, editor. 22: Elsevier; 2000. pp. 93-143.
97. Rongwei Teng, Haizhou Li, Jiangtao Chen, Dezu Wang, Yineng He , Chongren Yang
(2002), "Complete assignment of 1H and 13C NMR data for nine protopanaxatriol
glycosides", Magnetic Resonance Chemical, 40, pp. 483-488.
98. Shin Byong-Kyu, Kwon Sung Won, Park Jeong Hill (2015), "Chemical diversity of
ginseng saponins from Panax ginseng", Journal of Ginseng Research, 39 (4), pp. 287-
298.
99. Shin Y. W., Bae, E. A., Han, M. J., Kim, D. H. (2006), "Metabolism of ginsenoside
Rg5, a main constituent isolated from red ginseng, by human intestinal microflora and
their antiallergic effect.", Journal of Microbiology and Biotechnology, 16, pp. 1791–
1798.
100.Shinkai Kiyoko , Akedo Hitoshi, Mukai Mutsuko, Imamura Fumio, Isoai Atsushi,
Kobayashi Motomasa , et al. (1996), "Inhibition of in vitro tumor cell invasion by
ginsenoside Rg3", Journal of Cancer Research, 87, pp. 357–362.
101.Shu Youn Yuen, Ko Ming Yu, Chang Yuan Shiun (2003), "Microwave-assisted
extraction of ginsenosides from ginseng root", Microchemical Journal, 74 (2), pp.
131-139.
102.Sohn Sang-Hyun, Kim Si-Kwan, Kim Young-Ock, Kim Hyung-Don, Shin Yu-Su,
Yang Seung-Ok, et al. (2013), "A comparison of antioxidant activity of Korean White
and Red Ginsengs on H2O2-induced oxidative stress in HepG2 hepatoma cells",
Journal of Ginseng Research, 37 (4), pp. 442-450.
103.Song G.Y., Lee J.H., Park Y.J., Myung C.S., Oh H.J., Shin H.J., et al., inventors;
Google Patents, assignee. A novel process for preparing black ginseng and the
composition comprising the same patent WO2007133054A1. 2007.
104.Sultana Nasim, Afolayan A. J. (2007), "A novel daucosterol derivative and
antibacterial activity of compounds from Arctotis arctotoides", Natural Product
Research, 21 (10), pp. 889-896.
105.Sun Chengxin, Chen Yan, Li Xinzhi, Tai Guihua, Fan Yuying, Zhou Yifa (2014),
"Anti-hyperglycemic and anti-oxidative activities of ginseng polysaccharides in STZ-
induced diabetic mice", Food & Function, 5 (5), pp. 845-848.
106.Sun Yongxu (2011), "Structure and biological activities of the polysaccharides from
the leaves, roots and fruits of Panax ginseng C.A. Meyer: An overview",
Carbohydrate Polymers, 85 (3), pp. 490-499.
107.Sung Kwon Ko, Kyung Hee Lee, Jun Kee Hong, Sung An Kang, Uy Dong Sohn,
Byung Ok Im, et al. (2005), "Change of Ginsenoside Composition in Ginseng Extract
by Vinegar Process", Food Science and Biotechnology, 14 (4), pp. 509-513.
108.SW Kwon, SB Han, IH Park, JM Kim, MK Park, JH Park (2001), "Liquid
chromatographic determination of less polar ginsenosides in processed ginseng",
Journal of chromatography A, 921 (2), pp. 335-339.
109.Takahashi M., Yoshikura M. (1964), "Studies on the components of Panax ginseng C.
A. Meyer. 3. on the ethereal extract of ginseng radix alba. (3). on the structure of a
new acetylene derivative "panaxynol"", Yakugaku Zasshi, 84, pp. 757-759.
110.Taniyasu Shigenori, Tanaka Osamu, Yang Tsung Ren, Zhou Jun (1982), "Dammarane
saponins of flower buds of Panax notoginseng (Sanchi-Ginseng)", Planta Medica, 44
(2), pp. 124-125.
111.Toh Ding-Fung, Patel Dhavalkumar Narendrabhai, Chan Eric Chun-Yong, Teo Alvin,
Neo Soek-Ying, Koh Hwee-Ling (2011), "Anti-proliferative effects of raw and
steamed extracts of Panax notoginseng and its ginsenoside constituents on human
liver cancer cells", Chinese Medicine, 6, pp. 4-4.
112.Tran Le Quan, Adnyana I Ketut, Tezuka Yasuhiro, Nagaoka Takema, Tran Qui Kim,
Kadota Shigetoshi (2001), "Triterpene saponins from Vietnamese ginseng (Panax
vietnamensis) and their hepatocytoprotective activity", Journal of Natural Product, 64
(4), pp. 456-461.
113.Tran Le Quan, Adnyana I. K., Tezuka Y., Harimaya Y., Saiki I., Kurashige Y., et al.
(2002), "Hepatoprotective effect of majonoside R2, the major saponin from
Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)", Planta Medica, 68 (5), pp. 402-406.
114.Vanhaelen-Fastre R. J., Faes M. L., Vanhaelen M. H. (2000), "High-performance thin-
layer chromatographic determination of six major ginsenosides in Panax ginseng",
Journal of chromatography A, 868 (2), pp. 269-276.
115.Vo Duy Huan, Kazuhiro Ohtani, Ryoji Kasai, Nguyen Thoi Nham, Hoang Minh Chau,
Nguyen Minh Duc, et al., editors. New dammarane saponins from leaves of Panax
vietnamensis. Proceeding of the Third Indochina Conference on Pharmaceutical
Sciences; 2003; Bangkok, Thailand pp. pp. OP65-OP75.
116.Wan J. B., Li P., Li S., Wang Y., Dong T. T., Tsim K. W. (2006), "Simultaneous
determination of 11 saponins in Panax notoginseng using HPLC-ELSD and
pressurized liquid extraction", Journal of Separation Science, 29 (14), pp. 2190-2196.
117.Wan J. B., Li S. P., Chen J. M., Wang Y. T. (2007), "Chemical characteristics of three
medicinal plants of the Panax genus determined by HPLC-ELSD", Journal of
Separation Science, 30 (6), pp. 825-832.
118.Wang A., Wang C. Z., Wu J. A., Osinski J., Yuan C. S. (2005), "Determination of
major ginsenosides in Panax quinquefolius (American ginseng) using high-
performance liquid chromatography", Phytochemical Analysis, 16 (4), pp. 272-277.
119.Wang C. Z., Wu J. A., McEntee E., Yuan C. S. (2006), "Saponins composition in
American ginseng leaf and berry assayed by high-performance liquid
chromatography", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (6), pp. 2261-2266.
120.Wang Chong-Zhi, Aung Han H., Ni Ming, Wu Ji-An, Tong Robin, Wicks Sheila, et al.
(2007), "Red American Ginseng: Ginsenoside Constituents and Antiproliferative
Activities of Heat-Processed Panax quinquefolius Roots", Planta Medica, 73 (7), pp.
669-674.
121.Wang D. Q., Fan J., Feng B. S., Li S. R., Wang X. B., Yang C. R., et al. (1989),
"Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var. bipinnatifidus
(Seem.)Wu et Feng", Yao Xue Xue Bao, 24 (8), pp. 593-599.
122.Wang J., Li S., Fan Y., Chen Y., Liu D., Cheng H., et al. (2010), "Anti-fatigue activity
of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C. A. Meyer",
Journal of Ethnopharmacol, 130 (2), pp. 421-423.
123.Wang J. R., Yamasaki Y., Tanaka T., Kouno I., Jiang Z. H. (2009), "Dammarane-type
triterpene saponins from the flowers of Panax notoginseng", Molecules, 14 (6), pp.
2087-2094.
124.Wang J., Sun C., Zheng Y., Pan H., Zhou Y., Fan Y. (2014), "The effective
mechanism of the polysaccharides from Panax ginseng on chronic fatigue syndrome",
Archives of Pharmacal Research, 37 (4), pp. 530-538.
125.Wang W., Rayburn E. R., Hang J., Zhao Y., Wang H., Zhang R. (2009), "Anti-lung
cancer effects of novel ginsenoside 25-OCH(3)-PPD", Lung Cancer, 65 (3), pp. 306-
311.
126.Wang W., Rayburn, E. R., Zhao, Y., Wang, H., Zhang, R. (2009), "Novel ginsenosides
25-OHPPD and 25-OCH3-PPD as experimental therapy for pancreatic cancer:
anticancer activity and mechanisms of action.", Cancer Letters, 278, pp. 241–248.
127.Wang W., Zhao, Y., Rayburn, E. R., Hill, D. L., Wang, H., Zhang, R. (2007), "In vitro
anti-cancer activity and structure-activity relationships of natural products isolated
from fruits of Panax ginseng.", Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 59, pp.
589–601.
128.Wang Yutang, You Jingyan, Yu Yong, Qu Chenling, Zhang Huarong, Ding Lan, et al.
(2008), "Analysis of ginsenosides in Panax ginseng in high pressure microwave-
assisted extraction", Food Chemistry, 110 (1), pp. 161-167.
129.Wen Jun, Zimmer E. A. (1996), "Phylogeny and biogeography of Panax L. (the
ginseng genus, araliaceae): inferences from ITS sequences of nuclear ribosomal
DNA", Molecular Phylogenetics and Evolution, 6 (2), pp. 167-177.
130.Wong Alice S. T., Che Chi-Ming, Leung Kar-Wah (2015), "Recent advances in
ginseng as cancer therapeutics: a functional and mechanistic overview", Natural
Product Reports, 32 (2), pp. 256-272.
131.Xia Pengguo, Li Jiazhou, Wang Ruilin, Zhang Yu, Guo Hongbo, Yan Xijun, et al.
(2015), "Comparative study on volatile oils of four Panax genus species in Southeast
Asia by gas chromatography–mass spectrometry", Industrial Crops and Products, 74,
pp. 478-484.
132.Xu T. M., Cui, M. H., Xin, Y., Gu, L. P., Jiang, X., Su, M. M., Wang, D. D., Wang,
W. J. (2008), "Inhibitory effect of ginsenoside Rg3 on ovarian cancer metastasis.",
Chinese Medical Journal, 121, pp. 1394–1397.
133.Yang Di-Qing (1981), "The cyto-taxonomic studies on some species of Panax L.",
Acta Phytotaxonomica Sinica, 19, pp. 298-303.
134.Yang Heejung, Kim Jeom Yong, Kim Sun Ok, Yoo Young Hyo, Sung Sang Hyun
(2014), "Complete 1H-NMR and 13C-NMR spectral analysis of the pairs of 20(S) and
20(R) ginsenosides", Journal of Ginseng Research, 38 (3), pp. 194-202.
135.Yang Wen-zhi, Hu Ying, Wu Wang-Ying, Ye Min, Guo De An (2014), "Saponins in
the genus Panax L. (Araliaceae): a systematic review of their chemical diversity",
Phytochemistry, 106, pp. 7-24.
136.Yang WZ, Ye M, Qiao X, Liu CF, Miao WJ, Bo T, et al. (2012), "A strategy for
efficient discovery of new natural compounds by integrating orthogonal column
chromatography and liquid chromatography/mass spectrometry analysis: its
application in Panax ginseng, Panax quinquefolium and Panax notoginseng to
characterize 437 potential new ginsenosides", Analytica Chimica Acta, 739, pp. 56 -
66.
137.Yoshikawa M., Morikawa T., Kashima Y., Ninomiya K., Matsuda H. (2003),
"Structures of new dammarane-type Triterpene Saponins from the flower buds of
Panax notoginseng and hepatoprotective effects of principal Ginseng Saponins",
Journal of Natural Product, 66 (7), pp. 922-927.
138.Yoshikawa Masayuki, Morikawa T, Yashiro Kenichi, Murakami T., Matsuda Hisashi
(2001), "Bioactive saponins and glycosides. XIX. Notoginseng (3): immunological
adjuvant activity of notoginsenosides and related saponins: structures of
notoginsenosides-L, -M, and -N from the roots of Panax notoginseng (Burk.) F. H.
Chen", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 49 (11), pp. 1452-1456.
139.Yoshikawa Masayuki, Murakami Toshiyuki, Ueno Takahiro, Hirokawa Nobuko,
Yashiro Kenichi, Murakami Nobutoshi, et al. (1997), "Bioactive Saponins and
Glycosides. IX. Notoginseng (2) : Structures of Five New Dammarane-Type
Triterpene Oligoglycosides, Notoginsenosides-E, -G, -H, -I, and -J, and a Novel
Acetylenic Fatty Acid Glycoside, Notoginsenic Acid β-Sophoroside, from the
Dried Root of Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen", Chemical & Pharmaceutical
Bulletin, 45 (6), pp. 1056-1062.
140.Yoshikawa Masayuki, Murakami Toshiyuki, Ueno Takahiro, Yashiro Kenichi,
Hirokawa Nobuko, Murakami Nobutoshi, et al. (1997), "Bioactive saponins and
glycosides. VIII. Notoginseng (1): new dammarane-type triterpene oligoglycosides,
notoginsenosides-A, -B, -C, and -D, from the dried root of Panax notoginseng (Burk.)
F.H. Chen", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 45 (6), pp. 1039-1045.
141.Zhang Y. L., Zhang R., Xu H. L., Yu X. F., Qu S. C., Sui D. Y. (2013), "20(S)-
protopanaxadiol triggers mitochondrial-mediated apoptosis in human lung
adenocarcinoma A549 cells via inhibiting the PI3K/Akt signaling pathway", The
American journal of Chinese Medicine, 41 (5), pp. 1137-1152.
142.Zhou D., Hu C., Su X., Yang H. (2005), "Study on apoptosis of human lung
adenocarcinoma cell line A549/DDP induced by ginsenoside Rh2 in vitro", Zhongguo
Fei Ai Za Zhi, 8 (4), pp. 257-260.
143.Zhou J., Huang, W.-G., Wu, M.-Z., Yang, C.-R., Feng, K.-M., and Wu, Z.-Y (1975),
"Triterpenoids from Panax Linn. and their relationship with taxonomy and
geographical distribution.", Acta Phytotaxonomica Sinica, 13 (2), pp. 29-45.
144.Zhu J. J., Wang Z. M., Kuang Y. H., Zhang Q. W., Gao Q. P., Ma N. (2008), "A
quantitative method using one marker for simultaneous assay of ginsenosides in Panax
ginseng and P. notoginseng", Yao Xue Xue Bao, 43 (12), pp. 1211-1216.
145.Zhu Shu , Zou Kun, Cai Shaoqing, Meselhy Ragab, Komatsu Katsuko (2004),
"Simultaneous determination of triterpene saponins in ginseng drugs by high-
performance liquid chromatography", Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 52 (8),
pp. 995-998.
146.Zhu Shu, Fushimi H, Cai ShaoQing, Chen HuBiao, Komatsu Katsuko (2003), "A new
variety of the genus Panax from Southern Yunnan, China and its nucleotide sequences
of 18S ribosomal RNA gene and matK gene", Journal of Japanese Botany, 78 (2), pp.
86-94.
147.Zhu Shu, Fushimi H, Cai ShaoQing, Komatsu Katsuko (2003), "Phylogenetic
relationship in the genus Panax: inferred from chloroplast trnK gene and nuclear 18S
rRNA gene sequences", Planta Medica, 69 (7), pp. 647-653.
148.Zou Kun, Zhu Shu, Meselhy Ragab Meselhy, Tohda Chihiro, Cai Shaoqing, Komatsu
Katsuko (2002), "Dammarane-type Saponins from Panax japonicus and their neurite
outgrowth activity in SK-N-SH cells", Journal of Natural Product, 65 (9), pp. 1288-
1292.
149.Zou Kun, Zhu Shu, Tohda Chihiro, Cai Shaoqing, Komatsu Katsuko (2002),
"Dammarane-type triterpene saponins from Panax japonicus", Journal of Natural
Product, 65 (3), pp. 346-351.
150.http://www.theplantlist.org/tpl1.1/search?q=panax [cited 2016 07/12].
151.http://www.catalogueoflife.org/col/search/all/key/Panax/ 2016 [cited 2016 07/12].
152.http://www.hc-sc.gc.ca/dhp-mps/prodnatur/applications/licen-
prod/monograph/mono_panax_ginseng-eng.php 2016.
153.http://apps.who.int/medicinedocs/en/d/Js2200e/19.html#Js2200e.19 2016.