SAO CHÉP ADN

Bộ môn Vi sinh - Ký sinh

Môn học: Sinh học phân tử

1
 Mục tiêu

• Trình bày được quá trình sao chép ADN vi

khuẩn và ADN tế bào nhân thật

• Tóm tắt được cách thức sao chép của acid

nucleic virus

• Mô tả được quá trình sửa chữa ADN

2
 Nội dung
• Các khái niệm
• Sự sao chép của ADN
➢ Thí nghiệm của Meselson và Stahl
➢ Các yếu tố cần thiết cho sự sao chép ADN
➢ Sao chép ADN prokaryote (E. coli)
➢ Sao chép ADN eukaryote
➢ Sao chép ADN virus
• Sửa sai khi sao chép và khi không sao chép
➢ Sửa sai khi sao chép
➢ Sửa sai khi không sao chép
3
Học thuyết trung tâm
(Central Dogma)

4
Cấu trúc xoắn kép của ADN

Gồm:
➢ 2 chuỗi đường-
phosphat ở mặt
ngoài
➢ Các base nitơ ở
bên trong nối
với nhau bằng
các liên kết
hydro

5
 Cấu trúc xoắn kép của ADN

• Các base nitơ trên hai

mạch đơn ADN bắt cặp
với nhau bằng liên kết
hydro theo nguyên tắc
bổ sung:
A=T
G≡C

6
Cấu trúc xoắn kép của ADN

Video 1: DNA Structure

7
 Cơ chế sao chép bán bảo thủ của ADN

• Nuôi vi khuẩn vài thế hệ trong môi

trường N15 → tất cả ADN của vi
khuẩn đều là loại nặng.
• Chuyển vi khuẩn vào môi trường
chứa N14 là nguồn cung cấp nitơ
duy nhất, đến khi khối lượng ADN
tăng lên gấp đôi
• Chiết ADN và ly tâm trên thang
nồng độ CsCl
Video 2: Meselson và Stahl Experiment

8
Thí nghiệm của Meselson và
Stahl

2010 Pearson Education.Inc

 Cơ chế sao chép bán bảo thủ
của ADN

• Phân tử ADN được

tổng hợp gồm một
mạch mới và một
mạch cũ

10
Images.suit101.com
 Các yếu tố cần thiết cho quá trình
sao chép ADN
Quá trình sao chép ADN cần:
• ADN khuôn mẫu
• 4 loại desoxyribonucleotid triphosphat: dA,
dT, dC, dG
• ADN polymerase
• Ion Mg2+

Phương trình kéo dài chuỗi ADN:

d(NMP)n + dNTP d(NMP)n+1 + PPi

11
 ADN Polymerase

Các loại ADN polymerase:

• Tế bào nhân nguyên thủy: 5 loại I, II, III, IV, V
• Tế bào nhân thật: 5 loại α, β, γ, δ, ε

12
 Các ADN polymerase từ E. coli và retrovirus

E. coli
Polymerase Virus
I II III IV V
Trọng lượng 109 000 120 000 180 000 160 000
phân tử (Mr)
Cấu trúc, đơn vị một một α 140 000 α 65 000
nhỏ, Mr ε 25 000 β 95 000
θ 10 000

Polymer hóa 5’→ + + + + + +

3’
Hoạt tính
exonuclease
5’ → 3’ + - - -
3’ → 5’ + + + -
13
 Vai trò của các ADN polymerase

• ADN polymerase I chịu trách nhiệm sữa chữa ADN hư

hỏng và có vai trò phụ trong sao chép

• ADN polymerase II cần thiết cho sự tái khởi động chạc

ba sao chép khi ADN tổn thương

• ADN polymerase III, còn gọi là replicase, là enzym sao

chép chính

• ADN polymerase IV và V cho phép quá trình sao chép

bỏ qua những tổn thương trong ADN

14
 Các ADN polymerase của nhân thật

Polymerase α β γ δ ε

Mr 350 000 39 000 200 000 250 000 350 000

Đơn vị nhỏ 4 1 2 4 4

Vị trí Nhân Nhân Ty thể Nhân Nhân

Hoạt tính Khởi đầu Sửa chữa Sao chép Sao chép Sao chép
polymer hóa sao chép ADN ty thể ADN nhiễm ADN nhiễm
5’→3’ ADN nhiễm sắc thể sắc thể
sắc thể

15
 Sao chép ADN ở E. coli
Sao chép ADN ở E. coli gồm các bước:
• Khởi đầu
• Tháo xoắn
• Tổng hợp mồi
• Kéo dài
• Kết thúc

16
 Sao chép ADN ở E. coli
Bước khởi đầu
• ADN của nhân nguyên thủy có dạng vòng, xoắn kép
• Vị trí Origin (OriC), 254 bp, điểm bắt đầu sự tổng hợp ADN
của nhiễm sắc thể, do protein B nhận biết → tạo bong
bóng sao chép khi khởi đầu
• Các nút sao chép = các chạc ba sao chép

Chạc ba sao chép

Hướng Hướng
Chạc ba sao 17
chép
 Sao chép ADN ở E. coli
Bước tháo xoắn
• Protein khởi đầu tách hai sợi ADN tại vị trí khởi đầu
• Enzym helicase:
– Gắn vào vị trí khởi đầu
– Bẻ gãy liên kết hydro giữa các base của hai mạch
nucleotid
– Bám vào sợi muộn của mỗi chạc ba sao chép
– Di chuyển theo hướng 5’ – 3’ của sợi muộn
• Enzym ADN gyrase – topoisomerase: kiểm soát tình trạng
siêu xoắn của ADN

18
 Vai trò của Topoisomerase

• Là enzym điều hòa trạng thái xoắn của ADN

• Topoisomerase I gắn với ADN, cắt một sợi, cho phép
ADN xoắn kép quay quanh một điểm làm mất đi sự
xoắn.
• Topoisomerase II còn gọi là gyrase tạo ra các dạng siêu
xoắn âm (phải sang trái). Topoisomerase II làm mất đi
vòng catena, cắt một sợi ADN kép và để phân tử ADN
sợi kép còn lại đi xuyên qua điểm cắt, sau đó sợi kép
ban đầu được nối lại. 19
Vai trò của Topoisomerase

20
 Vai trò của Topoisomerase

• Sự tháo xoắn ADN gây ra hiện tượng siêu xoắn

o Siêu xoắn âm: mở vặn
o Siêu xoắn dương: vặn xoắn thêm

21
 Sao chép ADN ở E. coli
Bước tổng hợp mồi
• Đoạn mồi ARN
o Đoạn ARN ngắn, đầu 3' - OH tự do, bổ sung được với ADN khuôn
o Luôn cần cho sự tổng hợp ADN bởi ADN polymerase
o Do primase tổng hợp
• N-protein nhận diện trình tự đặc hiệu trên chuỗi ADN đơn
→ Primase + vài chuỗi polypeptid → primosome chức năng ~
5 - 10 base đặc hiệu
• ADN polymerase I loại bỏ mồi ARN khỏi chuỗi ADN →
khoảng trống được lắp đầy các bằng các dNTP thích hợp
• ADN ligase nối lại thành sợi ADN liên tục
22
Sao chép ADN ở E. coli

Tổng hợp mồi ARN 23

 Sao chép ADN ở E. coli
Bước kéo dài
• Xảy ra sau khi:
– ADN tháo xoắn
– Mồi ARN gắn vào
• Enzym ADN polymerase kéo dài chuỗi polynucleotid bằng
hoạt tính polymer hóa:
– Thêm nucleotid mới vào đầu tận cùng 3’ của phân tử
ADN đang tổng hợp

24
Sao chép ADN ở E. coli

Chạc ba sao chép 25

 Sao chép ADN ở E. coli
Bước kết thúc
• Xảy ra sau khi:
– Hai chạc ba sao chép gặp nhau
– Gặp trình tự kết thúc đặc hiệu
• Protein kết thúc Tus gắn với trình tự kết thúc → ngăn
chặn sự di chuyển của helicase → kết thúc sao chép
ADN

26
 Sao chép ADN ở E. coli
Cấu trúc theta
• Sao chép từ 1 vị trí Origin trên
ADN vòng, tiến hành theo cả hai
chiều thuận và nghịch
→ cấu trúc theta
• Cứ mỗi 10 base được sao chép thì
hai sợi ADN gốc phải vặn xoắn 1
vòng → sợi đơn ADN
• Hai phân tử ADN mạch kép lồng
vào nhau và được tách bởi
Topoisomerase II (Gyrase)

27
 Sao chép ADN ở E. coli
Các protein sao chép quan trọng của E. coli
Protein Chức năng
Protein B Nhận biết điểm Ori
N-protein Cho phép primase hoạt động
Primase Tổng hợp mồi ARN
Rep protein Tháo xoắn sợi dẫn
Helicase Tháo xoắn sợi chậm
SSB-protein Ổn định sợi ADN đơn
ADN polymerase III Tổng hợp ADN
ADN topoisomerase I Cắt khía một sợi đơn ADN
ADN topoisomerase II (gyrase) Cắt khía cả hai sợi đơn ADN
ADN ligase Nối các đầu của polynucleotid đã hình thành

28
 Sao chép ADN ở nhân thật
 Cơ chế sao chép: tương tự như ở nhân nguyên thủy
KHÁC
➢ ADN đóng cuộn trong nhiều nhiễm sắc thể và dài hơn
➢ Tốc độ di chuyển ADN polymerase ở nhân thật chậm hơn rất nhiều
(~ 50 nucleotid/giây).
➢ Có nhiều replicon
➢ ≥ 2000 chạc ba sao chép
➢ Các đoạn Okazaki nhỏ hơn, ~ 40 - 300 base
 Tốc độ sao chép ADN ở nhân thật nhanh hơn rất nhiều so với
E. coli

29
Quá trình sao chép ADN ở nhân thật

So sánh quá trình sao chép ADN ở

tế bào nhân nguyên thủy và nhân thật
Đặc điểm Nhân nguyên thủy Nhân thật
Tốc độ di chuyển 800 nucleotid/s 50 nucleotid/s
của ADN
polymerase
Số replicon 1 Nhiều
Kích thước đoạn 1000 – 2000 40 – 300
Okazaki nucleotid nucleotid
Tốc độ sao chép Chậm Nhanh
30
 Mô hình sao chép ở nhân thật
• Pol δ → tổng hợp sợ dẫn 5’

• Pol α → tổng hợp sợi muộn 3’ ADN primase

Polymerase - 
• Sợi muộn được thắt nút 3’
xung quanh pol α → enzym
di chuyển theo hướng chạc 5’
ba sao chép, giống sao chép
5’ Helicase
ở nhân nguyên thủy
PCNA
3’
Polymerase - 
PCNA = proliferating cell nuclear antigen
kháng nguyên tăng sinh nhân tế bào
31
32
Replicon ở tế bào nhân thật

33
 Sao chép ADN ty thể và lạp thể

• Ty thể có ADN polymerase γ

• Sự sao chép tạo nên cấu trúc D
– Sao chép 01 sợi của ADN gốc,
khi tiến hành được một nửa thì
sợi kia bắt đầu
– Kết quả là tạo ra sự lồng ghép
của 02 vòng ADN và
topoisomerase II sẽ tách đôi hai
vòng kép này

34
 Sao chép ADN virus
• Bộ gen là
– ADN dạng vòng đôi → sao chép bình thường
– ADN dạng thẳng
sao chép đặc biệt
– AND sợi đơn hay ARN

35
 Sao chép ADN virus
• Bộ gen dạng thẳng
– Bộ gen bị ngắn hơn sau mỗi lần sao chép
– Không được tổng hợp chính xác
5’ 3’

3’ 5’

➔ Chiến lược tránh

3’

Hủy mồi 3’ phage λ vòng hóa bộ gen

5’
5’ 3’ 5’ 3’ phage T7 thành lập các phức nối
3’ 5’ 3’ 5’

Hủy mồi
5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’ 36
 Sao chép ADN virus
• Sự sao chép theo kiểu lăn vòng
– Trên ADN vòng, tạo ra sản phẩm ADN dạng thẳng
– Nếu cứ tiếp tục → sợi ADN phức chứa nhiều bản sao liên tiếp
của phân tử ADN vòng
 Nhiều bản sao của bộ gen được tạo ra
Phage λ tạo ra nhiều bản sao nối tiếp
Phage M13 chỉ tạo 1 bản sao
5’

3’

37
 Sao chép ở phage Lambda
• Đặc điểm
– Bộ gen là ADN sợi đôi thẳng, tận cùng của bộ gen là một
đoạn sợi đơn gọi là đầu dính 12 nu → 2 đầu có thể gắn bổ
sung với nhau (vị trí cos)
– Trong E. coli, nst của phage Lambda vòng hóa nhờ vị trí cos
và sao chép theo chu trình tiêu giải tiềm ẩn
• Giai đoạn sớm
– Theo mô hình theta, ori nằm trên gen O tạo DnaA (yếu tố
khởi đầu sao chép) tách 2 sợi ADN
– Gen P có DnaC (yếu tố nạp helicase) giúp DnaB (helicase)
gắn vào ADN và sao chép
– Kéo dài khoảng 5 - 15 phút 38
 Sao chép ADN virus
• Giai đoạn muộn
– Sao chép lăn vòng → ADN kép dài chứa nhiều bản
sao liên tiếp cách nhau bằng cos
– Enzyme Terminase nhận diện vị trí cos và cắt tạo các
bản sao đơn của bộ gen phage với vị trí cos 2 đầu
– In vivo, có sự tham gia của protein capsid, đóng gói
ADN tạo phage hoàn chỉnh

39
 Sao chép của phage M13
• Đặc điểm
– Bộ gen là một phân tử ADN sợi đơn vòng
– Lệ thuộc hoàn toàn vào bộ máy của tế bào chủ do
không ADN polymerase
– Một phần của bộ gen có dạng kẹp tóc sợi đôi → ~
promoter cho ARN polymerase của tế bào chủ, để
phiên mã một đoạn mồi ARN ngắn, mất cấu trúc kẹp
tóc
– Theo kiểu ăn vòng: do gp2 endonuclease cắt khía
ADN của thể sao chép tại vị trí đặc hiệu

40
Sao chép ADN ở phage M13

41
 Sao chép của phage T7
• Đặc điểm
– Bộ gen là dsADN thẳng, dài 39.937 bp
– Sự sao chép bắt đầu tại một điểm cách đầu tận bên
trái khoảng 5900 bp và diễn ra theo cả hai hướng
– Có 160 bp ở đầu bên trái giống hệt 160 bp cuối cùng
bên phải → Gọi là các phần thừa ở đầu
– Sau vòng sao chép đầu tiên hai phân tử con thu
được có một đầu dính với trình tự của phần thừa

42
 Sao chép của phage T75’ 3’

3’ 5’
Sao chép
5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’

5’

3’
3’

5’
5’

3’
3’

5’
Xử lý
Nối lại
5’ 3’

3’ 5’

Cắt ra
5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’

5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’

43 5’ 3’ 5’ 3’

3’ 5’ 3’ 5’
 Cơ chế sửa sai trong sao chép
• Tính chính xác cao trong sao chép ADN nhờ các cơ
chế:
– Hướng sao chép luôn là 5’ -3’ → việc sửa sai chính
xác
– Ở tế bào nhân nguyên thủy: ADN polymerase I và III:
o Có hoạt tính polymer hóa
o Hoạt tính exonuclease 5’ – 3’ và 3’ – 5’
→ nếu gắn nucleotid sai → ADN polymerase lùi
lại, cắt bỏ theo hướng 3’ – 5’
– Ở tế bào nhân thật, ADN polymerase δ và ε có hoạt
tính exonuclease
44
 Cơ chế sửa sai khi không sao chép

Gắn vào trình Tổng hợp lại

Enzyme Cắt đoạn sai
tự sai đoạn sai

• 20 enzym dò tìm base bị biến đổi hóa học

• 5 enzym đặc hiệu liên kết cộng hóa trị sai giữa
base với các chất hóa học khác; giữa các base
trên một mạch
• Một số enzym khác phát hiện sự bắt cặp sai
 Có khoảng 50 enzym tham gia sửa sai 45
Cơ chế sửa sai khi không sao chép

Video 3: Direct Repair

46