Unidad de Investigación

Departamento de Pediatría y Cirugía Infantil Oriente

Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna

Biología Molecular Aplicada al Diagnóstico

Clínico II

Mauricio J. Farfán, PhD

Diploma Laboratorio Clínico

2022
Temas

• Impacto del diagnostico Molecular

• Farmacogenetica
• NGS
• Break
• Diagnostico de SARS-CoV-2
 100
120
140
160
180
200

20
40
60
80

0
90

Negativas
mediante Filmarray GI
181
Detección de enteropatogenos

Positivas

Ca
m
Ple Cl os py

10
20
30
40
50
60
70

0
t
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22

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33

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Co-infecciones

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5
3

Enteropatógenos en muestras positivas Filmarray GI

No st r us
11

r
Numero de enteropatogenos detectados

ro
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5

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Ro G I/G
ta
47
6
1

vi r I I
Sa us A
8

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vi r
us
11
 FilmArray®
GI Panel
www.BioFireDx.com

Run Summary
Sample ID: marin duarte 6760345 Run Date: 17 Oct 2016
2:34 PM
Detected: Enteroaggregative E. coli (EAEC) Controls: Passed
Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Enterotoxigenic E. coli (ETEC) lt/st
Cryptosporidium
Giardia lamblia
Norovirus GI/GII
Rotavirus A
Sapovirus

Result Summary
Bacteria
Not Detected Campylobacter
Not Detected Clostridium difficile toxin A/B
Not Detected Plesiomonas shigelloides
Not Detected Salmonella
Not Detected Vibrio
Not Detected Vibrio cholerae
Not Detected Yersinia enterocolitica
Diarrheagenic E. coli/Shigella
Detected Enteroaggregative E. coli (EAEC)
Detected Enteropathogenic E. coli (EPEC)
Detected Enterotoxigenic E. coli (ETEC) lt/st
Not Detected Shiga-like toxin-producing E. coli (STEC) stx1/stx2
N/A E. coli O157
Not Detected Shigella/Enteroinvasive E. coli (EIEC)
Parasites
Detected Cryptosporidium
Not Detected Cyclospora cayetanensis
Not Detected Entamoeba histolytica
Detected Giardia lamblia
Viruses
Not Detected Adenovirus F 40/41
Not Detected Astrovirus
Detected Norovirus GI/GII
Detected Rotavirus A
Detected Sapovirus

Run Details
Pouch: GI Panel v2.1 Protocol: Stool FA v2.3
Run Status: Completed Operator: Molecular Molecular
(Molecular)
Serial No.: 06011703 Instrument: ITI FA "FA2988"
Lot No.: 327316
Farmacogenética
 Farmacogenética en el HLCM

Nefrología Oncología Infectología

Trasplante Leucemia Infecciones

Renal Linfoblástica Fúngicas
Aguda

Tacrolimus 6-Mercaptopurina Voriconazol

 Tratamiento LLA y Mercaptopurinas

• La Mercaptopurina constituye un pilar fundamental del

tratamiento quimioterapéutico en todas las etapas de
tratamiento

• Efectos adversos (hepatoxicidad, problemas GI, etc)

• Ajuste de dosis de acuerdo a recuento de neutrófilos y

plaqueta

• Disminución dosis de tratamiento (50-25%)

• Abandono de la terapia asociado a niveles plasmáticos

tóxicos
Metabolismo de Mercaptopurinas

Efecto
Farmacológico

TPMT: Tiopurina S-metiltranferasa

ITPA: Inosine trifosfato pirofosfatasa

Stocco y cols., 2009

 Tiopurina S-Metil Transferasa (TPMT)

• En gen TPMT (TPMT*1) tiene un tamaño de 25 Kb, con 10

exones y 9 intrones, localizados en el cromosoma 6p22.3

• Polimorfismos en el gen TPMT*1 se heredan en forma

autosómica co-dominante

• Relacionados directamente con una baja en la actividad de la

enzima.

• Se han identificado mas de 30 polimorfismos para el gen

TPMT*1, de los cuáles 4 son los más comunes

• Prevalencia 10% heterozigotos y 0,1% con ambas variantes

Efecto de los polimorfismo en la duración terapia

Relling y cols., 1999

Prevalencia polimorfismos TPMT en
niños chilenos con LLA

Farfan y cols., BMC Cancer

Farfan y cols., BMC Cancer
Farfan y cols., BMC Cancer
Farfan y cols., BMC Cancer
Impacto de la Farmacogenética

500

500

Cheoks y Evans, 2006

Nefrología Oncología Infectología

Trasplante Leucemia Infecciones

Renal Linfoblástica Fúngicas
Aguda

Tacrolimus 6-Mercaptopurina Voriconazol

Niveles plásmaticos de Tacrolimus
en HLCM

C0 (ng/ml)

3,4 6,4 12,3

 Tacrolimus y Porlimorfismos géneticos

• Tacrolimus: Inhibidor de la calcineurina, ampliamente

utilizado para prevenir el rechazo en trasplante de órganos

• Índice terapéutico estrecho

• Problema clínico: Farmacocinética variable

• Metabolismo fase I: CYP3A4 y CYP3A5

• Polimorfismos en el gen CYP3A5

• CYP3A5*1 : Proteína normal
• CYP3A5*3 : Proteínas truncada no activa
Frecuencia del polimorfismo CYP3A5

García-Roca y cols. (2012)

 Metodología

Niños trasplantados renales HLCM

Detección polimorfismo CYP3A5*3

Niveles de Determinar Niveles

Tacrolimus Plasmáticos

Detección niveles plasmáticos

Toma muestra de sangre Tacrolimus
 Frecuencia del polimorfismo CY3A5 en niños
sometido a trasplante renal

N=68
 Razón Co/dosis de acuerdo a
polimorfismo CYP3A5
p<0,01
0,000

p<0,05
0,023
[(μg/ml)/(mg/kg/día)] p<0,05
0,035
Co/dosis

*1/*1 *1/*3 *3/*3

Nefrología Oncología Infectología

Trasplante Leucemia Infecciones

Renal Linfoblástica Fúngicas
Aguda

Tacrolimus 6-Mercaptopurina Voriconazol

Asociación entre concentración plasmática
basal de Voriconazol y SNP CYP2C19*17
 Secuenciación de nueva generación
(Next-generation sequencing)
NGS
• Whole genome sequencing (WGS)

• Demanda de secuenciación
 Proyección del gasto en NGS

60
Billones US$

10
Mellmann y cols. (2011)

Events timeline of German EHEC O104:H4 outbreak. Major events relating to the outbreak epidemiology (below
arrow) and those relating to genomic elucidation efforts (above arrow) are noted separately in the graph. Lines
within the arrow indicate single day progression, with the date noted every 5th day. Events span from early May
2011 to early June 2011. Times are noted in Central European Time (CET). Abbreviations: BfR = Bundesinstitut für
Risikobewertung (Federal Institute for Risk Assessment, Germany), BGI = Beijing Genomics Institute (People`s
Republic of China), ECDC = European Center for Disease Prevention and Control (Sweden), HPA = Health
Protection Agency (United Kingdom), HUS = hemolytic uremic syndrome, LT = Life Technologies Group, PGMTM
= Ion Torrent Personal Genome MachineTM, RKI = Robert Koch Institute (Germany), ST = multilocus sequence
type, UKE = University Hospital Hamburg (Germany), UKM = University Hospital Muenster (Germany), WGS =
whole genome sequencing.
 15 Oct 7 Nov
25 Sept 2 muestras + Envio manuscrito
Solicitud CDC EV-D68 a EID

Sept 2014 7 Octubre 3 Nov

Aumento EV Envio 6 muestras Resultados
Asmaticos al CDC Secuenciación
Sospecha EV-D68
Maximum likelihood tree (full information on next slide) showing that the Chile 2014 EV-D68 strain (solid circle) is very
closely related to the US 2014 EV-D68 outbreak strain (hollow circles). The tree is rooted to the Fermon EV-D68
prototype strain (solid square).
Diagnóstico molecular SARS-CoV-2

Mauricio J. Farfán, PhD

Ribeiro da Silva et al., 2021
https://dx.doi.org/10.1021/acsinfecdis.0c00274
Estrategias de pool testing
 Estrategia de pool testing en Chile

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
6 PCR Se informa
negativa negativa

7 PCR Se informa
positiva positiva

Pool A Pool B
PCR Se informa
8 negativa negativa

PCR negativa PCR positiva

9 PCR Se informa
negativa negativa

Se informa cada Se abre el pool

muestra como
10 PCR Se informa
negativa
negativa negativa
 Comparación analisis individual vs pool testing

• Consejo Asesor COVID-19 y consulta ética: recomienda su uso, ya que no presenta aspectos éticos negativos
 2 ELEAM Servicio Salud Metropolitano Oriente
(Residentes y Funcionarios: muestra nasofaríngea)
Toma Toma Toma
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3
ELEAM 1
(n=45) Todos (-) Todos (-) Todos (-)

Semana 1 Semana 2 Semana 3

ELEAM 2
(n=49) 1 Funcionario (+) Todos (-) Todos (-)

- Caso (+) detectado y aislado en

20 horas à no hubo brote
https://www.ispch.cl/sites/default/files/ProtocoloPoolTesting-26102020A.pdf
Pool testing en HLCM
Análisis de costos en Chile: Positividad 5%

Reducción 68%

Fuente: Coordinación Nacional TTA

 Tabla 1. Laboratorios que contestan la encuesta

Tipo Contesta No contesta Total % adhesión

Privado 91 0 91 100%

Público 70 0 70 100%

Universitario 17 0 17 100%

Total 178 0 178 100%

 Realizan pool testing No realizan pool testing
100

90

80

70

60
54
50

40 54
30

20
37
10
16 11
0 6
Privado Público Universitario

Semana 26 de Junio al 1 de Agosto 2021

 Mayor a 5 Menor a 3
muestras muestras
3% 5%

3 muestras
19%

5 muestras
73%

Semana 26 de Junio al 1 de Agosto 2021

 TOTAL
MOTIVO PARA NO REALIZAR POOL TESTING PRIVADO PÚBLICO UNIVERSIDAD GENERAL

Aún no han tenido la indicación directa o autorización para la

implementación de pool testing 1 10 1 12
Cantidad muy baja de muestras 12 7 3 22
Definición interna del laboratorio de no realizarlo 23 15 2 40
Dejaron de hacer pool testing por cambio en las condiciones
epidemiológicas del territorio 0 5 0 5
Desconfianza en la sensibilidad de la técnica pool testing (riesgo
falso negativo) 4 1 1 6
Están en periodo de evaluación 2 8 4 14
Inicio de análisis recientemente. no ha dado tiempo de
comenzar a usar la técnica 5 0 0 5
La prevalencia local es superior a la sugerida para la
implementación 0 4 0 4
Uso de equipamiento que no hace compatible el uso de la
técnica pool testing 7 4 0 11
Total general 54 54 11 119

Semana 26 de Junio al 1 de Agosto 2021

 Pool testing en búsqueda activa

603 Positivos
26.408 Negativas
435 Positivos
85 Indeterminados 503 Positivas
85 Indeterminadas
108 Indeterminados 1.483 Negativos
2,2% positividad

677.400.000
Negativos 24.925 Negativos
4.985 Costo ($)

27096
Nº de PCR

178.900.000
5.528 pools
(27.096 muestras)

7156
Pool testing Muestra individual Pool testing Muestra individual
Moreira et al., 2021
https://doi.org/10.3390/diagnostics11020363
 Pruebas rápidas de antígenos

• Rápidas (<15 minutos)

• No requieren equipamiento

• Operador

• Alta especifiidad

• Sensibilidad variable

• Búsqueda activa
 Unidad de Investigación
Departamento de Pediatría y Cirugía Infantil Oriente
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna

Biología Molecular Aplicada al Diagnóstico

Clínico II

Mauricio J. Farfán, PhD

Diploma Laboratorio Clínico

2022