Vi Sinh Vật Học Và Miễn Dịch

Học Trong Nhiễm Trùng Nội

Nha
2
Luis E. Chávez de Paz and Gunnar Dahlén

Tóm Tắt
Viêm nhiễm nội nha là 1 bệnh lý rất phức tạp, liên quan đến nhiễm trùng mô
quanh chóp, được xác định bởi nhiều yếu tố nguyên nhân như vi sinh vật, miễn
dịch và môi trường. Trong những năm qua, sự tích hợp các công cụ nghiên cứu,
bao gồm kĩ thuật nhận diện mức phân tử, mô hình in vitro tinh vi, phân tích hệ
vi khuẩn trên cơ thể người đã giúp cung cấp thêm nhiều thông tin chi tiết hơn
đối với những hiểu biết trong nhiễm trùng nội nha. Những nghiên cứu mới nhất
cho rằng cơ sở của những bệnh nhiễm trùng liên quan đến ống tủy chân răng là
do sự đa dạng của vi khuẩn trong tự nhiên, bao gồm sự xuất hiện của vi khuẩn
cư trú dưới dạng màng phím (biofilm). Biofilm nằm ở những vị trí sâu, khó tiếp
cận bằng các phương pháp cơ học, sẽ làm gia tăng tính độc hại của vi khuẩn,
tính kháng kháng sinh, khả năng ẩn náu và sức đề kháng. Hơn nữa, với sự xuất
hiện của những nghiên cứu về vi sinh vật trong miệng người thì những hiểu biết
về sự khác nhau giữa các chủng vi khuẩn trong miệng trên các cá thể khác nhau
dường như đóng vai trò quan trọng trong sự tiến triển của nhiễm trùng nội nha.
Chương này bàn về những kiến thức mới nhất về vai trò của màng phím vi
khuẩn (biofilm) trong nhiễm trùng nội nha, cũng như vị trí của chúng đối với vi
sinh học nội nha. Mối quan hệ phức tạp giữa hệ vi khuẩn trong ống tủy chân
răng và phản ứng viêm của mô quanh chóp cũng được nhấn mạnh trong
chương này, bên cạnh đó là những ứng dụng của chúng đối với việc chẩn đoán
và kiểm soát nhiễm trùng nội nha trên lâm sàng.

L.E. Chávez de Paz, DDS, MS, PhD (*)

Department of Endodontics, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden
e-mail: luis.chavez.de.paz@ki.se
G. Dahlén, DDS, PhD
Department of Oral Microbiology and Immunology, Institute of Odontology, Sahlgrenska
Academy, University of Gothenburg, Box 450, Göteborg, SE 40530, Sweden

© Springer International Publishing Switzerland 2017 13

N. Chugal, L.M. Lin (eds.), Endodontic Prognosis,
DOI 10.1007/978-3-319-42412-5_2
 1 L.E. Chávez de Paz and G.
4 Dahlén
2.1 Môi Trường Miệng Và Ống Tủy Chân Răng

2.1.1 Hệ Vi Sinh Vật Trong Miệng

Hệ vi sinh vật trong miệng bao gồm những nhóm vị trí như lưỡi, niêm mạc, khe
nướu và bề mặt răng, mỗi nhóm đều có những đặc điểm hình thái riêng biệt, góp
phần thúc đẩy sự tăng trưởng của từng chủng vi khuẩn khác nhau trong hệ vi sinh
vật. Đặc điểm chung của hệ vi sinh vật trong miệng là tính hằng nhiệt; sự khác
biệt là những biến đổi bề mặt mô từ mềm đến cứng để thuận lợi cho việc bám
dính, ẩn náu và tăng trưởng; nguồn cấp dinh dưỡng khác nhau. Sự tập hợp đặc biệt
của vi khuẩn trong miệng, hay còn gọi là mảng bám, có liên quan đến những vị trí
khác nhau trong hệ vi sinh vật [1,2].

2.1.2 Sự Ẩn Náu Của Vi Khuẩn Trên Bề Mặt Răng

Bề mặt răng là 1 vị trí lý tưởng để vi khuẩn ẩn náu, vì nó chứa nhiều độ ẩm, không
khí và mang lại nhiều dinh dưỡng từ quá trình ăn uống [3,4]. Mảng bám vi khuẩn
ở bề mặt răng được chia thành mảng bám trên nướu và mảng bám dưới nướu, dựa
vào vị trí của chúng so với đường viền nướu. Thành phần vi khuẩn và sự khác biệt
giữa 2 loại mảng bám trên chủ yếu liên quan đến những thay đổi sinh thái, độ pH
và yếu tố dinh dưỡng. Trong khi nguồn dinh dưỡng của mảng bám trên nướu bao
gồm thành phần thức ăn, nước bọt và dịch nướu thì mảng bám dưới nướu lại phụ
thuộc chủ yếu vào các chất có nguồn gốc từ cơ thể có trong dịch nướu, với thành
phần tương tự như huyết tương [5].

2.1.3 Sức Khỏe Và Bệnh Lý Miệng

Sức khỏe của các cấu trúc khác nhau trong xoang miệng phụ thuộc vào sự tương tác
giữa vi khuẩn và môi trường sống của chúng, trong đó có sự tham gia của các yếu
tố miễn dịch như kháng nguyên, cả dịch thể và tế bào. Sự cân bằng sinh thái này
ảnh hưởng đến sức khỏe vùng miệng 1 cách rất phức tạp vì nó cũng có thể bị ảnh
hưởng bởi các yếu tố bên ngoài như dinh dưỡng, thói quen và lối sống của mỗi cá
nhân.
Vào năm 2003, Marsh đã đề ra giả thuyết sinh thái học mảng bám để làm sáng
tỏ những thay đổi trong sinh thái học xoang miệng, dẫn đến sự phát triển các bệnh
lý miệng phổ biến như sâu răng và bệnh nha chu. Sâu răng và bệnh nha chu xảy ra
là hậu quả của sự mất cân bằng giữa các vi sinh vật tồn tại từ sự tích lũy theo thời
gian với cộng đồng vi khuẩn gây bệnh [6,7]. Sự tiêu thụ quá mức các loại thức ăn
giàu carbohydrate sẽ tạo điều kiện cho sự tăng trưởng và phát triển của các loại vi
sinh vật lên men acid, như Streptococcusmutans và Lactobacillus. Vi khuẩn sinh
ra môi trường acid thúc đẩy sự hủy khoáng của men răng, do đó làm tăng nguy cơ
sâu răng. Còn đối với bệnh nha chu, vệ sinh răng miệng kém dẫn đến tích lũy
mảng bám trong khe nướu, gây ra tình trạng viêm nhiễm mạn tính tại chỗ. Quá
trình viêm này cũng đồng thời làm thay đổi hệ vi sinh vật dưới nướu, thuận lợi
cho sự phát triển của vi khuẩn kị khí Gr(-), và cuối cùng dẫn đến sự phá hủy mô
liên kết và xương nâng đỡ răng
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 1
5
cho sự phát triển của vi khuẩn kị khí Gr(-), và cuối cùng dẫn đến sự phá hủy mô
liên kết và xương nâng đỡ răng [8].

2.1.4 Hệ Vi Sinh Vật Trong Ống Tủy Chân Răng

Khác với những vị trí khác trong môi trường miệng, ống tủy chân răng thường vô
khuẩn và chứa mô tủy sống lành mạnh. Tủy răng là mô liên kết chứa mạch máu và
thần kinh, kéo dài đến tận chóp chân răng. Tủy răng còn chứa hệ thống miễn dịch
để phản ứng lại với sự xâm nhập của vi khuẩn [9–11].
Khi vi khuẩn xâm nhập vào hệ thống ống tủy, chúng sẽ gặp phải 1 môi trường
được kiểm soát nghiêm ngặt mà chủ yếu là nhờ vào hoạt động tích cực của các
chất trung gian gây viêm. Sau khi hàng rào bảo vệ của tủy răng bị đánh bại thì 1
loạt những thay đổi trong môi trường ống tủy chân răng sẽ đóng vai trò là những
yếu tố chọn lọc, làm giới hạn sự phát triển của 1 loài so với những loài khác [10].
Những yếu tố chọn lọc chủ yếu ảnh hưởng đến khả năng tồn tại và tăng trưởng của
vi khuẩn trong ống tủy là độ PH, oxigen và nguồn dinh dưỡng. Khi điều trị nội
nha thì có thêm những yếu tố chọn lọc khác nữa, đặc biệt là tác dụng trong suốt
quá trình điều trị và tác dụng ngắn hạn/dài hạn của loại thuốc kháng khuẩn được
sử dụng. Vì vậy, sự sống của vi khuẩn trong môi trường ống tủy, đặc biệt là sau
khi điều trị nội nha, phụ thuộc vào khả năng của loài vi khuẩn có thích nghi được
với điều kiện hiện tại không [12]. Sự thích nghi của vi khuẩn với điều kiện bất lợi
của môi trường là nhờ vào khả năng sinh tồn, trong nhiều trường hợp là nhờ giai
đoạn ngủ yên, và sự tăng trưởng của biofilm.

2.2 Nhiễm Trùng Ống Tủy Chân Răng

2.2.1 Các Đường Vào Của Vi Khuẩn

Lớp hàng rào mô cứng còn nguyên vẹn của răng giúp bảo vệ tủy có thể bị phá hủy
bởi nhiều lí do. Vi khuẩn có nguy cơ ảnh hưởng đến tủy răng nhất bắt nguồn từ
các tổn thương sâu răng. Các lối vào khác bao gồm chấn thương, nứt, gãy và vỡ
do thực hiện các thủ thuật cơ học nha khoa làm lộ bề mặt. Ống tủy chân răng cũng
có thể bị lộ ở những răng có bệnh nha chu nặng. Khi đó, vi khuẩn có thể xâm nhập
thông quá các ống tủy phụ, ống tủy bên, ống tủy vùng chẽ và cuối cùng là lỗ chóp
chân răng. Tiêu ngót chân răng, sâu răng và các lỗ thủng ở lớp cement có thể tạo
điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tủy [13,14].

2.2.2 Phản Ứng Viêm Của Tủy Răng

Mô tủy sẽ có đáp ứng viêm khi tổn thương sâu răng xâm nhập đến lớp ngà. Vi
khuẩn và các sản phẩm chuyển hóa của chúng, chẳng hạn như acid, sẽ đi vào các
ống ngà và tiếp xúc trực tiếp với mô tủy. Vào giai đoạn này, mô tủy sẽ xảy ra phản
ứng viêm mạnh để vô hiệu hóa các tác nhân xâm nhập và sửa chữa vùng mô bị tổn
thương. Tuy nhiên, còn tùy thuộc vào sự phá hủy bởi những kích thích mạnh, ví
dụ như 1 lỗ sâu lớn, thì đáp ứng viêm của tủy răng có thể diễn ra mạnh mẽ đến
1 L.E. Chávez de Paz and G.
6 Dahlén
mức gây phá hủy. Giai đoạn mà phản ứng viêm vượt quá giới hạn, từ có khả năng
hồi phục sang không có khả năng hồi phục còn chưa được biết rõ. Tuy nhiên sự
không hồi phục được ghi nhận bởi sự tích lũy của các chất trung gian, mà cuối
cùng sẽ gây ra hoại tử. Những biến đổi xảy ra trong mô tủy có thể gây ra những
cơn đau nghiêm trọng, và có thể kéo dài 1 vài ngày [15–17].

2.2.3 Sự Xâm Nhập Nguyên Phát

Thông thường, hệ vi khuẩn chịu trách nhiệm chính cho đáp ứng viêm ban đầu của
mô tủy sống thường liên quan đến lỗ sâu ở ngà, chiếm ưu thế là các loài Gr(-),
nhất là Lactobacillus và Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus
sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius,
ngoài ra còn có Actinomyces, Propionibacterium, Corynebacterium, và
Bifdobacterium cũng thường thấy. Chúng là các loài sinh acid và có thể sinh tồn
trong môi trường acid. Những loại vi khuẩn này cần nguồn dinh dưỡng từ nước
bọt thông qua lỗ sâu cũng như từ sự lộ tủy.

2.2.4 Sự Tiến Triển Của Nhiễm Trùng

Trong và sau quá trình hoại tử tủy, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào buồng tủy và các
ống tủy, sự xâm nhập này tạo ra các lớp biofilm bám vào thành trong của ngà. Vi
khuẩn phát triển với số lượng lớn, và có vũ khí chống lại hệ miễn dịch, bao gồm
sự sản xuất các sản phẩm ngoại sinh, protein kháng kháng sinh và thay đổi hình
thể, làm cho chúng không thể bị tấn công bởi các đáp ứng miễn dịch còn lại (H2.1)
Các yếu tố bảo vệ cơ học và miễn dịch nhờ vào cấu trúc của biofilm do vi khuẩn
tạo ra có thể là mấu chốt cho sự tồn tại lâu dài của chúng. Sau 1 thời gian thì sẽ
xuất hiện tổn thương viêm lan đến mô quanh chóp, hay thường được gọi là viêm
quanh chóp.

2.2.5 Các Tác Nhân Gây Bệnh Trong Nội Nha

Tác nhân gây bệnh trong nội nha được định nghĩa là các vi sinh vật có khả năng
gây phá hủy mô trong bệnh lý viêm quanh chóp [18]. Tuy nhiên, hiện nay chưa có
bằng chứng thực tế nào cho thấy có 1 số vi sinh vật nhất định độc hại hơn các vi
sinh vật khác trong số hệ sinh vật ống tủy chân răng. Do vậy rất khó để phân biệt
được giữa vi khuẩn thông thường (vi khuẩn hội sinh) với vi khuẩn tham gia tích
cực vào quá trình viêm (tác nhân gây bệnh). Phần lớn các nghiên cứu về vi trùng
học – nội nha đều xem xét các tác nhân gây bệnh trong nội nha là những vi khuẩn
được phân lập từ 1 ống tủy chân răng được nuôi dưỡng trong môi trường đặc biệt
trong phòng thí nghiệm. Bằng phương pháp này thì xác định những loài hồi phục
nhiều nhất đóng vai trò là tác nhân gây bệnh nội nha [12].
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 1
7
Sự sản xuất các protease đặc biệt, hoạt động Bề mặt tế bào của vi khuẩn được điều chỉnh để
như bộ phận điều chỉnh hoặc là chất độc tránh bị nhận diện: lipid A của LPS,
carbohydrate trong lớp vỏ, protein màng và thành
phần kích hoạt bám dính và xâm nhập

Ức chế sự thực bào bằng cách tập hợp nhiều tế
bào
Can thiệp bằng các phần tử TLR để làm
giảm sự nhận biết, giảm hoạt động viêm và
ức chế các tín hiệu viêm
Các tế bào miễn dịch/thực bào bị tiêu diệt hoặc
phá hủy trực tiếp bởi các siêu kháng nguyên,
tránh sự hợp nhất của các đại thực bào, ức chế
đường dẫn viêm và sao chép các tế bào miễn
dịch
Ức chế các phân tử kháng khuẩn nhỏ bằng cách
tiết ra các protease, biến đổi bề mặt tế bào để
tránh chèn peptide và trực tiếp cảm nhận các
phân tử nhỏ để kích hoạt hàng rào phòng ngự

Ngăn chặn đáp ứng miễn dịch bởi IgA protease Ức chế trực tiếp sự tự tiêu hủy của tế bào,
và trình diện kháng nguyên kích hoạt các tín hiệu tiêu diệt và thay đổi
đường dẫn tín hiệu tự tiêu hủy

Sản xuất kháng nguyên: cấu trúc bề mặt nhung Hệ thống hỗ trợ bổ sung bị ức chế bởi các
mao, protein màng, LPS (với cấu trúc biến đổi từ enzym protease, vỏ bọc và các chuỗi dài LPS
loài này đến loài khác)

Ức chế các cytokine interferon/chemokine bằng

cách chặn đường dẫn viêm, kích hoạt các con
đường khác và tiết ra các protease phân giải

Hình. 2.1 Hệ thống chống lại hàng rào miễn dịch của vi khuẩn

2.2.6 Sự Đa Dạng Của Vi Khuẩn Trong Nhiễm Trùng Ống Tủy

Dựa vào kết quả từ những kĩ thuật truyền thống, nhiễm trùng ống tủy được khởi
phát bởi 1 số ít tác nhân gây bệnh. Chẳng hạn như sự chiếm ưu thế của các vi
khuẩn kị khí phân giả protein trong cộng đồng vi khuẩn ống tủy chân răng bị
nhiễm trùng có liên quan đến những triệu chứng cấp tính và sự xuất hiện của
chủng loài duy nhất E.faecalis, tồn tại dai dẳng trong các ống tủy nhiễm trùng gợi
ý rằng những vi sinh vật này là những tác nhân chính trong các trường hợp như
vậy. Tuy nhiên, những nghiên cứu toàn diện trên hệ vi sinh vật ống tủy chân răng
bằng cách sử dụng kĩ thuật phân tử cho thấy ống tủy chân răng có nhiều loại vi
khuẩn chưa được công nhận trước đây nhưng lại có liên quan đến lâm sàng [19].
Sự đa dạng của vi khuẩn trong ống tủy bị nhiễm trùng cũng được khẳng định
trong hàng loạt nghiên cứu mô hình in vivo trên động vật [20]. Trong các nghiên
cứu ở loài khỉ, sự phối hợp khác nhau của vi khuẩn được thử nghiệm trong ống tủy
chân răng trong phòng thí nghiệm đã thấy xuất hiện tổn thương quanh chóp. Răng
được điều trị nội nha và theo dõi bằng XQ và mô học trong thời gian 2 – 2.5 năm.
Đối với ống tủy chân răng còn sự hiện diện của vi khuẩn sau khi loại bỏ chất trám
bít, thì có 30 trong số 31 ống tủy vẫn còn tồn tại tổn thương quanh chóp.
1 L.E. Chávez de Paz and G.
8 Dahlén
Quan trọng hơn là còn có nhiều loại tổn thương không được hồi phục là có liên
quan đến sự kết hợp của nhiều loài vi khuẩn, ví dụ như nhiễm trùng phối hợp, hơn
là chỉ 1 loại vi khuẩn đơn độc. Các thí nghiêm bổ sung sử dụng 1 “bộ sưu tập 8
loài”, xuất phát từ 1 ống tủy bị nhiễm trùng có tái nhiễm với 1 tỉ lệ bằng nhau ở
răng của những loài khỉ khác, cho thấy khả năng phá hủy mô mạnh hơn so với
nhiễm trùng trong cộng đồng vi khuẩn đồng nhất [20].

2.3 Sự Phát Triển Của Biofilm

Chế độ sinh trưởng của biofilm là lối sống ưa thích của vi khuẩn trong môi trường
tự nhiên và nhân tạo. Khi vi khuẩn ở pha lỏng, xuất hiện trên những bề mặt có sẵn,
ví dụ như các thành ngà của ống tủy chân răng, thì chúng có 1 ái lực để bám dính
và tạo thành lớp biofilm. Biofilm có cấu trúc không đồng nhất, là nơi vi khuẩn có
kiểu hình với khả năng thích ứng cao trước ấp lực, hàng rào miễn dịch và thuốc
kháng sinh [21,22].

2.3.1 Vi Khuẩn Tạo nên Biofilm như thế nào ?

Quá trình tạo thành biofilm của vi khuẩn phải trải qua 1 só bước. Trước tiên, 1 tế
bào tự do (planktonic) tiếp xúc với bề mặt đã được phủ sẵn protein (cấu tạo của
các thụ thể) cùng với các chất lắng đọng từ môi trường. Sau đó tế bào vi khuẩn
thành lập sự liên kết tạm thời với bề mặt bằng chuyển động Brownian, vận chuyển
ngược dòng, và/hoặc biểu hiện của các yếu tố cấu trúc như tua và roi [23,24].
Trong thời gian ngắn, mối liên kết bề mặt tế bào này trở nên ổn định và bắt đầu sự
hình thành của các vi sinh vật, hoặc bằng sự kết hợp với các tế bào trong biofilm
khác hoặc bằng các đặc điểm sinh sản tích cực. Các lực cơ học ở những khu vực
hẹp và không có hệ thống dòng chảy như là cấu trúc phức tạp của chóp răng sẽ
làm thuận lợi cho sự hình thành các cụm vi khuẩn/biofilm này. Tầm quan trọng
trong giai đoạn này là sự bieeur hiện của các polyme ngoại bào (EPS) như
polysaccharides, proteins, nucleic acids,and phospholipids [25], là những thành
phần xây dựng nên chất nền, là khung xương của lớp biofilm. Cuối cùng, sự
trưởng thành của các cụm vi khuẩn theo 3 chiều cấu trúc sẽ xảy ra ở chất nền
ngoại bào. Thông thường, các vi khuẩn trong biofilm sau đó sẽ tách ra khỏi chất
nền. Các bước thành lập biofilm được thể hiện trong H2.2.

2.3.2 Biofilms Thành Lập Ở Ống Tủy Chân Răng

Hệ vi sinh vật trong ống tủy đã được tifmt hấy khi chúng ẩn náu bằng cách bám
dính vào thành ngà ở tất cả các mặt ống tủy, chẳng hạn như thành trong của chóp
hoặc các ống tủy phụ [26,27]. Vào năm 2004, Svensater and Bergenholtz đề xuất
1 giả thuyết về sự hình thành biofilm ở ống tủy chân răng. Quá trình thành lập
biofilm ở ống tủy được bắt đầu trực tiếp ngay sau cuộc xâm nhập đầu tiên của vi
khuẩn vào buồng tủy và làm phân hủy quá trình viêm. Vị trí ban đầu của tổn
thương viêm sẽ di chuyển dần về phía chóp, cung cấp dòng dịch chuyển cho các vi
sinh vật xâm nhập để chúng có thể nhân lên và tiếp tục gắn vào các thành ống tủy
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 1
9

Surface Primary Cell

Maturation, matrix formation
conditioning colonization multiplication
and co-adhesion

SURFACE

seconds minutes hours days/weeks

Hình. 2.2 Sự phát triển của 1 biofilm đa chủng loài theo thời gian. (1) Sự hình thành lớp màng
đầu tiên trên bề mặt. (2) Các tế bào vi khuẩn bám dính ban đầu. (3) Sự gắn kết không thể đảo
ngược, sự nhan lên và sự hình thành các quần thể nhỏ. Và (4) Sự trưởng thành của biofilm, hình
thành chất nền

Giả thiết này đã được xác minh bằng những quan sát trên kính hiển vi quang học,
đã thấy vi khuẩn tách ra từ mặt trong của ống tủy. Điều này có thể giúp giải thích
làm thế nào mà tổn thương viêm trở thành 1 nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn trong
biofilm phân tách và ẩn náu tại khu vực chóp ống tủy và những vùng xa hơn.

2.3.3 Tại sao vi khuẩn lại thành lập Biofilms

Sinh lý học của vi khuẩn trong cộng đồng planktonic (vi sinh vật trôi nổi tự do) rất
khác biệt so với những vi sinh vật khác cùng phát triển trên bề mặt biofilm [28]. .
Vi khuẩn planktonic thường nhạy cảm hơn với các tác nhân kháng khuẩn do
chúng tiếp xúc với 1 lượng lớn các tác nhân này.Những kiến thức hiện nay cho
thấy sự hình thành biofilm được điều chỉnh để đáp ứng với điều kiện môi trường
rất khác nhau giữa các loài khác nhau. Sau khi 1 tế bào planktonic được nhận diện
là 1 “tín hiệu bề mặt”, thì 1 số cơ chế điều chỉnh sẽ xảy ra trong tế bào, làm
chuyển đổi chế độ từ trôi tự do thành biofilm. Các cơ chế điều chỉnh này, hay còn
gọi là cảm nhận bề mặt, trong nhiều trường hợp có liên quan đến các receptor đặc
biệt ngoài lớp màng tế bào và những tín hiệu chẳng hạn như roi của vi khuẩn [29].
Vai trò cảm biến trước tiên này của roi vi khuẩn rất quan trọng trong giai đoạn
khởi phát hình thành biofilm, là yếu tố tín hiệu gây ra 1 loạt các hoạt động nội bào
dẫn đến sự hình thành các kiểu hình biofilm. Những yêu cầu về kiểu hình biofilm
này sẽ làm cho vi khuẩn được bảo vệ khỏi các tác nhân chống lại chúng, chủ yếu
nhờ vào sự hình thành quần thể không đồng nhất trong biofilm, với sự khác biệt về
tốc độ tăng trưởng và biểu hiện của gen [30]. Tính chất không đồng nhất của
biofilm, cùng với sự phối hợp và ràng buộc có chọc lọc của các yếu tố kháng
khuẩn, làm cho biofilm trở thành 1 mục tiêu điều trị khó khăn.

2.3.4 Sự Đề Kháng Của Biofilm Và Các Yếu Tố Kháng Khuẩn

Thông thường, hiệu quả của các yếu tố kháng khuẩn trong điều trị nội nha được
đánh giá dựa vào hoạt tính của chúng đối với vi sinh vật được nuôi cấy trong môi
trường in vitro. Tuy nhiên, hệ thống này sử dụng tế bào planktonic không thể hiện
đúng với trạng thái như in vivo vì các vi sinh vật được định hướng hơn là được
20 L.E. Chávez de Paz and G.
Dahlén
trôi nổi tự do trong cấu trúc của biofilm ở thành ống tủy. Cộng đồng vi sinh vật
trong biofilm này có sức đề kháng đáng kể và khó loại trừ triệt để bằng các chất
kháng khuẩn.
Sự gia tăng khả năng đề kháng của các loại tế bào vi khuẩn trong biofilm so với
các tế bào planktonic được điều chỉnh bởi 1 số cơ chế bao gồm sự thâm nhập
chậm của yếu tố kháng khuẩn vào biofilm, sự thay đổi môi trường vi sinh hóa
trong biofilm (tạo thành các vùng chậm tăng trưởng hoặc không tăng trưởng),
thích nghi với các phản ứng lực và sự hiện diện của 1 số lượng lớn các tế bào siêu
kháng [31]. Những tế bào siêu kháng này có thể chịu được các tác nhân kháng
khuẩn (tức là chúng sẽ không bị tiêu diệt), và có thể được xem là những thực thể
sống đặc biệt.
Nghiên cứu về sức đề kháng của vi khuẩn trong biofilm đối với các chất kháng
khuẩn đòi hỏi mô hình in vitro phải gần gống với điều kiện lâm sàng. Mặc dù các
thí nghiệm về tác nhân kháng khuẩn chống lại vi khuẩn trong biofilm chưa được
tiêu chuẩn hóa, nhưng nhiều nghiên cứu đã sử dụng mô hình loại bỏ các tế bào
biofilm bằng cơ học sau khi nuôi cấy tế bào theo hình thức truyền thống để nghiên
cứu CFU [32,33]. Các phương pháp khác bao gồm gồm sử dụng kính hiển vi kết
hợp với khả năng bắt màu thuốc nhuộm huỳnh quang để quan sát tại chỗ những
hiệu ứng kháng khuẩn trên biofilm [34]. Trong 1 bài báo cáo gần đây, 1 phương
pháp phân tích biofilm đã được trình bày bao gồm việc đánh giá khả năng tồn tại
của màng tế bào và cấu trúc của biofilm để đánh giá tại chỗ hiệu quả của các chất
kháng khuẩn lên vi khuẩn trên biofilm. Người ta xác định rằng sau khi kiểm soát
các biến số như điều kiện chất nền thì sự thay đổi cấu trúc của biofilm và sự phân
bố các tế bào với hoạt động chuyển hóa mạnh mẽ có thể được theo dõi sau khi sử
dụng các tác nhân kháng khuẩn trên lâm sàng [35]. NaOCl (1%) ảnh hưởng đến
tính toàn vẹn của màng tế bào của tất cả các loại vi sinh vật được thử nghiệm và
loại bỏ hầu hết các tế bào biofilm. Sự tiếp xúc với EDTA (50 mmol/l) cũng ảnh
hưởng đến tính toàn vẹn của lớp màng ở tất cả các chủng vi sinh vật nhưng chỉ
loại bỏ được 1 lượng ít vi khuẩn trong biofilm như E. faecalis, L. paracasei, and
S. anginosus. Chlorhexidine (2.5 %) có ít ảnh hưởng đến tính toàn vẹn của màng
tế bào ở E. faecalis và chỉ loại bỏ được 50% các tế bào biofilm của chúng. Cần lưu
ý rằng tác dụng kháng khuẩn còn phụ thuộc vào bề mặt chứa vi khuẩn, và hầu hết
các chủng vi sinh vật đều thể hiện khả năng kháng lại các yếu tố kháng khuẩn
ngày 1 mạnh hơn trên những bề mặt có phủ collagen. Những phát hiện này cung
cấp thêm nhiều bằng chứng cho thấy vi khuẩn trong các cộng đồng đồng nhất ở
lớp biofilm bám dính trên bề mặt có khả năng đề kháng rất thay đổi đối với các
chất kháng khuẩn, mà điều này thường đòi hỏi mô hình biofilm đa tạp có khả năng
tái sinh.

2.4 Phương Pháp Vi Sinh Vật Được Sử Dụng Trong Nội Nha

2.4.1 Xác Định Vi Khuẩn Bằng Phương Pháp Nuôi

Cấy Và Sinh Học Phân Tử

Thông thường, hệ vi sinh vật trong ống tủy chân răng được xác định từ các mẫu
thu được trong quá trình điều trị nội nha bằng các kĩ thuật nuôi cấy với các
phương tiện hiện đại. Mặc dù kĩ thuật nuôi cấy được thực hiện phức tạp, đòi hỏi
nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong phòng thí nghiệm, nhưng bằng các phương
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 21

pháp kị khí, các thử nghiệm sinh hóa và phân tích độ nhạy cảm với kháng sinh,
người ta vẫn có thể xác định chính xác chủng loài vi khuẩn. Những nghiên cứu dựa
trên phương pháp truyền thống đã xác định được 1 lượng vi khuẩn kị khí tăng lên,
và trong 1 vài trường hợp, chúng hoàn toàn chiếm số lượng vượt trội trong cộng
đồng vi khuẩn ở những răng bị nhiễm trùng.
Tuy nhiên gần đây người ta thường áp dụng kĩ thuật phân tử lên các mẫu ống
tủy chân răng [36]. Kĩ thuật phân tử không dựa vào việc nuôi cấy mà sử dụng các
đầu dò đặc biệt để tìm kiếm DNA và /hoặc RNA của vi khuẩn. Nguyên tắc của kĩ
thuật phân tử dựa trên việc xác định các trình tự DNA được bảo tồn cao mà các
chủng loài vi sinh vật khác nhau đều có. Những gen được bảo tồn này, chủ yếu là
gen 16S rRNA, giúp cho việc xác định phân tử cực kỳ chính xác. Hiện nay tồn tại
rất nhiều phương pháp phân tử khác nhau, và 1 vài phương pháp trong số đó có
thể định lượng các nhóm vi khuẩn khác nhau, ít nhất là ở giá trị tương đối. Các
nghiên cứu phân tử đã tìm thấy 1 lượng lớn các vi khuẩn không bị nghi ngờ, bao
gồm các vi khuẩn mà trước đây chưa từng được nuôi cấy. Bằng cách sử dụng
những phương pháp tiên tiến hơn, người ta có thể xác định được rất nhiều loài vi
khuẩn chưa từng biết trước đây trong những ống tủy bị nhiễm trùng. Mặt khác,
phương pháp sinh học phân tử bị hạn chế bởi thực tế là nó không có khả năng
phân biệt được giữa vi khuẩn chết và vi khuẩn sống. Nói chung, các phương pháp
sinh học phân tử áp dụng với những răng sau điều trị cho thấy vi khuẩn chết hoặc
acid nucleic còn lại có rất ít liên quan với nhiễm trùng (dương tính giả). Cũng cần
phải chỉ ra rằng hệ vi sinh vật trong ống tủy rất biến thiên thùy thuộc vào giai đoạn
nhiễm trùng.
Tóm lại, điều quan trọng nhất là phải hiểu rõ rằng cả 2 kĩ thuật là để bổ sung
cho nhau chứ không phải là thay thế nhau. Cần thực hiện thêm nhiều thử nghiệm
lâm sàng kết hợp cả 2 kĩ thuật trên để củng cố kết quả (H2.3).

Sample obtained from

the root canal

Immediate
molecular
identification
Primary isolation by
culture

Phenotypic Identification Molecular Identification

• Gram stain • DNA

• Cell morphology • 16S rRNA
• Colony morphology • Proteomics
• Selective growth
• Biochemical tests
• Chromatography

Hình. 2.3 Sơ đồ các phương pháp sử dụng để phân lập và nhận diện vi khuẩn trong
ống tủy
22 L.E. Chávez de Paz and G.
Dahlén
2.4.2 Sự Khác Nhau Trong Thành Phần Vi Sinh Vật

Nhìn chung, các phương pháp nuôi cấy và kĩ thuật phân tử đã xác định rằng hệ vi
khuẩn trong ống tủy chân răng thay đổi tùy theo điều kiện lâm sàng. Cần nhấn
mạnh rằng, ngay cả trong những nghiên cứu sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử, thì
vi khuẩn kị khí Gram (-) như Porphyromonas (P. gingivalis, P. endodontalis),
Prevotella (P. intermedia, P. nigrescens), Campylobacter (C. rectus, C. gracilis),
Fusobacterium nucleatum, và Tannerella forsythia đều là những loài chiếm ưu thế
trong sự phục hồi của vi khuẩn. Ngoài ra, kĩ thuật sinh học phân tử còn khám phá
ra nhiều chủng loài vi khuẩn chưa từng được nuôi cấy trước đây, như Treponema
(T. denticola, T. socranskii, T. pectinovorum, T. maltophilium, T. endodontalis),
Dialister, Megashaera, Olsenella và 1 số dòng vi khuẩn vô danh họ Synergistes.

2.4.3 Kĩ Thuật Kính Hiển Vi Tại Chỗ

Kĩ thuật kính hiển vi tại chỗ là công cụ hữu ích để nghiên cứu cấu trúc cộng đồng
vi sinh vật trong 1 hình thể không bị xáo trộn [37–39]. . Các kĩ thuật như quét kính
hiển vi điện tử (Scanning electron microscopy - SEM) và quét kính hiển vi Laser
(laser scanning microscopy - LSM) giúp đem lại những cái nhìn ấn tượng về cấu
trúc của cộng đồng vi sinh vật theo 3 chiều không gian.
SEM cung cấp cái nhìn hoàn hảo về cấu trúc của vi khuẩn trong biofilm; tuy
nhiên cần sự chuẩn bị kỹ lưỡng các mẫu vì có thể làm ảnh hưởng đến cấu trúc tự
nhiên của cộng đồng (H2.4).
LSM cho phép phân tích trực tiếp biofilm mà không cần các bước chuẩn bị gây
ảnh hưởng như trên. LSM kết hợp khả năng quét của kính hiển vi điện tử với sự
quan sát cùng lúc để nhận diện vi sinh vật (sử dụng các đầu dò lai đặc biệt). 1
trong những ưu điểm chính của kĩ thuật này là nó thu thập thông tin từ những vị trí
rời rạc của mẫu và loại bỏ những thông tin không quan trọng. Mẫu quét được thực
hiện trên mặt phẳng, cho phép chuyển tất cả hình ảnh vào phân tích. Do vậy, LSM
cung cấp hình ảnh 3D chi tiết và có độ phân giải cao (H2.5). Hơn nữa, có thể thu
thập thông tin về các cấu trúc đặc biệt của cộng đồng vi khuẩn bằng cách sử dụng
các chất đánh dấu huỳnh quang vào quá trình phát triển và chuyển hoa của chúng.

2.5 Tiên Lượng Nhiễm Trùng Ống Tủy Chân Răng

Điều trị tủy răng là sự sửa soạn bằng cơ học (bao gồm việc mở rộng, loại bỏ mảnh
vụn mô và làm sạch) để không còn vi khuẩn/hoặc mô hoại tử sót lại trong ống tủy
nhằm trám bít tốt. Việc loại bỏ vi khuẩn và mảnh vụn mô được thực hiện cùng với
việc bơm rửa ống tủy bằng các chất sát khuẩn. Yếu tố nguy cơ có khả năng ảnh
hưởng tới tiên lượng của việc điều trị ống tủy bị nhiễm trùng là sự lây nhiễm trong
quá trình điều trị, kết hợp với việc trám bít ống tủy vĩnh viễn không tốt. Yếu tố
nguy cơ này đã được đánh giá trong nhiều nghiên cứu vi sinh học, khi người ta
phát hiện những răng có tồn tại tổn thương quanh chóp trên phim XQ thì liên quan
đến các vi khuẩn còn sót lại trong ống tủy[40]. Những nghiên cứu đó đã chỉ ra rõ
ràng là khả năng lành thương sẽ cao hơn từ 2 – 5 lần nếu như vi khuẩn bị loại trừ
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 23

Hình. 2.4 Hình ảnh SEM,

vùng chóp của 1 răng có
nhiễm trùng chóp mãn tính.
Lớp biofilm là nơi mà các tế
bào vi khuẩn bám vào các ống
ngà.

Hình. 2.5 Hình ảnh tái tạo 3D 1 lớp biofilm được quan sát bằng kĩ thuật CSLM.
Khả năng tồn tại của vi khuẩn được phân tích bằng sự phát huỳnh quang, màu
xanh thể hiện màng tế bào chất còn nguyên vẹn, và màu đỏ thể hiện màng tế bào
chất đã bị phá hủy

triệt để vì không thấy sự tăng trưởng trong những mẫu trước trám bít. Tuy nhiên,
nếu tổn thương quanh chóp vẫn còn tồn tại 2 năm sau khi trám thì có khả năng là
ống tủy vẫn còn chứa vi khuẩn vào thời điểm trám bít. Hiểu được cách vi khuẩn
phát triển mạnh trong môi trường ống tủy sau điều trị tủy và khả năng hợp tác để
tồn tại, như việc thiếu hụt chất dinh dưỡng, có thể giúp làm sáng tỏ sinh bệnh học
viêm nha chu mãn tính. Điều này có thể giúp tiến bộ hơn trong việc tiên lượng
nhiễm trùng dai dẳng và mô tả cộng đồng biofilm như là chìa khóa then chốt trong
nhiễm trùng nội nha mãn tính.

2.5.1 Vi Khuẩn Cư Trú Ở Đâu Sau Khi Điều Trị Tủy?

Vi khuẩn có thể tồn tại trong hệ thống ống tủy bằng cách xâm nhập vào các ống
ngà dọc theo thành ống tủy. Mặc dù việc loại bỏ chúng khỏi những vị trí siêu nhỏ
như vậy dường như rất khó khăn, nhưng người ta vẫn nghi ngờ liệu những vi
2 L.E. Chávez de Paz and G.
4 Dahlén
khuẩn này có cần phải loại trừ hoàn toàn hay không? Quan điểm phổ biến là nếu
chúng không được loại bỏ khỏi ống ngà, thì chúng cũng có thể bị chôn vùi khi
trám bít tốt và sẽ không có ảnh hưởng đáng kể đến mô quanh chóp.
1 vị trí khác nữa thường thấy đối với những vi khuẩn còn sót lại là vị trí giải
phẫu phức tạp vùng chóp. Những khu vực như delta chóp và ống tủy bên tạo thành
1 cấu trúc cực kỳ phức tạp mà các biện pháp kháng khuẩn cũng khó tiếp cận được.
Vi khuẩn ẩn náu ở những vùng giải phẫu phức tạp này có thể gây khởi phát viêm
ngay cả khi đã trám bít ống tủy. Mức độ viêm phụ thuộc vào mức độ thông thương
và độ phức tạp của giải phẫu vùng chóp. Đối với những răng đã trưởng thành từ
lâu năm, có rất ít sự thông thương và khoảng trống, các vi khuẩn còn sót lại có thể
sống ở đó trong nhiều năm mà không gây hại gì nhiều, nhưng vẫn duy trì phản
ứng viêm ở 1 mức độ nào đó. Liệu những vi khuẩn này có nên được loại bỏ hay
không còn là 1 vấn đề cần được bàn luận, và hiện nay vẫn chưa có được sự thống
nhất rõ ràng nào.
Cũng có thể là các vi khuẩn còn tồn tại nằm ở bề mặt chóp chân răng và vùng
tiêu ngót chân răng/khe hở chân răng. Khi đó các tác nhân kháng khuẩn cũng
không thể tiếp cận được trong quá trình điều trị. Việc lấy mẫu thường rất phức tạp,
và tình trạng này thường rất khó chẩn đoán trên lâm sàng. Phẫu thuật cắt chóp đôi
khi là 1 lựa chọn để loại bỏ lượng vi khuẩn nói trên.

2.5.2 Vi Khuẩn Sống Sót Như Thế Nào Trong Quá Trình Điều
Trị Tủy?

Nhiễm trùng với các vi khuẩn biofilm tồn tại dai dẳng ở trạng thái ngủ yên hoặc có
hoạt động chuyển hóa thấp có liên quan đến sự thất bại của điều trị nội nha. Vi
khuẩn trong biofilm ở trạng thái ngủ hoặc chuyển hóa thấp, còn sót lại trong hệ
thống ống tủy dù có sử dụng biện pháp kháng khuẩn để loại bỏ chúng, có liên
quan đến hầu hết những trường hợp nhiễm trùng dai dẳng này. Sự phát triển của vi
khuẩn biofilm vượt quá giới hạn gây ra các đáp ứng miễn dịch mãn tính và trong 1
vài trường hợp có thể lây lan vào các mô xung quanh.

2.5.3 Các Chủng Vi Khuẩn Có Sức Đề Kháng Mạnh Nhất

Một trong số các chủng vi khuẩn đề kháng mạnh nhất là Enterococcus faecalis.
Chúng được phân lập từ những ống tủy có nhiễm trùng dai dẳng [41,42]. E.
faecalis đề kháng mạnh với rất nhiều biện pháp kháng khuẩn (hóa học và cơ học),
có cấu trúc bẩm sinh để phát triển mạnh trong môi trường kiềm, ví dụ như khả
năng chịu được Ca(OH)2 cao [43]. Các loài Enterococci hiện diện không thường
xuyên, với số lượng ít trong hệ vi sinh vật vùng miệng ở người, và cùng với các
loại vi khuẩn khác trong miệng, chúng xâm nhập vào các ống tủy bị nhiễm trùng.
Ít khi xác định được chúng trong các loài vi sinh vật khác ở những răng nhiễm
trùng hoại tử nguyên phát nhưng lại thấy trong suốt quá trình điều trị. Độc tính và
khả năng gây đau tương đối thấp. Ngoài ra người ta cũng tìm thấy các loài vi
khuẩn Gr(+) khác vẫn còn tồn tại trong những răng đã trám bít ống tủy.
Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces là những loài vi sinh vật cộng sinh
chủ yếu trong môi trường miệng, đã được phân lập từ những ống tủy có nhiễm
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 22
5
trùng dai dẳng [12,41,42]. Những nghiên cứu in vitro hệ vi sinh vật Gr(+) này cho
thấy, chúng có khả năng đề kháng với các điều kiện bất lợi, chẳng hạn như môi
trường kiềm, rất giống với đặc tính của Enterococci khi thành lập biofilm.

2.5.4 Đáp Ứng Viêm Mãn Tính

Mô hình mô học đặc trưng nhất của đáp ứng viêm mạn tính là sự hình thành mô
hạt với sự thâm nhiễm chủ yếu của tế bào lympho và tế bào plasma. Mô hạt tạo
thành 1 hàng rào chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn, và nguy cơ vi khuẩn lây lan
từ những tổn thương như vậy là rất thấp. Hầu hết nhiễm trùng ống tủy đều phát
triển trực tiếp đến giai đoạn mạn tính này khi mà nhiễm trùng lan đến mô quanh
chóp. Sự thông thương giữa ống tủy và mô quanh chóp có thể là nguyên nhân phổ
biến, quyết định nhiễm trùng sẽ phát triển cấp tính hay chuyển sang mãn tính như
thế nào. Viêm quanh chóp mạn thường có ít triệu chứng đặc trưng. Trên thực tế,
đa số bệnh nhân không hề nhận biết được là có tổn thương, nhưng nha sĩ có thể
phát hiện chúng nhờ quan sát trên phim X- Quang.

2.6 Kết Luận

• Vi khuẩn trong ống tủy thành lập cộng đồng biofilm đa chủng loài, có thể đáp
ứng và thích nghi tập thể để tồn tại trước điều kiện môi trường và tác dụng của
các yếu tố kháng khuẩn.
• Ống tủy nhiễm trùng có chứa mô hoại tử, cung cấp 1 môi trường thuận lợi với
lượng Oxi và nguồn dinh dưỡng thay đổi, ở đó các vi khuẩn trong môi trường
miệng có thể tồn tại và phát triển.
• Điều trị nội nha bằng phương pháp cơ học bao gồm việc bơm rửa bằng các chất
kháng khuẩn và trám bít bằng cement với Gutta Percha sẽ giúp loại bỏ vi sinh
vật đề kháng. Mức độ chịu đựng của vi khuẩn trong ống tủy trước thủ thuật
điều trị nội nha này sẽ quyết định sự dai dẳng của chúng và là nguyên nhân chủ
yếu của những tổn thương viêm mạn tính.
• Sự thành lập của cộng đồng biofilm đa chủng loài trong ống tủy làm tăng khả
năng sống sót tiềm tàng của từng loài riêng biệt.
• Khả năng gây bệnh tiềm tàng của vi khuẩn trong biofilm được quyết định bởi
tương tác giữa các tế bào, và sự thành lập các quần thể con không đồng nhất là
nơi mà các phân tử tín hiệu kích hoạt đáp ứng với môi trường sẽ giữ 1 vai trò
quan trọng.
• Cuối cùng là, vai trò của vi khuẩn đối với viêm quanh chóp phụ thuộc vào
tương tác giữa vi khuẩn với môi trường sống của chúng. Tất cả các chủng vi
khuẩn, dù có hay không gây bệnh thì đều có khả năng đề kháng tiềm tàng trong
cộng đồng biofilm phức tạp. Hiểu biết sâu về cơ chế kiểm soát sự tương tác này
là điều cốt lõi để làm sáng tỏ khả năng đề kháng của vi khuẩn trong ống tủy
trước các tác nhân kháng khuẩn, và mở ra cơ hội cho các nhà lâm sàng kiểm
soát và điều trị những nhiễm trùng biofilm này.
2 L.E. Chávez de Paz and G.
6 Dahlén
Tài Liệu Tham Khảo
1. Bowden GH, Hamilton IR. Survival of oral bacteria. Crit Rev Oral Biol Med. 1998;9(1):54–
85.
2. Marsh PD, Hunter JR, Bowden GH, Hamilton IR, McKee AS, Hardie JM, Ellwood DC. The
influence of growth rate and nutrient limitation on the microbial composition and
biochemical properties of a mixed culture of oral bacteria grown in a chemostat. J Gen
Microbiol. 1983;129(3):755–70.
3. Marsh PD. Dental plaque as a biofilm: the significance of pH in health and caries. Compend
Contin Educ Dent. 2009;30(2):76–8, 80, 83–77; quiz 88, 90.
4. Marsh PD. Microbiology of dental plaque biofilms and their role in oral health and caries.
Dent Clin N Am. 2010;54(3):441–54.
5. Marsh PD. Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology.
2003;149(Pt 2):279–94.
6. Do T, Devine D, Marsh PD. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future
prospects in dental diagnostics. Clin Cosmet Investig Dent. 2013;5:11–9.
7. Marsh PD, Devine DA. How is the development of dental biofilms influenced by the host?
J Clin Periodontol. 2011;38 Suppl 11:28–35.
8. Cook GS, Costerton JW, Lamont RJ. Biofilm formation by Porphyromonas gingivalis and
Streptococcus gordonii. J Periodontal Res. 1998;33(6):323–7.
9. Nair PN. Apical periodontitis: a dynamic encounter between root canal infection and host
response. Periodontol 2000. 1997;13:121–48.
10. Sundqvist G. Ecology of the root canal flora. J Endod. 1992;18(9):427–30.
11. Sundqvist G. Taxonomy, ecology, and pathogenicity of the root canal flora. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol. 1994;78(4):522–30.
12. Chávez de Paz LE. Redefining the persistent infection in root canals: possible role of biofilm
communities. J Endod. 2007;33(6):652–62.
13. Nair PN, Sjögren U, Krey G, Kahnberg KE, Sundqvist G. Intraradicular bacteria and fungi in
root-filled, asymptomatic human teeth with therapy-resistant periapical lesions: a long-term
light and electron microscopic follow-up study. J Endod. 1990;16(12):580–8.
14. Siqueira Jr JF, Roças IN, Paiva SS, Magalhaes KM, Guimaraes-Pinto T. Cultivable bacteria
in infected root canals as identified by 16S rRNA gene sequencing. Oral Microbiol Immunol.
2007;22(4):266–71.
15. Hahn CL, Liewehr FR. Relationships between caries bacteria, host responses, and clinical
signs and symptoms of pulpitis. J Endod. 2007;33(3):213–9.
16. Martin FE. Carious pulpitis: microbiological and histopathological considerations. Aust
Endod J. 2003;29(3):134–7.
17. Siqueira Jr JF, Roças IN. Bacterial pathogenesis and mediators in apical periodontitis. Braz
Dent J. 2007;18(4):267–80.
18. Figdor D, Sundqvist G. A big role for the very small – understanding the endodontic
microbial flora. Aust Dent J. 2007;52(1 Suppl):S38–51.
19. Roças IN, Siqueira Jr JF. In vivo antimicrobial effects of endodontic treatment procedures as
assessed by molecular microbiologic techniques. J Endod. 2011;37(3):304–10.
20. Möller AJ, Fabricius L, Dahlén G, Öhman AE, Heyden G. Influence on periapical tissues of
indigenous oral bacteria and necrotic pulp tissue in monkeys. Scand J Dent Res.
1981;89(6):475–84.
21. Costerton JW, Cheng KJ, Geesey GG, Ladd TI, Nickel JC, Dasgupta M, Marrie TJ. Bacterial
biofilms in nature and disease. Annu Rev Microbiol. 1987;41:435–64.
22. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent
infections. Science. 1999;284(5418):1318–22.
23. van Loosdrecht MC, Lyklema J, Norde W, Zehnder AJ. Influence of interfaces on microbial
activity. Microbiol Rev. 1990;54(1):75–87.
2 Microbiology and Immunology of Endodontic Infections 27

24. van Loosdrecht MC, Norde W, Zehnder AJ. Physical chemical description of bacterial adhe-
sion. J Biomater Appl. 1990;5(2):91–106.
25. Mayer C, Moritz R, Kirschner C, Borchard W, Maibaum R, Wingender J, Flemming HC.
The role of intermolecular interactions: studies on model systems for bacterial biofilms. Int J
Biol Macromol. 1999;26(1):3–16.
26. Nair P. Light and electron microscopic studies on root canal flora and periapical lesions.
J Endod. 1987;13:29–39.
27. Ricucci D, Siqueira Jr JF. Biofilms and apical periodontitis: study of prevalence and associa-
tion with clinical and histopathologic findings. J Endod. 2010;36(8):1277–88.
28. Romling U, Kjelleberg S, Normark S, Nyman L, Uhlin BE, Akerlund B. Microbial biofilm
formation: a need to act. J Intern Med. 2014;276(2):98–110.
29. Gode-Potratz CJ, Kustusch RJ, Breheny PJ, Weiss DS, McCarter LL. Surface sensing in
Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization
and virulence. Mol Microbiol. 2011;79(1):240–63.
30. Stewart PS, Franklin MJ. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol.
2008;6(3):199–210.
31. Stewart PS, Costerton JW. Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet.
2001;358(9276):135–8.
32. Kayaoglu G, Erten H, Bodrumlu E, Orstavik D. The resistance of collagen-associated, plank-
tonic cells of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide. J Endod. 2009;35(1):46–9.
33. Noiri Y, Katsumoto T, Azakami H, Ebisu S. Effects of Er:YAG laser irradiation on biofilm-
forming bacteria associated with endodontic pathogens in vitro. J Endod. 2008;34(7):826–9.
34. Zaura-Arite E, van Marle J, ten Cate JM. Confocal microscopy study of undisturbed and
chlorhexidine-treated dental biofilm. J Dent Res. 2001;80(5):1436–40.
35. Chávez de Paz LE, Bergenholtz G, Svensäter G. The effects of antimicrobials on endodontic
biofilm bacteria. J Endod. 2010;36(1):70–7.
36. Roças IN, Alves FR, Santos AL, Rosado AS, Siqueira Jr JF. Apical root canal microbiota as
determined by reverse-capture checkerboard analysis of cryogenically ground root samples
from teeth with apical periodontitis. J Endod. 2010;36(10):1617–21.
37. Auschill TM, Arweiler NB, Netuschil L, Brecx M, Reich E, Sculean A. Spatial distribution
of vital and dead microorganisms in dental biofilms. Arch Oral Biol. 2001;46(5):471–6.
38. Boulos L, Prevost M, Barbeau B, Coallier J, Desjardins R. LIVE/DEAD BacLight : applica-
tion of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in
drink- ing water. J Microbiol Methods. 1999;37(1):77–86.
39. Branda SS, Vik S, Friedman L, Kolter R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol.
2005;13(1):20–6.
40. Byström A, Claesson R, Sundqvist G. The antibacterial effect of camphorated
paramonochlo- rophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in the treatment of
infected root canals. Endod Dent Traumatol. 1985;1(5):170–5.
41. Molander A, Reit C, Dahlén G, Kvist T. Microbiological status of root-filled teeth with
apical periodontitis. Int Endod J. 1998;31(1):1–7.
42. Möller AJ, Fabricius L, Dahlén G, Sundqvist G, Happonen RP. Apical periodontitis develop-
ment and bacterial response to endodontic treatment. Experimental root canal infections in
monkeys with selected bacterial strains. Eur J Oral Sci. 2004;112(3):207–15.
43. Chávez de Paz LE, Bergenholtz G, Dahlén G, Svensäter G. Response to alkaline stress by
root canal bacteria in biofilms. Int Endod J. 2007;40(5):344–55.