Универзитет у Београду

Факултет за физичку хемију

ЗАВРШНИ РАД
Одређивање антиоксидативног
капацитета ртањског чаја

Ментор: Студент:
Др Милош Мојовић Давид Пирић

Београд, мај 2020.

 Захваљујем се Милошу Мојовићу, ванредном професору на Факултету за
физичку хемију, на указаној стручној помоћи при изради завршног рада и пажљиво
прочитаном тексту.
Посебну захвалност дугујем Ђури Накаради, на указаној стручној помоћи и
пријатној атмосфери при изради експерименталног дела завршног рада.
Такође се захваљујем породици и пријатељима на подршци приликом
студирања.

Давид Пирић
 Садржај

1. Увод ............................................................................................................................................... 1
2. Теоријски увод ........................................................................................................................... 2
2.1. Ртањски чај ........................................................................................................................... 2
2.2. Спински магнетни момент електрона .......................................................................... 3
2.3. Електронска парамагнетна резонанција (ЕПР) .......................................................... 6
2.4. Параметри ЕПР спектра .................................................................................................... 8
2.4.1. Положај спектра ..................................................................................................... 8
2.4.2. Интензитет спектралних линија ....................................................................... 9
2.4.3. Ширина спектралних линија ............................................................................ 10
2.4.4. Хиперфина структура ......................................................................................... 12
2.5. ЕПР спектрометар ............................................................................................................ 13
2.6. Слободни радикали у биолошким системима ......................................................... 14
2.7. Спинске пробе ................................................................................................................... 15
2.8. Слободни радикал DPPH …………………...…………………………………………….. 16
2.9. Одређивање антиоксидативне активности .............................................................. 18
3. Експериментални део ............................................................................................................. 19
3.1. Материјали и методе ....................................................................................................... 19
3.2. Водена екстракција биљног материјала ..................................................................... 20
3.3. Етанолна екстракција биљног материјала ................................................................ 20
3.4.Припрема узорака за снимање ЕПР спектара ......................................................... 21
4. Резултати и дискусија ............................................................................................................ 22
5. Закључак ..................................................................................................................................... 26
6. Литература ................................................................................................................................. 27
 1. Увод

Многе биљке из природе, попут ртањског чаја (лат. Satureja Montana), имају
антиоксидативна својства, што значи да у хемијском саставу садрже антиоксидансе.
Антиоксиданси су једињења која могу да неутралишу или умање утицај слободних
радикала, који се налазе у сваком живом организму. Слободни радикали су неопходни
за нормално функционисање живих организама, али у високој концентрацији могу бити
штетни и изазвати многе дегенеративне болести. Неутралишући штетан утицај
слободних радикала у организму, биљке са израженим антиоксидативним капацитетом
су нашле примену као природни лек у традиционалној медицини.
Овај рад има за циљ одређивање и упоређивање антиоксидативне активности
два узорка ртањског чаја (лат. Satureja Montana). Један узорак је са института „Јосиф
Панчић“ из Београда (не зна се одакле је сакупљен), а други узорак је прикупљен са
планине Ртањ. За оба узорка су припремљени водени и етанолни екстракти надземних
делова биљке, који су након тога испитивани ЕПР методом редукције слободног
радикала DPPH. Сви добијени спектри су упоређивани са контролним спектром тог
радикала.
Експериментални део овог дипломског рада је урађен у ЕПР лабораторији на
Факултету за физичку хемију Универзитета у Београду. Спектри су снимљени помоћу
ЕПР спектрометра Bruker Elexsys II E540.

1
 2. Теоријски увод

2.1. Ртањски чај

Биљка ртањски чај (лат. Satureja Montana) припада фамилији Laminaceae
(уснатице), а представља полужбун са гранчицама које одрвењују. Цвета од јуна до
октобра, а цветови су јој љубичасто-беле боје (слика 1). Природно станиште су јој
каменити пашњаци и ливаде у медитеранском и субмедитеранском подручју.
Традиционално се употребљава као саставни део народних лекова, зачин и природни
конзерванс. Савремена научна истраживања показују да се екстракти ртањског чаја
могу применити у медицини, јер имају изражену антимикробну и антиоксидативну
активност.

Слика 1. Ртањски чај1

Квалитативни и квантитативни састав екстраката ртањског чаја није апсолутан,

већ зависи од узорка. Најзначајнија компонента из састава екстраката ртањског чаја је
етарско уље, које садржи карвакрол, тимол, p-цимен, γ-терпинен и друге компоненте.
На основу HPLC анализе (течне хроматографије високих преформанси)2 водених и
етанолних ектраката ове биљке, утврђено је присуство кафене, сиригинске и
розмаринске киселине, три флавоноида (лутеолин, рутин и кварцетин) и других
компоненти. Најважније компоненте су карвакрол и тимол (њихове структурне
формуле су приказане на слици 2), а њихова антиоксидативна активност је највише
проузрокована присуством ароматичног прстена повезаног са хидроксилном групом. [1]

1
Слика је преузета из [1].
2
Хроматографија је физичкохемијска метода која на основу различитих коефицијената расподеле
компонената одређене смеше између покретне и непокретне фазе, врши раздвајање компонената смеше,
као и квалитативну и квантитативну анализу смеше. Течна хроматографија је облик хроматографије, у
којој се као покретна фаза користи течност, а непокретна фаза је гранулована чврста супстанца.
Савремени уређај за течну хроматографију је HPLC (енгл. High Performance Liquid Chromatograph) –
течни хроматограф високих перформанси. За течни хроматограф се каже да је високих перформанси, јер
је много тачнији и прецизнији у односу на класично елуирање кроз хроматографску колону. [7]

2
 карвакрол тимол
Слика 2. Структурне формуле најзначајнијих компоненти етарског уља ртањског чаја3

2.2. Спински магнетни момент електрона

Из класичне физике је познато да кретање наелектрисаних честица (електрична
струја) доводи до појаве магнетне индукције (магнетног поља). На сличан начин се
објашњавају и магнетне особине супстанце – постојањем микроструја.
На основу класичног модела атома, атом се састоји од позитивно наелектрисаног
језгра, око којег се крећу електрони (негативно наелектрисане честице). По овом
моделу, електрони, осим што се крећу кружно око језгра атома, ротирају и око
сопствене осе. Ово кретање наелектрисања (микроструја) доводи до појаве магнетног
момента (ствара се магнетно поље). Услед ротације електрона око језгра настаје
орбитни магнетни момент, а због ротације електрона око сопствене осе настаје спински
магнетни момент. Тачније, ротација електрона доводи до појаве одговарајућег
(орбитног и спинског) угаоног момента импулса, који проузрокује појаву одговарајућег
магнетног момента. Међутим, каснија научна истраживања су показала да ова
упрошћена слика атома не одговара у потпуности стварном атому, те се на њу не
можемо превише ослањати, иако нам омогућује лакше замишљање модела атома. Ни у
данашње време, наука није успела да објасни порекло спинског магнетног момента.
Због ових разлога се уводи векторски модел атома, на основу којег се орбитни и
спински угаони моменти разматрају само као придружени вектори електрона, а не
разматра се њихово порекло.
Спин (сопствени угаони момент) се посматра као једна од основних особина
елементарних честица попут масе и наелектрисања. Вредност спина је дефинисана
следећим изразом:

 = 

+ 1 ħ

(1)
(1)
где је
 – спински угаони момент (спин),
– спински квантни број (који за електрон
 
износи
= ), ħ – редукована Планкова константа (одређена је изразом: ћ =  , где је
ℎ – Планкова константа)4 и 


– јединични вектор спина.

3
Слика је преузета из [1].
4
Приближна вредност Планкове константе износи: ℎ = 6,6261 · 10-34 J s, а приближна вредност редуковане
Планкове константе износи ħ = 1,05456 · 10-34 J s. [2]

3
 Сопственом угаоном моменту електрона се придружује сопствени магнетни
момент електрона који се одређује на основу следећег израза:

 =  ∙
 = −  ∙
µ ∙
 (2)
(2)
2 
 – магнетни спински момент,  – жиромагнетни однос електрона,  – Ландеов
где је µ
фактор (за слободне електроне има вредност  ≈ 2,0023),  – елементарно
наелектрисање5 и  – маса електрона6.
Према једнакости (2), примећујемо да вектори магнетног спинског момента и
спинског угаоног момента имају исти правац, али супротне смерове, што је приказано
на слици 3.
На основу једнакости (1) и (2), може се закључити следеће:
 ℎ (3)
(3)
µ
 = −  ∙ ∙ 

+ 1 ∙ = −  μ! 

+ 1
 2  2 
 
где је μ! = "  # – Боров магнетон7 (јединица магнетног момента електрона).
$

Слика 3. Спински угаони момент и магнетни спински момент8

При присуству спољашњег магнетног поља, магнетни моменти електрона се

постављају тако да њихова пројекција у односу на правац деловања спољашњег
магнетног поља (који се обично обележава као z-оса) има вредности на основу следећег
израза:
%& = −  %!  (4)
(4)

5
Приближна вредност елементарног наелектрисања износи:  = 1,6022 · 10-19 С. [2]
6
Приближна вредност масе електрона износи:  = 9,1094 · 10-31 kg. [2]
7
Приближна вредност Боровог магнетона износи: μ! = 9,2740 · 10-24 J T-1. [2]
8
Слика је преузета из [2].

4
где је  – магнетни спински квантни број (може да има вредности −
, −
+ 1, … +
;


на основу чега следи да за електрон има вредности  = ± ).

На основу израза (4) следи да магнетни моменти електрона у спољашњем
магнетном пољу могу да имају само две оријентације (два стања). Те оријентације се
најчешће обележавају словима грчког алфабета: α (означава паралелну оријентацију – у
смеру поља) и β (означава антипаралелну оријентацију – супротну смеру поља).
У одсуству спољашњег магнетног поља, оријентације магнетних момената су
случајне у сваком тренутку, те су ова стања дегенерисана9 (имају исту енергију).
Међутим, у присуству спољашњег магнетног поља, долази до укидања дегенерације
електрона (због оријентације у правцу поља). Енергија интеракције спинског магнетног
момента електрона и спољашњег магнетног поља је једнака производу пројекције
спинског магнетног момента електрона на правац спољашњег поља и магнетне
индукције спољашњег поља10:
*#+ = − %& ,
=  %!  ,
(5))
(5
где је *#+ – енергија спинских стања електрона, а ,
– магнетна индукција спољашњег
поља. Ова појава је илустрована на слици 4. [2] [3] [5]

(а) (б) *#+

%! ,

, = 0 , = ,

1 
 = + +
2 2

0
1

=
2 1 
 = − −
1 2 2
 = ±
2


Слика 4. Енергија спинских стања електрона за
= (а) ван поља (б) у пољу11

9
Дегенерисана стања у квантној механици представљају различита стања која имају исту енергију.
Степен дегенерације је број начина на који се може остварити одређено стање енергије. [2]
10
Из класичне физике нам је познато да је енергија магнетног дипола у хомогеном магнетном пољу
једнака негативном скаларном производу магнетног момента дипола и магнетне индукције поља. У овом
случају имамо: *#+ = − µ 
= − µ ,
cos 0. Имајући у виду да је пројекција магнетног момента на z-осу
 ,
једнака µ& = µ cos 0, следи да важи израз *#+ = − %& ,
. [2]
11
Слика је преузета из [2].

5
 2.3. Електронска
Електронска парамагнетна резонанција (ЕПР)
На основу једнакости (5) се може закључити да слободни електрони губе
дегенерацију спинских стања при уношењу у магнетно поље. Исто важи и за везане
неспарене електроне, који се налазе у атомима, молекулима и јонима. Тада израз (5)
добија следећи облик:
*12 = − %& ,
=  %! 34 ,
(6)
(6)
где је 5 – укупни спински угаони момент, а 34 – укупни магнетни спински квантни број
(може да има вредности −5, −5 + 1, …. +5; односно укупно има 25 + 1 вредности).
Дакле, у спољашњем магнетном пољу, услед укидања дегенерације по укупном
магнетном спинском квантном броју (34 , долази до цепања спинских нивоа одређених
укупним спинским угаоним моментом (5). Ови нивои се називају Земанови нивои.
Колико ће бити спинских стања (нивоа) система (атома, молекула, јона...) зависи од
укупног спинског угаоног момента (5), који зависи од броја неспарених електрона. Ово
се најбоље може илустровати кроз следеће примере, који су најчешћи:
• систем са једним неспареним електроном – два спинска нивоа (приказан је на
слици 5)
  
5 = ⇒ 34 ∈ 8− , + 9 (7)
(7)

• систем са два неспарена електрона – три спинска нивоа
 
5 = + = 1 ⇒ 34 ∈ :−1, 0, +1; (8)
(8)
• систем са три неспарена електрона – четири спинска нивоа
   < <   <
5 = + + = ⇒ 34 ∈ 8− , − , + , + 9 (9)
(9)

=
34

,
>
+
?

%& %

>
−
?


Слика 5. Дозвољене вредности спинског магнетног момента за 5 = у магнетном пољу12

12
Слика је преузета из [3].

6
 На основу импликација (7), (8) и (9), очигледно је да за једно језгро са спином 5,
број нивоа у спољашњем магнетном пољу ће бити 25 + 1. Уколико посматрамо систем
са @ еквивалентних језгара, укупан број нивоа ће бити 2@5 + 1.
Када на системе (атоме, молекуле и јоне) са неспареним електронима који се
налазе у присуству спољашњег хомогеног магнетног поља (које доводи до укидања
дегенерације спинских стања), делујемо електромагнетним зрачењем из микроталасне
области спектра, може доћи до прелаза између магнетних спинских нивоа електрона
(због њихове интеракције са магнетном компонентом микроталасног зрачења). На тај
начин настају спектри електронске парамагнетне резонанције (ЕПР), који се често
називају и спектри електронске спинске резонанције (ЕСР) или спектри електронске
магнетне резонанције (ЕМР).13
Треба имати у виду да велики број молекула садржи све спарене електроне, тако
да нема ЕПР спектар. Најзначајније хемијске врсте које садрже неспарене електроне су
јони прелазних метала и слободни радикали. Такође, да би одређени прелаз између
спинских магнетних стања био могућ, мора да задовољава изборно правило:
∆34 = ±1 (10)
При електронској парамагнетној резонанцији, прелази између електронских
спинских стања се дешавају у оба смера – електрони прелазе из стања ниже у стање
више енергије, и обрнуто. Који ће од ових процеса бити доминантан зависи од
бројности електрона у одговарајућим стањима. На основу Болцмановог закона се може
показати да је број електрона у нижим енергетским стањима мало већи од броја
електрона у вишим енергетским стањима, из чега произилази закључак да је апсорпција
укупан ефекат електронске парамагнетне резонанције.
Посматрајмо систем са једним неспареним електроном (слика 6). Код овог
система, у присуству спољашњег магнетног поља, јављају се два спинска енергијска
 
нивоа: виши *B за 34 = и нижи *C за 34 = − :


*B =  %! ,
(11)

*C = −  %! ,
(12)
(12)
Разлика између енергије ова два спинска нивоа износи:
∆* = *B − *C =  %! ,
(13)

13
Принцип електронске парамагнетне резонанције је откривен 1944. године од стране Завојског.
Временом је нашао веома значајну примену у физици, хемији, физичкој хемији, биологији, медицини и
другим областима науке и привреде. [4]

7
 1
5=
2

Слика 6. Спински енергијски нивои у одсуству (лево) и присуству (десно) магнетног

поља14

Да би се прелаз између ових нивоа десио, неопходно је деловати

електромагнетним зрачењем које има фреквенцију чија је Планкова енергија тачно
једнака енергији цепања нивоа:
∆Е = ℎ ∙ D =  %! ,
(14)
где је ν – фреквенција електромагнетног зрачења.
Из израза (14) следи услов резонанције за појаву ЕПР спектра, који је дат
следећим изразом:
 %! ,
(15)
D =
ℎ
Резонантни услов се може постићи на два начина: мењањем фреквенције
електромагнетног зрачења при константној магнетној индукцији спољашњег магнетног
поља или мењањем магнетне индукције спољашњег магнетног поља при константној
фреквенцији електромагнетног зрачења. Међутим, из практичних разлога, резонанција
се најчешће постиже мењањем магнетне индукције спољашњег магнетног поља. [3] [4] [5]

2.4. Параметри ЕПР спектра

2.4.1. Положај спектра

E FG !H
На основу услова резонанције (D = ), закључује се да је Ландеов фактор ()

константа пропорционалности између резонантне фреквенције и магнетне индукције
спољашњег поља. За слободне електроне, вредност Ландеовог фактора (-фактора)
износи 2,0023; међутим, за везане електроне, вредност -фактора одступа, јер на
електроне утиче поље језгара и осталих присутних електрона. Вредност -фактора се

14
Слика је преузета из [3].

8
мења услед појаве орбиталног кретања електрона у спољашњем пољу које производи
ново магнетно поље које ствара интеракцију са магнетним моментом електрона. Дакле,
Ландеов фактор се посматра као мера локалног поља електрона, те се положај линије у
ЕПР спектру најчешће наводи као -вредност.
За велики број слободних радикала важи да имају вредности -фактора који
варира у опсегу ±0,003 од вредности  (Ландеовог фактора слободних електрона).
Овај мали релативни опсег код органских радикала је проузрокован делимично
слободним кретањем неспареног електрона у делокализованим орбиталама. Међутим,
за комплексе јона прелазних метала, вредност -фактора варира приближно у опсегу од
0,2 до 10,0. Узрок овог одступања је то што електрони припадају атомима или јонима, у
којима се јавља Расел-Сандерсово спрезање15, које се илуструје следећом једнакошћу:
I IJ K L LJ J 4 4J
 = 1 + (16)
I IJ
где су 5 – спински угаони момент, M – орбитални угаони момент, а N – укупни угаони
момент16. [3] [5]

2.4.2. Интензитет спектралних линија

Када се успостави услов резонанције, прелази могу да се дешавају у оба смера (из
стања ниже енергије у стање више енергије и обрнуто). Оба прелаза су подједнако
вероватна, али доминира онај прелаз који креће од нивоа веће запоседнутости.

Уколико посматрамо најједноставнији систем (5 = ), однос броја електрона са
антипаралелном (O) и паралелном (P) оријентацијом спинских момената, одређује се на
основу Болцмановог закона:
QR TU
XY
QS
=  V W ≈ 1 + Z [ (17)
где је \ – температура, а ] – Болцманова константа17.
Имајући у виду да је енергија ] \ (на собној температури) много већа од
енергетске разлике спинских нивоа, следи да је број језгара у вишем и нижем стању
приближно једнак. Међутим, ипак је нешто већи у нижем стању. Због тога је укупан
исход резонанције, прелаз из стања ниже у стање више енергије, то јест апсорпција.
Интензитет апсорпционих линија ЕПР спектра је директно пропорционалан
разлици запоседнутости основних и побуђених спинских нивоа електрона између којих
се врше прелази.

15
Расел-Сандерсов тип спрезања се јавља код хемијских врста у којима преовлађује електростатичко
одбијање над магнетном интеракцијом. Важи за већину атома, осим најмасивнијих. За овај тип спрезања
важи спрезање спинских момената електрона у спински момент атома, орбиталних момената електрона
у орбитални момент атома и укупних момената електрона у укупни момент атома. [8]
16
Укупни угаони момент је једнак збиру спинског и орбиталног угаоног момента.
17
Приближна вредност Болцманове константе износи: ] = 1,3807 · 10-23 J K-1. [2]

9
 Интензитет линија ЕПР спектра зависи и од положаја узорка у резонаторском
простору ЕПР спектрометра, што је приказано на слици 7. [3] [4]

10,0

амплитуда ЕПР сигнала

8,0

6,0

4,0

2,0
0 90 180 270 360
угао ротације (степени)

Слика 7. Зависност амплитуде ЕПР сигнала од угла ротације за филм-дозиметар

сниманог у ТЕ102 резонатору18

2.4.3. Ширина спектралних линија

Користећи релацију (17), следи да на собној температури у спољашњем пољу
магнетне индукције од 0,35 Т, на 10000 електрона, само 14 електрона више је у нижем
спинском стању (антипаралелне оријентације); следи да би дејством зрачења из
микроталасне области, у кратком временском интервалу, могло да дође до засићености
или сатурације (изједначавања запоседнутости оба нивоа). Па ипак се то не дешава, јер
на систем делују релаксациони процеси – представљају све што се дешава у току
експеримента преоријентишући језгра са вишег на нижи ниво без емисије зрачења, што
омогућава даљу апсорпцију.
Ширина спектралних линија зависи од релаксационих процеса. На основу
Хајзенберговог принципа неодређености19 следи да је ширина линија обрнуто
пропорционална релаксационом времену (уколико је релаксационо време краће, већа је

18
Слика је преузета из [4].
19
Хајзенбергов принцип неодређености нам указује да не можемо са сигурношћу знати истовремено
положај и брзину микрочестица, већ је производ неодређености положаја и неодређености импулса
(количине кретања) било које честице већи или једнак од вредности редуковане Планкове константе
подељене са два. Из овога следи да је неодређеност енергије (^Е ) обрнуто пропорционална
 [2]
неодређености времена (^_); прецизније, ^Е · ^_ ≥ .
" 

10
неодређеност енергије, те се шире енергетски нивои, што доводи до ширења линија у
спектру). Постоје две врсте релаксационих процеса: спин-спин и спин-околина
релаксација.
Спин-спин интеракција се јавља између одговарајућег неспареног електрона са
суседним електронима. Базира се на следећем процесу – флуктуирајуће магнетно поље
око посматраног електрона се мења услед утицаја сопственог магнетног поља суседних
електрона, а то утиче на ширење ЕПР линије. Спин-спин релаксација је најчешће
ефикасан процес (тада долази до ширења линија), осим у системима који су изразито
разблажени, а то је уочљиво на примеру са слике 8.
Спин-околина (или спин-решетка) релаксација представља процес којим
неспарени електрони предају вишак енергије околини, која се акумулира у околини у
облику топлоте. Овај процес је врло ефикасан за јоне прелазних метала и њихових
комплекса у чврстом стању и растворима, али не и за органске слободне радикале у
растворима. Релаксационо време може да се повећа са снижењем температуре, те се
ЕПР спектри јона прелазних метала и њихових комплекса снимају на веома ниским
температурама (на собној и вишим температурама линије су сувише широке и често се
губе).
Осим релаксационих процеса, на ширину ЕПР линија утиче и чињеница да се
резонанција спинова неспарених електрона не догађа истовремено, због чега линије
добијају гаусовски облик. Ова појава може настати као последица постојања
нехомогеног магнетног поља, утицаја локалних поља, али и због различите
оријентације система у чврстом стању. [3] [4]

(а) (б)
2+ 2+
Слика 8. ЕПР спектри Mn : (а) спектар Mn из концентрованог раствора MnCl2 (линије
су широке услед утицаја спин-спин интеракције), (б) спектар Mn2+/MgO након
„магнетног” разблаживања20

20
Слика је преузета из [4].

11
 2.4.4. Хиперфина структура
На основу експерименталних података се може лако закључити да структура ЕПР
спектра не зависи само од неспарених електрона. Научна истраживања су показала да се
код ЕПР спектара јављају две врсте мултиплетне структуре: хиперфина структура (услед
утицаја језгра на неспарени електрон) и фина структура (услед утицаја других
неспарених електрона).
Хиперфина структура се јавља код система који имају нуклеарни магнетни
момент, а узрокују је интеракције магнетних спинских момената језгара и електрона.
Цепање спинских енергијских нивоа електрона настаје као последица интеракције
њихових спинских магнетних момената са спинским магнетним моментом језгра
(различитим од нуле).
Спински квантни број (b) језгра зависи од укупног броја протона (c) и неутрона
(@) у језгру:
• парно c, парно @: b = 0
 < d e
• парно c, непарно @; или непарно c, парно @: b = , , , …
• непарно c, непарно @: b = 1 , 2 , 3 , 4 …
Језгра са спинским квантним бројем различитим од нуле, проузрокују цепање
електронских спинских нивоа, тако што ће за сваку вредност MS бити укупно
2b + 1 електронских спинских нивоа.
Квантитативна мера интеракције између језгра и електрона се најчешће
изражава производом ℎg
, где је g
– константа хиперфиног цепања, а ℎ – Планкова
константа. На основу тога следи да се енергија хиперфине интеракције може изразити
помоћу следеће формуле:
*hi = ℎ j gZ 34 3ik (18)
где је *hi – енергија хиперфине интеракције, gZ – константа хиперфиног цепања за ]-
то језгро, 34 – магнетни спински квантни број неспареног електрона, а 3ik –
магнетни спински квантни број ]-тог језгра.
Укупна енергија магнетне интеракције система се добија када изразу за енергију
из једнакости (6) додамо енергију хиперфине интеракције, то јест:
* =  μ! ,
34 + ℎ j gZ 34 3ik . (19)
Цепање енергијских нивоа услед хиперфине интеракције, за систем за који важи
 
5 = и b = , илустровано је на слици 9. [3] [4] [5]

12
 Слика 9. Хиперфино цепање енергијских нивоа: (а) у статичком магнетном пољу,
(б) постепеном променом магнетног поља21

2.5. ЕПР спектрометар

Феномен електронске парамагнетне резонанције се најчешће детектује помоћу
специјалних уређаја за ту намену, а који су познати као ЕПР спектрометри. Схема ЕПР
спектрометра који је коришћен у овом раду је приказан на слици 10. Основни принцип
рада ових уређаја се заснива на следећем: Ганова диода22 (која представља извор
електромагнетног зрачења) емитује монохроматско зрачење, а узорак се налази у
резонатору, у којем се линеарно мења јачина магнетног поља; када се успостави услов
резонанције, долази до апсорпције микроталасног зрачења, а микроталасе детектор
(чији се рад заснива на бази полупроводника) претвара у једносмерну струју.
Модулатор поља (систем за модулацију) има функцију да једносмерну струју претвори
у наизменичну помоћу наизменичног магнетног поља мале амплитуде, а служи за
повећање односа сигнал/шум. [4]

21
Слика је преузета из [4].
22
Старији уређаји уместо Ганове диоде имају клистрон.

13
 Узорци, који се постављају у резонатор уређаја, најчешће су у течном или
чврстом агрегатном стању, али могу бити и гасовити. Пре постављања у резонатор,
узорак се ставља у кварцну или стаклену цев23 танких зидова. [3]

модулатор поља

Ганова
диода
ослабљивач спаривач
резонаторски
изолатор
простор
детектор

таласометар
узорак

детектор-посматрач

Слика 10. Општа схема ЕПР спектрометра24

2.6. Слободни радикали у биолошким системима

Слободни радикали су хемијске врсте (атоми, молекули или јони) које у својој
конфигурацији поседују неспарене електроне. Веома су реактивни, јер изменом
електрона са околним хемијским врстама постају стабилне врсте. Постоји више начина
на који слободни радикали могу реаговати са нерадикалским врстама: оксидација
нерадикалске врсте (слободни радикал преузима електрон), редукција нерадикалске
врсте (слободни радикал предаје електрон) или везивање слободног радикала за
нерадикалску врсту. При томе лако може доћи до ланчане реакције, у којој настају нови
радикали.
Због велике реактивности, слободни радикали од биолошког значаја имају
кратак живот (од 10-9 до 10 секунди), иако постоје и такви, који имају полувреме живота
од око 1h.25 Због кратког живота (али и мале концентрације у биолошким системима),

23
Цев мора бити претходно очишћена у потпуности од присуства парамагнетних супстанци. [3]
24
Слика је преузета из [4].
25
Пример слободног радикала са полувременом живота од око 1h је аскорбил радикал. [12]

14
детекција слободних радикала је знатно отежана. Зато се већина метода детекције
заснива на претварању слободних радикала у дугоживеће врсте.
У биолошким системима, велики значај имају слободни радикали који у свом
хемијском саставу садрже кисеоник. За њих се најчешће користи скраћена ознака
ROS 26, а њихови најзначајнији примери су хидроксилни и супероксидни радикал.
Слободни радикали су неопходни за нормално функционисање живих бића, јер
су саставни део битних биохемијских процеса (раст, ћелијско дисање, одбрана од
патогена). Па ипак, слободни радикали могу оштетити живе организме и изазвати разне
болести. Због тога, у организмима постоје и антиоксиданси, који имају улогу да
смањују количину слободних радикала, тако што се оксидују реагујући са радикалима.
Оксидативни стрес се јавља у биолошким системима када је концентрација реактивних
кисеоничних врста доста већа од концентрације антиоксиданаса. При оксидативном
стресу долази до оштећења биомолекула. [5] [12] [13]

2.7. Спинске
Спинске пробе
Спинске пробе су стабилни парамагнетни радикали. Углавном припадају групи
нитроксидних једињења (имају пиролидински или пиперидински прстен за који је
прикачена NO-група), у којим нитроксидна група садржи слободан електрон, који је
стабилисан помоћу неколико метил-група (налазе се у орто-положају у односу на азот,
па тиме заклањају неспарен електрон, што омогућава да спинска проба дуже опстане у
биолошком систему). Пример често коришћене спинске пробе и њен ЕПР спектар су
приказани на слици 11.

O 5G

H H
H H
H3C CH3
H3C N CH3

O
(а) (б)

Слика 11. Спинска проба ТEMPON : (а) структурна формула, (б) ЕПР спектар27

Спински обележивачи су хемијске врсте које у хемијском саставу садрже

спинску пробу која је везана за тачно одређена места у молекулима масних киселина.
Користе се за постављање спинских проба у биолошке системе.

26
Скраћеница од Reactive Oxygen Species.
27
Слика је преузета из [4].

15
 Једна од најчешће коришћених метода за детекцију слободних радикала је ЕПР
спин-трап метода. Ова метода се користи тако што спински обележивачи (спин-
трапови) реагују са слободним радикалима, градећи дугоживеће ЕПР активно једињење
(спин-адукт). Пример ове методе је приказан на слици 12. Коришћењем ове методе се
може извршити и квалитативна и квантитативна анализа. [4] [5]

Слика 12. Принцип спин-трап методе за спински обележивач DMPO са хидроксилним и

супероксидним радикалом28

2.8. Слободни радикал DPPH

Једна од најчешће коришћених спинских проба је органско једињење DPPH, јер
представља стабилну радикалску врсту. DPPH је скраћеница од 2,2-дифенил-1-
пикрилхидразил. Има молекулску формулу C18H12N5O6, а његова структура је приказана
на слици 13.

Слика 13. Структурна формула DPPH 29

28
Слика је преузета из [6].
29
Слика је преузета из [9].

16
 Слободни радикал DPPH је љубичасте боје у растворима. Може да реагује са
антиоксидансима (начин на који DPPH реагује са антиоксидансима је илустрован на
слици 14), а у таквим реакцијама DPPH се редукује. Тачније, антиоксидативна
једињења донирају водоников атом радикалу DPPH, који се повезује преко неспареног
електрона радикала. Редукован облик DPPH је жуте боје.

+ArOH
. .
-ArO

Слика 14. Реакција DPPH радикала са антиоксидансом ArOH 30

ЕПР спектар слободног радикала DPPH је приказан на слици 15. При реакцији са
антиоксидансима, ЕПР сигнал се смањује, што је последица редукције DPPH, која
доводи до појаве мањег броја једињења са неспареним електронима. [5] [9] [10] [11]

Слика 15. ЕПР спектар DPPH 31

30
Слика је преузета из [15].
31
Слика је преузета из [10].

17
 2.9. Одређивање
Одређивање антиоксидативне активности
У циљу одређивања антиоксидативне активности, са добијених ЕПР спектара се
с
очитава укупна површина испод свих ЕПР максимума (слика 16) за сваки узорак и
контролу.32 Антиоксидативнене активности узорака се одређ
одређују на основу следеће
релације:
А
− А (20)
АА =
А

где је АА – антиоксидативна активност, А

– површина испод свих ЕПР максимума
контроле, а А – површина испод свих ЕПР максимума узорка. [5] [10]

Слика 16. ЕПР спектар DPPH – на спектру су црвеном бојом означени максимуми испод
којих се очитава површина ради одређивања антиоксидативне активности33

32
Најбоље је очитавати површину испод ЕПР максимума. Међутим, то је веома тешко код сложених
спектара или у случају постојања лоше базне линије, па се из тог разлога прибегава очитавању података о
висини средњег ЕПР максимума. Затим би се у одговарајућој фо формули
рмули за антиоксидативну активност
(20), уместо одговарајућих површина користиле измерене висине.
33
Слика је урађена на основу слике 15, која је преузета из [10].

18
 3. Експериментални део

3.1. Материјали и методе

Коришћена су два узорка ртањског чаја: један узорак са института „Јосиф
Панчић“ из Београда и један узорак прикупљен на планини Ртањ. Надземни делови
ртањског чаја су сакупљени и осушени на собној температури; а затим упаковани у
папирне кесе, чувани на тамном и сувом месту. Овај биљни материјал је анализиран,
тако што је прво преливен течним азотом (из Дјуаровог суда), а затим механички
уситњен до праха помоћу авана и тучка (слика 17). Након уситњавања, биљни прах је
подвргнут воденој и етанолној екстракцији.

Слика 17. Узорак пре (лево) и после (десно) уситњавања ртањског чаја

При испитивању антиоксидативне активности узорака су коришћене следеће

супстанце: дестилована вода, DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилхидразил) концентрована
хлороводонична киселина (36 %), n-хексан и етанол.
Спектри су снимљени помоћу ЕПР спектрометра Bruker Elexsys II E540. При
снимању су коришћени следећи параметри:
• центар магнетног поља: 3500 G
• модулациона амплитуда: 2 G
• модулациона фреквенција: 100 kHz
• микроталасна снага: 10 mW
• опсег скенирања: 200 G
• фреквенција микроталаса: 9,3 GHz
• време снимања: 2 min.

19
 3.2. Водена екстракција биљног материјала
Након уситњавања биљног материјала уз помоћ течног азота, измерено је 3 g
биљног праха. Овај прах је пребачен у стаклену чашу са магнетом, затим је у њу додато
30 ml дестиловане воде и 0,225 ml концентроване хлороводоничне киселине (већа је
ефикасност екстракције у киселој средини), те је ова чаша постављена на магнетну
мешалицу са грејачем, где је 90 минута држана на температури од 80 0C уз непрекидно
мешање (слика 18). Након тога је извршена филтрација овог узорка помоћу Бихнеровог
левка, а издвојен је филтрат (течни део) који је пребачен у епендорфице (чврст део је
одбачен, јер нам је за експеримент потребан водени екстракт). Затим су епендорфице
подвргнуте центрифугирању брзином 1300 обртаја по минуту у трајању од 10 минута, а
издвојен је супернатант (талог је одбачен, а ово је урађено ради добијања хомогеног
раствора у циљу прецизног и тачног снимања ЕПР спектара), који је пребачен у балон
ради упаравања до половине почетне запремине. На крају, упарен узорак је пребачен у
кивету са затварачем и остављен у фрижидеру на 5 0C (у циљу чувања).

Слика 18. Водени раствор ртањског чаја на магнетној мешалици

3.3. Етанолна екстракција биљног материјала

Након уситњавања биљног материјала уз помоћ течног азота, измерено је 2 g
биљног праха. Овај прах је пребачен у стаклену чашу са магнетом, затим је у њу додато
20 ml n-хексана (у циљу одмашћивања узорка – ради веће ефикасности екстракције), те
је ова чаша постављена на магнетну мешалицу, где је 30 минута држана на собној
температури уз непрекидно мешање. Након тога је цео узорак пребачен у епендорфице,
које су подвргнуте центрифугирању брзином 1300 обртаја по минуту у трајању од 10

20
минута, а издвојен је талог, који је пребачен у стаклену чашу са поклопцем и магнетом
(течни део је одбачен, а ово је урађено ради одбацивања масноћа). Затим је у чашу
додато 13 ml концентрованог етанола (96 %), након чега је чаша постављена на магнетну
мешалицу, где је 90 минута држана на собној температури (слика 19). Након тога је
извршена филтрација овог узорка помоћу Бихнеровог левка, а издвојен је филтрат
(талог је одбачен, а ово је урађено јер нам је за експеримент потребан етанолни
екстракт), који је пребачен у кивету са затварачем и остављен у фрижидеру на 5 0C (у
циљу чувања).

Слика 19. Етанолни раствор ртањског чаја на магнетној мешалици

3.4. Припрема узорака за снимање ЕПР спекта

спектара
За припрему узорка воденог екстракта ртањског чаја, у кивету (узете су нове
чисте кивете) је сипано 5 µl воденог екстракта ртањског чаја, а затим додато по 10 µl
воде и 15 µl раствора DPPH (спинске пробе) концентрације 200 mM. Контролни узорак
за водени екстракт добијен је тако што је у празну кивету сипано 15 µl воде и 15 µl
DPPH. За припрему узорка етанолног екстракта ртањског чаја, у кивету је сипано 5 µl
етанолног екстракта ртањског чаја, а затим додато по 10 µl етанола и 15 µl раствора
DPPH. Контролни узорак за етанолни екстракт добијен је тако што је у празну кивету
сипано 15 µl етанола и 15 µl DPPH. На тај начин су припремљени узорци у киветама, те
је након тога помоћу аутоматске пипете измерено 30 µl раствора и увучено у тефлонско
црево које је стављено у кварцну капилару. Кварцна капилара је постављена у
резонаторски простор ЕПР спектрометра Bruker Elexys II E540. Спектри су снимљени
два минута након додатка DPPH екстрактима чаја.

21
 4. Резултати и дискусија

Добијени ЕПР спектри спинске пробе DPPH у воденим и етанолним екстрактима

ек
ртањског чаја су приказани на следећим сликама (слика
слика 20, слика 21, слика 22 и слика
23). У овим
вим графицима су црном бојом приказани
казани спектри контроле, а црвеном бојом
спектри спинске пробе DPPH у воденим и етанолним екстрактима ртањског чаја.

зумиран црвени спектар

Магнетна индукција (G)

Слика 20.. Упоредни приказ ЕПР спектара спинске пробе DPPH у воденом екстракту
ртањског чаја из института „Јосиф Панчић“ и контроле

зумиран црвени спектар

Магнетна индукција (G)

Слика 21.. Упоредни приказ ЕПР спектара спинске пробе DPPH у воденом екстракту
ртањског чаја који је прикупљен са планине Ртањ и контроле

22
 Магнетна индукција (G)
Слика 22.. Упоредни приказ ЕПР спектара спинске пробе DPPH у етанолном екстракту
ртањског чаја из института „Јосиф Панчић“ и контроле

Магнетна индукција (G)

Слика 23.. Упоредни приказ ЕПР спектара спинске пробе DPPH у етанолном екстракту
ртањског чаја који је прикупљен са планине Ртањ и контроле

На основу добијених ЕПР спектара (слика 20, слика 21, слика 22 и слика
лика 23)
23 и релације
(20) је израчуната антиоксидативна активност за све узорке
узорке.. Резултати су приказани у
табели 1.

23
Табела 1. Упоредни приказ антиоксидативне активности узорака ртањског чаја
Узорак Антиоксидативна активност
са института „Јосиф Панчић“ 68,77 %
Водени екстракт
са планине Ртањ 69,02 %
са института „Јосиф Панчић“ 62,02 %
Етанолни екстракт
са планине Ртањ 46,54 %

У табели 1 су приказане одређене антиоксидативне активности узорака у

процентима. Већи проценат антиоксидативне активности указује на то да је узорак
бољи антиоксиданс (боље уклања слободне радикале). Упоређивањем добијених
вредности, може се закључити да етанолни екстракти имају мању антиоксидативну
активност у односу на водене.
Потенцијални доминантни антиоксиданси су феноли (карвакрол, тимол и
розмаринска киселина) и флавоноиди (лутеолин, рутин и кварцетин). Структура
карвакрола и тимола је приказана на слици 2, структура розмаринске киселине на
слици 24, a структура флавоноида (који су потенцијални антиоксиданси) на слици 25.
Антиоксидативна активност ових једињења се објашњава присуством ароматичног
прстена повезаног са хидроксилном групом.

Слика 24. Структурна формула розмаринске киселине34

лутеолин рутин кварцетин

Слика 25. Структурне формуле флавоноида који су потенцијални антиоксиданси35

34
Слика је преузета из [19].
35
Слика је преузета из [13].

24
 Сви поменути потенцијални антиоксиданси су веома распрострањени у биљним
организмима. Карвакрол и тимол се могу наћи у тимијану (лат. Thymus vulgaris),
мајчиној душици (лат. Thymus serpyllum), оригану (лат. Origanum vulgare) и другим
биљкама. Ова два антиоксиданса имају велику примену у медицини, где се, осим као
антиоксиданси, користе и као антисептици, антимикотици и бактерициди. Розмаринска
киселина је присутна у високом проценту код жалфије (лат. Salvia officinalis), нане (лат.
Mentha piperita), тимијана (лат. Thymus vulgaris), матичњака (лат. Melissa officinalis) и
других биљних врста. Ова киселина се користи у медицини због антиоксидативних,
антивирусних, антибактеријских, антиканцерогених и других корисних својстава за
здравље. Лутеолин је присутан у многим биљним врстама попут целера (лат. Apium
graveolens), шаргарепе (лат. Daucus carota sativus), мајчине душице (лат. Thymus
serpyllum), рузмарина (лат. Salvia rosmarinus), и оригана (лат. Origanum vulgare). Рутин
се може наћи код хељде (лат. Fagopyrum esculentum), цитрусног воћа (лат. Citrus),
црвене паприке (лат. Capsicum annum) и других биљака. Кварцетин улази у састав
различитих биљака, на пример, црног лука (лат. Allium cepa), броколија (лат. Brassica
oleracea var. silvestris) и парадајза (лат. Solanum lycopersicum). Скоро сви флавоноиди,
укључујући поменуте у овом пасусу (лутеолин, рутин и кварцетин) имају примену у
медицини због антиоксидативних и антипатогених својстава. [13] [16] [17] [18]
На основу података из литературе [14], може се претпоставити да водени
екстракти имају већу антиоксидативну активност у односу на етанолне, зато што се
феноли у воденим екстрактима задржавају у већем проценту. Према доступним
подацима [13] следи да се концентрација флавоноида у воденим и етанолним
екстрактима ртањског чаја мало разликује, али да је ипак мало већа у воденим
екстрактима. Сви ови подаци се уклапају са експерименталним резултатима овог рада,
који указују да је антиоксидативна активност етанолних екстраката ртањског чаја мања
у односу на водене екстракте.
Оба водена узорка показују сличну вредност антиоксидативне активности, и то
значајно велику (око 69%), етанолни узорак са института „Јосиф Панчић“ показује мало
мању антиоксидативну активност (око 62%), али етанолни узорак са планине Ртањ
показује знатно мању антиоксидативну активност у односу на узорак са института
„Јосиф Панчић“ (око 47%). Слабија антиоксидативна активност етанолног екстракта
прикупљеног са планине Ртањ је вероватно узрокована мањим бројем различитих
компоненти са својствима антиоксиданаса у овом узорку, или њихове ниже
концентрације. То може бити последица више различитих фактора попут састава тла,
надморске висине или броја сунчаних сати током године, који могу довести до
различите прилагодљивости биљака и последично, различитог састава њихових
екстраката. Ради одређивања тачног хемијског састава сваког од екстраката, потребно
је извршити додатне екперименте (на пример, UV/Vis спектрофотометрија или HPLC
хроматографија).

25
 5. Закључак

Антиоксидативна активност је важна биофизичка величина, јер нам омогућује да

утврдимо који биљни материјали имају изражен антиоксидативни капацитет, да бисмо
их касније користили у циљу отклањања оксидативног стреса. Антиоксидативна
активност се може одредити на више начина, а у овом дипломском раду је одређивана
помоћу електронске парамагнетне резонанције (ЕПР). Узети су одговарајући узорци (са
планине Ртањ и са института „Јосиф Панчић“) надземних делова ртањског чаја (лат.
Satureja Montana), а затим од њих направљени водени и етанолни екстракти. Узорци и
контрола су снимљени помоћу ЕПР спектрометра Bruker Elexsys II E540 са Факултета за
физичку хемију у Београду. На добијеним ЕПР спектрима су очитане укупне површине
испод свих ЕПР максимума за сваки узорак и контролу, а на основу њих су одређене
антиоксидативне активности узорака. Резултати указују да водени екстракти имају већи
антиоксидативни капацитет у односу на етанолне, што значи да се у њима, приликом
прављења екстраката, у већем проценту задржавају хемијске врсте које су одговорне за
антиоксидативну активност биолошког материјала.

26
 6. Литература

[1] Владић Јелена, Савремене методе екстракције ртањског чаја (Satureja Montana
L.), хемијски састав и биолошка активност одабраних екстраката, докторска
дисертација, Нови Сад, 2017, Технолошки факултет Универзитета у Новом Саду;

[2] Мацура Слободан, Радић-Перић Јелена, Атомистика, Београд, 2004, ЈП Службени

лист СЦГ и Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;

[3] Антић-Јовановић Анкица, Молекулска спектроскопија: спектрохемијски аспект,

Београд, 2016, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;

[4] Мојовић Милош, Карактеризација слободних радикала у мембранама биљака

применом ЕПР спектроскопије, магистарски рад, Београд, 2004, Факултет за физичку
хемију Универзитета у Београду;

[5] Поповић-Бијелић Ана, Мојовић Милош, Практикум из биофизичке хемије,

Београд, 2017, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;

[6] Бачић Горан, Спасојевић Иван, Шећеров Бојана, Мојовић Милош, Spin-trapping
of oxygen free radicals in chemical and biological systems: New traps, radicals and
possibilities, 2007, Spectrochimica acta;

[7] Ментус Славко, Дамјановић Љиљана, Физичкохемијска анализа, Београд, 2015,

Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;

[8] Антић-Јовановић Анкица, Атомска спектрохемија: спектрохемијски аспект,

Београд, 2015, Факултет за физичку хемију Универзитета у Београду;

[9] Pattusamy Nithya, Changa Madhavi, Antioxidant activity of 3-arylidene-4-piperidones

in the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy scavening assay, 2017, Journal of Taibah University of
Science;

[10] Живковић Ј, Мујић И, Зековић З, Видовић С, Мујић А, Јокић С, Уклањање

радикала, антимикробна активност и садржај фенолних материја Castanea sativa
екстраката, 2014, Journal of Central European Agriculture;

[11] Garcia Eugenio José, Oldoni Tatiane Luiza Cadorin, De Alencar Severino Matias, Reis
Alessandra, Loguercio Alessandro D, Grande Rosa Helena Miranda, Antioxidant Activity by
DPPH Assay of Potential Solutions to be Applied on Bleached Teeth, 2012, Brazilian dental
journal;

27
[12] Welin Anna-Karin, Sandberg Mats, Lindblom Anna, Arvidsson Pernilla, Nilsson Ulf
A, Kjellmer Ingemar, Mallard Carina, White Matter Injury Following Prolonged Free Radical
Formation in the 0.65 Gestation Fetal Sheep Brain, 2005, Pediatric Research;

[13] Крстић Јована, Минерални и полифенолни профил зеленог, црног, биљних и

воћних филтер чајева и њихов антиоксидативни капацитет, докторска дисертација,
Ниш, 2017, Природно-математички факултет Универзитета у Нишу;

[14] Serrano Carmo, Matos Olívia, Teixeira Barbara, Ramos Cristina, Neng Nuno,
Nogueira José, Leonor Nunes Maria, Marques António, Antioxidant and antimicrobial
activity of Satureja montana L. extracts, 2011, Wiley Online Library;

[15] Прегибан Кристина, Методе мјерења антиоксидативне активности, Осијек, 2017,

Свеучилиште J.J. Strossmayera у Осијеку;

[16] Дабановић Вера, Фармакокинетика карвакрола и тимола, семинарски рад,

http://www.baltikjunior.com/o-divljem-origanu/farmakokinetika-karvakrol-i-timol/, при-
ступљено 21.4.2020;

[17] Несторовић-Живковић Јасмина, Антиоксидативно, антимикробно и алелопатско

дејство три ендемичне врсте рода Nepeta (laminaceae), докторска дисертација, Београд,
2013, Биолошки факултет Универзитета у Београду;

[18] Мишан Александра, Антиоксидативна својства лековитог биља у храни,

докторска дисертација, Нови Сад, 2009, Природно-математички факултет
Универзитета у Новом Саду;

[19] Савић Весна, Хемијски састав и фармаколошке активности воденог екстракта

корена гавеза (Symphytum officinale L), докторска дисертација, Лесковац, 2015,
Технолошки факултет Универзитета у Нишу.

28