Molecular Testing di Era Pandemi:

HIV VIRAL LOAD & HIV KUALITATIF (EID) vs COVID-19

Christine Sugiarto
CLINICAL PATHOLOGIST, DHARMAIS NATIONAL CANCER HOSPITAL
2021
HIV VIRAL LOAD
Proses Amplifikasi

No. of No. Amplicon

1 cycle = 2 Amplicon Cycles Copies of Target
2 cycle = 4 Amplicon 1 2
3 cycle = 8 Amplicon
2 4
4 cycle = 16 Amplicon
3 8

5 cycle = 32 Amplicon 4 16

5 32
6 cycle = 64 Amplicon
6 64

20 1,048,576
7 cycle = 128 Amplicon
30 1,073,741,824
Bagaimanakah Viral Load HIV diukur ?
Proses Deteksi :
Denaturasi
Denaturasi dan Hibridisasi
Hibridisasi

Deteksi
Deteksi

Preparasi
Preparasi dandan Amplifikasi
Amplifikasi
HIV VIRAL LOAD

Convert to VL

Kalibrator
Pemeriksaan Viral Load
COBAS AmpliPrep/ COBAS Taqman System
(Roche)
 Dual Target: gag and LTR regions
 Ampliprep instrument untuk ekstraksi asam nukleat virus
otomatis dan Taqman analyzers untuk amplifikasi dan
deteksi target asam nukleat virus otomatis
 Quantifies HIV-1 group M (subtypes A-H), HIV-1 group O,
limit of detection of 20 – 10 juta RNA copies/mL.
Abbott m2000 System (Abbott)
 Target: integrase region dari polymerase (or pol) gene
 Automated sample preparation: m2000sp
 Amplificaton and detection: m2000rt
 Limits of detection: 40 copies/mL for 0.6mL input and 150
copies/mL for 0.2mL input – 10 juta copies/ml
Viral Load and EID* Product in Pipeline
GeneXpert

Features Xpert HIV-1 Viral Load

- Two Internal Quantitation Standards (IQS)

high and low (armored RNA)
Assay Controls - Sample Volume Adequacy (SVA)
- Probe Check Control (PCC)

Target 5’ LTR

Genotypes included Group M, N and O

Sample 1 mL plasma

LoD 15,3 copies/mL (Probit analysis, VQA)

LoQ 40 copies/mL

Linear Range 40 – 107 copies/mL

Perbandingan Teknologi Pemeriksaan VL
FItur GeneXpert Roche Abbott Biomerieux
CAP/CTM m2000

Target 5’ LTR gag gene dan int region pol gag gene
LTR gene
Volume 1000 μL 850 μL plasma 200 μL, 500 100 μL, 200
Sampel plasma μL, 600 μL, 1 μL, 500 μL
000 μL plasma
Waktu 90 menit 7-8 jam 5.5 jam – 8.5 7-8 jam
Pengerjaan jam
LoD 18 cp/mL 20 cp/mL 25 cp/mL 10 cp/mL

LoQ 40 cp/mL 40 cp/mL 40 cp/mL 40 cp/mL

HIV KUALITATIF (EID)
Pemeriksaan HIV pada bayi dan balita
<18 bulan
Diagnosis awal untuk bayi dan Balita usia < 18 bulan
1. EID/HIV DNA (kualitatif)
2. HIV RNA (Viral Load)

Jenis Sampel
1. EID HIV DNA :
- darah kapiler Dry Blood spot (DBS)
- stabilitas :7 hari (2 – 8oC), 24 jam pada suhu kamar
2. HIV RNA (viral Load)
- plasma EDTA 3 mL
Kriteria bayi dan anak < 18 bulan yang
membutuhkan pemeriksaan diagnostik
- Bayi yang terpapar HIV (Ibu diketahu
HIV (+))
- Bayi yang sakit dengan tanda dan
gejala HIV, meskipun status paparan
HIV tidak diketahui
Penularan HIV IBU ke Bayi

Penularan Human Immunodeficiency Virus (HIV) dari Ibu

hamil yang terinfeksi kepada bayinya

Hal ini dapat terjadi :

• Pada kehamilan (in utero) : 5-10%
• Pada waktu proses persalinan (intra partum) : 10-20%
• Melalui pemberian ASI (post-partum) : 5-20%

Wanita dengan HIV yang mendapatkan terapi ART pada

saat kehamilan sesuai rekomendasi PMTCT akan
menurunkan risiko penularan menjadi <1%
Mengapa Harus EID?

 Tanpa pengobatan, bayi baru lahir yang

terinfeksi HIV akan meninggal sebelum
mencapai usia 2 tahun
 Diagnosis dini dan pengobatan dini telah
meningkatkan kualitas hidup dan umur harapan
hidup bayi penderita HIV
 Diagnosis dini sehingga bisa dilakukan
pengobatan ARV lebih awal sebelum menjadi
lebih parah dan timbul komplikasi
Pemeriksaan HIV
pada bayi dan anak < 18 bulan
• Tesantibodi rapid/EIA , tidak dapat menegakkan
diagnosis untuk bayi dibawah usia 18 bulan karena
masih memiliki antibodi maternal, dapat digunakan
untuk mendeteksi pajanan
• Tes antigen p24 , sensitifitas rendah (tidak dianjurkan)
• Virologi
HIV DNA kualitatif, tes yang direkomendasi
untuk mendiagnosis dini bayi
• Virologi
HIV RNA kuantitatif (viral load), mengetahui
jumlah virus. Dapat digunakan untuk pemantauan
terapi ARV
Pemeriksaan HIV pada bayi dan anak < 18
bulan
Penggunaan Uji Serologis HIV pada usia
<18 bulan
 ALUR DIAGNOSIS HIV PADA BAYI < 18 BULAN
Bila Uji Virologi Tesedia
Bayi terpajan atau diduga terpajan
HIV usia < 18 bulan

Uji virologi

Usia >= 6 minggu

Positif Negatif

Kemungkinan terinfeksi HIV Tidak mendapat ASI Mendapat ASI

Mulai terapi ARV Tidak terinfeksi HIV Bayi atau anak berisiko
Ulangi uji virologi untuk terinfeksi HIV selama
konfirmasi diagnosis* belum berhenti ASI

Uji Antibodi pada usia 18 Ulangi uji virologi setelah 6

bulan minggu berhenti ASI atau
terdapat tanda atau gejala
*Jika pada konfirmasi didapatkan hasil yang berbeda, maka diulang kembali. HIV
Terapi ARV tetap dilanjutkan sampai didapatkan hasil konfirmasi (2 hasil sama)
EID pada PPIA

 Pada bayi lahir dari ibu terinfeksi HIV dan masuk

program PPIA, penegakan diagnosis HIV dapat
dilakukan sebagai berikut.
 1. Virologi HIV DNA dilakukan pada waktu:
 Test awal pada usia 6 minggu
 Pengulangan pada usia 4-6 bulan (jika hasil pemeriksaan
virologi di usia 6 minggu negatif)
 2. Pada usia 18 bulan dianjurkan untuk dilakukan
pemeriksaan antibodi HIV untuk konfirmasi
Pemeriksaan Diagnosis Bayi dan anak <18
bulan (Early Infant Diagnosis)
• Tes diagnostik dengan virologi
 HIV-1 DNA kuantitatif → TOTAL NUCLEIC ACID
• Tes ini menggunakan teknologi Polymerase Chain
Reaction (PCR) untuk meng-amplifikasi provirus DNA
yang berada didalam limfosit dari darah pasien
terinfeksi HIV-1.
• Pada bayi yang lahir dari Ibu positif HIV tes ini dapat
dipakai untuk mendeteksi HIV DNA paling awal 6 minggu
setelah kelahiran
Siklus Hidup HIV

PROVIRUS DNA

PROVIRUS DNA
Pemeriksaan HIV DNA kualitatif untuk EID
 Tes HIV DNA kualitatif :
 RT PCR konventional (reference method)
COBAS® HIV-1 Qualitative Test
Abbott RealTime Qualitative HIV-1
Perlu infratruktur laboratorium yang baik,
umumnya dilakukan pada laboratorium
propinsi / rujukkan
 TCM (Tes Cepat Molekuler)
Gene Xpert
Dapat di lakukan pada berbagai tingkatan
Laboratorium.
 Pemeriksaan HIV DNA kualitatif EID
 Sampel yang digunakan :
 Darah whole blood EDTA
 Whole blood Dry Blood Spot (DBS whatman 903)
minimal 4 lingkaran
PCR COVID-19

2n
PCR HIV Kualitatif

2500 copies/mL
Abbott m2000 System
(Abbott)
COVID-19
Etiologi
 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)
 Famili: Coronaviridae
 Genus: Betacoronavirus
 Subgenus: Sarbecovirus
 SARS-CoV-2 →coronavirus ke-7 yang diketahui menginfeksi manusia

Endemik
Musiman
ISPA ringan
Zoonotik
Lebih virulen

Fang B, Meng QH. Critical Rev Clin Lab Sci 2020;57:400-14

 Spesimen Pemeriksaan

Saluran pernafasan atas → direkomendasikan

•Tahap awal
•nasofaring & orofaring
Saluran nafas bawah
•Tahap lanjut, hasil dari sal. nafas atas - tapi klinis COVID +
•Sputum (spontan), aspirat endotrakeal/lavage bronkoalveolar
Cairan oral
•pada kasus yg sulit mendapatkan specimen sal. nafas atas
•Meludah, berkumur

Feses/swab rektum
•Sejak minggu ke-2 setelah muncul gejala

Spesimen post mortem

•Biopsi jaringan, biopsi jarum, usapan post mortem

Lainnya: darah, urin, cairan mata, cairan otak

https://www.who.int/publications/i/item/diagnostic-testing-for-sars-cov-2
https://www.amjmed.com/article/S0002-9343(20)30440-X/fulltext
 Positivitas specimen
swab nasofaring 63-94%

Wang et al, 2020. JAMAMay 12, 2020 Volume 323, Number 18

Tan et al, 2020. https://doi.org/ 10.1101/2020.03.24.20042382
 Jenis Pemeriksaan SARS-CoV-2
Pemeriksaan
Pemeriksaan Direk Indirek
Pemeriksaan Pemeriksaan Pemeriksaan
Molekular Antigen Serologi
• Mendeteksi • Mendeteksi • Mendeteksi
asam antigen antibodi
nukleat SARS-CoV-2 terhadap
dari virus SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 di darah
NAAT
 Metode Diagnosis SARS-CoV-2 Berdasarkan Onset

Sethuraman N, Jeremiah SS, Ryo A. Interpreting Diagnostic Tests for SARS-CoV-2. JAMA. 2020 Jun 9;323(22):2249–51.
Nature | Vol 585 | 24 September 202
PCR dan Tes Antigen COVID-19

8 10
A few weeks

Performa baik pada Ct ≤ 25 (1-3 hari sebelum onset gejala s/d

5-7 hari sesudah onset gejala)
WHO . Interim Guidance. 2020. Antigen-detection in the diagnosis of SARS-CoV-2 infection using rapid immunoassays. 11
September 2020. Available at: https://www.who.int/publications/i/item/antigen-detection-in-the-diagnosis-of-sars-cov-
2infection-using-rapid-immunoassays (Accessed 12 November 2020)
Periode
Jendela PCR

Lippi et al. Clin Chem Lab Med 2020; 58(7): 1070–1076

Pemeriksaan Molekular
 Struktur Gen

Afzal A. Journal of Advanced Research 26 (2020) 149–159

 Berbagai Jenis NAAT

Yu et al. Diagnostics 2021, 11, 53. https://doi.org/10.3390/diagnostics11010053

 rRT-PCR

 r= real time
 RT= reverse transcription
 PCR= polymerase chain reaction

Afzal A. Journal of Advanced Research 26 (2020) 149–159

 Metode NAAT lainnya

Xu et al. Clin. Transl. Med. 2020;10:e158.

 Perbandingan beberapa Metode NAAT

Xu et al. Clin. Transl. Med. 2020;10:e158.

PCR COVID-19

2n
PCR COVID-19
PCR COVID-19
PCR COVID-19
 Hasil dan Interpretasi
 Positif
 Terinfeksi SARS-CoV-2

 Kontaminasi, carryover

 Negatif
 Tidak terinfeksi SARS-CoV-2

 Viral load rendah (fase awal/akhir penyakit, tertekan

sistem imun)
 Proses pra-analitik/analitik tidak optimal
PCR COVID-19

 Hasil dan Interpretasi

 Nilai Ct

→Sesuai dengan jumlah virus di sampel

→Mungkin sesuai dengan jumlah virus di
pasien (gambaran kasar)
→Tidak berhubungan dengan derajat keparahan
PCR COVID-19

 Performa terhadap kultur virus

[PCR tidak dapat membedakan virus viabel/tidak,
kultur virus hanya bisa positif jika virus viabel]

 PCR positif sampai 83 hari vs. kultur positif sampai

20 hari
 Semakin rendah Ct, semakin mungkin didapatkan
kultur positif
Hubungan CT Value dengan kultur
• Hubungan bermakna antara Ct
value dengan kultur positif
• Sampel dengan Ct value 13-17
→ 100% kultur positif
• Kultur positif menurun seiring
dengan meningkatnya Ct value
• Ct value 33 → hanya 12% kultur
positif
• Ct value >34 → tidak ada kultur
yang positif

La Scola et al. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious

Diseases(2020) 39:1059–1061
Kesalahan
Preanalitik dan
Analitik

Lippi et al. Clin Chem Lab Med 2020; 58(7): 1070–1076

Masalah: Varian Gen SARS-CoV2 Baru
 B.1.1.7 B.1.351 P1 dan P2

Lokasi Inggris Afrika Selatan Brazil

(di Indonesia 2 Maret 2021)

Jenis Mutasi 17 mutasi yaitu 14 penggantian Mutasi multiple pada gen S 3 mutasi pada gen S RBD
asam amino dan 3 delesi pada
ORF1a/b, ORF 8, S, dan N Mutasi pada ORF1ab, ORF3, Mutasi pada ORFa1b, ORF8,
N, dan E juga dilaporkan N juga dilaporkan
8 dari 17 mutase melibatkan gen S
Dampak pada minimal Minimal, namun dapat Minimal, namun dapat
pemeriksaan mempengaruhi performa mempengaruhi performa
molekular assay dg target gen S assay dg target gen S

 PCR jarang mempunyai target gen S sebagai primer utama

 Target PCR harus multiple
 Jika menggunakan target gen S → harus monitor dan segera implementasi gen lain (misalnya
RdRP dan E)

https://www.finddx.org/covid-19/novel-variants/
8th January 2021
https://www.fda.gov/medical-devices/letters-health-care-providers/genetic-variants-sars-cov-2-may-lead-false-negative-results-molecular-tests-
detection-sars-cov-2

Rekomendasi FDA

 Waspada terhadap perkembangan varian genetik SARS-CoV-2 dan hasil

negative palsu dapat terjadi
 Kemungkinan tes yang menggunakan multiple genetic targets tidak terlalu
terganggu akibat variasi genetik
 Hasil negatif perlu mempertimbangkan klinis pasien, riwayat penyakit dan
informasi epidemiologi
 Perlu dipertimbangkan untuk mengulang pemeriksaan dengan alat lain (target
gen berbeda) jika masih mencurigai COVID-19 dengan hasil tes negatif