Estradđol Valerat Ve Dđenogest'Đn Farmasötđk Preparatlarda Ayni Anda Mđktar Tayđnlerđ

TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ
ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
ESTRADĐOL VALERAT VE DĐENOGEST’ĐN FARMASÖTĐK
PREPARATLARDA AYNI ANDA MĐKTAR TAYĐNLERĐ
Mehmet Gökhan ÇAĞLAYAN
ANALĐTĐK KĐMYA ANABĐLĐM DALI

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Feyyaz ONUR
2009- ANKARA
TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ
ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
ESTRADĐOL VALERAT VE DĐENOGEST’ĐN FARMASÖTĐK

PREPARATLARDA AYNI ANDA MĐKTAR TAYĐNLERĐ
Mehmet Gökhan ÇAĞLAYAN
ANALĐTĐK KĐMYA ANABĐLĐM DALI

YÜKSEK LĐSANS TEZĐ
DANIŞMAN
2009 ANKARA
ii
Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Analitik Kimya Yüksek Lisans Programı
Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından

Yüksek Lisans Tezi olarak kabul edilmiştir.
Tez Savunma Tarihi : 03/07/2009

Ankara Üniversitesi
Jüri Başkanı
Prof. Dr. Nilgün GÜNDEN GÖĞER Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN

Gazi Üniversitesi Ankara Üniversitesi
Doç. Dr. Uğur TAMER Doç. Dr. Bengi USLU

Gazi Üniversitesi Ankara Üniversitesi
iii
ĐÇĐNDEKĐLER
Kabul ve Onay ii
Đçindekiler iii
Önsöz vii
Simgeler ve Kısaltmalar viii
Şekiller x
Çizelgeler xii
1. GĐRĐŞ 1
1.1. Giriş ve Amaç 1
1.2. Kimyasal ve Fiziksel Özellikler 3
1.2.1. Estradiol Valerat 3
1.2.2. Dienogest 7
1.3. Türkiye’de Dienogest Đçeren Ticari Preparat 10
1.4. Türkiye’de Dienogest ve Estradiol Valerat Đçeren Preparat 10

(CLIMODIEN®) ile Đlgili Bilgiler
1.5. Dünyada Dienogest Đçeren Ticari Preparatlar 12
1.6. Türkiye’de Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 13
1.7. Dünyada Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 14
1.8. Üzerinde Çalışma Yapılan Etken Maddelerin Miktar Tayinleri 31

Konusunda Günümüze Kadar Yapılmış Çalışmalar
1.8.1. Estradiol Valerat Miktar Tayini Đçin Yapılmış Çalışmalar 31
1.8.1.1. Spektrofotometrik Yöntemler 31
1.8.1.2. Kromatografik Yöntemler 32
1.8.1.3. Voltametrik Yöntemler 34
1.8.1.4. Kapiler Elektroforez 34

iv
1.8.2. Dienogest Miktar Tayini Đçin Yapılmış Çalışmalar 35
1.8.2.1. Radyoimmunoassay 35
1.8.2.2. Kromatografik Yöntemler 36
2. GEREÇ ve YÖNTEM 37
2.1. Kullanılan Yöntemler 37
2.1.1. Türev Spektrofotometri 37
2.1.2. Kemometrik Yöntemler 43
2.1.2.1. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi ve Kısmi En Küçük Kareler 45

Yöntemi
2.1.2.2. Đstatistiksel Değerlendirme 48
2.1.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi 50
2.1.3.1. Sistem Uygunluk Testleri 60
2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Orijinleri 66
2.3. Kullanılan Cihazlar 66
2.4. Kullanılan Bilgisayar Programları 66
2.5. Kullanılan Bilgisayar Konfigürasyonu 67
2.6. Üzerinde Çalışma Yapılan Farmasötik Preparat 67
2.7. Standart Maddelerin Stok Çözeltileri 67
2.7.1. Türev Spektrofotometride 67
2.7.2. Kemometrik Yöntemlerde 67
2.7.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinde 68
3. BULGULAR 69
3.1. Kullandığımız Etken Maddelerin Saflık Kontrolleri 69
3.1.1. Dienogest için Saflık Kontrolü 69

v
3.1.2. Estradiol Valerat için Saflık Kontrolü 69
3.2. Kemometrik Tekniklerle Spektroskopik Verilerin Değerlendirilmesi 74

Yöntemleri ile Elde Edilen Sonuçlar
3.2.1. Kemometrik Çalışmalar 74
3.2.2. Dienogest - Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 75

Valerat’ın, TBR Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde
Kullanılması ile Miktar Tayini
3.2.3. Dienogest - Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 79

Valerat’ın, KEK Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde
Kullanılması Đle Miktar Tayini
3.2.4. ANOVA Testi 81
3.2.5. TBR ve KEK Yöntemlerinin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 82
3.2.5.1 Seçicilik 82
3.2.5.2. Farmasötik Preparata Uygulama 85
3.2.6. Kemometrik Yöntemlerle Elde Edilen Sonuçlara Göre TSH, KSH ve 88

THKT Değerlerinin Hesaplanması
3.2.7. 91
3.3. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Miktar Tayini Çalışmaları 92
3.3.1. Dienogest – Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 94

Valerat ’ın Miktar Tayini
1
3.3.2. D Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 102
3.3.2.1. Seçicilik 102
3.3.2.3. ANOVA Testi 106
3.4. YPSK Đle Yapılan Çalışmalar 108
3.4.1. ANOVA Testi 114
3.4.2. YPSK Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 114
3.4.2.1 Seçicilik 114

vi
4. TARTIŞMA 119
4.1. Dienogest – Estradiol Valerat Karışımının Analizi Đçin Yapılan 119

Çalışmalar
4.1.1. Kemometrik Yöntemlerin Kullanılışı 119
4.1.1.1 Temel Bileşen Regresyonu (TBR) Yöntemi Kullanılarak Yapılan 119

Çalışmalar
4.1.1.2. Kısmi En Küçük Kareler Yöntemi (KEK) ile Yapılan Çalışmalar 122
4.1.2. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Çalışmalar 127
4.1.3. YPSK ile Yapılan Çalışmalar 128
4.1.4. 129
4.2. Yöntemlerin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 130
4.3. Geliştirilen Yöntemlerin Birbirleriyle Karşılaştırılmaları 133
5. SONUÇ ve ÖNERĐLER 135
ÖZET 136
SUMMARY 138
KAYNAKLAR 140
ÖZGEÇMĐŞ 145
vii
ÖNSÖZ
Bu tez çalışmasında hormon replasman tedavisinde kullanılan, estradiol valerat

ve dienogest ikili karışımını içeren farmasötik preparatlarda aynı anda miktar
tayinleri için 1. Türev Spektrofotometri, Temel Bileşen Regresonu, Kısmi En Küçük
Kareler Yöntemi ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi yöntemleri
geliştirilmiştir.
Yüksek lisans tezimin hazırlanmasında ve Analitik Kimya Anabilim Dalı’ndaki

akademik çalışmaların sırasında bana her konuda yardımcı olan ve desteğini
esirgemeyen danışman hocam Prof. Dr. Feyyaz ONUR’a teşekkür ediyorum.
Anabilim Dalımız tüm öğretim üyelerine her konuda bana yaptıkları

yardımlardan ve anlayışlarından dolayı teşekkür ediyorum.
Tezin her aşamasında bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım Araştırma

Görevlisi Dr. Đsmail Murat PALABIYIK’a teşekkür ediyorum.
Tez çalışması sırasında benden yardımlarını esirgemeyen çalışma arkadaşlarım

Uzman Eczacı Araştırma Görevlisi Özgür ÜSTÜNDAĞ, Uzman Eczacı Araştırma
Görevlisi Burcu DOĞAN TOPAL, Eczacı Burçin BOZAL, Kimyager Elif
KARACAN’a teşekkür ediyorum.
Bütün yaşantım ve görevim sırasında maddi ve manevi hiçbir fedakarlıktan

kaçınmayan, bana her türlü konuda destek olan aileme ve eşim Hacer SELAMOĞLU
ÇAĞLAYAN’a sonsuz teşekkürlerimi sunuyorum.
viii
SĐMGELER ve KISALTMALAR
EV Estradiol Valerat
DNG Dienogest
TBR Temel Bileşen Regresyonu (PCR, Principle Component Regression)
TBA Temel Bileşen Analizi (PCA, Principal Component Analysis)
YPSK Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC, High Performance

Liquid Chromatography)
1
D 1. Türev Spektrofotometri (First derivative spectrophotometry)
GC – MS Gaz kromatografisi kütle spektrometrisi (Gas Chromatography Mass

Spectrometry)
TEK Ters En Küçük Kareler (ILS, Invers Least Squares)
KEK Kısmi En Küçük Kareler (PLS, Partial Least Squares)
ĐTK Đnce Tabaka Kromatografisi (TLC, Thin Layer Chromatıgraphy)
SUT Sistem Uygunluk Testleri
YS Yakalama Sınırı (LOD, Limit of Detection)
TAS Tayin Alt Sınırı (LOQ, Limit of Quantitation)
SS Standart Sapma (Standard Deviation)
BSS Bağıl Standart Sapma (RSD, Relative Standard Deviation)
GA Güven Aralığı
UV Ultraviole
IR Infrared
THKT Tahmin Hatalarının Karelerinin Toplamı (PRESS, Prediction Error Sum

of Squares)
KSH Kalibrasyonun Standart Hatası (SEC, Standard Error of Calibration)
TSH Tahminin Standart Hatası (SEP, Standard Error of Prediction)
RMS Karekök Ortalama (Root Mean Squares)
RIA Radyoimmunoassay
ix
HRT Hormon Replasman Tedavisi
CA Siproteron Aseatat
MEEKC Microemulsion electrokinetic chromatography
NACE Non-aqueous capillary electrophoresis
UPSK Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi (UPLC, Ultra performance Liquid

Chromatgoraphy
x
ŞEKĐLLER
Şekil 1.1. EV’ın metanol – su (3:1 h/h) karışımındaki 90 µg/mL çözeltisinin UV 4

spektrumu
Şekil 1.2. DNG’in metanol – su (3:1 h/h) karışımındaki 12 µg/mL çözeltisinin UV 8

spektrumu
Şekil 2.1. Gauss tipindeki bir eğrinin belirli noktalardaki tanjantları ve karşılıkları 38
Şekil 2.2. Türev eğrilerinin şekilleri 39
Şekil 2.3. Pikten pike ölçüm 41
Şekil 2.4. Pikten sıfıra ölçüm 42
Şekil 2.5. Teğet yöntemi ile ölçüm 42
Şekil 2.6. Bir YPSK cihazının şeması 53
Şekil 2.7. Teorik tabaka sayısı hesabını gösterir kromatogram 61
Şekil 2.8. Pik asimetri faktörü ve kuyruklanma faktörü hesabını gösterir kromatogram 62
Şekil 2.9. Kapasite faktörü hesabını gösterir kromatogram 62
Şekil 2.10. Rezolüsyon faktörünün kromatogramlara göre değişimi 64
Şekil 3.1. Metanol-su (3:1) içerisinde 12 µg/mL DNG çözeltisinin UV absorpsiyon 70

spektrumu
Şekil 3.2. ’ DNG’in IR spektrumu 71
Şekil 3.3. Metanol - su (3:1) içerisinde 120 µg/mL EV çözeltisinin UV absorpsiyon 72

spektrumu
Şekil 3.4. EV’ın IR spektrumu 73
Şekil 3.5. Metanol - su (3:1) içerisinde a) 120 µg/mL EV, b) 12 µg/mL DNG 74
çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
Şekil 3.6. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV, b) 12 µg/mL DNG 92


çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
xi

çözeltilerinin ikinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)

çözeltilerinin üçüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
Şekil 3.10. Metanol - su (3 : 1) içerisinde 120 µg/mL EV ve 12 µg/mL DNG 94

çözeltilerinin dördüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
Şekil 3.11. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG b) 90 µg/mL EV c) 120 95

µg/mL EV ve d) 150 µg/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
Şekil 3.12. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG b) 90 µg/mL EV c) 120 95

µg/mL EV ve d) 150 µg/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları
(skala faktör:30 ∆λ=2 nm)
Şekil 3.13. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV b) 8 µg/mL DNG c) 12 96

µg/mL DNG ve d) 20 µg/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon
spektrumları
Şekil 3.14. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV b) 8 µg/mL DNG c) 12 96

µg/mL DNG ve d) 20 µg/mL DNG çözeltilerinin birinci türev spektrumları
(skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
Şekil 3.15. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG, 90 µg/mL EV b) 12 µg/mL 97

DNG, 120 µg/mL EV c) 12 µg/mL DNG, 150 µg/mL EV çözeltilerinin UV
absorpsiyon spektrumları

DNG, 120 µg/mL EV c) 12 µg/mL DNG, 150 µg/mL EV çözeltilerinin
birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)

DNG, 120 µg/mL EV c) 20 µg/mL DNG, 120 µg/mL EV çözeltilerinin UV

DNG, 120 µg/mL EV c) 20 µg/mL DNG, 120 µg/mL EV çözeltilerinin
birinci türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
Şekil 3.19. a) DNG (8 µg/mL), b) Siproteron asetat (iç standart) (1.25 µg/mL) ve c) EV 108
(64 µg/mL)’ın geliştirilen YPSK yöntemindeki kromatogramı
Şekil 3.20. (a) CLIMODIEN® draje preparatı a) DNG, b) siproteron asetat (IS) ve c) EV 115
(b) plasebo’nun YPSK kromatogramı
xii
ÇĐZELGELER
Çizelge 1.1. Dünyada DNG içeren ticari preparatlar, bileşimleri ve ülkeleri 12
Çizelge 1.2. Dünyada EV içeren kombine ticari preparatlar, bileşimleri ve ülkeleri 14
Çizelge 1.3. Dünyada sadece EV içeren ticari preparatlar 28
Çizelge 3.1. DNG ve EV için TBR ve KEK yönteminde kullanılan kalibrasyon seti 77
Çizelge 3.2. DNG ve EV’ın standart karışımları için TBR yöntemiyle elde edilen 78
ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.3. DNG ve EV’ın standart karışımları için KEK yöntemiyle elde edilen 80
ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.4. Preparatlara standart ilavesinden sonra TBR yöntemi ile hesaplanan DNG 83
ve EV miktarları
Çizelge 3.5. Preparatlara standart ilavesinden sonra KEK yöntemi ile hesaplanan DNG 84
ve EV miktarları
Çizelge 3.6. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına TBR yöntemi uygulandığında DNG 86

ve EV için elde edilen sonuçlar (preparatın üzerinde yazılı miktar:2 mg
DNG + 2 mg EV/draje)
Çizelge 3.7. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına KEK yöntemi uygulandığında DNG 87

ve EV için elde edilen sonuçlar (2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
Çizelge 3.8. DNG + EV karışımı analizinde uygulanan TBR yöntemindeki parametreler 90
Çizelge 3.9. DNG + EV karışımı analizinde uygulanan KEK yöntemindeki 90

parametreler
Çizelge 3.10. DNG’in standart karışımları için farklı dalga boylarında 1. türev 99
spektrofotometri yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım
sonuçları
Çizelge 3.11. DNG ve EV’ın standart karışımları için 1.türev spektrofotometri 101
yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.12. Preparatlara standart ilavesinden sonra 1.türev spektrofotometri ile 103
hesaplanan DNG ve EV miktarları
Çizelge 3.13. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına 1.türev spektrofotometri yöntemi 105

uygulandığında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (preparat üzerinde
yazılı miktar; 2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
xiii
Çizelge 3.14. Önerilen yöntemler için DNG + EV karışımlarında ANOVA testi sonuçları 107
Çizelge 3.15. Kromatografik koşullar optimize edildiğinde EV ve DNG için elde edilen 110
validasyon parametreleri
Çizelge 3.16. DNG ve EV için geliştirilen YPSK yönteminde sistem 111

uygunluk testi sonuçları
Çizelge 3.17. Sentetik karışımlara YPSK yöntemi uygulandığında elde edilen ortalama 113
% geri kazanım sonuçları
Çizelge 3.18. Preparata standart ilavesinden sonra YPSK yöntemi ile hesaplanan DNG 116
ve EV miktarları
Çizelge 3.19. CLIMODIEN® (71112E) preparatına YPSK yöntemi uygulandığında DNG 118
ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktar: 2
mg DNG + 2 mg EV/ draje )
Çizelge 4.1. TBR ve KEK yöntemlerinde bulunan TSH, KSH, THKT ve r değerleri 125
Çizelge 4.2. Sentetik karışımlara geliştirilen yöntemler uygulandığında elde edilen 126
Çizelge 4.3. CLIMODIEN® (71112E) preparatına geliştirilen yöntemler 132

uygulandığında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde
yazılı olan miktarlar : 2 mg DNG + 2 mg EV/draje )
1
1. GĐRĐŞ
1.1. GĐRĐŞ VE AMAÇ
Estradiol valerat (EV) menopoz sonrası hormon tedavisinde kullanılan ve

klimakterik yakınmaları etkin bir şekilde tedavi eden bir ilaçtır. Dienogest (DNG) ise
endometrial hiperplazi gelişimini engeller; kanamanın azalmasına ve olguların
çoğunda giderek kesilme ile sonuçlanan endometrium atrofisine yol açar. EV + DNG
kombinasyonu ise en az bir yıllık menopoz geçmişi olan kadınların menopoza bağlı
östrojen yetmezliğinin belirti ve semptomları için hormon replasman tedavisinde
kullanılır.
Türkiye ilaç piyasasında, EV + DNG içeren bir adet draje preparatı, EV +

siproteron asetat kombinasyonunu içeren bir adet draje preparatı, EV + norgestrel
içeren bir adet draje preparatı, EV + hidroksiprogesteron kapronat içeren bir adet
ampul preparatı ve EV + medroksiprogesteron asetat içeren iki adet tablet preparatı
bulunmaktadır.
Bu ilaçlar içinde bir adet draje preparatı içerisinde karışım halinde birlikte yer
alan EV ve DNG’nin aynı anda miktar tayinleri için, rutin analizlerde
kullanılabilecek kolay, hızlı ve duyarlı analiz yöntemleri geliştirmek tez çalışmasının
temel amacı ve başlığı olarak seçilmiştir. Türkiye dışında ondört ülkede (Portekiz,
Đspanya, Almanya, Avusturya, Norveç, Đsveç, Belçika, Danimarka, Yunanistan,
Rusya, Đspanya, Fransa, Çek Cumhuriyeti, Macaristan) EV + DNG kombinasyonunu
içeren beş adet preparat vardır (Climodiene, Klimodien, Mevaren, Climodien,
Lafamme) ve bu nedenle geliştirilecek yöntemlerin geniş bir alanda ilaç analizlerinde
kullanımı sağlanmış olacaktır.
Yapılan literatür çalışmalarında EV ve DNG’nin farmasötik preparatlarda tek

başlarına veya başka etken maddeler ile birlikteyken çeşitli yöntemlerle miktar
tayinlerinin yapıldığı anlaşılmıştır. EV + DNG karışımı içeren preparatın verilmesi
sonucunda deneklerin kan plazmasında miktar tayinlerinin farmakokinetik amaçlı
çalışmalarda EV nin gaz kromatografi, DNG nin ise radyoimmunoassay yöntemiyle
yapıldığı gözlenmiştir (ZIMMERMANN VE ARK. 2000).
2
Daha önce yapılmış olan tüm çalışmalar gözden geçirildiğinde yukarıda

bahsedilen ve plazmada yapılan çalışma haricinde EV ve DNG’in bir arada
bulunuyorken aynı anda miktar tayinleri için geliştirilmiş herhangi bir yöntemin
bulunmadığı gözlenmiştir. Dolayısıyla bu konuda yapılacak çalışmalar tamamen
orijinal olacaktır. Bu amaçla yeni spektrofotometrik ve yüksek performanslı sıvı
kromatografik yöntemler geliştirerek herhangi bir ön işleme gerek duymaksızın EV
ve DNG’nin farmasötik preparatlarda aynı anda miktar tayinlerinin yapılabilmesini
ve bu yöntemlerin rutin analizlerde kullanabilirliğini sağlamak tezimizin amacı
olarak belirlenmiştir.
Bu yüksek lisans tezi kapsamında yukarıda belirtilen amaca ulaşabilmek için

ikili karışım halinde bulunan EV ve DNG’in aynı anda miktar tayinlerinin
yapılabilmesi için öncelikle spektrofotometrik analizler temel alınmış ve gerek
ölçülen absorbans değerlerini kemometrik teknikler ile değerlendirerek ve gerekse de
türev spektrofotometri yardımıyla karışım içerisindeki bu iki etken maddenin hiçbir
ayırma işlemine ihtiyaç duymadan miktar tayinlerinin yapılabilmesi için yöntemler
geliştirilmesi amaçlanmıştır. Kemometrik teknikler olarak temel bileşen regresyonu
(TBR) ve kısmi en küçük kareler (KEK) tekniklerinin uygulanması planlanmıştır.
Ayrıca hem aynı anda miktar tayinlerinin gerçekleştirilebilmesi hem de elde edilen
sonuçların karşılaştırılması için yeni bir yüksek performanslı sıvı kromatografisi
(YPSK) yöntemi geliştirilmesi de amaçlanmıştır. Ardından, geliştirilen tüm
yöntemlerin EV + DNG ikili karışımını içeren farmasötik preparatlara
uygulamasının sağlanması ve onların rutin analizlerinde kullanılabilir hale
getirilmesi yine tezimizin amaçları arasındadır.
3
1.2. Kimyasal ve Fiziksel Özellikler
1.2.1. Estradiol valerat
Formül :
CH3 O
CH3
H
H H
HO
Kapalı formül : C23H32O3
Kimyasal yapısı : Estra-1,3,5(10)-trien-3,17-diol (17β)-, 17-pentanoat
Fiziksel özellikleri:
Estradiol valerat beyaz renkte toz kristallerdir. Pratik olarak suda çözünmez. Etil
alkol, aseton ve kloroformda iyi çözünürken, bitkisel yağda düşük çözünürlüğe
sahiptir. Ağzı kapalı ve ışık geçirmez kaplarda saklanır. Molekül ağırlığı 356.51 g
dır. Erime noktası aralığı 143–150 0C’dir.
UV spektrumu:
EV’ın metanol - su (3:1 h/h) karışımındaki çözeltisinin UV spektrumunda 278.8

nm’de bir maksimum ve 285,4 nm’de bir omuz görülür. 90 µg/ml EV çözeltisinin
278.8 nm’deki absorbansı 0.476’dir (Şekil 1.1).
4
Şekil.1.1. EV’ın metanol – su (3:1, h/h) karışımındaki 90 µg/mL çözeltisinin UV spektrumu.
Genel Farmakolojik Etkisi :
Menopoz sonrası için hormon replasman tedavisi (HRT) sağlar.
Tanım :
Estradiol valerat (EV) menopoz sonrası için hormon HRT sağlar ve klimakterik
yakınmaları etkin bir şekilde tedavi eder (klimakterik yakınmalar; sıcak basması,
terleme, uyku bozuklukları, sinirlilik, irritabilite, baş dönmesi, baş ağrısı gibi mental
ve vejetatif semptomlar; üriner inkontinans, vajinal kuruluk ve yanma, disparöni gibi
genitoüriner sistemin deri ve müköz membranlarının dejeneratif semptomları). Diğer
estrojenler gibi intramüsküler yoldan uygulanabildiği gibi oral yoldan tablet
formunda da kullanılabilir.
Farmakolojik etkileri :
EV ve DNG kombinasyonunda; EV, estrojen yetmezliği nedeniyle oluşan

postmenopozal kemik kaybını engeller. Bu etki esas olarak osteoklast fonksiyonunun
inhibisyonu ile kemik remodelling sürecinin kemik formasyonu yönüne çekilmesine
5
bağlıdır. EV’ın bu etkisi alkalen fosfataz ile piridinolin ve dezoksipiridinolin çapraz

bağları gibi kemiğe özgü belirteçlerle gösterilmiştir
Endikasyonları :
Atrofik vajinit, hipogonadizm, menopoz semptomları, oforektomi, osteoporoz

profilaksisi, over yetmezliği, prostat kanseri, sıcak basması gibi semptomların
giderilmesinde kullanılır.
Kontrendikasyonları :
Astım, cerrahi, çocuklar, depresyon, diyabet (diabetes mellitus), endometrium

hiperplazisi, endometrium karsinomu, endometriyoz, epilepsi hastalığı, gebelik,
hepatik hastalık, hepatoselüler karsinom, hiperkalsemi, hiperkolesterolemi,
hiperlipoproteinemi, hipertansiyon, intravenöz uygulama, kalp hastalığı, kontakt
lensler, koroner arter hastalığı, meme hastalığı, migren, over kanseri, pankreatit,
porfiri, renal hastalık, safra kesesi hastalığı, sarılık, serebrovasküler hastalık, serviks
karsinomu, strok, süt verme (emzirme), tromboembolik hastalık, tromboflebit, tütün
içme, uterus karsinomu, uterus leyomiyomu (fibroid), vajinal kanama, vajinal
karsinom ve yeni doğanlarda kullanılmamalıdır.
Yan etkileri :
Abdominal (epigastrik) ağrı, akne, alopesi (saç dökülmesi), amenore,

anksiyete, anoreksi, ara kanama, baş ağrısı, biliyer tıkanma, bulantı/kusma,
depresyon, dış gebelik (ektopik gebelik), diplopi, dismenore, diyare, endometrium
karsinomu, enjeksiyon yeri reaksiyonu, ertiem, eritema nodosum, fatig,
fotosensitivite, galaktore, hepatik enzim düzeylerinde yükselme, hepatit, hepatoma,
hiperglisemi, hipertansiyon, jinekomasti, jinjivit, kandidiyazis, kaşıntı (pruritus),
keratokonüs, kilo alma, kolelityaz (safra taşı oluşumu), kolesistit (safra kesesi
iltihabı), kolestraz, libido artışı, libido azalması, makülopapüler döküntü, mastalji
(meme ağrısı), melazma, meme akıntısı, meme kanseri, memelerde büyüme,
memelerde duyarlılık, menoraji, miyokard infarktüsü, oprik nörit, over kanseri,
ödem, pankreatit, peliosis hepatis, pulmoner embolizm, retinal tromboz, ruhsal
labilite, sarılık, servikal displazi, servikal karsinom, servisit (serviks uteri iltihabı),
6
sıvı retansiyonu, strok, teratojenez, tromboembolizm, tromboz, uykusuzluk

(insomnia), ürtiker, vajinal kanama, vajinit
Saklama koşulları :
EV, 15-30 oC arasındaki kontrollü oda sıcaklığında ve hava geçirmeyen

kaplarda saklanmalıdır. Işıktan korunmalıdır.
7
1.2.2. Dienogest
Formül :
CH3 OH
N
Kapalı formül : C20H25NO2
Kimyasal yapısı : 17α-Siyanometil-17β-hidroksiestra-4, 9-dien-3-on
Fiziksel özellikleri :
DNG beyaz renkte ve kokusuz bir tozdur. Suda çözünmez, etanol ve

asetonitrilde çözünür. Spesifik rotasyonu 290o’dir. Molekül ağırlığı 311.42 gramdır.
Ağzı kapalı ve ışık geçirmez kaplarda saklanır. Erime noktası 204 – 214 oC
aralığındadır
UV spektrumu :
DNG’in metanol - su (3:1, h/h) karışımındaki çözeltisinin UV spektrumunda,

308.2 ve 216.0 nm’lerde maksimum görülür. 12 µg/ml DNG çözeltisinin 308.2
nm’deki absorbans değeri 0.759’dur (Şekil 1.2).
8
Şekil.1.2. DNG’in metanol – su (3:1, h/h) karışımındaki 12 µg/mL çözeltisinin UV

spektrumu
Genel Farmakolojik Etkisi :
Dienogest oral yoldan kullanılan güçlü bir sentetik projestindir.
Tanım :
Dienogest HRT için kullanılan bir estrojen-projestin kombinasyonunun

bileşimine girer. 19-nortestosteronun bir türevidir, ancak on yedinci karbonda alkil
grubu yerine, maddeye eşsiz farmasötik profilini kazandıran siyanometil grubu içerir.
Maddenin farmakokinetik özellikleri tekrarlanan dozlarda birikme olmadan ilacın
oral uygulamasını sağlar.
Farmakolojik etkileri:
HRT’ndeki estrojen-projestin formülasyonuna dienogest eklenmesi

endometrial hiperplazi gelişimini engeller, kanamanın azalmasına ve olguların
çoğunda giderek kesilmesiyle sonuçlanan endometrium atrofisine yol açar.
Endometriyum üzerindeki etkisinin gücü, projestin potansiyelinin diğer herhangi
9
projestinden dört kat daha büyük olmasında görülür. Globuline bağlı sex hormonuna
bağlanmaz, bu özellik dienogestin serbest serum seviyelerini yüksek, serbest
testesteron seviyelerini düşük tutar. Dienogestin güçlü in vivo projestojenik etkisi,
oral alımı takiben, %10’u serbest steorid olmak üzere serumdaki yüksek
konsantrasyonu ile açıklanabilir. Dienogestin etki mekanizmasının in vitro olarak
sitokrom P450 inhibisyonu ile ilgisi yoktur, dolayısıyla dienogestin bu düzeyde diğer
ilaçlarla etkileşimi beklenmez.
Endikasyonları:
Endometriyozis
Kontrendikasyonları :
Hepatik hastalık, hepatoselüler karsinom, hipertrigliseridemi, meme kanseri,

tromboembolik hastalık, trombositoz, vajinal kanama, hamilelerde ve emziren
bayanlarda kullanılmamalıdır.
Yan etkileri :
Dienogestin yan etkileri diğer progestojenlerden beklenilen yan etkiler

gibidir. Bunlar; kilo alma, kan basıncının artışı, göğüs duyarlılığı, mide bulantısı gibi
etkileri içerir. Diernogestin herhangi bir androjen yan etkisine rastlanmamıştır.
Ayrıca metabolik ve lipit hemostatik parametreler üzerinde çok az etkisi vardır.
Saklama koşulları :
Oda sıcaklığında, ağzı kapalı ve ışık geçirmez kaplarda saklanmalıdır.

10
1.3. Türkiye’de Dienogest Đçeren Preparat
CLIMODIEN ® draje (Schering)

Estradiol valerat ........... 2 mg
Dienogest ..................... 2 mg / draje
1.4. Türkiye’de Dienogest ve Estradiol Valerat Đçeren Preparat (CLIMODIEN®

Draje) Đle Đlgili Bilgiler
Farmakolojik etkileri :
Climodien 17β- estradiol’ün ön maddesi olan, estradiol valerat ve sentetik

progestagen olarak dienogest içerir. Bu preparattaki estradiol menopoz sonrası için
hormon replasman tedavisi (HRT) sağlar ve klimakterik yakınmaları etkin bir şekilde
tedavi eder (sıcak basması, terleme, uyku bozuklukları, sinirlilik, irritabilite, baş
dönmesi, baş ağrısı gibi mental ve vejetatif semptomlar; üriner inkontinans, vaginal
kuruluk ve yanma, disparoni gibi genitoüriner sistemin deri ve müköz
membranlarının dejeneratif semptomları). Formülasyona sürekli dienogest eklenmesi
endometriyal hiperplazi gelişimini engeller, kanamanın azalmasına ve olguların
çoğunda giderek kesilmesiyle sonuçlanan endometriyum atrofisine yol açar.
Kullanılırken dikkat edilmesi gereken noktalar :
Aşağıdaki koşullardan herhangi birinin varlığında HRT’ye başlanmamalıdır. HRT

kullanımı sırasında bu koşullardan herhangi birinin ortaya çıkması durumunda tedavi
derhal kesilmelidir:
− Gebelik ve laktasyon
− Tanı konmamış vaginal kanama
− Bilinen ya da şüphelenilen meme kanseri
− Bilinen ya da şüphelenilen premalign durumlar ya da seks steroidlerinden etkilenen
maligniteler
− Karaciğer tümörü varlığı ya da öyküsü (benign ve malign)
11
− Ağır karaciğer hastalığı

− Akut arteriyel tromboembolizm (örn. miyokard infarktüsü, inme)
− Aktif derin ven trombozu, tromboembolik bozukluklar veya bu durumlarla ilgili
kayıtlı öykü
− Ağır hipertrigliseridemi
− Climodien’in içeriğindeki bileşenlere karşı bilinen aşırı duyarlılık
Yan etkileri:
Çekilme kanaması, meme duyarlığı/ağrı, endometriyal kalınlıkta artma, vul-

vovajinit, bulantı, abdominal ağrı, diyare, g-GT artışı, baş ağrısı, migren, baş
dönmesi, yorgunluk, anksiyete, hipertansiyon/ağırlaşan hipertansiyon, sıcak basma-
ları, vücut ağırlığında değişiklikler, oral kandidiazis görülebilir.
12
1.5. Dünyada Dinogest Đçeren Ticari Preparatlar
Çizelge1.1 Dünyada DNG içeren ticari preparatlar, bileşimleri ve ülkeleri
Dienogestin yanındaki
Preparatın Adı Ülkesi
etken maddeler
Certostat Etinil estradiol Almanya
Climodiene Estradiol valerat Fransa
Çek Cumhuriyeti,
Klimodien Estradiol valerat
Macaristan
Mevaren Estradiol valerat Đspanya
Portekiz, Đspanya,
Almanya, Avusturya,
Climodien Estradiol valerat Norveç, Đsveç, Belçika,
Danimarka, Yunanistan,
Rusya
Çek Cumhuriyeti, Rusya,

Jeanine Etinil estradiol
Avusturya
Lafamme Estradiol valerat Almanya, Avusturya
Valette Etinil estradiol Almanya, Avusturya

13
1.6. Türkiye’de Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar
1. CLĐMEN ® Draje (Bayer)

Estradiol valerat ………………….…. 2 mg
Siproteron asetat ……………….….. 1 mg/draje
2. CYCLO-PROGYNOVA ® Draje (Schering)

Estradiol valerat ……………..………. 2 mg
Norgestrel …………………………...0.5 mg /draje
3. GRAVĐBĐNAN ® Steril Ampul (Schering)

Estradiol valerat ………………………. 2 mg
Hidroksiprogesteron kapronat ……….. 500 mg / 2 mL
4. DĐVĐNA ® Tablet (Abdi Đbrahim)

Medroksiprogesteron asetat ………….. 10 mg/tablet
5. DĐVĐTREN TABLET ® Tablet (Abdi Đbrahim)

Medroksiprogesteron asetat ………….. 20 mg/tablet
14
1.7. Dünyada Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar
Çizelge1.2 Dünyada EV içeren kombine ticari preparatlar, bileşimleri ve ülkeleri
Estradiol valeratın
Preparatın Adı yanındaki etken Ülkesi
maddeler
Testosterone,
Ablacton Đtalya, Đspanya
Noretindron
Absorlent Plus Noretindron Đspanya
Alüminyum asetat,
Acetonel Vaginale Almanya
Sülfanilamit
Activella Noretindron ABD
Arjantin, Portekiz, Đspanya,

Brezilya, Đtalya, Almanya,
Hollanda, Avusturya,
Norveç, Đsveç, Đsviçre,
Belçika, Çek Cumhuriyeti,
Activelle Noretindron Danimarka, Finlandiya,
Fransa, Yunanistan, Hong
Kong, Đrlanda, Đsrail, Güney
Afrika Cumhuriyeti,
Singapur, Tayland, Malezya,
Macaristan, Şili
Agurin Algestone Şili
Aknefug Hekzaklorofen Çek Cumhuriyeti
Aknefug-Emulsion Hekzaklorofen Almanya
Prednizolon, Salisilik Đsviçre, Almanya, Çek

Alpicot F
asit Cumhuriyeti, Macaristan
Anafertin Algestone Meksika
Andro/Fem Testosterone ABD
Androfemon Testosterone Almanya
Arjantin, Holland, Đngiltere,

Angeliq Drospirenon
Güney Afrika Cumhuriyeti
Atrimon Algestone Arjantin
Auroclim Norgestrel Đspanya

15
Avaden Gestoden Hollanda, Çek Cumhuriyeti
Avadene Gestoden Fransa
Binodian Prasteron Meksika
Biormon Progesteron Đtalya
Ciclocur Norgestrel Arjantin
Cicloprimogyna Norgestrel Brezilya
Ciclovular Algestone Brezilya
Cicnor Algestone Portekiz
Brezilya, Meksika, Yeni

Cliane Noretindron
Zelanda, Şili
Climabelle Norgestrel Avusturya
Climacteron Testosterone Kanada
Climagest Noretindron Đngiltere
Portekiz, Çek Cumhuriyeti,

Climara Duo Norgestrel
Finlandiya
ClimaraPro Norgestrel ABD
Climaston Didrogesteron Fransa
Đtalya, Portekiz, Đspanya,

Almanya, Avusturya,
Norveç, Đsviçre, Avustralya,
Belçika, Çek Cumhuriyeti,
Climen Siproteron
Danimarka, Rusya, Güney
Afrika Cumhuriyeti,
Singapur, Tayland, Malezya,
Macaristan
Climen 28 Siproteron Hong Kong
Arjantin, Brezilya, Meksika,

Climene Siproteron
Hollanda, Şili, Fransa
Climesse Noretindron Đngiltere
Portekiz, Đspanya, Almanya,

Avusturya, Norveç, Đsveç,
Climodien Dienogest
Belçika, Danimarka,
Yunanistan, Rusya
16
Climodiene Dienogest Fransa
Clionara Noretindron Almanya
Clisin Siproteron Đspanya
Clym-Depositum Testosterone Đtalya
CombiPatch Noretindron ABD
Combiseven Norgestrel Đtalya
Convaden Gestoden Çek Cumhuriyeti
Crinohermal FEM Flupredniden Almanya
Cristerona Progesteron Arjantin
Cyclabil Norgestrel Norveç, Đsveç, Finlandiya
Cyclacur Norgestrel Đtalya, Avusturya, Đsviçre
Cyclocur Norgestrel Hollanda, Beçlika
Cyclofem Medroksiprogesteron Şili
Cyclofemina Medroksiprogesteron Meksika, Brezilya
Almanya, Çek Cumhuriyeti,

Cyclo-Menorette Estriol, Norgestrel
Macaristan
CycloOstrogynal Estriol, Norgestrel Almanya, Çek Cumhuriyeti
CycloPolar Medroksiprogesteron Almanya
Cyclo-Progynon Norgestrel Danimarka
Almanya, Đrlanda, Rusya,

Cyclo-Progynova Norgestrel
Tayland
Cyclo-Progynova 1 mg Norgestrel Đngiltere
Cyclo-Progynova 2 mg Norgestrel Đngiltere
Damax Progesteron Meksika
Deladumone Testosteron ABD
depAndrogyn Testosteron ABD
Depo-Testadiol Testosteron ABD
Depotestogen Testosteron ABD

17
Despamen Testosteron Meksika

Dilena Medroksiprogesteron
Portekiz, Hong Kong
Nandrolon ,
Dinatrofon Đspanya
Progesteron
Güney Afrika Cumhuriyeti,

Hollanda, Avustralya, Çek
Divina Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Đsveç,
Danimarka, Finlandiya,
Rusya, Fransa, Macaristan
Divina Plus Medroksiprogesteron Đsveç, Danimarka
Diviplus Medroksiprogesteron Belçika
Norveç, Đsviçre, Çek

Diviseq Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Fransa,
Đrlanda, Rusya
Finlandiya, Rusya,
Divitren Medroksiprogesteron
Macaristan
Diviva Medroksiprogesteron Belçika
Etinil estradiol,
Dos Dias N Hidroksiprogesteron, Arjantin
Norgestrel
Duo-Cyp Testosteron ABD
Duofemme Noretindron Đspanya
Duogex LA Testosteron Kanada
Duo-Ormogyn Progesteron Đtalya
Duoton Progesteron Tayland
Duova Medroksiprogesteron Fransa
Duratestrin Testosteron ABD
Elamax Siproteron Brezilya
Deksametazon,
Ell-Cranell Almanya
Salisilik asit
Elleste Duet Conti Noretindron Đngiltere

18
Elleste-Duet Noretindron Đngiltere
Emenovister Progesteron Đspanya
Emmenovis Progesteron Portekiz
Enadiol CC Medroksiprogesteron Şili
Enadiol MP Medroksiprogesteron Şili
Estalis SQ Noretindron Brezilya
Arjantin, Brezilya, Portekiz,

Đspanya, Avusturya, Norveç,
Estalis Noretindron Đsveç, Đsviçre, Kanada, Çek
Cumhuriyeti, Finlandiya,
Yunanistan, Đrlanda
Estalis Continuous Noretindron Avustralya
Estalis Sekvens Noretindron Norveç, Đsveç, Finlandiya
Estalis Sequens Noretindron Avusturya
Arjantin, Đtalya, Portekiz,

Đspanya, Almanya, Đsviçre,
Estalis Sequi Noretindron
Avustralya, Kanada, Çek
Cumhuriyeti, Đrlanda
Estandron Testosteron Đtalya, Avusturya
Estandron P Testosteron Brezilya
Estandron Prolongado Testosteron Đspanya, Şili
Estandron Prolongatum Testosteron Hollanda, Đsviçre
Estranova 30 simple Medroksiprogesteron Şili
Estiamen Estriol, Estron Đtalya
Estiamen B Estriol, Estron Đtalya
Estopause Medroksiprogesteron Yunanistan
Estra-C Noretindron Çek Cumhuriyeti
Estrace Plus Noretindron Çek Cumhuriyeti
Meksika, Arjantin, Brezilya,

Estracomb Noretindron Đtalya, Portekiz, Đspanya,
Almanya, Hollanda,
19
Đsviçre, Kanada, Şili, Çek

Cumhuriyeti, Danimarka,
Finlandiya, Hong Kong,
Singapur, Macaristan
Estracomb TTS Noretindron Yunanistan
Đngiltere, Avustralya,
Estracombi Noretindron Belçika, Đrlanda, Güney
Afrika Cumhuriyeti
Estrafemol Medroksiprogesteron Almanya
Avusturya, Arjantin,
Brezilya, Almanya, Đsviçre,
Estragest Noretindron
Şili, Çek Cumhuriyeti,
Macaristan
Estrand Testosteron Kanada
Estranova CC Medroksiprogesteron Şili
Estrapak Medroksiprogesteron Avustralya
Estra-Testrin Testosteron ABD
Estro-Pause N Noretindron Güney Afrika Cumhuriyeti
Evitas Algestone Brezilya
Evo-Conti Noretindron Danimarka
Arjantin, Meksika, Đngiltere,

Evorel Conti Noretindron Finlandiya, Đrlanda, Đsrail,
Güney Afrika Cumhuriyeti
Evorel Micronor Noretindron Đsveç
Evorel Pak Noretindron Đngiltere
Arjantin, Đngiltere,
Evorel Sequi Noretindron Finlandiya, Đsrail, Güney
Afrika Cumhuriyeti
Evo-Sequi Noretindron Danimarka
Farludiol Medroksiprogesteron Arjantin
Farludiol Ciclo Medroksiprogesteron Arjantin
Farlupost Medroksiprogesteron Şili

20
Arjantin, Almanya, Şili,

Fem 7 Combi Norgestrel
Đsviçre
Fem 7 Sequi Norgestrel Hollanda
Femanor Noretindron Đsveç, Danimarka
Femapak Didrogesteron Đngiltere
Femasekvens Noretindron Đsveç, Danimarka
Femaston Didrogesteron Yunanistan
Femilar Siproteron Finlandiya
Femineo Algestone Brezilya
Feminova Plus Norgestrel Belçika
Femipak Medroksiprogesteron Avusturya

Hollanda, Avusturya,
Đsviçre, Đngiltere,
Avustralya, Belçika, Çek
Femoston Didrogesteron Cumhuriyeti , Finlandiya,
Hong Kong, Đrlanda, Rusya,
Singapur, Malezya,
Macaristan
Femoston 1/5 Didrogesteron Portekiz, Rusya
Femoston 2/10 Didrogesteron Portekiz

Femoston Conti Didrogesteron Avusturya, Đsviçre, Đngiltere,
Belçika, Finlandiya, Đrlanda
Fempack Progesteron Arjantin
Femphascyl Didrogesteron Avusturya
Femphascyl Conti Didrogesteron Avusturya
Femplan-MA Medroksiprogesteron Đrlanda
FemseptCombi Norgestrel Fransa
FemSeve Conti Norgestrel Đngiltere
FemSeven Combi Norgestrel Avusturya, Finlandiya

21
FemSeven Sequi Norgestrel Đngiltere
FemTab Continuous Noretindron Đngiltere
FemTab Sequi Norgestrel Đngiltere
Đtalya, Avusturya
Filena Medroksiprogesteron
Diklorofen, Bizmut
Fissan-Brustwarzensalbe Almanya
bileşikleri
Folivirin Testosteron Çek Cumhuriyeti
Gestadinona Hidroksiprogesteron Brezilya
Gianda Medroksiprogesteron Almanya
Ginecoside Progesteron Brezilya
Ginedisc 50 Plus Noretindron Brezilya
Ginoplan Algestone Meksika
Gravibinan Hidroksiprogesteron Đtalya, Fransa
Gravibinon Hidroksiprogesteron Almanya, Avusturya, Đsviçre
Gravidinona Hidroksiprogesteron Meksika, Şili
Gynamon Noretindron Almanya
Arjantin, Đtalya, Đspanya,

Almanya, Avusturya,
Gynodian Depot Prasteron Đsviçre, Şili, Çek
Cumhuriyeti, Fransa, Rusya
Progesteron, D
Hormonigase Brezilya
vitaminleri
Hormonin Estriol, Estron Đngiltere, Hong Kong
Hosterona Progesteron Arjantin
Icht-Oestren Đhtiyol, Üre Almanya
Almanya, Avusturya, Çek

Indivina Medroksiprogesteron Cumhuriyeti, Danimarka,
Finlandiya, Đsveç, Đsviçre,
Đngiltere, Đrlanda, Norveç,
22
Rusya, Tayland
Jephagynon Progesteron Almanya
Kloramfenikol,
Kemicetine Antiozena Hindistan
Dvitaminleri
Kilios Medroksiprogesteron Şili
Kliane Noretindron Çek Cumhuriyeti
Klimalet Medroksiprogesteron Danimarka
Klimaxil Medroksiprogesteron Danimarka
Çek Cumhuriyeti,
Klimodien Dienogest
Macaristan
Almanya, Çek Cumhuriyeti,

Klimonorm Norgestrel Hong Kong, Rusya, Tayland,
Malezya
Kliofem Noretindron Đngiltere
Arjantin, Portekiz, Brezilya,

Đtalya, Hollanda, Avusturya,
Norveç, Yeni Zelanda, Đsveç,
Cumhuriyeti, Danimarka,
Kliogest Noretindron Finlandiya, Fransa,
Yunanistan, Hong Kong,
Đrlanda, Đsrail, Güney Afrika
Cumhuriyeti, Singapur,
Tayland, Malezya,
Macaristan, Şili
Kliogest N Noretindron Almanya, Đsviçre
Kliovance Noretindron Yeni Zelanda, Đngiltere
Lafamme Dienogest Almanya, Avusturya
Lindisc Duo Norgestrel Brezilya
Linoladiol Gamolenik asit Đsviçre
Almanya, Çek Cumhuriyeti ,

Linoladiol-H N Prednizolon
Macaristan
Liseta Dezogestrel Avusturya

23
Lubriderm Progesteron Arjantin
Lunelle Medroksiprogesteron ABD
Lutalmin Didrogesteron Meksika
Lutoginestryl F Proesteron Meksika
Lynandron Testosteron Almanya
Meno-MPA Medroksiprogesteron Đsrail
Meno-Net Noretindron Đsrail
Menovis Progesteron Đtalya
Menstrogen Progesteron Arjantin
Brezilya, Almanya,
Mericomb Noretindron Avusturya, Đsviçre,
Finlandiya
Brezilya, Đspanya, Almanya,

Merigest Noretindron Avusturya, Đsviçre,
Finlandiya
Merigest Sequi Noretindron Đspanya
Brezilya, Arjantin, Meksika,

Mesigyna Noretindron
Şili
Metrigen Fuerte Progesteron Meksika
Mevaren Dienogest Đspanya
Minique Trimegestone Avusturya
Etinil estradiol,
Mixogen Metiltestosteron,
Hindistan
Testosteron
Naemis Nomegesterol Hollanda, Fransa
Natifa Pro Noretindron Brezilya
NeoOstrogynal Estriol Almanya
Neo-Pause Testosteron Kanada
NeyNormin Đnsan koriyonik

N(Revitorgan-Dilutionen gonadotropini, Almanya
N Nr 65) Liyotironin,
Prednizolon, Vitamin
24
B12, E vitaminleri
Normomensil Progesteron Brezilya
Novafem Medroksiprogesteron Şili
Almanya, Hollanda,
Novofem Noretindron Đsviçre, Đngiltere, Belçika,
Danimarka, Finlandiya,
Đrlanda, Đsrail
Novofemme Noretindron Fransa
Đtalya, Portekiz, Đspanya,

Yeni Zelanda, Đngiltere,
Nuvelle Norgestrel
Danimarka, Đrlanda,
Yunanistan
Nuvelle Continuous Noretindron Đngiltere
Nuvelle TS Norgestrel Đtalya, Đngiltere
OestroTabs Plus Cyclic Medroksiprogesteron Đsviçre
Ominol Progesteron Meksika
Osmil Medroksiprogesteron Almanya
Ostranorm Noretindron Danimarka
Ostrolut Hidroksiprogesteron Avusturya
Ostronara Norgestrel Almanya
Patector Algestone Meksika
Pausene Siproteron Đtalya
Çek Cumhuriyeti, Rusya,

Pausogest Noretindron
Macaristan
Perifem Medroksiprogesteron Đspanya
Perikliman Noretindron Avusturya
Perludil Algestone Meksika
Perlutal Algestone Arjantin, Meksika
Perlutan Algestone Brezilya
Plenifem Norgestrel Arjantin

25

Postoval Norgestrel
Brezilya, Şili

Prefest Norgestimate
ABD
Prefesta Norgestimate Güney Afrika Cumhuriyeti
Preg-Less Algestone Brezilya
Primaquin MP Medroksiprogesteron Şili
Primaquin MP
Medroksiprogesteron Şili
Continuous
Đtalya, Đspanya, Almanya,

Avusturya, Đsviçre,
Primodian Depot Testosteron
Avustralya, Güney Afrika
Cumhuriyeti, Tayland
Primosiston Hidroksiprogesteron Arjantin, Meksika
Primosiston Fuerte Hidroksiprogesteron Đspanya
Primoson-F Progesteron Meksika
Procyclo Medroksiprogesteron Almanya
Progediol Progesteron Meksika
Proger-F Progesteron Meksika
Etinil estradiol,
Progest Hidrokisprogesteron, Brezilya
Progesteron
Progestrol Algestone Hong Kong
Meksika, Portekiz, Đspanya,

Progyluton Norgestrel Şili, Đsrail, Singapur,
Malezya
Sebohermal Đhtiyol, Rezorsin Almanya
Senikolp Broksikinolin, Estron Finlandiya
Sisare Medroksiprogesteron Almanya
Sisare 28 Medroksiprogesteron Almanya
Substitol Morfin Avusturya

26
Successia Gestoden Fransa
Supligol Testosteron Arjantin
Supligol NF Prasteron Arjantin
Suprema Noretindron Brezilya
Syngynon Hidroksiprogesteron Almanya
Brezilya, Đsviçre, Çek

Systen Conti Noretindron
Cumhuriyeti
Brezilya, Đsviçre, Çek

Systen Sequi Noretindron
Cumhuriyeti
T-E Cypionate Testosteron ABD
Tesor-C Noretindron Đtalya
Testaval 90/4 Testosteron ABD
Test-Estro Testosteron ABD
TOM Triotrisin Fransa
Topasel Algestone Đspanya
Totelle Trimegestone Şili, Danimarka, Đtalya, Đsveç
Totelle Ciclico Trimegestone Arjantin
Totelle Continuo Trimegestone Arjantin, Meksika
Totelle Cycle Trimegestone Belçika
Totelle cyclo Trimegestone Avusturya
Totelle Secuencial Trimegestone Meksika
Totelle Sekvens Trimegestone Finlandiya, Norveç, Đsveç
Trevina Medroksiprogesteron Danimarka
Triaklim Noretindron Çek Cumhuriyeti, Rusya
Trial Combi Noretindron Arjantin
Trial Gest Noretindron Arjantin
Trial Pack Noretindron Arjantin
Triaval Medroksiprogesteron Đsviçre

27
Tridestra Medroksiprogesteron Đngiltere, Đrlanda
Tri-Filena Medroksiprogesteron Avusturya
Hidroksiprogesteron,
Trinestril Brezilya
Testosteron
Trinorm Noretindron Danimarka
Trioestrine-Retard Hidroksiprogesteron Monako
Norveç, Đsveç, Finlandiya

Trisekvens Noretindron
Danimarka
Arjantin, Portekiz, Đspanya,

Hollanda, Avusturya, Yeni
Zelanda, Đsviçre, Đngiltere,
Trisequens Noretindron Cumhuriyeti, Fransa,
Yunanistan, Hong Kong,
Đrlanda, Đsrail, Rusya, Güney
Afrika Cumhuriyeti,
Singapur, Tayland,
Macaristan, Şili

Trivina Medroksiprogesteron
Đsveç, Belçika
Tyliculine Triotrisin Đsviçre
Unalmes Algestone Brezilya, Şili
Uno-Ciclo Algestone Brezilya
Valertest Testosteron ABD
Vitrena Medroksiprogesteron Almanya
Vivelle Norgestimate Avusturya
Yectames Algestone Meksika
Zumeston Didrogesterom Avusturya

28
Çizelge 1.3. Dünyada sadece EV içeren ticari preparatlar
Absorlent Adgyn Estro Aerodiol
Agofollin Alcis Alora
Armistor Armonil Avicis
Benzo-Ginestryl Benzo-Ginoestril Benzo-Gynoestryl
Bisteron Calidol Cerella
Cerina Climaderm Climaval
Cliogan Cutanum Cycloderm
Deladiol Delestrogen Delidose
depGynogen Depogen Dermatrans
Dermestril Dimenformon Dimenformon

Prolongatum
Dioval Disequens Divigel
Duokliman Dura-Estrin Duragen
E-Cypionate Elleste Elleste-Solo
Enadiol Endomina Ephelia
Epiestrol Esclim Esclima
Esotran Essventia Estrabeta
Estrace Estracutan Estra-D
Estradelle Estraderm TTS Estradot
Estrahexal Estra-L Estramon
Estranaova E Estrapatch Estrasorb
Estrena Estreva Estrifam
Estrimax Estring Estroclim
Estro-Cyp Estrodose Estrofem
Estrofem N Estroffik Estrogel

29
Estroject Estronar Estronorm
Estro-Pause Etrosteron Eutocol
Evafilm Evopad Evorel
Farlutes Fem 7 Femalon
Femanest Fematab Fematrix
Femiderm Femigel Feminova
Femoston mono FemPatch Femring
Femsept FemSeven FemSieben
FemTab Femtrace Femtran
Gelestra Ginaikos Ginatex
Ginedisc Ginoderm Gynodiol
Gynogen Gynokadin GynPolar
Hormodiol Hormodose Klimapur
Klimareduct Lindisc Linoladiol N
Malun Menaval Meno_patch
MenoImplant Menorest Menoring
Menostar Meriestra Merimono
Mirion Natifa Neofollin
Octodiol Oesclim Oestraclin
Oestring Oestro Gel Oestrodose
Oestrogel Oromone Ovatest
Pantostin Primaquin Primofol Depot
Primogyn Primogyn Depot Primogyna
Progynon Progynon B Progynon Depot
Progynon Depot 10 Progynon Depot 100 Progynon Depot 40

30
Progynova Provames Reglovar
Replasyn Riselle Ronfase
Rontagel Sandrena Sisare Mono
Sprediol Sterigin Systen
Thais Tradelia Transdiol
Transvital Trial Gel Trial Sat
Vagifem Valergen Vivelle Dot
Vivelledot Zerella Zumenon
Benztrone Climara Femogex

31
1.8. ÜZERĐNDE ÇALIŞMA YAPILAN ETKEN MADDELERĐN MĐKTAR

TAYĐNLERĐ KONUSUNDA GÜNÜMÜZE KADAR YAPILMIŞ
ÇALIŞMALAR
1.8.1 Estradiol valerat miktar tayini için yapılmış çalışmalar
1.8.1.1. Spektrofotometrik yöntemler
YÜCESOY C. ve EROL S. (2000) yaptıkları bir çalışmada estradiol valerat

(EV) ve siproteron asetat’ın (CA) aynı anda miktar tayininin türev ve fark
(difference) spektrometri ile yapılabileceğini göstermişlerdir. Birinci türev
spektrofotometride bu iki etken maddenin 0.1 N metanolik NaOH içerisindeki
çözeltilerinin birinci türev spektrumunda CA için 269.9 ve 297.7 nm’lerde, EV için
ise 283.1 nm’deki dA/dλ değerleri okunarak aynı anda miktar tayinleri
gerçekleştirilmiştir. Fark spektrometrisi yönteminde ise sadece EV’nin CA ve EV
karışımında, 0.1 N metanolik NaOH içerisindeki çözeltilerinin 245.4 nm’deki fark
spektrumunda okunan absorbans değerlerinden hareketle her ikisininde aynı anda
miktar tayini gerçekleştirilmiştir. Birinci türev spektrometrisinde doğrusal çalışma
aralıkları CA için 5–25 µg/mL ve EV için 8–40 µg/mL olarak bulunmuştur. Fark
spektrometride EV için çalışma aralığının yine 8–40 µg/mL arasında olduğu
hesaplanmıştır. Birinci türev spektrometride hesaplanan bağıl standart sapma
değerleri ise CA ve EV için sırasıyla % 2.12 ve % 0.95 olarak hesaplanmıştır. Fark
spektrometride hesaplanan bağıl standart sapma değeri ise EV için % 0.99 olarak
bulunmuştur. Yöntemin farmasötik bir preparata (draje) başarıyla uygulandığı
çalışmada belirtilmektedir.
YÜCESOY C.(2000) yaptığı bir başka çalışmada estradiol valerat (EV) ve

siproteron asetatın (CA) ikili karışımlarında aynı anda miktar tayinlerini Vierordt ve
absorbans oranları yöntemleri ile tayin edilebileceğini göstermişlerdir. Bu
yöntemlerde EV ve CA’nın 0.1 N metanollü NaOH çözeltileri kullanılmış ve
yöntemler uygulanmıştır. Her iki yöntemde de ortalama yüzde geri kazanım EV için
% 98.1, CA için ise % 101.9 olarak bulunmuştur. Bağıl standart sapma değerleri ise
EV ve CA için her iki yöntemde de sırasıyla %1.03 ve % 0.97 olarak bulunmuştur.
Her iki yöntemde de EV için doğrusal çalışma aralığı 8–40 µg/mL, CA için ise 5–25
32
µg/mL olduğu saptanmıştır. Geliştirilen yöntemlerin CA ve EV içeren bir draje

formülasyonuna başarıyla uygulandığı çalışmada belirtilmektedir.
DĐNÇ ve arkadaşları (2003) yaptıkları bir çalışmada siproteron asetat (CA)

ve estradiol valeratın (EV) farmasötik preparatlarda oran spektrumu, birinci türev
spektrofotometri ve iki kemometrik yöntemle (CLS ve ILS) aynı anda miktar
tayininin yapılabileceğini göstermişlerdir. Oran spektrumu birinci türev
spektrofotometride CA ve EV’nin 0.1 M NaOH-metanol (1:9) içerisindeki
çözeltilerinin spektrumları kullanılmış ve elde edilen oran spektrumlarının birinci
türevinde EV için 235.4 ve 249.5 nm’ler, CA için 261.1 ve 277.1 nm’deki analitik
sinyaller okunarak miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir. Kemometrik yöntemlerde ise
EV ve CA’nın yine aynı çözücü içerisindeki çözeltilerinin 230–320 nm’ler arasında
∆λ=5 nm olarak 14 dalga boyunda okunan absorbans değerleri kullanılmıştır.
Geliştirilen üç yöntemde de doğrusal çalışma aralıkları EV için 16–48 µg/mL, CA
için ise 4–32 µg/mL olarak bulunmuştur. Oran spektrumu birinci türev
spektrofotometri, ILS ve CLS’de bağıl standart sapma değerleri sırasıyla EV için %
1.18, % 0.71 ve % 1.21 ve CA için % 1.49, % 0.69 ve % 0.54 olarak hesaplanmıştır.
Geliştirilen yöntemlerin bir farmasötik preparata başarıyla uygulandığı çalışmada
belirtilmektedir.
1.8.1.2. Kromatografik Yöntemler
SEGALL ve arkadaşları (1999) tablet formülasyonlarında estradiol valerat

(EV) ve medroksiprogesteron asetatın (MA) aynı anda tayini için bir YPSK yöntemi
geliştirmişlerdir. Yöntemde C18 ters faz kolonu ve mobil faz olarak amonyum nitrat
tampon-asetonitril (30:70, h/h) kullanılmıştır. Tayin 280 nm’de gerçekleştirilmiş,
akış hızı ise 2 ml/dk olarak seçilmiştir. Yöntemde MA için alıkonma zamanının 4 dk,
EV için ise 12 dk olduğu gözlenmiştir. Yöntemde doğrusal çalışma aralıklarının EV
için 0.32–0.48 mg/mL, MA için ise 0.8–1.2 mg/mL olduğu saptanmıştır.
Yöntemdeki bağıl standart sapma değerleri EV ve MA için sırasıyla % 0.6 ve % 1.16
olarak hesaplanmıştır.
33
CARIGNAN ve arkadaşları (1980) estradiolün diasetat, benzoat, dipropionat,

spiyonat ve valerat esterlerinin ayrılması ve miktar tayini için bir YPSK yöntemi
geliştirmişlerdir. Yöntemde kolon olarak RP–8 ve mobil faz olarak asetonitril-su
(70:30, h/h) sistemi kullanılmıştır. Yöntemde akış hızı 3 mL/dk olarak seçilmiş,
deteksiyon ise 220 nm’de yapılmıştır. Yöntemde iç standart olarak testesteron
enantat kullanılmıştır. Yöntemdeki bağıl standart sapma değeri estradiol valerat için
% 0.6 olarak hesaplanmıştır. Yöntemde estradiol valerat için alıkonma zamanı 4.1 dk
olarak bulunmuştur. Geliştirilen yöntem estradiol valeratı içeren iki enjeksiyon
formülasyonuna başarıyla uygulanmıştır.
CARIGNAN ve arkadaşları (1984) estradiol valerat (EV) ve testesteron

enantat’ın (TE) aynı anda yağlı formülasyonlar içerisinde miktar tayinlerinin
yapılabilmesi için bir YPSK yöntemi geliştirmişlerdir. Yöntemde Li Chrosorb
(10µm, 250 x 4.6mm) kolonu ve asetonitril-su (70:30, h/h) sistemi mobil faz olarak
kullanılmıştır. Tayin 210 nm’de yapılmış, akış hızı 1.5 mL/dk olarak seçilmiştir.
Yöntemde EV ve TE için alıkonma zamanları sırasıyla 7.70 ve 18.28 dk olarak
gözlenmiştir. Yöntemdeki bağıl standart sapma değerleri EV için % 0.39, TE için %
0.37 bulunmuştur. Yöntemdeki doğrusal çalışma aralıklarını EV için 0.08 – 0.5
µg/mL ve TE için ise 5 – 30 µg/mL olduğu hesaplanmıştır.
AMIN (1989) estradiol valerat (EV) ve dehidroepiandrosteron enantat’ın

(DE) farmasötik preparatlarda ve kanda kantitatif tayinini yapabilmek için bir ĐTK
yöntemi geliştirmiştir. Yöntemde silika jel 60 F254 kaplı plaklar üzerinde benzen-
kloroform (65:35, h/h) mobil fazıyla yaklaşık 30 dakikalık bir yürütme sonucunda
elde edilen lekeler 2,4-dinitrofenilhidrazin püskürtülerek görünür hale getirildikten
sonra dansitometrik olarak bu lekelerin ölçümü sonucunda miktar tayini
gerçekleştirilmiştir. Yöntemde bağıl standart sapma değerleri DE için % 3.7, EV için
% 2.9 olarak hesaplanmıştır. Geliştirilen yöntemin iki adet tablete ve bir yağlı
çözeltiye başarıyla uygulandığı çalışmada belirtilmektedir. Kan çalışmalarında bağıl
sapma değerlerinin DE için % 3.4’den, EV için ise % 2.74’den küçük olduğu
çalışmada belirtilmektedir.
ZIMMERMAN ve arkadaşları (2000) yaptıkları çalışmada menopoza girmiş

sağlıklı kadınlarda içerisinde EV ve DNG bulunan “CLIMODIEN®” preparatı
34
verildikten sonra farmakokinetiği GC-MS ile takip edilmiştir. Yöntemde negatif

kimyasal iyonizasyon modunda çalışılmış ve m/z = 608 ve m/z = 510’daki iyonlar
EV için takip edilmiş ve ölçülmüştür. Çalışmada plazma numuneleri eter-hekzan
karışımıyla ekstre edildikten sonra C18 kartuşundan geçirilerek temizlenmiştir. Daha
sonra kalıntı 3,5-bis-(triflorometil)benzoilklorür ve N-metil-bis-(trifloroasetamid) ile
türevlendirildikten sonra EV, GC-MS ile analiz edilmiştir. Yöntemde EV için
çalışma aralığı 100–400 ng/L olarak hesaplanmıştır. Yöntemdeki TAS değeri ise 10
ng/L olarak bulunmuştur. Bu yöntem kullanılarak etken maddelerin seçilen
deneklerde Cmax, tmax, t1/2,AUC0→∞ değerleri hesaplanmıştır. Buna karşılık DNG,
radioimmunoassay yöntemiyle tayin edilmiş ve yöntemdeki kalibrasyon aralığı 5–
500 pg/tüp olarak bulunmuştur. TAS değeri ise 1 µg/L olarak tayin edilmiştir.
1.8.1.3. Voltametrik Yöntemler
DUAN ve arkadaşları (1999) estradiol valeratın (EV) civa elektrot üzerinde

elektrokimyasal davranışlarını incelemişlerdir. Bu çalışmada siklik voltametri, lineer
tarama voltametri ve kronokulometri kullanılmıştır. Bunlara dayanarak adsorptif
sıyırma kare dalga voltametrik yöntem EV için miktar tayininde kullanılmıştır.
Yöntemde %18 alkol içeren Britton-Robinson tamponunda (pH=9.5) –1.29 V da
EV’ın bir indirgenme piki verdiği ve pik akımının 2x10–8 – 2.5x10–6 mol/L
konsantrasyon aralığında doğrusal ilişkili olduğu bulunmuştur. YS değeri ise
1.1x10–8 mol/L olarak hesaplanmıştır. Bu yöntemin biyolojik sıvılar için
kullanılabileceği çalışmada belirtilmektedir. Yöntemi diğer steroid estrojenlerin
etkilemediği çalışmada belirtilmektedir. Biriktirme zamanı 300 sn seçilmiş, tarama
hızı 120 mV/sn olarak deneyde kullanılmıştır.
1.8.1.4. Kapiler Elektroforez
TRIPODI ve arkadaşları (2006) doğal ve sentetik estrojenlerin aynı anda

miktar tayinlerinin yapılabilmesi için bis(2-etilhekzil)sulfosiksonata (AOT) dayalı
yeni bir mikro emülsiyon tekniğinden yararlanmışlardır (MEEKC). Mikro emülsiyon
35
sistemi % 1.4 AOT, % 1 oktan, % 71 bütanol ve % 90.6 20 mM 3-

siklohekzilamino–2-hidroksi–1-propan sülfonik asit (CAPSO) ve 10 mM fosfat
tamponundan (pH=12.5) oluşmaktadır. Yöntemde estron, 17-β estradiol, estriol,
estradiol–17-hemisüksinat, etinil estradiol, estradiol–3-benzoat ve estradiol–17-
valerat’ın 15 dakikadan daha kısa bir zaman içerisinde ayrıldığı ve miktarlarının
tayin edildiği anlatılmaktadır. Optimize edilmiş elektroforetik şartlar; 60 cm total
uzunlukta ve 75 µm iç çaplı kaplanmamış silika kapiler, 25 kV voltaj, 25 0C sıcaklık
ve 214 nm’de deteksiyon olarak belirlenmiştir. Estradiol valerat için yöntemde bağıl
standart sapma değeri % 1.5, doğrusal çalışma aralığı 10–75 µg/mL olarak
hesaplanmıştır. TYS değeri 2.1 µg/mL olarak tayin edilmiştir. Yöntemin farmasötik
preparatlar içerisinde yukarıda sayılan etken maddelerin miktar tayinlerinde başarıyla
uygulandığı çalışmada belirtilmektedir.
DU ve arkadaşları (2007) steroidlerin analizi için bir susuz kapiler

elektroforez (NACE) yöntemi geliştirmişlerdir. Elektrolitin cinsi ve organik
çözücünün bileşimi de dahil elektroforetik parametreler optimize edildikten sonra EV
için 20 mM sodyum asetat içeren metanol-asetonitril (95:5, h/h) tamponu (pH=7)
kullanılarak, 45 cm x 75 µm iç çaplı silika kapilerde 280 nm’de deteksiyon
yapıldığında en uygun şartların oluştuğu görülmüştür. Potansiyel 25 kV ve sıcaklık
15 oC olarak seçilmiştir. Göç zamanı estradiol valerat için 6 dak. civarındadır.
Yöntemin tabletlere başarılı bir şekilde uygulandığı çalışmada gösterilmiştir.
1.8.2 Dienogest Miktar Tayini Đçin Yapılmış Çalışmalar
1.8.2.1. Radyoimmunoassay
HIEU ve arkadaşları (1986) dienogestin plazmada miktar tayini için bir

radioimmunoassay (RIA) yönteminden yararlanmışlardır. Yöntemde, plazmadan
dikloroetan ile ekstraksiyondan sonra ve dikloroetan ile ekstraksiyon yapılmadan
dienogestin RIA ile tayini yapılmıştır. Yöntemde % geri kazanım dikloroetan ile
ekstraksiyondan sonra % 97.6 – 109.2, ekstraksiyon yapılmadan doğrudan
36
uygulamada ise % 99.2 – 103.1 arasında olduğu bulunmuştur. Yöntemde

ekstraksiyonlu ve ekstraksiyonsuz işlemde TAS değeri 3.2 pg olarak hesaplanmıştır.
HOBE ve arkadaşları (1986) plazma ve tükrük sıvısı içerisinde dienogestin

radioimmünolojik olarak miktar tayinini gerçekleştirmişlerdir. 2 mg dienogest’in
oral yolla verilmesinden sonra plazma ve tükürükten dikloroeten ile ekstre edilmiş
dienogestin miktarı radioimmunoassay yöntemiyle tayin edilmiştir. Yöntemin
dienogest için farmakokinetik olarak incelenmesinde Cmax, tmax, t1/2, AUCø→∞ gibi
parametrelerin hesaplanmasında kullanıldığı da çalışmada belirtilmektedir.
Kullanılan radioimmunoassay yönteminin HOBE ve arkadaşları tarafından daha önce
geliştirilen yöntem olduğu çalışmada belirtilmektedir.
1.8.2.2. Kromatografik Yöntemler
FEKETE ve arkadaşları (2008) yedi etken madde (dienogest, finasterid,

gestoden, levonorgestrel, estradiol, etinil estradiol ve noredisteron asetat) kalıntısının
aynı anda tayini için bir ultra performans sıvı kromatografisi yöntemi
geliştirmişlerdir. Çeşitli ilaçların üretildiği, steroid üreten üretim bandının
temizliğinin onaylanmasına imkan veren yeni ve kapsamlı bir yöntem geliştirilmiştir.
Yöntemde sabit faz olarak UPSKTM BEH C18 kolonu (1.7 µm parçacık büyüklüğü
ve 50 mm x 2.1 mm boyutlarında), mobil faz olarak asetonitril-su (48:52, h/h), akış
hızı 0.55 mL/dak. olarak kullanılmıştır. Yöntemde DNG için çalışma aralığı 0.12 –
4.55 µg/mL, tayin alt sınırı 0.12 µg/mL, yakalama sınırı 0.06 µg/mL’olarak
bulunmuştur. Alıkonma zamanı 0.45 dak. dır.
37
2. GEREÇ ve YÖNTEM
2.1. Kullanılan Yöntemler
2.1.1. Türev spektrofotometri
Türev spektrofotometri, kalitatif ve kantitatif analiz için dalga boyuna karşı

absorbansın birinci veya daha fazla türevini kullanır. Ancak bu teknik ilk
bulunduğunda çok fazla ilgi görmedi, çünkü o dönemki UV-Vis
spektrofotometreleriyle türev spektrumu almak zordu. Deneysel eğrilerin ölçüm
aletleri ile türevlerinin alınması oldukça eskiye dayanır ve 1920 lerde ilk defa
Rutherford tarafından kütle spektrumlarının yorumlanmasında kullanılmıştır. Genel
kullanma ise 1950’li yılları bulmuştur. Günümüzde mikro işlemcilerin yaygın olarak
kullanılması, bu yöntemin kolaylıkla analizlere uygulanmasına imkân tanımaktadır
ve geliştirilen spektrofotometreler de bu şekilde donanmışlardır. Son yıllarda
yayınlanan ilaç analizleri araştırmalarının çoğunda bu yöntemle ilgili çalışmalar
bulunmaktadır.
UV-görünür bölgedeki bir spektrum, madde üzerine gönderilen ışığın dalga

boylarına karşı absorbans değerlerinin grafiğe geçirilmesi ile elde edilir. Yani A=
f(λ) fonksiyonudur. Bu fonksiyonun her bir noktasındaki türevi hesaplanabilir (dA/
dλ).
Eğer bu türev değerleri dalga boyuna karşı grafiğe geçirilecek olursa “türev
spektrumu” meydana gelir ve 1 den n’e kadar derecede olabilir.
dA d2 A dnA
……….
dλ dλ2 dλn
Türev spektrofotometri ise türev spektrumlarının kullanılması esasına dayalı bir
analiz yöntemidir.
Esasında türev; eğrinin üzerine çizilen teğetin eğimidir yani tanjantıdır. (Şekil
2.1.)
38
Şekil 2.1. Gauss tipindeki bir eğrinin belirli noktalardaki tanjantları ve karşılıkları (OWEN
1995)
Buna göre gauss tipindeki bir eğride tanjantın en yüksek olduğu yarı yüksekliklerde
maksimum veya minimumlar gözlenir.
Türev Eğrilerinin Şekilleri:
Günümüzde 1. den 4. ye kadar türev eğrisi çizilmekte ve anlam kazanmaktadır.

Aşağıdaki şekilde de görüldüğü gibi 1. türev eğrisi orjinal spektrumdaki eğrinin
teğetlerinin eğimini göstermektedir. Burada orjinal spektrumun maksimum noktası
kaybolmuş buna karşılık orjinal spektrumda absorbansın yükseldiği kısımlar için
pozitif, azaldığı kısımlar için ise negatif değerler almaktadır. Orjinal spektrumdaki
eğri üzerinde eğimin en büyük olduğu noktalara yani eğrinin yarı yüksekliklerine
karşılık bir maksimum ve bir minimum göstermekte eğimin en düşük olduğu tepe
noktasında ise sıfır olmaktadır. Buna göre gauss eğrisindeki maksimum noktasına 1.
türev eğrisinde bir “kesim noktası (zero-crossing)” karşılık gelmektedir. Bu
noktanın her iki tarafında pozitif ve negatif bantta absorbans eğrisinin eğim
noktasında (inflection) maksimum ve minimum yapar. Bu iki kutuplu fonksiyon
bütün tek sayılı türevlerin karakteristiğidir. 2. türev eğrisinde ise aynı işlemler
sonucunda orjinal eğrinin maksimum noktasına karşılık gelen bir minimum
görülmektedir. Ayrıca ana pikin iki tarafında ve pozitif bölgede iki adet uydu pik
39
verir. Çift sayılı türevlerin karakteristik özelliği, absorbans spektrumunun

maksimum yaptığı dalga boyunda, λmax, pozitif veya negatif bölgede güçlü bir
maksimum veya minimum vermesidir. 3.türev eğrisinde orjinal eğrinin maksimum
noktasına aynen 1. türev eğrisinde olduğu gibi bir kesim noktası karşılık
gelmektedir. 4.türev ise orjinal spektrumdaki maksimum noktaya yine bir maksimum
nokta karşılık gelmektedir. Bu nedenle tek maddenin kantitatif tayinlerinde 2. ve 4.
türev eğrileri kullanılmaktadır. Ayrıca orjinal Gauss eğrisi tipindeki bir pik’e
Şekil 2.2. Türev eğrilerinin şekilleri

40
karşılık n. türevde n + 1 tane maksimum ve minimuma rastlanmaktadır. Yani 1.

türevde 2, 2. türevde 3, 3. türevde 4 tane gibi maksimum ve minimum noktası
gözlenmektedir (Şekil 2.2).
Önemli bir nokta ise, türev eğrilerinin aynı dalga boyu aralığı içerisinde alınması
nedeniyle piklerin genişliğinin azalmasıdır, Bu azalma yaklaşık 1. türevde yarısına,
2. türevde üçte birine ve 4. türevde yüzde 40’ına inmektedir.
Türev spektrumlarında, kesim noktası çok önemlidir. Çünkü bu noktada ait

olduğu maddenin diğer madde veya maddelerin spektrumuna katkısı yoktur.
Dolayısıyla karışım içerisinde herhangi bir ayırma işlemi gerekmeksizin bazı
maddelerin diğerleri yanında miktar tayinlerinin yapılabilmesi mümkündür. Bu da
özellikle karışım halinde maddeleri etken maddeler olarak içeren farmasötik
preparatların analizi için yöntemin çok etkili ve kolay bir miktar tayini yöntemi
olmasını sağlar.
Bu yöntem ikili karışımlarda olduğu kadar daha fazla sayıda bileşen içeren
karışımlarda da uygun kesim noktaları bulunduğunda uygulanabilir.
Şekil 2.2 türevlendirmenin basit Gauss absorbans eğrisinin görünümünde ne gibi

değişiklikler yaptığını bilgisayar simülasyonları halinde gösteriyor. Türev spektrumu
her zaman normal eğriden daha komplekstir.
Yöntemin Özellikleri:
— Avantajları:
a) Türev çalışması orjinal spektrumun eğimleri hakkında bilgi verir ve bunun omuz
noktaları ile dönüm noktalarının daha belirgin hale gelmesine neden olur. Böylece
bir bileşik daha kolay ve kesin olarak tanınabilir.
b) Çoğunlukla orjinal spektrumda elde edilen eğriler birçok pikin üst üste gelmesi
ile meydana gelmiştir. Türev alma ile bu absorpsiyon eğrileri daha ayrıntılı şekle
girer ve böylece birarada bulunan piklerin tek tek görülmesi sağlanır.
41
c) Bilindiği gibi spektrofotometride bulanık çözeltiler ile çalışılırken çökme hızı,

tanecik büyüklüğü gibi faktörlere bağlı olarak büyük oranda hata yapılabilir. Türev
eğrilerinin hazırlanması ile bulanıklığın oluşturduğu bu olumsuz etki ortadan
kaldırılabilir.
d) Birden fazla maddenin karışım halinde bulunduğu ortamlarda ekstraksiyon ve

kromatografi gibi herhangi bir ayırma işlemine başvurmaksızın tek tek miktarları
tayin edilebilir.
e) Reaksiyon ortamından kaynaklanan gürültü piklerinin yok edilmesi sağlanır.
— Dezavantajları:
a) Kullanımı çok kolay olmasına karşılık pahalı spektrofotometrelere ve oldukça

karmaşık bir elektronik yapıya ihtiyaç vardır.
Türev Spektrometrisinde Ölçüm Yöntemleri
Pikten pike ölçüm: Bir spektrumda ard arda gelen maksimum ve minimum noktalar
alınarak, bu iki noktanın mutlak değer olarak farkı ölçülür. Birkaç nokta var ise,
ordinat farkının en büyük olduğu bir bitişik çift seçilir. Bu ölçüm genelde çok
bileşenli nicel analizlerde kullanılır.
Şekil 2.3. Pikten pike ölçüm (TALSKY 1994)

42
Pikten sıfıra ölçüm: Ölçümü yapılacak pikin maksimum yada minimumu ile sıfır
arasındaki uzaklık ölçülür. Özellikle absise göre simetrik sinyaller içeren yüksek
derece türevler için ve üst üste çakışan eğrilerden biri sıfırdan geçtiğinde kullanılır.
Şekil 2.4. Pikten sıfıra ölçüm (TALSKY 1994)
Teğet yöntemi ile ölçüm: bir spektrumda ard arda gelen iki maksimum üzerinden
geçirilen teğetin aşağıdaki minimuma izdüşümü uzaklığı ölçülür. Bu yöntem
doğrusal geri zemine çok rahat uygulanabilir. Özellikle zemin absorpsiyonunun
belirlenemediği bulanık örneklere uygulanır. Bulanık örneklerde, bulanıklık arttıkça
spektrum daha kısa dalga boylarına kayar. Birinci derece ve ikinci derece türevleri
alınarak bu etki ortadan kaldırılabilir.
Şekil 2.5. Teğet yöntemi ile ölçüm (TALSKY 1994)
Pik-pik oranı yöntemi: Pik-pik oranı yöntemi birbirine komşu bir pik çiftinin
oranına dayanır. Eğer bu değerler fark gösterirse, o zaman background girişimi ve
dolayısıyla numunenin düşük kalitede ölçülmesiyle sonuçlanır. Ayrıca şekil 10’da
gösterilen P1 ve P2 sinyalleri numunedeki farklı sinyallerden kaynaklanabilir.
43
Konsantrasyonların oranı değişmediği sürece, p1 ve p2 yüksekliklerinin oranı her

zaman sabit kalacaktır. Kesin konsantrasyonlar farklı olsa ve modifiye edilse bile bu
değişmeyecektir. Diğer bir deyişle pik-pik oranı sadece saf maddeler için değil,
karışımlar için de karakteristik bir niceliktir. Bu özellik analiste bir maddenin
konsantrasyonu sabit tutulduğunda (standart olarak), ikinci maddenin
konsantrasyonundaki değişimi tahmin edebilmesine olanak sağlar. Bu, özellikle
karmaşık türev spektrumlarındaki küçük farklar araştırıldığında kullanışlıdır.
2.1.2. Kemometrik Yöntemler
1972 de ismi konulan kemometri, kimyasal verilerin analizlenmesi yardımıyla

optimum ölçüm işlemleri ve yöntemlerinin seçimi ve tasarlanması, ve maksimum
kimyasal bilgi edinilmesi için matematik ve istatistik yöntemlerin kullanıldığı bir
alan olarak tarif edilmektedir. Bu özellikleri nedeniyle de analitik kimyada çok
yaygın olarak kullanılmaktadır. Kemometrinin en çok kullanıldığı analiz
yöntemlerinin başında spektroskopi gelmektedir. Spektroskopik yöntemler ise
günümüzde pek çok amaçla analizciler tarafından kullanılmaktadır. Özellikle UV-
Görünür alan spektroskopi çok fazla kullanım alanına sahip olup üzerinde çalışılan
numune için hem kalitatif hem de kantitatif açıdan bilgiler elde etmemizi sağlar.
Kantitatif analitik spektroskopi açısından önemli olan analiz edilecek maddenin
miktarıdır. Miktar tayinleri için öncelikle kalibrasyon işleminin gerçekleştirilmesi
gerekir. Kalibrasyon işlemlerinde cihazdan elde edilen analitik sinyallerin analiz
edilen maddenin konsantrasyonu ile orantılı olması esastır. Kalibrasyon işlemleri
yıllardır kullanılmasına rağmen bilgisayar teknolojisinin ve gelişmiş cihazların
kullanılmasıyla büyük bir atılım göstermiş (Cowe ve McNicol, 1985; Fredericks ve
Ark., 1985; Thomas, 1994) olup günümüzde ticari olarak satılan pek çok analiz
cihazının içerisinde bunların çözümü için geliştirilen programlar standart olarak yer
almaktadır.
Spektrokimyasal analizlerde; değişik pek çok kalibrasyon yöntemleri

geliştirilmiştir (Atkinson, 1985; Beebe ve Kowalski, 1987; Booksh ve Kowalski,
1994; Box, 1980; Cook ve Weisberg, 1982; Geladi ve Kowalski, 1986; Haaland ve
44
Thomas, 1988; Hawkins, 1993; Miller, 1991; Roecker, 1991; Stromberg, 1993;
Wentzell ve Ark., 1997). Bu yöntemler içerisinde klasik olanı tek değişkenli
kalibrasyondur, ki bunda basit lineer regresyon yöntemleri kullanılır ve ölçülen
cevaplarda herhangi bir başka girişimin olmadığı kabul edilir. Bundan sonra pek çok
girişimin hesaba katıldığı kompleks kimyasal karışımların analizi için çok değişkenli
kalibrasyon yöntemleri geliştirilmiştir. Analiz edilecek madde ile elde edilen analitik
sinyal arasındaki ilişkinin non-lineer olduğu (doğrusal olmayan) çok sayıda
multivariate (çok değişkenli) kalibrasyon yöntemi de geliştirilmiştir (Frank, 1990;
Dutter ve Huber, 1981; Lawrence ve Arthur, 1990; Ratkowsky, 1990; Sekulic ve
Ark., 1993; Stromberg ve Ruppert,1989). Analiz için hangi kalibrasyon yönteminin
seçileceği bu tekniklerin temeline göredir.
Modern spektroskopik cihazlar içinde birden fazla bileşik içeren bir numune
için bir dakika içinde yüzlerce spektrum alabilecek kadar hızlı hale getirilmişlerdir.
Tek değişkenli kalibrasyon yöntemleri bu tip veriler için uygun değildir. Çok
değişkenli analizler çok sayıdaki matematik işlemlerden meydana gelmiştir ve her
numune için cihazdan bir veya daha fazla cevabın ölçüldüğü kimyasal analizlere
uygulanabilir (Beebe ve Kowalski, 1987; Jochum ve Schrot, 1984; Kisner ve Ark.,
1983; Rencher, 1995).
Spektroskopide çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri, birden fazla bileşen

içeren numunelerin çok sayıdaki dalga boyunda ölçülen cihaz cevaplarını içeren
verilerle ilgilenir. Çok değişkenli kalibrasyon yöntemleri tek değişkenli kalibrasyon
yöntemlerindeki problemleri yok edebilir. Çünkü verilen bir numune için analit
konsantrasyonunun tahmininde verilerin pek çok parçası kullanılır. Örneğin;
cihazdaki noise (gürültü) sinyallerinin ortalaması alınmak suretiyle azaltılabilir.
Ayrıca çok değişkenli kalibrasyon yöntemiyle numunedeki girişim yapan maddelerin
miktarı da tayin edilebilir.
Geçen son yıllarda kemometrideki gelişmeler kompleks kimyasal karışımların

analizi için pek çok multivariate (çok değişkenli) kalibrasyon yönteminin
gelişmesine yol göstermiştir. Günümüzde modern bilgisayarlar bu işlemi daha
kolaylıkla yapabilir hale gelmiştir. Günümüzde spektrokimyasal analizde en çok
kullanılan yöntemler klasik en küçük kareler , ters en küçük kareler, ki bunlar bazen
45
çoklu lineer regresyon (MLR) olarak ifade edilir, kısmi en küçük kareler ve temel
bileşen regresyonudur (Beebe ve Kowalski, 1987; Booksh ve Kowalski, 1994;
Haaland ve Thomas, 1988; Lorber ve Ark.,1987; Martens ve Naes, 1984; Naes ve
Martens, 1984; Sjostrom ve Ark., 1983; Thomas, 1994) . Klasik en küçük kareler ve
ters en küçük kareler yöntemleri univariate (tek değişkenli) kalibrasyonlarda
kullanılan modellerin üzerine kurulmuştur ve genellikle K ve P matris yöntemleri
olarak da adlandırılırlar. Bununla birlikte kısmi küçük kareler ve temel bileşen
regresyonu yöntemleri cihaz cevap matrislerinin iki daha küçük matrise parçalandığı
modelleme yöntemleridir.
2.1.2.1. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi (TBR) ve Kısmi En Küçük Kareler

Yöntemi (KEK)
Temel bileşen regresyonu ve kısmi en küçük kareler modelleme tekniklerinde

veriler orijinal verilerin lineer kombinasyonlarının yeni değişkenlerine parçalanır. Bu
yeni değişkenler temel bileşenler veya faktörler olarak adlandırılırlar. Temel bileşen
regresyonu basitçe temel bileşen analizinin (TBA) ardından regresyon
uygulamasıdır. Đçinde yeni değişkenlerin yaratılması iki boyutlu sistem ile
gerçekleştirilebilir. Eğer cihaz cevabı iki dalga boyunda (n=2) m sayıdaki numune
için birbirlerine karşı grafiğe geçirilirse, yeni bir aks meydana gelir ki bunun yönü
verilerin maksimum değişebilirliğini gösterir. Bu yeni aks, birinci temel bileşen veya
birinci eigen (öz) vektör olarak adlandırılır. Eğer bütün numuneler bu yeni aksın
üzerine düşüyorsa, bütün değişimler sadece bir eigen vektör kullanılarak ifade
edilebilirler. Aksi takdirde; ikinci bir eigen vektör bulunabilir ki, bu birinci eigen
vektöre diktir. Đkinci eigen vektör veri seti içerisinde birinciye uymayan residuallerin
maksimum miktarını ifade eder. Eğer iki dalga boyundan fazlası cihaz cevap
matrisinin içerisinde yer alıyorsa; cismin yapıldığı uzay çok boyutlu olur ve çok
sayıda eigen vektör bulunur. Her birisi kalan değişebilirliğin mümkün olan
maksimumunu içerir veya her birisi diğerlerine ortogonal olur. Genel olarak numune
sayısına eşit ya da ondan daha az sayıda temel bileşen veya faktör oluşturulabilir.
46
Temel bileşen regresyonu ve kısmi en küçük kareler teknikleri tüm spektrumu

içeren yöntemler olduğu için klasik en küçük kareler yönteminin tüm spektrum
avantajlarını da taşır. Bununla birlikte bütün bileşenlerin konsantrasyonlarının
bilinmesi gerekmemektedir. Çünkü kısmi en küçük kareler yöntemi, temel bileşen
regresyonu ve klasik en küçük kareler yöntemi dalga boyu seçme problemi
olmaksızın bir bileşenin analizini yapabilir.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen regresyonu spektrum

matrisinin iki daha küçük matrise parçalanmasındaki teknik nedeniyle birbirlerinden
ayrılırlar. Temel bileşen regresyonu yönteminde parçalanma analit
konsantrasyonundan bağımsız olarak yapılır. Buna karşılık kısmi en küçük kareler
yönteminde konsantrasyon bilgileri ekstraksiyon faktörleri için kullanılır.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen regresyonu için model

aşağıdaki gibi ifade edilir :
A = TB + EA (28)
Burada A önceki gibidir. B ise temel vektörlerin veya yüklenmiş (loaded)

spektrumun h x n matrisi, T ise h yükleme vektörüyle tanımlanan yeni koordinat
sisteminde absorpsiyon şiddeti ve skorların m x h matrisidir. EA, faktör modeline
uymayan spektral residuallerin m x n matrisidir. Klasik en küçük kareler yöntemi ile
diğer faktör yöntemleri arasındaki fark yükleme vektörü B’nin içinde saf bileşenin
spektrumunu değil orijinal kalibrasyon spektrumlarının doğrusal kombinasyonlarının
yer almasıdır. Đlaveten yeni koordinat sistemindeki şiddetler klasik en küçük kareler
yönteminde olduğu gibi doğrudan C ile sınırlandırılmamıştır. Fakat T’deki skorlar
bileşenlerin konsantrasyonlarıyla orantılıdır.
Bazı verilerin sayısı (h) kalibrasyon basamakları içerisinde bir algoritma

kullanılarak tayin edilir. Yeni koordinat sistemindeki spektral şiddetler, ters en küçük
kareler modelinde olduğu gibi analit konsantrasyonuna bağlanabilir:
C = TV + Ec (29)
47
Burada C, bileşen konsantrasyonlarının m x 1 vektörü, V, bileşen

konsantrasyonlarıyla spektral şiddetleri bir araya getiren katsayıların h x 1 vektörü ve
Ec , analiz edilen bileşiğin referans değerindeki hataların m x 1 vektörüdür.
V’ye göre en küçük kareler çözümü 27 eşitliğinin ters en küçük kareler

yöntemindeki çözümüne benzer. Burada T matrisinin kolonları ortogonaldir.
Diagonal (T ′ T) matrisi ihmal edilir ve v vektörü aşağıdaki gibi hesaplanır.
^
v h = (T′ T)–1 T′ C (30)
^
Burada v h, V’nin en küçük kareler değeridir. T ve B matrisleri istenen model
elde edilene kadar basamaklar halinde (her defasında bir vektör) hesaplanır. Daha
önce de söylendiği gibi kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen
regresyonu, T ve B matrislerinin yaratılması yönündeki farklılıklarla ayrılırlar. Temel
bileşen regresyonu modelinde NIPALS (Non-lineer Iterative Partial Least-squares)
algoritması, ki bu WOLD (1966) tarafından kullanılmıştır, geliştirilir.
Kısmi en küçük kareler yöntemi ve temel bileşen regresyonu gibi kalibrasyon

yöntemlerine dayalı faktörlerin klasik en küçük kareler ve ters en küçük kareler gibi
çok değişkenli kalibrasyon yöntemlerindeki pek çok eksikliği gidermesine rağmen bu
yöntemler matematik açıdan spektral matrisin çözümü ve baz vektörlerin elde
edilmesi açısından çok karmaşıktır.
Temel bileşen regresyonu yönteminin avantajları:

a) Dalga boyu seçimi için özel kurallar gerekmez. Herhangi bir sayıdaki dalga
boyu ki genellikle spektrumun tamamı veya geniş bir bölgesi kullanılabilir.
b) Çok sayıda dalga boyu seçimi gürültü piklerinin etkisinin minimuma indirilmesi
için yararlıdır.
c) Temel bileşen analizi (TBA) yöntemindeki veriler ile sadece bizi ilgilendiren
bileşiğin kalibrasyonu için gerekli katsayıların hesaplanmasına imkan tanır.
d) Çok karmaşık karışımlar için uygulanabilir bir yöntemdir. Çünkü yalnızca
ilgilenilen bileşen için gerekli bilgiler yeterlidir.
48
e) Bazen bu yöntem orijinal kalibrasyon karşımlarında var olmayan diğer

bileşenlerin miktarlarının tayini içinde kullanılabilir.
Temel bileşen regresyonu yönteminin dezavantajları:

a) Hesaplamalar klasik yöntemden çok yavaştır.
b) Hazırlanan modeller anlaşılır olmaları ve yorumlanabilmeleri bakımından
oldukça karmaşıktır.
c) Temel bileşen analizinde elde edilen vektörler ilgilenilen bileşiğe tam karşı
gelmeyebilir.
d) Genellikle doğru bir kalibrasyon elde edebilmek için çok sayıda standart
numune gereklidir.
e) Kalibrasyon numunelerinin hazırlanması zordur ve bileşen
konsantrasyonlarındaki ko-lineariteden kaçınmak gerekir.
2.1.2.2. Đstatistiksel değerlendirme
Her ayrılan numunenin konsantrasyonu onun orijinal değeriyle karşılaştırılır

ve tahmin hatası her ilave edilen faktör için THKT (Tahmin hatalarının karelerinin
toplamı) tayin edilir. THKT, ölçümün kalibrasyon verilerine ne kadar uyduğunu
ifade eder.
m
THKT = ∑ (cî – ci )2 (31)
i=1
Burada ci, i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu; ^ci ise i.

numunenin m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur.
Mutlaka THKT değerinin minimum olması gerekmez. Bununla birlikte bu

değer kısmi en küçük kareler yöntemi faktörlerinin optimal seçimi için kullanılır.
Çünkü minimum olursa sonuçların üst üste uyması, tahminde daha zayıf sonuçların
elde edilmesine neden olur.
49
Kalibrasyondaki standart hata (KSH) uygunluk fonksiyonu olarak kullanılır

ve en küçük kareler modelinde bilinen konsantrasyonlara göre hesaplanır. KSH,
standart hatanın (SH)’nin bir türevidir.
m
^
∑
i =1
( c i – ci )2
SH = (32)
Df
m
^
∑
i =1
( ci – c i ) 2
KSH = (33)
m–2
Burada ci ve ^ci sırasıyla bilinen ve bulunan analit konsantrasyonunu ifade eder. m

ise numune sayısıdır. Eğer lineer bir model kabul ediliyorsa ki bunda iki parametre
(eğim ve kesim) söz konusudur, bu durumda serbestlik derecesi (Df ) m-2’ye eşit
olur.
Yöntemlerin başarısı validasyon setlerindeki tahmin modellerine bağlıdır ve bu

tahminin standart hatası (TSH) olarak verilir.
∑ ( ^ci – c i ) 2
i =1
TSH = (34)
m
Burada m kalibrasyon numunelerinin sayısını ifade eder.
Kemometri ile ilgili teorik bölümün hazırlanmasında Haaland ve Thomas 1988

yılında yayınlanan “Partial least-squares methods for spectral analyses. 1. Relation
to other quantitative calibration methods and the extraction of qualitative
information” isimli makalesinden, Brian C. Smith’in 2002 yılında basılan
“Quantitative Spectroscopy: Theory and Practice (Academic Press; An Elsevier
50
Science Imprint (California, USA)” isimli kitabından, Matthias Otto’nun 1999

yılında basılan “Chemometrics : Statistics ad Computer Application in Analytical
Chemistry (WILEY-VCH, Germany)” kitabından ve Özdemir, 1999 (DOKTORA
TEZĐ); bilgilerden yararlanılarak hazırlanmıştır.
2.1.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
Kromatografi, karışım halinde bulunan bir örnekteki bileşenlerin ayrılması,

tanınması ve tayini için kullanılan yöntemlerin genel adıdır. Bütün kromatografik
ayırmalarda numune gaz, sıvı veya süperkritik akışkanı olan hareketli faz ile taşınır.
Bu hareketli faz bir kolonda veya bir katı yüzeyde sabitleştirilmiş kendisi ile
karışmayan bir durgun faz içinden geçmeye zorlanır. Bu iki faz, numune
bileşenlerinin hareketli ve sabit fazlarda farklı oranlarda dağıtılacağı şekilde seçilir.
Sabit faz tarafından kuvvetli tutulan numune bileşenleri, hareketli fazın akışıyla çok
yavaş hareket ederler. Buna karşılık sabit faz tarafından zayıfça tutulan bileşikler
hızlı hareket ederler. Bu hareket hızlarının farklılığı sonucu, numune bileşenleri
birbirlerinden kalitatif veya kantitatif olarak analizlenebilen farklı bantlar veya
bölgeler şeklinde ayrılırlar.
Kromatografik yöntemler iki şekilde sınıflandırılabilir. Đlk sınıflandırma, sabit

fazın birbirleri ile temas ettirilmesi için uygulanan fiziksel şekle göre yapılır. Kolon
kromatografisinde, sabit faz dar bir kolon içinde tutulurken hareketli faz basınç
altında veya yerçekimi etkisi ile sabit faz arasından geçmeye zorlanır. Düzlemsel
kromatografide ise sabit faz düz bir plaka üzerine veya bir kağıdın gözeneklerine
tutturulur. Burada hareketli faz, sabit faz boyunca kapiler etkisi veya yerçekimi etkisi
ile hareket eder. Kromatografinin daha temel bir sınıflandırması kullanılan durgun ve
hareketli fazların tipleri ve fazlar arasında madde aktarımını sağlayan dengelerin
cinslerine göre yapılır. Bu sınıflandırma aşağıdaki gibidir.
1. Sıvı Kromatografi
Sıvı – sıvı veya dağılma
Sıvı – katı veya adsorbsiyon
Đyon değişimi
Boyut eleme
51
2. Gaz Kromatografi
Gaz – sıvı
Gaz – katı
Sıvı kromatografi:
Daha önce de anlatıldığı gibi hareketli fazı sıvı olan kromatografi çeşitleri
dağılma kromatografisi, adsorbsiyon kromatografisi veya sıvı – katı kromatografi,
iyon değişimi kromatografisi ve boyut eleme veya jel kromatografisidir.
Tswett’in orijinal çalışmaları da dahil ilk sıvı kromatografi, çapı 1- 5 cm ve

uzunluğu 50 – 500 cm olan cam kolonlarında uygulanmıştır. Uygun akış hızları
temin etmek için, katı sabit fazı oluşturan partiküllerin çapı, genellikle 150 – 200 µm
aralığındaydı. Bu durumda bile, akış hızları düşüktü. Ayırma zamanları çok uzundu
ve çoğu zaman birkaç saat alıyordu. Bu klasik kromatografi işlemlerini hızlandırmak
için vakum veya basınç uygulama girişimleri de ayırma veriminin düşmesinden
dolayı yararlı olmadı. Sıvı kromatografinin geliştiği ilk yıllarda, bilim adamları,
kolon veriminin, dolguda kullanılan tanecik boyutunun azaltılması ile önemli ölçüde
artacağını göstermişlerdir. Bu teknoloji, klasik yer çekimi – akışlı sıvı
kromatografinin basit cam kolonlardaki durumun aksine, yüksek basınçta çalışan,
gelişmiş cihazlara ihtiyaç göstermekteydi. Böylece YPSK ismi, preparatif amaçla
kullanılan temel yöntemlerden, daha yeni işlemleri ayırt etmek için kullanılmaya
başlandı.
YPSK bütün analitik ayırma teknikleri arasında en yaygın kullanılanıdır.

Yöntemin bu kadar yaygın olmasının sebepleri, duyarlılığı, kantitatif tayinlere
uygulanabilir olması, uçucu olmayan türlerin veya sıcaklıkla kolayca bozunabilen
türlerin ayrılmasına uygun olması ve sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın birinci
derecede ilgilendiği ilaçlar ve gıda bileşenleri gibi maddelere geniş bir şekilde
uygulanabilirliğidir.
Kolon teknolojisindeki gelişmeler, yüksek basınçlı pompa sistemleri ve hassas

dedektörler sıvı kolon kromatografi yöntemini yüksek hızlı ve yüksek performanslı
52
ayırma kapasitesine ulaştırmıştır. Kolon teknolojisinde 2-5 mm çapında kolonlar ve

3-5 µm çapında küçük taneciklerin kullanılır. Böylece mobil ve sabit faz arasında
çok hızlı denge kurulur. Bu küçük tanecikli kolonlar için mobil fazı ml/dk akış
hızında akıtabilmek için 300 atm basıncı sağlayabilen pompa sistemleri gerekir.
Ayrıca µg seviyesinde analiz edilecek madde kullanıldığı için hassas dedektörlere
gerek vardır. Bu teknoloji ile yüksek hızda ayrım sağlanabilir ki uçucu olmayan veya
sıcakta bozunan maddelerin parçalanmadan veya bunların uçucu türevlerinin
hazırlanmasına gerek kalmadan bu yöntemle gaz kromatografisine üstünlükleri ile
ayrım sağlanabilir. Ayrıca özel şartlarda preparatif olarak da çalışılabilir.
Sabit faz, sıvı veya polimerlerin katı tanecikler üzerine ince bir film tabakası
olarak kaplanması veya kimyasal olarak bağlanması ile meydana gelir. Böylece
sabit ve mobil faz arasında kütle transferi direncini azaltarak hızlı bir dengenin
meydana gelmesi sağlanır.
53
Sıvı kromatografisi cihazları
Şekil 2.6. Bir YPSK cihazının şeması (SKOOG, WEST, HOLLER, 1998)
Hareketli faz (mobil faz) hazneleri ve çözücü muamele sistemleri
Modern bir YPSK cihazı, bir veya daha fazla her biri 200 – 1000 mL çözücü
içeren camdan veya çelikten yapılmış hazne içermektedir. Bu hazneler çoğunlukla
kolonda veya dedektör sisteminde gaz oluşturarak bozucu etkilere sebep olan
çözünmüş gazların giderilmesi için bir cihazla donatılmıştır. Çoğunlukla bu
sistemler, çözücü içinde bulunabilecek toz ve partikül halindeki maddelerin pompaya
veya enjeksiyon sistemine zarar vermemesi veya kolonu tıkamaması için toz ve
partikül maddeleri süzmeye yarayan bir süzme düzeneği de içerirler.
Sabit bileşimdeki tek bir çözücü kullanılarak yapılan bir ayırma izokratik
elüsyon olarak adlandırılır. Gradient elüsyonda ise polariteleri önemli derecede
birbirinden farklı iki veya üç çözücü sistemi kullanılır. Modern YPSK ekipmanları
çoğu zaman çözücülerin hacimsel oranı zamanla doğrusal olarak veya üstel olarak
değiştirilebilecek şekilde iki veya daha fazla hazneden aldığı çözücüleri bir
karıştırma odasında sürekli olarak değişen hızlarda bir araya getiren sistemlerle
donatılmıştır.
54
Pompalama sistemleri
Bir YPSK pompalama sistemi için gerekli şartlar şunlardır.
1) 400 atm’ye kadar basınç üretimi

2) Puls içermeyen basınç çıkışı
3) 0.1 – 10 mL/dakika aralığında akış hızları
4) % 0.5 veya daha iyi bir tekrarlabilirlikle akış kontrolü
5) Korozyona dayanıklı parçalar
Üç tip pompa vardır:
• Pistonlu pompalar: Genellikle motor kontrollü bir pistonun ileri ve geri

hareketiyle çözücünün pompalandığı küçük bir silindirden meydana
gelmiştir.
• Sürgülü pompalar: Bir kademeli motordan güç olan vidalı güdüm
mekanizması ile kumanda edilen sızdırmaz bir sürgüsü olan şırınga benzeri
silindirik bir kaptan ibarettir.
• Pnömatik Pompalar: Sıvı hareketli, sıkıştırılmış bir gaz ile
basınçlandırılabilen bir kap içine yerleştirilmiş, portatif bir kap içine konur.
Birçok YPSK cihazı çözücünün bileşimini ya sürekli ya da basamaklı olarak

değiştiren bir sisteme de sahiptir. Bu sistemde bilgisayarla kontrol edilen, pompa
çıkışına yerleştirilmiş bir geri tepme tıkacı boyunca basınç düşmesini belirleyerek
akış hızını ölçen bir sistemle donatılmıştır.
Numune enjeksiyon sistemleri
Daha önceki şırınga ile basit bir enjeksiyon sistemini takiben oluşturulan akış
durdurma enjeksiyonunda tekrarlanabilirliğin kötü olmasından dolayı, günümüzde en
yaygın olarak kullanılan yöntem numune giriş sarımlarının kullanılması esasına
dayanmaktadır. Bu sarımlar değiştirilebilir nitelikte olup 5 µL’den 500 µ L’ye kadar
değişen hacimlerde numune hacmi seçimine olanak tanımaktadır ve iyi bir
tekrarlanabilirlik vermektedir.
55
Sıvı kromatografi kolonları
Sıvı kromatografi kolonları normal olarak düzgün iç çaplı paslanmaz çelik

borulardan yapılır, ancak ara sıra kalın cidarlı cam borular da kullanılır. Sıvı
kromatografi kolonlarının büyük bir çoğunluğu 10 – 30 cm arasındadır. Kolonların iç
çapı çoğu zaman 4 – 10 mm ve yaygın olarak kullanılan birçok kolon dolgu
maddesinin tanecik büyüklüğü 5 – 10 µ m arasındadır. Son yıllarda üreticiler iç çapı 1
– 4.6 mm ve 3 – 5 µm tanecik büyüklüğüne sahip dolgu materyali ile doldurulmuş
kolonlar üretmektedirler. Bu kolonların yüksek tabaka sayısı, hız ve minimum
çözücü sarfiyatı gibi avantajları vardır.
Analitik kolonun ömrünü artırmak amacıyla analitik kolondan önce genellikle

kısa bir kolon yerleştirilir. Emniyet kolonu olarak da adlandırılan bu kolonların
görevi sadece partikül haldeki maddeleri ve çözücü içindeki yabancı maddeleri
tutmak değil, aynı zamanda numune içinde bulunan ve sabit faza tersinmez olarak
bağlanan bileşenleri de tutmaktır. Đlave olarak hareketli fazı sabit faz ile doyurarak
analitik kolondaki çözücü kaybının en aza indirilmesini sağlar.
Gerekli olduğu zaman kolon sıcaklığının uygun olarak ayarlandığı zamanlarda

daha iyi kromatogramlar elde edilmektedir. Birçok modern cihaz bu nedenden dolayı
kolon sıcaklığını ayarlayabilecek kolon ısıtıcıları ile donatılmıştır.
Sıvı kromatografide temel olarak iki tip kolon dolgu maddesi kullanılmaktadır.
Bunlar film dolgular ve gözenekli dolgulardır. Film dolgular küresel, gözeneksiz,
çapları 30 – 40 µm olan cam veya polimer tanelerinden oluşur. Bu tanelerin yüzeyine
silis, alumina, polistiren – divinil benzen sentetik reçinesi veya bir iyon değiştirici
reçineden oluşan ince gözenekli film ile kaplanmıştır. Gözenekli partiküller ise
çapları 3 – 10 µ m arasında olan gözenekli partiküllerdir. Partiküller silis, alumina,
polistiren divinil benzen sentetik reçinesi veya bir iyon değiştirici reçineden meydana
gelmiştir. Silis, sıvı kromatografide en yaygın kullanılan bir dolgu maddesidir ve
elde edilen partiküller çoğu zaman, yüzeye kimyasal olarak veya fiziksel bağlanan,
ince bir organik film ile kaplanır.
56
Dedektörler
Sıvı kromatografi dedektörleri temel olarak iki tiptir. Yığın özelliği dedektörleri
hareketli fazın kırma indisi, dielektrik sabiti ve yoğunluğu gibi analit tarafından
değiştirilen yığın özelliklerine cevap veren detektörlerdir. Bunun tersine analit
özelliği dedektörleri, analitin UV absorbansı, floresans şiddeti veya difüzyon akımı
gibi hareketli fazın sahip olmadığı, bazı özelliklerine cevap veren dedektörlerdir.
• Absorbans Dedektörleri: Kromatografik kolondan çıkan elüentlerin

absorbans ölçümü için içinden aktığı, Z şeklindeki tipik bir akış hücresinden
ibarettir. Filtreli absorbans dedektörlerinin en basiti bir civa lambası
kullanılan filtreli fotometrelerdir. Girişim filtresi bulunan döteryum veya
tungsten telli ışın kaynakları da, bir kolondan elüe edilen absorblayıcı türlerin
teşhisi için basit araçlardır. Monokromatörlü ultraviyole absorbans
dedektörleri optik ağlı spektrofotometreden oluşmaktadır. En güçlü
ultraviyole spektrofotometrik dedektörler spektrumun tamamı için gerekli
olan verileri yaklaşık bir saniyede toplayabilecek diyod serili cihazlardır.
Đnfrared absorbsiyon dedektörlerinden ilki dalga boyu taraması üç tane yarı
dairesel filtre kanalları ile yapılan cihazlardır. Diğeri ise fourier dönüşümlü
cihaza benzer olan infrared dedektörlerdir.
• Floresans dedektörler: Bunların çoğunda floresans, uyarıcı ışına 90
derecede yerleştirilmiş bir fotoelektrik dedektör yardımıyla gözlenmektedir.
En basit dedektörlerde uyarıcı ışık kaynağı olarak civa lambası ve yayılan
ışınların belli bir bandın izole etmek için bir veya birkaç filtre kullanılır. Daha
gelişmiş cihazlar, kaynak olarak ksenon lambası ve floresans ışımasını izole
etmek için ise optik ağ monokromatör kullanır.
• Kırılma indisi dedektörü: Bu dedektörde çözücü kolonun yolu üzerinde
bulunan hücrenin bir yarım bölmesinden geçer; elüent ise daha sonra diğer
bölmenin içinden geçer. Bu iki bölme, iki çözeltinin kırma indisi birbirinden
farklı ise, gelen ışın kırılacak şekilde uygun bir açıda yerleştirilmiş bir cam
plaka ile ikiye ayrılmıştır. Fotoduyarlı dedektörün yüzeyine gelen ışın
demetinin yolundan sapması, çıkış sinyalinin değişmesine sebep olur, bu
değişiklik yükseltilerek kaydedildiğinde kromatogram elde edilir.
57
• Buharlaştırmalı ışık saçma dedektörleri (Evaporation light scattering

dedector): Kolondan çıkan çözelti, bir sisleştirici içinden geçirilmekte ve
burada azot veya hava akımı ile çok ince sis haline dönüştürülmektedir.
Küçük damlalar daha sonra, hareketli fazın buharlaştığı ve tayin edilecek
maddenin çok küçük partiküllerinin oluştuğu sıcaklık kontrolü sürükleme
borusuna gönderilir. Tayin edilecek maddenin oluşturduğu partikül bulutu,
daha sonra bir lazer ışın demetinin içinden geçirilir. Akış yönüne dik açıda
saçılan ışınlar bir silisyum fotodiyod dedektör yardımıyla ölçülür.
• Elektrokimyasal dedektörler: Günümüzde çeşitli tipteki elektrokimyasal

dedektörler amperometri, polarografi, kulometri ve kondüktometri esasına
göre çalışmaktadır. Bu dedektörler duyarlılık, basitlik, kullanışlılık ve yaygın
kullanım alanı gibi çeşitli avantajlar sunmaktadır.
• Kütle spektrometrik dedektörler: Kütle spektrometre dedektörleri son

zamanlarda peptitler ve nükleotitler gibi uçucu olmayan ve termal olarak
kararlı, geniş bir madde grubu için spektrumlar veren dedektörlerdir. Bu
dedektörler kullanıldığında gözlenebilme sınırının 1 – 10 pg’a kadar düştüğü
rapor edilmiştir. Son zamanlarda hem elektron impakt hem de kimyasal
iyonlaşma spektrumu elde etmeyi mümkün kılan yeni tip bağlantılar piyasaya
çıkmıştır.
Dağılma Kromatografisi
Dağılma kromatografisi dört ayrı tip sıvı kromatografi içinde en yaygın

kullanılanıdır. Düşük ve orta mol kütleli iyonik olmayan polar moleküllerin bu
yöntemle analizi yanında son yıllarda türev hazırlama ve iyon çifti oluşturma gibi
teknikler kullanılarak iyonların ayrılması içinde yöntemler geliştirilmiştir. Dağılma
kromatografisi sıvı – sıvı ve bağlı – faz kromatografi olmak üzere iki alt sınıfa
ayrılabilir. Sıvı – sıvı kromatografide sıvı bir sabit faz dolgu maddesinin yüzeyine
fiziksel absorpsiyonla tutturulmuştur. Dezavantajlarından dolayı daha sonra bağlı faz
dağılma kromatografisi yöntemi geliştirilmiştir. Bağlı faz dolgu maddelerinin büyük
58
bir kısmı için kullanılan destek katıları rijit silis veya silis esaslı bileşimlerden
hazırlanmaktadır. En kullanışlı bağlı – faz kaplaması hidrolizlenmiş yüzeyin
organoklorosilan ile reaksiyonundan meydana gelen siloksanlardır.
Dağılma kromatografisi, hareketli ve sabit fazların bağıl polarlığına bağlı

olarak iki kısma ayrılır. Sıvı kromatografi ile yapılan ilk çalışmalar, silika veya
alümina partiküller üzerine tutturulmuş su veya trietilenglikol gibi oldukça polar
sabit faz ve heksan veya i-propil eter gibi nispeten az polar çözücüler
kullanılmaktaydı. Bu tip kromatografi normal kromatografi olarak
adlandırılmaktadır. Ters faz kromatografide sabit faz polardır ve çoğu zaman bir
hidrokarbondur. Hareketli faz ise su, metanol veya asetonitril gibi polar çözücülerden
meydana gelmektedir. Ters faz kromatografide kaplamalardaki siloksandaki R grubu
bir C8 veya C18 zinciridir. Piyasada bulunan normal – faz bağlı dolgu maddelerinde
siloksan yapısındaki R, siyano, diol, amino ve dimetilamino gibi polar fonksiyonlu
bir gruptur. Normal faz kromatografide en düşük polaritedeki bileşenler hareketli
fazda nispeten çok çözündükleri için en önde elüe edilirler ve hareketli fazın
polaritesindeki artış elüsyon zamanının azalması ile sonuçlanır. Bunun aksine ters –
faz yönteminde en çok polar bileşenler en önde yürür ve hareketli fazın
polaritesindeki artış, elüsyon zamanını artırır.
Adsorbsiyon Kromatografisi
Adsorbsiyon veya sıvı – katı kromatografi yirminci yüzyılın başlarında Tswett

tarafından ilk olarak ortaya atılan klasik bir sıvı kromatografi tipidir. Bu yöntemde
kullanılan sabit fazlar sadece silis ve alüminadır. Đlk sabit faz, yüksek numune
kapasiteli ve kullanışlı değişik tipleri olduğu için uygulamaların çoğunda tercih
edilmektedir. Bu kromatografi çeşidi mol kütlesi yaklaşık 5000’den küçük olan polar
olmayan bileşikler için en uygundur. Genellikle polar olmayan çözücülerde
çözülebilen ve ters – faz dağılma kromatografide kullanılan sulu çözücülerde sınırlı
çözünürlüğü olan numuneler için en uygun yöntemdir. Adsorbsiyon kromatografinin
diğer yöntemlerde görülmeyen özel bir gücü, izomerik karışımların bileşenlerini
ayırma kabiliyetidir.
59
Đyon – Değiştirme Kromatografi
Çoğu zaman iyon kromatografi olarak da adlandırılan bu kromatografi çeşidi

iyon değiştirici reçinelerin kullanımına dayanan iyonların ayrılması ve tayini için
modern ve etkili bir yöntemdir. Daha önceden bu teknikte kullanılan stiren ve
divinilbenzenin kopolimerizasyonu ile oluşan gözenekli polimerik taneciklerin, analit
moleküllerin mikrogözeneklerden geçmesi, polimer matriksindeki difüzyonun yavaş
olması ve matriksin sıkıştırılabilmesinden dolayı yeni tip dolgu maddeleri
geliştirilmiştir. Bunlardan biri yüzeyi bağıl olarak büyük, gözenekli olmayan küresel
sentetik iyon değiştirici reçine ile kaplanmış cam veya polimer tanelerden meydana
gelen zar kaplamalı yatak dolgusudur. Đkinci bir tipteki dolgu maddesi, adsorbsiyon
kromatografide kullanılan silisten ibaret gözenekli mikropartiküllerin, iyon
değiştiricinin ince bir filmi ile kaplanmasıyla hazırlanır. Đyon değiştirme
kromatografinin inorganik uygulamaları elüent baskılayıcı kolonlu iyon – değiştirme
kromatografi ve tek kolonlu iyon kromatografi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu
kromatografi çeşidi ilaçlar ve bunların metabolitleri, serumlar, gıda koruyucu
maddeler, vitamin karışımları, şekerler ve farmasötik preparatlar gibi çok farklı
organik ve biyokimyasal sistemlere uygulanmaktadır.
Đyon eleme kromatografi, iyonlardan çok nötral türlerin ayrılmasından dolayı

tam bir iyon kromatografisi çeşidi olmamasına rağmen, iyon – değiştirici kolonlar
kullanılmaktadır. Bu kromatografi çeşidi iyon – eleme kromatografi süt, kahve, şarap
ve diğer ticari ürünler gibi çok sayıdaki maddenin teşhisi ve tayini için kullanılabilir.
Boyut Eleme Kromatografi
Jel geçirgenlik veya jel süzme kromatografi adı da verilen bu kromatografi

çeşidi özellikle yüksek mol kütleli türlere uygulanabilen güçlü bir tekniktir. Dolgu
maddeleri, çözünen madde ve çözücü moleküllerinin içine difüzlenebileceği düzgün
bir gözenek ağı içeren küçük boyutlu silis veya polimer partiküllerden meydana
gelmiştir. Gözenekler içinde moleküller etkin bir şekilde yakalanır ve hareketli faz
akımı ile uzaklaştırılır. Gözenek içinde ortalama kalma süresi, analit molekülünün
etkin büyüklüğüne bağlıdır.
60
Jel süzme kromatografisinde sulu çözücüler ve hidrofilik dolgu maddeleri

kullanılırken, jel süzme kromatografisinde polar olmayan organik çözücüler ve
hidrofobik dolgu maddeleri kullanılır. Eleme sınırı birkaç bin olan bir jel, proteinleri,
amino asitlerden ve düşük mol kütleli peptitlerden kolayca ayrılabilir. Diğer
uygulamaları ise, homologların ve oligomerlerin ayrılması, büyük polimer veya
doğal ürünlerin mol kütlelerinin veya mol kütlesi dağılımının hızlı bir şekilde tayin
edilmesidir.
2.1.3.1. Sistem Uygunluk Testleri
Kromatografik yöntemlerin kabul edilebilir doğruluk ve kesinlikte olduğunu

belirten Sistem Uygunluk Testleri (SUT) için gerekli işlem ve hesaplamalar yöntem
geliştirilmesi ve validasyon işlemlerinin tamamlanmasından sonra veya işlemler
sırasında yapılır.
Avrupa Farmakopesi tarafından tanımlanan SUT parametreleri
• Teorik Tabaka (Plaka) sayısı (N)

• Kuyruklanma Faktörü (T)
• Kapasite Faktörü (k)
• Seçicilik faktörü (α)
• Ayırım Gücü (Resolution) (Rs)
• Pik yüksekliği veya alanının % Bağıl standart sapması
• Cihaz tekrarlanabilirliği
Bu kriterlerden en az 2 tanesinin gerekli şartları sağlaması yöntemin sistem
uygunluğunu göstermektedir.
Teorik Tabaka Sayısı (N)
Kolonun en önemli parametresidir. Kolondan çıkan pikin sivri ve dar olması ve

piklerin birbirlerinden iyi ayrılması ile ilgilidir. N’in sayısal değeri, analizi yapılan
maddenin cinsine bağlı olduğu gibi, deney koşullarına, akış hızı, sıcaklık, kolon
61
kalitesi ve dolumun tek biçimliliği gibi çeşitli faktörlere de bağlıdır. Tavsiye edilen
değer N> 2000’dir.
Alıkonma zamanı
Pik genişliği
Şekil 2.7. Teorik tabaka sayısı hesabını gösterir kromatogram (KAZAKEVICH ve

LoBRUTTO, 2007)
2
t 
N = 16 R 
W 
tR: Maddenin alıkonma zamanı
W : Elde edilen pikin taban genişliği
Kuyruklanma faktörü (T) ve Asimetri faktörü (AS)
Bu faktör pikin simetrik olması ile ilgilidir. Çalışmalarda daima simetrik pikler
seçilmelidir. Simetrik olmayan piklerde;
1. Doğru olmayan tabaka sayısı ve ayırım gücü sonuçları

2. Kararlı olmayan miktar tayinleri
3. Gözlemlenemeyen pik kuyruklanmaları
4. Alıkonmanın tekrarlanabilirliğinin düşük olması gibi sorunlarla karşılaşılır.
62
Pik asimetrisi taban yüksekliğinin % 10’u civarında, kuyruklanma faktörü

ise % 5’i civarında ölçülür. Uygun değerler pik asimetrisi için 0.95 – 1.2 arasında,
kuyruklanma faktörü için ise 2’nin altında olmasıdır.
Pik
Pik kuyruğu
önü
Pik maksimumu
Şekil 2.8. Pik asimetri faktörü ve kuyruklanma faktörü hesabını gösterir kromatogram (USP
23, NF 18, 1995)
Kapasite Faktörü (k’)
Analizi yapılan maddelerin alıkonma zamanları veya alıkonma hacimleri

yardımı ile hesaplanır. Kolonun performansı ve alıkonmanın uzun süreli
tekrarlanabilirliği ile ilgilidir.
Şekil 2.9. Kapasite faktörü hesabını gösterir kromatogram (SKOOG, WEST, HOLLER,
1998)
63
tr − t0 Vr − V0
k′ = =
t0 V0
tr/Vr : Maddenin alıkonma zamanı / hacmi

t0/V0 : Hareketli fazın alıkonma zamanı / hacmi
Elde edilen bu değerin genel çalışmalarda 2 – 8 arasında, eser madde miktar

tayininde 1 – 3 arasında, stabilite belirleyici çalışmalarda ise 4’ten büyük olması
istenir.
Seçicilik Faktörü (α)

Bağıl alıkonmayı ifade eder.
t2 − t0
α=
t1 − t0
t1: 1. maddenin alıkonma zamanı

t0: Hareketli fazın alıkonma zamanı
2 pikin elde edildiği sistemlerde kullanılır. Genel olarak bu değerin 1’den büyük
olması istenir.
Ayırım Gücü (Resolution (RS))
Ayırım kantitatif kromatografi çalışmalarının başlıca gerekliliğidir. Genellikle 5

veya daha az madde içeren numunelerde bu değerin 1.5’dan büyük olması kolaylıkla
sağlanabilir. Bu sonuç, maksimum kesinliğin göstergesidir. Ayırım gücü, bir kolonun
eskiliğini, günler arası ayırım şartlarındaki değişiklikleri gösterir.
64
Şekil 2.10. Rezolüsyon faktörünün kromatogramlara göre değişimi (SKOOG, WEST,

HOLLER, 1998)
2(t 2 − t1 )
Rs =
W1 + W2

W1: 1. maddenin taban genişliği
W2: 2. maddenin taban genişliği
Genel ayırımlarda bu değer 2’nin, miktar tayini çalışmalarında 1.5’un, biyolojik
sıvılardan yapılan çalış malarda 1.2’nin üstünde olması kabul edilebilir değerlerdir.
Cihaz, Pik Alanı veya Yüksekliğinin Tekrar Edilebilirliği
En az 6 defa tekrarlanan deneyler sonucu elde edilen pik alanı veya

yüksekliklerinin bağıl standart sapmalarının hesaplanması ile elde edilir. Genel
ayırımlarda % bağıl standart sapma değerinin 1.5’un, biyolojik sıvılardan yapılan
çalışmalarda 5.0’ın altında olması ve eser madde miktar tayininde 5 – 15 arasında
65
olması istenen değerlerdir. Cihaz tekrarlanabilirliği için alıkonma zamanlarının %

bağıl standart sapmasının 5’den daha çok sayıda tekrar edilen enjeksiyonlar için %
1’den küçük olması istenir.
66
2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Orijinleri
1. Estradiol valerat…………………… Eczacıbaşı
2. Dienogest…………………………...Schering
3. Metanol……………………………..Riedel
4. Asetonitril………………………… LabScan
5. NH4NO3………………………….…Merck
Bu etken maddeler ve çözeltiler ayrıca bir saflaştırma işlemi uygulamaksızın

doğrudan deneylerde kullanılmıştır
2.3. Kullanılan Cihazlar
1. UV-Visible spektrofotometre : SHIMADZU UV – 1601
2. Manyetik Karıştırıcı : VELP SCIENTIFICA ARE
3. IR spektrofotometre : JASCO FT/IR – 420 Fourier
4. Erime noktası tayin cihazı : BUCHI SMP – 20
5. Terazi : OHAUS ADVENTURER-PRO
6. pH metre : WTW pH 538
7. YPSK : Agilent 1100
8. Ultrasonik banyo : P SELECTA
2.4. Kullanılan Bilgisayar Programları
1. Multivariate Analysis Add-in for MS Excel v1.3 software (Brereton, 2002)
2. UV-PC 1601
3. Microsoft Excel 2003

67
4. Microsoft Word 2003
2.5. Kullanılan Bilgisayar Konfigürasyonu
Intel® Celeron® CPU 2,26 GHz, 1 GB RAM Masaüstü Bilgisayar
2.6. Üzerinde Çalışma Yapılan Farmasötik Preparat
CLIMODIEN® Draje (Schering) (71112 E)
Estradiol valerat………2 mg
Dienogest …………….2 mg / draje
2.7. Standart Maddelerin Stok Çözeltileri
2.7.1. Türev spektrofotometride
Estradiol valerat; metanol - su (3:1, v/v) karışımı içerisinde 250 mg / 500 mL

çözeltisi
Dienogest; metanol - su (3:1, v/v) karışımı içerisinde 20 mg / 100 mL

çözeltisi
2.7.2. Kemometrik yöntemlerde
Estradiol valerat için; metanol - su (3:1, v/v) karışımı içerisinde 250 mg / 500
mL çözeltisi
68
Dienogest için; metanol - su (3:1, v/v) karışımı içerisinde 20 mg / 100 mL

çözeltisi
2.7.3. YPSK de
Estradiol valerat; asetonitril içerisinde 25 mg / 100 mL çözeltisi
Dienogest; asetonitril içerisinde 10 mg / 100 mL çözeltisi
Siproteron asetat; asetonitril içerisinde 5 mg / 100 mL çözeltisi
3.33 x 10-2 M amonyum nitrat çözeltisinin hazırlanması (pH:5.4): 1.3356 gram
NH4NO3 bir miktar suda çözülür ve 500 mL’ye tamamlanır.

69
3. BULGULAR
3.1. Kullandığımız Etken Maddelerin Saflık Kontrolleri
Deneylerde kullanılan standart maddeleri saflık kontrolleri için; erime

noktaları, UV spektrumları ve IR spektrumları alınmış ve referanslarla
karşılaştırılmıştır.
3.1.1. DNG için saflık kontrolü
UV spektrumu : DNG’in metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltisinin 200 –

400 nm arasındaki spektrumu Şekil 3.1’de görülmektedir. Bu spektrumda 215.6 nm
ve 308.0 nm’de iki tane maksimum 258.2 nm’de bir adet minimum görülmektedir.
IR spektrumu : KBr diski halinde basılmış DNG’in 400 – 4000 cm-1

arasındaki IR spektrumunda temel pikler görülmüştür. (Şekil 3.2)
Erime Noktası : DNG’in erime noktası 204 – 214 oC aralığındadır.
3.1.2. EV için saflık kontrolü
UV spektrumu : EV’ın metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltisinin 200 – 400

nm arasındaki spektrumu Şekil 3.3’de görülmektedir. Bu spektrumda 207.4 ve 278.8
nm’lerde iki adet maksimum ve 246.4 nm’de bir adet minimum gözlenmektedir.
IR spektrumu : KBr diski halinde basılmış EV’ın 400 – 4000 cm-1 arasındaki
IR spektrumunda temel pikler 1245, 1054, 1227, 1493, 1276, 821 cm-1’de
görülmektedir (Şekil 3.4). Bu da referansla uyum göstermiştir (ISOLATION AND
IDENTIFICATION OF DRUGS, CLARKE’S).
Erime Noktası: EV’ın erime noktası 144 oC’dir.

70
Şekil 3.1. Metanol-su (3:1) içerisinde 12 µg/mL DNG çözeltisinin UV absorpsiyon

spektrumu
71
Şekil 3.2. DNG’in IR spektrumu
71
72
Şekil 3.3. Metanol - su (3:1) içerisinde 120 µg/mL EV çözeltisinin UV absorpsiyon

spektrumu
73
Şekil 3.4. EV’ın IR spektrumu
73
74
3.2. Kemometrik Tekniklerle Spektroskopik Verilerin Değerlendirilmesi

Yöntemleri ile Elde Edilen Sonuçlar
3.2.1. Kemometrik çalışmalar
Estradiol Valerat (EV) ve dienogest (DNG)’in metanol – su (3:1) karışımı

içerisindeki çözeltilerinin 200-400 nm arasındaki UV spektrumları (Şekil 3.5)
çizdirildiğinde 200-300 nm’ler arasında EV ve DNG’in spektrumlarının girişim
yaptığı görülmektedir. Dolayısıyla karışımlarında her iki etken maddenin aynı anda
hiçbir ayırma işlemi gerekmeksizin miktar tayinlerinin doğrudan bu spektrum
aralığında absorbans değerlerinin ölçülmesi ile yapılması mümkün değildir. Şekil 3.5
de görüldüğü gibi 300-360 nm arasındaki bölgede DNG’in EV’ın girişimi
olmaksızın doğrudan absorbans değerinin ölçülmesiyle tayini yapılabilmesine
rağmen EV için böyle bir aralık bulunmamaktadır. Bu nedenle karışımlarında DNG
ve EV’ın, miktar tayinlerinin bu iki maddenin karışımlarının çözeltilerinde okunan
absorbans değerlerinin kemometrik yöntemler kullanılarak değerlendirilmesi ile
yapılabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla TBR ve KEK yöntemleri uygulanmış ve bu
yöntemlerden iyi sonuçlar alınmıştır.
a b
Şekil 3.5. Metanol - su (3:1) içerisinde a) 120 µg/mL EV, b) 12 µg/mL DNG
75
3.2.2. Dienogest – Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol

Valerat’ın, TBR Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde
Kullanılması ile Miktar Tayini:
Öncelikle; dalga boyu aralığı ve ∆λ belirlenmesi için çalışmalar yapılmıştır.

Bu çalış malar sonucunda bu yöntemden en iyi sonuçların; DNG için 300 -350 nm
aralığında ∆λ = 1 nm aralıkla 51 dalga boyunda, EV için ise 260-300 nm aralığında
∆λ = 1 nm aralıkla 41 dalga boyunda absorbans değerlerinin ölçülmesi ile elde
edildiği bulunmuştur..
Bu karışımda her iki maddenin de miktar tayini için EV ve DNG nin metanol -
su (3:1) içerisinde değişik konsantrasyonlarındaki karışım çözeltilerinden hazırlanan
kalibrasyon setine (Çizelge 3.1) temel bileşen regresyonu yöntemi paket programlar
kullanılmak suretiyle uygulanmış ve kalibrasyon verileri elde edilmiştir..
Kalibrasyon seti hazırlanırken kullanılan karışım konsantrasyonları Çizelge 3.1’de
gösterilmiştir..
Yapılan çalış malarda 25 karışım numunesinde 2 temel bileşen alındığında
DNG, 5 temel bileşen alındığında EV için en iyi sonuçların elde edildiğ i
bulunmuştur. Bu yöntemde lineer kalibrasyon aralığının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL,
EV için ise 20.0 – 270.0 µg/mL olduğu saptanmıştır.
Yöntemde tayin alt sınırı (TAS) DNG ve EV için sırasıyla 2.0 µg/mL ve 20.0
µg/mL olarak seçilmiş yakalama sınırı (YS) ise DNG için 0.2 µg/mL ve EV için 2.5
µg/mL olarak bulunmuştur. TAS hesaplamasında RIBONE ve ark. 2001 ın
çalışmasındaki işlemler temel alınmıştır. Bu işlemler: TAS = 3 || ε || || b || den
hesaplanmıştır.
Bu paket programlar içerisinde en iyi sonucu alabilmek için ön işlem

yapmadan, ortalama merkezli (mean center) ve standardize edilmiş veriler denenmiş,
bunların içerisinde en uygun analiz sonuçlarının aşağıda gösterilen formüle göre
ortalama merkezli verilerle ulaşıldığı gözlenmiştir.
Z = x - x¯
Burada z ortalama merkezli değer, x veri, x¯ ortalamadır. Kullandığımız paket

programlarla çalışma (kalibrasyon) setindeki konsantrasyonlara (Çizelge 3.1) karşılık
76
gelen score matrisleri ve okunan absorbanslara karşılık gelen loading (yükleme)

matrisleri kurulmuştur. Sonra aynı işlem bilinmeyen konsantrasyonlarda bu iki etken
maddeyi içeren karışımlara uygulanmış ve elde edilen veriler kalibrasyon regresyonu
yardımıyla hesaplanmıştır.
Standart çözeltilerden hareketle hazırlanan sentetik karışımlara yöntem
uygulandığında elde edilen ortalama % geri kazanım ve % bağıl standart sapma
değerleri Çizelge 3.2’de gösterilmiştir. Buna göre; ortalama % geri kazanım ve bağıl
standart sapma (BSS) değerleri sırasıyla DNG için % 99.33 ve % 0.34, EV için ise %
100.48 ve % 1.58 olarak bulunmuştur.
77
Çizelge 3.1. DNG ve EV için TBR ve KEK yönteminde kullanılan kalibrasyon seti
DNG EV
Karışım No
µg/mL µg/mL
1 16 120
2 2 120
3 2 20
4 24 270
5 8 270
6 24 60
7 16 270
8 8 120
9 8 60
10 20 60
11 24 200
12 20 270
13 16 200
14 24 120
15 24 270
16 2 270
17 20 20
18 2 200
19 16 20
20 20 120
21 20 200
22 8 200
23 2 60
24 8 20
25 16 60
78
Çizelge 3.2. DNG ve EV’ın standart karışımları için TBR yöntemiyle elde edilen ortalama
KONULAN BULUNAN GERĐ KAZANIM

KARIŞIM µg/mL µg/mL (%)
NO
DNG EV DNG EV DNG EV
1 12 90 11.87 87.60 98.94 97.33
2 12 120 11.92 121.02 99.30 100.85
3 12 150 11.90 151.96 99.13 101.31
4 8 120 7.96 120.70 99.56 100.58
5 12 120 11.90 121.95 99.18 101.63
6 20 120 19.98 121.40 99.88 101.17
* x 99.33 100.48
** SS 0.34 1.58
***BSS % 0.34 % 1.58

****
GA(p=0.05 için) x ± 0.36 x ± 1.30
* x : Ortalama
** SS : Standart sapma
*** BSS : Bağıl standart sapma
t.s
**** GA : Güven aralığı :
n
79
3.2.3. Dienogest – Estradiol Valereat Karışımında Dienogest ve Estradiol

Valerat’ın, KEK Yönteminin Spektrofotometrik Analizlerde Kullanılması ile
Miktar Tayini:
Temel bileşen regresyonunda olduğu gibi kısmi en küçük kareler yönteminde

de en iyi sonuçlar; DNG için 300 - 350 nm aralığında ∆λ = 1 nm aralıkla 51 dalga
boyunda, EV için ise 260-300 nm aralığında ∆λ = 1 nm aralıkla 41 dalga boyunda
absorbans değerlerinin ölçülmesiyle elde edildiği bulundu.
Bu karışımda her iki maddenin de miktar tayini için bu maddelerin

konsantrasyonlarını içeren metanol - su (3:1) içerisindeki karışım çözeltilerinin
kalibrasyon setine (Çizelge 3.1) temel bileşen regresyonu yöntemi paket programlar
kullanılmak suretiyle uygulanmıştır. Kalibrasyon seti hazırlanırken kullanılan
karışım konsantrasyonları Çizelge 3.1’de görülmektedir. Bu kalibrasyon seti TBR
yönteminde de kullanılan settir.
Yapılan çalış malarda 25 karışım numunesinde 1 temel bileşenin alındığında

DNG, 3 temel bileşen alındığında EV için en iyi sonuçların elde edildiği bulundu. Bu
yöntemde lineer kalibrasyon aralığının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL, EV için ise 20.0
– 270.0 µg/mL olduğu saptandı.
Yöntemde tayin alt sınırı DNG ve EV için sırasıyla 2.0 µg/mL ve 20.0 µg/mL,
yakalama sınırı ise DNG için 0.2 µg/mL ve EV için 2.5 µg/mL olarak bulunmuştur.
TAS hesaplamasında RIBONE ve ark. 2001 ın çalışmasındaki işlemler temel
alınmıştır. Bu işlemler: TAS = 3 || ε || || b || den hesaplanmıştır.
Bu paket programlar içerisinde en iyi sonucu alabilmek için ön işlem

yapmadan, ortalama merkezli (mean center) ve standardize edilmiş veriler denenmiş,
bunların içerisinde en uygun analiz sonuçlara ortalama merkezli verilerle ulaşıldığ ı
gözlenmiştir.
80
Çizelge 3.3. DNG ve EV’ın standart karışımları için KEK yöntemiyle elde edilen ortalama

KARIŞIM µg/mL µg/mL (%)
NO
1 12 90 11.87 87.64 98.89 97.38
2 12 120 11.90 121.14 99.16 100.95
3 12 150 11.90 152.03 99.14 101.35
4 8 120 7.95 120.82 99.39 100.68
5 12 120 11.87 122.01 98.95 101.68
6 20 120 19.91 121.46 99.57 101.21
x 99.18 100.54
SS 0.26 1.59
BSS % 0.26 % 1.58
GA(p=0.05 için) x ± 0.27 x ± 1.67

81

uygulandığında elde edilen ortalama % geri kazanım ve bağıl standart sapma
değerleri Çizelge 3.3’de gösterilmiştir. Buna göre; ortalama % geri kazanım ve bağıl
standart sapma (BSS) değerleri sırasıyla DNG için % 99.18 ve % 0.26, EV için ise %
100.54 ve % 1.58 olarak bulunmuştur.
3.2.4. ANOVA testi
DNG + EV karışımlarının metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin gün

içi absorbans değerleri okunarak (2’şer saat aralıkla 5 kez) ve günler arası değerleri
(3 gün boyunca) okunarak temel bileşen regresyonu ve kısmi en küçük kareler
yöntemleri uygulanmış ve bunların sonucunda DNG + EV karışımlarında hesaplanan
DNG ve EV miktarları ANOVA testi ile karşılaştırılmış ve elde edilen sonuçlar
Çizelge 3.13’de gösterilmiştir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F değerlerinin
serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge değeri olan 5.91 değerinden küçük olduğu
gözlenmiştir. DNG için TBR yönteminde güniçi ve günler arası bağıl standart sapma
değerleri sırasıyla % 0.46 ve 0.87, KEK yönteminde % 0.66 ve 0.76’dır. EV için
TBR yönteminde güniçi ve günler arası bağıl standart sapma değerleri sırasıyla %
0.25 ve 0.42, KEK yönteminde ise bu değerler sırasıyla % 0.19 ve 0.36’dır.
82
3.2.5. TBR ve KEK yöntemlerinin farmasötik preparatlara uygulanması:
3.2.5.1. Seçicilik
Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN® draje preparatına uygulamasının
yapılması için de çalış malar yapılmıştır. Amacımız etken maddelerin miktarını tayin
etmek olduğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin yöntemi
etkilemediğinin saptanması gerekir. Bu nedenle CLIMODIEN® draje preparatının
hazırlanan çözeltilerine standart olarak ayrı ayrı DNG ve EV ilave edilerek (DNG
için %25, %50 ve %75; EV için % 50, % 100 ve % 150 oranında ilave yapılarak)
miktar tayini yapılmış ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi
etkilemediği bulunmuştur (Çizelge 3.4 ve 3.5).
83
Çizelge 3.4. Preparatlara standart ilavesinden sonra TBR yöntemi ile hesaplanan DNG ve
EV miktarları
KARIŞIM NO
(%)
DNG EV DNG EV
DNG EV
µg/mL µg/mL µg/mL µg/mL
1 2.5 10.0 2.55 10.15 101.92 101.46
2 2.5 10.0 2.52 9.97 100.66 99.67
3 5.0 10.0 5.18 10.19 103.50 101.87
4 5.0 10.0 5.05 10.06 101.04 100.59
5 7.5 10.0 7.75 10.32 103.37 103.21
6 7.5 10.0 7.77 10.36 103.66 103.62
7 5.0 5.0 5.20 5.09 104.04 101.86
8 5.0 5.0 5.17 5.06 103.30 101.23
9 5.0 15.0 5.29 15.73 105.77 104.86
10 5.0 15.0 5.22 15.51 104.44 103.42
x 103.17 102.18
SS 1.56 1.57
BSS % 1.51 % 1.54
GA(p=0.05 için) x ± 1.12 x ± 1.12

84
Çizelge 3.5. Preparatlara standart ilavesinden sonra KEK yöntemi ile hesaplanan DNG ve
EV miktarları
GERĐ KAZANIM
KONULAN BULUNAN
(%)
KARIŞIM
NO
DNG EV DNG EV
DNG EV
1 2.5 10.0 2.54 10.13 101.70 101.33
2 2.5 10.0 2.51 9.96 100.51 99.56
3 5.0 10.0 5.17 10.17 103.31 101.70
4 5.0 10.0 5.04 10.05 100.87 100.46
5 7.5 10.0 7.74 10.32 103.21 103.19
6 7.5 10.0 7.76 10.35 103.51 103.53
7 5.0 5.0 5.19 5.08 103.84 101.60
8 5.0 5.0 5.16 5.05 103.13 101.00
9 5.0 15.0 5.28 15.72 105.55 104.78
10 5.0 15.0 5.21 15.50 104.19 103.35
x 102.98 102.05
SS 1.54 1.61
BSS % 1.50 % 1.58
GA(p=0.05 için) x ± 1.12 x ± 1.10

85
3.2.5.2. Farmasötik preparata uygulama:
6 adet CLIMODIEN® draje tartılmış ve 25 mL’lik balon jojede metanol - su

(3:1) içerisinde çözülmüştür. 30 dakika manyetik karıştırıcıda karıştırıldıktan sonra
süspansiyon, Whatman No:42 kağıdından süzülerek süzüntüden alınan 6.25 mL’lik
kısım 25 mL’lik balon joje içerisinde metanol – su (3:1) çözeltisi ile tamamlanmıştır.
Yöntem bu çözeltilere uygulandıktan sonra elde edilen sonuçlar Çizelge 3.6 ve
3.7’de gösterilmiştir.
86
Çizelge 3.6. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına TBR yöntemi uygulandığında DNG ve

EV için elde edilen sonuçlar (preparatın üzerinde yazılı miktar:2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
DNG EV
DENEY NO
(mg) (mg)
1 2.05 2.03
2 2.05 1.93
3 2.07 1.99
4 2.07 2.04
5 2.07 2.04
6 2.07 2.05
x 2.06 2.01
SS 0.01 0.05
*
SH ±0.00 ±0.02
**
BH % 3.16 % 0.70
* s
S.H. : Standart hata : ( )
n
n
xn − x
**
∑(
1 x
.100)
B.H. : Bağıl hata : ( )
n
87
Çizelge 3.7. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına KEK yöntemi uygulandığında DNG ve

EV için elde edilen sonuçlar (2 mg DNG + 2 mg EV/draje)
DNG EV
DENEY NO
(mg) (mg)
1 2.07 2.02
2 2.07 2.03
3 2.05 2.01
4 2.05 1.93
5 2.07 2.04
6 2.07 1.98
x 2.06 2.00
SS 0.01 0.04
SH ±0.00 ±0.02
BH % 3.17 % 0.08
88
3.2.6. Kemometrik yöntemlerle elde edilen sonuçlara göre TSH, KSH ve THKT
değerlerinin hesaplanması
Temel bileşen regresyonu ve kısmi en küçük kareler yöntemlerinde elde

edilen veriler değerlendirilmiş ve aşağıdakiler hesaplanmıştır :
a) TSH : Tahmindeki standart hata :
∑ ( cî – ci ) 2
i =1
TSH =
m
formülü yardımıyla hesaplanmış ve elde edilen değerler Çizelge 3.8 ve 3.9’de

gösterilmiştir.
Burada ci i. numunenin referans (bilinen) konsantrasyonu, ^ci ise i. numunenin

bulunan konsantrasyondur.
b) KSH : Kalibrasyondaki standart hata :
∑ (cî – ci ) 2
i =1
KSH =
m–2
formülü yardımıyla hesaplamış ve elde edilen değerler Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de
gösterilmiştir.

m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur.
c) THKT : Tahmin hatalarının karelerinin toplamı:
m
THKT = ∑ ( cî – ci ) 2
i =1
89
formülü yardımıyla hesaplamış ve elde edilen değerler Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de
gösterilmiştir.

m kalibrasyon standardı için tahmin edilen konsantrasyondur.
Ayrıca, konulan ile bulunan değerler grafiğe geçirildiğinde elde edilen
doğrunun korelasyon katsayısı (r), eğimi ve kesimi de aynı çizelgelerde
gösterilmiştir.
Yöntemde hesaplanan TSH, KSH, r, kesim, eğim, RMS ve THKT değerleri
Çizelge 3.8 ve Çizelge 3.9’de gösterilmiştir.
90
Çizelge 3.8. DNG + EV karışımı analizinde uygulanan TBR yöntemindeki parametreler
TSH KSH r Kesim Eğim RMS THKT
DNG 0.00948 0.0979 0.9990 0.1347 0.9848 0.319969 2.2523
EV 0.676187 0.23953 0.9996 -1.1776 1.0168 0.538477 5.509188
Çizelge 3.9. DNG + EV karışımı analizinde uygulanan KEK yöntemindeki parametreler
TSH KSH r Kesim Eğim RMS THKT
DNG 0.01193 0.098634 0.9989 0.1416 0.9821 0.31406 2.268578
EV 0.71302 0.250931 0.9996 -1.2630 1.0181 0.524242 5.771418
r’nin 1’e yakın olması konulan ile bulunan miktarlar arasındaki doğrusal
ilişkinin çok iyi olduğunu göstermektedir.
91
3.2.7. Şekil 3.5’de görüldüğü gibi DNG + EV karışımının metanol – su (3:1)
içerisindeki UV spektrumlarında 308,2 nm’de DNG’in EV’ın etkisi olmaksızın
miktar tayininin yapılabileceği görülmektedir. Bu konuda yapılan çalışmalarımız
308,2 nm’de EV’ın çok küçük de olsa absorpsiyona katkısının var olduğunu
göstermiştir.
Seçilen farmasötik preparatta bu dalga boyunda DNG’in miktar tayini
yapmaya çalışıldığında ise DNG için kötü sonuçlar elde edilmiştir.

92
3.3. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Miktar Tayini Çalışmaları
DNG + EV karışımında DNG ve EV’nin aynı anda miktar tayinlerini
yapabilmek için türev spektrofotometri yöntemi kullanılmıştır. Bu amaçla çeşitli
türevleri alınmış (Şekil 3.7 – 3.10) ama en iyi ayrımın 1. türevde (1D) olduğu
görülmüştür.
a b
Şekil 3.6. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV, b) 12 µg/mL DNG çözeltilerinin
UV absorpsiyon spektrumları
birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
93
ikinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
üçüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
94
Şekil 3.10. Metanol - su (3 : 1) içerisinde 120 µg/mL EV ve 12 µg/mL DNG çözeltilerinin

dördüncü türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
3.3.1. DNG – EV Karışımında Dienogest ve Estradiol Valerat’ın 1D ile Miktar

Tayini:
Yaptığımız çalışmalarda DNG’in miktar tayinini yapabilmek için öncelikle
DNG ve EV’ın metanol - su (3:1, v/v) içerisindeki spektrumlarının 200 – 400 nm
arasındaki birinci türevi alınarak sıfırı kestiği noktalar belirlenmiştir (Şekil 3.7).
Buna göre; EV’nin 1. türevinde sıfırı kestiği 247.2 nm, 279.0 nm ve 328.8 nm ler
DNG’in tayini için belirlenmiş; aynı şekilde DNG’in 1. türevinde sıfırı kestiği nokta
olarak da 258.4 nm EV’ın tayini için belirlenmiştir (Şekil 3.11-3.18). EV’ın sıfırı
kestiği noktalardan 328.8 nm’deki değerlerin DNG’in tayini için diğer dalga
boylarına göre daha iyi sonuçlar verdiği yapılan denemeler sonucunda görülmüştür
(Çizelge 3.10.).
95
d
a
c
b
Şekil 3.11. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG b) 90 µg/mL EV c) 120 µg/mL

EV ve d) 150 µg/mL EV çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
a
b
c
d
Şekil 3.12. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG b) 90 µg/mL EV c) 120 µg/mL

EV ve d) 150 µg/mL EV çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktör:30, ∆λ=2 nm)
96
c
a
b
Şekil 3.13. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV b) 8 µg/mL DNG c) 12 µg/mL

DNG ve d) 20 µg/mL DNG çözeltilerinin UV absorpsiyon spektrumları
d
c
b
Şekil 3.14. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 120 µg/mL EV b) 8 µg/mL DNG c) 12 µg/mL

DNG ve d) 20 µg/mL DNG çözeltilerinin birinci türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2
nm)
97
c
b
a
Şekil 3.15. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG + 90 µg/mL EV, b) 12

µg/mL DNG + 120 µg/mL EV c) 12 µg/mL DNG + 150 µg/mL EV çözeltilerinin UV
a
b
c
Şekil 3.16. Metanol - su (3 : 1) içerisinde a) 12 µg/mL DNG + 90 µg/mL EV b) 12

µg/mL DNG + 120 µg/mL EV c) 12 µg/mL DNG + 150 µg/mL EV çözeltilerinin birinci
türev spektrumları (skala faktörü:30, ∆λ=2 nm)
98
b
a

µg/mL DNG + 120 µg/mL EV c) 20 µg/mL DNG + 120 µg/mL EV çözeltilerinin UV
a
b
c

µg/mL DNG + 120 µg/mL EV c) 20 µg/mL DNG + 120 µg/mL EV çözeltilerinin birinci
türev spektrumları (skala faktörü:30 ∆λ=2 nm)
99
Çizelge 3.10. DNG’in standart karışımları için farklı dalga boylarında 1. türev
spektrofotometri yöntemiyle elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları
KONULAN BULUNAN
KARIŞIM NO
GERĐ KAZANIM (%)

µg/ml µg/ml
247.2 279.0 328.8 247.2 279.0 328.8

nm nm nm nm nm nm
1 12 12.43 12.12 12.03 103.59 101.00 100.27
2 12 12.71 11.57 11.85 105.91 96.38 98.78
3 12 12.34 11.89 11.94 102.82 99.04 99.46
4 8 7.53 7.34 7.81 94.10 91.77 97.59
5 12 11.51 11.18 11.95 95.88 93.18 99.59
6 20 19.37 19.65 20.00 96.85 98.25 99.99
x 99.86 96.60 99.28
SS 4.84 3.55 0.97
BSS % 4.85 % 3.68 % 0.98

100
uygulandığında elde edilen ortalama % geri kazanım ve % bağıl standart sapma (%
BSS) değerleri Çizelge 3.11’da gösterilmiştir. Buna göre ortalama % geri kazanım ve
% BSS değerleri sırasıyla DNG için % 99.28 ve % 0.98, EV için ise % 98.56 ve %
0.96 olarak bulunmuştur.

101
Çizelge 3.11. DNG ve EV’ın standart karışımları için 1. türev spektrofotometri yöntemiyle
elde edilen ortalama % geri kazanım sonuçları

KARIŞIM µg/ml µg/ml (%)
NO
1 12 90 12.03 87.16 100.27 96.84
2 12 120 11.85 119.00 98.78 98.28
3 12 150 11.94 147.42 99.46 99.16
4 8 120 7.81 118.21 97.59 98.51
5 12 120 11.95 119.26 99.59 99.38
6 20 120 20.00 119.00 99.99 99.16
x 99.28 98.56
SS 0.97 0.94
BSS % 0.98 % 0.96
GA (p=0.05 için) x ± 1.02 x ± 0.99

102
3.3.2 1D Yönteminin Farmasötik Preparatlara Uygulanması:
3.3.2.1. Seçicilik
Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN® draje preparatına uygulamasının

yapılması için de çalış malar yapılmıştır. Amacımız etken maddelerin miktarını tayin
etmek olduğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin yöntemi
etkilemediğinin saptanması gerekir. Bu nedenle CLIMODIEN® draje preparatının
hazırlanan çözeltilerine standart olarak ayrı ayrı DNG ve EV ilave edilerek (DNG
için %25, %50 ve %75; EV için % 50, % 100 ve % 150 oranında ilave yapılmıştır)
miktar tayini yapılmış ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi
etkilemediği bulunmuştur (Çizelge 3.12).
103
Çizelge 3.12. Preparatlara standart ilavesinden sonra 1.türev spektrofotometri ile hesaplanan
DNG ve EV miktarları
GERĐ KAZANIM
KONULAN BULUNAN
(%)
KARIŞIM
NO
DNG EV DNG EV
DNG EV
1 2.5 10.0 2.51 9.67 100.39 96.69
2 2.5 10.0 2.49 9.74 99.46 97.44
3 5.0 10.0 5.11 9.97 102.23 99.70
4 5.0 10.0 5.06 9.93 101.13 99.32
5 7.5 10.0 7.63 10.27 101.73 102.70
6 7.5 10.0 7.75 10.20 103.27 101.95
7 5.0 5.0 5.20 5.24 103.92 104.79
8 5.0 5.0 5.12 5.18 102.45 103.62
9 5.0 15.0 5.13 15.38 102.57 102.55
10 5.0 15.0 5.15 15.30 103.06 101.99
x 102.02 101.07
SS 1.37 2.67
BSS % 1.34 % 2.64
GA(p=0.05için) x ± 0.98 x ± 1.91

104
3.3.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama:
6 adet CLIMODIEN® draje tartılmış ve 25 mL’lik balon jojede metanol - su

(3:1) içerisinde çözülmüştür. 30 dakika manyetik karıştırıcıda karıştırıldıktan sonra
süspansiyon, Whatman No:42 kağıdından süzülerek süzüntüden alınan 6.25 mL’lik
kısım 25 mL’lik balon joje içerisinde metanol – su (3:1) çözeltisi ile tamamlanmıştır.
Yöntem bu çözeltilere uygulandıktan sonra elde edilen sonuçlar Çizelge 3.13’de
gösterilmiştir.
105
Çizelge 3.13. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına 1.türev spektrofotometri yöntemi

uygulandığında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar (preparat üzerinde yazılı miktar; 2 mg
DNG + 2 mg EV/draje)
DNG EV
DENEY NO
(mg) (mg)
1 2.07 1.93
2 2.06 2.00
3 2.06 1.93
4 2.02 1.93
5 2.04 1.95
6 2.06 2.03
x 2.05 1.96
SS 0.02 0.04
SH ±0.01 ±0.02
BH % 2.58 % -1.92
106
3.3.2.3. ANOVA testi

(3 gün boyunca) okunarak 1D yöntemi uygulanmış ve bunların sonucunda DNG +
EV karışımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları ANOVA testi ile
karşılaştırılmış ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’da gösterilmiştir. Bu çizelge
sonuçlarına göre hesaplanan F değerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre
çizelge değeri olan 5.91 değerinden küçük olduğu gözlenmiştir. DNG için gün içi ve
günler arası bağıl standart sapma değerleri sırasıyla % 0.68 ve 0.58, EV için ise
sırasıyla % 0.84 ve 1.17’dir.
107
Çizelge 3.14. Önerilen yöntemler için DNG+ EV karışımlarında ANOVA testi sonuçları
1
D TBR KEK YPSK
Parametreler
EV DNG EV DNG EV DNG EV DNG
Günler arası
3.1242 0.0021 0.4065 0.0049 0.3067 0.0037 0.0643 0.0054
varyans
Gün içi
1.6332 0.0029 0.1432 0.0013 0.1031 0.0028 0.1083 0.0035
varyans
F oranı 1.9129 1.3816 2.8390 3.6173 2.9764 1.2913 1.6852 1.5483
Ortalama değer
150.77 7.87 152.54 8.04 152.59 8.00 24.15 8.18
(µg/mL)
Günler arası % BSS 1.17 0.58 0.42 0.87 0.36 0.76 1.05 0.90
Gün içi % BSS 0.84 0.68 0.25 0.46 0.19 0.66 1.35 0.73
Günler arası ve gün içi sonuçları 4 ve 12 serbestlik derecesinde hesaplanmıştır. Bu serbestlik derecesinde ve %95 olasılıkla F oranı
5,91’dir.
107
108
3.4. YPSK Đle Yapılan Çalışmalar
Yöntemi optimize etmek için çalışmalar yapılmıştır. Bu amaçla kolon, mobil

faz, pH, akış hızı, enjeksiyon hacmi ve deteksiyon dalga boyu araştırılmıştır. Bu
çalışmalar sonucunda kolon olarak ACE C8 (25cm x 4.6 mm) ters faz kolonu
seçilmiştir. Mobil faz için yapılan çalış malarda ise asetonitril-NH4NO3 (pH:5.4, 3.33
x10-2 M) (70:30 h/h) nun en iyi sonucu verdiği görülmüştür. Yine en iyi sonuçlar için
enjeksiyon hacmi 20 µL, akış hızı 2 mL/dk ve deteksiyon dalga boyu 280 nm olarak
belirlenmiştir. Đç standart için yapılan denemelerden sonra siproteron asetat iç
standart olarak seçilmiştir. Yöntemde alıkonma zamanları siproteron asetat için 3.01
dakika, DNG için 1.85 dakika ve EV için 5.95 dakika olarak bulunmuştur.
Şekil 3.19. a) DNG (8 µg/mL) b) Siproteron asetat (iç standart) (1.25 µg/mL), ve c) EV
(64 µg/mL)’ın geliştirilen YPSK yöntemindeki kromatogramı
Miktar tayini iş lemlerinde kalibrasyon grafiklerinden yararlanılmıştır. Bu

grafikler için pik alanları ölçülmüş ve kromatogramda etken maddeler için ölçülen
pik alanları iç standart için ölçülen pik alanlarına bölündükten sonra elde edilen
değerler konsantrasyona karşı grafiğe geçirilmiştir (N = 10). Böylece elde edilen
doğrusal kalibrasyon eğrisinin denklemleri:
109
EV için y = 0.1413 x + 0.0774 (r2 = 0.9999)
DNG için y = 0.7945 x – 0.0052 (r2 = 0.9998) olarak bulunmuştur.
(Burada x, µg/mL cinsinden konsantrasyonu, y ise pik alanı madde/pik alanı iç

standart oranını göstermektedir.)
Yöntemde çalış ma aralıkları; DNG için ise 3.0 – 45.0 EV için 18.0 – 100.0.
µg/mL olduğu saptanmıştır. Yöntemde DNG için TAS 3.0 µg/mL, YS ise 0.06
µg/mL, EV için ise TAS 18.0 µg/mL ve YS 0.58 µg/mL olarak bulunmuştur. Elde
edilen sonuçlar Çizelge 3.15’de gösterilmiştir. Tayin alt sınırı 10 SS/m, yakalama
sınırı ise 3 SS/m (SS = standart sapma, m= eğim) formülünden hesaplanmıştır.
110
Çizelge 3.15. Kromatografik koşullar optimize edildiğinde EV ve DNG için elde edilen
EV DNG
Lineer çalışma aralığı

18.0 – 100.0 3.0 – 45.0
(µg/mL)
Eğim 0.1413 0.7945
± ± ±
Eğimin standart hatası 0.0003 0.0010
Kesim 0.0774 -0.0052
± ± ±
Kesimin standart 0.025 0.014

hatası
r 0.999 0.999
YS (µg/mL) * 0.58 0.06
TAS (µg/mL) ** 18.0 3.0
* YS : Yakalama sınırı (LOD)

** TAS : Tayin sınırı (LOQ)
111
Yöntemde sistem uygunluk testleri araştırılmış elde edilen sonuçlar Çizelge

3.16’ de gösterilmiştir.
Çizelge 3.16. DNG ve EV için geliştirilen YPSK yönteminde sistem

uygunluk testi sonuçları
Olması gereken
Parametreler DNG EV
değerler
Teorik tabaka sayısı 5487 14175 N>2000
Kapasite faktörü 0.75 4.62 k’ = 2 – 8
Seçicilik faktörü 6.178 6.178 α>1
Ayırım gücü 11.54 19.64 R > 1.5
Asimetri faktörü 1.00 1.01 A = 0.95 – 1.20
Çizelge 3.16’da gösterilen seçicilik faktörleri DNG’in EV’a göre hesaplanan

değerleridir. Đç standart hesaba katıldığında EV ile siproteron asetat (IS) pikleri için
2.514, DNG – IS pikleri için 2.455 olarak hesaplanmıştır.
112

uygulandığında elde edilen ortalama % geri kazanım ve bağıl standart sapma
değerleri Çizelge 3.17’de gösterilmiştir. Buna göre ortalama % geri kazanım ve %
bağıl standart sapma değerleri sırasıyla DNG için % 101.10 ve % 0.49, EV için %
100.32 ve % 1.18 olarak bulunmuştur (Çizelge 3.17).
113
Çizelge 3.17. Sentetik karışımlara YPSK yöntemi uygulandığında elde edilen ortalama %
geri kazanım sonuçları
GERĐ KAZANIM
KONULAN BULUNAN
(%)
KARIŞIM
NO
DNG EV DNG EV
DNG EV
1 8 24 8.15 24.02 101.93 100.08
2 8 48 8.06 48.04 100.78 100.07
3 8 72 8.04 72.26 100.55 100.36
4 16 24 16.27 24.68 101.66 102.82
5 16 48 16.22 47.83 101.36 99.64
6 16 72 16.20 71.71 101.28 99.59
7 32 24 32.31 24.40 100.97 101.67
8 32 48 32.27 47.59 100.86 99.14
9 32 72 32.16 71.67 100.49 99.54
x 101.10 100.32
SS 0.49 1.18
BSS % 0.49 % 1.18
GA (p=0.05 için) x ± 0.38 x ± 0.91

114
3.4.1. ANOVA testi
DNG + EV karışımları için gün içi absorbans değerleri okunarak (2’şer saat
aralıkla 5 kez) ve günler arası değerleri okunarak kromatografik yöntemler
uygulanmış ve bunların sonucunda DNG + EV karışımları için 3 gün aynı saat
aralıklarında karşılaştırılarak bulunan miktarlar ANOVA testi ile karşılaştırılmış ve
elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’de gösterilmiştir. Bu çizelge sonuçlarına göre
hesaplanan F değerlerinin serbestlik derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge değeri olan 5.91
değerinden daha küçüktür. Dolayısıyla her iki etken maddenin miktarlarında 3 gün
içerisinde önemli bir değişim gözlenmemiştir. YPSK yönteminde DNG için gün içi
ve günler arası bağıl standart sapma değerleri sırasıyla % 0.73 ve 0.90, EV için ise
sırasıyla % 1.35 ve 1.05 olarak bulunmuştur.
3.4.2. YPSK yönteminin farmasötik preparatlara uygulanması :
3.4.2.1. Seçicilik
Đçerisinde DNG ve EV bulunan CLIMODIEN® draje preparatına

uygulamasının yapılması için de çalışmalar yapılmıştır. Amacımız etken maddelerin
miktarını tayin etmek olduğu için öncelikle bu preparatlardaki yardımcı maddelerin
yöntemi etkilemediğinin saptanması gerekir. Bu nedenle drajelerin çözeltilerine
standart olarak DNG ve EV ayrı ayrı ilave edilerek (DNG için %60, % 70, % 80 ve
%110; EV için % 70, % 105, % 125, % 155 oranında ilave yapılmıştır) miktar tayini
yapılmış ve elde edilen sonuçlara göre yardımcı maddelerin yöntemi etkilemediğ i
bulunmuştur (Çizelge 3.18). Ayrıca optimize edilen şartlarda DNG, EV ve iç
standardın piklerini etkileyecek piklere rastlanmamıştır (Şekil 3.15).
115
a
(a) (b)
c
b
Şekil 3.20. (a) CLIMODIEN® draje preparatı a) DNG, b) siproteron asetat (IS) ve c) EV (b) plasebo’nun YPSK kromatogramı
114
116
Çizelge 3.18. Preparata standart ilavesinden sonra YPSK yöntemi ile hesaplanan DNG ve
EV miktarları
GERĐ KAZANIM
KONULAN BULUNAN
(%)
KARIŞIM
NO
DNG EV DNG EV
DNG EV
1 14 14 14.00 14.49 100.01 103.50
2 14 14 13.86 14.27 99.02 101.93
3 14 21 14.06 20.82 100.45 99.15
4 14 21 14.20 20.72 101.40 98.65
5 12 31 12.08 31.09 100.68 100.30
6 12 31 11.90 31.23 99.20 100.74
7 16 25 16.10 25.16 100.65 100.65
8 16 25 16.12 24.85 100.73 99.39
9 22 25 22.43 24.48 101.95 97.94
10 22 25 22.66 24.36 103.01 97.45
x 100.71 99.97
SS 1.20 1.85
BSS % 1.19 % 1.85
GA(p=0.05için) x ± 0.86 x ± 1.32

117
3.4.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama
6 adet CLIMODIEN® draje tartılıp havanda toz edildikten sonra içerisinden 1

drajenin miktarına karşılık gelecek kadar alınıp 25 mL’lik balon jojede asetonitril
içerisinde çözüldü. 30 dakika karıştırıldıktan sonra çözelti 0.45 µm yavaş süzen
milipore filtreden 25 mL’lik balonjojeye süzüldü. Bu süzüntüden alınan 10 mL ye
siproteron asetat’ın stok çözeltisinden 0.625 mL ilave edildikten sonra 25 mL’lik
balon jojede asetonitril ile 25 mL’ye tamamlandı. Yöntemin hazırlanan çözeltilere
uygulanmasıyla elde edilen sonuçlar Çizelge 3.19’de gösterilmiştir.
118
Çizelge 3.19. CLIMODIEN® (71112 E) preparatına YPSK yöntemi uygulandığında DNG ve

EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde yazılı olan miktar: 2 mg DNG + 2 mg EV/
draje )
DNG EV
DENEY NO
mg mg
1 2.05 1.99
2 2.05 1.98
3 2.05 1.95
4 2.03 2.00
5 2.07 1.94
6 2.03 1.94
x 2.05 1.97
SS 0.02 0.03
SH ± 0.01 ± 0.01
BH 2.33 -1.67
119
4. TARTIŞMA
4.1. DĐENOGEST – ESTRADĐOL VALERAT KARIŞIMININ ANALĐZĐ

ĐÇĐN YAPILAN ÇALIŞMALAR
4.1.1. Kemometrik yöntemlerin kullanılışı
Kemometrik yöntemler, temelde kendileri analitik yöntemler olmayıp
matematiksel ve istatistiksel yöntemlerdir. Yani her türlü veri için uygulanabilir. Biz
çalışmalarımızda spektrofotometrik analizleri tez konumuz olarak seçtiğimiz ve ikili
karışımlara uygulamayı amaçladığımız için spektrumlarda okunan absorbans
değerleri bu kemometrik yöntemlerle değerlendirilerek karışımdaki etken maddelerin
miktar tayinleri gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmalarda TBR ve KEK teknikleri
paket programlar kullanılarak DNG + EV karışımında DNG ve EV’ın miktar tayini
için uygulamaya çalış ılmış ve iki yöntemde de tutarlı sonuçlar elde edilmiştir.
4.1.1.1. Temel bileşen regresyonu (TBR) yöntemi kullanılarak yapılan
çalışmalar
DNG + EV karışımında bu iki etken maddenin de aynı anda miktar tayini
için temel bileşen regresyonu yöntemi spektrofotometrik verilerin (absorbansların)
değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Yöntemde bu iki maddenin karışımlarının
metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin 260 – 350 nm’ler arasındaki UV
absorpsiyon spektrumları kullanılmıştır (Şekil 3.5). Şekil 3.5’te görüldüğü gibi 200 –
300 nm’ler arasında her iki maddenin spektrumları girişim yapmaktadır. Dolayısıyla
diğerinin etkisi olmaksızın DNG veya EV’ın yalnızca absorbans değerlerini
okuyarak bu karışımda seçici olarak miktar tayinlerini gerçekleştirmek imkansızdır.

120
Hiçbir ayırma işlemi yapmaksızın DNG ve EV’ın ikili karışımlarında miktar
tayinlerinin yapılabilmesi için spektral verilerin temel bileşen regresyonu yöntemiyle
analizinden yararlanılmıştır. Buna göre Şekil 3.5’teki spektrumun 240 – 360 nm’ler
arasındaki bölümünün istenen amaç için yeterli olduğu yapılan analizler sonucunda
bulunmuştur. Buna göre 240 – 360 nm’ler arasındaki spektrumda hangi dalga
boylarının seçilmesi gerektiği konusunda yapılan denemeler sonucunda 25 karışım
numunesi için (kalibrasyon seti) (Çizelge 3.1) ∆λ = 1 nm olarak DNG için 300–350
nm’ler arasında 51 dalga boyunda, EV için ise 260–300 nm’ler arasında 41 dalga
boyunda absorbans değerlerinin okunmasının ve bu yöntemdeki hesaplamada
kullanılmasının yeterli olduğu anlaşılmıştır. Sonra 3.2.2 bölümünde anlatıldığı gibi
okunan absorbans değerlerine göre hazırlanan matris ve konsantrasyon matrislerini
kullanarak önce kalibrasyon matrisi ve katsayıları hesaplanmış daha sonra
bilinmeyen numune için belirlenen dalga boylarında yapılan ölçümler bu matris ve
katsayılar yardımıyla analiz edilerek bilinmeyen numunedeki bileşenlerin
konsantrasyonları hesaplanmıştır (Çizelge 3.2). Bu hesaplamada 2.4 bölümünde
gösterilen paket programlardan yararlanılmıştır.
Yöntemde 3.2.2 bölümünde anlatıldığı gibi ortalama merkezli veriler
kullanıldığında daha iyi sonuçlar elde edildiği saptanmıştır.
TSH ve KSH değerlerinin mümkün olduğu kadar düşük olması istenir.
Çizelge 4.1’deki değerlere bakıldığında TSH ve KSH değerlerinin gerçekten küçük
olduğu görülmektedir.
r değeri, konulan ile bulunan arasındaki korelasyonun ölçüsüdür. Bu değerin
1’e yakın olması çalışmanın hassasiyetinin yüksek olduğunu ifade eder ki Çizelge
121
4.1’deki verilere göre hesaplanan r değerlerinin 1’e çok yakın oldukları
görülmektedir.
THKT değerleri ise her zaman minimum olması beklenmeyen değerlerdir.
Buna rağmen THKT değerlerinin çok düşük olduğu Çizelge 4.1’de görülmektedir.
Bu sonuç TSH ve KSH için elde edilen sonuçlarla uyum göstermektedir.
Hazırlanan standart karışımlara yöntem uygulanarak ortalama % geri
kazanım değerleri ve % bağıl standart sapma değerleri hesaplanmıştır (Çizelge 3.2 ve
4.2). Çizelge 4.2’de görüldüğü gibi % geri kazanım değerleri DNG için % 99.33, EV
için % 100.48 olarak bulunmuştur ki bu değerler yöntemdeki doğruluğun yüksek
olduğunu göstermektedir. Yöntemdeki kesinliği göstermek için ise % bağıl standart
sapma (% BSS) değerleri hesaplanmış ve sırasıyla DNG ve EV için % 0.34 ve %
1.58 olarak bulunmuştur (Çizelge 3.2 ve 4.2). Bulunan değerler yeterli olarak
değerlendirilmiştir.
Yaptığımız çalış malarda DNG + EV karışımında temel bileşen regresyonu
tekniğinin spektrofotometriye uygulanması ile DNG ve EV’ün miktarının tayin
edilmesi yönteminde çalışma aralığının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL, EV için 20.0 –
270.0 µg/mL olduğu saptanmıştır. Bu çalışma aralıkları örnek için seçilen draje
preparatındaki DNG ve EV’ın aynı anda miktar tayinine imkan vermektedir.
Yöntemde TAS; DNG için 2.0 µg/mL, EV için 20 µg/mL olarak seçilmiş,
YS ise DNG için 0.20 µg/mL, EV için ise 2.50 µg/mL olarak hesaplanmıştır. Bu
sonuçlar da yöntemin oldukça duyarlı olduğunu göstermektedir.
122
(3 gün boyunca) okunarak temel bileşen regresyonu yöntemleri uygulanmış ve
bunların sonucunda DNG + EV karışımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları
ANOVA testi ile karşılaştırılmış ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.14’de
gösterilmiştir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F değerlerinin serbestlik
derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge değeri olan 5.91 değerinden küçük olduğu
gözlenmiştir. Elde edilen bu sonuçlar ile, 3 gün içerisinde TBR yönteminin
hazırlanan çözeltilere uygulanmasında elde edilen sonuçların (p = 0.05 olarak)
birbirlerinden istatistiksel olarak anlamlı farkının bulunmadığını ve bu süre içerisinde
yöntemin geçerli olduğunu göstermektedir. Bu aynı zamanda stabilitenin de
göstergesidir.
4.1.1.2. Kısmi en küçük kareler yöntemi (KEK) ile yapılan çalışmalar
DNG + EV karışımınında bu iki etken maddenin aynı anda tayini için kısmi
en küçük kareler yöntemi de uygulanmıştır. Yöntemde bu iki maddenin
karışımlarının metanol - su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin 260 – 350 nm’ler
arasındaki UV absorpsiyon spektrumları kullanılmıştır (Şekil 3.5). Şekil 3.5’te
görüldüğü gibi 200 – 300 nm’ler arasında her iki maddenin spektrumları giriş im
yapmaktadır. Dolayısıyla diğerinin etkisi olmaksızın DNG veya EV’ın yalnızca bu
aralıkta absorbans değerlerini okuyarak bu karışımda seçici olarak miktar tayinlerini
gerçekleştirmek olanaksızdır. Hiçbir ayırma işlemi yapmaksızın DNG ve EV’ın ikili
karışımlarında miktar tayinlerinin yapılabilmesi için spektral verilerin kısmi en
küçük kareler (KEK) yöntemiyle analizinden yararlanılmıştır. Buna göre Şekil
3.5’teki spektrumun 240 – 360 nm’ler arasındaki bölümünün istenen amaç için
123
yeterli olduğu yapılan analizler sonucunda bulunmuştur. Buna göre 240 – 360 nm’ler
arasındaki spektrumda hangi dalga boylarının seçilmesi gerektiği konusunda yapılan
denemeler sonucunda 25 karışım numunesi için (kalibrasyon seti) (Çizelge 3.1) ∆λ =
1 nm olarak DNG için 300-350 nm’ler arasında 51 dalga boyunda, EV için ise 260-
300 nm’ler arasında 41 dalga boyunda absorbans değerlerinin okunmasının ve bu
yöntemdeki hesaplamada kullanılmasının yeterli olduğu anlaşılmıştır. Okunan
absorbans değerlerine göre hazırlanan matris ve konsantrasyon matrislerini
kullanarak önce kalibrasyon matrisi ve katsayıları hesaplanmış daha sonra
bilinmeyen numune için belirlenen dalga boylarında yapılan ölçümler bu matris ve
katsayılar yardımıyla analiz edilerek bilinmeyen numunedeki bileşenlerin
konsantrasyonları hesaplanmıştır (Çizelge 3.2). Bu hesaplamada 2.4 bölümünde
gösterilen paket programlardan yararlanılmıştır.
Yöntemde 3.2.3 bölümünde anlatıldığı gibi ortalama merkezli veriler
kullanıldığında daha iyi sonuçlar elde edildiği saptanmıştır.
Temel bileşen regresyonunda olduğu gibi kısmi en küçük kareler yönteminde
de TSH, KSH, r ve THKT değerlerinin uygun değerler olduğu Çizelge 4.1’de
görülmektedir.
kazanım değerleri ve % bağıl standart sapma değerleri hesaplanmıştır (Çizelge 3.3 ve
Çizelge 4.2). Çizelge 4.2’de görüldüğü gibi % geri kazanım değerleri DNG için %
99.18, EV için % 100.54 olarak bulunmuştur ki bu değerler yöntemdeki doğruluğu
göstermektedir. Yöntemdeki kesinliği göstermek için ise % bağıl standart sapma
(%BSS) değerleri hesaplanmış ve sırasıyla DNG ve EV için % 0.26 ve % 1.58

124
olarak bulunmuştur (Çizelge 3.3 ve Çizelge 4.2). Bulunan değerler tatmin edici
olarak değerlendirilmiştir.
Yaptığımız çalış malarda DNG + EV karışımında kısmi en küçük kareler
tekniğinin spektrofotometriye uygulanması ile DNG ve EV’ün miktarının tayin
edilmesi yönteminde çalışma aralığının DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL, EV için 20.0 –
270.0 µg/mL olduğu saptanmıştır. Bu çalışma aralıkları örnek için seçilen draje
preparatındaki DNG ve EV’ın aynı anda miktar tayinine imkan vermektedir.
TAS (tayin alt sınırı), DNG için 2.0 µg/mL, EV için 20 µg/mL olarak
seçilmiş ,YS (yakalama sınırı) ise DNG için 0.2 µg/mL, EV için ise 2.5 µg/mL
olarak hesaplanmıştır. Bu sonuçlar da yöntemin oldukça duyarlı olduğunu
göstermektedir.
(3 gün boyunca) okunarak kısmi en küçük kareler yöntemleri uygulanmış ve
bunların sonucunda DNG + EV karışımlarında hesaplanan DNG ve EV miktarları
ANOVA testi ile karşılaştırılmış ve elde edilen sonuçlar Çizelge 3.11’de
gösterilmiştir. Bu çizelge sonuçlarına göre hesaplanan F değerlerinin serbestlik
derecesi 4 ve 12’ye göre çizelge değeri olan 5.91 değerinden küçük olduğu
gözlenmiştir. Elde edilen bu sonuçlar ile, 3 gün içerisinde KEK yönteminin
hazırlanan çözeltilere uygulanmasında elde edilen sonuçların (p = 0.05 olarak)
birbirlerinden istatistiksel olarak anlamlı farkının bulunmadığını ve bu süre içerisinde
yöntemin geçerli olduğunu göstermektedir. Bu aynı zamanda stabilitenin de
göstergesidir.
125
Çizelge 4.1. TBR ve KEK yöntemlerinde bulunan TSH, KSH, THKT ve r değerleri
TBR KEK
DNG EV DNG EV
TSH 0.0095 0.6762 0.0119 0.7130
KSH 0.0979 0.2395 0.0986 0.2509
r 0.9990 0.9996 0.9989 0.9996
THKT 2.2523 5.5092 2.2686 5.7714

126
Çizelge 4.2. Sentetik karışımlara geliştirilen yöntemler uygulandığında elde edilen validasyon parametreleri
1
TBR KEK D YPSK
n=6 n=6 n=6 n=9
DNG EV DNG EV DNG EV DNG EV
Ortalama % geri 99.33 100.48 99.18 100.54 99.28 98.56 101.10 100.32
kazanım (±SS) (±0.34) (±1.58) (±0.26) (±1.59) (±0.97) (±0.94) (±0.49) (±1.18)
BSS % 0.34 %1.58 % 0.26 %1.58 % 0.98 % 0.96 % 0.49 % 1.18
Çalış ma Aralığı
2.0-24.0 20.0-270.0 2.0-24.0 20.0-270.0 2.0-24.0 10.0-275.0 3.0-45.0 18.0-100.0
(µg/mL)
TAS (µg/mL) 2.0 20.0 2.0 20.0 2.0 10.0 3.0 18.0
YS (µg/mL) 0.2 2.5 0.2 2.5 0.2 2.5 0.06 0.58
SS : Standart Sapma
BSS: Bağıl Standart Sapma
TAS: Tayin Alt Sınırı
YS: Yakalama Sınırı
126
127
4.1.2. Türev Spektrofotometri ile yapılan çalışmalar
DNG + EV karışımımda bu iki maddenin aynı anda tayini için absorpsiyon
spektrumlarına birinci türev spektrofotometri (1D) yöntemi uygulanmış ve iyi
sonuçlar elde edilmiştir. Bu amaçla, EV ve DNG’in metanol- su (3:1) çözeltilerinin
1. türevi alındıktan sonra, türev spektrumlarının sıfırı kestiği noktalar belirlenmiş ve
DNG için 328.8 nm, EV için ise 258.4 nm’de ölçüm yapılması kararlaştırılmıştır
(Şekil 3.7). 1.türev spektrumları alınırken ∆λ = 2 nm, skala faktörü ise 30
seçildiğinde optimal değerlere ulaşıldığı yapılan denemeler sonucunda görülmüştür.
kazanım değerleri ve % bağıl standart sapma değerleri hesaplanmıştır. Yöntemdeki
doğruluğu gösteren % geri kazanım değerleri Çizelge 3.11 ve 4.2’de görülmektedir.
Buna göre % geri kazanım değerleri DNG için % 99.28, EV için % 98.56 olarak
bulunmuştur. Yöntemdeki kesinliği göstermek için ise % bağıl standart sapma
değerleri hesaplanmış ve DNG ve EV için sırasıyla % 0.98 ve % 0.96 olarak
bulunmuştur (Çizelge 3.11 ve 4.2). Bulunan değerler tatmin edici olarak
değerlendirilmiştir.
DNG ve EV karışımının 1. türev spektrofotometri yöntemiyle tayininde
çalışma aralıkaları DNG için 2.0 – 24.0 µg/mL ve EV için ise 10.0 – 275.0 µg/mL
olduğu bulunmuştur. Bu çalışma aralıkları kullanılarak örnek için seçilen draje
preparatına da yöntem kolaylıkla uygulanabilmektedir.
1. türev spektrofotometri yönteminde TAS; DNG için 2.0 µg/mL, EV için
10.0 µg/mL olarak seçilmiş YS ise DNG için 0.20 µg/mL, EV için ise 2.50 µg/mL
olarak hesaplanmıştır.
128
4.1.3. YPSK ile yapılan çalışmalar
Yöntemi optimize etmek için yapılan çalış malar sonucunda; en iyi ayrımın
ACE C8 ters faz kolonu (250 mm x i.d. 4.6 mm, 5 µm) üzerinde hareketli (mobil) faz
olarak asetonitril – amonyum nitrat (pH:5.4, 0.03 M) (70:30 h/h) ve 20 µL
enjeksiyon hacmi kullanılarak 2 mL/dak akış hızı ile elde edildiği saptanmıştır.
Dedeksiyon 280 nm’de yapılmıştır. Đç standart olarak çeşitli maddeler denenmiş ve
en uygun piki veren siproteron asetat seçilmiştir. Yöntemde alıkonma zamanları
(retention time) DNG için 1.86 dakika, siproteron asetat (iç standart) için 3.01 dakika
ve EV için 5.95 dakika olarak bulunmuştur (Şekil 3.19).
Yöntemdeki doğrusal çalışma aralığının DNG için 3.0 – 45.0 µg/mL, EV için
18.0 – 100.0 µg/mL olduğu saptanmıştır. TAS, DNG için 3.0 µg/mL, EV için ise
18.0 µg/mL’dir. YS ise DNG için 0.06 µg/mL, EV için 0.58 µg/mL’dir.
Yöntemin validasyonu konusunda yapılan çalış malarda; ortalama % geri
kazanım değerleri DNG için % 101.10, EV için % 100.32, % bağıl standart sapma
değerleri ise sırasıyla DNG ve EV için % 0.49 ve % 1.18 olarak bulunmuştur
(Çizelge 3.17 ve Çizelge 4.2). Bu değerler yöntemin doğruluğu ve kesinliği açısından
tatmin edicidir.
4.1.4. Şekil 3.5’de DNG ve EV’ın metanol – su (3:1) içerisindeki çözeltilerinin UV
spektrumlarında DNG’in 308.2 nm’de bir maksimum absorpsiyon verdiği, buna
karşılık EV’ın bu dalga boyunda absorpsiyona sahip olmadığı gözlenmektedir.

129
Yapılan çalışmalar, EV’ın her ne kadar absorpsiyona katkısı yok gibi görünse de,
pratikte çok küçük bir miktarda katkısının olduğunu göstermiştir. Dolayısıyla DNG
+ EV karışımında yalnızca 308.2 nm’de absorbans değerleri okunarak DNG’in
miktarının tayin edilemeyeceği anlaşılmıştır.
Ayrıca, farmasötik preparatlarda DNG’in yine 308.2 nm’de ölçüm yapılarak
tayini yapılmaya çalışıldığında daha da kötü sonuçlar elde edilmiştir. Bunun
nedeninin belki de preparattaki yardımcı maddelerin olabileceği düşünülmüştür.
4.2. Yöntemlerin farmasötik preparatlara uygulanması

130
DNG + EV karışımında her iki etken maddenin de miktar tayini için
geliştirilen 1D, TBR, KEK ve YPSK yöntemlerinin bu iki etken maddeyi içeren
farmasötik preparatlara uygulanabilirliği araştırılmıştır:
Bilindiği gibi farmasötik preparatların içerisinde etken maddelerin yanında
çeşitli yardımcı maddeler de bulunmaktadır. Bizim seçmiş olduğumuz draje
preparatındaki yardımcı maddelerin yöntemi etkileyip etkilemediğinin öncelikle
saptanması gerekir. Bunu yapabilmek için DNG + EV karışımını içeren
CLIMODIEN® draje içerisindeki DNG ve EV’ın miktarı önerilen tüm yöntemlerle
tayin edilmiştir. Sonra tayin işleminde kullanılan preparata bilinen miktarlarda ayrı
ayrı DNG ve EV eklenmiş ve bu miktarlar tayinde kullanılan çözücülerdeki
çözeltileri seyreltilerek her iki maddenin de yöntemdeki çalış ma aralıklarına
getirildikten sonra miktarları tayin edilmiştir. Hem standart ilavesinden önce hem de
sonra tayin edilen DNG ve EV’ın miktarlarının arasında önemli bir fark olmadığ ı
saptanmıştır. Böylece bu preparatdaki yardımcı maddelerin yöntemi etkilemediğ i
sonucuna varılmıştır. Dolayısıyla 3.2.5.2, 3.3.2.2 ve 3.4.2.2 bölümlerinde anlatıldığ ı
şekilde yöntemler CLIMODIEN® draje preparatına uygulanmış ve çalışılan seriler
için bulunan DNG ve EV’ın miktar tayini sonuçları Çizelge 3.6, 3.7, 3.13 ve 3.19’da
gösterilmiştir.
Geliştirilen yöntemlerin seçilen farmasötik preparata uygulanması konusunda
ise, dikkati çeken CLIMODIEN® drajede 1D, KEK, TBR ve YPSK yöntemleriyle
bulunan DNG miktarlarının preparatın üzerinde belirtilenden biraz yüksek
bulunmasıdır (Çizelge 4.3).

131
Tüm yöntemlerde bu farmasötik preparatlar içerisindeki DNG ve EV için
bulunan değerlerin ortalama miktarları, birbirleriyle student’s t testi yardımı ile
karşılaştırılmıştır (Çizelge 4.3) ve hesaplanan değerin p = 0.05 için çizelge
değerinden (bu çalışma için 2.26 dır) küçük olması nedeniyle CLIMODIEN® drajeye
uygulanan yöntemlerde DNG ve EV için bulunan sonuçlar arasında istatistiksel
olarak anlamlı bir farkın olmadığı anlaşılmıştır. Ayrıca uygulanan yöntemlerin
standart sapmaları birbirleriyle F testi ile karşılaştırılmış (Çizelge 4.3) ve bulunan
değerler çizelge F değerinden (bu çalışma için 5.05’dir) küçük olduğu, dolayısıyla
uygulanan yöntemlerde DNG ve EV için bulunan sonuçlar arasında kesinlik
açısından istatistiksel olarak anlamlı bir farkın olmadığı sonucuna varılmıştır.

132
Çizelge 4.3. CLIMODIEN® (71112 E)preparatına geliştirilen yöntemler uygulandığında DNG ve EV için elde edilen sonuçlar ( Preparat üzerinde
yazılı olan miktarlar : 2 mg DNG + 2 mg EV/draje )
DNG EV
Kullanılan
Yöntemler
Hesaplanan Hesaplanan Hesaplanan Hesaplanan
x ± SS x ± SS
t değerleri F değerleri t değerleri F değerleri
TBR 2.06 ± 0,01 2.01 ± 0.05

TBR-KEK = 0.02 TBR-KEK = 1.43 TBR-KEK = 0.48 TBR-KEK = 1.23
TBR - 1D = 1.36 TBR - 1D = 3.16 TBR - 1D = 2.08 TBR - 1D = 1.17
KEK 2.06 ± 0,01 YPSK - TBR = 0.10 YPSK - TBR = 2.13 2.00 ± 0.04 YPSK - TBR =2.16 YPSK - TBR = 3.08
KEK - 1D = 1.31 KEK - 1D =2.21 KEK - 1D = 1.69 KEK - 1D = 1.05

1
D 2.05 ± 0,02 YPSK – KEK = 2.11 YPSK – KEK = 1.49 1.96 ± 0.04 YPSK – KEK = 1.72 YPSK– KEK = 2.50
YPSK - 1D = 0.52 YPSK - 1D = 1.49 YPSK - 1D = 0.48 YPSK - 1D = 2.63
YPSK 2.05 ± 0,02 1.96 ± 0.03
P = 0.05 için Çizelge değeri t = 2.26

Çizelge F değeri = 5.05
132
133
4.3. Geliştirilen yöntemlerin birbirleriyle karşılaştırılmaları
Yaptığımız literatür taramasına göre bu karışım için analitik yöntemle elde
edilen verilere kemometrik teknikleri uygulayarak, YPSK ve 1.türev
spektrofotometri ile veya başka bir yöntemle DNG ve EV’ı içeren karışımlarda ve bu
karışımları içeren preparatlarda DNG ve EV’ın aynı anda miktar tayinlerinin
yapıldığı bir çalışmaya rastlanmamıştır. Dolayısıyla yapılan çalış malar tamamen
orijinaldir. Bu nedenle de geliştirilen yöntemler ne bir başka literatürdeki yöntemle
ne de bir farmakope yöntemiyle karşılaştırılamamıştır. Ancak kendi aralarında
karşılaştırılmışlardır. Buna göre; spektrofotometrik verilere kemometrik yöntemler
(TBR ve KEK) uygulayarak geliştirdiğimiz miktar tayini işlemlerinde orijinal (0.
derece) spektrumların kullanılabilmesi bir avantaj olurken hesaplamaların yapılması
için mutlaka bilgisayarda istatistik programlarının kullanılmasının gerekliliği bir
dezavantaj olarak ortaya çıkmaktadır. 1.türev spektrofotometri yöntemi ise cihaz
üzerindeki bilgisayar programı ile gerçekleştirilmekte ama duyarlı sonuçlar
vermektedir. DNG ve EV karışımında DNG ve EV’ın miktar tayini için TBR, KEK,
1
D ve YPSK yöntemleriyle elde edilen sonuçlar uyumludur ve her dört yöntemde de
hiçbir ayırma işlemi gerekmeksizin bu karışımda DNG ve EV’ın aynı anda miktar
tayinleri yapılabilmektedir. YPSK yönteminde TBR ve KEK yöntemleriyle elde
edilenlere göre EV için daha düşük TAS görülürken, 1D yöntemiyle YPSK, TBR ve
KEK yöntemlerine nazaran daha düşük TAS değerlerine ulaşılmıştır. DNG için ise
TBR, KEK ve 1D yöntemleriyle YPSK’ya göre çok az da olsa daha düşük tayin alt
sınırı görülmüştür. Yakalama sınırları açısında değerlendirecek olursak YPSK
yöntemi diğer yöntemlere oranla çok daha düşük yakalama sınırı değerlerine sahiptir.
YPSK yönteminde çalışma aralıkları DNG için TBR, KEK ve 1D yöntemlerine göre
134
daha genişken, EV için 1D yöntemi; YPSK, TBR ve KEK’e göre daha geniş olduğu
bulunmuştur. (Çizelge 4.2)
YPSK bir ayırma tekniğidir ve hem uzun işlemleri gerektirmekte hem de
kullanılan çözücülerin saflığı nedeniyle oldukça pahalı bir yöntemdir. Buna karşılık
optimize edilmiş şartlarda yaklaşık 7 dakika içerisinde sonuç alınması ve giriş im
yapan diğer maddelerden ayırım yapıldıktan sonra etken maddelerin tayinlerinin
yapılması ve bu nedenle spesifik olması bir avantajdır. Seçilen preparatlara bu üç
yöntem uygulandığında elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak karşılaştırıldıklarında
aralarında anlamlı bir farkın olmadığı yani elde edilen sonuçların güven aralığ ı
içerisinde birbirleri ile uyumlu olduğu anlaşılmıştır.

135
5. SONUÇ ve ÖNERĐLER
Tez kapsamı içerisinde DNG ve EV içeren karışımlarda DNG ve EV’ın aynı

anda miktar tayinlerinin yapılabilmesi için 4 değişik yöntem geliştirilmiştir. Bunlar;
spektrofotometrik verilere temel bileşen regresyonu (TBR) tekniğinin uygulanması,
spektrofotometrik verilere kısmi en küçük kareler (KEK) uygulanması, 1. türev
spektrofotometri (1D) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK)’dir.
TBR ve KEK yöntemlerinde; standart çözeltiler kullanılarak hazırlanan

kalibrasyon matrisleri yardımıyla DNG için 300 – 350 nm’ler arasında 51 dalga
boyunda, EV için ise 260-300 nm’ler arasında ∆λ = 1 nm olarak 41 dalga boyunda
okunan absorbansların değerledirilmesi ile karışımdaki DNG ve EV’ın aynı anda
miktarı tayini gerçekleştirilmiştir.
1
D yönteminde; DNG ve EV’ın metanol – su (3:1) çözeltisi içerisindeki karışım
çözeltilerinin ayrı ayrı 1. türev spektrumları çizdirilerek spektrumlarında sıfır olduğu
noktalar bulunarak, o dalga boylarında diğer madde için dA/dλ değerleri okunmuş
ve hazırlanan kalibrasyon grafikleri yardımıyla, karışımdaki DNG ve EV’ın aynı
anda miktarı tayini gerçekleştirilmiştir.
YPSK’de ise; ACE C8 kolonu üzerinde asetonitril – amonyum nitrat (pH: 5.4,
0.03 M) (70:30, h/h) mobil fazı kullanılarak, 280 nm’de deteksiyon ile elde edilen
kromatogramlardaki pik alanlarının, iç standart olarak seçilen siproteron asetatın pik
alanına bölünmesi ile elde edilen değerlerin, konsantrasyona karşı grafiğe
geçirilmesi ile hazırlanan kalibrasyon eğrileri yardımıyla, karışımdaki DNG ve
EV’ün aynı anda miktarı tayini gerçekleştirilmiştir. Sayılan dört yöntem de optimize
edildikten sonra valide edilmiş lerdir. Sonra bu dört yöntemin Türkiye ilaç
piyasasında bulunan bir adet draje preparatına uygulaması için optimal şartlar
belirlenmiş ve hiçbir ayırma işlemi gerekmeden preparatın içerisinde bulunan DNG
ve EV’ın aynı anda miktarı tayini gerçekleştirilmiştir. Böylece tez çalış malarımıza
başlarken belirlediğimiz amaca ulaşılmıştır.
DNG + EV karışımında DNG ve EV’ın aynı anda tayini için kapiler

elektroforez yöntemininde uygulanabileceğini düşünüyoruz. Đleriki çalışmalarda bu
yöntemin farmasötik preparatlara uygulamasının yapılmasını planlıyoruz.
136
ÖZET
Dienogest ve estradiol valerat’ın farmasötik preparatlarda

spektrofotometrik yöntemlerle aynı anda miktar tayinleri
Bu tez kapsamında; dienogest (DNG) ve estradiol valerat (EV) içeren bir
karışımda her iki maddenin aynı anda miktar tayininin yapılabilmesi için yeni
yöntemler geliştirilmesi amacıyla çalış malar yapılmıştır. Çalışmalarda
spektrofotometrik analizler temel alınmış ve 1. türev spektrofotometri (1D),
spektrofotometrik verilerin temel bileşen regresyonu (TBR) ve kısmi en küçük
kareler (KEK) yöntemleriyle analizi kullanılmıştır.
1
D yönteminde, DNG + EV karışımının metanol – su (3:1) içerisindeki
çözeltilerinin 200 – 400 nm arasındaki spektrumlarının 1. türevinde, DNG için 328.8
nm’ de, EV için ise 258.4 nm’de analitik sinyaller okunmuştur (∆λ = 2 nm, skala
faktörü = 30). TBR ve KEK yöntemlerinde ise, DNG için metanol – su (3:1)
içerisindeki çözeltilerinin UV spektrumunlarının (0. derece) 300 - 350 nm’ler
arasındaki bölgede ∆λ = 1 nm olarak 51 adet dalga boyundaki absorbansları, EV için
260-300 nm’ler arasındaki bölgede ∆λ = 1 nm olarak 41 adet dalga boyundaki
absorbansları okunmuş ve TBR ve KEK ile analizleri yapılmıştır. Yöntemlerdeki
ortalama % geri kazanım ve % bağıl standart sapma değerleri sırasıyla DNG için;
1
D’de % 99.28 ve % 0.98, TBR’de % 99.33 ve % 0.34, KEK’de % 99.18 ve % 0.26,
EV için; 1D’de % 98.56 ve % 0.96, TBR’de % 100.48 ve % 1.58, KEK’de % 100.54
ve % 1.58 olarak bulunmuştur. Yöntemlerdeki çalışma aralıklarının 1D’de DNG için
2.0 – 24.0 µg/mL, EV için 10.0 – 275.0 µg/mL olduğu, TBR ve KEK’de DNG için
2.0 – 24.0 µg/mL, EV için 20.0 – 270.0 µg/mL olduğu saptanmıştır. Geliştirilen bu
üç spektrofotometrik yöntem Türkiye ilaç piyasasında bulunan draje preparatına
başarıyla uygulanmıştır. Ayrıca yeni bir YPSK yöntemi geliştirilmiştir ki yöntemde
kolon olarak ACE C8 ters faz kolonu, mobil faz olarak asetonitril – amonyum nitrat
(pH: 5.4, 0.03 M) (70:30 h/h) kullanılmış ve deteksiyon 280 nm’de yapılmıştır. Đç
standart olarak siproteron asetat seçilmiştir. Yöntemde alıkonma zamanları DNG için
1.85 dakika, siproteron asetat için 3.01 dakika ve EV için 5.95 dakikadır.
Yöntemdeki ortalama % geri kazanım ve % bağıl standart sapma değerleri sırasıyla
DNG için % 101.10 ve % 0.49, EV için % 100.32 ve % 1.18 olarak bulunmuştur.
137
Yöntemdeki çalış ma aralığının DNG için 3.0 – 45.0 µg/mL EV için 18.0 – 100.0
µg/mL olduğu saptanmıştır. Geliştirilen YPSK yöntemi de aynı preparata
uygulanmış ve elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak birbirleriyle karşılaştırılmıştır.
Anahtar kelimeler: Farmasötik preparat; Dienogest; Estradiol valerat; Sıvı

kromatografi; Türev spektrofotometri; Temel bileşen regresyonu; Kısmi en küçük
kareler.
138
SUMMARY
Simultaneous spectrophotometric determination of dienogest and estradiol

valerate in pharmaceutical preparations
In the scope of this thesis, studies were conducted in order to develop new
methods for the simultaneous determination of dienogest (DNG) and estradiol
valerate (EV) in their binary mixture. In the studies; spectrophotometric analysis
were essential and first derivative spectrophotometry (1D), principle component
regression (PCR) and partial least squares (PLS) methods were used in the analysis.
In 1D method, analytical signals were measured at 328.8 nm for DNG, and 258.4
nm for EV in the first derivative spectra of the solution of DNG + EV mixture in
methanol – water (3:1) in 200 – 400 nm range (∆λ = 2 nm, scaling factor = 30). In
PCR and PLS methods, absorbances were measured at 51 wavelengths between 300-
350 nm (∆λ = 1 nm) for DNG and at 41 wavelengths between 260-300 nm (∆λ = 1
nm) for EV in original absorption spectra of DNG + EV mixture in methanol – water
(3:1) and, PCR and PLS analysis were achieved. For DNG; mean recoveries and
relative standard deviations were found as % 99.28 and % 0.98 in 1D; % 99.33 and %
0.34 in PCR; % 99.18 and % 0.26 in PLS methods respectively. They are % 98.56
and % 0.96 in 1D; % 100.48 and % 1.58 in PCR; %100.54 and % 1.58 in PLS for EV
respectively. Working ranges were 2.0 – 24.0 µg/mL in 1D, PCR and PLS for DNG.
It is 10.0 – 275.0 µg/mL in 1D and 20 – 270 µg/mL in PCR and PLS for EV. These
three methods were successfully applied to a sugar coated tablet marketed in Turkey.
Moreover we developed an HPLC method in which ACE C8 reverse phase column
and acetonitril – ammonium nitrate (pH: 5.4, 0.03 M) (70:30 v/v) mobil phase was
used and 280 nm was selected for detection. Cyproteron acetate were chosen as
internal standard. Retention times were 1.85 min. for DNG, 3.01 min. for cyproteron
acetate and 5.95 min. for EV. Mean recoveries and relative standard deviations are
% 101.10 and % 0.49 for DNG; % 100.32 and % 1.18 for EV respectively. In HPLC
method, working ranges were found as 3.0 – 45.0 µg/mL for DNG and 18.0 – 100.0
µg/mL for EV. HPLC method was also applied to the same formulation selected and
the results were compared with each other statistically.
139
Keywords: Pharmaceutical preparation; Dienogest; Estradiol valerate; Liquid

chromatography; Derivative spectrophotometry; Principal component regression;
Partial least squares.
140
KAYNAKLAR
AMIN, M. (1989). Quantitative thin-layer chromatographic analysis of

dehydroepiandrosterone enanthate and estradiol valerate in pharmaceutical preparations
and blood, Pharmazeutische Industrie 51, Nr.1
ATKINSON, A.C. (1985). Plots, Transformation and Regression. Oxford University Press,
New York
BEEBE, K.R., KOWALSKI, B.R. (1987). An introduction to multivariate calibration and

analysis. Analytical Chemistry, 59 : 1007 A – 1017 A
BOOKSH, K.S., KOWALSKI, B.R. (1994). Theory of analytical chemistry. Analytical

Chemistry, 66 : 782 A – 791 A
BOX, G.E.P. (1980). Sampling and Bayer inference in scientific modeling and robustness.
Journals of The Royal Statistical Society, Series A. 143 : 383 – 404
BRITISH PHARMACOPOEIA. Stationary Office Books; 99 Edition., 1999 London
CARIGNAN, G., LODGE, B. A., SKAKUM, W. (1984). High-performance liquid

chromatographic analysis of estradiol valerate-testosterone enanthate in oily
formulations, Journal of Chromatography A, 301, 292-296
CARIGNAN, G.; LODGE, B. A.; SKAKUM, W. (1980), Determination of estradiol esters

in oily solution by high-performance liquid chromatography, Canadian Journal of
Pharmaceutical Sciences,15(1), 10-12
COOK, R.D., WEISBERG,S. (1982). Residuals and influence in regression. Chapman and
Hill, New York
COWE, I.A., McNICOL, J.W. (1985). The use of principal components in the analysis of
near – infrared spectra. Applied Spectroscopy, 39 : 257 - 266
DĐNÇ¸ E., YÜCESOY, C., PALABIYIK, Đ. M., ÜSTÜNDAĞ, Ö., ONUR, F. (2003),
Simultaneous spectrophotometric determination of cyproterone acetate and estradiol
valerate in pharmaceutical preparations by ratio spectra derivative and chemometric
methods, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 32 (3), p.539-547
DU, B., SONG, S., SHI, X., ZHANG, Z., (2009). Analysis of steroids by nonaqueous
capillary electrophoresis, Journal of Analytical Chemistry, 64(1), 59-64
141
DUAN, J. P., CHEN, G. N., CHEN, M. L., WU, X. P., CHEN, H. Q. (1999). Adsorptive and
electrochemical behaviors of estradiol valerate at a mercury electrode, The Analyst,
124(11), 1651-5.
DUTTER, R., HUBER, P.J. (1981). Numerical methods for the nonlinear robust regression.
Journal of Statistical Computation and Simulation. 13 : 79 –114
FEKETE, S., FEKETE, J., GANZLER, K. (2009). Validated UPLC method for the fast and
sensitive determination of steroid residues in support of cleaning validation in
formulation area, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 49, 833-838
FOSTER R.H., WILDE M.I. (1998). Dienogest. Drugs 56 (5): 825–33; discussion 834–5
FRANK, I.E. (1990). Nonlinear PLS model. Chemometrics International Laboratuary

System, 8 : 109 – 119
FREDERICKS, P.M., LEE, J.B., DSBORN, P.R., SWINK, D.A. (1985). An excellent
reference to PCR and PCA methods. Applied Spectroscopy, 39 : 303 – 310
HAALAND D.M., THOMAS, E.V., (1988). Partial least-squares methods for spectral
analyses. 1.Relation to other quantitative calibration methods and the extraction of
qualitative information, Analytical Chemistry, 60 1193-1202.
HAWKINS, D.M. (1993). The feasible set algorithm for least median of squares regression.
Computational Statistics and Data Analysis. 16 : 81 – 101
HIEU, D.K., REDDERSEN, G., WEHRBERGER, K., HOBE, G. (1986).

Radioimmunoassay of the progestagen Dienogest using different methods of plasma
sample preparation Pharmazie , 41(10), 711-14.
HOBE, G., KLINGER, G., REDDERSEN, G., ERDMANN, A.; KLINGER,G., (1986).
Determination of the progestagen dienogest in plasma and saliva by radioimmunoassay,
Pharmazie , 41(11), 772-4.
GALBRAITH, A., SHANE, B., ELIZABETH M., BARRY H., ANN R. (2007).
Fundamentals of Pharmacology: An Applied Approach for Nursing and Health. United
Kingdom: Pearson Education LTD. pp. 632.
GELADI, P., KOWALSKI, B.R. (1986). Partial least squares regression A: Tutorial.
Analytica Chimica Acta, 185 : 1 - 17
142
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF DRUGS, CLARKE’S. Littenhouse Book

Distributions. Inc., 1986. Pennsylvania, USA.
JOCHUM, P., SCHROT, E.L. (1984). Deconvulation of multicomponent ultraviolet and

visible spectra. Analytica Chimica Acta, 157 : 211 - 216
KAZAKEVICH, Y., LoBRUTTO, R. (2007). HPLC for Pharmaceutical Scientist, John

Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, USA
KISNER, H.J., BRIWN, C.W., KAVARNOS, G.I. (1983). Multiple analytical frequencies
and standards for the least – squares spectrophotometric analysis of serum lipids.
Analytical Chemistry, 55 : 1703 – 1707
LAWRENCE, K.D., ARTHUR, J.L. (1990). Robust nonlinear regression. Analysis and
Application. Marcel Dekker, New York. 59 - 86
LORBER, A., WANGEN, L.E., KOWALSKI, B.R. (1987). A therotical foundatiton for the
PLS algorithm. Journal of Chemometrics, 19 : 1 - 18
MARTENS, L., NAES, T. (1984). Multivariate calibration. I. Concepts and distinction.

Trends in Analytical Chemistry, 3: 204 – 211
MILLER, J.N. (1991). Basic statistical methods for analytical chemistry. Part 2: Calibration
and regression review. Analyst, 116 : 3 – 14
NAES, T., MARTENS, L. (1984). Multivariate calibration. II. Chemometric methods. Trends
in Analytical Chemistry, 3: 266 - 271
OWEN A. J., (1995). Uses of Derivative Spectroscopy; UV-visible Spectroscopy,

Application Note, Agilent Technologies, Germany.
ÖZDEMĐR, D. “Multi-instrument calibration using genetic regression in UV-visible and

near-infrared spectroscopy”. Doktora tezi, Mayıs 1999. Clemson University, South
Carolina, USA.
PALABIYIK, Đ.M. “dekstrometorfan hidrobromür içeren çoklu preparatlardaki etken

maddelerin spektrofotometrik, kromatografik ve kapiler elektroforetik yöntemlerle miktar
tayinleri”. Doktora tezi, Kasım 2008. Ankara Üniversitesi, Türkiye.
RATKOWSKY, D.A. (1990). Handbook of nonlinear regression models. Marcel

Dekker. New York
143
RENCHER, A.C. (1995). Methods of multivariate analysis, John Wiley & Sons Inc.
New York
RILEY ve ROSANSKE,1996; Development And Validation Of Analytical Methods,
Tarrytown, N.Y., Pergamon, 1996.
ROECKER, E.B. (1991). Prediction error and its estimation for subset – selected models.
Tecnometrics. 33: 459 – 468
RXMEDIAPHARMA® ĐNTERAKTĐF ĐLAÇ BĐLGĐ KAYNAĞI, (2009), GEMAŞ GENEL

MÜHENDĐSLĐK Mekanik Sanayi ve Tic. A.Ş., Đzmir
SEGALL,A., HORMAECHEA, F.,VITALE, M., PEREZ, V., PIZZORNO, M. T., (1999).

Development and validation of a reversed-phase liquid chromatographic method for
analysis of estradiol valerate and medroxyprogesterone acetate in a tablet formulation,
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19 (5), p.803-808,
SEKULIC, S., SEASHOLTZ, M.B., WANG, Z., KOWALSKI, B.R., LEE, S.E., HOLT,
B.R. (1993). Nonlinear multivariate calibration methods in analytical chemistry.
Analytical Chemistry, 65 : 835A – 845 A
SJOSTROM, M., WOLD, S., LINDBERG, W., PERSSON, J.A., MARTENS, H. (1983). A
multivariate calibration problem in analytical chemistry solved by partial least squares
models in latent variables. Analytica Chimica Acta, 150 : 61 – 70
SKOOG, D.A., HOLLER, F.J., NIEMAN, T.A. (1998). (Çeviri editörleri Prof. Dr. Esma
KILIÇ, Prof. Dr. Fitnat KÖSEOĞLU, Doç Dr. Hamza YILMAZ) Enstrümental Analiz
Đlkeleri, birinci baskı, Bilim Yayıncılık, Ankara, Türkiye
STROMBERG, A.J. (1993). Computing the exact least median of squares estimate and
stability diagnostics in multiple linear regression. SIAM Journal on Scientific and
Statistical Computing.14 : 1289 – 1299
STROMBERG, A.J., RUPPERT,D. (1989). Breakdown in nonlineer regression. Journal of

the American Statistical Association. 87 : 991 – 997
TALSKY G. (1994). Derivative Spectrophotometry Low and Higher Order, First ed., VCH
Publishers, New York, NY, .
th
THE MERCK INDEX. 13 Edition. Merck & Co. Inc.Whitehouse Statition New Jersey
2001
144
THOMAS, E.V. (1994). A primer on multivariate calibration. Analytical Chemistry, 66 :

795 A – 804 A
TOPTAN S.; “Sitrik asit ve sakaroz içeren gıdalarda kullanılan ikili boya karışımlarının
analizi”, Doktora tezi, 1999. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü
TRIPODI, V., FLOR, S., CARLUCCI, A., LUCANGIOLI, S. (2006). Simultaneous

determination of natural and synthetic estrogens by EKC using a novel microemulsion,
Electrophoresis , 27, 4431-4438
USP 23 - NF 18 (1994). The United States Pharmacopeia & The National Formulary,
United States Pharmacopeial Convention, Inc, US Pharmacopeia, Washington
WENTZELL, P.D., ANDREWS, D.T., KOWALSKI, B.R. (1997). Maximum likelihood

multivariate calibration. Analytical Chemistry , 69 : 2299 - 2311
WIEGRATZ, I., LEE, J.H., KUTSCHERA, E., BAUER, H.H., VON HAYN, C., MOORE,
C., MELLINGER, U., WINKLER, U.H., GROSS, W., KUHL, H. (2002). Effect of
dienogest-containing oral contraceptives on lipid metabolism. Contraception 65 (3):
223–9.
YÜCESOY, C., EROL S. (2000). Derivative and difference spectrophotometric

determination of cyproterone acetate and estradiol valerate in formulations, FABAD J.
Pharm. Sci., 25, 85-90,
YÜCESOY, C. (2000). Simultaneous spectrophotometric determination of estradiol valerate

and cyproterone acetate, Ankara Universitesi Eczacilik Fakultesi Dergisi , 29(1), 9-19.
ZIMMERMAN, H., THEBAULT, J. J., DUVAUCHELLE, T., MIGNOT, A., RENOUX, A.,
GUALANO, V. (2000). Pharmacokinetics of estradiol valerate 2mg + dienogest 2mg
(climodien 2/2) after single and repeated oral administration in healthy postmenopausal
women, Clinical Drug Investigation , 20(2), 123-134.
145
ÖZGEÇMĐŞ
I- BĐREYSEL BĐGĐLER
Adı : M. Gökhan
Soyadı : Çağlayan
Doğum Yeri ve Tarihi : Đstanbul / 08.06.1982
Uyruğu : T.C.
Đletişim Adresi ve Telefonu :Aydınlar mah. Cahit Sıtkı sok.

No:24/19
Dikmen Çankaya / Ankara
Tlf : 0 312 479 75 16
0 505 203 37 32
II- EĞĐTĐMĐ
Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı -

Tezli yüksek lisans-2007-2009
Orta Doğu Teknik Üniversitesi – Kimya Öğretmenliği (lisansla birleştirilmiş

tezsiz yüksek lisans programı)-2000–2005
Yakacık Meslek Lisesi – Kimya Bölümü-1996–1999
Fuat Köprülü Đlköğretim Okulu-1993–1996
Kavakpınar Đlkokulu-1988–1993
Yabancı dili: Đngilizce

146
III- ÜNVANLARI
Kimya Teknisyeni 1999
Kimya Öğretmeni 2005
IV- MESLEKĐ DENEYĐMĐ
09.1998- 06.1999 -Đller Bankası 1. Bölge Müdürlüğü – Đçme suyu analiz laboratuarı
– su analizleri
09.2005-06.2006 -Pendik Anadolu Denizcilik Meslik Lisesi – Kimya Öğretmeni
09.2005-02.2006 -80.yıl Nuh Çimento Lisesi – Kimya Öğretmeni
09.2007-12.2007 -Orta Doğu Teknik Üniversitesi Çevre Analiz Laboraturarı – Su

analizleri
01.2008 – -Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Analitik Kimya Anabilim Dalı

– Araştırma Görevlisi

Estradđol Valerat Ve Dđenogest'Đn Farmasötđk Preparatlarda Ayni Anda Mđktar Tayđnlerđ

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Estradđol Valerat Ve Dđenogest'Đn Farmasötđk Preparatlarda Ayni Anda Mđktar Tayđnlerđ

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ

ESTRADĐOL VALERAT VE DĐENOGEST’ĐN FARMASÖTĐK

PREPARATLARDA AYNI ANDA MĐKTAR TAYĐNLERĐ

Mehmet Gökhan ÇAĞLAYAN

ANALĐTĐK KĐMYA ANABĐLĐM DALI

ESTRADĐOL VALERAT VE DĐENOGEST’ĐN FARMASÖTĐK

Mehmet Gökhan ÇAĞLAYAN

ANALĐTĐK KĐMYA ANABĐLĐM DALI

Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü

Analitik Kimya Yüksek Lisans Programı

Çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından

Tez Savunma Tarihi : 03/07/2009

Prof. Dr. Feyyaz ONUR

Prof. Dr. Nilgün GÜNDEN GÖĞER Prof. Dr. Sibel A. ÖZKAN

Doç. Dr. Uğur TAMER Doç. Dr. Bengi USLU

Simgeler ve Kısaltmalar viii

1.1. Giriş ve Amaç 1

1.2. Kimyasal ve Fiziksel Özellikler 3

1.2.1. Estradiol Valerat 3

1.3. Türkiye’de Dienogest Đçeren Ticari Preparat 10

1.4. Türkiye’de Dienogest ve Estradiol Valerat Đçeren Preparat 10

1.5. Dünyada Dienogest Đçeren Ticari Preparatlar 12

1.6. Türkiye’de Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 13

1.7. Dünyada Estradiol Valerat Đçeren Ticari Preparatlar 14

1.8. Üzerinde Çalışma Yapılan Etken Maddelerin Miktar Tayinleri 31

1.8.1. Estradiol Valerat Miktar Tayini Đçin Yapılmış Çalışmalar 31

1.8.1.1. Spektrofotometrik Yöntemler 31

1.8.1.2. Kromatografik Yöntemler 32

1.8.1.3. Voltametrik Yöntemler 34

1.8.1.4. Kapiler Elektroforez 34

1.8.2. Dienogest Miktar Tayini Đçin Yapılmış Çalışmalar 35

1.8.2.2. Kromatografik Yöntemler 36

2.1. Kullanılan Yöntemler 37

2.1.1. Türev Spektrofotometri 37

2.1.2. Kemometrik Yöntemler 43

2.1.2.1. Temel Bileşen Regresyon Yöntemi ve Kısmi En Küçük Kareler 45

2.1.2.2. Đstatistiksel Değerlendirme 48

2.1.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi 50

2.1.3.1. Sistem Uygunluk Testleri 60

2.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ve Orijinleri 66

2.3. Kullanılan Cihazlar 66

2.4. Kullanılan Bilgisayar Programları 66

2.5. Kullanılan Bilgisayar Konfigürasyonu 67

2.6. Üzerinde Çalışma Yapılan Farmasötik Preparat 67

2.7. Standart Maddelerin Stok Çözeltileri 67

2.7.1. Türev Spektrofotometride 67

2.7.2. Kemometrik Yöntemlerde 67

2.7.3. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisinde 68

3.1. Kullandığımız Etken Maddelerin Saflık Kontrolleri 69

3.1.1. Dienogest için Saflık Kontrolü 69

3.1.2. Estradiol Valerat için Saflık Kontrolü 69

3.2. Kemometrik Tekniklerle Spektroskopik Verilerin Değerlendirilmesi 74

3.2.1. Kemometrik Çalışmalar 74

3.2.2. Dienogest - Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 75

3.2.3. Dienogest - Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 79

3.2.4. ANOVA Testi 81

3.2.5. TBR ve KEK Yöntemlerinin Farmasötik Preparatlara Uygulanması 82

3.2.5.2. Farmasötik Preparata Uygulama 85

3.2.6. Kemometrik Yöntemlerle Elde Edilen Sonuçlara Göre TSH, KSH ve 88

3.3. Türev Spektrofotometri ile Yapılan Miktar Tayini Çalışmaları 92

3.3.1. Dienogest – Estradiol Valerat Karışımında Dienogest ve Estradiol 94

3.3.2.1. Seçicilik 102

3.3.2.2. Farmasötik Preparata Uygulama 104