Испитивање редокс карактеристика екстракта ртањског чаја (Satureja montana) интегрисаног у липозоме

Универзитет у Београду
Факултет за физичку хемију
МАСТЕР РАД
Испитивање редокс карактеристика
екстракта ртањског чаја (Satureja
montana) интегрисаног у липозоме
Ментори: Студент:
Проф. Милош Мојовић Давид Пирић
Др Ђура Накарада
Београд, septembar 2021.

Захваљујем се др Милошу Мојовићу, редовном професору на Факултету за
физичку хемију, на указаној стручној помоћи при изради мастер рада и пажљиво
прочитаном тексту.
Посебну захвалност дугујем др Ђури Накаради, научном сараднику на Факултету
за физичку хемију, на указаној стручној помоћи и пријатној атмосфери при изради
експерименталног дела мастер рада и пажљиво прочитаном тексту.
Захваљујем се др Вуку Максимовићу, научном саветнику на Институту за
мултидисциплинарна истраживања, на указаној стручној помоћи за HPLC анализу.
Такође се захваљујем породици и пријатељима на подршци приликом
студирања.
Давид Пирић
Садржај
1. Увод ............................................................................................................................................... 1
2. Теоријске основе ....................................................................................................................... 2
2.1. Ртањски чај .............................................................................................................................. 2
2.1.1. Биљка ртањски чај ....................................................................................................... 2
2.1.2. Хемијски састав ртањског чаја ................................................................................ 2
2.2. Липозоми ................................................................................................................................. 3
2.2.1. Липиди и фосфолипиди ............................................................................................ 3
2.2.2. Појам, класификација и значај липозома ............................................................ 5
2.3. Слободни радикали и антиоксиданси ............................................................................. 6
2.3.1. Слободни радикали ..................................................................................................... 6
2.3.2. Антиоксиданси ............................................................................................................. 7
2.3.3. Фентонова реакција .................................................................................................... 8
2.4. Електронска парамагнетна резонанција ........................................................................ 8
2.4.1. Спински магнетни момент електрона ................................................................... 8
2.4.2. Принцип електронске парамагнетне резонанције (ЕПР) .............................. 11
2.4.3. Параметри ЕПР спектра .......................................................................................... 14
2.4.3.1. Положај спектра ........................................................................................... 14
2.4.3.2. Интензитет спектралних линија .............................................................. 14
2.4.3.3. Ширина спектралних линија .................................................................... 15
2.4.3.4. Хиперфина структура .................................................................................. 16
2.4.4. ЕПР спектрометар ..................................................................................................... 18
2.4.5. Спинске пробе ............................................................................................................ 19
2.4.6. Хватачи спинова ........................................................................................................ 19
2.4.7. Одређивање антиоксидативне активности ....................................................... 20
2.5. Течна хроматографија високих перформанси ........................................................... 22
2.5.1. Основно о HPLC методи ......................................................................................... 22
2.5.2. Типови течне хроматографије .............................................................................. 22
2.5.3. Течни хроматограф високих перформанси ....................................................... 24
2.5.4. Детектори за течну хроматографију .................................................................... 25
2.5.5. Квалитативна и квантитативна анализа ............................................................. 26
2.6. Одређивање величине и стабилности колоидних честица .................................... 27
2.6.1. DLS метода .................................................................................................................. 27
2.6.2. Зета потенцијал ......................................................................................................... 28
3. Циљ рада .................................................................................................................................... 31
4. Експериментална испитивања ............................................................................................. 32
4.1. Материјали и методе ......................................................................................................... 32
4.2. Припрема екстракта ртањског чаја ............................................................................... 33
4.3. Припрема липозома ........................................................................................................... 34
4.4. Припрема узорка за снимање ЕПР спектра ................................................................. 36
4.5. Анализа екстракта помоћу течне хроматографије ................................................... 38
5. Резултати и дискусија ............................................................................................................ 39
5.1. Величина и стабилност липозома .................................................................................. 39
5.2. Антирадикалска активност липозома према DPPH радикалу .............................. 41
5.3. Антирадикалска активност липозома према хидроксилном радикалу .............. 42
5.4. Резултати течне хроматографије ................................................................................... 43
6. Закључак ..................................................................................................................................... 45
7. Литература ................................................................................................................................. 46
1. Увод
Многе биљке из природе су лековите и корисне за здравље људи, јер поседују у

свом хемијском саставу супстанце које имају антирадикалска, антиоксидативна,
антиинфламаторна, антимикробна и друга својства. Због тога се такве биљке могу
користити у фармацији и медицини у циљу производње биљних препарата и лекова.
Једна од таквих биљака је и ртањски чај (лат. Satureja montana), који је тема овог рада.
Ртањски чај је жбунаста биљка, која расте у медитеранским и субмедитеранским
областима. Код примене екстраката ових биљака јавља се проблем у томе што су многе
компоненте (које би биле фармаколошки корисне) нестабилне, склоне оксидацији,
утицају светлости и различитих pH вредности, слабо се растварају у води, или се слабо
апсорбују у организму. Један од начина да се овакви проблеми превазиђу је
инкапсулација, која представља поступак преко којег се активне компоненте неке
смеше смештају физичко-хемијским методама унутар структуре неког носача
(матрикса). Показало се да као носачи, посебно могу да буду погодни липозоми.
Предност липозома је у томе што у својој структури садрже хидрофилно (поларно)
језгро и хидрофобну (неполарну) мембрану, те самим тим могу у сопственој структури
да интегришу и водорастворне и водонерастворне компоненте екстракта биљке.
Овај рад има за циљ одређивање редокс карактеристика ртањског чаја
интегрисаног у липозоме. Коришћен је узорак са института „Јосиф Панчић” из Београда.
Од тог узорка је направљен водено-етанолни екстракт ртањског чаја, а затим је
екстракт интегрисан у липозоме. Величина липозома је испитивана методом
динамичког расејања светлости, а стабилност липозома је одређена на основу мерења
зета потенцијала. Редокс карактеристике липозома су одређене методом електронске
парамагнетне резонанције. Сачуван део екстракта пре интеграције у липозоме је
испитан методом течне хроматографије високих перформанси, у циљу одређивања
квалитативног и квантитативног састава екстракта, да би се на тај начин утврдило који
су антиоксиданси присутни.
Највећи део експерименталних испитивања је урађен у ЕПР лабораторији на
Факултету за физичку хемију Универзитета у Београду. Течна хроматографија високих
перформанси је урађена на Институту за мултидисциплинарна истраживања у Београду.
1
2. Теоријске основе
2.1. Ртањски чај
2.1.1. Биљка ртањски чај

Ртањски чај (лат. Satureja montana) је биљка која припада фамилији Laminaceae
(уснатице), којој припадају око 7000 врста биљака, од којих се многе могу наћи и на
Балкану. Ова биљка има и друге народне називе: планински чубар, вријесак и горска
метвица. Врста Satureja montana је вишегодишња биљка у облику полужбуна, висине од
10 до 50 cm, са снажним вретенастим кореном и одрвенелим доњим деловима стабла и
гранчицама које су обрасле длачицама. Листови су јој без изражене петељке, дужине и
ширине од неколико центиметара, линеарно ланцетастог облика, бодљасти, сјајни,
покривени светлуцавим жлездама. Време цветања јој је од јула до октобра, а цветови су
јој миришљави, дужине око 1 cm, љубичасте, ружичасте или беле боје. Природно
станиште су јој брдски и планински пашњаци и ливаде на кречњачкој подлози у
медитеранском и субмедитеранском подручју. [1] [2] [3] [4]
Слика 1. Ртањски чај1
За људску употребу се користе надземни делови ове биљке. Традиционално се

употребљава као зачин и природни конзерванс, као и саставни део народних лекова.
Екстракти ртањског чаја, на основу научних истраживања, имају изражену
антиоксидативну и антимикробну активност, те се могу применити у медицини. [39] [40]
Ова биљка се најчешће користи за лечење респираторног, дигестивног и уринарног
система, као и код упала коже и слузокоже. [1] [2] [3] [4]
2.1.2. Хемијски састав ртањског чаја

Квалитативни и квантитативни састав ртањског чаја није апсолутан, већ зависи
од порекла биљке. Садржи етарско уље (у чији састав улазе карвакрол, тимол, p-цимен,
1
Слика је преузета из [2] и [3].
2
γ-терпинен и друге компоненте) и танине. Применом HPLC анализе (течне
хроматографије високих перформанси) водено-етанолних екстраката ртањског чаја,
детектовано је и присуство кафеинске, сиригинске и розмаринске киселине, три
флавоноида (лутеолин, рутин и кварцетин) и других компоненти. Највећу важност међу
овим компонентама имају карвакрол и тимол. За антиоксидативну активност ртањског
чаја су поред карвакрола и тимола, битни и розмаринска киселина, као и флаваноиди
(лутеолин, рутин, кварцетин), а њихова изражена антиоксидативна активност је
последица постојања ароматичног прстена повезаног са хидроксилном групом (слика
2). [1] [3]
карвакрол тимол розмаринска киселина
лутеолин рутин кварцетин
Слика 2. Структурне формуле потенцијалних антиоксиданаса ртањског чаја2
2.2. Липозоми
2.2.1. Липиди и фосфолипиди

Липиди представљају значајну групу биолошки важних органских једињења, која
се не растварају (или слабо растварају) у води, а растварају се у неполарним
(органским) растварачима (на пример, бензен, хлороформ или метанол). Улазе у састав
биљних и животињских ткива. Њихова најважнија улога у живим системима је да чине
основу грађе мембране, представљају дугорочне изворе енергије, изграђују заштитни
омотач на површини многих живих система, представљају хормоне, витамине и
одређене компоненте на површини ћелија. [9] [10] [11] [12]
2
Слика је преузета из [1], [2] и [18].
3
Према грађи, липиди се могу поделити на комплексне (сложене) и просте. Групи
комплексних липида припадају липиди који у хемијском саставу садрже нелипидну
компоненту, која је естерификована масним киселинама3. Сложени липиди се
класификују према врсти нелипидне компоненте на: ацилглицероле (глицерол је
нелипидна компонента), глицерофосфолипиде (глицерол-3-фосфат је нелипидна
компонента), сфинголипиде (сфингозин је нелипидна компонента) и воскове
(алифатични алкохол или стерол је нелипидна компонента). Групи простих липида
припадају липиди који у хемијском саставу не садрже масне киселине. Простим
липидима припадају терпени, стероиди и простагландини, који су редом деривати
изопрена, циклопентаноперхидрофенантрена и простаноинске киселине. [9] [11]
Глицерофосфолипиди, који су познати и као фосфолипиди, састоје се од
глицерол-3-фосфата, који је естерификован фосфатном групом и масним киселинама.
Фосфатна група представља поларну главу (која је хидрофилна, раствара се у води), а
масне киселине неполарни реп (који је хидрофобан, не раствара се у води). Дакле,
молекули фосфолипида су амфифилни, односно састоје се из поларног и неполарног
дела. [9] [10] [11]
Уколико се фосфолипиди (ван ћелије) нађу у воденој средини спонтано се
организују градећи двослој, при чему су хидрофобни делови усмерени ка унутрашњости
двослоја, а хидрофилни делови ка воденом раствору. Фосфолипидни двослој чини
основу грађе биљних и животињских мембрана ћелија. Дејством механичке енергије
(на пример, мешањем или под дејством притиска) липидни двослој се затвара у
сферични систем, који се назива липозом. Суспензијом вишеслојних липозома могу
настати и мицеле, које су сферичног облика као липозоми, али имају само један слој
фосфолипида (слика 3). [10] [11] [12]
липозом
мицела
фосфолипидни двослој
Слика 3. Основне структуре које граде фосфолипиди у воденом раствору4
3
Масне киселине су монокарбоксилне органске киселине са дугачким угљениковим ланцем. [9]
4
Слика је преузета из [10].
4
Температура фазне трансформације фосфолипида је температура на којој
фосфолипид прелази из кристалне у течну (гел) структуру. Ова физичко-хемијска
величина је веома значајна, јер се липозоми могу изградити искључиво на
температурама које су више од температуре фазне трансформације. [10]
2.2.2.
2.2.2. Појам, класификација и значај лип
липозома
ипозома
Липозоми су сферне фосфолипидне везикуле које се састоје од једног или више
концентричних липидних двослоја који окружују водено средиште. Имају димензије од
неколико нанометара до неколико микрометара. Спонтано се могу формирати и у
природи и у лабораторијским условима. Према броју липидних двослоја који чине
њихову структуру, липозоми се деле на једнослојне (униламеларне везикуле) и
вишеслојне (мултиламеларне везикуле). Униламеларни липозоми, према величини,
класификују се на мале (од 20 nm до 100 nm), велике (од 100 nm до 1000 nm) и гигантске
(више од 1000 nm). [10] [11] [13] [14]
молекули фосфолипида
фосфолипидни слој мултиламеларне везикуле
споро раздвајање
брзо раздвајање
хидратација фосфолипидних слојева

униламеларне везикуле
Слика 4. Изградња липозома од фосфолипида5
5
5
Липозоми нису токсични и могу се разградити без стварања штетних супстанци
по здравље. Због постојања поларног (језгро) и неполарног дела (мембрана) липозома,
липозоми могу да транспортују и хидрофилне и хидрофобне супстанце. Поред тога,
могу да заштите биоразградиве материје. Такође, липозоми су биоразградиви, а њихова
структура је веома слична структури ћелијске мембране. Све ово је довело до велике
примене липозома за уградњу, чување и транспорт супстанци које су важне за медицину
и фармацију.6 Па ипак треба имати у виду и недостатак липозома, које се огледа у
нестабилности и могућности грађења агрегата. [10] [11] [13] [14]
2.3. Слободни радикали и антиоксиданси
2.3.1. Слободни радикали

Слободни радикали су хемијске врсте које у структури честица (атома, молекула,
јона) имају један или више неспарених електрона у спољашњој љусци. У уобичајеним
околностима, честице садрже електроне у паровима супротних спинова, што омогућује
стабилност честица. Имајући у виду да изменом електрона са околним хемијским
врстама, слободни радикали могу постићи стабилност, они су најчешће веома
реактивни. Могу реаговати на више начина: тако што слободни радикал предаје
електрон нерадикалској врсти (долази до оксидације слободних радикала), тако што
слободни радикал преузима електрон нерадикалске врсте (долази до редукције
слободних радикала) и тако што се слободни радикал везује за нерадикалску врсту. У
току процеса ових реакција, врло лако долази до ланчане реакције која доводи до
стварања нових слободних радикала. [2] [7] [13]
Сви биолошки системи садрже слободне радикале који се формирају у току
метаболизма (на пример, у току редукције кисеоника до воде у електронском
транспортном ланцу у митохондријама) или под утицајем спољних фактора (на пример,
зрачења и тешких метала). Већина слободних радикала који су значајни за биолошка
истраживања имају кратак живот (време живота обично износи од једне наносекунде
до 10 секунди [7]), али постоје и примери слободних радикала са полувременом живота
од око 1h.7 Као последица кратког живота (али и ниске концентрације), јавља се
проблем у отежаној детекцији слободних радикала у биолошким системима. Овај
проблем се најчешће решава тако што се на слободне радикале дејствује другим
хемијским врстама, које их преводе у дугоживеће врсте. [7] [15]
Слободни радикали су неопходни живим биолошким системима, јер улазе у
важне биохемијске процесе у живим организмима (раст, метаболизам, дисање, одбрана
од патогена). Међутим, уколико се у живој ћелији појави сувише висока концентрација
6
И у Србији се раде истраживања у вези са транспортом лекова путем липозома. [31]
7
Аскорбил-радикал има време полуживота око 1h. [15]
6
слободних радикала, долази до оштећења важних биомолекула, те ћелија постаје
дисфункционална, а ова појава се назива оксидативни стрес, а он може довести до
многих обољења, као што су канцер, кардиоваскуларна обољења, дијабетес и слично.
Због тога живи системи поседују и антиоксидансе који смањују концентрацију
слободних радикала. У нормалним живим организмима постоји баланс између
концентрација слободних радикала и антиоксиданаса. У овим процесима, највећу улогу
имају слободни радикали који у свом саставу садрже кисеоник (на пример,
хидроксилни и супероксидни радикал), који се називају реактивне кисеоничне врсте8
или ROS (енгл. reactive oxygen species). Најзначајније реактивне кисеоничне врсте су
приказане на слици 5. Поред реактивних кисеоничних врста, за биолошке системе су
веома значајне и реактивне азотне врсте или RNS (енгл. Reactive Nitrogen Species). [2] [7]
[13]
синглетни кисеоник супероксидни анјон пероксидни анјон хидроксилни радикал
Слика 5. Најзначајније реактивне кисеоничне врсте у биолошким системима

(неспарени електрони су обележени црвеном бојом)9
2.3.2. Антиоксиданси
Антиоксиданси су сва једињења која смањују утицај слободних радикала, тако
што и при ниским концентрацијама у односу на ћелијске биомолекуле, спречавају
оксидацију истих биомолекула (која би се десила због присуства слободних радикала).
Ово се дешава тако што се антиоксиданси оксидују у реакцији са слободним
радикалима (предају им електроне). Антиоксиданси се могу синтетисати у организму
или унети преко хране. [2] [7] [13]
Систем антиоксидативне заштите организма чине ензимски и неензимски
антиоксиданси. Најзначајнији ензимски антиоксиданси су супероксид дисмутаза
(SOD), глутатион пероксидаза (GPx) и каталаза (CAT), а најважнији неензимски
антиоксиданси су аскорбинска киселина (витамин C), α-токоферол (витамин E),
флавоноиди, каротеноиди и глутатион (GSH). Антиоксиданси који су битни за људски
организам се деле на ендогене (синтетишу се у организму) и егзогене (уносе се преко
хране или лекова). У ендогене антиоксидансе спадају ензими (супероксид дисмутаза,
глутатион пероксидаза, каталаза), глутатион, мокраћна киселина, протеини који садрже
8
Треба имати у виду да нису све реактивне кисеоничне врсте слободни радикали, него само оне које
садрже неспарене електроне.
9
7
јоне метала и други; а у егзогене антиоксидансе спадају витамин C, витамин Е,
флавоноиди, каротеноиди, фенолне киселине и други. [2] [7] [13]
Антиоксидативна активност је способност инхибиције реакција оксидације.
Овај појам није исто што и антирадикалска активност, јер се односи на све могуће
реакције оксидације (па и на оне које настају нерадикалским механизмима), док
антирадикалска активност представља способност једињења да реагује са слободним
радикалима. [7] [13]
2.3.3. Фентонова реакција

Фентонову реакцију је открио хемичар Хенри Џон Фентон, а ова реакција је
важна за многе биохемијске процесе у живим организмима. Њен основни облик је
следећи:
·
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH¯ + OH
Дакле, јони гвожђа се оксидују из двовалентног у тровалентно стање при реакцији са
водоник-пероксидом, а при томе настају реактивни хидроксилни радикали. Ова
реакција није тако једноставна, већ се у току реакције јавља низ интермедијерних
комплекса. Важно је приметити да при Фентоновој реакцији настаје хидроксилни
радикал, који је веома реактиван и може оштетити биомолекуле. [22] [23] [24]
2.4.
2.4. Електронска парамагнетна резонанција
2.4.1.
2.4.1. Спински магнетни момент електрона
На основу закона класичне физике произилази да кретање наелектрисаних
честица (електрична струја) узрокује појаву магнетне индукције (магнетног поља). То
доводи до идеје да се на основу постојања микроструја објасне магнетне особине
супстанце. [5]
Према Боровом моделу атома, сви атоми се састоје од језгра (које је позитивно
наелектрисано) око којег круже електрони (који су негативно наелектрисани).
Електрони се истовремено крећу кружно око језгра и ротирају око сопствене осе. Оба
оваква кретања електрона предствљају микрострују која доводи до стварања магнетног
момента. Ротација електрона око језгра проузрокује орбитни магнетни момент, а
ротација електрона око сопствене осе проузрокује спински магнетни момент. Међутим,
савремена истраживања из атомистике показују да Боров модел атома не одговара
реалном атому, те се зато уводи векторски модел атома. У векторском моделу атому,
орбитни и спински магнетни моменти се посматрају као придружени вектори
електрона и не проучава се њихово порекло. [5]
8
Једна од основних карактеристика елементарних честица је спин (сопствени
угаони момент или спински угаони момент). Спин се одређује на основу следеће
релације:
= + 1 ħ
(1)
где је – спин (спински угаони момент), – спински квантни број (за електрон износи

= ), ħ – редукована Планкова константа (њена вредност је одређена изразом: ћ = ,
где је ℎ – Планкова константа)10 и

– јединични вектор спина. [5]
Вектору спина електрона се придружује спински магнетни момент електрона
(који је такође вектор), који се одређује на основу следеће једнакости:

= ∙ = − ∙
µ ∙ (2)
(2)

где је
µ – спински магнетни момент, – жиромагнетни однос електрона, – Ландеов
фактор (за слободне електроне има вредност ≈ 2,0023), – елементарно
наелектрисање11 и – маса електрона12. [5] [6] [7]
Једнакост (2) указује да вектори спинског угаоног момента и спинског магнетног
момента, имају исти правац, али супротне смерове, што је приказано на слици 6.

$

Слика 6. Спински магнетни момент и спински угаони момент 13
На основу израза (1) и (2) изводи се следећа релација:

µ = − ∙ ∙ + 1 ∙ = − μ" + 1
(3)
(3)

где је μ" = # – Боров магнетон14 (јединица магнетног момента електрона). [5] [6] [7]

Оријентације спинских магнетних момената, без присуства спољашњег поља, су
случајне у сваком тренутку, па на основу тога, спински магнетни моменти имају исту
10
Приближна вредност Планкове константе износи: ℎ = 6,6261 · 10-34 J s, а приближна вредност
редуковане Планкове константе износи ħ = 1,05456 · 10-34 J s. [5]
11
Приближна вредност елементарног наелектрисања износи: = 1,6022 · 10-19 С. [5]
12
Приближна вредност масе електрона износи: = 9,1094 · 10-31 kg. [5]
13
14
Приближна вредност Боровог магнетона износи: µ" = 9,2740 · 10-24 J T-1. [5]
9
енергију, те се њихова стања називају дегенерисана.15 Међутим, присуство магнетног
поља проузрокује укидање дегенерације електрона, и спински магнетни моменти
електрона се преоријентишу на такав начин да њихова пројекција у односу на правац
деловања спољашњег магнетног поља (за који се најчешће, као и овде, узима z-оса) има
вредности према следећој релацији:
$% = − $" (4)
(4)
где је – спински магнетни квантни број (може да има вредности −, − + 1, … + ;

на основу чега следи да за електрон има вредности = ± ). [5] [6] [7]
Према једнакости (4) произилази да спински магнетни моменти у присуству
спољашњег магнетног поља могу да имају само два стања (две оријентације). Ове
оријентације се обележавају словима грчког алфабета: α – паралелна оријентација – у
смеру поља, и β – антипаралелна оријентација – супротна смеру поља. [6]
Спољашње магнетно поље делује на спински магнетни момент електрона, а
енергија њихове међусобне интеракције је једнака производу пројекције спинског
магнетног момента електрона на правац спољашњег поља и магнетне индукције
спољашњег поља16:
)* = − $% +
= $" +
(5)
(5)
где је )* – енергија спинских стања електрона, а +
– магнетна индукција спољашњег
поља. Ова појава је приказана на слици 7. [5]
(а) (б) )*

$" +
+ = 0 + = +
1
= + +
2 2
1
=
2
0
1
= ±
2 1
= − −
2 2

Слика 7. Енергија спинских стања електрона за = (а) без присуства спољашњег
магнетног поља (б) при присуству спољашњег магнетног поља17
15
Дегенерисана стања су различита стања са истом енергијом. Степен дегенерације представља број
начина на који се може остварити одређено стање енергије. [5]
16
Енергија магнетног дипола у хомогеном магнетном пољу је једнака негативном скаларном производу
магнетног момента дипола и магнетне индукције поља. У овом случају имамо: )* = − µ
=
+
− µ +
cos 0. У овом случају важи да је пројекција магнетног момента на z-осу једнака µ% = µ cos 0, па
следи да важи једнакост )* = − $% +
. [5]
17
10
2.4.2.
2.4.2. Принцип електронске парамагнетне резонанције (ЕПР)
У поглављу 2.4.1. је објашњено како спољашње магнетно поље утиче на спински
магнетни момент слободних електрона. Слично важи и за честице (атоме, молекуле,
јоне, слободне радикале) који садрже везане неспарене електроне (то јест,
парамагнетне материјале). За такве системе, релација (5) добија следећи облик:
)12 = − $% +
= $" 34 +
(6)
(6)
где је 5 – укупни спински угаони момент, а 34 – укупни магнетни спински квантни број
(може да има вредности −5, −5 + 1, ... +5; односно укупно има 25 + 1 вредности). [6] [7]
Према томе, када се честица са неспареним електронима постави под утицај
спољашњег магнетног поља, уочава се цепање спинских нивоа (које одређује укупни
спински угаони момент – 5), а добијени нивои у присуству спољашњег магнетног поља
се називају Земанови нивои. Број Земанових нивоа представља укупан број могућих
вредности укупног магнетног спинског квантног броја, што значи да зависи од броја
неспарених електрона, а то се може приказати кроз неколико најједноставнијих
примера, који се најчешће јављају (табела 1). За систем са једним неспареним
електроном, ова појава је илустрована на слици 8. [6] [7]
Табела 1. Зависност броја спинских нивоа у спољашњем магнетном пољу од броја

неспарених електрона
Број неспарених Укупни магнетни Број спинских
Укупни спински
електрона у спински квантни број (Земанових)
угаони момент (5)
систему честице (34 ) нивоа
1 1 1
1 5 = 34 ∈ 7− , + 8 2
2 2 2
1 1
2 5 = + = 1 34 ∈ 9−1, 0, +1: 3
2 2
1 1 1 3 3 1 1 3
3 5 = + + = 34 ∈ 7− , − , + , + 8 4
2 2 2 2 2 2 2 2
@A
BC >
+
?
;< ;=
>
−
?
Слика 8. Вредности спинског магнетног момента и његове пројекције у спољашњем

магнетном пољу за 5 = 18
18
11
Електронска парамагнетна резонанција (ЕПР)19 или електронска спинска
резонанција (ЕСР) или електронска магнетна резонанција (ЕМР) је појава која се
дешава када честице са неспареним електронима, које се налазе у присуству спољашњег
магнетног поља, ступају у интеракцију са микроталасним електромагнетним зрачењем,
које доводи до прелаза између Земанових нивоа неспарених електрона. [6] [7] [8] [13]
Појава електронске парамагнетне резонанције се не уочава код свих честица, јер
немају све честице неспарене електроне. Најважније хемијске врсте које у свом саставу
имају неспарене електроне су слободни радикали и јони прелазних метала. Такође,
треба имати у виду и да нису сви прелази између Земанових спинских нивоа могући,
већ само они који задовољавају изборно правило:
∆34 = ±1 (7)
(7)
У систему са једним неспареним електроном (слика 9), при присуству спољашњег

магнетног поља, постоје два спинска нивоа. Спински ниво више енергије (за 34 = )
има паралелну оријентацију (обележава се са E), а спински ниво ниже енергије (за

34 = − ) има антипаралелну оријентацију (обележава се са F). Њихове енергије ()G и
)H ) следе из израза (6), а приказане су у изразима (8) и (9). [6] [7] [8] [13]

)G = $" +
(8)

)H = − $" +
(9)
(9)
Разлика енергије спинских нивоа за системе са једним неспареним електроном износи:
∆) = )G − )H = $" +
(10)
Слика 9. Спински нивои система са једним неспареним електроном у одсуству (лево) и

присуству (десно) магнетног поља20
19
Принцип електронске парамагнетне резонанције је открио физичар Јевгениј Завојскиј (рус. Евгений
Завойский) 1944. године. Електронска парамагнетна резонанција је касније стекла изузетно важну
примену у хемији, физици, физичкој хемији, медицини и у другим областима науке, као и у привреди. [13]
20
12
Прелази између спинских стања електрона, током електронске парамагнетне
резонанције, одигравају се у оба смера, дакле, истовремено се дешавају прелази из
стања ниже у стање више енергије, као и обрнуто. Од бројности електрона у
одговарајућим спинским стањима зависи који ће од ова два процеса бити доминантан.
Према Болцмановом закону расподеле, однос броја електрона (за систем честица са
једним неспареним електроном) ниже и више енергије одређен је следећом релацијом:
IJ ∆L OP
Q
= MN = MN ≈ 1 + (11)
IK RS
где је TH – бројчана концентрација електрона са антипаралелном оријентацијом, TG –
бројчана концентрација електрона са паралелном оријентацијом, U – Болцманова
константа21, V – температура и W – фреквенција електромагнетног зрачења. [6]
Пошто је енергија UV на собној температури доста већа од енергијске разлике
спинских нивоа (ℎW), на основу Болцмановог закона произилази закључак да је број
електрона антипаралелне оријентације (ниже енергије) мало већи у односу на број
електрона паралелне оријентације (више енергије), односно да је укупан ефекат
електронске парамагнетне резонанције апсорпција електромагнетног зрачења. [6]
Прелаз електрона између ова два нивоа је могућ само ако се на систем делује
електромагнетним зрачењем које има енергију, која износи тачно онолико колико
износи разлика енергије спинских нивоа. На основу овог следи једнакост (12). [6]
∆Е = ℎ ∙ W = $" +
(12)
На основу релације (12) изводи се услов резонанције за појаву ЕПР спектра, који је
приказан једнакошћу (13).
X YZ "[
W = (13)
До резонанције се може доћи на два начина, мењањем фреквенције
електромагнетног зрачења при константној магнетној индукцији спољашњег магнетног
поља или мењањем магнетне индукције спољашњег магнетног поља при константној
фреквенцији електромагнетног зрачења. Најчешће се резонантни услов постиже
мењањем магнетне индукције спољашњег магнетног поља, јер је тако технички
једноставније. [6] [7] [13]
ЕПР метода се заснива на мерењу апсорпције микроталасног зрачења, до чега
долази при услову резонанције за парамагнетне супстанце (хемијске врсте са
неспареним електронима). Ово може да буде и мана и предност ЕПР технике.
Парамагнетних супстанци у природи има мало, јер већина супстанци из природе има
спарене електроне, што може отежати налажење супстанце за снимање ЕПР спектра.
Међутим, уколико анализирамо сложене системе, ова малобројност ЕПР активних
једињења може знатно поједноставити анализу. Такође, код снимања ЕПР спектра неке
парамагнетне суспстанце, чињеница да хемијске врсте са спареним електронима не
21
Приближна вредност Болцманове константе износи: U = 1,3807 · 10-23 J K-1. [5]
13
утичу на спектар, нам омогућује једноставну детекцију тражене парамагнетне
супстанце. [6] [7] [8] [13]
2.4.3.
2.4.3. Параметри ЕПР спектра
2.4.3.1. Положај спектра

Положај линије у ЕПР спектру се обично наводи као вредност Ландеовог
фактора (-фактора). Услов резонанције, односно релација (13) указује да је Ландеов
фактор () константа пропорционалности између резонантне фреквенције и магнетне
индукције спољашњег поља. Већ је поменуто да за слободне електроне Ландеов фактор
износи = 2,0023. Везани електрони су под утицајем магнетног поља језгара и
електрона који припадају истом систему, те на основу тога, Ландеов фактор везаних
електрона се разликује од Ландеовог фактора слободних електрона, а разлика зависи од
окружења посматраног електрона. [6] [7]
Већина слободних радикала од биолошког значаја имају неспарене електроне
који се делимично слободно крећу у делокализованим орбиталама, те њихове
вредности Ландеовог фактора мало одступају од вредности Ландеовог фактора
слободних електрона, тачније варирају у опсегу ±0,003 од вредности . Комплекси
јона прелазних метала имају већа одступања Ландеовог фактора, тачније њихове
вредности Ландеовог фактора варирају 0,2 до 10,0. Ово одступање се јавља као
последица припадања електрона системима у којима постоји Расел-Сандерсово
спрезање22, које је дато следећом једнакошћу:
\ \] ^ _ _] ] 4 4]
= 1 + (14)
\ \]
где је 5 – спински угаони момент, ` – орбитални угаони момент, а a – укупни угаони
момент23. [6] [7]
2.4.3.2. Интензитет спектралних линија

Интензитет спектралних линија ЕПР спектра највише зависи од разлике
запоседнутости основних и побуђених спинских нивоа електрона између којих се врше
прелази, а ова разлика се може добити на основу Болцмановог закона расподеле, који је
приказан у релацији (11). Интензитет линија такође зависи и од положаја узорка
приликом постављања у ЕПР спектрометру (слика 10). [6] [8]
22
Расел-Сандерсово спрезање постоји код хемијских врста код којих електростатичко одбијање
преовлађује над магнетном интеракцијом. Јавља се код већине атома осим најмасивнијих. Код овог
спрезања спински моменти електрона се спрежу у спински момент атома, орбитални моменти електрона
се спрежу у орбитални момент атома, а укупни спински моменти електрона се спрежу у укупни спински
момент атома. [41]
23
Укупни угаони момент је једнак збиру спинског и орбиталног угаоног момента. [41]
14
амплитуда ЕПР сигнала угао ротације (степени)
Слика 10. Зависност амплитуде ЕПР сигнала од угла ротације за филм-дозиметар

сниманог у ТЕ102 резонатору24
2.4.3.3. Ширина спектралних линија

Имајући у виду да за већину система са неспареним електронима при присуству
спољашњег магнетног поља на собној температури, број електрона у нижем и вишем
спинском стању је приближно једнак, али врло мало већи у нижем стању
(антипаралелне оријентације). На основу тога би се могло закључити да дејство
микроталасног зрачења може довести до изједначења запоседнутости оба нивоа
(сатурације) у кратком временском интервалу. Међутим, то се не дешава због процеса
релаксације, који без емисије зрачења преоријентишу електроне са вишег на нижи
ниво, чиме спречавају сатурацију и омогућавају даљу апсорпцију микроталасног
зрачења. [6] [8]
Од релаксационих процеса зависи ширина спектралних линија. Према
Хајзенберговом принципу неодређености25, неодређеност времена је обрнуто
пропорционална неодређености енергије, из чега следи да, уколико је релаксационо
време краће, већа је неодређеност енергије, односно шире се енергијски нивои, то јест
долази до ширења спектралних линија. Дакле ширина линија је обрнуто
пропорционална релаксационом времену. [5] [6] [8]
Постоје две врсте релаксационих процеса: спин-околина релаксација и спин-
спин релаксација. Спин-околина (или спин-решетка) релаксација се дешава када
неспарени електрони пренесу вишак енергије околини, коју околина акумулира у
облику топлоте. Овај процес је веома ефикасан за јоне прелазних метала и њихових
24
25
Према Хајзенберговом принципу неодређености, за било коју честицу вежи да је производ

неодређености положаја и неодређености импулса (количине кретања) већи или једнак од вредности ,
#
где је ℎ – Планкова константа. Из овог следи да је неодређеност енергије (bЕ ) обрнуто пропорционална
[5]
неодређености времена (bc); тачније, bЕ · bc ≥ .
#
15
комплекса у чврстом стању и растворима (за разлику од раствора органских слободних
радикала), те због малог релаксационог времена на собним и вишим температурама,
линије су широке и губе се. Па ипак, овај проблем се може превазићи тако што се ЕПР
спектри јона прелазних метала и њихових комплекса снимају на ниским
температурама, јер се са снижењем температуре релаксационо време повећава. Спин-
спин релаксација се дешава под утицајем суседних електрона, тако што се магнетно
поље око посматраног електрона мења под дејством сопственог магнетног поља
суседних електрона. Спин-спин релаксација је обично ефикасан процес (долази до
ширења спектралних линија), осим у случају веома разблажених раствора. [6] [8]
На ширину спектралних линија, осим релаксационих процеса, утиче и то што се
резонанција спинова неспарених електрона не дешава истовремено, због чега ЕПР
линије добијају гаусовски облик. Ова појава може бити последица нехомогености
спољашњег магнетног поља, утицаја локалних поља и различите оријентације система у
чврстом стању. [6] [8]
2.4.3.4. Хиперфина структура

Структура ЕПР спектра не зависи само од неспарених електрона, већ се код ЕПР
спектра јављају три врсте мултиплетне структуре: хиперфина, суперхиперфина и фина
структура. Хиперфина структура се јавља услед интеракције неспареног електрона и
језгра од којег потиче неспарени електрон; суперхиперфина структура је последица
интеракције неспареног електрона и суседног језгра; а фина структура настаје због
утицаја других неспарених електрона у оквиру истог молекула на посматрани
неспарени електрон. Од ове три структуре, нејвећи значај за проучавање ЕПР спектара
има хиперфина структура. [13]
Хиперфина структура се јавља код хемијских врста које имају нуклеарни
спински магнетни момент различит од нуле (односно спински квантни број језгра
различит од нуле), који доводи до цепања спинских нивоа електрона. Спински квантни
број језгра (f) зависи од укупног броја протона (g) и неутрона (h) у језгру:
• парно g, парно h: f = 0
i j k
• непарно g, парно h; или парно g, непарно h: f = , , , …
• непарно g, непарно h: f = 1, 2, 3, 4 … [6] [7] [8]
Језгра која доводе до цепања електронских спинских нивоа, за сваку вредност
магнетног спинског квантног броја неспареног електрона (34 ), доводе до стварања
укупно 2f + 1 електронских нивоа. У овом случају до прелаза може доћи уколико је
поред већ поменутог изборног правила (∆34 = ±1), задовољено и додатно изборно
правило:
∆3m = 0 (15)
16
где је 3m – магнетни спински квантни број језгра (који може да има вредности −f,
−f + 1, … +f, односно укупно има 2f + 1 вредности, слично као за магнетни спински
квантни број електрона). Цепање енергијских нивоа због хиперфине интеракције за

систем у којем важи 5 = и f = је приказано на слици 11. [6] [7] [8] [13]

Слика 11. Хиперфино цепање енергијских нивоа: (а) у статичком магнетном пољу, (б)
постепеном променом магнетног поља26
Квантитативна мера хиперфине интеракције се обично представља преко

производа ℎn
, где је ℎ – Планкова константа, а n
– константа хиперфиног цепања.
Према томе, енергија хиперфине интеракције се може представити на основу следеће
релације:
)om = ℎ p nR 34 3mR (16)
где је )om – енергија хиперфине интеракције, nR – константа хиперфиног цепања за U-
то језгро, 34 – магнетни спински квантни број неспареног електрона, а 3mR –
магнетни спински квантни број U-тог језгра.
Укупна енергија магнетне интеракције система се добија када изразу за енергију из
релације (6) додамо енергију хиперфине интеракције, дакле:
) = μ" +
34 + ℎ p nR 34 3mR . [6] (17)
26
17
2.4.4.
2.4.4. ЕПР спектрометар
ЕПР спектрометри су уређаји који детектују појаву електронске парамагнетне
резонанције и омогућавају снимање ЕПР спектра. Постоје две врсте ЕПР
спектрометара: CW (енгл. continuous wave, то јест континуалан талас) и FT (енгл.
Fourier transform, то јест Фуријева трансформација). Код CW спектрометра (који се
чешће користи), услов резонанције се постиже мењањем магнетне индукције
спољашњег магнетног поља при константној фреквенцији електромагнетног зрачења.27
Код FT спектрометра, услов резонанције се постиже мењањем фреквенције
електромагнетног зрачења при константној магнетној индукцији спољашњег магнетног
поља, а детектор мери разлику интензитета зрачења рефлектованог из резонаторског
простора, што се помоћу Фуријевих трансформација преводи у ЕПР спектар. [8] [13]
модулатор поља
Ганова
диода
изолатор
ослабљивач циркулатор резонаторски
појачивач
простор сигнала
детектор
рачунар
електромагнет
детектор-посматрач
узорак
Слика 12. Општа схема ЕПР спектрометра28
Општа схема ЕПР спектрометра (тип CW) је приказана на слици 12. Извор
микроталасног зрачења код ЕПР уређаја је Ганова диода29, а она емитује монохроматско
зрачење. Ово зрачење прво долази до изолатора, који пропушта зрачење према узорку,
смањујући пертурбације. Затим зрачење стиже до ослабљивача, који смањује
интензитет зрачења, претварајући део зрачења у топлоту, и на тај начин се јачина
електромагнетних таласа прилагођава узорку. Након тога, микроталасно зрачење
27
Ова фреквенција може имати вредности 1-2 GHz (L-област), 2-4 GHz (S-област), 8-10 GHz (X-област),
35 GHz (Q-област) и 95 GHz (W-област). [7]
28
29
Старији уређаји уместо Ганове диоде имају клистрон.
18
долази до циркулатора (дирекционог куплера), који усмерава зрачење ка резонаторском
простору. Узорак се уноси у резонатор (који се налази између два пола електромагнета),
у којем се линеарно мења јачина магнетног поља. До апсорпције зрачења долази када се
успостави услов резонанције. Полупроводнички детектор претвара електромагнетно
зрачење у електричну струју, коју учитава и исписује рачунар. Неапсорбовано
микроталасно зрачење, рефлектујући се са детектора, враћа се у циркулатор, одакле се
усмерава у посебан таласовод и претвара у топлоту. [8] [13]
Узорци који се постављају у резонатор уређаја су обично течног или чврстог
агрегатног стања, мада могу бити и гасовити. Пре постављања у резонаторски простор,
узорак се уноси у стаклену или кварцну цев танких зидова, која је претходно очишћена
од присуства парамагнетних супстанци. [8] [13]
2.4.5. Спинск
Спинскеске пробе
Спинске пробе су стабилни парамагнетни радикали. Најчешће су то једињења са
нитроксидном групом која садржи неспарен електрон, а тај електрон је стабилизован
због присуства неколико метил група у орто-положају у односу на азот, које
омогућавају заклањање тог неспареног електрона. Пример често коришћене спинске
пробе и њен ЕПР спектар су приказани на слици 13. Спински обележивачи су супстанце
које у хемијском саставу садрже спинску пробу везану за тачно одређена места у
молекулима масних киселина. Користе се за уношење спинских проба у биолошке
системе. [7] [8]
Слика 13. Спинска проба ТEMPON : (а) структурна формула, (б) ЕПР спектар30
2.4.6. Хватачи спинова

Хватачи спинова (који су познати и под називом спин-трапови) су дијамагнетне
хемијске врсте са нитроксидном или нитрозо-групом, које омогућавају детекцију
слободно-радикалских краткоживећих врста, тако што у реакцији са њима граде
стабилна (дугоживећа) ЕПР активна једињења, која су позната под називом спин-
30
19
адукти. Ова метода је ЕПР спин-трап метода, а може се користити и за квалитативну и
за квантитативну анализу. [7] [8] [13]
DEPMPO (слика 14) је један од често коришћених хватача спинова у
биохемијским истраживањима. То је органско једињење 5-диетоксифосфорил-5-метил-
1-пиролин-N-оксид (енгл. 5-diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide), а његова
емпиријска хемијска формула је C9H18NO4P. Може да реагује са слободним радикалима
градећи дугоживеће адукте, што индиректно омогућује да се детектују краткоживеће
радикалске врсте (слика 15). Ове хемијске врсте се детектују на основу снимања ЕПР
спектра одговарајућег адукта, а то је могуће јер се ЕПР спектри различитих адуката
добијених од слободног радикала DEPMPO разликују због постојања суперхиперфине
структуре (услед утицаја различитих суседних група на неспарен електрон). [27] [28] [29]
Слика 14. Структурна формула DEPMPO 31
Слика 15. Реакција DEPMPO са хидроксилним и супероксидним радикалом32
2.4.7.
2.4.7. Одређивање антиоксидативне активности
На основу снимљених ЕПР спектара одређеног узорка и контроле за тај узорак,
могуће је одредити антиоксидативну активност узорка, а то се ради на основу следеће
формуле:
31
32
20
А
− А
АА = (18)
А
где је АА – антиоксидативна активност, А

– површина испод свих ЕПР максимума
контроле, а А – површина испод свих ЕПР максимума узорка. [7]
Уколико је ЕПР спектар сложен или има лошу базну линију, веома компликовано
је очитати површину испод ЕПР спектра, те се тада у формули (18), уместо површина,
користе измерене вредности висина одређеног ЕПР максимума. [7]
У анализама биолошких система као стандард за одређивање антиоксидативне
активности се често користи стабилан (дугоживећи) слободан радикал DPPH (слика
16). Ова супстанца је органско једињење 2,2-дифенил-1-пикрилхидразил (енгл. 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl, скраћено DPPH), а његова емпиријска хемијска формула је
C18H12N5O6. DPPH у растворима реагује са антиоксидансима (слика 17), при чему се
редукује и мења боју из љубичасте у жуту, што омогућује његову примену за
одређивање антиоксидативне активности. [7] [13] [25]
Слика 16. Структурна формула DPPH 33
+ ArOH
- ArO.
Слика 17. Реакција DPPH радикала са антиоксидансом ArOH 34
33
34
21
2.5. Течна хроматографија високих перформанси
2.5.1. Основно о HPLC методи

Хроматографија је физичкохемијска метода помоћу које се врши раздвајање, као
и квалитативна и квантитативна анализа одређене смеше на основу тога што различите
компоненте те смеше на различит начин интерагују са одређеном супстанцом са којом
долазе у контакт. Поступак хроматографије се изводи тако што се прво испитивани
узорак раствори у неком растварачу, а овако добијен раствор представља покретну
(мобилну) фазу; те се затим покретна фаза преводи преко непокретне (стационарне)
фазе. У случају течне хроматографије, покретна фаза је течност, а непокретна фаза је
чврста гранулована супстанца или течност нанешена на грануле чврстог носача. Пошто
је покретна фаза у течном агрегатном стању, течна хроматографија се најчешће изводи
на температурама које су блиске собној температури, што указује да је ова метода
погодна за анализу биолошки важних органских једињења, која су нестабилна на
високим температурама. [2] [16] [17]
Интеракција између мобилне и стационарне фазе се током процеса
хроматографије остварује у простору који се назива хроматографска колона. Растварач
помоћу којег узорак пролази кроз колону се назива елуент, а поступак његовог увођења
у колону је елуирање. Елуирање може бити изократско или градијентно – код
изократског елуирања састав елуента остаје исти током целог експеримента, а код
градијентног елуирања састав елуента се мења према унапред задатом програму ради
бољег раздвајања и смањења времена анализе. [17]
Избор покретне и непокретне фазе зависи од смеше коју анализирамо, као и од
компонената смеше које су нам од значаја за анализу. Савремени урађаји за течну
хроматографију омогућавају анализу са више парова покретне и непокретне фазе на
једном уређају, аутоматско управљање процесом, прикључење више врста детектора,
веома малу количину узорка која је неопходна за анализу и друге погодности. Уређај са
оваквим карактеристикама се назива HPLC (енгл. High Performance Liquid
Chromatograph) – течни хроматограф високих перформанси, а самим тим и
хроматографија помоћу оваквих уређаја – течна хроматографија високих перформанси.
Течна хроматографија високих перформанси је много прецизнија и тачнија у односу на
класично елуирање кроз хроматографску колону под дејством силе гравитације. [2] [16] [17]
2.5.2
2.5.2. Типови течне хроматографије
У зависности од начина на који се извршава хроматографски поступак, постоји
неколико врста течне хроматографије:
• хроматографија нормалних фаза
Ова врста хроматографије подразумева да је покретна фаза неполарна (најчешће
органски растварачи), а непокретна поларна супстанца (најчешће силика-гел са
22
површином која садржи поларне групе). Базира се на различитом афинитету
различитих супстанци да граде слабе везе, као што су Ван дер Валсове и дипол-дипол
везе. Неполарни молекули брже напуштају колону од поларних, јер су јаче
међумолекулске интеракције поларних молекула узорка са поларним молекулима
непокретне фазе у односу на интеракције неполарних молекула узорка са поларним
молекулима непокретне фазе. Овај тип хроматографије представља најстарији облик
хроматографије, али се у данашње време не користи, јер се поларне компоненте (попут
воде) везују за непокретну фазу колоне, па није могуће поновити један исти
експеримент (нема репетабилности). [17]
• хроматографија обрнутих (реверзних) фаза
Ова врста хроматографије подразумева да је покретна фаза поларна (најчешће
вода или водени раствор), а непокретна неполарна супстанца (најчешће силика-гел са
површином која садржи алкил-групе или фенил-групе). Слично као и код
хроматографије нормалних фаза, базира се на различитом афинитету молекула да граде
слабе везе, међутим, у хроматографији реверзних фаза, неполарни молекули спорије
напуштају колону од поларних (компоненте имају обрнут редослед изласка из колона у
односу на хроматографију нормалних фаза). Колоне за овај тип хроматографије су
дуготрајне, а овај облик хроматографије је погодан за већину биолошких система који
садрже супстанце са ароматичним прстеновима. [17]
• јоноизмењивачка хроматографија
Ова врста хроматографије раздваја компоненте и омогућава анализу узорака
чије су компоненте наелектрисане на основу различитог афинитета различитих
компоненти да измењују јоне са непокретном фазом. Стационарну фазу чине
јоноизмењивачке смоле, које се састоје од инертног синтетичног полимера на чијој
површини су ковалентно повезане јонске групе. Јони мањих димензија и мањег
наелектрисања брже напуштају колону због мањег афинитета према јонским групама.
На основу врсте јона које везују, јоноизмењивачке групе могу бити катјонске, анјонске
и амфотерне. Катјонске јоноизмењивачке смоле везују катјоне (садрже киселе
функционалне групе), анјонске везују анјоне (садрже базне функционалне групе), а
амфотерне везују и катјоне и анјоне (садрже и базне и киселе функционалне групе). [17]
• ексклузивна (гел) хроматографија
Ова врста хроматографије служи за раздвајање компоненти по величини
честица. Колоне се састоје од гранула са порама различитих величина. Компоненте
мањих димензија улазе у поре и задржавају се у њима, а компоненте већих димензија не
могу ући и поре и заобилазе их. Због тога већи молекули брже напуштају колону од
мањих. [17]
• афинитетна хроматографија
23
Ова врста хроматографије се користи за раздавајање већих молекула (најчешће
(најчеш
биолошки важних органских једињења) које имају специфичне интеракције са посебно
припремљеном стационарном фазом. [17]
• танкослојна хроматографија
Ова врста хроматографије се фундаментално разликује од осталих врста, јер
компоненте узорка не пролазе кроз колону, него се посматра кретање компоненети
узорка који је нанешен на танак слој. Ово кретање је последица капиларних сила,
различите компоненте се крећу ра
различитим
читим брзинама, те након одређеног
одређен времена ће
доћи до раздвајања компоненти. Стационарна фаза може бити папир (у том случају
имамо хроматографију на папиру) или неки адсорбенс (на пример, силика-гел)
силика нанешен
на стаклену или пластичну плочу. [17]
2.5.3. Течни хроматограф високих перформанси

2.5.3.
Иако течне хроматографе високих перформанси производе различити
произвођачи, за све HPLC уређаје је скоро иста схема (слика 18).
Слика 18.. Општа схема течног хроматографа високих перформанси: (1) резервоар
мобилне фазе, (2) дегасификатор мобилне фазе, (3) вентил, (4) мешач, (5) пумпа, (6)
вентил за надзор, (7) инјекциони систем, (8) филтер или предколона, (9) колона, (10)
детектор, (11) рачунар, (12) колектор отпада;35
Сваки хроматограф за HPLC анализу садржи посебан резервоар у који се сипа

растварач који има улогу мобилне фазе. Најчешће је потребно имати више резервоара,
јер је за многе анализе неопходно више растварача. Ови растварачи прво пролазе кроз
дегасификатор
ификатор мобилне фазе у циљу ук уклањања
ња гасовитих супстанци из течне фазе
(гасовите супстанце ометају рад пумпе и онемогућују правилан проток елуента кроз
колону), а затим помоћу одговарајућег вентила прелазе у мешач. Растварачи из
35
24
резервоара у мешач стижу различитим брзинама што омогућава стварање покретне
фазе одређеног хемијског састава. Мобилна фаза се покреће уз помоћ пумпе која ради
под притиском од 105 до 108 Pa, а оваква пумпа је произведена да може да омогући
континуалну промену брзине покретне фазе у широком интервалу протока без
пулсирања. Покретна фаза из пумпе, пролазећи кроз вентил за надзор, долази у
инјекциони систем, коју омогућава уношење узорка у мобилну фазу. Количина узорка за
анализу је обично од 5 до 20 μl. Уношење узорка се најчешће врши помоћу кружних
система за дозирање, који су програмирани да уносе тачно одређене количине узорка у
тачно одређеним временским интервалима. Након тога, покретна фаза преко филтера
прелази у колону. Колоне су цеви испуњене гранулама непокретне фазе, а од хемијског
састава покретне фазе у колони зависи и могућност примене дате колоне. Различите
хемијске компоненте из покретне фазе различитим брзинама пролазе кроз
хроматографску колону, те ће у различитим временима изаћи из колоне и стићи до
детектора. Детектори који се користе у течној хроматографији су високе осетљивости, а
дају струјни сигнал који је пропорционалан концентрацији аналита. Овај сигнал се
региструје у меморији рачунара. [2] [16] [17]
2.5.4. Детектори за течну хроматографију

Постоји више врста детектора: детектори на бази ултраљубичасте
спектрометрије, флуоресцентни детектори, радиометријски детектори, поларографски
детектори, кондуктометријски детектори и други. Који ће се детектор користити
зависи од врста компоненти које се анализирају. [16] [17]
Детектори на бази ултраљубичасте спектрометрије се користе за детекцију
супстанци које апсорбују електромагнетно зрачење у ултраљубичастој области спектра.
Због тога су ови детектори веома погодни за детекцију већине органских једињења са
ароматичним прстеновима и двоструким везама око атома кисеоника, угљеника, азота и
сумпора. Ови детектори садрже проточну ћелију (која је пропустљива за
ултраљубичасто зрачење) кроз коју пролази мобилна фаза након изласка из колоне. На
проточну ћелију се делује ултраљубичастим зрачењем чиме се мења апсорбанција
раствора, која доводи до промене фотострује у струјном колу фотодиоде. [16] [17]
Флуоресцентни детектор се користи за детекцију супстанци које показују
флуоресценцију (на пример, једињења са ароматичним прстеном или π-конјугованим
везама). Принцип рада овог детектора је сличан принципу рада детектора на бази
ултраљубичасте спектрометрије – флуоресценти детектори садрже проточну ћелију
кроз коју пролази покретна фаза, а на њу делује зрачење које изазива појаву
флуоресцентног зрачења, које се одговарајућим дисперзионим елементом усмерава ка
фотоћелији. [17]
У течној хроматографији постоји могућност да се са HPLC уређајем повеже
масени спектрометар као детектор. На тај начин се добија техника које се назива течна
25
хроматографија са масеном спектрометријом. Ова метода је врло тачна, прецизна и
осетљива за сва једињења. [16] [17]
2.5.5
2.5.5. Квалитативна и квантитативна анализа
Након урађене хроматографије добија се хроматограм (слика 19) – то је график
зависности сигнала детектора од времена протока кроз колону (то јест, ретенционог
времена). Сигнали на хроматограму се називају хроматографски пикови (или траке), и
најчешће имају облик Гаусове функције расподеле. [17]
Слика 19. Пример хроматограма36
Циљ квалитативне анализе је да се одреди за сваки хроматографски пик од које

хемијске супстанце потиче. Који ће се хроматографски пик придружити одређеном
једињењу зависи од ретенционог времена, које се очитава на апсциси хроматограма.
Уколико је састав узорка непознат, идентификација компоненти се може урадити
другом методом (на пример, масеном спектрометријом, што се најчешће ради) или се
могу сакупити компоненте смеше на крају колоне и анализирати другим методама (на
пример, инфрацрвена спектроскопија, Раманска спектроскопија, нуклеарна магнетна
резонанција и друге). Када нам је састав узорка познат, идентификација
хроматографских пикова се може урадити на више начина, али најчешће се користе
метода референтног стандарда и метода коинјектирања. Метода референтног
стандарда се заснива на снимању хроматограма стандардног раствора компоненте која
се тражи под истим условима и упоређивању са већ снимљеним хроматограмом узорка
– ретенциона времена траженог хроматографског пика ће се поклапати. Метода
коинјектирања се заснива на поновном снимању хроматограма узорка, али са додатком
компоненте чији се хроматографски пик тражи – уочиће се пораст траженог
хроматографског пика у односу на хроматограм чистог узорка. [17]
Циљ квантитативне анализе је да се одреди количина сваке супстанце у узорку.
Мера релативне количине одређене супстанце у узорку је површина испод пика на
36
26
хроматограму тог узорка. Ова површина се најчешће одређује нумеричком
интеграцијом. Најједноставнија метода квантитативне анализе је метода
нормализације, која представља одређивање површина сваког пика и сразмерно односу
површина се посматрају удели компоненти у узорку. Међутим, ова метода полази од
претпоставке да је одговор детектора на све компоненте узорка исти, а то обично није у
потпуности тачно. Ради прецизнијих квантитативних података се често користи метода
спаљашњег стандарда. Ова метода се заснива на снимању хроматограма узорка и
стандардног раствора одређене компоненте из узорка познате концентрације. Узорак и
стандардни раствор који се инјектирају у хроматограф су исте запремине и снимају се
под истим условима. Претпостављајући линеарни одзив детектора, концентрација
тражене компоненте у узорку је одређена следећом формулом:
t
rs = r
tu (19)
[
где је rs – концентрација компоненте у узорку, r
– концентрација стандардног
раствора, vs – површина пика компоненте на хроматограму узорка и v
– површина
пика компоненте на хроматограму стандардног раствора. [17]
2.6. Одређивање величине и стабилности колоидних честица
2.6.1. DLS метода

Динамичко расејање светлости (енгл. dynamic light scattering, скраћено DLS) је
метода којом се одређује коефицијент дифузије на основу интензитета расејања
ласерског зрачења кроз раствор честица које испитујемо. На основу коефицијента
дифузије може се установити расподела величине (димензија) честица. Величина
сферних честица се одређује према Стокс-Њутновој једначини, која је дата следећом
релацијом:
R S
w = xyz
Z
(20)
где је w – полупречник сферних честица, U" – Болцманова константа, V – температура,
{ – вискозност средине и | – коефицијент дифузије. [20]
Уређај за мерење величине честица који се заснива на принципу динамичког
расејања светлости (слика 20) ради тако што ласер емитује монохроматско зрачење,
које пролазећи кроз пригушивач ради смањења интензитета зрачења, стиже до кивете
са узорком, након чега долази до расејања светлости. Након расејања, светлосни зрак
стиже до детектора, који се поставља под углом од 90° за полупрозирне узорке или под
углом од 175° за замућене узорке, а код новијих уређаја постоји могућност аутоматског
бирања угла. Детектор шаље сигнал корелатору, који упоређује интензитете сигнала, а
на крају сигнале обрађује рачунар. [20]
27
Слика 20. Схема DLS уређаја: (1) ласер, (2) пригушивач, (3) кивета, (4) детектор, (5)
корелатор, (6) рачунар;37
2.6.2.
2.6.2. Зета потенцијал
Колоидне честице, попут липозома, обично имају наелектрисану површину, а то
је последица дисоцијације функционалних група и адсорпције јона из раствора у којем
се налазе. Уколико имамо честицу која је негативно површински наелектрисана, она ће
привући слој позитивно наелектрисаних јона, који се назива Штернов слој. Око
Штерновог слоја се формира још један слој, који садржи покретљивије (слабије везане)
позитивно и негативно наелектрисане честице, а овај слој се назива дифузни слој.
Штернов и дифузни слој граде двоструки електрични слој, а граница ова два слоја која
одваја причвршћене од непричвршћених јона се назива раван смицања (слика 21). [19] [20]
[21]
Зета потенцијал је вредност електричног потенцијала у равни смицања. Може да

има вредности од –100 mV до +100 mV. Не зависи само од колоидне честице која се
посматра, већ и од pH вредности и јонске јачине раствора, као и од врсте присутних
супстанци у раствору. Ова физичкохемијска величина може помоћи у процени
стабилности честица. Обично се сматра да честице код којих је апсолутна вредност зета
потенцијала већа од 30 mV, могу се сматрати стабилним (јер доминира одбојна сила
међу честицама); док код честица са малом вредношћу апсолутне вредности зета
потенцијала, долази до доминације привлачних сила, што липозоме чини нестабилним
и подложним стапању (флокулацији). [19] [20] [21]
37
28
раван смицања
Штернова раван
негативно
дифузни слој
наелектрисана
честица
двоструки електрични слој

Штернов слој
електрични потенцијал
површински потенцијал
Штернов потенцијал
зета потенцијал
растојање од површине честице

Слика 21. Схематски приказ двоструког електричног слоја и зета потенцијала38
Одређивање
дређивање зета потенцијала се врши експериментално методом
електрофорезе. Овај поступак је развио Маријан Смолучовски (Marian Smoluchowski), а
овом методом се најчешће рачуна зета потенцијал, јер је ова метода прецизна и тачна
за колоидне честице било ког облика и за различите концентрације. Електрофореза је
поступак кретања наелектрисаних честица у раствору под утицајем спољашњег
електричног поља. Код електрофорезе, важна физичкохемијска величина је
покретљивост честица, коју сматрамо позитивном уколико се дата честица креће од
вишег ка нижем
ем потенцијалу, а негативном у обрнутом случају. Покретљивост честица
се рачуна према следећој једнакости:
~
}= (21)
38
29
где је } – покретљивост честице, – брзина честице и ) – јачина спољашњег
електричног поља.
Релација на основу које се рачуна зета потенцијал према теорији Смолучовског је
следећа:

} = [ (22)
y
где је – релативна диелектрична пропустљивост,
– диелектрична пропустљивост
вакуума39, { – вискозност и – зета потенцијал. [30]
Постоје посебни уређаји за мерење зета потенцијала, али постоји могућност
повезивања уређаја за мерење зета потенцијала према теорији Смолучовског са
уређајем за мерење величине честица на основу динамичког расејања светлости у један
уређај. У случају једног уређаја, за мерење зета потенцијала се користи иста кивета, али
се кроз њу уместо снопа светлости пропушта електрична струја помоћу два контакта са
стране, а уређај аутоматски рачуна вредност зета потенцијала. [30]
39
Приближна вредност диелектричне пропустљивости вакуума износи:
= 8,8542 · 10-12 F m-1. [5]
30
3. Циљ рада
Предмет истраживања овог рада је испитивање могућности употребе липозома у

циљу примене екстракта ртањског чаја у клиничкој фармакологији. Због тога је
потребно интегрисати екстракте ртањског чаја у липозоме, а у том циљу се испитивања
реализују у следећим фазама:
1) екстракција водорастворних и водонерастворних биолошки активних компоненти
из ртањског чаја;
2) квалитативна и квантитативна анализа хемијског састава екстракта помоћу течне
хроматографије високих перформанси (HPLC) у циљу идентификовања компоненти
екстракта које утичу на антиоксидативна и антирадикалска својства;
3) синтеза и карактеризација контролних липозома и испитивање њихове стабилности
– карактеризацију је потребно извршити методама електронске парамагнетне
резонанције (EPR) и динамичког расејања светлости (DLS);
4) синтеза и карактеризација липозома који у свом саставу имају екстракте ртањског
чаја (укључујући и водорастворне и водонерастворне супстанце) – потребно је
направити липозоме који ће имати уграђене активне компоненте у мембрани
(хидрофобне супстанце) или језгру (хидрофилне супстанце) липозома;
5) испитивање редокс активности липозома обогаћеним екстрактом – потребно је
утврдити могућност уклањања стабилних радикала и реактивних кисеоничних врста
помоћу ЕПР спин-трап методе.
Ова испитивања показују да ли је метода интеграције екстракта у липозоме као
носаче погодна за очување редокс активности екстракта. Овакви липозоми са
уграђеним компонентама из екстракта ртањског чаја би могли потенцијално имати
широку примену у клиничкој фармакологији при изради антиинфламаторних лекова и
препарата.
31
4. Експериментална испитивања
4.1. Материјали и методе

За експериментална испитивања коришћен је један узорак надземних делова
биљке ртањског чаја са института „Јосиф Панчић“ из Београда
Београда. Овај узорак
рак је уситњен у
млину (слика 22),, након чега је од њега направљен водено-етанолни
етанолни екстракт. За
прављење екстракта коришћен је водени раствор етанола (запреминског удела од 50 %).
Слика 22.. Самлевен узорак надземних делова биљке ртањског чаја са института „Јосиф
Панчић“ из Београда
За припрему липозома, коришћени су фосфолипид DPPC (1,2-дипалмито

дипалмитоил-sn-
глицеро-3-фосфохолин,, слика 23
23), хлороформ, метанол и дејонизована вода.
Слика 23. Структура DPPC (1,2-дипалмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин)

фосфохолин)40
40
32
У циљу испитивања антирадикалске активности липозома, снимљени су ЕПР
спектри слободнорадикалских врста и спинских адуката помоћу спектрометра Bruker
Elexsys II E540, а при снимању је коришћена фреквенција зрачења од 9,85 GHz (X-област
микроталасног зрачења). Урађена су два различита експеримента снимања. У првом
експерименту су снимљени ЕПР спектри DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилхидразил), а за то
су коришћени слободан радикал DPPH, етанол и дејонизована вода. У другом
експерименту су снимљени ЕПР спектри DEPMPO (5-диетоксифосфорил-5-метил-1-
пиролин-N-оксид), а за то су коришћени гвожђе(II)-сулфат хептахидрат, дејонизована
вода, раствор водоник-пероксида и хватач спинова DEPMPO.
Анализа састава екстракта је урађена помоћу течне хроматографије високих
перформанси (HPLC ). Мобилна фаза је припремљена од разблаженог раствора мравље
киселине и чистог ацетонитрила.
4.2. Припрема екстракта ртањског чаја

Надземни делови биљке ртањског чаја су уситњени у млину, а затим је измерено
2 грама узорка. Узорак је пренет у ерленмајер, у којем је сипано 20 ml воденог раствора
етанола (запреминског удела од 50 %). Након затварања ерленмајера стакленим чепом,
стаклени чеп је причвршћем парафилмом. Потом је ерленмајер са узорком пренет у
обичан инкубатор (инкубатор је употребљен као термостат). У инкубатору је узорак
стајао 210 минута на 40 0C, при томе је брзина ротационог шејкера инкубатора била 90
min-1 (ротациони шејкер одржава хомогеност). Одмах након инкубирања, урађена је
филтрација узорка помоћу Бихнеровог левка, гуч боце и вакуум пумпе на притиску од 5
bar (слика 24). Издвојен је филтрат и пребачен у микроцентрифушку тубу. На тај начин
смо добили екстракт ртањског чаја. Након затварања, микроцентрифушка туба је
додатно осигурана парафилмом и стављена у фрижидер ради чувања на температури од
– 80 0C (ова температура је одабрана, јер на њој престаје дејство ензима).
Слика 24. Филтрација узорка ртањског чаја

33
4.3.
4.3. Припрема липозома
У циљу прављења липозома, коришћен је фосфолипид DPPC (1,2-дипалмитоил-
sn-глицеро-3-фосфохолин). Измерено је 2,5 mg DPPC у микроцентрифушкој туби.
Затим је додато 1000 μl (4 пута по 250 μl) раствора хлороформа и метанола (у
запреминском односу хлороформа и метанола = 4 : 1). Потом је сипано 250 μl узорка
филтрата ртањског чаја (из фрижидера). Одмах након тога је добијена смеша пребачена
у балон, ради упаравања узорка (слика 25). Упаравање узорка је урађено помоћу
вакуумског упаривача. Након упаравања, балон је стављен у ексикатор, у циљу потпуног
сушења.
Слика 25. Упаравање узорка
Осушен узорак ртањског чаја у балону је рехидратисан – додано је 500 μl

дејонизоване воде. Најпре је балон држан три минута на вортексу, што омогућава
одвајање крупних делова липида са зидова балона. Затим је балон стављен у
ултразвучну каду (урађено је при снази апарата од 80 W), у којој је држан три минута, у
циљу одвајања ситнијих липида са зидова балона, али и даљег уситњавања великих.
Након тога је раствор пребачен у микроцентрифушку тубу. Овај поступак је поновљен
четири пута (да би се одвојили скоро сви липиди са зидова), тако да је рехидратација
урађена са укупно 2 ml дејонизоване воде.
Након рехидратације је урађена екструзија помоћу екструдера Avanti Polar Lipids
Mini Extruder kit опремљеног тефлонском мембраном са порама од 200 nm (слика 26).
Овај поступак омогућава задржавање у узорку липозома мање величине од пора
мембране. Узорак је пребачен у балон и држан у ултразвучној кади 21 минут, а затим
34
постављен у шприц за екструзију и термостатиран на 42 0C, јер је на тој температури
фазни прелаз DPPC. Екструзија је урађена 21 пут.
Слика 26. Екструзија
После урађене екструзије, снимљен је спектар величина липозома помоћу

уређаја на бази динамичког расејања светлости (DLS метода). На истом апарату је
одређен и зета-потенцијал, који показује колико су липозоми стабилни.
Слика 27. Кивета за узорком за снимање на DLS уређају
35
4.4. Припрема узорка за снимање ЕПР спектра
Урађена је дијализа (поступак којим се преко мембране одвајају мали молекули,
а задржавају крупне колоидне честице) узорка у 500 ml дестиловане воде на магнетној
мешалици у току три дана при температури од 4 0C. Овај експеримент је урађен
коришћењем Servapor MWCO 12 000 – 14 000 црева за дијализу које је пропустљиво за
молекуле мање од 12-14 хиљада далтона. Затим је узорак подељен у 4 микроцетрифушке
тубе од по 200 μl. Након тога је урађенo концентровање узорка у вакуумском
концентратору (слика 28). Вакуумски концентратор производи вакуум, те омогућава да
вода брзо испарава на собној температури. Прво је два пута урађено концентровање у
трајању од 30 минута. Затим су четири узорка спојена у два. Након тога је урађено два
пута концентровање од по 20 минута. На крају су два узорка спојени у један (једну
микроцентрифушку тубу).
Слика 28. Вакуумски концентратор за узорцима у току рада
Прво је урађено снимање ЕПР спектра помоћу слободног радикала DPPH.

Раствор DPPH је припремљен тако што је 1 mg DPPH рaстворен у 800 μl етанола. За
припрему узорка екстракта ртањског чаја интегрисаног у липозоме у циљу снимања
ЕПР спектра је узета чиста кивета, у којој је сипано 5 μl узорка екстракта ртањског чаја
интегрисаног у липозоме, 24 μl дејонизоване воде и 1 μl раствора DPPH. Контролни
узорак је добијен тако што је у празну кивету сипано 29 μl дејонизоване воде и 1 μl
DPPH. Узорак контролних липозома је припремљен истим поступком којим је
припремљен узорак ртањског чаја који је интегрисан у липозоме, само што није додат
екстракт ртањског чаја. За сва три припремљена узорка у киветама је помоћу
аутоматске пипете измерено 30 µl раствора и увучено у тефлонско црево, које је
постављено у кварцну капилару. Кварцна капилара је постављена у резонаторски
простор ЕПР спектрометра, а спектри су снимљени два минута након додатка DPPH у
36
кивете са растворима, при следећим параметрима: центар поља 3511 G, снага
микроталаса 10 mW, фреквенција микроталаса 9,85 GHz, модулациона фреквенција 100
kHz, модулациона амплитуда 1 G, једна акумулација.
Затим је урађено снимање ЕПР спектра на бази Фентонове реакције помоћу
спин-трапа DEPMPO. Измерено је 1,4 mg соли гвожђа(II)-сулфата хептахидрата (FeSO4 ·
7H2O). У две микроцентрифушке тубе је сипано по 1 ml дејонизоване воде, а затим је у
једну сипано 2,2 μl водоник-пероксида, а у другу је додато 1,4 mg чврсте соли
гвожђа(II)-сулфата хептахидрата. Након тога су обе микроцентрифушке тубе држане
пола минута на вортексу ради бољег мешања. Контролни узорак је добијен тако што је у
празну кивету редом сипано 26 μl дејонизоване воде, 1 μl припремљеног раствора
гвожђа(II)-сулфата из микроцентрифушке тубе, 1 μl спинског хватача DEPMPO и 2 μl
раствора водоник-пероксида. За снимање ЕПР спектра контролних липозома, у кивету
је редом сипано 21 μl дејонизоване воде, 5 μl узорка контролних липозома, 1 μl
припремљеног раствора гвожђа(II)-сулфата из микроцентрифушке тубе, 1 μl спинског
хватача DEPMPO и 2 μl раствора водоник-пероксида. Узорак екстракта ртањског чаја
који је интегрисан у липозоме је припремљен на исти начин као узорак контролних
липозома, само је уместо 5 μl узорка контролних липозома, сипано 5 μl узорка
екстракта ртањског чаја интегрисаног у липозоме. За сва три припремљена узорка у
киветама је помоћу аутоматске пипете измерено 30 µl раствора и увучено у тефлонско
црево, које је постављено у кварцну капилару. Кварцна капилара је постављена у
резонаторски простор ЕПР спектрометра, а спектри су снимљени два минута након
додатка водоник-пероксида у кивете са растворима, при следећим параметрима: центар
поља 3510 G, снага микроталаса 10 mW, фреквенција микроталаса 9,85 GHz,
модулациона фреквенција 100 kHz, модулациона амплитуда 1 G, једна акумулација.
Слика 29. ЕПР спектрометар Bruker Elexsys II E540 41
41
37
4.5. Анализа екстракта помоћу течне хроматографије
Одређивање концентрације појединачних фенолних једињења је изведено
применом реверзно-фазне течнe хроматографијe високих перформанси са масеном
спектрометријом (енгл. high-performance liquid chromatography - mass spectrometry,
HPLC-MS). Узорци су инјектирани у HPLC систем (Waters, САД) састављен од
бинарних пумпи, термостата и аутоинјектора повезаног са Waters 2996 Diode Array
(низом диода) и EMD 1000 квадрупол детектором са eлектрон-спреј јонизационом
(енгл. electron spray ionization, ESI) пробом (Waters, САД). Раздвајање фенолних
једињења је изведено помоћу Symmetry C-18 колоне димензија 150 · 4,6 mm паковане са
честицама пречника 5 µm (Waters, САД) и повезане са одговарајућом претколоном. Две
мобилне фазе, A (0,1 % раствор мравље киселине) и Б (ацетонитрил) су коришћене при
протоку од 1 mLmin-1 у следећем градијентном профилу: 0,0-10,0 min 10 % Б, 10,0-30,0
min oд 10 % до 50 % Б, 30,0-40,0 min од 50 % до 10 % Б, затим 10 % Б 5 min. Постколонски
делилац протока мобилне фазе (ASI, Richmond, САД) са фиксним 5/1 односом
коришћен је за добијање оптималног протока (0,2 mLmin-1) мобилне фазе за ESI пробу.
За LC/MS анализу, сигнали сваке компоненте су детектовани у негативном
скенирајућем режиму (100-900 m/z) са следећим параметрима ESI извора: напон на
капилари - 3,0 kV; напон на конусу -35 V; напон екстрактора и напони RF сочива су били
3,0 односно 0,2 V, респективно. Температура извора и температура десолвације су биле
130, односно 400 0C, у струји N2 од 500 Lh-1. Прикупљање, обрада података и спектрална
евалуација за потврду пикова специфичних једињења урађена је помоћу Waters
Empower 2 софтвера (Waters, САД).
38
5. Резултати и дискусија
5.1.
5.1. Величина и стабилност липозома
Резултати снимања величине липозома у које је интегрисан екстракт ртањског
чаја и контролних липозома методом динамичког расејања светлости су приказани на
слици 30.
контрола
ртањски чај
Релативни интензитет (%)
Величина (nm)
Слика 30. График расподеле интензитета расејаног зрачења према величини липозома
Са слике 30 закључујемо следеће:

• највероватнија величина контролних липозома: 122,3 nm;
• највероватнија величина липозома у које је интегрисан екстракт ртањског чаја:
162,6 nm.
Дакле, липозоми са интегрисаним екстрактом су нешто већи од контролних липозома.

И једни и други липозоми су задовољавајуће величине, пошто су мањи од 200 nm,
колико су биле поре мембране употребљене при екструзији.
39
Резултати снимања зета потенцијала липозома у које је интегрисан екстракт
ртањског чаја и контролних липозома су приказани на слици 31.
контрола
Детектовани сигнал (a.u.)
Зета потенцијал (mV)

Слика 31. График зависности детектованог сигнала од зета потенцијала липозома
Са слике 31 закључујемо следеће:

• зета потенцијал контролних липозома: - 36,0 mV;
• зета потенцијал липозома у које је интегрисан екстракт ртањског чаја: - 34,2 mV.
Дакле, може се рећи да су и контролни липозоми и липозоми у које је интегрисан

екстракт ртањског чаја релативно стабилни, при чему су контролни липозоми за
нијансу стабилнији. Овај податак о стабилности липозома је значајан, јер указује да
липозоми нису у великој мери склони флокулацији и могу да сачувају и пренесу
одговарајуће биоактивне компоненте до одговарајућег органа при примени у клиничкој
фармакологији.
40
5.2 Антирадикалска активност липозома према DPPH радикалу
5.2. Антирадикалска
Резултати снимања ЕПР спектра слободног радикала DPPH су приказани на
графику (слика 32), а очитани подаци у табели 2.
контрола
празни липозоми
Магнетно поље (G)

Слика 32. ЕПР спектар слободног радикала DPPH у контролном узорку, контролним
липозомима и липозомима у које је интегрисан екстракт ртањског чаја
Табела 2. Резултати снимања ЕПР спектара слободног радикала DPPH

Вредност двоструког
Узорак Интензитет пика
интеграла
Контрола 121,22653 6,452 · 106
Празни липозоми 120,73754 5,752 · 106
Ртањски чај 44,842532 2,090 · 106
На основу вредности двоструког интеграла из табеле 2 и формуле (18) је

израчунато да контролни липозоми показују антиоксидативну активност која износи
0,40 %, што је у границама експерименталне грешке. Са друге стране екстракт ртањског
чаја интегрисан у липозоме показује антиоксидативну активност која износи 63,01 %,
што указује да екстракти ртањског чаја имају значајну антиоксидативну активност када
41
су интегрисани у липозоме, што омогућује његову примену у производњи лекова и
препарата за отклањање оксидативног стреса.
5.3.
5.3. Антирадикалска активност липозома према хидроксилном радикалу
Резултати снимања ЕПР спектара адуката спинског хватача DPPH и
хидроксилних радикала (који настају у Фентоновој реакцији) су приказани на графику
(слика 33), а очитани подаци у табели 3.
контрола
празни липозоми
Магнетно поље (G)
Слика 33. ЕПР спектар DEPMPO/OH адукта у контролном узорку, контролним

липозомима и липозомима у које је интегрисан екстракт ртањског чаја
Табела 3. Резултати снимања ЕПР спектара хидроксилних радикала

Вредност двоструког
Узорак Интензитет пика
интеграла
Контрола 60,194127 1,821 · 106
Празни липозоми 60,336447 1,902 · 106
Ртањски чај 3,2065599 9,630 · 104
На основу вредности двоструког интеграла из табеле 2 и формуле (18) је

израчунато да контролни липозоми показују антирадикалску активност за хидроксилни
42
радикал која износи - 0,24 %, што је у границама експерименталне грешке. Са друге
стране екстракт ртањског чаја интегрисан у липозоме има антирадикалску активност за
хидроксилни радикал која износи 94,67 %, што указује да екстракти ртањског чаја имају
изузетну антирадикалску активност за хидроксилне радикале када су интегрисани у
липозоме. Ова могућност уклањања хидроксилних радикала је веома значајна, јер су те
хемијске врсте врло реактивне, а најчешће су главни узрок оксидативног стреса.
5.4.
5.4. Резултати течне хроматографије
Као резултат снимања полифенолног састава екстракта ртањског чаја методом
течне хроматографије, добијен је хроматограм (на 280 nm), који је приказан на слици
34. Легенда пикова је приказана у табели 4.
Апсорбанција (AU)
Време (min)
Слика 34. Хроматограм екстракта ртањског чаја
Табела 4. Легенда пикова са хроматограма екстракта ртањског чаја

Однос масе и
Редни број Назив једињења
наелектрисања
1 Дериват розмаринске киселине 377 m/z
2 Дериват ферулинске киселине 637 m/z
3 Лутеолинглукуронид 461 m/z
4 Сагеринична киселина 719 m/z
5 Розмаринска киселина 359 m/z
6 Салвионолична киселина А 493 m/z
7 Салвионолична киселина J 537 m/z
8 Салвионолична киселина В 717m/z
9 Ацацетинрутинозид 591 m/z
10 Метил-розмаринска киселина 535 m/z
11 Салвионолична киселина К 555m/z
12 Салвионолична киселина изомер 493 m/z
43
Осим наведених једињења, присутни су и хлорогена и кафеинска киселина
(хидроксицинамичне киселине) и карнозол (биоактивни дитерпен).
Резултати течне хроматографије високих перформанси указују да су
најдоминантнији антиоксиданси розмаринска и салвионолична киселина Ј, а да су
после њих најзначајнији дериват ферулинске киселине, лутеолинглукуронид,
сагеринична киселина и салвионолична киселина К.
Розмаринска киселина (њена структурна формула је приказана на слици 2) се
може наћи у саставу многих биљака у природи, пре свега код рузмарина (лат.
Rosmarinus officinalis), жалфије (лат. Salvia officinalis), нане (лат. Mentha piperita),
тимијана (лат. Thymus vulgaris), матичњака (лат. Melissa officinalis) и других биљних
врста. Добила је име по рузмарину, јер је први пут изолована из те биљке.
Претпоставља се да има улогу у заштити биљака од предатора и инфекција. Ова
киселина припада групи фенолних киселина и представља естар кафеинске киселине и
3,4-дихидроксифенил-млечне киселине. Има примену у медицини и прехрамбеној
индустрији због антиоксидативних, антирадикалских, антиканцерогених,
антивирусних, антибактеријских и антиинфламаторних својстава. Специјално, може се
користити при лечењу упала. [34] [35] [36]
Салвионоличне киселине (структура салвионоличне киселине Ј је приказана на
слици 35) су први пут изоловане из биљке Salvia miltiorrhiza (познате као даншен) у
Кини. Због полифенолне структуре имају изражену антиоксидативну активност, чиме
помажу отклањање оксидативног стреса. Специјално, имају примену у лечењу
кардиоваскуларних болести. [37] [38]
Слика 35. Структура салвионоличне киселине Ј 42
42
44
6. Закључак
Ртањски чај (лат. Satureja montana) је биљка која показује изражену

антиоксидативну активност, што је експериментално утврђено на основу података из
литературе [32]. Изражена антиоксидативна активност омогућава овој биљци да њени
екстракти потенцијално стекну примену у производњи лекова и препарата за сузбијање
оксидативног стреса. У циљу очувања и ефикасног транспорта компоненти ртањског
чаја, дошло се на идеју интеграције екстракта у липозоме, због компатибилности
липозома са ћелијским мембранама и могућности липозома да у свој састав интегришу
и поларне и неполарне молекуле. Припремљен је водено-етанолни екстракт ртањског
чаја (надземних делова биљке са института „Јосиф Панчић” из Београда) и интегрисан у
липозоме (који су припремљени од фосфолипида DPPC). За контролне липозоме су
припремљени празни липозоми (100 % DPPC). Урађена је екструзија за узорак и
контролу, помоћу које су одабрани липозоми мање величине. Након тога, применом
динамичког расејања светлости је одређена величина, а применом електрофорезе је
одређен зета потенцијал липозома. Мерењем величине липозома је показано да је
екструзија довољно ефикасна за формирање липозома жељене величине у циљу даље
анализе. Одређивање зета потенцијала указује да су липозоми довољно стабилни, што
смањује евентуалну могућност формирања агрегата у већем проценту и омогућава
липозомима да сачувају и пренесу компоненте екстракта ртањског чаја до
одговарајућег органа при употреби у клиничкој фармакологији. Антиоксидативна
активност екстракта ртањског чаја је одређена на основу редукције ЕПР сигнала
слободног радикала DPPH у екстракту ртањског чаја интегрисаном у липозоме и
контролног узорка, и снимљених ЕПР спектара DPPH у екстракту и контроли. Показало
се да екстракти ртањског чаја показују значајну антиоксидативну активност. Помоћу
спин-трапа DEPMPO и хидроксилних радикала из Фентонове реакције је измерена
антирадикалска активност за хидроксилни радикал (пошто је најчешће главни
узрочник оксидативног стреса), а то је урађено на основу одговарајућих ЕПР спектара,
слично као при одређивању антиоксидативне активности помоћу слободног радикала
DPPH. Показана је изузетна антирадикалска активност за хидроксилни радикал. Сви
ови подаци указују да се липозоми у које су интегрисани екстракти ртањског чаја могу
применити као саставни делови лекова и препарата за отклањање оксидативног стреса.
Значајна антиоксидативна активност је последица присуства антиоксиданаса у саставу
екстракта ртањског чаја. У циљу одређивања састава екстракта ртањског чаја, део
екстракта је сачуван (пре интеграције у липозоме), а његов састав је одређен применом
течне хроматографије високих перформанси (HPLC). На основу HPLC анализе је
утврђено да су најдоминатнији антиоксиданси розмаринска и салвионолична киселина,
које се налазе код различитих биљака и имају широк спектар биолошке активности.
45
7. Литература
[1] Владић Јелена, Савремене методе екстракције ртањског чаја (Satureja Montana
L.), хемијски састав и биолошка активност одабраних екстраката, докторска
дисертација, Нови Сад, 2017, Технолошки факултет Универзитета у Новом Саду;
[2] Крстић Јована, Минерални и полифенолни профил зеленог, црног, биљних и

воћних филтер чајева и њихов антиоксидативни капацитет, докторска дисертација,
Ниш, 2017, Природно-математички факултет Универзитета у Нишу;
[3] Банковић Јована, Развој и валидација HPLC методе за одређивање

полифенолних једињења у одабраним биљним чајевима, мастер рад, Ниш, 2016,
Природно-математички факултет Универзитета у Нишу;
[4] Ранђеловић Новица, Аврамовић Данијела, Приручник о лековитим биљкама,

Сокобања, 2011, Удружење за лековито биље „Др Јован Туцаков” – Сокобања, ДО Филм
публик арт;
[5] Мацура Слободан, Радић-Перић Јелена, Атомистика, Београд, 2004, ЈП Службени

лист СЦГ, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;
[6] Антић-Јовановић Анкица, Молекулска спектроскопија: спектрохемијски аспект,

Београд, 2016, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;
[7] Поповић-Бијелић Ана, Мојовић Милош, Практикум из биофизичке хемије,

[8] Мојовић Милош, Карактеризација слободних радикала у мембранама биљака

применом ЕПР спектроскопије, магистарски рад, Београд, 2004, Факултет за физичку
хемију Универзитета у Београду;
[9] Тописировић Љубиша, Фира Ђорђе, Лозо Јелена, Динамичка биохемија, Београд,
2010, Биолошки факултет Универзитета у Београду;
[10] Баланч Бојана, Липозоми и системи липозоми-алгинат за контролисано

отпуштање расвератрола, докторска дисертација, Београд, 2016, Технолошко-
металуршки факултет Универзитета у Београду;
[11] Правиловић Радослава, Дифузија полифенолних једињења из микрочестица

добијених различитим техникама инкапсулације, докторска дисертација, Београд, 2016,
Технолошко-металуршки факултет Универзитета у Београду;
46
[12] Камчева Тина, Интеракција комплекса платине и рутенијума са панкреасном
фосфолипазом А2 и фосфолипидима, докторска дисертација, Београд, 2013, Факултет за
физичку хемију Универзитета у Београду;
[13] Накарада Ђура, Антирадикалска активност аварола: теоријски и

експериментални приступ, докторска дисертација, Београд, 2019, Факултет за физичку
хемију Универзитета у Београду;
[14] Марковић Маја, Кинетика ослобађања слабо водорастворних активних

супстанци из носача на бази поли(метакрилне киселине), казеина и липозома,
докторска дисертација, Београд, 2020, Технолошко-металуршки факултет Универзитета
у Београду;
[15] Welin Anna-Karin, Sandberg Mats, Lindblom Anna, Arvidsson Pernilla, Nilsson Ulf
A, Kjellmer Ingemar, Mallard Carina, White Matter Injury Following Prolonged Free Radical
Formation in the 0.65 Gestation Fetal Sheep Brain, 2005, Pediatric Research;
[16] Ментус Славко, Дамјановић Љиљана, Физичкохемијска анализа, Београд, 2015,

Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;
[17] Ристић Мирослав, Скрипта из „Хроматографије и сепарационих метода”,

[18] Савић Весна, Хемијски састав и фармаколошке активности воденог екстракта

корена гавеза (Symphytum officinale L), докторска дисертација, Лесковац, 2015,
Технолошки факултет Универзитета у Нишу;
[19] Орешковић Јелена, Испитивање утјецаја помоћних твари на физичку стабилност

суспензије посаконазола, дипломски рад, Загреб, 2015, Фармацеутско-биокемијски
факултет Свеучилишта у Загребу;
[20] Матуља Дарио, Експериментално одређивање односа набоја и величине агрегата

самонакупљених амфифилних боја, дипломски рад, Ријека, 2018, Одјел за
биотехнологију Свеучилишта у Ријеци;
[21] Ковачевић Анђелка, Липидне наночестице стабилизоване нејонским

полихидроксилним сурфакантима: поступак добијања, карактеризација, стабилност и
инкорпорирање лековите супстанце, докторска дисертација, Београд, 2014,
Фармацеутски факултет Универзитета у Београду;
[22] Пуцар Милидраг Гордана, Примена модификованог бентонита као катализатора

у Фентон и фото-Фентон процесу уклањања текстилне реактивне боје, докторска
47
дисертација, Нови Сад, 2019, Природно-математички факултет Универзитета у Новом
Саду;
[23] Гвоић Весна, Испитивање могућности примене Фентон-процеса у третману

обојених отпадних вода графичке индустрије, докторска дисертација, Нови Сад, 2019,
Природно-математички факултет Универзитета у Новом Саду;
[24] Керкез Ђурђа, Потенцијал употребе пиритне изгоретине у третману отпадних

вода и могућност њене даље санације применом имобилизационих агенаса, докторска
дисертација, Нови Сад, 2014, Природно-математички факултет Универзитета у Новом
Саду;
[25] Pattusamy Nithya, Changa Madhavi, Antioxidant activity of 3-arylidene-4-piperidones

in the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl scavening assay, 2017, Journal of Taibah University of
Science;
[26] Прегибан Кристина, Методе мјерења антиоксидативне активности, Осијек, 2017,

Свеучилиште J. J. Strossmayera у Осијеку;
[27] Савић Александар, Примена напредних статистичких метода у анализи

сложених ЕПР и флуоресцентних спектара слободних радикала, докторска дисертација,
[28] Лугоња Николета, Испитивање антиоксидативног потенцијала хране за бебе,

докторска дисертација, Београд, 2014, Хемијски факултет Универзитета у Београду;
[29] Bačić Goran, Spasojević Ivan, Šećerov Bojana, Mojović Miloš, Spin-trapping of oxygen
free radicals in chemical and biological systems: New traps, radicals and possibilities, 2007,
Spectrochimica acta;
[30] Raja Pavan, Barron Andrew, Physical Methods in Chemistru and Nano Science,
https://chem.libretexts.org/Bookshelves/Analytical_Chemistry/Book%3A_Physical_Methods
_in_Chemistry_and_Nano_Science_(Barron), приступљено 1.9.2021;
[31] Nakarada Đura, Pejin Boris, Tommonaro Giuseppina, Mojović Miloš, Liposomal
integration method for assessing antioxydative activity of water insoluble compounds towards
biologically relevant free radicals: example of avarol, 2019, Journal of Liposome Research;
[32] Пирић Давид, Одређивање антиоксидативног капацитета ртањског чаја,

завршни рад, Београд, 2020, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;
[33] https://www.bruker.com/es/products-and-solutions/mr/epr-instruments/epr-
research-instruments/Elexsys-II-E540.html, приступљено 20.9.2021;
48
[34] Несторовић-Живковић Јасмина, Антиоксидативно, антимикробно и алелопатско
дејство три ендемичне врсте рода Nepeta (Lamiaceae), докторска дисертација, Београд,
2013, Биолошки факултет Универзитета у Београду;
[35] Мишан Александра, Антиоксидантна својства лековитог биља у храни,

докторска дисертација, Нови Сад, 2009, Природно-математички факултет
Универзитета у Новом Саду;
[36] Теофиловић Бранислава, Биохемијска и хемијска карактеризација екстраката

босиљка и утицај фармацеутско-технолошке формулације на гликемијски, липидни и
оксидо-редукциони статус код огледних животиња, докторска дисертација, Нови Сад,
2016, Медицински факултет Универзитета у Новом Саду;
[37] Jennifer Hui-Chun Ho, Chuang-Ye Hong, Salvianolic acids: small compounds with
multiple mechanisms for cardiovascular protection, 2011, Journal of Biomedical Science;
[38] Man Xu, Jian Han, Hui-feng Li, Li Fan, Ai-hua Liu, De-an Guo, Analysis on the
Stability of Total Phenolic Acids and Salvianolic Acid B from Salvia miltiorrhiza by HPLC
and HPLC-MS, 2007, Natural Product Communications;
[39] Ćebović Tatjana, Vladić Jelena, Gavarić Aleksandra, Zeković Zoran, Vidović Senka,
Assessment of antioxidant and hepatoprotective potential of Satureja montana extracts
against CCl4 induced liver damage, 2019, Lekovite sirovine;
[40] Carmo Serrano, Olivia Matos, Barbara Teixeira, Cristina Ramos, Nuno Neng, Jose
Nogueira, Maria Leonor Nunes, Antonio Marqus, Antioxidant and antimicrobial activity of
Satureja montana L. extracts, 2011, Wiley Online Library;
[41] Антић-Јовановић Анкица, Атомска спектроскопија: спектрохемијски аспект,

Београд, 2015, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду.
49

Испитивање редокс карактеристика екстракта ртањског чаја (Satureja montana) интегрисаног у липозоме

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Испитивање редокс карактеристика екстракта ртањског чаја (Satureja montana) интегрисаног у липозоме

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Универзитет у Београду

Факултет за физичку хемију

Београд, septembar 2021.

Многе биљке из природе су лековите и корисне за здравље људи, јер поседују у

2.1. Ртањски чај

2.1.1. Биљка ртањски чај

Слика 1. Ртањски чај1

За људску употребу се користе надземни делови ове биљке. Традиционално се

2.1.2. Хемијски састав ртањског чаја

карвакрол тимол розмаринска киселина

лутеолин рутин кварцетин

Слика 2. Структурне формуле потенцијалних антиоксиданаса ртањског чаја2

2.2.1. Липиди и фосфолипиди

Слика 3. Основне структуре које граде фосфолипиди у воденом раствору4

фосфолипидни слој мултиламеларне везикуле

хидратација фосфолипидних слојева

Слика 4. Изградња липозома од фосфолипида5

2.3. Слободни радикали и антиоксиданси

2.3.1. Слободни радикали

синглетни кисеоник супероксидни анјон пероксидни анјон хидроксилни радикал

Слика 5. Најзначајније реактивне кисеоничне врсте у биолошким системима

2.3.3. Фентонова реакција

Слика 6. Спински магнетни момент и спински угаони момент 13

На основу израза (1) и (2) изводи се следећа релација:

(а) (б) )*

Табела 1. Зависност броја спинских нивоа у спољашњем магнетном пољу од броја

Слика 8. Вредности спинског магнетног момента и његове пројекције у спољашњем

Слика 9. Спински нивои система са једним неспареним електроном у одсуству (лево) и

2.4.3.1. Положај спектра

2.4.3.2. Интензитет спектралних линија

Слика 10. Зависност амплитуде ЕПР сигнала од угла ротације за филм-дозиметар

2.4.3.3. Ширина спектралних линија

2.4.3.4. Хиперфина структура

Квантитативна мера хиперфине интеракције се обично представља преко

Слика 12. Општа схема ЕПР спектрометра28

2.4.6. Хватачи спинова

Слика 14. Структурна формула DEPMPO 31

Слика 15. Реакција DEPMPO са хидроксилним и супероксидним радикалом32

где је АА – антиоксидативна активност, А

Слика 16. Структурна формула DPPH 33

Слика 17. Реакција DPPH радикала са антиоксидансом ArOH 34

2.5.1. Основно о HPLC методи

2.5.3. Течни хроматограф високих перформанси

Сваки хроматограф за HPLC анализу садржи посебан резервоар у који се сипа

2.5.4. Детектори за течну хроматографију

Слика 19. Пример хроматограма36

Циљ квалитативне анализе је да се одреди за сваки хроматографски пик од које

2.6. Одређивање величине и стабилности колоидних честица

2.6.1. DLS метода

Зета потенцијал је вредност електричног потенцијала у равни смицања. Може да

двоструки електрични слој

растојање од површине честице

Предмет истраживања овог рада је испитивање могућности употребе липозома у

4.1. Материјали и методе

За припрему липозома, коришћени су фосфолипид DPPC (1,2-дипалмито

Слика 23. Структура DPPC (1,2-дипалмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин)

4.2. Припрема екстракта ртањског чаја

Слика 24. Филтрација узорка ртањског чаја

Слика 25. Упаравање узорка

Осушен узорак ртањског чаја у балону је рехидратисан – додано је 500 μl

Слика 26. Екструзија

После урађене екструзије, снимљен је спектар величина липозома помоћу

Слика 27. Кивета за узорком за снимање на DLS уређају

Слика 28. Вакуумски концентратор за узорцима у току рада

(а) (б) )*