Machine Translated by Google

PLOS MỘT

BÀI NGHIÊN CỨU

Phát triển xét nghiệm RT-PCR đa thời gian

thực để phát hiện SARS-CoV-2
Huseyin TombulogluID1 *, Hussein Sabit1 , Ebtesam Al-SuhaimiID2 , Reem Al Jindan3 ,
Khaled R. Alkharsah3

1 Phòng Nghiên cứu Di truyền, Viện Nghiên cứu và Tư vấn Y tế (IRMC), Imam
Đại học Abdulrahman Bin Faisal, Dammam, Ả Rập Xê-út, 2 Khoa Sinh học, Đại học Khoa học và Viện Nghiên cứu và Tư vấn
Y tế (IRMC), Đại học Imam Abdulrahman Bin Faisal,
Dammam, Ả Rập Xê Út, 3 Khoa Vi sinh, Đại học Y khoa, Imam Abdulrahman Bin Faisal
Đại học, Dammam, Ả Rập Xê Út
a1111111111
a1111111111 * htoglu@iau.edu.sa

a1111111111
a1111111111
a1111111111
trừu tượng

Sự bùng phát của virus coronavirus mới ở người SARS-CoV-2 (còn được gọi là 2019-nCoV) có thể

sẽ gia tăng trên toàn cầu. Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược thời gian thực (rRT-PCR)

MỞ TRUY CẬP là kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất trong việc phát hiện virus. Tuy nhiên, các kết quả âm

tính giả và dương tính giả có thể tạo ra những hậu quả sai lệch, do đó cần phải cải tiến các
Trích dẫn: Tombuloglu H, Sabit H, Al-Suhaimi

E, Al Jindan R, Alkharsah KR (2021) Phát triển

phương pháp hiện có. Ở đây, chúng tôi đã phát triển một phương pháp chẩn đoán rRT-PCR đa hợp,

thử nghiệm RT-PCR đa thời gian thực để phát nhắm mục tiêu đồng thời hai gen virus (RdRP và E) và một gen người (RP). Phản ứng được thử
hiện SARS-CoV-2. PLoS MỘT 16 (4): e0250942.
nghiệm bằng cách sử dụng chuỗi RNA giả virus và mRNA đích của con người làm khuôn mẫu. Ngoài
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942
ra, quy trình đã được xác nhận bằng cách sử dụng 14 mẫu sam dương tính SARS-CoV-2 trên lâm
Biên tập viên: Turgay Unver, Dokuz Eylul Universitesi,
sàng. Kết quả phù hợp với hệ thống chẩn đoán Xpert® Xpress SARS-CoV-2 của Cepheid được CDC ủy
GÀ TÂY
quyền (100%). Không giống như các chiến lược nhắm mục tiêu gen đơn lẻ, phương pháp hiện tại
Nhận: ngày 21 tháng 3 năm 2021
cung cấp sự khuếch đại của hai vùng virus trong cùng một phản ứng PCR. Do đó, một xét nghiệm

Được chấp nhận: ngày 16 tháng 4 năm 2021 chẩn đoán SARS-CoV-2 chính xác đã được cung cấp, cho phép kiểm tra 91 sam ples trong các đĩa

Xuất bản: 29 tháng 4, 2021

96 giếng trong mỗi lần chạy. Nhờ chiến lược này, phương pháp PCR rRT nhanh, đáng tin cậy và

dễ sử dụng thu được để chẩn đoán SARS-CoV-2.

Bản quyền: © 2021 Tombuloglu et al. Đây là một

bài viết truy cập mở được phân phối theo các điều

khoản của Giấy phép Ghi nhận tác giả Creative

Commons, cho phép sử dụng, phân phối và tái sản

xuất không hạn chế ở bất kỳ phương tiện nào, miễn

là tác giả và nguồn gốc được ghi công.

Giới thiệu
Tuyên bố về tính sẵn có của dữ liệu: Tất cả dữ liệu liên

quan đều có sẵn trong bài báo. Sự bùng phát của Betacoronavirus mới, SARS-CoV-2, bắt đầu ở Vũ Hán, Trung Quốc vào tháng 12

năm 2019, đã lây lan nhanh chóng sang nhiều quốc gia như một đại dịch toàn cầu. Tính đến ngày 10
Tài trợ: Các tác giả gửi lời cảm ơn tới Phó

Trung tâm Nghiên cứu & Đổi mới, Bộ Giáo dục Ả

tháng 3 năm 2021, khoảng 135 triệu người đã được xác nhận nhiễm SARS-CoV-2 và 3 triệu sư tử đã

Rập Xê Út đã tài trợ cho công việc nghiên cứu chết (https://www.worldometers.info/coronavirus/#countries). Số lượng bệnh nhiễm trùng ngày càng gia
này thông qua dự án số COVID19-2020-026-IRMC tại tăng trên toàn thế giới đòi hỏi nhu cầu về một công cụ chẩn đoán ít xâm lấn, đáng tin cậy và nhanh
Đại học / Viện Nghiên cứu và Tư vấn Y tế lmam
chóng [1]. Để đạt được mục tiêu này, một số nghiên cứu đã giải quyết thách thức này và những nỗ lực
Abdulrahman bin Faisal (IRMC) (https://seu.edu.sa/
này đã mang lại một số bộ dụng cụ chẩn đoán. Nhiều phương pháp đã được đề xuất để phát hiện vi rút
dammam / en / news / Vice-Ministry-of-education
SARS-CoV-2 trong dịch mũi họng như đa phương pháp RT-PCR [2, 3], CRISPR / Cas12 [4, 5], và CRISPR-
for-university-research-and-Innovation; https: //

www.iau.edu.sa/en). Ngoài ra, nghiên cứu này Cas3 [6], xét nghiệm miễn dịch dòng chảy bên [7 ], cảm biến phân tử sinh học dựa trên giấy [8], thử

được tài trợ bởi nghiệm SHERLOCK trong một nồi [9], aptamer DNA [10], đẳng nhiệt trung gian vòng lặp

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 1/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Viện Nghiên cứu và Tư vấn Y tế

khuếch đại (LAMP) [11], v.v ... Mỗi phương pháp này đều có điểm mạnh và điểm yếu riêng về
(IRMC) (https://www.iau.edu.sa/en/administration/
độ nhạy và độ đặc hiệu. Trong số các phương pháp này, xét nghiệm dựa trên khuếch đại axit
center / Institute-for-research-and- Medical
nucleic là phương pháp phổ biến nhất để chẩn đoán SARS-CoV-2. Cho đến nay, Cơ quan Quản lý
tham vấn-irmc) theo số dự án 2020-IRMC-S-3.

Huseyin Tombuloglu nhận giải thưởng.

Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã phê duyệt 196 xét nghiệm chẩn đoán phân tử để phát
hiện axit nucleic SARS CoV-2 dưới dạng Cho phép Sử dụng Khẩn cấp (EUA) (https://www.fda.gov/
medical devices / coronavirus -disease-2019-covid-19-khẩn cấp-sử dụng-cho phép-y tế-thiết bị /
Các lợi ích cạnh tranh: Các tác giả đã tuyên bố rằng

không có lợi ích cạnh tranh nào tồn tại.

ống nghiệm-chẩn đoán-euas). Ngoài ra, CDC Hoa Kỳ (Trung tâm Kiểm soát Dịch bệnh và Preven
tion) đề xuất một quy trình phát hiện SARS-CoV-2, dựa trên sự khuếch đại của hai vùng của gen
nucleocapsid, cụ thể là N1 và N2, và kiểm soát nội bộ của con người. gen RNase P (RP) [12].
Ngoài các chiến lược này, các nỗ lực phát triển các phương pháp phát hiện SARS-CoV-2 với
hiệu quả và độ chính xác cao, với ít thời gian và nỗ lực phản ứng vẫn đang được tiến hành.
SARS-CoV-2 là một loại vi rút RNA ((+) ssRNA) chuỗi đơn cảm nhận dương tính. Bộ gen của
nó bao gồm 29,900 nucleotide (nt) bao quanh năm khung đọc mở (ORF) (50 –30 ); ORF1ab
polyprotein (P, 7.096 axit amin), glycoprotein tăng đột biến (S, 1.273 axit amin), protein
nucleocapsid (N, 419 axit amin), protein vỏ (E, 75 axit amin) và protein màng (M, 222 axit
amin) [1, 13]. Do đó, một số gen virus có thể được nhắm mục tiêu để phát hiện SARS-CoV-2
bằng phương pháp RT-PCR. Những gen này bao gồm như gen RdRP và S (Yan và cộng sự 2020) [14],
gen N và S [2], và gen E [15]. Để có hiệu suất RT-PCR tốt nhất, sự kết hợp của các mục tiêu
gen tiềm năng này nên được tối ưu hóa.
Trong nghiên cứu này, nó nhằm phát triển thử nghiệm phản ứng chuỗi poly merase phiên mã
ngược thời gian thực (rRT-PCR) để phát hiện SARS-COV-2. Thử nghiệm simulta gần như nhắm vào
hai gen virus (RdRP và E) và gen người (RP) như một biện pháp kiểm soát nội bộ bằng cách sử
dụng công cụ PCR thời gian thực nhanh 7500 Applied Biosystems (ABI, Thermo Fisher Sci).
Ngoài ra, hiệu quả lâm sàng của xét nghiệm được đánh giá trên các mẫu SARS-CoV-2 lấy từ
bệnh nhân dương tính với COVID-19 và được so sánh bằng cách sử dụng thiết bị GeneXpert Dx
(Cepheid, Sunnyvale, CA, USA).

Nguyên liệu và phương pháp

Căn chỉnh trình tự gen SARS-nCoV-19 Trình tự gen của tất cả

các loại SARS-nCoV-19 đã được giải trình tự trên toàn thế giới đã được tải xuống từ cơ
sở dữ liệu của GISAID (Sáng kiến Toàn cầu về Chia sẻ Tất cả Dữ liệu Bệnh cúm, https://
www.gisaid.org) . Các phân tích so sánh bằng cách sắp xếp các trình tự ở mức cơ bản được
thực hiện với các chương trình tin sinh học như NCBI BLAST [16], MUSCLE [17], và Clus tal
Omega [18]. Hơn 100 bộ gen được chú thích, có thông tin trình tự bộ gen đã được xác định và
bao gồm các mẫu từ Châu Âu và Châu Á, đã được chọn. Bằng cách này, các mục tiêu gen của virus
được điều chỉnh nhạy, cụ thể và chính xác nhất có thể.

Thiết kế mồi / đầu dò đa kênh Mảng đầu

dò và mồi tương thích đa PCR dành riêng cho các mục tiêu gen của virus và người được thiết
kế bằng cách sử dụng các chương trình như PrimerPooler [19], PrimerPlex (http://www.
premierbiosoft.com/primerplex/index.html) , và Primer3 [20]. 5 'Fluorescein amidites (FAM)
và 3' đầu dò gắn nhãn lỗ đen-1 (BHQ-1) cho gen RdRp của virus, 5 'hexa chloro-fluorescein
(HEX) và đầu dò gắn nhãn 3' BHQ-1 cho virus Gen E, và một đầu dò 5 'cacboxyr hodamine (ROX)
và 3' BHQ-2 được đánh dấu cho gen RP của người đã được thiết kế và tổng hợp (Hình 1A).
Nồng độ và trình tự của mỗi mồi hoặc mẫu dò được nêu trong Bảng 1.

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 2/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Hình 1. Thiết kế thí nghiệm và giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) của rRT-PCR lặp lại. (a) Tổ chức bộ gen của SARS-CoV-2 và bộ
gen / mẫu dò đã chọn. (b) Xét nghiệm Simplex nhắm mục tiêu các gen RdRP, E và RP trong các ống phản ứng riêng biệt.
Xét nghiệm đa phân hoặc song công khuếch đại đồng thời hai gen: (c) RdRP và RP, (d) E và RP. (e) Xét nghiệm đa phương
tiện hoặc ba lần nhắm mục tiêu đồng thời hai gen virus (RdRP và E) và một gen kiểm soát nội bộ (RP) của con người.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942.g001

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 3/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Bảng 1. Trình tự và nồng độ của bộ mồi và đầu dò được sử dụng trong phản ứng PCR.

Primer / thăm dò Trình tự (5'- 3 ') Nồng độ (μM) Tài liệu tham khảo

RdRp — F GTCATGTGTGGCGGTTCACT 20 Nghiên cứu này

RdRp — R CAACACTATTAGCATAAGCAGTTGT 20

RdRp- P FAM-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC- BHQ1 5 [33]

E- F GGAAGAGACAGGTACGTTAATA 20 Nghiên cứu này

E- R AGCAGTACGCACACAATCGAA 20

E- P HEX-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 5 [32]

RP — F AGATTTGGACCTGCGAGCG 20 Phổ quát

RP — R GATAGCAACAACTGAATAGCCAAGGT 20

RP — P ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2 5

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942.t001

Phân lập RNA

Nghiên cứu được phê duyệt bởi Hội đồng Đánh giá Thể chế (IRB) tại Đại học Imam Abdulrahman bin Fai sal

(IAU) với số IRB là IRB-2020-13-406. Ngoài ra, nó được phê duyệt bởi ủy ban nghiên cứu hiến pháp và các

mẫu không xác định được còn sót lại sau khi hoàn thành

xét nghiệm chẩn đoán; do đó nghiên cứu này không yêu cầu sự đồng ý theo ủy ban đạo đức thể chế

các quy định.

RNA của virus được chiết xuất từ các mẫu gạc mũi họng trong môi trường vận chuyển virus (VTM)

được gửi đến phòng thí nghiệm vi sinh tại Bệnh viện King Fahd của Đại học

(KFHU), Al Khobar để phát hiện SARS-CoV-2. Tách chiết RNA được thực hiện từ 280 μL

của VTM sử dụng bộ kit QIAamp Viral RNA Mini (Qiagen, Hilden, Đức) theo
hướng dẫn của nhà sản xuất.

phản ứng rRT-PCR

Hỗn hợp phản ứng (20 μL) bao gồm các thuốc thử sau: 2 μL 10x Buffer, 0,25 μL

dNTPs (mỗi 10 mM), 0,2 μL uracil-DNA glycosylase (UDG) (1 U / μL), 0,4 μL VitaTaq1

HS polymerase (2 U / μL), 0,05 μL VitaScript1 Hỗn hợp enzyme bao gồm M-MLV (Procomcure,

Áo), 0,05 μL Triton ™ X-100 (cấp sinh học phân tử, Merck), mồi và đầu dò

hỗn hợp, và ddH2O không có RNase / DNase lên đến 20 μL. Hỗn hợp cho mồi và đầu dò là

đa dạng theo thiết kế bộ. Đối với bộ ghép kênh nhắm mục tiêu đồng thời ba

gen, nồng độ cuối cùng của mồi / mẫu dò được điều chỉnh như sau:

1. 10 pM cho RdRP-F, 13 pM cho RdRP-R và 4 pM cho RdRP-P

2. 4 pM cho EF, 4 pM cho ER và 2 pM cho EP

3. 10 pM cho RP-F, 3,75 pM cho RP-R và 4 pM cho RP-P

Hỗn hợp được phân phối trong các đĩa 96 giếng (Phản ứng quang học nhanh MicroAmp ™ 96 giếng

Tấm 0,1 mL, Hệ sinh học Ứng dụng) và được niêm phong bằng màng quang học (Keo quang học MicroAmp ™

Phim, Hệ thống sinh học ứng dụng). ARN giả virut bao gồm gen RdRP và gen E của virut và con người

Trình tự mRNA RNaseP (RP) được sử dụng làm mẫu dương tính. Trong khi đó, ddH2O tự do RNase / DNase đã

được thêm vào các ống đối chứng âm tính để kiểm tra bất kỳ sự nhiễm bẩn hoặc mồi
ăn tối.

Các thí nghiệm định lượng được thực hiện trong một thiết bị PCR thời gian thực (Applied Biosys tems

™, 7500 Fast Real-Time PCR System). Trước khi hoạt động, thiết bị đã được hiệu chỉnh

bằng cách sử dụng Bộ hiệu chuẩn quang phổ hệ thống PCR thời gian thực nhanh Applied Biosystems ™ 7500.

Sau đó, các điều kiện phản ứng qPCR được điều chỉnh như sau: 1) Phiên mã ngược ở 45˚C

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 4/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

trong 5 phút, 2) Biến tính trước ở 95˚C trong 30 giây, 3) 40 chu kỳ biến tính ở 95˚C trong 5 giây

và khuếch đại ở 60˚C trong 30 giây. Kênh nhuộm phóng viên đặt là FAM cho gen RdRp của virus; và VIC

cho gen E; và ROX cho gen RNAseP (RP) của con người. Đối với thiết bị PCR thời gian thực Applied

Biosys tems ™ (kiểu máy 7500 và StepOne), hãy đặt thuốc nhuộm “tham chiếu thụ động” là “không có”.

Hiệu suất khuếch đại Để tìm hiểu

hiệu suất khuếch đại (E) của các gen, người ta chuẩn bị một đường cong chuẩn từ chuỗi pha loãng

của các khuôn mẫu. Các giá trị Ct so với lượng logarit của mẫu được vẽ biểu đồ. Hiệu suất khuếch

đại thu được bằng cách sử dụng công thức sau:

1 = độ dốc

E ¼ 100 x ð10 THỨ TỰ ð1Þ

Xác thực xét nghiệm bằng Xpert Xpress SARS-CoV-2 Các tăm bông mũi họng

được sử dụng để xác nhận xét nghiệm hiện tại cũng được kiểm tra SARS-CoV-2 bằng cách sử dụng

kit Xpert Xpress SARS-CoV-2 (n = 14) (Cepheid, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ). Khoảng 300 μL VTM đã

được chuyển sang bộ tridge car kit Xpert Xpress SARS-CoV-2. Bộ dụng cụ này bao gồm chiết xuất

RNA trực tiếp và rRT-PCR nhắm mục tiêu đến các phần nhỏ gen E và N2 của SARS-CoV-2. Thử nghiệm

được chạy trên thiết bị GeneXpert Dx (Cepheid, Sunnyvale, CA, Hoa Kỳ).

Phân tích dữ liệu

Kết quả được đánh giá bằng cách xác định đường cong khuếch đại của gen mục tiêu và gen kiểm soát

nội bộ. Đối với thiết bị ABI 7500, đường ngưỡng chu kỳ (Ct hoặc Cq) đã được tự động điều chỉnh

tự động để đảm bảo rằng tất cả các đường cong đều ở vị trí thẳng hàng. Với mục đích này, phần

mềm ABI 7500 (v2.3) đã được sử dụng. Ngưỡng chu kỳ số � 38 với đường cong biểu thị được chấp

nhận là 'dương'.

Kết quả

Chuẩn hóa Simplex rRT-PCR

Trước khi ghép kênh, tất cả bộ mồi / đầu dò gen được nhắm mục tiêu và thuốc thử RT-PCR đã được

thử nghiệm trong rRT-PCR đơn giản. Số lượng mồi và bộ mẫu dò gen E và RdRP đặc hiệu SARS-CoV-2

được tối ưu hóa bằng cách sử dụng 105 bản sao / μL của RNA virus tổng hợp làm khuôn mẫu. Trước

khi có hiệu ứng phản ứng, thiết bị rRT-PCR (Applied Biosystems ™, Hệ thống PCR thời gian thực nhanh

7500) đã được hiệu chỉnh để có được hiệu suất huỳnh quang tốt nhất. Các phản ứng simplex được lặp

lại ít nhất sáu lần đối với hai gen E và RdRP của virus và một gen RP kiểm soát nội bộ (IC). Giá

trị ngưỡng chu kỳ trung bình (Ct) với độ lệch chuẩn (SD) lần lượt là 24,1 ± 1,05, 27,1 ± 1,5 và

31,5 ± 1,0 đối với RP, E và RdRP (Hình 1B).

Chuẩn hóa rRT-PCR song công Bộ mồi và đầu dò

được thiết kế để phát hiện một virut (E hoặc RdRP) và một gen IC của người (RP) tại cùng một

phản ứng rRT-PCR. Hai hỗn hợp phản ứng khác nhau được thiết kế bao gồm bộ mồi và bộ thăm dò cho

RdRP với RP hoặc E với RP. Các phản ứng ba lần mang lại giá trị Ct lần lượt là 23,6 ± 0,77 và 32,3

± 1,8 cho các gen RP và RdRP (Hình 1C).

Trong hỗn hợp phản ứng thứ hai, giá trị Ct được phát hiện lần lượt là 25,7 ± 0,84 và 25,5 ± 0,73

đối với gen E và RP (Hình 1D). Giá trị Ct của cả hai phản ứng đều nhỏ hơn 38, đây là giới hạn
khuyến cáo của CDC (Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh).

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 5/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Chuẩn hóa rRT-PCR đa kênh (triplex) Giao

thức rRT-PCR đa kênh được thiết lập để khuếch đại ba gen (E, RdRP và RP).
Ba đoạn mồi và bộ dò cho mỗi gen được kết hợp trong cùng một ống phản ứng. Đường cong khuếch
đại tín hiệu thu được với giá trị Ct ± SD trung bình lần lượt là 28,8 ± 0,51, 27,3 ± 0,7 và
23,6 ± 1,04 đối với các gen RdRP, E và RP (Hình 1E). Điều này cho thấy xét nghiệm có khả năng
phát hiện ba gen trong cùng một ống phản ứng.

Giới hạn phát hiện (LOD) và hiệu quả rRT-PCR Pha loãng nối

tiếp RNA tổng hợp (105 , 104 giới hạn phát 103 ,(LOD)
gen ,hiện
RdRP và E.
102 và cho
Biểucác
101 đồsao / μL) đã được chuẩn bị để tìm
bản

khuếch đại, hiệu suất khuếch đại (E), và Điểm R2 được thể hiện trong Hình 2. LOD của gen
RdRP là �10 bản sao / μL. Tuy nhiên, LOD của gen E là �103 bản sao / μL. Giá trị E của gen
RdRP và E được xác định là 99,9. Điểm R2 được xác định là 0,977 cho RdRP và 0,995 cho E

gen.

Xác thực xét nghiệm bằng cách sử dụng các mẫu dương tính với SARS-CoV-2 được phát hiện bởi hệ

thống của Cepheid Để xác nhận kết quả của xét nghiệm rRT-PCR đa hợp (được đặt tên là COV2-kit)

trong các mẫu dương tính với SARS-CoV-2 trên lâm sàng, chúng tôi đã so sánh kết quả của mình bằng

cách sử dụng Hệ thống GeneXpert1 của Cepheid . Với mục đích này, trước hết các mẫu gạc mũi họng

được thu thập từ các bệnh nhân bị nhiễm COVID-19 trong khoảng thời gian từ ngày 1 tháng 11 đến ngày

5 tháng 12 năm 2020 tại King Fahd

Hình 2. Giới hạn phát hiện (LOD) của các gen RdRP và E. Một sự pha loãng nối tiếp của RNA tổng hợp (105 , , 103 , 102 và 101 bản sao / μL)

104 đã được chuẩn bị. Biểu đồ khuếch đại (a, c) và hiệu quả khuếch đại (E) (b, d) được thể hiện.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942.g002

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 6/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Hình 3. So sánh giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) của các mẫu dương tính COVID-19 sử dụng xét nghiệm Cepheid và
hiện tại (COV2-kit). (a) Dữ liệu cho thấy giá trị Ct của gen E, là gen chung trong cả hai xét nghiệm. (b)
So sánh gen Cepheid N2 và COV2-kit's RdRP. Các đồ thị cho thấy sự so sánh các giá trị Ct của các gen mục tiêu
đối với (c) E và N2 của Cepheid; và (d) RdRP của COV2-kit và E. Đường gạch ngang màu đỏ hiển thị giá trị ngưỡng 37,
được chấp nhận là giới hạn trên để CDC phát hiện SARS-CoV-2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942.g003

Bệnh viện Đại học (KFHU), Al Khobar. Sau đó, các mẫu được giữ trong môi trường VTM và 300 μL dung dịch

được chuyển trực tiếp vào hộp mực GeneXpert1 của Cepheid . Các mẫu được chạy bằng cách sử dụng bộ phát

hiện Xpert1 Xpress SARS-CoV-2. Các mẫu posi SARS-CoV-2 được chọn để tách chiết RNA vi rút (QIAamp Viral

RNA Mini Kit, Qiagen, Germany). Sau đó, RNA chiết xuất được sử dụng làm khuôn mẫu để kiểm tra xét nghiệm

của chúng tôi. Hiệu suất Ct so sánh của mỗi xét nghiệm được thể hiện trong Hình 3. Bộ COV2 phát hiện tất

cả các mẫu dương tính với SARS-CoV-2 đã được xác nhận. Tất cả các giá trị Ct của gen E đều dưới ngưỡng

được CDC chấp nhận (�37) (Hình 3A). Đối với gen RdRP, chỉ có một mẫu lâm sàng nằm ngoài ngưỡng, phù hợp

với xét nghiệm của Cepheid (Hình 3B). Theo sự so sánh các giá trị Ct giữa E và N2 của Cepheid (Hình 3C),

và các gen RdRP và E của COV2-kit, có sự thống nhất giữa dữ liệu thu được (Hình 3D).

Thảo luận

Sự gia tăng toàn cầu của đại dịch COVID-19 làm cho việc phát triển các phương pháp phát hiện virus nhanh

hơn, đáng tin cậy và nhạy cảm trở thành ưu tiên [21]. Các nghiên cứu mở rộng nhằm tìm ra một phương pháp

phát hiện hiệu quả, đáng tin cậy và nhạy cảm đối với SARS-CoV-2 vẫn đang được tiến hành. Nghiên cứu này

nhằm mục đích phát triển một thử nghiệm rRT-PCR đa hợp nhắm vào hai gen virus (RdRP và E) và một gen

người (RP) được mô phỏng thuần túy trong một ống phản ứng duy nhất. Thử nghiệm được đặt tên là COV2-kit.

Nhờ các đầu dò cụ thể được gắn nhãn với các thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau (HEX, ROX và FAM), các

khuếch đại gen có thể được xác định trong cùng một ống phản ứng bằng cách sử dụng các bộ lọc khác nhau

của Hệ thống PCR Applied Biosystems ™, 7500 Fast Real-Time PCR. Ba cách tiếp cận khác nhau đã được hình

thành để tối ưu hóa giao thức: simplex (nhắm mục tiêu gen đơn), song công (nhắm mục tiêu đồng thời

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 7/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

hai gen) và triplex (nhắm mục tiêu đồng thời ba gen). Với mục đích này, một loại virus tổng hợp

mẫu cùng với mRNA của gen RP đã được sử dụng. Giá trị Ct của các phản ứng được thay đổi

trong khoảng từ 24 đến 34. Theo CDC (Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh) và

Khuyến cáo của WHO, các mẫu có giá trị Ct từ 37,01 trở lên được coi là không có ý nghĩa (CDC, https://www.cdc.gov/

dengue/healthcare-providers/testing/molecular-tests/faq_rt pcr.html; WHO, https://extranet.who.int/pqweb/sites/

default/files/documents/201005_final_

pqpr_eul_0517_204_00_sars_cov2_nucleic_acid_detection% 20% 281% 29.pdf). Nói cách khác,

giá trị Ct không được vượt quá 37 để chấp nhận mẫu là dương tính. Các giá trị Ct trong tất cả các giá trị đã thử nghiệm

các phương pháp tiếp cận (đơn giản, song công hoặc ba mặt) nằm dưới ngưỡng này. LOD (giới hạn của detec tion)

cho các gen RdRP và E lần lượt là ít nhất 101 và 103 bản sao / μL. Các lớp sơn lót và

đầu dò đối với gen RdRP được phát hiện là nhạy cảm hơn so với các thăm dò đối với gen E. Vi-rút

tải lượng bệnh nhân COVID-19 là yếu tố quan trọng đối với hiệu quả xét nghiệm [22]. Có thể kết luận rằng gen

RdRP cung cấp khả năng phát hiện tối đa trên những bệnh nhân có

tải lượng vi rút (�101 bản sao / μL). Ngoài ra, những bệnh nhân có tải lượng vi rút �103 bản sao / μL có thể

được phát hiện bằng cách sử dụng gen E làm mục tiêu. Do đó, các mẫu có tải lượng vi rút thấp có thể được phát hiện

bằng cách sử dụng hai phương pháp nhắm mục tiêu gen nhạy cảm này. Ngoài các gen virus này,

phản ứng bao gồm mục tiêu gen người, RP, như một kiểm soát nội bộ (IC). Nói chung, gen IC

được thử nghiệm trong một ống riêng biệt cho từng phản ứng làm giảm kích thước mẫu cần thử nghiệm và

tăng chi phí. Bằng cách sử dụng chiến lược hiện tại, số lượng phản ứng trên mỗi mẫu là

giảm. Ví dụ, xét nghiệm cho phép kiểm tra 91 bệnh nhân trong các đĩa 96 giếng mỗi lần chạy, do đó tiết kiệm

thời gian hơn và tiết kiệm thuốc thử RT-PCR đắt tiền. Việc phát hiện SARS-CoV-2 nhanh chóng, đáng tin cậy, độ

nhạy cao và chi phí thấp đạt được bằng cách thiết kế và sử dụng các bộ mồi / đầu dò hiệu quả.

Xét nghiệm COV2-kit đã được kiểm tra để xác minh hiệu suất của nó trên lâm sàng dương tính với SARS-CoV-2

mẫu. Ngoài ra, kết quả được so sánh bằng cách sử dụng Hệ thống GeneXpert1 của Cepheid.

sử dụng bộ phát hiện Xpert1 Xpress SARS-CoV-2 (Hình 3). Thay vì chiến lược của chúng tôi nhắm mục tiêu

các gen RdRP và E, Xpert1 Xpress SARS-CoV-2 phát hiện các gen N2 và E. Giá trị Ct

của gen E nằm trong khoảng từ 18 đến 41 sử dụng hệ thống Cepheid. COV2-kit tiết lộ Ct

điểm của cùng một gen là 27–35,5. CDC khuyến nghị giới hạn trên của Ct là 37. Theo lý thuyết, tất cả các mẫu thử

nghiệm đều được tìm thấy dưới giới hạn này bằng cách sử dụng phương pháp COV2-kit. Ngoài ra, hiệu suất của gen

RdRP của COV2-kit so với gen N2 của Cepheid đã được so sánh.

Theo đó, giá trị Ct của gen RdRP (COV2-kit) được phát hiện thấp hơn gen N2

(Cepheid's), chỉ ra độ nhạy của COV2-kit hơn hệ thống của Cepheid. Tuy nhiên,

điểm Ct của ba bệnh nhân COVID19 gen N2 và một gen RdRP nằm ngoài

ngưỡng trên (Hình 3B). Ngoài ra, kiểm tra tiêu chuẩn hóa đa kênh (triplex) rRT-PCR

cho thấy rằng xét nghiệm này hiệu quả để phát hiện ba gen trong cùng một ống phản ứng.

Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) là một xét nghiệm nhạy cảm đối với detec

số lượng trình tự gen xác định mã hóa protein của vi rút, chẳng hạn như phụ thuộc vào ARN

RNA polymerase (RdRP), nucleocapsid (N), vỏ (E), và gai (S). Mặc dù RT-PCR

các thử nghiệm được áp dụng rộng rãi, và các thử nghiệm thay thế đang được phát triển, quy trình thử nghiệm hiện

tại phải đáp ứng các nhu cầu phổ quát mới để phát hiện phân tử nhanh, đáng tin cậy và có thể [23].

Trong phương pháp này, chúng tôi đã cố gắng vượt qua nhiều thách thức và điểm yếu dẫn đến các thử nghiệm trước đây

và tận dụng lợi ích từ các kết quả và ứng dụng của họ để cải thiện thử nghiệm mới. So với phân tích sim plex hoặc

phân tích song công, phân tích bộ ba cung cấp độ chính xác cao hơn và tránh được các kết quả sai lệch có thể xảy

ra do đột biến ở một trong các gen của virus [24]. Gen E là một

mã gen quan trọng cho protein vỏ (E) của SARS-CoV-2. Nó là một màng tích hợp

protein có chức năng trong một số quá trình sinh học của virus như lắp ráp, nảy chồi, hình thành enve lope, và cơ

chế bệnh sinh [25]. Ngoài ra, RNA polymerase phụ thuộc RNA

(RdRP) gen mã hóa một loại enzim chịu trách nhiệm cho sự nhân lên của virut. Những gen không thể thiếu này

là mục tiêu chính để phát hiện phân tử SARS-CoV-2 [12, 26–29]. Kakhki và cộng sự. [30]

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 8/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

đã báo cáo rằng gen ORF8 là mục tiêu có thể để phát hiện COVID-19 và nó khác với các gen được

báo cáo (gen RdRP, E và N), và ORF8 hoàn toàn đặc hiệu với COVID-19 và không có phản ứng chéo

với các loại coronavirus khác. Họ báo cáo rằng gen ORF8 có thể được coi là một thử nghiệm xác

nhận bổ sung.

Nghiên cứu của chúng tôi phần nào đồng ý với giao thức của một nghiên cứu được xuất bản bởi

Park et al. [31], dựa trên chiến lược tạo kiểu bộ dụng cụ mồi động, và trạng thái phản ứng đề cử

dẫn đến phân vùng tối ưu của các loại mồi này. Họ đã báo cáo hướng dẫn ba bước để thiết kế và

tối ưu hóa các bộ mồi cụ thể: 1) lựa chọn bộ mồi cho các gen mục tiêu (RdRP, N, E và S) trong bộ

gen SARS-COV-2, 2) hiệu quả trong silico của mồi và trình tự của amplicon, và 3) tối ưu hóa các

điều kiện PCR. Giao thức phụ thuộc vào PCR thời gian thực đã được phát triển lựa chọn thay vì các

giao thức dựa trên PCR truyền thống và sử dụng giao thức dựa trên PCR đa hợp cho phép khuếch đại

đồng thời nhiều mục tiêu gen như RdRP, N, E và S.

Điều này cho phép chạy phản ứng trong một ống duy nhất. Giao thức được mô tả giống như giao thức của chúng

tôi có quy mô rộng, tính toàn vẹn cao và được chấp nhận là tiêu chuẩn vàng. Nó sẽ được áp dụng cho một số lượng

lớn hơn các mẫu RNA lâm sàng được chiết xuất từ virus trong các thử nghiệm tiếp theo để xác minh tính đặc hiệu và

độ nhạy của nghiên cứu. Mặc dù chiến lược này tập trung vào SARS-CoV-2, nhưng nó cũng có thể áp dụng cho các loại
virus khác.

Kết luận

Nghiên cứu này chứng minh một phương pháp rRT-PCR đa hợp để chẩn đoán SARS-CoV-2.

Việc nhắm mục tiêu đồng thời hai gen virus (RdRP và E) và một gen người (RP) trong cùng một phản

ứng PCR cung cấp một xét nghiệm chẩn đoán SARS-CoV-2 chính xác, đáng tin cậy và dễ sử dụng.

Ngoài ra, xét nghiệm cho phép làm việc với số lượng lớn bệnh nhân sử dụng ít thuốc thử PCR hơn.

Do đó, chi phí và độ tin cậy của thử nghiệm được cải thiện. Mặc dù trình tự mồi / đầu dò

được thiết kế để giảm thiểu khả năng phản ứng chéo với các chủng coronavirus khác, chúng nên

được thử nghiệm với các biến thể đột biến mới nổi. Thử nghiệm phải được xác nhận bằng cách sử

dụng các thiết bị RT-PCR khác nhau và có thể được sử dụng trong các tổ chức phòng ngừa và kiểm

soát nhiễm trùng, bệnh viện, trung tâm y tế và phòng thí nghiệm chẩn đoán.

Sự nhìn nhận

Chúng tôi xin cảm ơn ông Geoffrey James T. Moro đã hỗ trợ kỹ thuật trong việc thực hiện các thí

nghiệm RT-PCR và hỗ trợ Giáo sư Mehmet Ozdemir cho việc biên tập và hiệu đính ngôn ngữ.

Sự đóng góp của tác giả

Lên ý tưởng: Huseyin Tombuloglu.

Giám tuyển dữ liệu: Huseyin Tombuloglu, Reem Al Jindan, Khaled R. Alkharsah.

Phân tích chính thức: Huseyin Tombuloglu, Reem Al Jindan, Khaled R. Alkharsah.

Tài trợ mua lại: Huseyin Tombuloglu.

Điều tra: Huseyin Tombuloglu, Hussein Sabit, Khaled R. Alkharsah.

Phương pháp luận: Huseyin Tombuloglu, Hussein Sabit, Reem Al Jindan, Khaled R. Alkharsah.

Nguồn: Ebtesam Al-Suhaimi.

Giám sát: Ebtesam Al-Suhaimi.

Viết - bản thảo gốc: Huseyin Tombuloglu, Hussein Sabit, Ebtesam Al-Suhaimi.

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 9/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

Viết - đánh giá & biên tập: Ebtesam Al-Suhaimi, Khaled R. Alkharsah.

Người giới thiệu

1. Liu R, Fu A, Deng Z, Li Y, Liu T. Các phương pháp đầy hứa hẹn để phát hiện coronavirus mới SARS-CoV-2.
Lượt xem. Năm 2020; 1 (1): e4.

2. Ulloa S, Bravo C, Parra B, Ramirez E, Acevedo A, Fasce R, et al. Một phương pháp đơn giản cho SARS-CoV-2
phát hiện bằng rRT-PCR mà không cần sử dụng bộ tách chiết RNA thương mại. Tạp chí về virus học meth ods. Năm 2020;
285: 113960. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2020.113960 PMID: 32835738

3. Kudo E, Israelow B, Vogels CB, Lu P, Wyllie AL, Tokuyama M, et al. Phát hiện RNA SARS-CoV-2 bằng cách
ghép kênh RT-qPCR. PLoS Sinh học. Năm 2020; 18 (10): e3000867. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.
3000867 PMID: 33027248

4. Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, et al. Bộ dò tìm dựa trên CRISPR – Cas12 của SARS-
CoV-2. Công nghệ sinh học bản chất. Năm 2020; 38 (7): 870–4. https://doi.org/10.1038/s41587-020-
0513-4 PMID: 32300245

5. Ali Z, Aman R, Mahas A, Rao GS, Tehseen M, Marsic T, et al. iSCAN: Mô-đun CRISPR Cas12 được kết hợp với RT-LAMP để
phát hiện nhanh, nhạy SARS-CoV-2. Nghiên cứu vi rút. Năm 2020; 288: 198129. https: //
doi.org/10.1016/j.virusres.2020.198129 PMID: 32822689

6. Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, Shibumura S, Yamauchi Y, Yamamoto M, et al. Tốc độ phát hiện nhanh chóng và chính
xác của coronavirus mới SARS-CoV-2 sử dụng CRISPR-Cas3. MedRxiv. https://doi.org/10.
2139 / ssrn.3640844

7. Chen Z, Zhang Z, Zhai X, Li Y, Lin L, Zhao H, et al. Phát hiện nhanh chóng và nhạy cảm chống SARS-CoV-2
IgG, sử dụng phương pháp xét nghiệm miễn dịch dòng chảy bên dựa trên phân tử nano có pha tạp chất lanthanide. Hóa học phân tích.

Năm 2020; 92 (10): 7226–31. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c00784 PMID: 32323974

8. Kasetsirikul S, Umer M, Soda N, Sreejith KR, Shiddiky MJ, Nguyen NT. Phát hiện SARS-CoV-2
kháng thể nhân tính bằng ELISA trên giấy. Chuyên viên phân tích. Năm 2020; 145 (23): 7680–6. https://doi.org/10.1039/
d0an01609h PMID: 32975254

9. Joung J, Ladha A, Saito M, Kim NG, Woolley AE, Segel M, et al. Phát hiện SARS-CoV-2 bằng SHER
LOCK thử nghiệm một nồi. Tạp chí Y học New England. Năm 2020; 383 (15): 1492–4.

10. Chen Z, Wu Q, Chen J, Ni X, Dai J. Một phương pháp dựa trên aptamer DNA để phát hiện protein capsid SARS-CoV-2 nucleo.
Virologica Sinica. Năm 2020; 35: 351–4. https://doi.org/10.1007/s12250-020-00236-z PMID:
32451881

11. Jang WS, Lim DH, Yoon J, Kim A, Lim M, Nam J, et al. Phát triển thử nghiệm Khuếch đại nhiệt Iso trung gian đa vòng
(LAMP) để chẩn đoán tại chỗ SARS CoV-2. PloS một. Năm 2021; 16 (3):
e0248042. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248042 PMID: 33657176

12. Zhen W, Berry GJ. Phát triển xét nghiệm RT-PCR đa kênh thời gian thực mới để phát hiện Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Hội
chứng rối loạn hô hấp cấp tính nghiêm trọng. Tạp chí Chẩn đoán Phân tử. Năm 2020;
22 (12): 1367–72. https://doi.org/10.1016/j.jmoldx.2020.09.004 PMID: 32961315

13. Khan S, Tombuloglu H, Hassanein SE, Rehman S, Bozkurt A, Cevik E, et al. Bệnh do coronavirus
2019: tình hình sinh học hiện tại và quan điểm điều trị tiềm năng. Tạp chí Dược phẩm Châu Âu (European Journal of
Pharma cology). Năm 2020; 886: 173447. https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2020.173447 PMID: 32763302

14. Yan C, Cui J, Huang L, Du B, Chen L, Xue G, et al. Phát hiện nhanh chóng và trực quan của coronavirus mới 2019
(SARS-CoV-2) bằng xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian phiên mã ngược. Vi sinh lâm sàng và Nhiễm trùng.
Năm 2020; 26 (6): 773–9. https://doi.org/10.1016/j.cmi.2020.04.001 PMID: 32276116

15. Moran A, Beavis KG, Matushek SM, Ciaglia C, Francois N, Tesic V, et al. Việc phát hiện SARS-CoV 2 bằng xét nghiệm
cepheid xpert xpress SARS-CoV-2 và Roche cobas SARS-CoV-2. Tạp chí vi sinh vật học clini cal. 2020. https://doi.org/
10.1128/JCM.00772-20 PMID: 32303565

16. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Công cụ Tìm kiếm Đối chiếu Nội bộ Cơ bản. Tạp chí của
sinh học phân tử. Năm 1990; 215 (3): 403–10. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2 PMID:
2231712

17. Edgar RC. MUSCLE: một phương pháp căn chỉnh nhiều trình tự với độ phức tạp không gian và thời gian được giảm bớt.
Tin sinh học BMC. Năm 2004; 5 (1): 1–9. https://doi.org/10.1186/1471-2105-5-113 PMID: 15318951

18. Sievers F, Wilm A, Dineen D, Gibson TJ, Karplus K, Li W, et al. Nhanh chóng, có thể mở rộng thế hệ chất lượng cao
sắp xếp nhiều trình tự protein bằng cách sử dụng Clustal Omega. Hệ thống sinh học phân tử. 2011; 7 (1): 539.
https://doi.org/10.1038/msb.2011.75 PMID: 21988835

19. Brown SS, Chen YW, Wang M, Clipson A, Ochoa E, Du MQ. PrimerPooler: tổng hợp mồi tự động
để chuẩn bị thư viện cho trình tự nhắm mục tiêu. Các phương pháp và quy trình sinh học. Năm 2017; 2 (1): bpx006. https: //

doi.org/10.1093/biomethods/bpx006 PMID: 32161789

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 10/11

Machine Translated by Google

PLOS MỘT Xét nghiệm RT-PCR thời gian thực đa kênh để chẩn đoán SARS-COV-2

20. Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, et al. Primer3 — các mối quan hệ và giao diện
capabili mới. Nghiên cứu axit nucleic. Năm 2012; 40 (15): e115–. https://doi.org/10.1093/nar/gks596 PMID: 22730293

21. Orooji Y, Sohrabi H, Hemmat N, Oroojalian F, Baradaran B, Mokhtarzadeh A, et al. Tổng quan về
SARS-CoV-2 (COVID-19) và các coronavirus khác ở người và khả năng phát hiện của chúng thông qua xét nghiệm khuếch
đại, cảm biến hóa học, cảm biến sinh học, xét nghiệm miễn dịch và xét nghiệm lâm sàng. Chữ cái Nano-Micro. Năm
2021; 13 (1): 1–30.

22. Wacharapluesadee S, Kaewpom T, Ampoot W, Ghai S, Khamhang W, Worachotsueptrakun K, et al.

Đánh giá hiệu quả của việc gộp mẫu để phát hiện COVID-19 dựa trên PCR. Tạp chí virus học y học. Năm 2020; 92 (10):
2193–9. https://doi.org/10.1002/jmv.26005 PMID: 32401343 23. Feng W, Newbigging AM, Le C, Pang B, Peng H, Cao Y, et

al. Chẩn đoán phân tử COVID-19: le le chal và nhu cầu nghiên cứu. Hóa học phân tích. Năm 2020; 92 (15): 10196–209. https://
doi.org/10.1021/ acs.analchem.0c02060 PMID: 32573207

24. Petrillo S, Carrà G, Bottino P, Zanotto E, De Santis MC, Margaria JP, et al. Một xét nghiệm qRT-PCR đa hợp mới để phát
hiện nhiễm SARS-CoV-2: độ nhạy cao và khả năng xét nghiệm tăng lên. Vi sinh vật. Năm 2020; 8 (7): 1064. https://
doi.org/10.3390/microorganisms8071064 PMID: 32708870 25. Schoeman D, cung BC. Protein vỏ coronavirus: kiến thức hiện

tại. Tạp chí virus học. Năm 2019; 16

(1): 1–22. https://doi.org/10.1186/s12985-018-1108-2 PMID: 30606229 26. Al-Saud

H, Al-Romaih K, Bakheet R, Mahmoud L, Al-Harbi N, Alshareef I, et al. SARS tự động

Tách chiết RNA COV-2 từ các mẫu mũi họng của bệnh nhân bằng cách sử dụng bộ tách chiết DNA đã được sửa đổi để
kiểm tra thông lượng cao. Biên niên sử của Y học Ả Rập Xê Út. Năm 2020; 40 (5): 373–81. https://doi.org/10.5144/0256-
4947.2020.373 PMID: 32954791

27. Abasiyanik MF, Flood B, Lin J, Ozcan S, Rouhani S, Pyzer A, et al. Phát hiện nhạy cảm và định lượng SARS-CoV-2 trong
nước bọt. medRxiv. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.12.04.20241059 PMID:
33330880

28. Reijns MA, Thompson L, Acosta JC, Black HA, Sanchez-Luque FJ, Diamond A, et al. Một xét nghiệm RT-qPCR đa hợp nhạy
cảm và giá cả phải chăng để phát hiện SARS-CoV-2. PLoS sinh học. Năm 2020; 18 (12): e3001030. https://doi.org/
10.1371/journal.pbio.3001030 PMID: 33320856 29. Chung HY, Jian MJ, Chang CK, Lin JC, Yeh KM, Chen CW, et al. Thử

nghiệm RT PCR đa công suất kép trong thời gian thực mới lạ để phát hiện nhanh SARS-CoV-2, Cúm A / B và Virus hợp bào hô
hấp bằng Hệ thống Mở BD Max. Vi khuẩn & nhiễm trùng mới nổi. Năm 2021; 8: 1–24.

30. Mục tiêu Kakhki RK, Kakhki MK, Neshani A. COVID-19: Mục tiêu cụ thể để phát hiện coronavirus mới.
Báo cáo Gene. Năm 2020; 20: 100740. https://doi.org/10.1016/j.genrep.2020.100740 PMID: 32510005 31. Park M,

Won J, Choi BY, Lee CJ. Tối ưu hóa bộ mồi và giao thức phát hiện bệnh SARS-CoV-2 của bệnh coronavirus 2019 (COVID-19)
bằng cách sử dụng PCR và PCR thời gian thực. Y học thực nghiệm & phân tử. Năm 2020; 52 (6): 963–77. https://doi.org/
10.1038/s12276-020-0452-7 PMID: 32546849

32. Giri B, Pandey S, Shrestha R, Pokharel K, Ligler FS, Neupane BB. Đánh giá hiệu suất phân tích của các phương pháp phát
hiện COVID-19. Hóa học phân tích và phân tích sinh học. Năm 2020; 18: 1–4. https://doi.org/10. 1007 / s00216-020-02889-
x PMID: 32944809

33. WHO (Tổ chức Y tế Thế giới). Phát hiện chẩn đoán 2019-nCoV bằng RT-PCR thời gian thực. Năm 2020.
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf?sfvrsn=a9ef618c_2 Truy cập ngày 10 tháng 12 năm
2020.

PLOS MỘT | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0250942 Ngày 29 tháng 4 năm 2021 11/11