Εργαστηριακές Ασκήσεις Κλινικής Χημείας

Εργαστηριακές ασκήσεις
κλινικής χημείας
ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ:
ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ ΠΕΤΡΟΣ
Καθηγητής Εφαρμογών Κλινικής Χημείας
ΓΕΩΡΓΙΟΥ ΖΩΗ
Κλινική Χημικός, Ph.D.
ΚΡΟΥΠΗΣ ΧΡΗΣΤΟΣ
Επίκουρος καθηγητής Κλινικής χημείας – Μοριακής Διαγνωστικής
ΠΑΠΑΙΩΑΝΝΟΥ ΑΓΓΕΛΟΣ
Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας
ΠΛΑΓΕΡΑΣ ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ
Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής χημείας
ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ
Καθηγητής Βιοϊατρικής Τεχνολογίας
ΤΣΟΤΣΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΕΛΕΝΗ

Χημικός Ph.D.
ΦΟΥΝΤΖΟΥΛΑ ΧΡΙΣΤΙΝΑ
Επίκουρη Καθηγήτρια Χημείας
ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΑ

ΣΥΓΓΡΑΜΜΑΤΑ ΚΑΙ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ
2
Εργαστηριακές ασκήσεις κλινικής χημείας
Συγγραφή
Γεωργίου Ζωή,
Κλινική Xημικός, Ph.D. Βιοχημικό Εργαστήριο, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας
Καρκαλούσος Πέτρος,
Καθηγητής Εφαρμογών Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας
Κρούπης Χρήστος,
Επίκουρος Καθηγητής Κλινικής Χημείας – Μοριακής Διαγνωστικής, Εργαστήριο Κλινικής Βιοχημείας,
Αττικό Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή,
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Παπαϊωάννου Άγγελος,
Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Θεσσαλίας
Πλαγεράς Παναγιώτης,
Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Θεσσαλίας
Σπυρόπουλος Βασίλειος,
Καθηγητής Βιοϊατρικής τεχνολογίας, Τμήμα Μηχανικών Βιοϊατρικής Τεχνολογίας, ΤΕΙ Αθήνας
Τσότσου Γεωργία Ελένη,

Χημικός Ph.D. Επιστημονικός Συνεργάτης Εργαστηρίου Κλινικής Χημείας,
Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας
Φούντζουλα Χριστίνα,
Επίκουρη Καθηγήτρια Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας
Κριτικός αναγνώστης
Γιώργος-Αλβέρτος Καρίκας
Καθηγητής Βιοχημείας - Κλινικής Χημείας, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας
Συντελεστές έκδοσης
ΓΛΩΣΣΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Νεκταρία Κλαδά
ΓΡΑΦΙΣΤΙΚΗ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ & TEXNIKH ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: Πέτρος Σταυρουλάκης
Copyright © ΣΕΑΒ, 2015

Το παρόν έργο αδειοδοτείται υπό τους όρους της άδειας: Αναφορά Δημιουργού - Μη Εμπορική
Χρήση - Όχι Παράγωγα Έργα 3.0 Ελλάδα (CC BY-NC-ND 3.0 GR)
ΣΥΝΔΕΣΜΟΣ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ

Εθνικό Μετσόβιο Πολυτεχνείο
Ηρώων Πολυτεχνείου 9, 15780 Ζωγράφου
www.kallipos.gr
ISBN: 978-960-603-113-7
3
Αφιερώνεται στους ανθρώπους που δοκιμάζονται,
αλλά συνεχίζουν να αγωνίζονται, στον τόπο τους ή σε τόπους μακρινούς
4
5
Ευχαριστίες
Θα θέλαμε ιδιαίτερα να ευχαριστήσουμε τα παρακάτω άτομα που συνέβαλαν στην παραγωγή του
οπτικοακουστικού υλικού του συγγράμματος:
 Θεοδώρα Νικολακοπούλου, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων

 Γιάννης Κλάρας, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο βιοχημείας και τοξικολογίας, ΠΕΔΥ
 Νικολίτσα Καφάτη, Βιοπαθολόγος, Διευθύντρια ΕΣΥ, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ
Λαϊκό
 Παναγιώτα Χριστοφίδη, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Διαγνωστικό κέντρο: Δημήτρης Παπανδρέ-
ου - Ιατρικές Υπηρεσίες ΑΕ
 Δημήτρης Χρονόπουλος, Βιολόγος, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό
 Καλλιρόη Τσαλιμαλμά, Βιοπαθολόγος, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμβατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό
 Φελιπινία Τσουμπρή, Βοηθός Ιατρικών και Βιολογικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ανοσολογίας και Ιστοσυμ-
βατότητας, ΓΝΑ Λαϊκό
 Αλίκη Ινιωτάκη, Βιοπαθολόγος, Διευθύντρια ΕΣΥ, Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμο-
σχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς
 Κυριακή Μασσέλου, Βιοπαθολόγος, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας, Τμήμα Ιστοσυμβατό-
τητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς
 Δήμητρα Μελισσού, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας,
Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς
 Κατερίνα Μανδαράκα, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Εργαστήριο πρωτεϊνών και ελέγχου ανοσίας,
Τμήμα Ιστοσυμβατότητας και ανοσολογίας μεταμοσχεύσεων, ΓΝΑ Γ. Γεννηματάς
6
7
Πρόλογος
Το σύγγραμμα περιλαμβάνει τις σημαντικότερες εργαστηριακές τεχνικές που μπορούν να
χρησιμοποιηθούν στα βιοχημικά εργαστήρια ή αλλιώς εργαστήρια κλινικής χημείας. Προσπαθεί να καλύψει
όλο το φάσμα των γνώσεων που χρειάζονται οι εκπαιδευόμενοι φοιτητές ή απόφοιτοι στον εργαστηριακό
χώρο της κλινικής χημείας, ανεξαρτήτου σχολής και τμήματος φοίτησης. Έτσι περιλαμβάνονται, τόσο απλές
τεχνικές που γίνονται κυρίως σε χώρους εκπαίδευσης, όσο και πολύπλοκες τεχνικές που εφαρμόζονται σε
εξειδικευμένα βιοχημικά εργαστήρια νοσοκομείων, διαγνωστικών κέντρων και ερευνητικών κέντρων. Τα
θέματα που καλύπτονται εδώ, δεν αφορούν μόνο φοιτητές, αλλά και ασκούμενους σε βιοχημικά εργαστήρια
που ενδιαφέρονται κυρίως να κατανοήσουν την σχετική τεχνολογία. Επιπλέον, κάποια από τα κεφάλαια που
αναπτύσσονται σε αυτό το σύγγραμμα αφορούν εξίσου και εργαζόμενους εργαστηριακούς επιστήμονες σε
εργαστήρια κλινικής χημείας.
Ενδεικτικά οι τεχνικές που παρουσιάζονται είναι: οι φωτομετρήσεις τελικού και κινητικού σταδίου,
η ποτενσιομετρία, η μέτρηση αερίων, η ηλεκτροφόρηση, οι τεχνικές χρωματογραφίας με έμφαση στην υγρή
χρωματογραφία υψηλής απόδοσης, οι ανοσοχημικές μέθοδοι με έμφαση στην ELISA και στη
χημειοφωταύγεια, η ατομική απορρόφηση και η υπέρυθρη φασματοσκοπία. Επιπλέον παρουσιάζονται
σημαντικά θέματα που αφορούν τις αναλύσεις κλινικής χημείας όπως είναι η εξέλιξη της σχετικής
βιοϊατρικής τεχνολογίας, ο έλεγχος ποιότητας των αποτελεσμάτων, τα διεθνή πρότυπα για τα
ιατροδιαγνωστικά προϊόντα στο χώρο της κλινικής χημείας, η ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων, η επικύρωση
και επαλήθευση των εργαστηριακών μεθόδων καθώς και η βιοασφάλεια στα βιοχημικά εργαστήρια.
Ο επιμελητής της έκδοσης Πέτρος Καρκαλούσος
8
9
Οι συγγραφείς κάθε κεφαλαίου
1. Βασικές αρχές φωτομετρίας και χρωματομετρικών αναλύσεων, Άγγελος Παπαϊωάννου, Παναγιώτης Πλα-
γεράς
2. Χρωματομετρικοί προσδιορισμοί τελικού σημείου. Παραδείγματα από την κλασική κλινική χημεία κατά
τον προσδιορισμό υποστρωμάτων. Βαθμονόμηση και τεχνική, Γεωργία Ελένη Τσότσου
3. Κινητικοί χρωματομετρικοί προσδιορισμοί. Παραδείγματα από την κλασική κλινική χημεία: προσδιορι-
σμός ενζύμων. Βαθμονόμηση και τεχνική, Γεωργία Ελένη Τσότσου.
4. Εργαστηριακός έλεγχος οξεοβασικής ισορροπίας και ηλεκτρολυτών, Γεωργία Ελένη Τσότσου.
5. Ηλεκτροφόρηση. Βασικές αρχές. Σύγχρονη τεχνολογία. Εφαρμογές στην Κλινική Χημεία, Άγγελος Πα-
παϊωάννου, Παναγιώτης Πλαγεράς
6. Ανοσοχημικοί προσδιορισμοί. Βασικές τεχνικές ELISA, Πέτρος Καρκαλούσος
7. Αυτόματοι αναλυτές και σύγχρονη βιοϊατρική τεχνολογία στο εργαστήριο κλινικής χημείας, Βασίλειος
Σπυρόπουλος.
8. Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (απόδοσης) στην κλινική χημεία. Βασικές αρχές και παραδείγματα,
Γεωργία Ελένη Τσότσου.
9. IVD προϊόντα – εσώκλειστα φυλλάδια των αντιδραστηρίων και πληροφορίες που περιλαμβάνουν. Ο
προσδιορισμός των τιμών αναφοράς και άλλες σχετικές απαιτήσεις, Χρήστος Κρούπης
10. Υλικά αναφοράς – ιχνηλασιμότητα. Διαπίστευση εργαστηρίων. Η έννοια της αβεβαιότητας, Χρήστος
Κρούπης
11. Ο έλεγχος ποιότητας στις σύγχρονες αναλύσεις κλινικής χημείας, Άγγελος Παπαϊωάννου, Παναγιώτης
Πλαγεράς
12. Η ατομική απορρόφηση και οι εφαρμογές της, Ζωή Γεωργίου
13. Η υπέρυθρη φασματοσκοπία και οι εφαρμογές της στην κλινική χημεία, Χριστίνα Φούντζουλα
14. Υγιεινή και ασφάλεια εργασίας στο κλινικό εργαστήριο. Διαχείριση υγειονομικών αποβλήτων, Ζωή Γε-
ωργίου
15. Eρωτήσεις/Απαντήσεις επανάληψης, Συλλογικό
16. Αγγλοελληνικό και Ελληνοαγγλικό λεξιλόγιο, Συλλογικό
10
11
Πίνακας περιεχομένων
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ
ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ ...................................................................................................................................... 19
Σύνοψη .......................................................................................................................................................... 19
Προαπαιτούμενες γνώσεις ............................................................................................................................ 19
1.1 Η φύση του φωτός ......................................................................................................................... 19
1.2 Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell .................................................................................. 19
1.4 Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα) ................................................................................. 20
1.5 Η Φασματοσκοπία ......................................................................................................................... 21
1.6 Ο νόμος Lambert – Beer................................................................................................................ 21
1.6.1 Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer .................................................................... 21
1.7 Το Φασματοφωτόμετρο ................................................................................................................. 22
1.7.1 Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου ........................................................................................... 22
1.7.2 Η διαδικασία της Φωτομέτρησης .............................................................................................. 22
1.7.3 Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας .................................................................................. 22
1.7.3.2 Ο Ποσοτικός Προσδιορισμός ................................................................................................ 23
1.9 Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis ................................................................................................... 24
1.10 Η Βαθμονόμηση των οργάνων.............................................................................................................. 25
1.11 Τα υλικά Βαθμονόμησης (Calibrators) ......................................................................................... 26
1.12 Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων ................................................................................... 26
1.13 Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης ........................................................................................................ 26
1.13.1 Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη) ....................................................................... 26
1.13.2 Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method) ................................ 27
1.13.4 Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών .................................................................................. 30
1.13.5 Η μέθοδος Παρεμβολής......................................................................................................... 31
1.13.6 Η μέθοδος της Μειώσεως κατά Γνωστή Ποσότητα .............................................................. 31
1.14 Η εξίσωση Αναφοράς ή Συνάρτηση Βαθμονόμησης ................................................................ 32
1.15 Ο έλεγχος της Καμπύλης Βαθμονόμησης ή Αναφοράς ................................................................ 32
1.16 Η αρχή της μεθόδου της Παλινδρόμησης ..................................................................................... 32
1.17 Η εκτίμηση της Ευθείας Παλινδρόμησης με τη Μέθοδο Ελαχίστων Τετραγώνων (Least Squares
Method) 33
1.18 Η γραμμική Καμπύλη Παλινδρόμησης με Διαστήματα Εμπιστοσύνης ........................................ 34
1.19 Σύνοψη της πορείας της Προσαρμογής (Παλινδρόμησης) ........................................................... 34
1.20 Τα Διαστήματα Εμπιστοσύνης.............................................................................................................. 34
1.20 O Συντελεστής Συσχετίσεως (Correlation Coefficient) ................................................................ 35
1.21 Η Μη Γραμμική Παλινδρόμηση.................................................................................................... 35
1.22 Η Γραμμικότητα της Μεθόδου Ανάλυσης .................................................................................... 36
1.23 Το Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection)..................................................................................... 36
1.24 Το Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation) ...................................................................... 37
1.25 Εφαρμογές ..................................................................................................................................... 37
Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο ....................................................................................... 40
Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο ........................................................................................................ 40
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο\ ........................................................................................ 40
Aναφορές ...................................................................................................................................................... 40
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο . ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΗΜΕΙΟΥ.
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΑ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ
ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ ................................................................. 42
2.1 Εισαγωγή................................................................................................................................................. 42
2.2 Κριτήρια επιλογής αναλυτικής μεθοδολογίας στην Kλινική Aνάλυση .................................................. 42
2.3 Φωτομετρικές Aναλυτικές Mέθοδοι στην Kλινική Aνάλυση ................................................................. 44
2.4 Μεθοδολογίες Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών ...................................................................... 46
2.4.1 Μέθοδοι Τελικού Σημείου Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών ........................................... 47
12
2.5 Πειραματικό Μέρος ................................................................................................................................ 53
2.5.1 Προσδιορισμός γλυκόζης με μέθοδο Τελικού Σημείου ................................................................... 53
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 O. ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ ....................................................................... 57
ΣΎΝΟΨΗ .............................................................................................................................................. 57
ΠΡΟΑΠΑΙΤΟΎΜΕΝΕΣ ΓΝΏΣΕΙΣ........................................................................................................ 57
3.1 Εισαγωγή................................................................................................................................................. 57
3.2 Βασικές αρχές Χημικής και Ενζυμικής Κινητικής ................................................................................. 58
3.2.1 ΧΗΜΙΚΉ ΚΙΝΗΤΙΚΉ .................................................................................................................. 58
3.2.2 ΕΝΖΥΜΙΚΉ ΚΙΝΗΤΙΚΉ ............................................................................................................. 59
3.3 Κινητικές μέθοδοι Κλινικών Προσδιορισμών ........................................................................................ 61
3.3.1 ΑΡΧΈΣ ΚΙΝΗΤΙΚΉΣ ΜΕΘΌΔΟΥ ............................................................................................... 61
3.3.2 Πλεονεκτήματα Κινητικών Μεθόδων ............................................................................................. 63
3.3.3 Ενζυμική Δραστικότητα και Συγκέντρωση ..................................................................................... 63
3.3.4 Πειραματική διαδικασία Ποσοτικού Φωτομετρικού Κλινικού Προσδιορισμού με Κινητική
Μέθοδο 64
3.3.5 Υπολογισμός Ενζυμικής Συγκέντρωσης ................................................................................... 64
3.3.6 Πρωτόκολλο ανάλυσης με Κινητική Μέθοδο ........................................................................... 65
3.4 Πειραματικό μέρος 3.4.1 Προσδιορισμός Αμυλάσης με Κινητική μέθοδο ................................. 69
3.4.2 Προσδιορισμός GOT με Κινητική Μέθοδο................................................................................... 70
Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο ....................................................................................... 72
Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο ........................................................................................................ 72
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο. ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΟΞΕΟΒΑΣΙΚΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ ΚΑΙ
ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ .............................................................................................................................. 74
Σύνοψη .......................................................................................................................................................... 74
4.1 Οξεοβασική Ισορροπία.................................................................................................................. 74
4.1.1 Ορισμοί- Βασικές Έννοιες ........................................................................................................ 74
4.1.1 Σημασία Οξεοβασικής Ισορροπίας .................................................................................................. 75
4.1.3 Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Οξεοβασικής Ισορροπίας............................................ 75
4.1.4 Διαταραχές της Οξεοβασικής Ισορροπίας ..................................................................................... 77
4.1.5 Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση οξεοβασικών διαταραχών .......................................... 79
4.1.6 Εκτίμηση του Είδους της Οξεοβασικής Διαταραχής και Κλινική Σημασία των αποτελεσμάτων της
ανάλυσης................................................................................................................................................... 82
4.1.7 Οργανολογία .................................................................................................................................... 84
4.1.8 Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης ........................................................... 89
4.2 Ηλεκτρολυτική Ισορροπία ............................................................................................................. 90
4.2.2 Σημασία Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας....................................................................................... 93
4.2.3 Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας ................................ 93
4.2.4 Διαταραχές της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας .................................................................................. 96
4.2.5 Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση ηλεκτρολυτικών διαταραχών ..................................... 97
4.2.6 Οργανολογία .................................................................................................................................. 101
4.3 Πειραματικό μέρος................................................................................................................................ 109
4.3.2 Ηλεκτρολυτική Ισορροπία ............................................................................................................. 110
Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο ...................................................................................................... 113
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο ....................................................................................... 114
Αναφορές .................................................................................................................................................... 114
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ – ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ.
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ........................................................................................ 116
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 116
Προαπαιτούμενες γνώσεις .......................................................................................................................... 116
5.1 Η ηλεκτροφόρηση ως βασική μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών .................................................. 116
5.2 Οι βασικές αρχές της Ηλεκτροφόρησης ............................................................................................... 116
5.2.2 Τα Υποστρώματα της Ηλεκτροφόρησης ........................................................................................... 118
5.2.3 Χρώση κλασμάτων ............................................................................................................................ 120
5.2.4 Καθήλωση και ανίχνευση των συστατικών μείγματος .................................................................. 121
13
5.2.5 Πυκνομετρία (densitometry) .............................................................................................................. 122
5.2.6 Εργαστηριακά όργανα και σκεύη Ηλεκτροφόρησης ..................................................................... 122
5.2.7 Το βιολογικό δείγμα ...................................................................................................................... 123
5.2.8 Διαχωριστική ικανότητα - τεχνικές ηλεκτροφόρησης ................................................................... 123
5.3 Τα χαρακτηριστικά ορισμένων τεχνικών Hλεκτροφόρησης................................................................. 124
5.3.1 Ηλεκτροφόρηση σε Oξική Κυτταρίνη και Nιτρική Kυτταρίνη ..................................................... 124
5.3.2 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Αγαρόζης ............................................................................................... 124
5.3.3 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aκρυλαμιδίου ........................................................................................ 125
5.3.4 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aμύλου .................................................................................................. 126
5.4 H Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση .............................................................................................................. 126
5.5 Η Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης) ............................. 128
5.6 Πειραματικό μέρος ...................................................................................................................... 129
5.6.1 Αντιδραστήρια και αναλώσιμα ...................................................................................................... 129
5.6.2 Συσκευές και υλικά........................................................................................................................ 129
5.6.3 Προετοιμασία της διαδικασίας ...................................................................................................... 130
5.7 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων ................................................................................................................ 136
5.7.1 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Γαλακτικής Αφυδρογονάσης (LDH) ............................................. 136
5.7.2 Η Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Αλκαλικής Φωσφατάσης .............................................. 138
5.7.3 H Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Κρετανικής Κινάσης ..................................................... 140
5.8 Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρίνης (Γλυκοζυλιωμένη Αιμοσφαιρίνη) .................................................... 142
Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο ..................................................................................... 145
Aναφορές .................................................................................................................................................... 146
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ο ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ELISA ............ 148
6.1 Εισαγωγή............................................................................................................................................... 148
6.2 Η βασική αρχή των Ανοσοχημικών τεχνικών ....................................................................................... 148
6.3 Οι κατηγορίες των Ανοσοχημικών τεχνικών ........................................................................................ 149
6.3.1 Ομογενείς και Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι ...................................................................... 149
6.3.2 Οι διαφορές των Ανοσοχημικών μεθόδων ανάλογα με τον Ιχνηθέτη ........................................... 150
6.3.3 Ανταγωνιστικοί και μη Ανταγωνιστικοί μέθοδοι .......................................................................... 154
6.4 Οι Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι, η ELISA ................................................................................ 155
6.4.1 Βασικά αντιδραστήρια και αναλώσιμα που περιέχονται στα kits της ELISA ............................... 157
6.4.2 Υλικά και Εξοπλισμός που δεν παρέχονται με τα kits .................................................................. 158
6.4.3 Τα βασικά στάδια της μεθοδολογίας ELISA ................................................................................. 158
6.5 Εργαστηριακό μέρος ............................................................................................................................. 161
Παραδείγματα Ανταγωνιστικής και μη Ανταγωνιστικής ELISA ............................................................... 161
6.5.1 Ο προσδιορισμός της FT3 με ELISA ............................................................................................ 161
6.5.2 Ο Προσδιορισμός της TSH με ELISA ........................................................................................... 166
6.6 Παρατηρήσεις και επιπλέον πληροφορίες για τις Καμπύλες Βαθμονόμησης ...................................... 170
6.6.1 Μονά ή Διπλά δείγματα; ................................................................................................................ 170
6.6.2 H Διχρωματική Ανάλυση .............................................................................................................. 170
6.6.3 Άλλοι τρόποι υπολογισμού των Εξισώσεων Αναφοράς ................................................................ 170
6.7 Στοιχεία για τις άλλες Ανοσοχημικές μεθόδους ................................................................................... 171
6.7.1 Χημειοφωταύγεια .......................................................................................................................... 171
6.8 Οι Ομογενείς Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί ..................................................................................... 175
6.8.1 Η Ανοσοενζυμική Ενισχυμένη μέθοδος ........................................................................................ 175
6.8.2 Ο Πολωμένος Φθορισμός .............................................................................................................. 175
6.8.3 Η Μικροσωματιδιακή Ανάλυση .................................................................................................... 176
6.9 Παράγοντες που επηρεάζουν τις Ανοσοχημικές αναλύσεις ................................................................. 177
6.9.1 Το φαινόμενο του Αγκίστρου ........................................................................................................ 177
6.9.2 Τα Eτερόφιλα Αντισώματα............................................................................................................ 177
6.9.3 Τα Αυτοαντισώματα ...................................................................................................................... 178
6.9.4 Τα Θεραπευτικά Αντισώματα........................................................................................................ 178
6.9.5 Άλλοι ανοσολογικοί παράγοντες που παρεμβαίνουν στις μετρήσεις ............................................ 178
14
Αναφορές .................................................................................................................................................... 182
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Ο. ΑΥΤΌΜΑΤΟΙ ΑΝΑΛΥΤΈΣ. ΚΑΙ ΣΎΓΧΡΟΝΗ BΙΟΪΑΤΡΙΚΉ
ΤΕΧΝΟΛΟΓΊΑ ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΉΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΉΣ ΧΗΜΕΊΑΣ ...................................................... 183
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 183
7.1 Εισαγωγή............................................................................................................................................... 183
7.2 Πλήρη Οπτικά Συστήματα Αυτόματων Αναλυτών............................................................................... 188
7.3 Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν Χρωματομετρικές, Ανοσοχημικές κ.λπ. αναλύσεις .................... 196
7.4 Εργαστηριακά Συστήματα Πληροφοριών............................................................................................. 202
7.5 Αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες............................................................................................. 205
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο ................................................................................ 220
Αναφορές .................................................................................................................................................... 220
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Ο. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ) (HPLC)
ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ..................................... 222
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 222
8.1 Εισαγωγή............................................................................................................................................... 222
8.2 Διάκριση Χρωματογραφικών τεχνικών ................................................................................................ 223
8.2.1 Χρωματογραφία Στήλης ................................................................................................................ 224
8.2.2 Επίπεδη Χρωματογραφία .............................................................................................................. 224
8.2.3 Αέρια Χρωματογραφία .................................................................................................................. 226
8.2.4 Υγρή Χρωματογραφία ................................................................................................................... 227
8.2.5 Άλλες Χρωματογραφικές τεχνικές ................................................................................................ 227
8.2.6 Χρωματογραφία HPLC ................................................................................................................. 229
8.3 Οργανολογία HPLC .............................................................................................................................. 232
8.4 Σύνοψη των βασικών σταδίων της Χρωματογραφίας Στήλης .............................................................. 233
8.4.1 Σύγκριση HPLC/TLC .................................................................................................................... 234
8.5 Βασικές έννοιες που περιγράφουν μία Xρωματογραφική ανάλυση ..................................................... 234
8.6 Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός με Χρωματογραφία HPLC .................................................. 241
8.6.1 Ποιοτικός προσδιορισμός .............................................................................................................. 241
8.7 Παραδείγματα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού ................................................................ 244
8.7.1 Η επιλογή της Στατικής Φάσης ..................................................................................................... 244
8.7.2 Η επιλογή της Κινητής Φάσης ....................................................................................................... 245
8.7.3 Παράδειγμα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Σιμβαστατίνης σε ορό ........................ 247
8.8 Εφαρμογές της HPLC στην Κλινική Ανάλυση ..................................................................................... 251
8.8.1 Προσδιορισμός των επιπέδων της Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης και άλλων Αιμοσφαιρινικών
κλασμάτων με HPLC .............................................................................................................................. 251
8.9 Πειραματικό μέρος................................................................................................................................ 252
8.9.1 Προσδιορισμός συγκέντρωσης Σιμβαστατίνης σε ορό.................................................................. 252
8.9.2 Παράδειγμα προσδιορισμού HbA1c με HPLC .............................................................................. 256
Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο ........................................................................................... 258
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο ................................................................................ 259
Αναφορές .................................................................................................................................................... 260
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Ο. IVD ΠΡΟЇΟΝΤΑ-ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ
ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ. Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ
ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΆΛΛΕΣ ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ .................................................................. 261
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 261
9.1 Εισαγωγή για τα IVDs .......................................................................................................................... 261
9.2 Γενικές προδιαγραφές των IVDs .......................................................................................................... 263
9.3 Ετικέτα και εσώκλειστα φυλλάδια των IVDs ....................................................................................... 264
9.4 Αναλυτικά χαρακτηριστικά των ΙVD αντιδραστηρίων......................................................................... 265
15
9.5 Προσδιορισμός τιμών αναφοράς........................................................................................................... 269
Αναφορές .................................................................................................................................................... 271
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Ο. ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ. ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ. Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ………………………………………….. ..... 272
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 272
10.1 Υλικά αναφοράς – Ιχνηλασιμότητα .................................................................................................... 272
10.2 Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων ................................................................................................... 277
10.3 Αβεβαιότητα ....................................................................................................................................... 280
Πηγές από το διαδίκτυο για εύρεση υλικών αναφοράς............................................................................... 286
Αναφορές .................................................................................................................................................... 286
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 11 Ο. Ο ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΙΣ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ ΚΛΙΝΙΚΗΣ
ΧΗΜΕΙΑΣ .......................................................................................................................................... 288
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 288
11.1 Βασικές έννοιες ........................................................................................................................... 288
11.1.1 Προ-αναλυτικοί παράγοντες.................................................................................................... 288
11.1.2 Αναλυτικοί παράγοντες ........................................................................................................... 289
11.1.3 Μετα-αναλυτικοί παράγοντες.................................................................................................. 289
11.1.4 Διαχείριση ολικής ποιότητας ................................................................................................... 289
11.2 Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας.................................................................................................. 292
11.2.1 Ακρίβεια και Ολικό Σφάλμα (Total Error) .............................................................................. 292
11.2.3 Ορθότητα (Trueness) και Συστηματικό σφάλμα (Systematic error) ....................................... 297
11.2.4 Πιστότητα ................................................................................................................................ 298
11.2.5 Η Αβεβαιότητα της ανάλυσης ................................................................................................. 298
11.2.7 Ολικό Εργαστηριακό Σφάλμα (Total Laboratory Error) ......................................................... 300
11.3.1 Υλικά ελέγχου ......................................................................................................................... 301
11.3.2 Χάρτες ή Διαγράμματα Ελέγχου ............................................................................................. 301
11.3.3 Κατασκευή Χαρτών Ελέγχου Levey – Jennings ..................................................................... 302
11.3.4 Κριτήρια Westgard .................................................................................................................. 303
11.3.5 Κριτήρια χρήσης ενός Υλικού Ελέγχου .................................................................................. 303
11.3.6 Ο Εσωτερικός Ποιοτικός Έλεγχος της Ορθότητας (ακρίβειας) (Συσσωρευτικό Αθροιστικό
Διάγραμμα (Cusum chart, CUSUM) ...................................................................................................... 306
11.4 O Eξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας...................................................................................................... 308
11.4.1 Ορισμός του Εξωτερικού ελέγχου Ποιότητας ............................................................................. 308
11.4.2 Βασικοί στόχοι του Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας.................................................................. 308
11.4.3 Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA (Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Διαγνωστικών και
Βιοαναλυτικών Εργαστηρίων ................................................................................................................. 309
11.4.4 Αξιολόγηση των επιδόσεων των εργαστηρίων σε προγράμματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας
309
11.4.5 Διαγράμματα................................................................................................................................ 310
Aναφορές .................................................................................................................................................... 314
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12 O. Η ΑΤΟΜΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ........................... 315
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 315
12.1 Εισαγωγή............................................................................................................................................. 315
12.1.1 Τα Χημικά Στοιχεία του ανθρώπινου οργανισμού ...................................................................... 315
12.1.3 Ο ρόλος των Ιχνοστοιχείων ......................................................................................................... 316
12.2 Η δράση των τοξικών Ιχνοστοιχείων .................................................................................................. 316
12.3 Μέθοδοι προσδιορισμού Ιχνοστοιχείων ............................................................................................. 317
12.4 Δειγματοληψία .................................................................................................................................... 317
12.4.1 Επεξεργασία Δειγμάτων .............................................................................................................. 318
12.5 H αρχή λειτουργίας Φασματοσκοπίας Ατοµικής Απορρόφησης........................................................ 319
12.6 Τα βασικά τμήματα των συστημάτων Ατομοποίησης ........................................................................ 319
16
12.6.1 Οι πηγές Ακτινοβολίας για την Ατομική Απορρόφηση............................................................... 320
12.6.2 Το σύστηµα Ατοµοποίησης (Καύσης και Εκνέφωσης)............................................................... 321
12.6.3 Το Οπτικό Σύστηµα και το Σύστηµα Μέτρησης ......................................................................... 324
12.6.4 Υπολογισμοί, Καμπύλη Αναφοράς και Έλεγχος Ποιότητας ....................................................... 325
12.7 Πειραματικό μέρος.............................................................................................................................. 326
12.7.1 Υλικά και αντιδραστήρια............................................................................................................. 326
12.7.2 Τα βήματα εφαρμογής ................................................................................................................. 326
12.8 Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων .................................................................................................... 327
12.9 Ασφάλεια Εργαστηρίου ...................................................................................................................... 328
Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο ........................................................................................... 329
Aναφορές .................................................................................................................................................... 330
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 13 Ο. Η ΥΠΕΡΥΘΡΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΣΤΗΝ
ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ .......................................................................................................................... 331
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 331
13.1 Εισαγωγή............................................................................................................................................. 331
13.1.1 H νεφρολιθίαση ........................................................................................................................... 331
13.1.2 Η σύσταση των ουρολίθων .......................................................................................................... 332
13.1.3 Μακροσκοπική εξέταση των ουρολίθων ..................................................................................... 334
13.1.4 Ποιοτική ανάλυση των Ουρολίθων ............................................................................................. 335
13.2 Υπέρυθρη φασματοσκοπία ................................................................................................................. 335
13.2.1 Υπέρυθρη ακτινοβολία ................................................................................................................ 335
13.2.2 Αρχή Φασματοσκοπίας Υπέρυθρου ............................................................................................ 337
13.2.3 Φασµατοσκοπία υπέρυθρου µε µετασχηµατισµό Fourier .......................................................... 340
13.3 Πειραματικό μέρος.............................................................................................................................. 343
13.3.1 Προετοιμασία δισκίου δείγματος................................................................................................. 343
13.3.2 Λήψη φάσματος ........................................................................................................................... 343
13.3.3 Αξιολόγηση φασμάτων FTIR ...................................................................................................... 345
Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο ..................................................................................... 347
Σχετικό οπτικό υλικό στο διαδίκτυο ........................................................................................................... 348
Αναφορές .................................................................................................................................................... 348
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 14 Ο. ΥΓΙΕΙΝΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ
ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΥΓΕΙΟΝΟΜΙΚΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ ........................................................................... 349
Σύνοψη ........................................................................................................................................................ 349
14.1 Υγιεινή και Ασφάλεια Εργασίας στο Κλινικό Εργαστήριο ................................................................ 349
14.1.1 Εισαγωγή ..................................................................................................................................... 349
14.1.2 Κύριες πηγές κινδύνου στα εργαστήρια ...................................................................................... 350
14.2 Διαχείριση Υγειονομικών Αποβλήτων - Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων (ΑΥΜ) ...................... 355
14.2.1 Εισαγωγή ..................................................................................................................................... 355
14.2.2 Είδη Αποβλήτων Υγειονομικών Μονάδων ................................................................................. 356
14.2.3 Μεταφορά και προσωρινή αποθήκευση ...................................................................................... 360
14.2.4 Αποκομιδή ................................................................................................................................... 361
14.2.5 Επεξεργασία - διάθεση ................................................................................................................ 362
14.2.6 Σχέδιο έκτακτης ανάγκης ............................................................................................................ 364
Σχετικό οπτικό υλικό και ενημερωτικό υλικό από το διαδίκτυο ................................................................ 367
Χρήσιμα ακρωνύμια από οδηγούς διαχείρισης ιατρικών αποβλήτων ........................................................ 367
Νομοθεσία................................................................................................................................................... 367
Αναφορές .................................................................................................................................................... 369
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 15 Ο. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ/ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ ................................................. 370
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 16 Ο. ΛΕΞΙΛΟΓΙΑ ......................................................................................................... 387
17
18
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1ο
ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑΣ
ΚΑΙ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΩΝ ΑΝΑΛΥΣΕΩΝ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό γίνεται εισαγωγή στις πιο ευρύτερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους στη κλινική χημεία, τις
φωτομετρικές ή αλλιώς χρωματομετρικές αναλύσεις. Βασίζονται στην ιδιότητα του φωτός να απορροφάται
από συγκεκριμένα έγχρωμα μόρια μέσα σε διαφανή διάλυμα. Το κεφάλαιο επεκτείνεται στην κατασκευή των
καμπυλών αναφοράς και στον υπολογισμό των άγνωστων συγκεντρώσεων με τη χρήση γνωστών συγκε-
ντρώσεων προτύπων διαλυμάτων. Περιγράφονται αναλυτικά πολλά διαφορετικά μαθηματικά μοντέλα υπο-
λογισμού των αγνώστων συγκεντρώσεων, καθώς και τα σημαντικότερα σημεία των καμπυλών αναφοράς
(π.χ. όριο ανίχνευσης). Τέλος, γίνεται εισαγωγή στην έννοια της αβεβαιότητας των μετρήσεων και στους
σχετικούς στατιστικούς υπολογισμούς.
·
Προαπαιτούμενες γνώσεις
Το πρώτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις φυσικής και ιδιαίτερα οπτικής (απορρόφηση
φωτός) και ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Θα χρειαστούν, αν και περιγράφονται αναλυτικά, βασικές γνώ-
σεις στατιστικής π.χ. μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων, συντελεστής συσχέτισης, μέση τιμή, τυπική απόκλιση
κ.α.
1.1 Η φύση του φωτός
Οι James Clerk Maxwell και ο Μax Planck, διατύπωσαν τις θεωρίες τους για τη φύση του φωτός, στις αρχές
του 20ου αιώνα, οι οποίες είναι αποδεκτές μέχρι σήμερα από την επιστημονική κοινότητα.
1.2 Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell
Το 1873 o Μaxwell διατύπωσε την ηλεκτρομαγνητική του θεωρία σύμφωνα με την οποία: «Κάθε χρονικά
μεταβαλλόμενο ηλεκτρικό πεδίο δημιουργεί ένα αλληλένδετο μεταβαλλόμενο μαγνητικό πεδίο και αντίστροφα.
Το ηλεκτρομαγνητικό πεδίο που δημιουργείται με τον παραπάνω τρόπο διαδίδεται στο χώρο με τη μορφή ηλε-
κτρομαγνητικών κυμάτων τα οποία, όπως παρατήρησε ο Maxwell, διαδίδονται με την ταχύτητα του φωτός. Συ-
νεπώς, το φως είναι ηλεκτρομαγνητικό κύμα».
Φως ονομάζεται η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που ανιχνεύεται από τον ανθρώπινο οφθαλμό.
Το ορατό φως αποτελεί ένα μικρό μέρος της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας. Τα μήκη κύματος που είναι
ορατά στο ανθρώπινο μάτι κυμαίνονται από 400 έως 700 nm περίπου. Συνεπώς, μόνο ένα μικρό μέρος της
ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας γίνεται αντιληπτό από τον άνθρωπο. Ο παρακάτω πίνακας (Πίνακας 1.1)
δείχνει τα χρώματα που αντιλαμβάνεται η ανθρώπινη όραση, ανάλογα με το μήκος κύματος της εκπεμπόμε-
νης ακτινοβολίας (Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012).
Μήκος κύματος (nm) Χρώμα

340-400 Υπεριώδες (δεν είναι ορατό)
400-430 Ιώδες
430-500 Μπλε
500-560 Πράσινο
560-620 Κίτρινο προς πορτοκαλί
620-700 Πορτοκαλί προς κόκκινο
πάνω από 700 Σχεδόν υπέρυθρο (δεν είναι ορατό)
Πίνακας 1.1 Μήκη κύματος και το αντίστοιχο χρώμα που αντιλαμβάνεται ο άνθρωπος με την όρασή του.
19
Σημείωση: Ένα χρώμα, π.χ. κίτρινο, δεν συνεπάγεται και γνώση του μήκους κύματος της ακτινοβολίας (590
nm), αλλά μπορεί να οφείλεται σε περισσότερες της μιας ακτινοβολίες με μήκη κύματος μεταξύ 590 και 600
nm). Φυσικά, ανάλογα με τον αριθμό των ακτινοβολιών και τα μήκη κύματος θα λαμβάνουμε κίτρινο χρώμα,
αλλά διαφορετικών αποχρώσεων.
1.3 Ηλεκτρομαγνητικό Φάσμα
Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα.
Περιοχή φάσματος Μήκος Κύματος

Ακτίνες Χ 0,3 – 100 Α
Υπεριώδες 200 – 380 nm
Ορατό 380 – 750 nm
Εγγύς Υπέρυθρο 0,75 – 2,5μm
Υπέρυθρο 2,5 – 15 μm
Άπω Υπέρυθρο 15 – 200 μm
Μικροκύματα 0,2 – 7,0 mm
Ραδιοσυχνότητες 100 – 10000 m
Πίνακας 1.2 Επιμέρους περιοχές του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος.
Όπως ήδη γίνεται φανερό, τα ηλεκτρομαγνητικά κύματα διαφέρουν τόσο ως προς τη συχνότητα, όσο
και ως προς το μήκος κύματός τους. Το σύνολο των συχνοτήτων των ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων αποτε-
λούν το ηλεκτρομαγνητικό φάσμα. Στον Πίνακα 1.2 παρουσιάζονται οι επιμέρους ζώνες του ηλεκτρομα-
γνητικού φάσματος.
1.4 Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα)

Η θεωρία του Maxwell δεν κατάφερε να ερμηνεύσει φαινόμενα που σχετίζονται με την αλληλεπίδραση του
φωτός και την ύλη (π.χ. φωτοηλεκτρικό φαινόμενο). Ο Planck, το 1900, για να εξηγήσει την ακτινοβολία που
παράγει ένα θερμαινόμενο σώμα διατύπωσε τη θεωρία των κβάντα φωτός. Σύμφωνα μ’ αυτή:
1. Κάθε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία εκπέμπεται και απορροφάται από τα άτομα της ύλης όχι με συνεχή
αλλά με μη συνεχή τρόπο. Δηλαδή κάθε άτομο εκπέμπει ή απορροφά στοιχειώδη ποσά ενέργειας (κβάντα
φωτός ή φωτόνια).
20
2. Κάθε φωτόνιο μεταφέρει ενέργεια (Ε), η οποία υπολογίζεται από τη σχέση: E = h  f, όπου h είναι η στα-
θερά του Planck (h = 6,63 10-34 Js).
Σημείωση: Ο Εinstein, στηριζόμενος στη θεωρία του Planck, εξήγησε το φωτοηλεκτρικό φαινόμενο. Έτσι, η
διπλή φύση του φωτός (κύμα και σωματίδιο) άνοιξε το δρόμο για την κατανόηση της συμπεριφοράς του
μικρόκοσμου.
1.5 Η Φασματοσκοπία
Όταν ένα σύστημα απορροφά ενέργεια, τότε διεγείρεται από τη βασική του κατάσταση σε μία διεγερμένη
κατάσταση, ενώ, όταν από μία διεγερμένη κατάσταση επανέρχεται στη βασική ή σε μια άλλη ενδιάμεση ε-
νεργειακή κατάσταση, τότε αποβάλλει ενέργεια. Έτσι, κάθε μεταπήδηση ηλεκτρονίων από μια ενεργειακή
στάθμη σε μια άλλη (μέσα στα άτομα ή στα μόρια) και κάθε περιστροφική κίνηση και δόνηση ομάδων ατό-
μων και μορίων, έχει ως αποτέλεσμα την απορρόφηση ή την αποβολή ενέργειας. Οι ενεργειακές αυτές μετα-
βολές γίνονται με τη μορφή ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με χαρακτηριστικό μήκος κύματος ή συχνότη-
τα ανάλογα με το είδος της ηλεκτρονικής μετάπτωσης ή της μοριακής κίνησης.
Η φασματοσκοπία ασχολείται με τον προσδιορισμό της συχνότητας ή του μήκους κύματος της α-
πορροφούμενης ή εκπεμπόμενης ακτινοβολίας καθώς και με τον καθορισμό των σχέσεων και των νόμων που
διέπουν τις μεταβολές αυτές.
Η φασματοφωτομετρία είναι ένα τμήμα της φασματοσκοπίας, που μελετά τις ποσοτικές σχέσεις που
διέπουν την ένταση της απορροφούμενης (ή εκπεμπόμενης) ακτινοβολίας και τους νόμους της απορρόφησης
του φωτός.
1.6 Ο νόμος Lambert – Beer

Οι Lambert & Beer μελετώντας μονοχρωματικές ακτινοβολίες κατέληξαν στον παρακάτω νόμο (γνωστός και
ως νόμος Beer‐Lambert), που αποτελεί την αρχή της φασματοφωτομετρίας:
Σχήμα 1.2 Αναπαράσταση της απορρόφησης του φωτός σε κυβέττα με έγχρωμο διάλυμα.
Η απορρόφηση (A) για σταθερό πάχος στοιβάδας (d) και ορισμένο μήκος κύματος φωτός είναι
γραμμική συνάρτηση της συγκέντρωσης του διαλύματος (C) της ουσίας που απορροφά (Σχήμα 1.2).
Συνεπώς:
Α = -logΤ = -log(I/Iο) = ε d C (Εξίσωση 1.1)
Η διαπερατότητα (Τ) εκφράζεται σε % (Αν Τ = 0% τότε η Α = ∞ και αν Τ = 100% τότε η Α = 0).

Η απεικόνιση της απορρόφησης (Α) σε συνάρτηση με το μήκος κύματος (λ) καλείται φάσμα απορρόφησης.
1.6.1 Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer

Γενικά θα πρέπει:
 τα διαλύματα να μην είναι πυκνά (0,1 < Α < 1),
 η ακτινοβολία να είναι μονοχρωματική,
 η κυψελίδα να έχει ομοιόμορφη διατομή,
21
 τα μόρια της διαλυμένης ουσίας να μην αντιδρούν μεταξύ τους,
 η μέτρηση να γίνεται στο λmax (το μήκος κύματος μέγιστης απορρόφησης, χαρακτηριστικό για κάθε έ-
νωση).
1.7 Το Φασματοφωτόμετρο
Η μέτρηση της απορρόφησης του φωτός και η καταγραφή ενός φάσματος απορρόφησης, π.χ. στην περιοχή
ορατού ‐ υπεριώδους (UV – Vis), γίνεται με ειδικά όργανα, τα φασματοφωτόμετρα (Σχήμα 1.3).
Σχήμα 1.3 Σχηματική παράσταση φασματοφωτόμετρου UV - Vis.
1.7.1 Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου

Η επιλογή φωτόμετρου πραγματοποιείται με βάση τις ανάγκες του εργαστηρίου.
Έτσι, όταν η χρήση του αφορά:

 ερευνητικούς σκοπούς: απαιτείται συνεχές φάσμα, μεγάλη ακρίβεια και επαναληψιμότητα,
 εξετάσεις καθημερινής χρήσης: απαιτείται ταχύτητα, επαναληψιμότητα, αυτοματοποίηση με φίλτρα, θερ-
μοστατούμενη κυψελίδα, χρονόμετρο, μνήμη και καταγραφικό.
Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και άλλοι παράμετροι, όπως:

 ευκολία στη χρήση,
 όγκος, σχήμα, δυνατότητα συντήρησης κ.α.
1.7.2 Η διαδικασία της Φωτομέτρησης

Γενικά πρέπει να ισχύουν τα παρακάτω:
 το διάλυμα που θα φωτομετρηθεί θα πρέπει να είναι σε ισορροπία.
 ο μηδενισμός του φωτόμετρου πραγματοποιείται με το τυφλό (blank) διάλυμα το οποίο περιέχει όλα τα
αντιδραστήρια και έχει υποστεί την ίδια διαδικασία με το προς μέτρηση διάλυμα, δεν περιέχει όμως την
ένωση που θέλουμε να προσδιορίσουμε.
 οι κυψελίδες που θα χρησιμοποιηθούν θα πρέπει να είναι ίδιες και καθαρές και κατάλληλες για το μήκος
κύματος της μέτρησης (π.χ. στο υπεριώδες χρησιμοποιούνται κυψελίδες χαλαζία).
1.7.3 Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας
1.7.3.1 Ο Ποιοτικός προσδιορισμός (ταυτοποίηση, ανίχνευση)
Π.χ. Στα 280 nm πραγματοποιείται ανίχνευση πρωτεϊνών σε απομονωμένο DNA.
22
1.7.3.2 Ο Ποσοτικός Προσδιορισμός
1.7.3.2.1 Ο ποσοτικός προσδιορισμός με Πρότυπο Διάλυμα
Έστω ότι το πρότυπο διάλυμα Δπ έχει συγκέντρωση Cπ και η απορρόφησή του είναι ίση με Απ. Η
απορρόφηση του άγνωστου διαλύματος Δx συγκέντρωσης Cx έστω ότι είναι ίση με Αx.
Με εφαρμογή του νόμου των Lambert-Beer για τα δύο διαλύματα, έχουμε:
Άγνωστο Διάλυμα: Αx = k l Cx (Εξίσωση 1.2)

Πρότυπο Διάλυμα: Aπ = k l Cπ (Εξίσωση 1.3)
Με διαίρεση κατά μέλη έχουμε:
Αx / Aπ = Cx / Cπ
Λύνοντας ως προς Cx έχουμε: Cx = (Αx / Aπ) Cπ (Εξίσωση 1.4)
1.7.3.2.2 Ο ποσοτικός προσδιορισμός με κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης
Χρησιμοποιούνται πρότυπα διαλύματα της ουσίας που θέλουμε να αναλύσουμε. Με φωτομέτρηση

των πρότυπων διαλυμάτων λαμβάνουμε τις απορροφήσεις τους (Αi). Με γραφική παράσταση, σε σύστημα
ορθογώνιων αξόνων, των ζευγών (Αi, Ci) κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη (Σχήμα 1.4).
Σχήμα 1.4 Πρότυπη καμπύλη.
1.8 Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι ανάλυσης στην κλινική βιοχημεία

Στην κλινική βιοχημεία, όπως και στην αναλυτική χημεία, χρησιμοποιούνται διάφορες ενόργανες τεχνικές
(Τietz, 1995· Παπαϊωάννου & Πλαγεράς, 2012). Οι ενόργανες αναλύσεις διακρίνονται κυρίως σε:
 οπτικές μεθόδους,
 χρωματομετρικές μεθόδους,
23
 ηλεκτροχημικές μεθόδους,
 φασματοσκοπία μάζας,
 υπέρυθρη φασματοσκοπία,
 φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR),
 μοριακές μέθοδους.
Οι οπτικές μέθοδοι ανάλυσης περιλαμβάνουν κυρίως τις μεθόδους:
 φασματοφωτομετρία UV – Vis,
 φασματοσκοπία εκπομπής,
 φλογοφωτομετρία,
 πολωσιμετρία, κ.α.
1.9 Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis
Στην πράξη το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να είναι συγκεκριμένου μήκους
κύματος λ. Όπως ήδη γνωρίζουμε, το ορατό φως αποτελεί τμήμα ενός μεγάλου αριθμού ηλεκτρομαγνητικών
ακτινοβολιών που καλύπτουν ένα πολύ μεγάλο φάσμα μηκών κύματος. Το φάσμα του φωτός που αξιοποιεί-
ται στα βιοϊατρικά εργαστήρια, μπορεί να διακριθεί σε δύο περιοχές:
1. στην υπεριώδη περιοχή (ultraviolet ή UV) που είναι αόρατη στον οφθαλμό, με μήκος κύματος 185 -380
nm,
2. στην ορατή περιοχή (visible ή Vis) που είναι ορατή στον οφθαλμό, με μήκος κύματος ακτινοβολίας 380 -
780 nm.
Τα πιο συνηθισμένα φασματόμετρα που συναντώνται στα βιοϊατρικά εργαστήρια είναι τα φασματο-
φωτόμετρα ορατής-υπεριώδους ακτινοβολίας, που χρησιμοποιούν τα μήκη κύματος 180 -780 nm.
Το φάσμα της μετρούμενης ουσίας δίνεται συνήθως ως διάγραμμα της απορρόφησης συναρτήσει του
μήκους κύματος, όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.5.
Σχήμα 1.5 Τυπικό φάσμα στο UV – Vis.
24
1.10 Η Βαθμονόμηση των οργάνων
Συχνά ο όρος «Βαθμονόμηση» συγχέεται με τον όρο «Διακρίβωση», επειδή ο αγγλικός όρος είναι ο ίδιος
«Calibration».
Η βαθμονόμηση (calibration) ενός οργάνου, είναι μια απαραίτητη διαδικασία για τον έλεγχο της αξι-
οπιστίας του οργάνου (εκτός λίγων περιπτώσεων, π.χ. σταθμική ανάλυση και κουλομετρία).
Για να γίνει βαθμονόμηση πρέπει να υπάρχει αναμφισβήτητη εμπειρική ή θεωρητική σχέση μεταξύ
αναλυτικής παραμέτρου (σήματος) και συγκεντρώσεως ή ποσότητας (x). Η σχέση αυτή καλείται αναλυτική
συνάρτηση ή συνάρτηση βαθμονόμησης (calibration function): y = g(x).
Παραδείγματα αναλυτικής συνάρτησης:
Ποτενσιομετρία (Εξίσωση Nernst):

E (δυναμικό) = Eσταθ + S log α = E΄σταθ + S log C (Εξίσωση 1.5)
Πολαρογραφία (Εξίσωση ρεύματος διαχύσεως Ilkovic):

Id (ρεύμα διαχύσεως) = 708 n D1/2 C m2/3 t1/6 = k C (Εξίσωση 1.6)
Φασματοφωτομετρία (Νόμος Lambert – Beer):

Α (απορρόφηση) = ε b C
Φθορισμομετρία:
F (ισχύς φθορισμού) = 2.3 Φ Po ε b c = k C (Εξίσωση 1.7)
Φλογοφασματομετρία εκπομπής:
P (ισχύς εκπεμπόμενης ακτινοβολίας) = k C (Εξίσωση 1.8)
Υγρή και Αέρια Χρωματογραφία:

Α (εμβαδόν κορυφής) = k C (Εξίσωση 1.9)
Ανοσοχημική τεχνική:
Logit y = a + log C (Εξίσωση 1.10)
όπου:
logit y = ln [y/(1-y)] και
y = B/Bo (B: σήμα προτύπου, Βo: σήμα μηδενικού προτύπου).
Παρόλο που η ακριβής διαδικασία της βαθμονόμησης μπορεί να ποικίλλει από όργανο σε όργανο,
αυτή γενικά περιλαμβάνει τη χρήση ενός οργάνου, το οποίο θα προσδιορίσει την ποσότητα μιας γνωστής
ουσίας, γνωστής ποσότητας, η οποία θα βρίσκεται σε ένα ειδικό δείγμα που ονομάζεται «βαθμονομητής».
Η βαθμονόμηση είναι η διαδικασία ρύθμισης των παραμέτρων ενός οργάνου, ώστε το αποτέλε-
σμα μιας εξέτασης - παραμέτρου για ένα συγκεκριμένο δείγμα (βαθμονομητής) να βρεθεί εντός ενός
αποδεκτού εύρους τιμών.
Τα αποτελέσματα της βαθμονόμησης χρησιμοποιούνται για να δημιουργηθεί μια σχέση μεταξύ της
μεθόδου προσδιορισμού μίας ουσίας που χρησιμοποιείται από το όργανο και των γνωστών τιμών (π.χ. συ-
γκεντρώσεων) αυτής. Με αυτό τον τρόπο, το όργανο μπορεί να παρέχει πιο ακριβή αποτελέσματα, όταν
προσδιορίζει άγνωστα δείγματα. Για παράδειγμα, η μέτρηση της συγκέντρωσης της γλυκόζης σε ένα δείγμα
βαθμονομητή πρέπει να δώσει ένα συγκεκριμένο εύρος τιμών, σύμφωνα με την τιμή – στόχο και την τυπική
απόκλιση, που μας δίνονται από την εταιρεία κατασκευής του βαθμονομητή.
25
1.11 Τα υλικά Βαθμονόμησης (Calibrators)
Οι βαθμονομητές είναι διαλύματα που προσομοιάζουν με τα προς ανάλυση δείγματα. Στην κλινική χημεία,
είναι διαλύματα με βάση το βόειο ή το ανθρώπινο αίμα. Στο εμπόριο υπάρχουν είτε σε υγρή μορφή έτοιμα
προς χρήση, είτε σε λυοφιλοποιημένη μορφή, οπότε θα πρέπει να ανασυσταθούν πριν τη χρήση τους.
Πλεονέκτημα των βαθμονομητών σε υγρή μορφή είναι ότι χρησιμοποιούνται χωρίς καμία άλλη αν-
θρώπινη ενέργεια, όμως έχουν μικρή σχετικά ημερομηνία λήξης. Αντίθετα, οι βαθμονομητές σε λυοφιλοποι-
ημένη μορφή χρειάζονται ανασύσταση, έχουν όμως μεγαλύτερη ημερομηνία λήξης.
Σήμερα, καλύτεροι θεωρούνται οι βαθμονομητές με βάση το ανθρώπινο αίμα, διότι προσομοιάζουν
περισσότερο με τα προς ανάλυση δείγματα.
1.12 Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων

Όλοι οι τύποι αναλυτικών μεθόδων, με δύο εξαιρέσεις (σταθμική ανάλυση και κουλομετρία), απαιτούν βαθ-
μονόμηση.
Η καμπύλη βαθμονόμησης (calibration curve), κατασκευάζεται με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμά-
των με ακριβώς γνωστές συγκεντρώσεις του αναλύτη (προσδιοριζόμενη ουσία). Τα διαλύματα αυτά μετρού-
νται (π.χ. φωτομετρούνται) και καταγράφεται η ένδειξη του οργάνου (π.χ. Ρ). Με τις μετρήσεις που λαμβά-
νονται σχεδιάζεται διάγραμμα της ένδειξης του οργάνου (Ρ) ως προς τη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης
ουσίας (C). Συνήθως τα διαγράμματα που προκύπτουν είναι γραμμικά σε μια αρκετά μεγάλη περιοχή συγκε-
ντρώσεων (δυναμική περιοχή - γραμμικότητα).
Τα διαγράμματα αυτά είναι επιθυμητό να είναι γραμμικά, επειδή έτσι έχουμε λιγότερα σφάλματα σε
σχέση με τις μη γραμμικές καμπύλες. Δεν είναι όμως ασυνήθιστο να προκύπτουν και μη γραμμικά διαγράμ-
ματα, τα οποία απαιτούν μεγαλύτερο αριθμό δεδομένων βαθμονόμησης (περισσότερα πρότυπα διαλύματα),
για να εξακριβωθεί ακριβέστερα η σχέση μεταξύ της ένδειξης του οργάνου και της συγκέντρωσης.
Συνήθως από την καμπύλη βαθμονόμησης προκύπτει μια εξίσωση με τη μέθοδο ελάχιστων τετραγώ-
νων, ώστε να είναι δυνατός ο άμεσος υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων.
1.13 Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης

Όπως ήδη αναφέρθηκε, οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών αναλύσεως (εκτός από ολιγάριθμες
περιπτώσεις) είναι σχετικές και απαιτούν τη βαθμονόμηση των οργάνων με πρότυπα ή διαλύματα προτύπων
παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα.
Οι κυριότερες μέθοδοι βαθμονόμησης που χρησιμοποιούνται είναι:
1.13.1 Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη)

Η κατασκευή της καμπύλης αναφοράς πραγματοποιείται με τα ακόλουθα βήματα:
1. Παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα του μετρούμενου συστατικού, κατά το δυνατόν παρόμοιας συστά-
σεως με τα διαλύματα των προς προσδιορισμό δειγμάτων (ιονική ισχύς, pH, παρουσία διαφόρων ουσιών,
ιξώδες. κ.α.) στη χρήσιμη αναλυτική περιοχή, και μετρούνται οι τιμές της αναλυτικής παραμέτρου.
2. Από τις μετρήσεις των πρότυπων διαλυμάτων κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς, δηλαδή γραφική
παράσταση της αναλυτικής παραμέτρου (Ρ) ως προς συγκέντρωση (ή ποσότητα συστατικού) των προτύ-
πων διαλυμάτων (Σχήμα 1.6).
Θα πρέπει πάντα να έχουμε υπόψη ότι η ισχύς της πρότυπης καμπύλης είναι συγκεκριμένης χρονικής
διάρκειας (πολλές φορές μικρής) και συνεπώς θα πρέπει η μέτρηση των αγνώστων διαλυμάτων να γίνεται
έγκαιρα.
Στην περίπτωση που η γραμμικότητα της καμπύλης αναφοράς διέρχεται από το μηδέν, τότε είναι δυ-
νατή η χρησιμοποίηση ενός μόνο πρότυπου διαλύματος, συγκεντρώσεως Cs, οπότε η συγκέντρωση του α-
γνώστου Cx υπολογίζεται από την Eξίσωση 1.4.
Για όσες ενόργανες τεχνικές απαιτείται μηδενισμός της κλίμακας, αυτή γίνεται με τη βοήθεια του
τυφλού διαλύματος.
26
Animation 1.1 Κατασκευή καμπύλης αναφοράς με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων.
1.13.2 Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method)

Βήματα εφαρμογής
Εφαρμόζεται στις περιπτώσεις στις οποίες το μητρικό υλικό του δείγματος ασκεί μεγάλη επίδραση στη συ-
νάρτηση βαθμονόμησης (στατιστικά διαφορετική κλίση b) και είναι αδύνατη η παρασκευή πρότυπων διαλυ-
μάτων παρόμοιας συστάσεως με τα διαλύματα των αγνώστων, είτε διότι είναι άγνωστη η σύστασή τους, ή
ποικίλλει από δείγμα σε δείγμα, είτε επειδή υπάρχουν ουσίες που παρεμποδίζουν. Απαιτείται γραμμική σχέ-
ση της καμπύλης βαθμονόμησης και υποχρεωτική διέλευσή της από αρχή αξόνων (a = 0).
Κατά τη μέθοδο αυτή, μετρείται το διάλυμα του άγνωστου δείγματος και στη συνέχεια μετρείται το
ίδιο ή άλλο τμήμα του διαλύματος του δείγματος, στο οποίο έχει προστεθεί μικρός όγκος πρότυπου διαλύμα-
τος, ώστε να προκαλέσει αύξηση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC (θεωρείται μικρή ή αμελητέα
η αύξηση του όγκου του διαλύματος).
Συνεπώς, χρησιμοποιείται σε εκείνες τις περιπτώσεις που ισχύουν τα παρακάτω:

1. Εάν η σχέση που συνδέει τη μετρούμενη φυσική/χημική παράμετρο P και τη συγκέντρωση C X της ουσίας
X που μας ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε, είναι αναλογική, δηλ. εάν P = k  CX.
2. Εάν ο συντελεστής αναλογίας k επηρεάζεται έντονα από τη σύσταση του δείγματος (όλες οι άλλες ουσίες
που υπάρχουν στο μετρούμενο διάλυμα) του δείγματός μας.
3. Εάν έχουμε να αναλύσουμε πολλά δείγματα με διαφορετική σύσταση ή έστω και ένα δείγμα αλλά με ά-
γνωστη σύσταση, τότε είναι πρακτικά αδύνατη η χρησιμοποίηση καμπύλης αναφοράς.
Σχήμα 1.6 Αναπαράσταση του πειράματος προσδιορισμού συγκέντρωσης.
27
Βήμα 1ο
Από το άγνωστο διάλυμα της ουσίας Χ, με άγνωστη συγκέντρωση CX, λαμβάνουμε γνωστό όγκο VX
δείγματος με σιφώνιο (π.χ. VX = 10,00 mL) και τον μεταφέρουμε σε δύο μικρά ποτήρια ζέσεως (Δ0 και Δ1),
όπως φαίνεται στο Σχήμα 1.7.
Βήμα 2ο
Με ένα σιφώνιο μεταφέρουμε ακριβώς γνωστό όγκο VS πρότυπου διαλύματος της ουσίας Χ, συγκέντρωσης
CS (π.χ. CS = 1000 μg X/ mL) στο ποτήρι Δ1. Ο όγκος αυτός θα πρέπει να είναι πολύ μικρότερος [τυπικά το
1/100 ή ακόμη λιγότερο] από τον όγκο VX (π.χ. VS = 0,100 mL).
Σχήμα 1.7 Αναπαράσταση μέτρησης της απορρόφησης σε φωτόμετρο.
Βήμα 3ο
Μετρούμε με το όργανο τη φυσική/χημική παράμετρο P στο ποτήρι Δ0, όπως φαίνεται στην παραπάνω εικό-
να. Στην περίπτωσή μας, δεν ενδιαφέρει η τεχνική που χρησιμοποιούμε και το όργανο ανάλυσης, αρκεί να
ισχύει η αναλογική σχέση μεταξύ του μετρούμενου μεγέθους και της συγκέντρωσης. Έστω ότι βρίσκουμε P 0
= 35,0.
Βήμα 4ο
Μετρούμε με το όργανο την παράμετρο P στο ποτήρι Δ1. Προφανώς θα είναι P1 > P0, αφού στο ποτηράκι Δ1
βάλαμε επιπλέον ποσότητα της ουσίας Χ («γνωστή προσθήκη»). Έστω ότι τη βρίσκουμε P1 = 61,0.
Επειδή προσθέσαμε πολύ μικρό όγκο προτύπου στο ποτήρι Δ1, ουσιαστικά η αραίωση ήταν αμελητέα και δεν
διαταράξαμε τη σύσταση του δείγματος. Οπότε ο συντελεστής k είναι ο ίδιος και στις δύο μετρήσεις.
Η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης ΔCX υπολογίζεται εύκολα και ως εξής:
H ποσότητα της Χ που προσθέσαμε στο ποτήρι Δ1 είναι VS × CS.
Αυτή αραιώθηκε σε τελικό όγκο: VX + VS, οπότε η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης είναι:
ΔC1 = (VS × CS) / (VX + VS) (Εξίσωση 1.11)
και επειδή VX >> VS, πρακτικά είναι: ΔC1 = (VS × CS) / VX (Εξίσωση 1.12)
Με τις τιμές που έχουμε δώσει σαν παράδειγμα θα είναι:

ΔC1 = (VS × CS) / VX = (0,100 mL) × (1000 μg X/mL) / (20,00 mL) = 5,00 μg X/mL
Τότε θα είναι:
 P0 = k CX
 P1 = k (CX + ΔC1)
28
Από τις οποίες με διαίρεση κατά μέλη και επίλυση ως προς Cx προκύπτει ότι:
Cx = [P0 / (P1 – P0)] / ΔC1 (Εξίσωση 1.13)
Αντικαθιστώντας τις πειραματικές τιμές, υπολογίζουμε τελικά την άγνωστη συγκέντρωση της ουσίας Χ στο
δείγμα:
Cx = [35,0 / (61,0 – 35,0)] / (5,00 μg X/mL) = 6,73 μg/mL
1.13.3 Ο Γραφικός Υπολογισμός

Το παραπάνω αποτέλεσμα μπορεί να προκύψει και γραφικά (Σχήμα 1.8) ως εξής. Σχεδιάζουμε ένα
διάγραμμα των τιμών της μετρούμενης παραμέτρου P ως προς τις τιμές ΔCX. Η προέκταση της ευθείας, η
οποία ορίζεται από τα δύο πειραματικά σημεία (P0, 0) και (P1, ΔC1), θα τμήσει τον άξονα των τιμών ΔCX σε
σημείο (C) που αντιστοιχεί στην τιμή -CX.
Σχήμα 1.8 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔCx.
 Η μέθοδος αυτή πρέπει να χρησιμοποιείται, όταν δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί κάποια καλύτερη τεχνική
ποσοτικοποίησης. Γενικά, δεν είναι ιδιαίτερα ακριβής.
 Η γνωστή προσθήκη ΔC1 δεν πρέπει να είναι ούτε μεγάλη, ούτε μικρή. Ιδανικά θα πρέπει η ΔC1 να είναι
στην περιοχή 0,5 CX < ΔC1 < 1,5 CX.
Συνεπώς τα όρια γραμμικότητας με τη μέθοδο αυτή είναι σχετικά περιορισμένα, οπότε υπάρχει εν-
δεχόμενο η μέτρηση της P1 να πραγματοποιηθεί σε περιοχή συγκεντρώσεων της Χ, όπου δεν ισχύει πλέον η
γραμμική σχέση, με αποτέλεσμα να έχουμε στη μέτρησή μας συστηματικά σφάλματα.
Στο Σχήμα 1.10 παρουσιάζεται το σφάλμα που θα είχε το αποτέλεσμα της μέτρησής μας, αν οι τι-
μές P0 και P1 κυμαίνονταν γύρω από μια κεντρική τιμή.
29
Σχήμα 1.9 Σφάλμα μέτρησης λόγω κοντινών μετρήσεων Ρ0 και Ρ1.
Από την παραπάνω γραφική παράσταση είναι προφανές πως μικρές σχετικά διακυμάνσεις στις
τιμές P0 μια P1 δημιουργούν μια μεγάλη (σχετικά) διακύμανση στις τιμές CX.
1.13.4 Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών
Οι «πολλαπλές προσθήκες» αποτελούν μια βελτιωμένη εφαρμογή της μεθόδου προσθήκης γνωστής ποσότη-
τας. Συχνά, αντί μίας γνωστής προσθήκης πραγματοποιούνται 2 ή 3 γνωστές προσθήκες για καλύτερη ακρί-
βεια και κυρίως για να είμαστε βέβαιοι ότι όλες οι μετρούμενες τιμές της φυσικής παραμέτρου (Ρ) βρίσκο-
νται στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης βαθμονόμησης (όλα τα σημεία θα βρίσκονται σε μία ευθεία).
Στις περιπτώσεις αυτές προχωρούμε σε ανάλογο γραφικό υπολογισμό, όπως ανωτέρω. Το Σχήμα
1.11 παρουσιάζει την περίπτωση 3 γνωστών προσθηκών (ΔC1, ΔC2, ΔC3).
Σχήμα 1.10 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔCx με προσθήκη 3 γνωστών ποσοτήτων.
30
Από τη γραφική παράσταση του Σχήματος 1.10 με προέκταση της ευθείας μπορούμε να
υπολογίσουμε και σε αυτή την περίπτωση τη ζητούμενη τιμή CX.
Εναλλακτικά, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων για τον

υπολογισμό των συντελεστών α και b της εξίσωσης, που προσαρμόζεται στα πειραματικά σημεία: (0, P0),
(ΔC1, P1), (ΔC2, P2) και (ΔC3, P3) ως εξής:
P = α ΔC + b (Εξίσωση 1.14)
Από την οποία, για την τιμή P = 0, προκύπτει ότι:
ΔC = CΧ = b / α (Εξίσωση 1.15)
1.13.5 Η μέθοδος Παρεμβολής

Χρησιμοποιείται, όταν η καμπύλη βαθμονόμησης δεν είναι γραμμική. πχ. στη φλογοφωτομετρία, όπου λόγω
αυτο-απορρόφησης υπάρχει καμπύλωση προς τα κάτω.
Για την κατασκευή της μη γραμμικής καμπύλης απαιτείται σχετικά μεγάλος αριθμός προτύπων. O
υπολογισμός του αγνώστου γίνεται γραφικά, χρησιμοποιώντας το τμήμα της καμπύλης μεταξύ δυο σημείων /
προτύπων που περικλείουν το σήμα του αγνώστου. Αυτό το τμήμα, χωρίς μεγάλο σφάλμα, θεωρείται γραμ-
μικό.
Εναλλακτικά, υπολογιστικά υπολογίζεται ως ακολούθως:

 Πρότυπο 1 με συγκέντρωση C1 και απόκριση P1
 Πρότυπο 2 με συγκέντρωση C2 και απόκριση P2
 Άγνωστο Χ με συγκέντρωση Cx και απόκριση Px
Ισχύει:
(Ρ2 - Ρx) / (C2 – Cx) = (Px – P1) / (Cx – C1) ή
Cx = [C1 (P2 – Px) + C2 (Px – P1)] / (P2 – P1) (Εξίσωση 1.16)
1.13.6 Η μέθοδος της Μειώσεως κατά Γνωστή Ποσότητα
Είναι παρόμοια με την προηγούμενη και διαφέρει μόνο κατά το ότι με την προσθήκη του προτύπου προκα-
λείται μείωση της συγκεντρώσεως του συστατικού κατά ΔC, λόγω στοιχειομετρικής αντιδράσεως, συμπλο-
κοποιήσεως ή καθιζήσεως. Χρησιμοποιείται κυρίως στην απόλυτη ποτενσιομετρία με εκλεκτικά ηλεκτρόδια
ιόντων. Δίνονται και οι σχετικές εξισώσεις.
1.13.7 Η μέθοδος Κανονικοποίησης

Χρησιμοποιείται στις χρωματογραφικές τεχνικές (π.χ. GLC, HPLC), για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας
των συστατικών ενός μείγματος. Χρησιμοποιούνται τα εμβαδά των κορυφών των συστατικών του δείγματος
(κλάσμα εκάστου εμβαδού ως προς το συνολικό άθροισμα των εμβαδών):
𝐴
𝐶 = ∑ 𝐴𝑖 100 (Εξίσωση 1.16)
𝑖
Στην περίπτωση που ο ανιχνευτής δεν παρουσιάζει την ίδια απόκριση για όλα τα συστατικά του
μείγματος, είναι ανάγκη να υπολογισθεί για κάθε συστατικό ο πειραματικός παράγοντας απόκρισης Fi ως
προς ένα κύριο συστατικό (ουσία αναφοράς) χρησιμοποιώντας πρότυπα διαλύματα των ουσιών. Στην
31
περίπτωση αυτή για τον υπολογισμό της περιεκτικότητας κάθε συστατικού λαμβάνονται τα μεγέθη FiAi και
ΣFiAi:
𝐶𝜄
𝐶𝑟𝑒𝑓
𝐹𝜄 = 𝐴𝜄 (Εξίσωση 1.17)
𝐴𝑟𝑒𝑓
1.14 Η εξίσωση Αναφοράς ή Συνάρτηση Βαθμονόμησης

Η συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η προσαρμογή (fitting) ενός κατάλληλου μαθηματικού μοντέλου στα δια-
θέσιμα πειραματικά δεδομένα (Σήμα Υ – Συγκέντρωση C).
Η περισσότερο εύχρηστη συνάρτηση βαθμονόμησης είναι η γραμμική (linear), που διέρχεται από
την αρχή των αξόνων (origin) και είναι εφαρμόσιμη σε μία ευρεία δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων.
Σημειώνεται ότι στην πράξη εμφανίζονται αποκλίσεις από ιδανική γραμμή βαθμονόμησης, όπως:
 αποκλίσεις νόμου Beer (πυκνά διαλύματα, χημική ισορροπία σωματιδίων, παράσιτη ακτινοβολία),
 καμπύλωση στην ποτενσιομετρία ιοντικών αισθητήρων σε πυκνές συγκεντρώσεις),
 καμπύλωση στη φλογοφωτομετρία λόγω αυτο-απορρόφησης.
Για την πλειονότητα των αναλυτικών τεχνικών, χρησιμοποιείται η γραμμική εξίσωση βαθμονόμησης:
y = a + b x (Εξίσωση 1.18)
όπου:
y το αναλυτικό σήμα,
x η συγκέντρωση προτύπων,
a η τομή στον άξονα των y,
b η κλίση.
1.15 Ο έλεγχος της Καμπύλης Βαθμονόμησης ή Αναφοράς

Ο έλεγχος περιλαμβάνει τα παρακάτω σημεία:
 εάν είναι γραμμική ή όχι και, εάν όχι, ποιάς μορφής είναι,
 ποιά είναι η καλύτερη ευθεία που πρέπει να χαραχθεί;
 ποιά είναι η γραμμική περιοχή (περιοχή εργασίας);
 ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης των παραμέτρων της τομής και της κλίσεως της ευθείας;
 ποιό είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης στην προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου που
λαμβάνεται από την καμπύλη βαθμονόμησης;
Σημείωση: Στη βαθμονόμηση χρησιμοποιείται η μονο-παραμετρική παλινδρόμηση ή προσαρμογή (univariate

regression), που σημαίνει ότι οι μετρούμενες τιμές του αναλυτικού σήματος εξαρτώνται από μία μόνο ανεξάρ-
τητη (χωρίς σφάλμα) μεταβλητή, τη συγκέντρωση προτύπων.
1.16 Η αρχή της μεθόδου της Παλινδρόμησης

Είναι η εκτίμηση μιας εξαρτημένης μεταβλητής από μία άλλη που ονομάζεται ανεξάρτητη μεταβλητή. Η
μέθοδος ή η διαδικασία αυτή καλείται παλινδρόμηση.
Εάν θεωρήσουμε ότι μία εξαρτημένη μεταβλητή Υ θα εκτιμηθεί από μία ανεξάρτητη μεταβλητή Χ
με βάση μια εξίσωση, η εξίσωση αυτή ονομάζεται εξίσωση παλινδρόμησης της Υ ως προς Χ.
Η καμπύλη που παριστάνει την Υ συναρτήσει της Χ την ονομάζουμε καμπύλη παλινδρόμησης.
32
Γενικά τα μοντέλα που μπορούμε να βρούμε είναι:
 Y = α + βX + ε (απλή γραμμική παλινδρόμηση, simple linear regression).
 Y = α + β1X1 + ... + βkXk + ε (πολλαπλή παλινδρόμηση, multiple regression).
 Y = α + β1X + β2X2 +... + βkX + ε (πολυωνυμική παλινδρόμηση, multinomial regression).
1.17 Η εκτίμηση της Ευθείας Παλινδρόμησης με τη Μέθοδο Ελαχίστων

Τετραγώνων (Least Squares Method)
Αποδεχόμαστε ότι οι τιμές x στερούνται σφάλματος (η παρασκευή προτύπων είναι πολύ ακριβής με σφάλμα-
τα της τάξεως 0,1%, δηλαδή μικρότερα από τα μετρήσιμα σφάλματα). Οι τιμές x τοποθετούνται στον οριζό-
ντιο άξονα.
Οι τιμές y (αναλυτικό σήμα), είναι η εξηρτημένη μεταβλητή, και εμπεριέχουν σφάλμα. Τοποθετού-
νται στο κάθετο άξονα.
Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να υπολογισθούν εκείνες οι τιμές των παραμέτρων
a, b1, …, bm, για τις οποίες το μοντέλο θα έχει την καλύτερη προσαρμογή στα πειραματικά δεδομένα (xi –
yi).
Για τις περισσότερες αναλυτικές τεχνικές η καμπύλη βαθμονόμησης (πρότυπη καμπύλη ή καμπύλη
αναφοράς) περιγράφεται από μια ευθεία γραμμή (γραμμικό μοντέλο) και έτσι χρησιμοποιείται η γραμμική
μέθοδος προσαρμογής ελαχίστων τετραγώνων (linear least square regression).
Η σχέση μεταξύ κάθε ζεύγους παρατηρήσεων (xi, yi) παριστάνεται ως:
yi = a +bxi + ei (Εξίσωση 1.19)
Δηλαδή το σήμα yi συνίσταται από ένα καθορισμένο μέγεθος (a + bxi) που προβλέπεται από το
γραμμικό μοντέλο και ένα τυχαίο συστηματικό (σφάλμα) ei.
Στόχος της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων είναι να βρεθούν οι εκτιμήτριες (estimates) των
αληθινών τιμών a και b. Αυτό πετυχαίνεται με τον υπολογισμό τιμών a και b, για τις οποίες το άθροισμα των
τετραγώνων των αποκλίσεων (δηλαδή των ei) να γίνεται ελάχιστο:
 e2  0
Μετά από επεξεργασία λαμβάνονται οι σχέσεις:
∑𝑛
𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥´)(𝑦𝑖 −𝑦´) 𝑛 ∑𝑛 𝑛 𝑛
𝑖 𝑥𝑖 𝑦𝑖 −∑𝑖 𝑥𝑖 ∑𝑖 𝑦𝑖
𝑏= ∑𝑛 2 = 2 (Εξίσωση 1.20)
𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥´) 𝑛 ∑𝑛 2 𝑛
𝑖 𝑥𝑖 −(∑𝑖 𝑥𝑖 )
∑𝑛 𝑛 2 𝑛
𝑖 𝑦𝑖 ∑𝑖 𝑥𝑖 −∑𝑖 𝑥𝑖 𝑦𝑖
𝑎 = 𝑦´ − 𝑏𝑥´ = 2 (Εξίσωση 1.21)
𝑛 ∑𝑛 2 𝑛
𝑖 𝑥𝑖 −(∑𝑖 𝑥𝑖 )
∑𝑛
𝑖 𝑦𝑖
𝑦´ = 𝑛
(Εξίσωση 1.22)
∑𝑛
𝑖 𝑥𝑖
𝑥´ = (Εξίσωση 1.23)
𝑛
33
1.18 Η γραμμική Καμπύλη Παλινδρόμησης με Διαστήματα Εμπιστοσύνης
Στο Σχήμα 1.11 παρουσιάζεται η αβεβαιότητα μιας μέτρησης, λόγου προσδιορισμού της μέσω πρότυπης
καμπύλης.
Σχήμα 1.11 Αβεβαιότητα μέτρησης.
1.19 Σύνοψη της πορείας της Προσαρμογής (Παλινδρόμησης)

1. Επιλογή του μοντέλου (συνήθως γραμμικό).
2. Υπολογισμός (εκτίμηση) των παραμέτρων του μοντέλου με τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων.
3. Αξιολόγηση του μοντέλου.
4. Υπολογισμός ορίων εμπιστοσύνης των παραμέτρων για τη συνάρτηση παλινδρόμησης και για το αναλυ-
τικό αποτέλεσμα.
1.20 Τα Διαστήματα Εμπιστοσύνης

Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από:
 το σφάλμα μέτρησης,
 από το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence interval) της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του α-
γνώστου, που εξαρτάται από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b.
Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους:
∑𝑛
𝑖 (𝑦𝑖 −𝑦´)
2
𝑆𝑦 = √ 𝑛−2
𝑥
∑𝑛𝑖 𝑥𝑖
2
𝑆𝑎 = 𝑆𝑦 = √ 𝑛 (Εξίσωση 1.25)
𝑥 𝑛 ∑𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥´)2
𝑆𝑦
𝑆𝑏 = 𝑥
√∑𝑛
𝑖 (𝑥𝑖 −𝑥´)
2
34
1.20 O Συντελεστής Συσχετίσεως (Correlation Coefficient)
Ο συντελεστής συσχετίσεως (r) παίρνει τιμές από: -1 ≤ r ≤ +1 και είναι μέτρο της γραμμικότητας της
καμπύλης βαθμονόμησης. Έχει περισσότερη αξία στην ανάλυση συσχετίσεως πειραματικών δεδομένων
(correlation analysis).
1.21 Η Μη Γραμμική Παλινδρόμηση
Σχήμα 1.12 Μη γραμμικό μοντέλο.
Στην περίπτωση του Σχήματος 1.12 το βέλτιστο μοντέλο προκύπτει να είναι:
𝑌 = 1,73 − 0,2𝜎𝜐𝜈(0,63𝑋) − 1,41𝜂𝜇(0,63𝑋) − 0,77𝜎𝜐𝜈(2 · 0,63𝑋) − 1,31𝜂𝜇(2 · 0,63𝑋)

το οποίο ένα έμπειρο μάτι ίσως τα αναγνωρίζει ως τους πρώτους 4 όρους μίας σειράς Fourier!
Πολλές φορές, ιδιαίτερα στις βιολογικές επιστήμες, το διάγραμμα διασποράς συνηγορεί σε μία μη
γραμμική σχέση (Σχήμα 1.13). Στην περίπτωση του Σχήματος 1.13 το βέλτιστο μοντέλο είναι:
𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑋
𝑢= (Εξίσωση 1.28)
𝐾𝑚 +𝑋
35
Σχήμα 1.13 Μη γραμμικό μοντέλο.
Η ακρίβεια της προσδιοριζόμενης συγκέντρωσης του αγνώστου εξαρτάται από:

 το σφάλμα μέτρησης,
 από το διάστημα εμπιστοσύνης της καμπύλης βαθμονομήσεως στο σημείο του αγνώστου, που εξαρτάται
από τις αβεβαιότητες των εκτιμητριών των α και b.
Ο υπολογισμός διακυμάνσεων των α και b δίνεται από τους τύπους:
1.22 Η Γραμμικότητα της Μεθόδου Ανάλυσης

Είναι εκείνο το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο το μετρούμενο μέγεθος είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση
της προς προσδιορισμό ουσίας.
Όταν αναφερόμαστε στη Φασματοφωτομετρία UV – Vis, είναι το τμήμα της καμπύλης, στο οποίο
ισχύει ο νόμος του Beer.
1.23 Το Όριο Ανίχνευσης (Limit of Detection)

Το όριο ανίχνευσης ή αναλυτική ευαισθησία (Analytical Sensitivity) μιας μεθόδου είναι η ελαχίστη συγκέ-
ντρωση μιας παραμέτρου που μπορεί να ανιχνευθεί «αξιόπιστα» από τη μέθοδο αυτή.
Ως όριο ανίχνευσης ορίζουμε τη συγκέντρωση ενός αναλύτη (π.χ. μιας ουσίας) σε διάλυμά του, που
ανιχνεύεται με βεβαιότητα 95%. Ισοδύναμα μπορούμε να πούμε πως είναι η ποσότητα του αναλύτη που δίνει
μία τιμή στο όργανο μέτρησης ίση με το διπλάσιο (ή το τριπλάσιο κατ’ άλλους) της σταθερής τυπικής από-
κλισης (SD), μιας σειράς δηλαδή, δέκα τουλάχιστον προσδιορισμών με διάλυμα μηδενικής συγκέντρωσης
(τυφλό).
Στην περίπτωση της φλογοφωτομετρίας το όριο ανίχνευσης φτάνει τα μg/mL. Για τις ανοσοχημικές
μεθόδους, αραιώνεται ορός ασθενούς με βαθμονομητή μηδενικής συγκέντρωσης ή κατάλληλο αραιωτικό, σε
τέτοιο βαθμό, ώστε ο συντελεστής διακύμανσης (CV), ο οποίος προκύπτει από είκοσι μετρήσεις, που πραγ-
ματοποιούνται κατά τη διάρκεια της ίδιας ημέρας να είναι ίσος με την τιμή 20. Η συγκέντρωση αυτή αντι-
στοιχεί στο όριο ανίχνευσης της μεθόδου. Όμως η διαδικασία των αραιώσεων δύσκολα εφαρμόζεται σε ένα
κλινικό εργαστήριο με πρόγραμμα μέτρησης δειγμάτων ασθενών.
Στην πράξη, για τον προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης των βιοχημικών κλινικών δοκιμών, των ο-
ποίων η καμπύλη βαθμονόμησης είναι γραμμική, χρησιμοποιείται ως πειραματικό υλικό αραιωμένος ορός
ελέγχου χαμηλής συγκέντρωσης και εκτελούνται τουλάχιστον 15 μετρήσεις μεταξύ διαδοχικών ημερών. Υ-
πολογίζεται η τυπική απόκλιση των μετρήσεων και το όριο ανίχνευσης (LOD) από τον μαθηματικό τύπο:
36
LOD = 3 ∙ SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% (Εξίσωση 1.29)
ή LOD = 2∙ SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% (Εξίσωση 1.30)
1.24 Το Όριο Ποσοτικοποίησης (Limit of Quantitation)

Το όριο ποσοτικοποίησης ή λειτουργική ευαισθησία (Functional Sensitivity) είναι η ελαχίστη συγκέντρωση
της μετρούμενης παραμέτρου, που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί (να προσδιορισθεί ποσοτικά) με αποδεκτή
ακρίβεια και επαναληψιμότητα. Το όριο ποσοτικοποίησης (LOQ) δίδεται από τον τύπο:
LOQ = 10 ∙ SD (Εξίσωση 1.31)
Ένας τρόπος προσδιορισμού του ορίου ποσοτικοποίησης για τις αναλύσεις που οι καμπύλες αναφο-
ράς τους δεν είναι γραμμικές (π.χ. ανοσοχημικές), είναι ο εξής:
 πραγματοποιούνται 10 μετρήσεις των παρεχομένων βαθμονομητών, στα χαμηλότερα διαθέσιμα επίπεδα
συγκεντρώσεων και υπολογίζεται η μέση τιμή και η τυπική απόκλιση SD ανά επίπεδο,
 τα αποτελέσματα τοποθετούνται σε διάγραμμα δύο αξόνων. Στον άξονα των x εμφανίζονται οι τιμές των
συγκεντρώσεων και στον άξονα των y οι τιμές της τυπικής απόκλισης,
 υπολογίζεται με τη βοήθεια της μεθόδου ελαχίστων τετραγώνων η εξίσωση γραμμικής καμπύλης της
μορφής y = αx + β,
 προσδιορίζεται η τιμή της τυπικής απόκλισης (SD) για μηδενική συγκέντρωση (y = β).
Το όριο ανίχνευσης προκύπτει από την εξίσωση LOD= 3 x SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 99,9% ή
LOD = 2∙SD, για στάθμη εμπιστοσύνης 95%.
1.25 Εφαρμογές
1η Εφαρμογή
Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους – Ορατού (UV-Vis) – Κατασκευή Φάσματος Απορρόφησης
Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι η κατασκευή φάσματος απορρόφησης γνωστής ου-
σίας με τη φασματοφωτομετρία UV – Vis.
Ρυθμίζουμε το φασματοφωτόμετρο και ορίζουμε το μήκος κύματος στα 600 nm. Η φωτομέτρηση θα
πραγματοποιηθεί από τα 600 nm και κατεβαίνοντας κάθε 10 nm προς τα μικρότερα μήκη κύματος, μετρώ-
ντας κάθε φορά την απορρόφηση μέχρι τα 410 nm. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί στο μηδενισμό του
οργάνου με το τυφλό, πριν από τη λήψη κάθε επιμέρους μέτρησης για κάθε μεταβολή του μήκους κύματος.
Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης, για να προσδιοριστεί το μήκος κύματος στο
οποίο παρατηρείται η μέγιστη απορρόφηση. Για την κατασκευή του φάσματος απορρόφησης, καταγράφουμε
στον παρακάτω πίνακα τις τιμές Α που αντιστοιχούν σε κάθε μήκος κύματος.
37
λ (nm) Απορρόφηση (Α)
600 0,10
590 0,13
580 0,16
570 0,20
560 0,24
550 0,29
540 0,33
530 0,37
520 0,39
510 0,40
500 0,41
490 0,38
480 0,34
470 0,31
460 0,28
450 0,21
440 0,16
430 0,12
420 0,09
410 0,08
400 0,08
Πίνακας 1.3 Παράδειγμα υπολογισμού του λmax λαμβάνοντας φάσμα απορρόφησης.
Στη συνέχεια κατασκευάζουμε το φάσμα απορρόφησης της ουσίας σε χιλιοστομετρικό χαρτί και
σημειώνουμε το λmax που βρήκαμε (Σχήμα 1.14). Στο παράδειγμα το λmax ισούνται με 510 nm.
Σχήμα 1.14 Ο υπολογισμός του λmax από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης.
2η Εφαρμογή
Φασματοφωτομετρία Υπεριώδους – Ορατού (UV-Vis) – Κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης & Υπολογι-
σμός Συγκέντρωσης Άγνωστου Διαλύματος
38
Στόχος της συγκεκριμένης εργαστηριακής άσκησης είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης διαλύματος
γνωστής ουσίας με τη φασματοφωτομετρία UV – Vis.
Με φωτομέτρηση και προσδιορισμό της απορρόφησης Α = f (C) μιας σειράς προτύπων διαλυμάτων
σε ένα ορισμένο εύρος συγκεντρώσεων, μπορούμε να κατασκευάσουμε την καμπύλη αναφοράς ή βαθμονό-
μησης (calibration curve).
Ακολούθως, μετρώντας την απορρόφηση ενός διαλύματος άγνωστης συγκέντρωσης, της ίδιας με τα
πρότυπα διαλύματα ουσίας, σε συγκεκριμένο μήκος κύματος και με χρήση της καμπύλης αναφοράς, μπο-
ρούμε να προσδιορίσουμε τη συγκέντρωση του άγνωστου διαλύματος.
Στάδια προσδιορισμού
1. Παρασκευάζουμε μία σειρά τεσσάρων πρότυπων υδατικών διαλυμάτων μιας ουσίας (Πi) που απορροφά
στο UV – Vis (π.χ. ουσία Α).
2. Φωτομετρούμε τα πρότυπα διαλύματα στο λmax για να προσδιορίσουμε τις απορροφήσεις τους. Εάν δια-
θέτουμε φωτόμετρο απλής δέσμης, τότε κάθε φορά μηδενίζουμε το φωτόμετρο με διαλύτη (στη περίπτω-
σή μας νερό), ενώ, εάν διαθέτουμε φωτόμετρο διπλής δέσμης, τότε στη μία κυψελίδα τοποθετούμε το τυ-
φλό διάλυμα (νερό) και στην άλλη το πρότυπο ή το προς μέτρηση διάλυμα.
3. Καταγράφουμε τα αποτελέσματα στον ακόλουθο πίνακα:
Διάλυμα Συγκέντρωση (Μ) Απορρόφηση

Π1
Π2
Π3
Π4
Άγνωστο
1. Κατασκευάζουμε την καμπύλη αναφοράς Α = f (C) (Σχήμα 1.4).

2. Φωτομετρούμε το άγνωστο διάλυμα.
39
Βίντεο που δημιουργήθηκε για αυτό το Κεφάλαιο
Ο υπολογισμός του λmax από την καμπύλη του φάσματος απορρόφησης, https://youtu.be/n5ZD--fizB8
Σχετικό οπτικό υλικό από το διαδίκτυο
 Λειτουργία σπεκτροφωτoμέτρου: https://www.youtube.com/watch?v=xHQM4BbR040 (τελευταία

προσπέλαση 1/4/2015).
 Ερμηνεία του νόμου Lambert-Beer: https://www.youtube.com/watch?v=rdY41FPI9iE (τελευταία
 Προσδιορισμός συγκέντρωσης με χρωματομετρία: https://www.youtube.com/watch?v=QdufRwbkeKo
(τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Αρχή μεθόδου της χρωματομετρίας: https://www.youtube.com/watch?v=yTabfxvMdCM (τελευταία
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο\
 Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα,

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Spectre_visible_light_el.svg#/media/File:Spectre_visible_light_el
.svg (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
Aναφορές
1. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Εξειδικευμένα Θέματα Κλινικής Χημείας. Aθήνα: Εκδό-
σεις Π.Χ. Πασχαλίδης.
2. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, A. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Ειδικά Θέματα Βιοχημείας. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πα-
σχαλίδης.
3. ADERSON, S & COCKAYNE, S. (1993) Clinical Chemistry – Concepts and Applications. Philadelphia:
W. B. Sauders Company Ltd.
4. ALEXANDER, R. & GRIFFIT, M. (1993) Basic Biochemical Methods. New York: Wiley-Liss Inc.
5. BURGOSS, C. & KNOWLES A. (1984) Techniques in Vis and UV Spectroscopy Series. London: Chap-
man and Hall.
40
6. MARHALL, J., BOTHAM, M., RODWELL, W., BENDER, A., KENNELLY, J., ANTHONH, P. (2011)
Harper’s Εικονογραφημένη Βιολογική Χημεία. Aθήνα: Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.
7. TIETZ, W. (1995) Clinical Guide to Laboratory Tests. 3rd ed. Philadelphia: W.B. Sauders Company Ltd.
41
ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΕΛΙΚΟΥ ΣΗΜΕΙΟΥ
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ ΚΑΤΑ
ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ
ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζονται τα κριτήρια με τα οποία ένα κλινικό εργαστήριο επιλέγει την αναλυτική
μεθοδολογία που θα ακολουθήσει για τον προσδιορισμό κάποιου αναλύτη (συστατικού). Επεξηγούνται
επίσης οι γενικές αρχές των φωτομετρικών μεθόδων κλινικών προσδιορισμών. Η μεθοδολογία που
εφαρμόζεται στους κλινικούς φωτομετρικούς προσδιορισμούς τελικού σημείου παρουσιάζεται στη συνέχεια
λεπτομερώς, όσον αφορά τα πειραματικά στάδια της, τον τρόπο βαθμονόμησης, τους τρόπους ελέγχου
παρεμβολών της μήτρας των δειγμάτων, τα χαρακτηριστικά του πρωτοκόλλου της και τους εμπλεκόμενους
υπολογισμούς.
Απαιτείται η μελέτη του Κεφαλαίου 1, ειδικά σε ό, τι αφορά στις αρχές φωτομετρίας και βαθμονόμησης και
τις έννοιες δείγματος, τυφλού και προτύπου, ορίου ανίχνευσης, ορίου ποσοτικοποίησης και ορίου
γραμμικότητας.
2.1 Εισαγωγή
H αποτελεσματικότητα μίας κλινικής ανάλυσης εξαρτάται από την ειδικότητα και την ευαισθησία αυτής να
εντοπίσει με πιστότητα και ακρίβεια κάποια παθολογική αλλαγή. Στη συνέχεια παρουσιάζονται τα κριτήρια
αξιολόγησης μίας μεθοδολογίας κλινικού προσδιορισμού και οι γενικές αρχές των πιο κοινά
χρησιμοποιούμενων μεθόδων, των φωτομετρικών κλινικών προσδιορισμών.
2.2 Κριτήρια επιλογής αναλυτικής μεθοδολογίας στην Kλινική Aνάλυση
Η αναλυτική μεθοδολογία που εφαρμόζεται σε κάποια κλινική ανάλυση αξιολογείται και επιλέγεται με βάση
τα παρακάτω κριτήρια (Burtis & Ashwood, 2015) (βλ. Κεφάλαια 1 και 9):
1. To πόσο αναπαραγώγιμη είναι, δηλαδή την πιστότητα (precision) της μεθόδου. H επαναληπτικότητα
(repeatability ή intra-assay precision) και η αναπαραγωγιμότητα (reproducibility ή inter-assay precision)
των αναλυτικών δεδομένων αναφέρονται στο βαθμό συμφωνίας μεταξύ μετρήσεων που λήφθηκαν με τον
ίδιο τρόπο. Αποτελούν μέτρο του τυχαίου σφάλματος της ανάλυσης. Τα πιο κοινά κριτήρια αξιολόγησής
τους είναι η απόλυτη και σχετική τυπική απόκλιση (Standard Deviation ή SD και Relative Standard
Deviation ή RSD), ο συντελεστής μεταβλητότητας (Coefficient of Variation ή CV) και η διακύμανση
(Variance). Αυτά αναλύονται περισσότερο στο Κεφάλαιο 9.
2. Το πόσο κοντινό είναι το υπολογιζόμενο αποτέλεσμα στην πραγματική τιμή της μέτρησης, δηλαδή την
ακρίβεια της μέτρησης (accuracy). Η ακρίβεια μίας μέτρησης αναφέρεται στη διαφορά μεταξύ του μέσου
όρου μιας σειράς μετρήσεων και της τιμής, η οποία είναι αποδεκτή ως η αληθής τιμή μίας μέτρησης.
3. Το πόσο μικρό σήμα μπορεί να μετρήσει, δηλαδή την ανιχνευσιμότητα (detectability) της μεθόδου. Η
ανιχνευσιμότητα αναφέρεται στην ικανότητα της μεθόδου να διακρίνει το σήμα του αναλύτη από το σήμα
του υποβάθρου ή θορύβου (δηλαδή από το σήμα του τυφλού (blank, backgrοund, noise). Το όριο
42
ανίχνευσης (Detection Limit ή DL ή Limit of Detection ή LOD) αναφέρεται στη μικρότερη συγκέντρωση
ή ποσότητα του μετρούμενου συστατικού, που μπορεί να προσδιορισθεί με ορισμένη πιστότητα και
ακρίβεια από τη μέθοδο (βλ. Ενότητα 1.24). Συνήθως ορίζεται ως η συγκέντρωση ή ποσότητα του
συστατικού για την οποία η απόκριση της μεθόδου διαφέρει από την απόκριση του τυφλού κατά το
τριπλάσιο της τυπικής απόκλισης του μέσου όρου του τυφλού. Σχετιζόμενο με το όριο ανίχνευσης είναι
το όριο ποσοτικού προσδιορισμού ή ποσοτικοποίησης (Limit of Quantification ή Limit of Quantitation
ή LOQ). Είναι το τριπλάσιο του ορίου ανίχνευσης. Χαρακτηρίζει τη μικρότερη συγκέντρωση του
μετρούμενου συστατικού, που μπορεί να προσδιορισθεί ποσοτικά με ορισμένη πιστότητα και ακρίβεια
από τη μέθοδο.
4. Την ευαισθησία της (sensitivity), δηλαδή το λόγο της μεταβολής του μετρούμενου μεγέθους (πχ.
απορρόφηση) προς τη μεταβολή της συγκέντρωσης του αναλύτη.
5. Τo εύρος γραμμικότητας (linearity range). Εξακριβώνεται με κατασκευή καμπύλης αναφοράς (γραφική

παράσταση αναλυτικού σήματος ως προς τη συγκέντρωση του αναλύτη, Σχήμα 2.1) και εφαρμογή
ανάλυσης παλινδρόμησης ελαχίστων τετραγώνων (βλ. Ενότητα 1.17). Το άνω άκρο του εύρους
γραμμικότητας καλείται όριο γραμμικότητας (Limit of Linearity ή LOL).
6. Tη χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων ή δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων (working range

ή dynamic range). Είναι η περιοχή συγκεντρώσεων μεταξύ του ορίου ποσοτικοποίησης και του ορίου
γραμμικότητας, στην οποία βέβαια η καμπύλη συσχέτισης είναι ευθεία. Στο Σχήμα 2.1 υποδεικνύεται
επάνω στην καμπύλη αναφοράς η χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων μίας αναλυτικής
μεθοδολογίας. Μόνο εντός αυτής της περιοχής, είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός του αναλύτη με
καθορισμένη αποδεκτή πιστότητα και ακρίβεια, με τη συγκεκριμένη μέθοδο.
Σχήμα 2.1 Καμπύλη αναφοράς. Σημειώνονται το όριο ανίχνευσης (DL) και ποσοτικοποίησης (LOQ), το όριο
γραμμικότητας (LOL) και η χρήσιμη αναλυτική (δυναμική) περιοχή συγκεντρώσεων. Είναι φανερό ότι η γραμμική σχέση
μεταξύ του σήματος του οργάνου μέτρησης και της συγκέντρωσης του προσδιοριζόμενου αναλύτη διατηρείται μόνο μέχρι
μία συγκεκριμένη συγκέντρωση του αναλύτη (LOL).
7. Το πόσο σημαντική είναι η επίδραση των άλλων συστατικών του δείγματος στην ακρίβεια του
προσδιορισμού, δηλαδή ποια είναι η εκλεκτικότητα (selectivity) ή ειδικότητα (specificity) της
αντίδρασης. Οι δύο όροι συχνά χρησιμοποιούνται χωρίς διάκριση, κι έτσι θα χρησιμοποιηθούν για τις
ανάγκες αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Μία αναλυτική μεθοδολογία θεωρείται ειδική, όταν μπορεί να
προσδιορίσει με ορισμένη ακρίβεια, χωρίς επίδραση από τα άλλα συστατικά του δείγματος, τον αναλύτη.
43
Τα κριτήρια αυτά για κάθε προτεινόμενη αναλυτική μεθοδολογία ποσοτικού προσδιορισμού,
μελετούνται από την επιστημονική κοινότητα και δημοσιεύονται στην επιστημονική βιβλιογραφία. Πολύ
συχνά, ένα κλινικό εργαστήριο επιλέγει να χρησιμοποιήσει μία τέτοια μεθοδολογία κατόπιν αξιολόγησής
της, με βάση τα παραπάνω κριτήρια, από ειδικές επιτροπές επιστημονικών ενώσεων. Τέτοιες είναι: η Διεθνής
Ένωση Κλινικής Χημείας (International Federation of Clinical Chemistry ή IFCC), η Γερμανική Ένωση
Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής (Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Chemie und
Laboratoriums Μedizin ή DGKL), η Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας (Société Française de Biologie
Clinique ή SFBC) κ.α. Η κάθε επιστημονική ένωση εξετάζει τα παραπάνω κριτήρια και αποφαίνεται σχετικά
με την υιοθέτηση μίας μεθόδου ως επίσημη, αποδεκτή μέθοδο ή μη αποδεκτή μέθοδο, για τον ποσοτικό
προσδιορισμό κάποιου αναλύτη σε κλινικά δείγματα. Έτσι, για παράδειγμα, η Γερμανική Ένωση Κλινικής
Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής και η Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας έχουν υιοθετήσει ως
επίσημη μέθοδο ποσοτικού προσδιορισμού της LDH σε πλάσμα την καταλυόμενη από LDH μετατροπή του
πυροσταφυλικού σε γαλακτικό οξύ σε pH 7,4 - 7,8 (Standardization Committee of the German Society for
Clinical Chemistry, 1993· Mathieu et al., 1982). Αντίθετα, η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας προτείνει τη
μετατροπή του γαλακτικού σε πυροσταφυλικό σε pH 8,8 - 9,8 (Bais & Philcox, 1994).
Πέραν των γνωμοδοτήσεων αυτών, άλλα κριτήρια που παίζουν ρόλο στην επιλογή της αναλυτικής
μεθοδολογίας μιας ανάλυσης από ένα συγκεκριμένο κλινικό εργαστήριο αποτελούν η διαθεσιμότητα του
απαραίτητου εξοπλισμού, το κόστος και ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης, ο βαθμός πολυπλοκότητας
της μεθοδολογίας και η εμπειρία/επιδεξιότητα του διαθέσιμου επιστημονικού προσωπικού.
Σύνοψη: Τα ποσοτικά κριτήρια που λαμβάνονται υπ’ όψιν κατά την επιλογή μίας αναλυτικής μεθοδολογίας
ποσοτικού προσδιορισμού κλινικού αναλύτη αποτελούν οι πιστότητα, ακρίβεια, ανιχνευσιμότητα, ευαισθησία,
εκλεκτικότητα και δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων της μεθόδου. Με βάση τα κριτήρια αυτά, διάφορες
επιστημονικές ενώσεις κλινικής χημείας υιοθετούν μία μέθοδο προσδιορισμού κλινικού αναλύτη ως επίσημη.
Τα διαγνωστικά εργαστήρια μπορούν στη συνέχεια να επιλέξουν μία εκ των επίσημων μεθόδων με βάση
ποιοτικά κριτήρια, όπως η διαθεσιμότητα του απαιτούμενου εξοπλισμού και εμπειρίας, το κόστος, η
πολυπλοκότητα και ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης.
2.3 Φωτομετρικές Aναλυτικές Mέθοδοι στην Kλινική Aνάλυση
Καθ’ ότι οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού είναι οι πλέον εύχρηστες, γρήγορες, και απαιτούν κοινό
εργαστηριακό εξοπλισμό, βρίσκουν ευρύτατη εφαρμογή στην κλινική ανάλυση (McPherson & Pincus, 2011).
Πολύ σπάνια όμως, στην κλινική ανάλυση, ο προσδιορισμός μίας κλινικής παραμέτρου βασίζεται
στην εκλεκτική απορρόφηση του προσδιοριζόμενου αναλύτη σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Αυτό ισχύει
γιατί στην πλειοψηφία τους οι αναλύτες κλινικού ενδιαφέροντος δεν είναι έγχρωμοι. Έτσι, δεν απορροφούν
στο ορατό (Vis), αλλά απλώς στο υπεριώδες (UV) και κυρίως μεταξύ 220 και 315 nm (δηλαδή εντός της
UVC και UVB περιοχής), όπου επίσης απορροφάται και πλήθος άλλων μορίων που περιέχονται σε κάποιο
κλινικό δείγμα. Κατά συνέπεια, δεν είναι δυνατόν η συντριπτική πλειοψηφία των κλινικών αναλυτών να
προσδιοριστεί εκλεκτικά με βάση απλώς την απορρόφηση των αναλυτών σε αυτές τις περιοχές του UV.
Προκειμένου να αυξηθεί η εκλεκτικότητα του προσδιορισμού, η μεγάλη πλειοψηφία των
αναλυτικών μεθόδων στην κλινική ανάλυση βασίζεται στον ποσοτικό προσδιορισμό μίας έγχρωμης ένωσης,
που παράγεται όταν το προς ανάλυση κλινικό δείγμα αναμιγνύεται με κατάλληλα αντιδραστήρια, υπό
καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Οι έγχρωμες ενώσεις (βλ. Ενότητα 1.1) απορροφούν στην ορατή
περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος (Vis). Η γενική αντίδραση που περιγράφει την αρχή των
προσδιορισμών αυτών είναι η:
Δείγμα + Χρωμογόνο ——› Έγχρωμη ένωση (Αντίδραση 2.1)
Το χρωμογόνο προστίθεται πάντοτε σε περίσσεια. Εάν οι συνθήκες της παραπάνω αντίδρασης είναι
τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του
αναλύτη στο δείγμα, η αντίδραση μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του αναλύτη. Ως
παράδειγμα τέτοιου κλινικού προσδιορισμού, αναφέρεται ο in vitro ποσοτικός προσδιορισμός του μαγνησίου
44
σε ορό ή ούρα. Σε αλκαλικό περιβάλλον το μαγνήσιο αντιδρά με την ένωση καλμαγίτη προς σχηματισμό
χηλικής ένωσης ερυθρού χρώματος.
Καλμαγίτης + Mg 2+ ——› Έγχρωμη χηλική ένωση (Αντίδραση 2.2)
Η οφειλόμενη στη χημική ένωση απορρόφηση στα 520 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του
μαγνησίου στο κλινικό δείγμα.
Μεταξύ των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή του έγχρωμου προϊόντος
μπορεί να συγκαταλέγονται και ένζυμα. Στις περιπτώσεις αυτές τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες της
αντίδρασης. Παραδείγματα ενζυμικά καταλυόμενων κλινικών προσδιορισμών αποτελούν οι χημικές
αντιδράσεις 2.3, 2.4, 2.5, 2.6 και 2.7 παρακάτω.
Σύνοψη: Πολύ συχνά ο ποσοτικός προσδιορισμός κάποιου κλινικού αναλύτη επιτυγχάνεται με φωτομέτρηση
έγχρωμης ένωσης που παράγεται, σε ένα ή περισσότερα στάδια, όταν ο αναλύτης αντιδράσει με κατάλληλο
χρωμογόνο, υπό την κατάλυση ενζύμου ή όχι. Οι συνθήκες της αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε η
απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο κλινικό
δείγμα.
Σε αρκετές περιπτώσεις δεν είναι δυνατή η παραγωγή έγχρωμης ένωσης κατά την αντίδραση ενός
κλινικού αναλύτη σε ένα στάδιο. Στις περιπτώσεις αυτές καταφεύγουμε σε συζευγμένες αντιδράσεις.
Συζευγμένη μέθοδος (coupled assay) είναι αυτή όπου μία δεύτερη αντίδραση επιστρατεύεται (συχνά
ενζυμικά καταλυόμενη) στην οποία το προϊόν μιας πρώτης αντίδρασης, όπου συμμετέχει ο αναλύτης ως
αντιδρών, μετατρέπεται σε έγχρωμη ένωση. Όταν η δεύτερη αντίδραση προχωρά με πολύ ταχύτερο ρυθμό σε
σχέση με την πρώτη αντίδραση, ο ρυθμός σχηματισμού του χρώματος είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του
αναλύτη που συμμετέχει στην πρώτη αντίδραση. Υπό τις συνθήκες αυτές, η μέθοδος μπορεί να
χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του συγκεκριμένου κλινικού αναλύτη. Παράδειγμα
συζευγμένης μεθόδου που χρησιμοποιείται ευρύτατα στην κλινική ανάλυση για τον ποσοτικό προσδιορισμό
της γλυκόζης είναι η παρακάτω: Παρουσία του ενζύμου οξειδάση της γλυκόζης (Glucose Oxidase ή GOD) η
γλυκόζη οξειδώνεται παράγοντας Η2Ο2. Το Η2Ο2 αντιδρά στη συνέχεια με φαινολικό παράγωγο και 4-
αμινοφαιναζόνη και παράγει έγχρωμο προϊόν ερυθρού χρώματος. Η τελευταία αντίδραση καταλύεται από το
ένζυμο υπεροξειδάση (Peroxidase ή POD).
𝐺𝑂𝐷
Γλυκόζη + Η2Ο + O2 → Γλυκονικό οξύ + 2Η2Ο2 (Αντίδραση 2.3)
𝑃𝑂𝐷
Η2Ο2 + φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη → έγχρωμο προϊόν + 4 Η2Ο (Αντίδραση 2.4)
Η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος στα 510 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της
γλυκόζης στο δείγμα.
Σύνοψη: Συχνά για τον ποσοτικό προσδιορισμό κάποιου κλινικού αναλύτη επιστρατεύεται και δεύτερη
αντίδραση στην οποία το προϊόν μίας πρώτης αντίδρασης, όπου συμμετέχει ο αναλύτης ως αντιδρών,
μετατρέπεται σε έγχρωμη ένωση. Τότε μιλάμε για σύστημα συζευγμένων αντιδράσεων. Οι συνθήκες της
συνολικής αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες, ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να
είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη στο κλινικό δείγμα.
Πέραν των έγχρωμων παραγώγων, κοινό προϊόν των αντιδράσεων στις οποίες βασίζονται πολλοί
βιοχημικοί προσδιορισμοί αποτελεί το συνένζυμο ΝADH (ή η φωσφορυλιωμένη μορφή του, ΝΑDPH) είτε
στη οξειδωμένη NAD(P)+, είτε στην ανηγμένη του μορφή NAD(P)Η. Το ΝΑD(P)H απορροφά στα 340 nm,
ενώ η οξειδωμένη μορφή του ΝΑD(P)+ δεν απορροφά σε αυτό το μήκος κύματος. Καθώς το ΝΑD(P)H
συμμετέχει και στα δύο σκέλη μίας τέτοιας αντίδρασης υφιστάμενο οξείδωση ή αναγωγή, μπορούμε να
προσδιορίσουμε τον αναλύτη που μας ενδιαφέρει, καταγράφοντας την αύξηση ή μείωση της απορρόφησης
στα 340 nm. Ως παράδειγμα αναφέρεται η εναλλακτική μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού της γλυκόζης:
Παρουσία του ενζύμου εξοκινάση (Hexokinase ή HK) η γλυκόζη φωσφορυλιώνεται προς 6-φωσφορική
45
γλυκόζη. Η τελευταία με τη βοήθεια του ενζύμου 6-φωσφορική αφυδρογονάση της γλυκόζης (Glucose 6P-
dehydrogenase ή G6P-DH) οξειδώνεται με ταυτόχρονη αναγωγή του συνενζύμου NAD+ σε NΑDH.
𝐻𝐾
γλυκόζη +ΑΤP → γλυκόζη-6P +ADP (Αντίδραση 2.5)
𝐺6𝑃−𝐷𝐻
γλυκόζη-6P +NAD+ → γλυκoνικό-6P+ ΝADΗ + Η+ (Αντίδραση 2.6)
Η αύξηση της απορρόφησης στα 340 nm είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της γλυκόζης στο δείγμα.
Σύνοψη: Πολύ συχνή στη κλινική ανάλυση είναι και η χρήση ποσοτικών μεθοδολογιών βασισμένων στη
μεταβολή της οξειδωτικής κατάστασης του συνενζύμου NAD(P)H. Στις μεθοδολογίες αυτές παρακολουθείται η
μεταβολή της απορρόφησης στα 340 nm, όπου απορροφά η ανηγμένη μόνο μορφή του συνενζύμου.
Σε αναλογία με ό, τι ειπώθηκε παραπάνω, πολύ λίγα ένζυµα (κλινικού ή μη ενδιαφέροντος)

µπορούν να προσδιοριστούν µε άμεσες φωτοµετρικές µεθόδους. Για τα περισσότερα ένζυµα, ο
προσδιορισμός τους γίνεται έμμεσα, μέσω της προόδου συγκεκριμένων αντιδράσεων που καταλύουν. Η
συγκέντρωση δε του ενζύμου υπολογίζεται από την ταχύτητα της καταλυόμενης αντίδρασης (βλ. Κεφάλαια 1
& 3). Αντίστοιχες αναλυτικές μέθοδοι, απλές ή συζευγμένες, που παράγουν έχρωμη ένωση ή μεταβάλλουν
την οξειδωτική κατάσταση του συνενζύμου NAD(P)H χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για τον
προσδιορισμό ενζύμων με κλινικό ενδιαφέρον. Ως παράδειγμα αναφέρεται ο προσδιορισμός της
δραστικότητας της δεϋδρογονάσης του γαλακτικού οξέος (Lactate Dehydrogenase ή LDH), μέσω της
αναγωγής του πυροσταφυλικού οξέος.
𝐿𝐷𝐻
Πυροσταφυλικό + NADH + H+ → L-γαλακτικό + NAD+ (Αντίδραση 2.7)
Ο ρυθμός ελάττωσης της απορρόφησης στα 340 nm (λόγω της οξείδωσης του NADH) είναι
ανάλογος της δραστικότητας της LDH στο δείγμα.
Όπως αναφέρθηκε, φωτομετρικές μεθοδολογίες χρησιμοποιούνται στη συντριπτική πλειονότητα
των βιοχημικών αναλύσεων, κυρίως λόγω της ευρείας διαθεσιμότητας του απαραίτητου εξοπλισμού. Σε
μεμονωμένες όμως περιπτώσεις βιοχημικών προσδιορισμών το παραγόμενο προϊόν προσδιορίζεται
φθορισμομετρικά, ποτενσιομετρικά, ή αγωγιμομετρικά, ή μέσω της παραγόμενης χημειοφωταύγειας.
2.4 Μεθοδολογίες Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών
Για τον ποσοτικό φωτομετρικό προσδιορισμό ενός κλινικού αναλύτη βασιζόμενο σε μία συγκεκριμένη
αντίδραση, είναι δυνατόν να εφαρμοστούν δύο εναλλακτικές μεθοδολογίες, η μέθοδος τελικού σημείου και η
κινητική μέθοδος (Chang, 2005· Palmer & Bonner, 2007· Pillay, 2014). Στο κεφάλαιο αυτό θα αναπτυχθεί η
μέθοδος τελικού σημείου, και στο επόμενο (Κεφάλαιο 3) η κινητική μέθοδος.
Στη μέθοδο τελικού σημείου (end point method) η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος
μετριέται μόνο σε μία συγκεκριμένη χρονική στιγμή μετά την έναρξη της αντίδρασης. Η μέτρηση γίνεται
κατά κανόνα στο τέλος της αντίδρασης, δηλαδή αφού έχει παραχθεί η μέγιστη ποσότητα προϊόντος. Η
συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη.
Στην κινητική μέθοδο (kinetic method) λαμβάνονται σειρά μετρήσεων και υπολογίζεται ο ρυθμός
εξέλιξης μίας αντίδρασης για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενός αναλύτη. Πέραν αυτής της βασικής
διαφοράς τους, οι δύο κατηγορίες κλινικών προσδιορισμών διαφέρουν επίσης ως προς τη βαθμονόμηση,
όπως κι ως προς τον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα επεξεργάζονται για τον προσδιορισμό της
συγκέντρωσης του αναλύτη ενδιαφέροντος.
Στο Κεφάλαιο 3 επεξηγείται γιατί η δραστικότητα κάποιου ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα
με κινητικές μεθόδους. Αντίθετα, στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών κλινικών αναλυτών, η κινητική όπως
και η μέθοδος τελικού σημείου μπορούν να εφαρμοστούν.
46
2.4.1 Μέθοδοι Τελικού Σημείου Κλινικών Φωτομετρικών Προσδιορισμών
2.4.1.1 Βασικές Αρχές
Ένα πρωτόκολλο φωτομετρικού προσδιορισμού με μέθοδο τελικού σημείου είναι αυτό της Φωτογραφίας 2.1
κατά τον προσδιορισμό της γλυκόζης στον ορό με το σύστημα των ενζύμων GOD/POD (Αντιδράσεις 2.3,
2.4). Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, λαμβάνεται μία τιμή απορρόφησης για κάθε άγνωστο, πρότυπο και για το
τυφλό στα 510 nm, μετά από 15 min επώασης στους 37οC.
Το διάγραμμα μεταβολής της οφειλόμενης στο έγχρωμο προϊόν απορρόφησης με το χρόνο, για τη
συγκεκριμένη αντίδραση στους 37οC φαίνεται στο Σχήμα 2.2. Είναι φανερό ότι ήδη από τα 9,5 min μετά την
έναρξη της αντίδρασης η καμπύλη συσχέτισης παρουσιάζει «πλάτωμα». Αυτό σημαίνει ότι ουσιαστικά δεν
υπάρχει πλέον μεταβολή της απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου, δηλαδή δεν συμβαίνει πλέον παραγωγή
έγχρωμου προϊόντος. Επομένως, είναι βέβαιο ότι, εάν γίνει μία μέτρηση της απορρόφησης στα 15 min από
την έναρξη της αντίδρασης, η λαμβανόμενη απορρόφηση θα αντιστοιχεί στη μέγιστη μετατροπή του
αντιδρώντος σε έγχρωμο προϊόν.
Σχήμα 2.2 Διάγραμμα μεταβολής της οφειλόμενης στο έγχρωμο προϊόν απορρόφησης με το χρόνο, κατά τον φωτομετρικό
προσδιορισμό τελικού σημείου της γλυκόζης στον ορό με το σύστημα των ενζύμων GOD/POD. Η κάθετη διακεκομμένη
γραμμή υποδεικνύει τη χρονική στιγμή πέραν της οποίας η καμπύλη συσχέτισης παρουσιάζει «πλάτωμα».
Για τη συσχέτιση της μετρούμενης απορρόφησης με τη συγκέντρωση του αναλύτη, σε μία μέθοδο
τελικού σημείου, απαιτείται βαθμονόμηση π.χ. με καμπύλη αναφοράς ή χρήση μόνο ενός προτύπου (Harr,
2012).
Σύνοψη: Στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών κλινικών αναλυτών η κινητική όπως και η μέθοδος τελικού
σημείου μπορούν να εφαρμοστούν. Στις φωτομετρικές μεθόδους τελικού σημείου η απορρόφηση μετριέται κατά
κανόνα μόνο στο τέλος της αντίδρασης, αφού πλέον δεν παράγεται άλλο προϊόν. Απαιτείται βαθμονόμηση για
τον ποσοτικό προσδιορισμό. Αντίθετα, η δραστικότητα κάποιου κλινικού ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα
με κινητική μέθοδο.
47
Φωτογραφία 2.1 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού γλυκόζης με μέθοδο
τελικού σημείου βασισμένη στο ενζυμικό σύστημα GOD/POD.
2.4.1.2 Βαθμονόμηση Μεθόδων Τελικού Σημείου
Καθώς οι μετρήσεις των ενόργανων τεχνικών ανάλυσης είναι σχετικές, απαιτούν τη βαθμονόμηση
(calibration) των οργάνων (βλ. Ενότητα 1.13), προκειμένου να χρησιμοποιηθούν στον ποσοτικό
προσδιορισμό κάποιου αναλύτη. Η βαθμονόμηση είναι η διαδικασία που συσχετίζει το μετρούμενο
αναλυτικό σήμα (π.χ. απορρόφηση) με τη συγκέντρωση του αναλύτη. Μέσω αυτής, το αναλυτικό σήμα
μετατρέπεται σε χημική πληροφορία (συγκέντρωση ή περιεκτικότητα προσδιοριζόμενης ουσίας), όπως στα
Σχήματα 2.1 και 2.3.
Υπάρχουν πολλοί τύποι βαθμονόμησης (βλ. Ενότητα 1.13). Εδώ θα υπογραμμιστούν και πάλι μόνο
τα βασικά βήματα της βαθμονόμησης με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων και κατασκευή καμπύλης
αναφοράς (calibration curve method) ή με χρήση ενός μόνο εξωτερικού προτύπου (single external standard
method). Αυτές είναι οι δύο κυριότερες μεθοδολογίες που εφαρμόζονται στην καθημερινή πρακτική ενός
κλινικού εργαστηρίου για τη βαθμονόμηση, κατά το προσδιορισμό αναλυτών με μεθόδους τελικού σημείου.
Η βαθμονόμηση (βλ. Ενότητα 1.13.1) και στις δύο περιπτώσεις επιτυγχάνεται με διαλύμα(τα)
προτύπου(ων) της προσδιοριζόμενης ουσίας, ιδανικά σε μήτρα παραπλήσιας σύστασης με τα δείγματα. Η
βαθμονόμηση εδώ προϋποθέτει ότι το μετρούμενο σήμα (π.χ. η απορρόφηση) είναι γραμμική συνάρτηση της
συγκέντρωσης του αναλύτη που προσδιορίζεται. Με τη μέθοδο απλού εξωτερικού προτύπου γίνεται
βαθμονόμηση του οργάνου με χρήση ενός μόνο προτύπου, δηλαδή ενός μόνο πειραματικού σημείου, αντί
πολλών, σε αντίθεση με τη μέθοδο της καμπύλης αναφοράς. Η βαθμονόμηση με χρήση ενός μόνο
εξωτερικού προτύπου προϋποθέτει όχι απλά γραμμική, αλλά και αναλογική σχέση μεταξύ μετρούμενου
σήματος/συγκέντρωσης. Αυτό σημαίνει ότι η ευθεία συσχέτισης θα πρέπει να διέρχεται από την αρχή των
48
αξόνων. H μέθοδος απλού εξωτερικού προτύπου έχει μικρότερη ακρίβεια από τη μέθοδο της καμπύλης
αναφοράς.
Σύνοψη: Οι δύο κυριότερες μεθοδολογίες βαθμονόμησης κλινικών προσδιορισμών τελικού σημείου είναι η
βαθμονόμηση με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων και κατασκευή καμπύλης αναφοράς, και η
βαθμονόμηση με χρήση ενός μόνο εξωτερικού προτύπου. H τελευταία μέθοδος έχει μικρότερη ακρίβεια από τη
μέθοδο της καμπύλης αναφοράς.
2.4.1.3 Ελαχιστοποίηση της επίδρασης παρεμβαλλόμενων ουσιών στην απορρόφηση
Σε ένα φωτομετρικό προσδιορισμό κλινικού βιοχημικού αναλύτη είναι πολύ πιθανόν συστατικά της μήτρας
να παρεμβάλλονται, λόγω απορρόφησης ή διάθλασης του φωτός, οδηγώντας σε εσφαλμένα ποσοτικά
συμπεράσματα.
Η επίδραση των παρεμβολών αυτών λαμβάνεται υπόψη μέσω της φωτομέτρησης τυφλού (blank)
και αφαίρεσης της συνεισφοράς του στην απορρόφηση του δείγματος. Το τυφλό είναι όμοιο με το δείγμα που
αναλύεται (άγνωστο), με τη διαφορά ότι δεν περιέχει την ουσία που επιθυμούμε να προσδιορίσουμε.
Υποβάλλεται επίσης στους ακριβείς πειραματικούς χειρισμούς που υποβάλλεται το προς ανάλυση δείγμα.
Επομένως, περιέχει τη μήτρα του δείγματος και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στην αναλυτική
μέθοδο. Στην καθημερινή εργαστηριακή πράξη όμως δεν είναι πάντοτε διαθέσιμο τυφλό που να αντιστοιχεί
απολύτως στη μήτρα. Συχνά ως τυφλό χρησιμοποιείται είτε το πρότυπο 0, είτε φυσιολογικός ορός, είτε
απιονισμένο νερό, το οποίο υποβάλλεται στους ακριβείς πειραματικούς χειρισμούς που υποβάλλεται το προς
ανάλυση δείγμα. Είναι κατανοητό ότι ένα τέτοιο τυφλό όμως δεν αντικατοπτρίζει επακριβώς τη συνεισφορά
της μήτρας.
Αυτή η συνεισφορά μπορεί να είναι ιδιαίτερα σημαντική, π.χ. στην περίπτωση αιμολυμένων ή
ικτερικών δειγμάτων, λόγω της απορρόφησης της αιμοσφαιρίνης και χολερυθρίνης αντίστοιχα, στο Vis. Η
απορρόφηση της αιμοσφαιρίνης ή χολερυθρίνης καθώς και η θολερότητα σε λιπαιμικά δείγματα είναι οι πιο
κοινές παρεμβολές σε κλινικούς φωτομετρικούς προσδιορισμούς. Επίσης μπορεί συστατικά της μήτρας να
παρεμβάλλονται στον ποσοτικό προσδιορισμό λόγω αντίδρασης με το χρωμογόνο. Στις περιπτώσεις αυτές
είναι δυνατόν να ελαχιστοποιηθεί η συνεισφορά του συστατικού της μήτρας στην ανάπτυξη του
μετρούμενου σήματος με την εφαρμογή διχρωματικής ανάλυσης (bichromatic analysis) (Thomas, eJIFCC).
Στη διχρωματική ανάλυση, η απορρόφηση δειγμάτων και τυφλού μετράται σε δύο μήκη κύματος:
Σε μήκος κύματος όπου απορροφούν από κοινού ο αναλύτης ενδιαφέροντος και η παρεμβαλλόμενη ουσία
της μήτρας και σε ένα δεύτερο μήκος κύματος, όπου απορροφά μόνο η παρεμβαλλόμενη ουσία. Γνωρίζοντας
το μοριακό συντελεστή απόσβεσης της ουσίας στο δεύτερο μήκος κύματος, μπορούμε να υπολογίσουμε τη
συγκέντρωση αυτής. Στη συνέχεια με βάση το μοριακό συντελεστή απόσβεσης αυτής στο πρώτο μήκος
κύματος, όπου απορροφούν από κοινού αναλύτης και παρεμβαλλόμενη ουσία, είναι δυνατόν να υπολογιστεί
η οφειλόμενη στην παρεμβολή απορρόφηση. Ακολούθως, υπολογίζεται και η καθαρή συνεισφορά του
αναλύτη στην απορρόφηση. Π.χ. διχρωματική ανάλυση εφαρμόζεται κατά τον προσδιορισμό της νεογνικής
χολερυθρίνης μέσω της απορρόφησης αυτής στα 452 nm. Η διχρωματική ανάλυση εφαρμόζεται για την
ελαχιστοποίηση της επίδρασης της αιμοσφαιρίνης που επίσης απορροφά στα 452 nm. Το δεύτερο μήκος
κύματος όπου παρακολουθείται η απορρόφηση είναι τα 540 nm, εκεί όπου εμφανίζεται η εκλεκτική
απορρόφηση της αιμοσφαιρίνης. Μάλιστα, επειδή ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης της αιμοσφαιρίνης
στα 452 nm και στα 540 nm είναι πολύ αντίστοιχος, ο προσδιορισμός της χολερυθρίνης γίνεται απευθείας
στα 452 nm μετά από μηδενισμό του φωτόμετρου με το τυφλό στα 540 nm. Αντίστοιχη είναι η έννοια και η
χρήση της πολυχρωματικής ανάλυσης, όπου η απορρόφηση δειγμάτων και τυφλού μετράται σε
περισσότερα από δύο μήκη κύματος.
Η τεχνική της διχρωματικής (ή πολυχρωματικής) ανάλυσης δυστυχώς δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε
κάθε περίπτωση παρεμβολών της μήτρας, λόγω έλλειψης περιοχής του UV/Vis, όπου απορροφά εκλεκτικά η
παρεμβαλλόμενη ουσία. Σε τέτοιες περιπτώσεις η ελαχιστοποίηση των παρεμβολών επιτυγχάνεται με
εναλλακτικές τεχνικές, όπως με καταβύθιση της παρεμβαλλόμενης ουσίας ή μέσω (ενζυματικής ή χημικής)
μετατροπής αυτής. Η καταβύθιση επιτυγχάνεται για παράδειγμα με υπερφυγοκέντρηση, στην περίπτωση
λιπαιμικών δειγμάτων, ή με χημική καταβύθιση σε άλλες περιπτώσεις. Τέτοιο παράδειγμα, αποτελεί η
μετατροπή της παρεμβαλλόμενης στον προσδιορισμό της κρεατινίνης, χολερυθρίνης, σε παράγωγο αυτής
μετά από κατεργασία με άλκαλι ή με θειοκυανιούχο σίδηρο. Το σχηματιζόμενο παράγωγο δεν απορροφά
49
πλέον σε μήκος κύματος, που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό της κρεατινίνης (O’Leary et al., 1992·
Vaishya et al., 2010).
Τέλος, η χρήση κινητικών μεθόδων προσδιορισμού αντί μεθόδων τελικού σημείου, μπορεί να
ελαχιστοποιήσει τη συνεισφορά της παρεμβαλλόμενης ουσίας. Σε μία κινητική μέθοδο ο σχηματισμός του
έγχρωμου προϊόντος παρακολουθείται επί πολύ σύντομο χρονικό διάστημα, όπου (ανάλογα με την
περίπτωση) είναι δυνατόν η οποιαδήποτε συνεισφορά της παρεμβαλλόμενης ουσίας στην ανάπτυξη του
έγχρωμου προϊόντος να είναι αμελητέα. Επίσης, καθώς σε μία κινητική μέθοδο υπολογίζεται η μεταβολή της
απορρόφησης με το χρόνο, η συνεισφορά της μήτρας στην απορρόφηση ακυρώνεται, εάν βέβαια η
απορρόφηση της μήτρας δε μεταβάλλεται με το χρόνο.
2.4.1.4 Πειραματική διαδικασία ποσοτικού Φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού Τελικού

Σημείου
Η πειραματική διαδικασία ποσοτικού φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού τελικού σημείου περιλαμβάνει

τα παρακάτω γενικά στάδια:
Α. Εφαρμόζεται η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του κλινικού αναλύτη, όπως ακριβώς περιγράφεται
στο πρωτόκολλο, για το τυφλό, τα πρότυπα και το άγνωστο.
Β. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με απιονισμένο νερό και λαμβάνονται οι μετρήσεις απορρόφησης του
αγνώστου, του τυφλού και των προτύπων. Η μέτρηση του τυφλού δε θα πρέπει να είναι υψηλότερη
συγκεκριμένης, δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Στην αντίθετη περίπτωση, τα αντιδραστήρια
εργασίας που εμπεριέχονται στο τυφλό απορρίπτονται. Αυτό, διότι μία τέτοια υψηλή τιμή για το τυφλό
είναι ενδεικτική αλλοίωσης των αντιδραστηρίων εργασίας π.χ. λόγω επιμόλυνσής τους με τον
προσδιοριζόμενο αναλύτη.
Ανάλογα με την εφαρμοζόμενη μέθοδο βαθμονόμησης ακολουθούνται τα βήματα Γ και Δ ή το βήμα Ε.
Γ. Βαθμονόμηση με μέθοδο καμπύλης αναφοράς: Κατασκευάζεται στη συνέχεια η γραφική παράσταση
του λαμβανόμενου σήματος (απορρόφησης) (άξονας ψ) με τη συγκέντρωση του αναλύτη στα πρότυπα
(άξονας χ), δηλαδή η καμπύλη αναφοράς. Η μέτρηση του τυφλού πρέπει να αφαιρεθεί από τη μέτρηση
των προτύπων πριν κατασκευαστεί η καμπύλη αναφοράς. Εφαρμόζεται η μέθοδος των ελαχίστων
τετραγώνων (βλ. Ενότητα 1.17) και υπολογίζεται η γραμμική εξίσωση συσχέτισης
απορρόφησης/συγκέντρωσης: y = αx+ β.
Δ. Από την τιμή του σήματος του αγνώστου επίσης αφαιρείται η τιμή του τυφλού. Εάν η προκύπτουσα τιμή
σήματος (απορρόφησης) αντιστοιχεί στη δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων της καμπύλης, η
συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο μπορεί να προσδιοριστεί με τη βοήθεια της εξίσωσης
παλινδρόμησης.
Προσοχή: Εάν η τιμή της απορρόφησης του αγνώστου αντιστοιχεί εκτός της δυναμικής περιοχής
συγκεντρώσεων στην καμπύλη αναφοράς, γίνεται αραίωση του αρχικού δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το
πρωτόκολλο της μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα, μέχρις ότου η τιμή του μετρούμενου σήματος (απορρόφησης)
αντιστοιχεί εντός της δυναμικής περιοχής συγκεντρώσεων της καμπύλης. Υπολογίζεται τότε η συγκέντρωση του
αραιωμένου δείγματος με βάση την καμπύλη αναφοράς και πολλαπλασιάζεται επί τον συντελεστή αραίωσης για
να υπολογιστεί η συγκέντρωση του μη αραιωμένου δείγματος.
Ας υποθέσουμε ότι κατά τον φωτομετρικό προσδιορισμό κάποιου αναλύτη μετρήθηκαν οι

απορροφήσεις των προτύπων, του τυφλού (Ατυφλού = 0,05) και του άγνωστου (ΑΑγνώστου = 0,65), και ότι
υπολογίστηκε η εξίσωση παλινδρόμησης της απορρόφησης ως προς τη συγκέντρωση του αναλύτη. Ο
υπολογισμός της εξίσωσης παλινδρόμησης έγινε όπως περιγράφηκε στην Ενότητα 1.17, λαμβάνοντας υπόψη
μόνο τα σημεία αυτά, όπου είναι εμφανής η γραμμική συσχέτιση μεταξύ απορρόφησης και συγκέντρωσης
αναλύτη. Στο παράδειγμα του Σχήματος 2.3 δε λήφθηκαν υπόψη τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10
mg/mL. Η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο δείγμα ([Άγνωστο]) υπολογίζεται αντικαθιστώντας στην
εξίσωση της ευθείας όπου y = ΑΆγνωστο-ΑΤυφλό και όπου x = [Άγνωστο]:
y = 0,0789 x + 0,0265 => (ΑΆγνωστο - ΑΤυφλό) = 0,0789 [Άγνωστο] + 0,0265 =>
50
[Άγνωστο] = (0,65 - 0,05 – 0,0265)/0,0789 => [Άγνωστο] = 0,5735/0,0789 => [Άγνωστο] = 7,27 mg/mL
Σχήμα 2.3 Ευθεία παλινδρόμησης που κατασκευάσθηκε με χρήση πολλαπλών εξωτερικών προτύπων. Στην κατασκευή της
δεν λήφθηκαν υπόψη τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10 mg/mL. Η εξίσωση της ευθείας και ο συντελεστής
συσχέτισης R2 σημειώνονται.
Βλέπουμε, ότι το τετράγωνο του συντελεστή συσχέτισης για την εξίσωση παλινδρόμησης του
Σχήματος 2.3 πλησιάζει πολύ κοντά στη μονάδα, το οποίο καταδεικνύει πολύ καλή γραμμική συσχέτιση
απορρόφησης/συγκέντρωσης για την περιοχή των συγκεντρώσεων που εξετάσθηκαν. Εάν ληφθούν υπόψη
και τα σημεία για συγκεντρώσεις αναλύτη > 10 mg/mL, η υπολογιζόμενη τιμή R2 μειώνεται σε R2 = 0,9819.
Ο χαμηλότερος συντελεστής συσχέτισης υποδεικνύει φτωχότερη συσχέτιση. Γενικά στοχεύουμε να έχουμε
τιμές R2 > 0,99, προκειμένου η ακρίβεια υπολογισμού να είναι αποδεκτή.
Ε. Βαθμονόμηση με μέθοδο απλού εξωτερικού προτύπου: Εάν χρησιμοποιείται μόνο ένα εξωτερικό
πρότυπο με συγκέντρωση αναλύτη [Πρότυπο], τότε η συγκέντρωση του αναλύτη στο Άγνωστο
([Άγνωστο]) προσδιορίζεται με βάση τη σχέση:
𝛢𝛢𝛾𝜈ώ𝜎𝜏𝜊𝜐 −𝛢𝛵𝜐𝜑𝜆𝜊ύ
[Άγνωστο]= 𝛢 x [Πρότυπο] (Εξίσωση 2.1)
𝛱𝜌𝜊𝜏ύ𝜋𝜊𝜐 −𝛢𝛵𝜐𝜑𝜆𝜊ύ
όπου ΑΑγνώστου, ΑΠροτύπου και ΑΤυφλού οι τιμές απορρόφησης που μετρήθηκαν για το Άγνωστο, το Πρότυπο και
το Τυφλό αντίστοιχα.
Έτσι π.χ. εάν μετρήθηκαν οι απορροφήσεις ΑΤυφλού = 0,1, ΑΑγνώστου = 1,1, ΑΠροτύπου = 0,6 και είναι
γνωστό ότι [Πρότυπο] = 50 mg/dL, τότε η συγκέντρωση του αναλύτη στο Άγνωστο θα είναι:
1,1−0,1
[Άγνωστο]= 0.6−0,1 x 50 (mg/ dL)= 100 mg/ dL (Εξίσωση 2.2)
Εάν η τιμή του σήματος (απορρόφησης) αντιστοιχεί εκτός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης
(αναφέρεται ως «γραμμικότητα» στο πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1), γίνεται αραίωση του αρχικού
δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το πρωτόκολλο της μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα, μέχρις ότου η τιμή της
απορρόφησης του αραιωμένου δείγματος αντιστοιχεί εντός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης. Στη
συνέχεια, υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του αραιωμένου δείγματος και λαμβάνουμε υπόψη τον συντελεστή
αραίωσης, για να υπολογιστεί η συγκέντρωση του μη αραιωμένου δείγματος.
Εξυπακούεται, ότι και στις δύο περιπτώσεις βαθμονόμησης, η ακρίβεια της μέτρησης βασίζεται
στην ακρίβεια των συγκεντρώσεων των προτύπων και στο κατά πόσο πανομοιότυπη είναι η μήτρα των
51
προτύπων με τη μήτρα του αγνώστου. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μία διαφορά στη μήτρα μπορεί να οδηγήσει
σε σημαντικά αναλυτικά σφάλματα.
Σύνοψη: Κατά τον φωτομετρικό κλινικό προσδιορισμό τελικού σημείου εφαρμόζεται η μέθοδος στο τυφλό,
τα(ο) πρότυπα(ο) και το άγνωστο. Η μέτρηση του τυφλού δε θα πρέπει να είναι υψηλότερη συγκεκριμένης,
δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Η συγκέντρωση του αναλύτη στο άγνωστο υπολογίζεται κατόπιν
βαθμονόμησης. Εάν η τιμή της απορρόφησης του αγνώστου αντιστοιχεί εκτός της δυναμικής περιοχής
συγκεντρώσεων της καμπύλης αναφοράς, ή εκτός της περιοχής γραμμικής συσχέτισης σε βαθμονόμηση με
χρήση ενός προτύπου, γίνεται αραίωση του αρχικού δείγματος. Εφαρμόζεται εκ νέου το πρωτόκολλο της
μεθόδου στο αραιωμένο δείγμα. Υπολογίζεται η συγκέντρωση του αρχικού, μη αραιωμένου, δείγματος,
λαμβάνοντας υπόψη τον συντελεστή αραίωσης.
2.4.1.5 Πρωτόκολλο ανάλυσης Φωτομετρικού προσδιορισμού Τελικού Σημείου
Το πρωτόκολλο ανάλυσης (analytical protocol) αποτελεί μία λεπτομερή περιγραφή της πορείας ενός
συγκεκριμένου προσδιορισμού που είναι πλήρως προδιαγεγραμμένη και εγκεκριμένη. Η περιγραφή αυτή
περιλαμβάνει μία σειρά πληροφοριών που αναφέρονται παρακάτω.
Ας θεωρήσουμε ότι ο προσδιορισμός του μορίου κλινικού ενδιαφέροντος Α βασίζεται στο
παρακάτω ενζυματικά καταλυόμενο σύστημα μετατροπών:
𝐸1 , 𝑀𝑔+2
Α+Β→ Γ (Αντίδραση 2.8)
𝛦2
Γ + Ζ → Έγχρωμο προϊόν (Αντίδραση 2.9)
Όπου η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του Α.
Αυτό το γενικό σχήμα ακολουθεί π.χ. το σύστημα των συζευγμένων αντιδράσεων, που
εκμεταλλευόμαστε στον ποσοτικό προσδιορισμό γλυκόζης (Αντιδράσεις 2.3, 2.4).
𝐺𝑂𝐷
Γλυκόζη + Η2Ο + O2 → Γλυκονικό οξύ + 2Η2Ο2 (Αντίδραση 2.3)
𝑃𝑂𝐷
Η2Ο2 + φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη → έγχρωμο προϊόν + 4Η2Ο (Αντίδραση 2.4)
Στη Φωτογραφία 2.1 παρουσιάστηκε το πρωτόκολλο του προσδιορισμού της γλυκόζης κατά το
σύστημα των συζευγμένων Aντιδράσεων 2.3 και 2.4, με χρήση kit, που περιέχει όλα τα απαραίτητα
αντιδραστήρια και πρότυπα. Από το πρωτόκολλο και την παραπάνω συζευγμένη αντίδραση γίνεται φανερό
ότι προκειμένου να παραχθεί το έγχρωμο προϊόν, απαιτείται η επώαση του κλινικού δείγματος που
εμπεριέχει τον αναλύτη ενδιαφέροντος (ενζυμικό υπόστρωμα (Α ή γλυκόζη) σε περιβάλλον (διάλυμα) που
περιέχει:
 Ένζυμα (Ε1, Ε2 στο γενικό παράδειγμα, ή GOD και POD στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο): Μπορεί να
είναι φυτικής, ζωικής ή βακτηριακής προέλευσης, φυσικά ή γενετικά τροποποιημένα.
 Συμπαράγοντες, ενεργοποιητές, ιόντα: Δεν καταναλώνονται κατά την αντίδραση, όμως την επιταχύνουν
πολύ σημαντικά, π.χ. ιόντα Mg++ χρησιμοποιούνται στο συγκεκριμένο γενικό παράδειγμα.
 Άλλα αντιδρώντα: Το B στο γενικό παράδειγμά μας (ή τα Η2Ο + O2 στο πρωτόκολλο). Αυτό σημαίνει ότι
η αντίδραση οξείδωσης της γλυκόζης προς γλυκονικό οξύ πρέπει να γίνει υπό αερόβιες συνθήκες και σε
υδατικό περιβάλλον. Το αερόβιο και υδατικό περιβάλλον είναι προφανώς εξασφαλισμένα σε κάθε κλινικό
προσδιορισμό, οπότε για τον προσδιορισμό της γλυκόζης με GOD/POD δεν χρειάζεται κάποιο άλλο αντι-
δρών.
 Χρωμογόνο: Η ουσία η οποία κατά την αντίδραση θα μετατραπεί σε έγχρωμο προϊόν. Το Ζ στο γενικό
παράδειγμα μας (ή το ζεύγος φαινολικό παράγωγο + 4-αμινοφαιναζόνη στο πρωτόκολλο).
52
 Ρυθμιστικό διάλυμα: με σκοπό τη διατήρηση σταθερού pH και ιοντικής ισχύος, ώστε η ενζυματική με-
τατροπή(ες) να εκτυλίσσεται υπό τις βέλτιστες συνθήκες. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ρυθμιστικό διά-
λυμα 0,2 Μ pH 8,0 χρησιμοποιείται.
Tα χρωμογόνο, ένζυμο, ρυθμιστικό διάλυμα, συμπαράγοντες και άλλα τυχόν απαιτούμενα

αντιδρώντα αποτελούν τα συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας (Working Reagent ή WR). Πολύ συχνά
τα ασταθή επιμέρους συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας εμπεριέχονται σε ξεχωριστά φιαλίδια και
αναμιγνύονται αμέσως πριν την εκτέλεση της αντίδρασης. Αυτό γίνεται προκειμένου να αποφευχθεί η
αλλοίωση ή η κατανάλωση αυτών (π.χ. μέσω της οξείδωσής τους ή γενικότερα της αντίδρασής τους, ή της
καταβύθισής τους, μετουσίωσής τους κ.λπ.). Μία τέτοια αλλοίωση θα είχε ως αποτέλεσμα είτε τη μη
εκλεκτική ανάπτυξη χρώματος στο τυφλό (δηλαδή την ανάπτυξη χρώματος απουσία του αναλύτη), είτε την
αδυναμία ανάπτυξης χρώματος σύμφωνα με τις προκαθορισμένες συνθήκες, παρουσία του αναλύτη.
Το πρωτόκολλο μίας κλινικής ανάλυσης τελικού σημείου καθορίζει τα παρακάτω:
1. Την επακριβή σύσταση του διαλύματος εργασίας.

2. Τη τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του δείγματος, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο
προσδιορίζεται ο αναλύτης.
3. Τη τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία στο αντιδραστήριο εργασίας πριν τη χρήση του (π.χ. ανασύσταση,
αραίωση, επαναιώρηση, ανάμιξη κ.λπ.). Στο πρωτόκολλο προσδιορισμού του σακχάρου τα ένζυμα (GOD
και POD) φυλάσσονται πριν την αντίδραση μαζί λυοφιλοποιημένα σε ξεχωριστό φιαλίδιο. Απαιτείται η
ανασύσταση των ενζύμων με ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει όλα τα υπόλοιπα συστατικά του
αντιδραστηρίου εργασίας.
4. Τη θερμοκρασία επώασης για το κάθε στάδιο. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 37οC.
5. Το χρόνο επώασης, δηλαδή σε πόσο χρόνο μετά την έναρξη της αντίδρασης θα πρέπει να γίνει η
καταγραφή της απορρόφησης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 10 ή 15 min, ανάλογα με το kit.
6. Το μήκος κύματος καταγραφής της απορρόφησης. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο είναι 510 nm.
7. Τη συγκέντρωση των (του) προτύπων (προτύπου). Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται ένα
εξωτερικό πρότυπο με συγκέντρωση 100 mg γλυκόζης/dL.
8. Τις τιμές αναφοράς για τον συγκεκριμένο κλινικό αναλύτη ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο
προσδιορίζεται. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο είναι 70 - 120 mg γλυκόζης/dL ορού. Διαφορετικά, οι
τιμές αναφοράς εκφράζονται ως 3,89 - 6,67 mmol γλυκόζης/L ορού.
9. Τις μαθηματικές σχέσεις υπολογισμού της άγνωστης συγκέντρωσης του αναλύτη.
10. Άλλους παράγοντες που αφορούν την εκτέλεση της αντίδρασης ανάπτυξης του έγχρωμου προϊόντος π.χ
τη σειρά ανάμιξης των επιμέρους αντιδραστηρίων και τους χρησιμοποιούμενους όγκους αντιδραστηρίων
και δείγματος για το πρότυπο, δείγμα και τυφλό. Αυτοί φαίνονται αναλυτικά στον πίνακα του
πρωτοκόλλου.
11.Πιο ειδικές πληροφορίες π.χ. τυχόν παρεμποδίσεις και τρόπους αναίρεσης αυτών, σχετικές
βιβλιογραφικές μελέτες κ.α.
12.Τους χρόνους ζωής των επιμέρους αντιδραστηρίων και τη σταθερότητα του παραγόμενου έγχρωμου
προϊόντος. Στο πρωτόκολλο αναφέρεται ότι το διάλυμα εργασίας είναι σταθερό για 45 ημέρες στους 2 -
10οC. Επίσης αναφέρεται εκεί, ότι το παραγόμενο έγχρωμο προϊόν είναι σταθερό επί 2 ώρες.
13.Τη σταθερότητα του προσδιοριζόμενου αναλύτη, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο
προσδιορίζεται ο αναλύτης. Αναφέρεται στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ότι η γλυκόζη είναι σταθερή
στον ορό επί 7 ημέρες, στους 2 - 10οC.
14.Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της μεθόδου, όπως το εύρος γραμμικότητας μεταξύ απορρόφησης και
συγκέντρωσης αναλύτη, το όριο ανίχνευσης, την επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα.
2.5 Πειραματικό Μέρος

2.5.1 Προσδιορισμός γλυκόζης με μέθοδο Τελικού Σημείου
Ως πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με μέθοδο τελικού σημείου θα περιγραφεί ο

προσδιορισμός της γλυκόζης, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1. Αναλυτική παρουσίαση
53
του πρωτοκόλλου και της μεθοδολογίας προσδιορισμού και υπολογισμού της συγκέντρωσης της γλυκόζης
στο άγνωστο έγινε στις προηγούμενες παραγράφους.
Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 3,5 mL αντιδραστηρίου εργασίας. Ο σωλήνας
πωματίζεται και προθερμαίνεται σε υδρόλουτρο στους 37οC. Εάν δεν υπάρχει η δυνατότητα προθέρμανσης
στους 37οC, επισημαίνεται ότι το αντιδραστήριο εργασίας θα πρέπει να έχει έρθει τουλάχιστον σε
θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της επώασης με το τυφλό, άγνωστο και πρότυπο.
Μετά την προθέρμανση, σε έναν νέο δοκιμαστικό σωλήνα προστίθεται ο ορός (10 μL). Σε δεύτερο
σωλήνα προστίθεται 10 μL προτύπου, ενώ σε τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα 10 μL απιονισμένου νερού. Και
στους τρεις σωλήνες προστίθεται αμέσως μετά 1 mL από το προθερμασμένο αντιδραστήριο εργασίας. Οι
σωλήνες πωματίζονται και ακολουθεί ανάμιξη. Οι τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες επωάζονται σε υδρόλουτρο
στους 37οC. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει
και η καταγραφή του χρόνου. Σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή του kit, η καταγραφή της
απορρόφησης πρέπει να γίνει σε 10 min ή 15 min μετά την έναρξη της αντίδρασης. Στον κατάλληλο χρόνο οι
σωλήνες αποσύρονται από το υδρόλουτρο, επαναφέρονται σε θερμοκρασία δωματίου και φωτομετρείται το
περιεχόμενο τους στα 510 nm. Απιονισμένο νερό χρησιμοποιείται για το μηδενισμό του φωτόμετρου. Οι
τιμές της απορρόφησης που μετρήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα 2.1. Είναι σημαντικό η μέτρηση της
απορρόφησης για το τυφλό, πρότυπο και δείγμα να γίνει στο ίδιο μήκος κύματος και χρησιμοποιώντας
κυψελίδα με ίδιο μήκος διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος.
Δείγμα Α (510 nm)
Τυφλό 0,020
Πρότυπο 0,556
Άγνωστο 0,612
Πίνακας 2.1 Μετρήσεις απορρόφησης που λαμβάνονται στο τελικό σημείο κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό γλυκόζης
με μέθοδο GOD/POD, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 2.1.
Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του αγνώστου γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση
2.1. Aντικαθιστώντας τις τιμές του Πίνακα 2.1 έχουμε:
0,612−0,020
[Άγνωστο]= x 100 mg/ dL = 110 mg/dL
0,556 −0,020
Καθώς οι τιμές αναφοράς της γλυκόζης στον ορό σύμφωνα με το πρωτόκολλο είναι 70 - 120
mg/dL, συμπεραίνουμε πως το δείγμα μας είναι φυσιολογικό (διεθνώς οι τιμές αναφοράς έχουν αναθεωρηθεί
σε 70 - 105 mg/dL).
54
Μέθοδος φωτομετρίας τελικού σημείου. Επιδεικνύεται ο προσδιορισμός της γλυκόζης με τη μέθοδο

οξειδάσης της γλυκόζης, https://youtu.be/V2lkVFUBsX8
Σχετικό οπτικό υλικό στο διαδίκτυο

 Λειτουργία ημιαυτόματου φωτόμετρου: https://www.youtube.com/watch?v=gKRKqLAzzM0 (τελευταία
προσπέλαση: 1/7/2015).
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση το διαδίκτυο

 Φωτογραφία 2.1 www.biosis.com.gr (τελευταία προσπέλαση: 1/1/2015).
Αναφορές
1. BAIS, R. & PHILCOX, M. (1994) Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of
catalytic concentration of enzymes. Part 8. IFCC method for lactate dehydrogenase. Eur J Clin Chem
Clin Biochem, 32, p. 639-55.
2. BURTIS, A. & ASHWOOD, E.R. (2015) Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. Εds. 7th Edition,
Philadelphia: WB Saunders.
3. CHANG, R. (2005) Physical Chemistry for the Biosciences. California: University Science Books.
4. HARR, R. (2012) Medical Laboratory Science Review. 4th Edition, Philadelphia: F. A. Davis Company.
5. MATHIEU, M., ARTUR, Y., AUDRY, A., BAILLY, M., BRAUN, J.P., BRETAUDIERE, J.P., et al..
(1982) Recommendations for determining the catalytic concentration of lactate dehydrogenase in human
serum at +30°C. Ann Biol Clin, 40, p. 87-164.
6. MCPHERSON, A. & PINCUS, R. (2011) Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods. Philadelphia: Elsevier-Saunders.
55
7. O’LEARY, N., PEMBROKE A., DUGGAN, F. (1992) A simplified procedure for eliminating the nega-
tive interference of bilirubin in the Jaffe reaction for creatinine. Clin Chem, 38, p. 1749–51.
8. PALMER, T. & BONNER, P. (2007) Enzymes: Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry.
Cambridge: Woodhead Publishing Ltd.
9. PILLAY, S. (2014) Practical Clinical Chemistry: Core Concepts. A training Manual. iTunes book.
10. STANDARDIZATION COMMITTEE OF THE GERMAN SOCIETY FOR CLINICAL CHEMISTRY,
ENZYME WORKING GROUP OF THE GERMAN SOCIETY FOR CLINICAL CHEMISTRY. (1993)
Recommendation for the determination of the catalytic concentration of lactate dehydrogenase at 37 de-
grees C. Eur J Clin Chem Clin Biochem, 31, p. 897-9.
11. THOMAS, L. Haemolysis as influence and interference factor, eJIFCC 13(4) Διαθέσιμο στο:
www.ifcc.org/ejifcc/vol13no4/130401002.htm (τελευταία προσπέλαση: 1/1/2015).
12. VAISHYA, R., ARORA, S., SINGH, B., MALLIKA, V., (2010) Modification of Jaffe’s kinetic method
decreases bilirubin interference: A preliminary report. Ind J Clin Biochem, 25, p. 64-6.
56
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3o
KINHTIKOI ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗ ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ:
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΩΝ -
ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΣΗ ΚΑΙ ΤΕΧΝΙΚΗ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό γίνεται μία εισαγωγή στις βασικές έννοιες της χημικής και ενζυμικής κινητικής,
προκειμένου να γίνει κατανοητή η μεθοδολογία που εφαρμόζεται στους κινητικούς φωτομετρικούς
προσδιορισμούς κλινικών αναλυτών. Η μεθοδολογία αυτή παρουσιάζεται στη συνέχεια λεπτομερώς, σε ό, τι
αφορά στα πεδία εφαρμογής της, τα πειραματικά στάδια της, τον τρόπο βαθμονόμησης, την ανάγκη
ανάλυσης τυφλού δείγματος, τα χαρακτηριστικά του πρωτοκόλλου της και τους εμπλεκόμενους
υπολογισμούς. Υπογραμμίζονται οι διαφορές της κινητικής μεθόδου σε σχέση με τη μέθοδο του τελικού
σημείου και καταγράφονται τα πλεονεκτήματα της πρώτης.
Απαιτείται η μελέτη του Κεφαλαίου 1, ειδικά σε ό, τι αφορά στις αρχές φωτομετρίας και βαθμονόμησης και
τις έννοιες δείγματος, τυφλού και προτύπου. Απαιτείται επίσης, η μελέτη των κριτηρίων επιλογής μιας
αναλυτικής μεθοδολογίας και των φωτομετρικών αναλυτικών μεθόδων στην κλινική ανάλυση, καθώς και
των αρχών κλινικών φωτομετρικών προσδιορισμών τελικού σημείου, που αναπτύχθηκαν στο Κεφάλαιο 2.
Τέλος, οι βασικές γνώσεις χημικής κινητικής, ενζυμολογίας και ενζυμικής κατάλυσης θεωρούνται
απαραίτητες για την κατανόηση του Κεφαλαίου 3.
Τα κριτήρια με τα οποία μια αναλυτική μεθοδολογία αξιολογείται και επιλέγεται στον ποσοτικό
προσδιορισμό κάποιου αναλύτη παρουσιάστηκαν ήδη στα Κεφάλαια 1 και 2.
Αναφέρθηκε επίσης, ότι καθώς οι φωτομετρικές μέθοδοι προσδιορισμού είναι οι πλέον εύχρηστες,
γρήγορες, και απαιτούν κοινό εργαστηριακό εξοπλισμό, βρίσκουν ευρύτατη εφαρμογή στην κλινική
βιοχημική ανάλυση. Πολύ συχνά ο ποσοτικός προσδιορισμός κάποιου κλινικού αναλύτη (συστατικού)
επιτυγχάνεται με φωτομέτρηση έγχρωμης ένωσης που παράγεται, σε ένα ή περισσότερα στάδια, όταν ο
αναλύτης αντιδράσει με κατάλληλο χρωμογόνο. Οι συνθήκες της αντίδρασης θα πρέπει να είναι τέτοιες,
ώστε η απορρόφηση της παραγόμενης έγχρωμης ένωσης να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη
στο κλινικό δείγμα.
Επίσης, πολύ συχνή στην κλινική βιοχημεία είναι και η χρήση ποσοτικών μεθοδολογιών
βασιζόμενων στη μεταβολή της οξειδωτικής κατάστασης του συνενζύμου NAD(P)H. Στις μεθοδολογίες
αυτές παρακολουθείται η μεταβολή της απορρόφησης στα 340 nm, όπου απορροφά η ανηγμένη μόνο μορφή
του συνενζύμου, δηλαδή η NAD(P)H.
Αναφέρθηκε επίσης, στο Κεφάλαιο 2 ότι για τον ποσοτικό φωτομετρικό προσδιορισμό ενός
κλινικού βιοχημικού αναλύτη, είναι δυνατόν να εφαρμοστούν δύο εναλλακτικές μεθοδολογίες, η μέθοδος
του τελικού σημείου και η κινητική μέθοδος. Η κινητική μέθοδος ανάλυσης θα παρουσιαστεί αναλυτικά
στη συνέχεια.
Στην κινητική μέθοδο (kinetic method) λαμβάνονται σειρά μετρήσεων και υπολογίζεται ο ρυθμός
εξέλιξης μίας αντίδρασης που είναι ανάλογος της συγκέντρωσης ενός αναλύτη. Αντίθετα, στη μέθοδο
τελικού σημείου λαμβάνεται μόνο μία μέτρηση, όταν πλέον δεν παράγεται περισσότερο προϊόν. Η
συγκέντρωση του παραγόμενου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλύτη. Πέραν αυτής της
βασικής διαφοράς τους, οι δύο κατηγορίες κλινικών προσδιορισμών διαφέρουν επίσης, ως προς τη
βαθμονόμηση, όπως και τον τρόπο με τον οποίο τα αποτελέσματα επεξεργάζονται για τον προσδιορισμό της
συγκέντρωσης του αναλύτη (Pardue, 1977).
57
Πριν την αναλυτική παρουσίαση της κινητικής μεθόδου θα πρέπει να περιγραφούν κάποιες
απαραίτητες εισαγωγικές έννοιες.
3.2 Βασικές αρχές Χημικής και Ενζυμικής Κινητικής

3.2.1 Χημική Κινητική
Η ταχύτητα μίας χημικής αντίδρασης (reaction velocity, v) ορίζεται ως η μεταβολή της συγκέντρωσης
ενός εκ των συστατικών της αντίδρασης, στη μονάδα του χρόνου. Η ταχύτητα μιας αντίδρασης ισούται
δηλαδή με τον ρυθμό μεταβολής της συγκέντρωσης των αντιδρώντων ή των προϊόντων αυτής. Για μια
αντίδραση της γενικής μορφής:
aΑ + bΒ ——› cΓ (Αντίδραση 3.1)
όπου Α και Β είναι τα αντιδρώντα της αντίδρασης και Γ είναι το προϊόν αυτής, η ταχύτητα της αντίδρασης
μπορεί να εκφραστεί ως:
1 𝛥[𝛢] 1 Δ[Β] 1 Δ[Γ]
v= − 𝑎 = −b =c (Εξίσωση 3.1)
𝛥𝑡 Δt Δt
Το αρνητικό πρόσημο εμφανίζεται λόγω της μείωσης της συγκέντρωσης των αντιδρώντων
συναρτήσει του χρόνου, και χρησιμοποιείται, ώστε η ταχύτητα να λάβει θετικές τιµές. H ταχύτητα της ίδιας
αντίδρασης έχει αποδειχτεί ότι ισούται με:
v= k [A]a [B] b (Εξίσωση 3.2)
όπου k είναι σταθερά, η οποία εξαρτάται από όλους τους άλλους παράγοντες που επηρεάζουν την ταχύτητα
(pH, θερμοκρασία, ενεργοποιητές κ.α.), εκτός από τις συγκεντρώσεις. Ονομάζεται σταθερά της ταχύτητας
της αντίδρασης ή ειδική ταχύτητα της αντίδρασης (rate constant). Η Εξίσωση 3.2 αποτελεί έκφραση του
νόμου της ταχύτητας μιας αντίδρασης (rate law).
Οι συντελεστής a ονομάζεται τάξη της αντίδρασης (reaction order) ως προς Α, ενώ ο b τάξη της
αντίδρασης ως προς Β. Το άθροισμα των εκθετών των συγκεντρώσεων των αντιδρώντων του νόμου της
ταχύτητας, n = a + b, ονομάζεται συνολική τάξη της αντίδρασης. Η τάξη μίας αντίδρασης ως προς το κάθε
αντιδρών προσδιορίζεται πειραματικά και δεν ταυτίζεται πάντοτε με τον στοιχειομετρικό συντελεστή του
κάθε αντιδρώντος στην Αντίδραση 3.1.
Ως παράδειγμα, η αντίδραση:
2NO + O2 ——› 2NO2 (Αντίδραση 3.2)
με πειραματικά προσδιοριζόμενη ταχύτητα αντίδρασης v = k [ΝΟ]2 [Ο2] είναι 2ης τάξης (second order) ως
προς ΝΟ και 1ης (first order) ως προς Ο2. Ετσι η συνολική τάξη της αντίδρασης είναι n = 2 + 1 = 3.
Η ταχύτητα μίας αντίδρασης δεν είναι σταθερή, αλλά μεταβάλλεται κατά τη διάρκεια της
αντίδρασης. Έτσι, έχει νόημα να μιλάμε για τη στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης (instantaneous rate of
reaction). Στην αρχή της αντίδρασης η ταχύτητα είναι η µέγιστη και σταθερή, αλλά ελαττώνεται µε την
πάροδο του χρόνου, μέχρι να μηδενιστεί στο τέλος της αντίδρασης. H φάση της αντίδρασης, όπου υπάρχει
γραμμική σχέση μεταξύ συγκέντρωσης προϊόντος και χρόνου ονομάζεται γραμμική περιοχή (linear range) ή
φάση σταθεροποιημένης κατάστασης (steady-state phase) και σημειώνεται με σκίαση στο Σχήμα 3.1. Η
προοδευτική μείωση της ταχύτητας οφείλεται στη μείωση της συγκέντρωσης των αντιδρώντων, αλλά και
στην αύξηση της συγκέντρωσης των προϊόντων, με τυχόν συνεπαγόμενες παρεμποδίσεις της αντίδρασης από
τα προϊόντα. Η στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης μπορεί να υπολογιστεί από τη γραφική παράσταση της
μεταβολής της συγκέντρωσης των αντιδρώντων ή των προϊόντων (καμπύλη αντίδρασης) με το χρόνο. Η
στιγμιαία ταχύτητα μίας αντίδρασης σε κάθε χρονική στιγμή είναι ίση με την κλίση της εφαπτόμενης (ΔC/Δt)
στην καμπύλη της αντίδρασης στο συγκεκριμένο χρόνο (Σχήμα 3.1). H κλίση αυτή στη γραμμική περιοχή
καλείται αρχική ταχύτητα αντίδρασης,v0 (initial reaction rate) (Chang, 2005·Arneson & Brickell, 2007·
Palmer & Bonner, 2007· Κλώνης, 2008· Rogers & Gibon, 2009· Καρίκας, 2012).
58
Σχήμα 3.1 Διάγραμμα μεταβολής της συγκέντρωσης του αντιδρώντος Α (κόκκινη καμπύλη) και του προϊόντος Γ (μπλε
καμπύλη) της Αντίδρασης 3.1 σε συνάρτηση με τον χρόνο από την έναρξη της αντίδρασης. Σημειώνεται με σκίαση το
γραμμικό τμήμα της κάθε καμπύλης. Η κλίση της εφαπτομένης ΔC/Δt σε οποιοδήποτε σημείο της κάθε καμπύλης ισούται με
την ταχύτητα της αντίδρασης στο σημείο αυτό.
3.2.2 Ενζυμική Κινητική

Μία ουσία, η παρουσία της οποίας προκαλεί αύξηση της ταχύτητας μιας χημικής αντίδρασης ονομάζεται
καταλύτης (catalyst). Τα ένζυμα (enzymes) είναι βιολογικοί καταλύτες που προάγουν/επιταχύνουν
αντιδράσεις κάτω από τις ήπιες συνθήκες που επικρατούν στους περισσότερους ζωντανούς οργανισμούς.
Αυτό επιτυγχάνεται με τη δέσμευση του υποστρώματος στο ενεργό κέντρο (active site) του ενζύμου με
συνέπεια τη μείωση της απαιτούμενης ενέργειας ενεργοποίησης (activation energy, ΔG‡). Αναφέρθηκε ότι η
μέτρηση της ταχύτητας μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης, είναι πολύ σημαντική στον προσδιορισμό
της δραστικότητας ενός ενζύμου.
Το πιο κοινό μοντέλο που περιγράφει την κινητική των ενζυμικά καταλυόμενων αντιδράσεων είναι
αυτό των Michaelis – Menten. Ας θεωρήσουμε μια τέτοια αντίδραση, όπου το ενζυμικό υπόστρωμα S
(substrate) μετατρέπεται από το ένζυμο Ε (enzyme) στο προϊόν P (product), μέσω σχηματισμού του
ενδιάμεσου συμπλόκου ενζύμου‐υποστρώματος ES (enzyme-substrate complex). Στο τέλος της αντίδρασης
το ένζυμο, E, ως καταλύτης, ανακτάται. k1, k-1 και k2 είναι οι σταθερές ταχύτητας των επιμέρους
αντιδράσεων.
𝑘1 𝑘2
E+ S 𝑘−1
ES → P + E (Aντίδραση 3.3)
Η εξέλιξη της ενζυμικής αντίδρασης ακολουθεί τη γραφική παράσταση του Σχήματος 3.1. Η κλίση
της εφαπτομένης σε οποιοδήποτε σημείο της καμπύλης ισούται με την ταχύτητα της αντίδρασης στο σημείο
αυτό.
Με βάση την παραπάνω αντίδραση, διαμορφώθηκε η εξίσωση των Leonor Michaelis- Maud
Μenten (1913) (Εξίσωση 3.3), σύμφωνα με την οποία, η ταχύτητα της ενζυμικής αντίδρασης της μορφής 3.3
υπακούει στη σχέση:
𝜈𝑚𝑎𝑥[𝑆]
ν= 𝐾𝑀+[𝑆]
όπου KM η σταθερά Michaelis και νmax είναι η μέγιστη ταχύτητα (maximum velocity) της αντίδρασης. Η
σταθερά Michaelis συνδέεται με τις σταθερές ισορροπίας των επιμέρους αντιδράσεων (Αντίδραση 3.3), με τη
σχέση: KΜ = ( k-1 + k2) / k1
Αποδεικνύεται από την Εξίσωση 3.3 ότι η σταθερά KM ταυτίζεται με εκείνη τη συγκέντρωση του
υποστρώματος [S], για την οποία η αντίδραση πραγματοποιείται με ταχύτητα ίση με το μισό της νmax. Η
φυσική σημασία της σταθεράς ΚΜ είναι ότι αποτελεί μέτρο της συγγένειας ενζύμου-υποστρώματος. Είναι
59
ανεξάρτητη της συγκέντρωσης του ενζύμου. Μεγάλη συγγένεια του ενζύμου προς το υπόστρωμα, αντιστοιχεί σε
χαμηλή τιμή Km και αντίστροφα.
Επίσης, αποδεικνύεται ότι η μέγιστη ταχύτητα είναι γραμμικώς ανάλογη της συνολικής
συγκέντρωσης του ελεύθερου (μη δεσμευμένου) ενζύμου [Ε0], δηλαδή:
νmax = kcat [E0] (Εξίσωση 3.4)
Όπου kcat είναι η σταθερά κατάλυσης, γνωστή ως αριθμός μετατροπής ή ανακύκλισης (turnover number).
Η σταθερά kcat δηλώνει τον μέγιστο αριθμό των μορίων του υποστρώματος, την μετατροπή των
οποίων κάθε ενεργό κέντρο ενζύμου μπορεί να καταλύσει στη μονάδα του χρόνου. Ο μέγιστος αυτός αριθμός
μετατροπών σε προϊόν συμβαίνει όταν το υπόστρωμα βρίσκεται σε μεγάλη περίσσεια και όλα τα ενεργά
κέντρα του ενζύμου είναι κορεσμένα σε υπόστρωμα. H σταθερά kcat, συνεπώς, αποτελεί μέτρο της
ταχύτητας και αποτελεσματικότητας ενός ενζύμου (Chang, 2005· Arneson & Brickell, 2007· Palmer &
Bonner, 2007· Κλώνης, 2008, Rogers & Gibon, 2009· Καρίκας, 2012).
Στο Σχήμα 3.2 απεικονίζεται η μεταβολή της αρχικής ταχύτητας μιας ενζυμικά καταλυόμενης
αντίδρασης με την αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, S0. Είναι φανερό ότι όσο μικρότερη είναι η
αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος, τόσο μικρότερη είναι η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης. Η αρχική
ταχύτητα μιας ενζυμικής αντίδρασης φτάνει μία μέγιστη τιμή νmax, μόνο σε μεγάλες τιμές αρχικής
συγκέντρωσης υποστρώματος [S0]. Στο γραμμικό τμήμα της καμπύλης (σκιασμένο τμήμα του Σχήματος 3.2)
η αρχική ταχύτητα είναι ευθέως ανάλογη προς την [S0], οπότε η κινητική είναι πρώτης τάξεως. Όταν η
ταχύτητα της αντίδρασης προσεγγίζει τη vmax, η κινητική είναι μηδενικής τάξεως. Επομένως, πέραν μιας
ορισμένης περίσσειας υποστρώματος η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης είναι
μέγιστη και ανεξάρτητη της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος, S0.
Σχήμα 3.2 Διάγραμμα μεταβολής της αρχικής ταχύτητας μιας ενζυματικά καταλυόμενης μετατροπής σε συνάρτηση με την
αρχική συγκέντρωση του υποστρώματος [S0]. Σημειώνονται η vmax και KM. Με κυανή σκίαση σημειώνεται το γραμμικό
τμήμα της καμπύλης (κινητική πρώτης τάξεως), ενώ με πράσινη σκίαση το πλάτωμα (κινητική μηδενικής τάξεως).
Από τα παραπάνω προκύπτει ότι υπό μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, ο ρυθμός
σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος (αρχική ταχύτητα) είναι ανεξάρτητος της
συγκέντρωσης του υποστρώματος και ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου. Με άλλα λόγια, υπό
μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, η αρχική ταχύτητα μιας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης,
αποτελεί μέτρο της δραστικότητας του ενζύμου.
Στην πράξη λοιπόν, σε μία κινητική φωτομετρική μέθοδο κλινικής ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη αρχική
περίσσεια υποστρώματος, ώστε ο ρυθμός σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος να
είναι αρχικά ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου (Chang, 2005· Arneson & Brickell, 2007·
Palmer & Bonner, 2007· Κλώνης, 2008· Rogers & Gibon, 2009· Καρίκας, 2012).
Σύνοψη: Η ταχύτητα μίας ενζυμικά καταλυόμενης αντίδρασης ακολουθεί το μοντέλο των Michaelis-Menten: ν
= (νmax[S] )/(KM+[S]). Η σταθερά ΚΜ αποτελεί μέτρο της συγγένειας ενζύμου-υποστρώματος. H σταθερά kcat
60
αποτελεί μέτρο της ταχύτητας και της αποτελεσματικότητας ενός ενζύμου. Στην πράξη, σε μια κινητική
φωτομετρική μέθοδο κλινικής ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη αρχική περίσσεια υποστρώματος, ώστε ο
ρυθμός σχηματισμού προϊόντος ή ο ρυθμός κατανάλωσης αντιδρώντος (ταχύτητα της αντίδρασης), να είναι
αρχικά ανάλογος μόνο της δραστικότητας του ενζύμου και ανεξάρτητος της συγκέντρωσης του υποστρώματος.
3.3 Κινητικές μέθοδοι Κλινικών Προσδιορισμών

3.3.1 Αρχές Κινητικής Μεθόδου
Η κινητική μέθοδος χρησιμοποιείται κυρίως για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ενζύμων κλινικού
ενδιαφέροντος. Όπως επεξηγήθηκε αμέσως παραπάνω, σε μια κινητική φωτομετρική μέθοδο κλινικής
ανάλυσης χρησιμοποιείται μεγάλη περίσσεια υποστρώματος, ώστε η ταχύτητα της αντίδρασης να είναι
αρχικά ανάλογη μόνο της δραστικότητας του ενζύμου. Αυτή η περιορισμένη σε διάρκεια περιοχή μιας
αντίδρασης, ονομάζεται γραμμική περιοχή ή φάσης σταθεροποιημένης κατάστασης (steady-state phase),
της αντίδρασης. Σε μία κινητική μέθοδο, η απορρόφηση μετράται σε διαδοχικά τακτά διαστήματα, στη
γραμμική περιοχή της αντίδρασης, και υπολογίζεται η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης v0 (initial reaction
rate). Προκειμένου ένα συζευγμένο σύστημα αντιδράσεων να είναι κατάλληλο για τον υπολογισμό της
συγκέντρωσης ενζύμου που καταλύει το πρώτο στάδιο των συζευγμένων αντιδράσεων, η δεύτερη αντίδραση
θα πρέπει να βαίνει ταχύτατα σε σχέση με την πρώτη, ώστε η ταχύτητα σχηματισμού του έγχρωμου
προϊόντος να είναι ουσιαστικά ίση, με την ταχύτητα του πρώτου σταδίου (Chang, 2005· Arneson & Brickell,
2007· Palmer & Bonner, 2007· Κλώνης, 2008· Rogers & Gibon, 2009· Καρίκας, 2012).
Εάν καταγράψουμε τη μεταβολή της απορρόφησης (ή άλλου μετρούμενου σήματος γενικότερα) με
τον χρόνο από την έναρξη της αντίδρασης μιας ενζυμικά καταλυόμενης μετατροπής, θα πάρουμε καμπύλες
σαν αυτές που φαίνονται στο Σχήμα 3.3. Η κάθε καμπύλη αντιστοιχεί σε διαφορετική συγκέντρωση ενζύμου,
παρουσία σταθερής ποσότητας υποστρώματος. Μάλιστα, το υπόστρωμα βρίσκεται αρχικά σε περίσσεια σε
σχέση με το ένζυμο, η οποία περίσσεια είναι σημαντική για τις χαμηλές συγκεντρώσεις ενζύμου. Όσο
μικρότερη η συγκέντρωση του ενζύμου, τόσο πιο αργά καταναλώνεται το υπόστρωμα και συνεπώς τόσο
αργότερα φτάνουμε στο μέγιστο της απορρόφησης. Ταυτόχρονα, τόσο ευρύτερη είναι η γραμμική περιοχή
της καμπύλης σήματος/χρόνου. Εντός αυτής της γραμμικής περιοχής (που στο Σχήμα 3.3 υποδεικνύεται με
κόκκινο χρωματισμό της καμπύλης) παίρνουμε τις μετρήσεις απορρόφησης σε μια κινητική μέθοδο. Σε μια
μέθοδο τελικού σημείου θα πάρουμε μία μέτρηση, όταν έχει καταναλωθεί όλο το υπόστρωμα και πλέον δεν
αυξάνεται η απορρόφηση με το χρόνο (δηλαδή στο πλάτωμα της κάθε καμπύλης).
Στο ένθετο του ίδιου σχήματος απεικονίζονται λεπτομερώς τα πολύ αρχικά στάδια της καμπύλης
εξέλιξης της αντίδρασης. Είναι φανερό ότι η γραμμική περιοχή δεν ξεκινάει αμέσως με την έναρξη της
αντίδρασης, αλλά μετά από πολύ σύντομο διάστημα κατόπιν αυτής. Στο διάστημα αυτό που ονομάζεται
φάση έναρξης (initiation phase), σχηματίζεται το σύμπλοκο ενζύμου-υποστρώματος σε μια ενζυμική
αντίδραση, σύμφωνα με την Αντίδραση 3.3. Η φάση έναρξης διαρκεί από μερικά δέκατα του δευτερολέπτου,
έως λίγα δευτερόλεπτα. Η καθυστέρηση αυτή στην έναρξη της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης
(steady-state phase), δηλαδή στην έναρξη της γραμμικής περιοχής της αντίδρασης είναι ο λόγος για τον
οποίο, όταν παρακολουθείται η εξέλιξη μίας ενζυμικής αντίδρασης με κινητική μέθοδο, η καταγραφή του
σήματος του οργάνου με τον χρόνο ξεκινάει συνηθέστερα 0,5 - 1,0 min μετά την έναρξη της αντίδρασης.
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η κλίση του γραμμικού τμήματος στο διάγραμμα απορρόφησης/χρόνου
είναι ανάλογη της αρχικής ταχύτητας, v0. Αυτό ισχύει διότι σύμφωνα με το νόμο των Lambert – Beer (βλ.
Ενότητα 2.2) η απορρόφηση είναι ανάλογη της συγκέντρωσης, ενώ σύμφωνα με το Σχήμα 3.1 η κλίση του
γραμμικού τμήματος στο διάγραμμα συγκέντρωσης/χρόνου ταυτίζεται με την αρχική ταχύτητα, v0.
Καθώς τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες, επηρεάζουν μόνο την κινητική περιοχή μιας αντίδρασης και
συνεπώς η δραστικότητα κάποιου ενζύμου μπορεί να προσδιοριστεί μόνο με κινητικές μεθόδους. Αντίθετα, η
συγκέντρωση του υποστρώματος επηρεάζει και την κινητική αλλά και την περιοχή, όπου παρατηρείται το
πλάτωμα της καμπύλης εξέλιξης της αντίδρασης. Γι’ αυτό το λόγο στους προσδιορισμούς μη ενζυμικών
κλινικών αναλυτών, η κινητική όπως και η μέθοδος τελικού σημείου, μπορεί να εφαρμοστεί.
61
Σχήμα 3.3 Διάγραμμα μεταβολής του μετρούμενου σήματος με τον χρόνο από την έναρξη μίας ενζυμικά καταλυόμενης
μετατροπής, για μια σειρά ενζυμικών συγκεντρώσεων. Με κόκκινο χρώμα σημειώνεται η γραμμική περιοχή της αντίδρασης
για κάθε ενζυμική συγκέντρωση. Στο ένθετο φαίνεται λεπτομέρεια του αρχικού τμήματος μιας τέτοιας καμπύλης εξέλιξης
της αντίδρασης. Με μπλε χρώμα δίνεται η καμπύλη εξέλιξης του δείγματος, ενώ με πράσινο χρώμα του τυφλού. Εκεί
διακρίνεται η φάση έναρξης (δίνεται με σκίαση).
Ένα διάγραμμα ταχύτητας αντίδρασης-συγκέντρωσης ενζύμου έχει τη μορφή του Σχήματος 3.4.
Εκεί φαίνεται ότι αρχικά η ταχύτητα είναι ανάλογη της ενζυμικής συγκέντρωσης. Για τέτοιες συγκεντρώσεις
ενζύμου, όπου το υπόστρωμα βρίσκεται σε σημαντική περίσσεια σε σχέση με το ένζυμο (περιοχή
σημειωμένη με κόκκινο) λαμβάνονται οι μετρήσεις απορρόφησης σε μια κινητική μέθοδο. Στη συνέχεια της
καμπύλης είναι εμφανές ότι δεν διατηρείται αυτή η αναλογία. Σε μεγάλες μάλιστα συγκεντρώσεις ενζύμου
(όταν δηλαδή το υπόστρωμα δε βρίσκεται σε περίσσεια), ο ρυθμός αυξάνεται πολύ λίγο με την αύξηση της
ενζυμικής συγκέντρωσης. Έτσι, σε τέτοιες συγκεντρώσεις, η μέτρηση της ταχύτητας μιας αντίδρασης δε
μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον ποσοτικό προσδιορισμό ενός ενζύμου. Η περιοχή της καμπύλης, που
σημειώνεται με κόκκινο, είναι η γραμμική περιοχή της μεθόδου μας, και εντός αυτής θα πρέπει να βρεθεί ο
υπολογιζόμενος ρυθμός της αντίδρασης σε ανάλυση βιολογικού δείγματος προκειμένου να αντιστοιχιστεί σε
ενζυμική συγκέντρωση – διαφορετικά θα πρέπει να γίνει αραίωση του αρχικού δείγματος.
Σχήμα 3.4 Διάγραμμα ταχύτητας αντίδρασης-συγκέντρωσης ενζύμου για μια ενζυμικά καταλυόμενη μετατροπή. Είναι
φανερό ότι αρχικά η ταχύτητα είναι ανάλογη της ενζυμικής συγκέντρωσης. Η περιοχή σημειωμένη με κόκκινο είναι η
γραμμική περιοχή της μεθόδου μας.
Σύνοψη: Η αρχική ταχύτητα αντίδρασης ταυτίζεται με το ρυθμό μεταβολής της συγκέντρωσης προϊόντος ή
αντιδρώντος στη γραμμική περιοχή (φάση σταθεροποιημένης κατάστασης) της αντίδρασης. Στις κινητικές
62
φωτομετρικές μεθόδους μετριέται ο ρυθμός μεταβολής της απορρόφησης στη γραμμική περιοχή της αντίδρασης.
Αυτός είναι ανάλογος του ρυθμού μεταβολής της συγκέντρωσης του έγχρωμου προϊόντος, δηλαδή της αρχικής
ταχύτητας της αντίδρασης και της ενζυμικής συγκέντρωσης.
3.3.2 Πλεονεκτήματα Κινητικών Μεθόδων
Το πιο σημαντικό πλεονέκτημα των κινητικών μεθόδων είναι η ταχύτητά τους. Οι κινητικές μέθοδοι μετρούν
τον αρχικό ρυθμό μιας αντίδρασης και ολοκληρώνονται συνήθως, όταν έχει πραγματοποιηθεί το 3 - 10%
μιας αντίδρασης. Μέσα σε αυτό το χρονικό διάστημα από την έναρξη της αντίδρασης, η επίδραση της
αντίστροφης πορείας της αντίδρασης ή τυχόν παρεμποδίσεις λόγω των προϊόντων της αντίδρασης δεν είναι
ακόμα σημαντικές. Έτσι, μέχρι αυτού του ορίου, η καμπύλη μεταβολής του μετρούμενου σήματος (π.χ.
απορρόφησης) σε συνάρτηση µε τον χρόνο είναι συνήθως ευθεία γραµµή. Βρισκόμαστε δηλαδή στο
γραμμικό τμήμα της καμπύλης των Σχημάτων 3.1 και 3.3. Στο διάστημα αυτό, με άλλα λόγια, ο ρυθμός
μεταβολής της απορρόφησης με το χρόνο είναι σταθερός, άρα η ταχύτητα της αντίδρασης είναι σταθερή.
Πρόκειται για την αρχική ταχύτητα της αντίδρασης, που είναι και η μέγιστη ταχύτητα αυτής.
Άλλο πλεονέκτημα των κινητικών μεθόδων είναι η μη ανάγκη χρήσης προτύπων και τυφλού (για
τις περισσότερες κινητικές μεθοδολογίες).
Οι κινητικές μέθοδοι είναι προτιμώμενες σε προσδιορισμούς σε δείγματα, όπου υπάρχει κάποια
ενδογενής ουσία που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό. H επίδραση μιας τέτοιας παρεμβολής είναι
αμελητέα, όταν η ουσία απορροφά μεν στην ίδια περιοχή με το έγχρωμο προϊόν, με απορρόφηση όμως που
μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης της αντίδρασης.
Επιπλέον, λόγω της πολύ σύντομης διάρκειας των μετρήσεων σε μια κινητική μέθοδο (π.χ. μπορεί να είναι
λίγων δευτερολέπτων) ακόμα και όταν μια παρεμβαλλόμενη ουσία αντιδρά κατά την αντίδραση προς
παραγωγή επιπλέον έγχρωμου προϊόντος, η επίδραση της παρεμβολής δύναται να είναι αμελητέα. Για
παράδειγμα, μια φωτομετρική κινητική μέθοδος που είναι εκλεκτική για κάποιον κλινικό βιοχημικό αναλύτη
μπορεί να εφαρμοστεί στον ποσοτικό προσδιορισμό του σε ολικό αίμα. Σε μια τέτοια περίπτωση, η μέτρηση
της αύξησης της απορρόφησης, παρουσία της έγχρωμης μήτρας, είναι δυνατή. Αντίθετα, μια μέθοδος
τελικού σημείου δεν μπορεί να είναι ακριβής στη συγκεκριμένη εφαρμογή. Αυτό, διότι δεν είναι δυνατόν να
γίνει πάντοτε με ακρίβεια ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του παραγόμενου έγχρωμου προϊόντος μέσω της
απορρόφησης αυτού σε μήκος κύματος που απορροφά και η μήτρα. Αυτό ισχύει ιδίως, όταν η συμμετοχή της
μήτρας στην απορρόφηση είναι σημαντική ή δεν είναι σταθερή από δείγμα σε δείγμα.
Τέλος, όπως αναφέρθηκε ήδη, καθώς τα ένζυμα δρουν ως καταλύτες επηρεάζουν μόνο την κινητική
περιοχή μιας αντίδρασης. Συνεπώς, η δραστικότητα κάποιου ενζύμου προσδιορίζεται κατά κανόνα με
κινητικές μεθόδους (Pardue, 1977· Skoog et al., 2014).
Σύνοψη: Οι κινητικές μέθοδοι είναι ταχύτερες και κυρίως προτιμώμενες σε προσδιορισμούς σε δείγματα, όπου
υπάρχει κάποια ενδογενής ουσία που παρεμβάλλεται στον προσδιορισμό. Για τον προσδιορισμό της
συγκέντρωσης ενζύμων με κλινικό ενδιαφέρον χρησιμοποιούνται κατά κανόνα κινητικές μέθοδοι. Οι κινητικές
μέθοδοι χρησιμοποιούνται επίσης σε προσδιορισμούς κλινικών αναλυτών μη ενζυμικής φύσης (όπως και οι
μέθοδοι τελικού σημείου).
3.3.3 Ενζυμική Δραστικότητα και Συγκέντρωση
Η ενζυμική συγκέντρωση δεν εκφράζεται με τις κλασικές εκφράσεις περιεκτικότητας και συγκέντρωσης.
Εκφράζεται κατά κανόνα ως ενζυμική ενεργότητα ή δραστικότητα (enzyme activity) ανά μονάδα όγκου
και μετριέται σε μονάδες ενζυμικής δραστικότητας (enzyme units, U) ανά μονάδα όγκου, δηλαδή σε U/L.
Μια μονάδα ενζυμικής δραστικότητας (U), αντιστοιχεί στην ποσότητα του ενζύμου που μετατρέπει ένα μmol
υποστρώματος ανά min, ή παράγει ένα μmol προϊόντος ανά min, κάτω από καθορισμένες πειραματικές
συνθήκες. Επίσης, μετριέται σε katal (kat). To 1 kat αντιστοιχεί στην ενζυμική ενεργότητα που μετατρέπει
ένα mole υποστρώματος ανά sec κάτω από συγκεκριμένες πειραματικές συνθήκες. Η αντιστοιχία είναι 1 kat
= 6 · 107 U. Οι κυριότερες πειραματικές συνθήκες που καθορίζονται, όταν προσδιορίζεται η ενζυμική
δραστικότητα είναι το pH, η θερμοκρασία και η συγκέντρωση του υποστρώματος. Η ενζυμική μονάδα
καλείται και διεθνής μονάδα (International Unit ή IU ή U). Επειδή η ενζυμική ενεργότητα εξαρτάται από τις
πειραματικές συνθήκες, οι τιμές αναφοράς της μεταβάλλονται με τις πειραματικές συνθήκες. Η ειδική
63
δραστικότητα (specific activity) ενός ενζύμου ισούται με το λόγο της ενζυμικής ενεργότητας προς τα
συνoλικά mg του ενζύμου στο παρασκεύασμα ή στο προς ανάλυση δείγμα. Μετράται σε U/mg.
Σύνοψη: Η ενζυμική συγκέντρωση δεν εκφράζεται με τις κλασικές εκφράσεις περιεκτικότητας και
συγκέντρωσης, αλλά ως ενζυμική δραστικότητα ανά μονάδα όγκου, με μονάδες U/L. Μια μονάδα ενζυμικής
δραστικότητας (U), αντιστοιχεί στην ποσότητα του ενζύμου που μετατρέπει ένα μmol υποστρώματος ανά min, ή
παράγει ένα μmol προϊόντος ανά min, υπό καθορισμένες πειραματικές συνθήκες.
3.3.4 Πειραματική διαδικασία Ποσοτικού Φωτομετρικού Κλινικού Προσδιορισμού με Κινη-

τική Μέθοδο
Η πειραματική διαδικασία φωτομετρικού κλινικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο περιλαμβάνει τα

παρακάτω γενικά στάδια:
1. Το φωτόμετρο μηδενίζεται με απιονισμένο νερό στο μήκος κύματος, όπου παρακολουθείται η αντίδραση
(δηλαδή σε μήκος κύματος όπου απορροφά κάποιο προϊόν ή αντιδρών της αντίδρασης).
2. Στις κινητικές μεθόδους, όπου λαμβάνονται περισσότερες μετρήσεις απορρόφησης, δεν απαιτείται χρήση
τυφλού. Επίσης, δεν απαιτείται χρήση προτύπων για βαθμονόμηση. Οι δύο αυτές ιδιαιτερότητες της κινη-
τικής μεθόδου επεξηγούνται παρακάτω.
3. Εφαρμόζεται για το άγνωστο η μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού, όπως ακριβώς περιγράφεται στο πρω-
τόκολλο. Στη θερμοστατούμενη κυψελίδα του φασματοφωτόμετρου προστίθενται το κλινικό δείγμα με το
προς προσδιορισμό ένζυμο ή αναλύτη, και αμέσως μετά, υπό ανάδευση, το αντιδραστήριο εργασίας. Το
τελευταίο έχει ήδη προθερμανθεί στη θερμοκρασία επώασης. Η προσθήκη του αντιδραστηρίου εργασίας
σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της α-
ντίδρασης παρακολουθείται μέσω καταγραφής της αύξησης (ή μείωσης) της οπτικής απορρόφησης, συ-
ναρτήσει του χρόνου. Η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει μετά την πάροδο της φάσης έναρξης.
Λαμβάνονται τιμές απορρόφησης σε διαδοχικούς χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης, εντός της
γραμμικής περιοχής αυτής. Υπολογίζονται στη συνέχεια οι διαφορές ΔΑ και Δt ανάμεσα σε δύο διαδοχι-
κές μετρήσεις και τέλος η μέση τιμή ΔΑ/Δt. Σπανιότερα υπολογίζεται η εξίσωση της ευθείας παλινδρό-
μησης με βάση τις μετρήσεις. Η μέση τιμή ΔΑ/Δt ή η κλίση της ευθείας παλινδρόμησης χρησιμοποιού-
νται για τον προσδιορισμό της ενζυμικής συγκέντρωσης, όπως αναλύεται παρακάτω.
Ενδείκνυται, κατά καιρούς μέτρηση του δείγματος σε χρόνο 0, (ή αλλιώς μέτρηση τυφλού), και
σύγκριση αυτής με τιμή που δίνεται από το πρωτόκολλο. Η τιμή της μέτρησης δε θα πρέπει να είναι
υψηλότερη της δεδομένης από το πρωτόκολλο τιμής. Στην αντίθετη περίπτωση, το αντιδραστήριο εργασίας
απορρίπτεται. Αυτό, διότι μία τέτοια υψηλή τιμή είναι ενδεικτική αλλοίωσης του αντιδραστηρίου εργασίας
π.χ. λόγω επιμόλυνσής του με τον προσδιοριζόμενο αναλύτη (Pardue, 1977).
3.3.5 Υπολογισμός Ενζυμικής Συγκέντρωσης
Όπως αναφέρθηκε στις κινητικές μεθόδους δεν είναι απαραίτητη η βαθμονόμηση με την κλασική έννοια
αυτής, δηλαδή με τη χρήση προτύπων που αναπτύσσονται παράλληλα με το δείγμα, για τον ποσοτικό
προσδιορισμό.
Η μη ανάγκη βαθμονόμησης με τη χρήση προτύπων οφείλεται στο ότι η ενζυμική συγκέντρωση

υπολογίζεται στην πλειοψηφία των πρωτοκόλλων μόνο με βάση τα πειραματικά δεδομένα του δείγματος. Ο
υπολογισμός αυτός βασίζεται στον πολλαπλασιασμό της υπολογιζόμενης μέσης τιμής του λόγου ΔΑ/Δt ή της
κλίσης της ευθείας παλινδρόμησης, επί έναν συντελεστή μετατροπής. Αυτό επεξηγείται παρακάτω:
Αντικαθιστώντας στην Εξίσωση 3.1 την έκφραση του νόμου των Lambert-Beer (βλ. Ενότητα 1.6)
προκύπτει για την ταχύτητα της αντίδρασης:
𝛥[𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈] 𝛥𝛢𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈𝜏𝜊𝜍
𝑣= 𝛥𝑡
= 𝜀 𝑑 𝛥𝑡
64
𝛥 (𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈𝜏𝜊𝜍) 𝛥𝛢𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈𝜏𝜊𝜍 𝛵𝑉
𝛥𝑡
= 𝛥𝑡 𝜀 𝑑
όπου:
TV o συνολικός όγκος της αντίδρασης,
ε ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης του έγχρωμου προϊόντος,
d το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην κυψελίδα, όπου παρακολουθείται
η μεταβολή της απορρόφησης με το χρόνο.
Επειδή όμως, η ενζυμική ενεργότητα ισοδυναμεί με την ποσότητα του ενζύμου που παράγει
συγκεκριμένη ποσότητα προϊόντος στη μονάδα του χρόνου, το πρώτο σκέλος της Εξίσωσης 3.5 θα
αντιστοιχεί στην ενζυμική ενεργότητα. Εάν στη συνέχεια διαιρέσουμε την ενζυμική ενεργότητα με τον όγκο
του δείγματος (Vδείγματος), λαμβάνουμε την ενζυμική συγκέντρωση. Η Εξίσωση 3.5 τότε γίνεται:
𝛥(𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈𝜏𝜊𝜍) 𝛥𝛢 𝛵𝑉
𝑉 𝛿𝜀ί𝛾𝜇𝛼𝜏𝜊𝜍 𝛥𝑡
= 𝛥𝑡 𝜀 𝑑 𝑉𝛿𝜀ί𝛾𝜇𝛼𝜏𝜊𝜍 (Εξίσωση 3.6)
και:
𝛥(𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝜋𝜌𝜊ϊό𝜈𝜏𝜊𝜍) 𝛥𝛢
𝑉 𝛿𝜀ί𝛾𝜇𝛼𝜏𝜊𝜍 𝛥𝑡
= 𝛥𝑡
𝛴. 𝛭 (Εξίσωση 3.7)
όπου Σ.Μ. είναι ο συντελεστής μετατροπής, σταθερά, διαφορετική για κάθε πρωτόκολλο κινητικής
φωτομετρικής ανάλυσης. Ο Σ.Μ. δίνεται από τη εξίσωση:
𝑇𝑉
Σ.Μ.= 𝜀 𝑑 𝑉𝛿𝜀ί𝛾𝜇𝛼𝜏𝜊𝜍 (Εξίσωση 3.8)
O Σ.Μ. έχει μονάδες min ∙ U/L και τιμή που δίνεται στο φυλλάδιο οδηγιών του κάθε πρωτοκόλλου
κινητικής φωτομετρικής ανάλυσης.
Εφόσον στις κινητικές φωτομετρικές μεθόδους υπολογίζεται η διαφορά απορρόφησης μεταξύ

διαδοχικών χρόνων, οποιαδήποτε συνεισφορά που οφείλεται σε τυφλό δείγμα ακυρώνεται. Αυτό ισχύει
φυσικά με την προϋπόθεση ότι η εφαρμοζόμενη μέθοδος είναι εκλεκτική ως προς τον αναλύτη
ενδιαφέροντος και η απορρόφηση του τυφλού μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της φάσης της
σταθεροποιημένης κατάστασης της αντίδρασης.
Σπανίως σε κάποια πρωτόκολλα φωτομετρικών κινητικών μεθόδων λαμβάνεται μία μόνο μέτρηση
εντός της γραμμικής περιοχής. Σε αυτή την κατηγορία μεθόδων απαιτείται η χρήση τυφλού (Pardue, 1977).
Σύνοψη: Στις κινητικές μεθόδους ο προσδιορισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται με πολλαπλασιασμό του
πειραματικά υπολογιζόμενου ρυθμού μεταβολής της απορρόφησης επί κάποιον συντελεστή που δίνεται από το
πρωτόκολλο. Στις κινητικές μεθόδους δεν είναι απαραίτητη η βαθμονόμηση με πρότυπα για τον ποσοτικό
προσδιορισμό. Επίσης, όταν ο προσδιορισμός γίνεται με κινητική μέθοδο, όπου καταγράφεται το μετρούμενο
σήμα σε περισσότερες χρονικές στιγμές και η απορρόφηση του τυφλού μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια
της φάσης της σταθεροποιημένης κατάστασης, δεν απαιτείται παράλληλη χρήση τυφλού.
3.3.6 Πρωτόκολλο ανάλυσης με Κινητική Μέθοδο
Στη Φωτογραφία 3.1 παρουσιάζεται το πρωτόκολλο του προσδιορισμού της ασπαρτικής αμινοτρανσφεράσης
(Aspartate Τransaminase [AST] ή Glutamate Oxaloacetate Transaminase [GOT]) κατά το σύστημα των
συζευγμένων Αντιδράσεων 3.4 και 3.5. Αυτό παρέχεται στο φύλλο οδηγιών του κατασκευαστή του kit
προσδιορισμού.
𝐺𝑂𝑇
α-κετογλουταρικό + L-ασπαρτικό ↔ L-γλουταμικό + oξαλοξικό (Αντίδραση 3.4)
65
𝑀𝐷𝐻
οξαλοξικό + NADH + H+ ↔ L-μηλικό + NAD+ (Αντίδραση 3.5)
Το ένζυμο GOT προσδιορίζεται έμμεσα μέσω της καταλυόμενης από αυτό μεταφοράς αμινομάδας
από το μόριο του L-ασπαρτικού στο μόριο του α-κετογλουταρικού οξέος. Το παραγόμενο οξαλοξικό οξύ
παρουσία του ενζύμου μηλική αφυδρογονάση (MDH) ανάγεται προς L-μηλικό οξύ με ταυτόχρονη οξείδωση
του συνενζύμου NADH σε NAD+. Η ελάττωση της απορρόφησης στα 340 nm (οφειλόμενη στην ελάττωση
της συγκέντρωσης του NADH) είναι ανάλογη της δραστικότητας της GOT στο δείγμα (Bergmeyer et al.,
1976· Bergmeyer et al., 1978a· Bergmeyer et al., 1978b· McPherson & Pincus, 2011).
Σε αναλογία με το πρωτόκολλο ανάλυσης μεθόδου τελικού σημείου (Κεφάλαιο 2) το πρωτόκολλο

ανάλυσης μίας κινητικής μεθόδου περιλαμβάνει τις πληροφορίες που αναφέρονται παρακάτω:
 Την Επιστημονική Ένωση που έχει υιοθετήσει τη συγκεκριμένη μέθοδο ως επίσημη ή αποδεκτή για τον
ποσοτικό προσδιορισμό του συγκεκριμένου αναλύτη. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο ο προσδιορισμός
γίνεται σύμφωνα με τις προδιαγραφές της Διεθνούς Εταιρείας Κλινικής Χημείας (IFCC).
 Τη σύσταση του αντιδραστηρίου εργασίας. Το αντιδραστήριο εργασίας μπορεί να περιλαμβάνει όλα ή
κάποια από τα παρακάτω συστατικά:
 Συμπαράγοντες, ενεργοποιητές, ιόντα: Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται το συνένζυμο
NADH. Η παρακολούθηση της αντίδρασης γίνεται δυνατή μέσω της μείωσης της οφειλόμενης στο
NADH απορρόφησης στα 340 nm.
 Υποστρώματα: L-ασπαρτικό στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο.
 Άλλα αντιδρώντα: To α-κετογλουταρικό αποτελεί το δέκτη της μεταφερόμενης αμινομάδας.
 Χρωμογόνο: Είναι η ουσία η οποία κατά την αντίδραση θα μετατραπεί σε έγχρωμο προϊόν. Δεν αποτελεί
συστατικό του διαλύματος εργασίας στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακο-
λουθείται μέσω της μείωσης της οφειλόμενης στο NADH απορρόφησης στα 340 nm.
 Ρυθμιστικό διάλυμα: με σκοπό τη διατήρηση σταθερού pH και ιοντικής ισχύος, ώστε η(οι) ενζυμική με-
τατροπή(ες) να εκτυλίσσεται υπό τις βέλτιστες συνθήκες. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο χρησιμοποιείται
ρυθμιστικό Tris 80 mM - pH 7,8.
 Τυχόν άλλα ένζυμα που καταλύουν συζευγμένες αντιδράσεις. Στο συγκεκριμένο πρωτόκολλο η μηλική
αφυδρογονάση (MDH).
Πολύ συχνά τα επιμέρους συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας εμπεριέχονται σε ξεχωριστά
φιαλίδια. Τα ασταθή επιμέρους συστατικά αναμιγνύονται αμέσως πριν την εκτέλεση της αντίδρασης. Αυτό
γίνεται προκειμένου να αποφευχθεί η αλλοίωση ή η κατανάλωση αυτών (π.χ. μέσω της οξείδωσής τους ή
γενικότερα της αντίδρασής τους ή της καταβύθισής τους, μετουσίωσής τους κ.λπ.). Μια τέτοια αλλοίωση θα
είχε ως αποτέλεσμα, είτε τη μη εκλεκτική ανάπτυξη χρώματος στο τυφλό (απουσία του αναλύτη), είτε την
αδυναμία ανάπτυξης χρώματος σύμφωνα με τις προκαθορισμένες συνθήκες, παρουσία του αναλύτη. Έτσι,
και στο πρωτόκολλο της GOT, τo ένζυμo (ΜDH) φυλάσσεται λυοφιλοποιημένo σε ξεχωριστό φιαλίδιο και,
πριν τη χρήση του αντιδραστηρίου εργασίας, απαιτείται η ανασύστασή του.
Το πρωτόκολλο μιας κινητικής ανάλυσης θα πρέπει ακόμα να καθορίζει τα παρακάτω:
• Την τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του δείγματος, ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο προσ-
διορίζεται ο αναλύτης.
• Την τυχόν απαιτούμενη προκατεργασία του αντιδραστηρίου εργασίας πριν τη χρήση του (π.χ. ανασύστα-
ση, αραίωση, επαναιώρηση, ανάμιξη κ.λπ.). Στο πρωτόκολλο προσδιορισμού της GOT τo ένζυμo (ΜDH)
φυλάσσεται λυοφιλοποιημένo σε ξεχωριστό φιαλίδιο και απαιτείται η ανασύσταση του ενζύμου με ρυθ-
μιστικό διάλυμα που περιέχει όλα τα υπόλοιπα συστατικά του αντιδραστηρίου εργασίας πριν την αντί-
δραση.
• Τη θερμοκρασία επώασης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 37οC.
• Το χρόνο που διαρκεί η φάση έναρξης της αντίδρασης. Στο πρωτόκολλο αυτό δεν ορίζεται. Η φάση έναρ-
ξης είναι κοινώς διάρκειας μόνο λίγων δευτερολέπτων κατά το μέγιστο. Έτσι, αναμονή επί 1 min πριν τη
λήψη της πρώτης μέτρησης εξασφαλίζει μέτρηση εντός της γραμμικής περιοχής.
66
• Τους προτεινόμενους χρόνους καταγραφής της απορρόφησης κατά τη γραμμική περιοχή της αντίδρασης.
Στο πρωτόκολλο αυτό δεν αναφέρονται. Αναφέρεται μόνο η διάρκεια της γραμμικής περιοχής (3 min).
Έτσι, μετρήσεις απορρόφησης θα μπορούσαν να γίνουν στα 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 και 3,0 min.
• Το μήκος κύματος καταγραφής της απορρόφησης. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 340 nm.
• Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου το διαλύματος στην κυψελίδα, βάση του οποίου υπο-
λογίστηκε από τον κατασκευαστή ο συντελεστής μετατροπής. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι 1 cm.
• Τις τιμές αναφοράς για τον συγκεκριμένο κλινικό αναλύτη ανάλογα με το βιολογικό δείγμα στο οποίο
προσδιορίζεται. Στο πρωτόκολλο αυτό είναι μέχρι 45 U/L στον ορό. Οι τιμές αναφοράς αναφέρονται στις
πειραματικές συνθήκες (υπόστρωμα, θερμοκρασία, pH κ.ά.) που ορίζονται στο πρωτόκολλο.
• Τον συντελεστή μετατροπής για τον υπολογισμό της ενζυμικής συγκέντρωσης. Στο πρωτόκολλο αυτό
είναι 1746 min ∙ U/L.
• Πιο ειδικές πληροφορίες π.χ. τυχόν παρεμποδίσεις και τρόπους αναίρεσης αυτών, σχετικές βιβλιογραφι-
κές μελέτες κ.α.
• Τους χρόνους ζωής των επιμέρους αντιδραστηρίων και τη σταθερότητα του ενζύμου που προσδιορίζεται
στο κλινικό δείγμα. Στο πρωτόκολλο αυτό το διάλυμα εργασίας είναι σταθερό επί 15 ημέρες σε θερμο-
κρασία 2 - 10οC, μετά την ανασύσταση της MDH. H σταθερότητα της GOT σε ορό αναφέρεται ως 48 h
σε θερμοκρασία 15 - 30οC, ή 3 ημέρες σε θερμοκρασία 2 - 10οC.
• Τα τεχνικά χαρακτηριστικά της μεθόδου, όπως το εύρος γραμμικότητας μεταξύ απορρόφησης και συγκέ-
ντρωσης αναλύτη, το όριο ανίχνευσης, την επαναληπτικότητα και αναπαραγωγιμότητα.
Φωτογραφία 3.1 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού GOT με κινητική
μέθοδο.
67
68
3.4 Πειραματικό μέρος
3.4.1 Προσδιορισμός Αμυλάσης με Κινητική μέθοδο
Ως πρώτο πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο θα αναφερθεί ο

προσδιορισμός της αμυλάσης (Amylase ή AMYL), (Winn-Deen et al., 1988), σύμφωνα με το πρωτόκολλο
της Φωτογραφίας 3.2.
Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, ο προσδιορισμός της αμυλάσης στον ορό βασίζεται στην καταλυόμενη
από την αμυλάση, μετατροπή ενός παραγώγου σακχαρίτη σε έγχρωμο προϊόν. Το έγχρωμο προϊόν απορροφά
στα 405 nm. Η επώαση πραγματοποιείται στους 37οC. Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο, ώστε να μετρά στα 405 nm
και το μηδενίζουμε με απιονισμένο νερό. Στη θερμοστατούμενη κυψελίδα του φασματοφωτομέτρου προστί-
θενται ο ορός (20 μL) με το προς προσδιορισμό ένζυμο και αμέσως μετά 1 mL από το αντιδραστήριο
εργασίας (που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα, συμπαράγοντα, συντηρητικό και υπόστρωμα), το οποίο έχει ήδη
προθερμαθεί στους 37οC. Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην
κυψελίδα θα πρέπει να είναι 1 cm. Αναμιγνύουμε αμέσως με αναρρόφηση με την πιπέτα και απότομη
απόδοση του περιεχομένου της. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της
αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται στα
405 nm μέσω καταγραφής της αύξησης της οπτικής απορρόφησης, συναρτήσει του χρόνου. Σύμφωνα με τη
σύσταση του κατασκευαστή του kit, η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει μετά τα 30 sec (λήξη της
φάσης έναρξης της αντίδρασης) και συνεχίζεται επί 3 min, ανά 30 sec. Οι τιμές της απορρόφησης που
μετρήθηκαν στους αντίστοιχους χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης φαίνονται στον Πίνακα 3.1. Στον
ίδιο πίνακα υπολογίζονται και οι λόγοι ΔΑ/Δt για την κάθε χρονική στιγμή και η μέση τιμή ΔΑ/Δt.
Όπως αναφέρθηκε στο θεωρητικό μέρος, στη γραφική παράσταση της μεταβολής της οπτικής
απορρόφησης ΔΑ συναρτήσει του χρόνου t (Σχήμα 3.3), η κλίση του γραμμικού τμήματος είναι ανάλογη της
αρχικής ταχύτητας, v0. Η κλίση αυτή μπορεί να υπολογιστεί γραφικά. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο, η
γραμμική αυτή περιοχή διαρκεί τουλάχιστον από τα πρώτα 30 sec και για τα επόμενα 3 min της αντίδρασης.
Με βάση τη γνώση αυτή και για την απλούστευση του υπολογισμού, υπολογίζεται ο λόγος ΔΑ/Δt δηλαδή ο
λόγος μεταβολής της απορρόφησης προς τη μεταβολή του χρόνου, για κάθε μέτρηση. Ο λόγος αυτός
ταυτίζεται με την κλίση της ευθείας στη γραμμική περιοχή και είναι ανάλογος της αρχικής ταχύτητα της
αντίδρασης σε κάθε στιγμή. Εφόσον όμως αυτή η ταχύτητα είναι σταθερή εντός του συγκεκριμένου χρονικού
διαστήματος, έχει νόημα ο υπολογισμός της μέσης ΔΑ/Δt.
Ο υπολογισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση 3.7.
Πολλαπλασιάζουμε τη μέση ΔΑ/Δt του Πίνακα 3.1 επί τον συντελεστή μετατροπής, ο οποίος δίνεται από το
πρωτόκολλο ως 3954 min ∙U/L. H συγκέντρωση της αμυλάσης επομένως υπολογίζεται ως 0,0227 min-1 ∙
3954 min ∙ U/L = 89,6 U/L. Καθώς οι τιμές αναφοράς της αμυλάσης στον ορό είναι μέχρι 90 U/L,
συμπεραίνουμε ότι το δείγμα μας είναι φυσιολογικό.
Χρόνος Α 405 nm ΔΑ Δt ΔΑ/Δt Μέση

(min) (min) (min-1) ΔΑ/Δt
(min-1)
0,5 0,217
1 0,229 0,012 0,5 0,024
1,5 0,241 0,012 0,5 0,024
2 0,252 0,011 0,5 0,022 0,0227
2,5 0,264 0,012 0,5 0,024
3 0,275 0,011 0,5 0,022
3,5 0,285 0,010 0,5 0,020
Πίνακας 3.1 Μετρήσεις απορρόφησης που λήφθηκαν σε αντίστοιχους χρόνους κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό
αμυλάσης με κινητική μέθοδο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.2.
69
Φωτογραφία 3.2 Πρωτόκολλο ανάλυσης που παρέχεται από εταιρία παραγωγής kit προσδιορισμού αμυλάσης με κινητική
μέθοδο.
3.4.2 Προσδιορισμός GOT με Κινητική Μέθοδο
Ως εναλλακτικό πειραματικό παράδειγμα κλινικού ενζυμικού προσδιορισμού με κινητική μέθοδο θα

αναφερθεί, εν συντομία, ο προσδιορισμός της GOT (Bergmeyer et al., 1976· Bergmeyer et al., 1978a·
Bergmeyer, et al., 1978b· McPherson & Pincus, 2011) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.1.
Αναλυτική περιγραφή του πρωτοκόλλου έγινε στην Παράγραφο 3.3.6.
Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο στα 340 nm και το μηδενίζουμε με απιονισμένο νερό. Στη
θερμοστατούμενη στους 37οC κυψελίδα του φασματοφωτομέτρου προστίθενται ο ορός (100 μL) με το προς
προσδιορισμό ένζυμο, και αμέσως μετά 1 mL από το αντιδραστήριο εργασίας, το οποίο έχει ήδη
προθερμαθεί στους 37οC. Το μήκος της διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος στην
κυψελίδα θα πρέπει να είναι 1 cm.
Αναμιγνύουμε αμέσως με αναρρόφηση με την πιπέτα και απότομη απόδοση του περιεχομένου της.
Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης, οπότε ξεκινάει και η
καταγραφή του χρόνου. Η εξέλιξη της αντίδρασης παρακολουθείται στα 340 nm μέσω καταγραφής της
μείωσης της οπτικής απορρόφησης, συναρτήσει του χρόνου. Η καταγραφή της απορρόφησης ξεκινάει
70
μετά το 1 min (λήξη της φάσης έναρξης της αντίδρασης) και συνεχίζεται επί 2 min, ανά 30 sec. Οι τιμές της
απορρόφησης που μετρήθηκαν στους αντίστοιχους χρόνους από την έναρξη της αντίδρασης καταγράφονται
στον Πίνακα 3.2. Στον ίδιο πίνακα πρέπει να υπολογιστούν και οι λόγοι ΔΑ/Δt για την κάθε χρονική στιγμή
και η μέση τιμή ΔΑ/Δt.
Ο υπολογισμός της ενζυμικής συγκέντρωσης γίνεται πολλαπλασιάζοντας τη μέση ΔΑ/Δt του
Πίνακα 3.2 επί τον συντελεστή μετατροπής, ο οποίος δίνεται από το πρωτόκολλο ως 1746 min ∙U/L. Έτσι,
υπολογίζεται η συγκέντρωση της GOT σε U/L και συγκρίνεται με τις τιμές αναφοράς της GOT στον ορό
(μέχρι 45 U/L).
Χρόνος Α 340nm ΔΑ Δt ΔΑ/Δt Μέση ΔΑ/Δt

(min) (min) (min-1) (min-1)
1
1,5
2
2,5
3
Πίνακας 3.2 Μετρήσεις απορρόφησης που λαμβάνονται σε αντίστοιχους χρόνους κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό
GOT με κινητική μέθοδο, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της Φωτογραφίας 3.1. Εφόσον το συνένζυμο NADH οξειδώνεται
κατά τη συζευγμένη αντίδραση θα πρέπει να παρατηρηθεί μείωση της μετρούμενης απορρόφησης με το χρόνο (Αντιδράσεις
3.4 και 3.5).
71
Ο προσδιορισμός της δραστικότητας του GOT με τη μέθοδο της IFCC στους 37 οC,
https://youtu.be/SFV9h8EGO5g.

 Εργαστηριακό πείραμα υπό μορφή animation όπου φαίνεται η επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώ-
ματος στην παραγωγή έγχρωμου προϊόντος κατά μία ενζυμικά καταλυόμενη αντίδραση:
http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=64&sim=1090&cnt=2114 (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Αnimation που επιδεικνύει τη βασική αρχή του μηχανισμού ενζυμικής κατάλυσης σύμφωνα με τη θεωρία
«κλειδιού-κλειδαριάς»
http://highered.mheducation.com/sites/0072495855/student_view0/chapter2/animation__how_enzymes_w
ork.html (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Animations με τις βασικές αρχές ενζυμικής κινητικής:
 http://academics.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/enzymekinetics.html
http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/student/animations/enzyme_kinetics/index.html (τελευ-
ταία προσπέλαση 1/4/2015).

 Φωτογραφία 3.1 http://www.biosis.gr (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Φωτογραφία 3.2 http://www.spinreact.com (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
72
Αναφορές
1. ARNESON, L. & BRICKELL, M. (2007) Clinical Chemistry: A Laboratory Perspective. Philadelphia:
Davis Company.
2. BERGMEYER, U., BOWERS, JR., HORDER, M., MOSS, W. (1976) Provisional recommendations on
IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of enzymes. Part 2: IFCC method for as-
partate aminotransferase. Clin Chim Acta, 70, p. F19-F42.
3. BERGMEYER, U., HORDER, M., MOSS, W. (1978a) Provisional recommendations on IFCC methods
for the measurement of catalytic concentrations of enzymes. Part 3: Revised IFCC method for aspartate
aininotransferase. Clin Chem, 24, p. 720-21.
4. BERGMEYER, U., SCHEIBE, P., WAHLEFELD, W. (1978b) Optimization of methods for aspartate
aminotransferase and alanine aminotransferase. Clin Chem, 24, p. 58-73.
5. CHANG, R. (2005) Physical Chemistry for the Biosciences, California: University Science Books.
6. ΚΑΡΙΚΑΣ, Γ.Α. (2012) Εφαρμοσμένη Βιοχημεία. Αθήνα: Εκδόσεις Οδυσσέας, Βιβλιόπολις ΑΕΒΕ.
7. ΚΛΩΝΗΣ, Ι. (2008) Ενζυμική Βιοτεχνολογία. Ηράκλειο: Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης.
8. MCPHERSON, A. & PINCUS, R. (2011) Henry's Clinical Diagnosis and Management by Laboratory
Methods. Philadelphia: Elsevier-Saunders.
9. PALMER, T. & BONNER, P. (2007) Enzymes: Biochemistry, Biotechnology, Clinical Chemistry, Cam-
bridge: Woodhead Publishing Ltd.
10. PARDUE, L. (1977) A comprehensive classification of kinetic methods of analysis used in clinical chem-
istry. Clin Chem, 23, p. 2189-201.
11. ROGERS, A, & GIBON, Y. (2009; pp. 71-103) Enzyme Kinetics: Theory and Practice. In: Plant Metabol-
ic Networks J. Schwender (ed.), Heidelberg: Springer Science and Business Media.
12. SEGEL, H. (1975) Enzyme Kinetics. New York: John Wiley & Sons.
13. SKOOG, D., WEST, D., HOLLER, F., CROUCH, S. (2014; pp. 819-842) Kinetic Methods of Analysis,.
In: Fundamentals of Analytical Chemistry. California: Brooks/Cole.
14. WINN-DEEN, S., DAVID, H., SIGLER G., CHAVEZ, R. (1988) Development of a direct assay for al-
pha-amylase. Clin Chem, 34, p. 2005-08.
73
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΟΞΕΟΒΑΣΙΚΗΣ ΙΣΟΡΡΟΠΙΑΣ
ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό παρουσιάζονται οι βασικές έννοιες σχετικά με τη φυσιολογία, τις διαταραχές και την
φυσιολογική και κλινική σημασία της οξεοβασικής και ηλεκτρολυτικής ισορροπίας του οργανισμού.
Περισσότερο αναλυτικά παρουσιάζεται η οργανολογία προσδιορισμού των σχετικών εργαστηριακών
παραμέτρων, ενώ αναφέρονται και η δειγματοληψία και ο χειρισμός των κλινικών δειγμάτων. Τέλος, στο
πειραματικό μέρος του κεφαλαίου παρουσιάζονται περιληπτικά τα βασικά στάδια προσδιορισμού
ηλεκτρολυτών με αυτόματο αναλυτή καθώς και με κλασική τεχνική ποσοτικής χημικής ανάλυσης.
Η κατανόηση του κεφαλαίου αυτού πρoϋποθέτει βασική γνώση της φυσιολογίας των νεφρών και των
πνευμόνων. Η γνώση των εννοιών των οξέων και βάσεων, του pH, των ρυθμιστικών διαλυμάτων και της
μερικής πίεσης των αερίων, καθώς και των βασικών αρχών της ποτενσιομετρίας και αμπερομετρίας, των
φωτομετρικών μεθόδων τελικού σημείου και της φασματοφωτομετρίας ατομικής απορρόφησης, είναι επίσης
απαραίτητη για την κατανόηση του κεφαλαίου αυτού. Τέλος, προαπαιτούμενες γνώσεις θεωρούνται ακόμα η
σχετική με το ισοζύγιο του νερού και των ηλεκτρολυτών φυσιολογία, η ωσμωτικότητα, και η μεταφορά των
μορίων που απαντώνται εσωκυττάρια διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης.
4.1 Οξεοβασική Ισορροπία
4.1.1 Ορισμοί- Βασικές Έννοιες
Ο όρος οξεοβασική ισορροπία (acid-base balance) αναφέρεται στη διατήρηση της οξύτητας (δηλαδή της
συγκέντρωσης των ιόντων Η+) των υγρών του σώματος σε σταθερά επίπεδα, παρά το φορτίο οξέων αλλά και
βάσεων που παράγονται κατά τον μεταβολισμό των κυττάρων ή που προσλαμβάνονται καθημερινά με τις
τροφές.
H συγκέντρωση των ιόντων Η+ ([Η+]) τυπικά εκφράζεται ως pH, το οποίο δίνεται από τη σχέση:
pH = - log10[H+] (Εξίσωση 4.1)
Θα πρέπει να σημειωθεί εδώ, ότι η [H+] και το pH είναι αντιστρόφως ανάλογα μεγέθη. Αύξηση της
[Η+], δηλαδή αύξηση της οξύτητας, αντιστοιχεί σε μείωση του pH, και το αντίστροφο. Η φυσιολογική [Η +]
των 0,0004 mmol/L ισοδυναμεί με pH 7,40. Το φυσιολογικό εύρος των τιμών pH του αίματος είναι 7,35 -
7,45, δηλαδή το pH του περιβάλλοντος του οργανισμού παρουσιάζει μόνο μικρές διακυμάνσεις (Σχήμα 4.1).
74
Σχήμα 4.1 Σχηματική αναπαράσταση των διακυμάνσεων του pH του περιβάλλοντος του οργανισμού.
Ο όρος «μερική πίεση» (partial pressure) αναφέρεται στην πίεση που εξασκείται στο αίμα από τα
διαλυμένα αέρια του αίματος, εάν θεωρηθεί ότι το καθένα καταλαμβάνει μόνο του τον συνολικό όγκο του
αίματος του οργανισμού. Η μερική πίεση ενός αερίου στο αίμα είναι ανάλογη της ποσότητας του διαλυμένου
αερίου στο αίμα. Η μερική πίεση αερίου Χ συμβολίζεται ως PΧ. Επιπλέον, ο πεζός χαραχτήρας «a» στο «Pa»,
προστίθεται όταν γίνεται αναφορά στην τιμή της μερικής πίεσης αερίου στο αρτηριακό αίμα. Έτσι, η
έκφραση PaCO2 αναφέρεται στην πίεση που θα εξασκούνταν στο αρτηριακό αίμα από το διαλυμένο εκεί
CΟ2, εάν το CO2 καταλάμβανε όγκο ίσο με το συνολικό όγκο του αρτηριακού αίματος. Η μερική πίεση
μετράται σε kPa ή σε mm Hg. Για τη μετατροπή από kPa σε mm Hg πρέπει η μετρούμενη ένδειξη να
πολλαπλασιαστεί επί 7,5. Για τη μετατροπή από mm Hg σε kPa πρέπει η μετρούμενη ένδειξη να διαιρεθεί
διά 7,5.
4.1.1 Σημασία Οξεοβασικής Ισορροπίας
Αποκλίσεις πέραν των φυσιολογικών τιμών στη [H+] έχουν ως αποτέλεσμα αποκλίσεις στη λειτουργικότητα
των πρωτεϊνών και των ενζυμικών συστημάτων, στη λειτουργία μεταφοράς οξυγόνου, στην κατανομή και
κατάσταση ιονισμού των ηλεκτρολυτών (διαταραχές ηλεκτρολυτικής ισορροπίας) στην ερεθιστικότητα του
Κεντρικού Νευρικού Συστήματος, στη συσταλτικότητα του μυοκαρδίου και αλλού. Ως συνέπεια, η
διατήρηση του pH του αίματος εντός στενών ορίων είναι απαραίτητη για την ομαλή λειτουργία του
οργανισμού.
4.1.3 Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Οξεοβασικής Ισορροπίας
Η διατήρηση της ομοιόστασης μέσω της σταθερότητας της οξύτητας του αίματος είναι αποτέλεσμα της
λειτουργίας τριών φυσιολογικών μηχανισμών που εξομαλύνουν αιφνίδιες αλλαγές στην [Η +] (Φύτου-
Παλληκάρη, 2005):
 των ρυθμιστικών συστημάτων (buffer systems) του οργανισμού (ενδο- και εξω-κυττάριων), σημαντικό-
τερο των οποίων είναι το ρυθμιστικό διάλυμα του ζεύγους H2CO3/ HCO3-,
 της αναπνευστικής ρύθμισης (pulmonary control) της μερικής πίεσης του CO2 (PCO2), που επιτυγχάνε-
ται με απαγωγή προς το περιβάλλον του CO2 διαμέσου των πνευμόνων,
 της νεφρικής επαναρρόφησης ή απέκκρισης (renal reabsorption or rejection) της διττανθρακικής ρίζας
(HCO3-) και της νεφρικής απέκκρισης οξέων και αμμωνίου.
Η κεντρική σχέση που συνδέει τους τρεις παραπάνω μηχανισμούς ρύθμισης είναι η ακόλουθη:
H2Ο + CO2 H2CΟ3 H+ + HCO3 - (Αντίδραση 4.1)
Σύμφωνα με την παραπάνω σχέση, το διαλυμένο στο αίμα CO2 παραλαμβάνει ένα μόριο νερού,
ευρισκόμενο σε ισορροπία με το ανθρακικό οξύ H2CO3. Το H2CO3 επίσης βρίσκεται σε ισορροπία με τη
διϊσταμένη μορφή αυτού, το διττανθρακικό ανιόν (bicarbonate anion, HCO3-) αποβάλλοντας ένα ιόν H+.
75
Το CO2 είναι προϊόν του κυτταρικού αερόβιου μεταβολισμού και συνεπώς παράγεται διαρκώς από
τα κύτταρα. Αποβάλλεται στο αίμα και μεταφέρεται στους πνεύμονες (κατά 70% ως HCO3-), όπου τελικά
απάγεται προς το περιβάλλον. O ρυθμός παραγωγής του κατά τον οξειδωτικό μεταβολισμό και εκπνοής του
από τους πνεύμονες είναι ίσος, έτσι που η PCO2 να παραμένει σταθερή.
Σε διαταραχές του φυσιολογικού pH, οι παραπάνω μηχανισμοί εξομάλυνσης του pH
ενεργοποιούνται προς την επιθυμητή κατεύθυνση, προκειμένου να επιτευχθεί αντιρρόπηση της αλλαγής. Γι’
αυτό το λόγο οι παραπάνω μηχανισμοί καλούνται και μηχανισμοί αντιρρόπησης (compensatory
mechanisms).
Τα ενδογενή ρυθμιστικά διαλύματα του οργανισμού αποτελούν την πρώτη γραμμή άμυνας του
οργανισμού. Tα διαλύματα αυτά δρουν ταχύτατα με χημικό τρόπο ώστε να ελαχιστοποιήσουν αλλαγές του
pH μέσω της ρύθμισης της σχετικής αναλογίας του οξέος και της συζυγούς βάσεως που συνιστούν το
ρυθμιστικό. Το πιο σημαντικό είναι το ρυθμιστικό διάλυμα του ζεύγους H2CO3/ HCO3-.
Αναφέρθηκε ότι η ποσότητα του διαλυμένου CO2 στο αίμα είναι ανάλογη της μερικής πίεσης του
CO2 (PCO2) στο αίμα. Οι πνεύμονες, μέσω της εκπνοής και με βάση την Αντίδραση 4.1, ρυθμίζουν
αποτελεσματικά τη συγκέντρωση και του H2CO3. Σύμφωνα με την Αντίδραση 4.1, η συσσώρευση του CO2
στο αίμα έχει ως αποτέλεσμα την πτώση του pH, λόγω της μετατόπισης του δεύτερου σκέλους της
ισορροπίας πρoς τα δεξιά. Το αναπνευστικό κέντρο του εγκεφάλου ρυθμίζει την ταχύτητα της αναπνοής των
πνευμόνων καθορίζοντας το ρυθμό αποβολής του CO2 και συνεπώς μπορεί να διατηρεί σταθερό το pH του
αίματος. Έτσι, πτώση του pH, έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη λειτουργία των πνευμόνων (υπεραερισμός
ή υπερκαπνία, hyperventilation ή hypercapnia) προκειμένου να απομακρυνθεί από τον οργανισμό η
περίσσεια CO2. Απομάκρυνση της περίσσειας του CO2 μετατοπίζει την ισορροπία (Αντίδραση 4.1) προς τα
αριστερά και συνεπώς οδηγεί σε μείωση της [Η+]. Αντιστρόφως, αύξηση του pH επιβραδύνει την αναπνοή. Ο
μειωμένος αερισμός (υποαερισμός ή υποκαπνία, hypoventilation ή hypocapnia) αυξάνει την PCO2,
μετατοπίζει την ισορροπία (Αντίδραση 4.1) προς τα δεξιά και επαναφέρει το pH προς τη φυσιολογική τιμή
του. Η ρύθμιση του pH μέσω των πνευμόνων είναι ταχύτατη.
Από την άλλη, η συγκέντρωση του διττανθρακικού ανιόντος, ([HCO3-]) είναι άμεσα ελεγχόμενη
από τους νεφρούς. Ο μηχανισμός αντιρρόπησης των νεφρών ενεργοποιείται όταν οι δύο προηγούμενοι
μηχανισμοί υπήρξαν αναποτελεσματικοί στην πλήρη αποκατάσταση του pH. Είναι όμως πολύ πιο αργός και
απαιτεί κάποια 24ωρα προκειμένου να φτάσει στη μέγιστη δυναμικότητά του. Η πτώση του pH προκαλεί
αποβολή από τους νεφρούς ιόντων Η+ στα ούρα και κατακράτηση διττανθρακικών. Η κατακράτηση των
διττανθρακικών έχει ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση της ισορροπίας (Αντίδραση 4.1) προς τα αριστερά και
συνεπώς οδηγεί σε μείωση της [Η+], δηλαδή σε αύξηση του pH. Αντίθετα, σε αύξηση του pH, οι νεφροί
αποβάλλουν διττανθρακικά και κατακρατούν Η+ υπό τη μορφή οργανικών οξέων, με αποτέλεσμα τη
μετατόπιση της ισορροπίας (Αντίδραση 4.1) προς τα δεξιά και αποκατάσταση του φυσιολογικού pH.
Η αμοιβαία εξάρτηση μεταξύ των παραπάνω μηχανισμών αποκατάστασης εκφράζεται από την
εξίσωση των Henderson-Hasselbalch:
pH = pK' + log ([HCO3-]/ (S PCO2) (Εξίσωση 4.2)
όπου pK' ο αρνητικός λογάριθμoς της σταθεράς διάστασης του ανθρακικού οξέος και S η σταθερά
διαλυτότητας του CO2 στο αίμα.
Η εξίσωση αυτή μπορεί να γραφεί απλoποιημένη ως:
[𝐻𝐶𝑂3 −]
pH ∝ 𝑃𝐶𝑂2
προκειμένου να τονισθεί η ανάλογη εξάρτηση του pH από το λόγο [HCO3-] / PCO2.

Η αμοιβαία εξάρτηση των βασικών οξεοβασικών παραμέτρων και η φυσιολογική ρύθμιση αυτών
φαίνεται σχηματικά στο Σχήμα 4.2.
Σύνοψη: Η αμοιβαία εξάρτηση μεταξύ των παραμέτρων της οξεοβασικής ισορροπίας και των μηχανισμών
αποκατάστασης αυτής εκφράζεται από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch: pH ∝ ([HCO3-])/PCO2. Το
διαλυμένο στο αίμα CO2 παράγεται κατά τον κυτταρικό μεταβολισμό, οδηγώντας στην παραγωγή
διττανθρακικού ανιόντος και ιόντων H+. Η PCO2 ελέγχεται από τον αερισμό των πνευμόνων, ο οποίος
προσαρμόζεται ώστε να διατηρούνται τα επίπεδα της PCO2 εντός στενών ορίων. Η [HCO3–], όπως και η [H+],
76
ελέγχονται μέσω της νεφρικής απέκκρισης και επαναρρόφησης. Το τελικό pH του οργανισμού εξαρτάται από
την ποσότητα των οξέων που παράγονται, τη ρυθμιστική ικανότητα των ρυθμιστικών συστημάτων του
οργανισμού, και την αποβολή των οξέων μέσω των πνευμόνων και των νεφρών.
Σχήμα 4.2 Σχηματική αναπαράσταση της αμοιβαίας εξάρτησης μεταξύ των παραμέτρων της οξεοβασικής
ισορροπίας και των μηχανισμών αποκατάστασης αυτής.
4.1.4 Διαταραχές της Οξεοβασικής Ισορροπίας
Οι όροι οξέωση (acidosis) και αλκάλωση (alkalosis) αναφέρονται σε παθοφυσιολογικές διαταραχές της
οξεοβασικής ισορροπίας που τείνουν να προκαλέσουν αύξηση ή μείωση της [Η+], αντίστοιχα. Στην οξέωση
λοιπόν έχουμε μείωση του pH του αίματος λόγω υψηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή
λόγω μειωμένης συγκέντρωσης βάσεως). Αντίθετα, στην αλκάλωση σημειώνεται αύξηση του pH του
αίματος λόγω χαμηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω αυξημένης συγκέντρωσης
βάσεως). Η οξέωση και αλκάλωση διακρίνονται σε αναπνευστική ή μεταβολική, ανάλογα με το πρωτoγενές
αίτιο τους. Έτσι, πρωτογενείς μεταβολές στην PCO2 προκαλούν αναπνευστικής αιτιολογίας διαταραχές στην
οξεοβασική ισορροπία, ενώ πρωτογενείς μεταβολές στην [HCO3-] είναι υπεύθυνες για μεταβολικής
αιτιολογίας διαταραχές. Συγκεκριμένα, η μεταβολική οξέωση (χαμηλή [HCO3-], primary metabolic acidosis)
και η μεταβολική αλκάλωση (υψηλή [HCO3-], primary metabolic alkalosis) προκαλούνται πρωτογενώς
λόγω της διαταραχής στην ισορροπία παραγωγής οξέων και βάσεων στον οργανισμό και αποβολής τους
μέσω των νεφρών. Η αναπνευστική αλκάλωση (χαμηλό PCO2, primary respiratory alkalosis), και
αναπνευστική οξέωση (υψηλό PCO2, primary respiratory acidosis), προκαλούνται πρωτογενώς από αλλαγές
στην αποβολή του CO2, λόγω πνευμονικών ή αναπνευστικών παθήσεων (Τιτόπουλος, 2001; Γιαμπίδου et al.,
2010).
Πέραν των απλών (αμιγών) διαταραχών στην οξεοβασική ισορροπία, οι οποίες προκαλούνται μόνο
από έναν αιτιολογικό παράγοντα, είναι δυνατόν να εμφανίζονται και μεικτές διαταραχές (mixed acid-base
disorders). Εκεί, περισσότερες οξεοβασικές διαταραχές συνυπάρχουν ως αιτιολογικοί παράγοντες. Στην
77
τελευταία περίπτωση ο συνδυασμός των διαταραχών μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα φυσιολογική ή μη
φυσιολογική τιμή pH.
Κάθε πρωτογενής διαταραχή, προκαλεί την ενεργοποίηση κάποιου μηχανισμού αποκατάστασης
(compensatory mechanism) του pH. Έτσι, η οξέωση και η αλκάλωση δεν έχουν απαραίτητα ως αποτέλεσμα
μία οξυαιμία (pH < 7,35, acidemia) ή μία αλκαλαιμία (pH > 7,45, alkalemia). Οι διαταραχές της
οξεοβασικής ισορροπίας διακρίνονται σε μη αντιρροπούμενες ή οξείες (uncompensated ή acute), μερικώς
αντιρροπούμενες (partly compensated) ή πλήρως αντιρροπούμενες (compensated), ανάλογα με το εάν ή όχι
έχουν ενεργοποιηθεί οι μηχανισμοί για την αποκατάσταση του pH και με το πόσο αποτελεσματικοί υπήρξαν
αυτοί. Η οξεία διαταραχή έχει νόημα στην περίπτωση των αναπνευστικών πρωτογενών διαταραχών, λόγω
της καθυστέρησης στην ενεργοποίηση της αντιρροπιστικής απάντησης των νεφρών. Παρόμοια καθυστέρηση
δεν υφίσταται σε φυσιολογική λειτουργία των πνευμόνων καθότι, όπως αναφέρθηκε, η αναπνευστική
αντιρρόπηση ενεργοποιείται ταχύτατα. Έτσι, η οξεία αναπνευστική οξέωση διακρίνεται από τη δραστική
ελάττωση του pH, ενώ στη χρόνια αναπνευστική οξέωση, το pH διατηρείται σε ικανοποιητικά επίπεδα, λόγω
της ενεργοποίησης της αντιρροπιστικής απάντησης των νεφρών.
Η σχέση των Hendersοn–Hasselbalch (Εξίσωση 4.2) επιτρέπει την πρόβλεψη της αντιρροπιστικής
απάντησης του οργανισμού σε συγκεκριμένες διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας. Ως παραδείγματα
παρουσιάζονται τα παρακάτω:
1. Kατά την αναπνευστική αλκάλωση αναφέρθηκε ότι η PaCO2 είναι μειωμένη. Η αντιρροπιστική απά-
ντηση του oργανισμού προκειμένου να διατηρηθεί σταθερό το pH (δηλ. σύμφωνα με την σχέση των
Hendersοn–Hasselbalch προκειμένου να διατηρηθεί ο λόγος ([HCO3-])/PCO2 σταθερός) είναι η μεί-
ωση των διττανθρακικών.
2. Κατά τη μεταβολική οξέωση αναφέρθηκε ότι η [HCO3-] είναι μειωμένη. Η αναμενόμενη αντιρροπι-
στική απάντηση του oργανισμού προκειμένου να διατηρηθεί σταθερό το pH είναι η μείωση της
PCO2.
Στον Πίνακα 4.1 φαίνεται η μεταβολή των βασικών παραμέτρων της οξεοβασικής ισορροπίας σε
αναπνευστική ή μεταβολική αλκάλωση και οξέωση. Στον Πίνακα 4.2 παρουσιάζονται κάποια ειδικότερα
αριθμητικά κριτήρια που βοηθούν στην εκτίμηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής από τον κλινικό
επιστήμονα (Hennessey & Japp, 2007· Verma & Roach, 2010· Gaw et al., 2013).
Μεταβολικές Διαταραχές Αναπνευστικές Διαταραχές

Μεταβολική Μεταβολική Αναπνευστική Αναπνευστική
Οξέωση Αλκάλωση Οξέωση Αλκάλωση
pH ↓ ↑ ↓ ↑
Σ Σ
Mη Mη ↑ ↓
αντιρροπούμενη αντιρροπούμενη
PaCO2
Aντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη
↓ ↑
Σ Σ
↓ ↑ Mη Mη
αντιρροπούμενη αντιρροπούμενη
-
[HCO3 ]
Aντιρροπούμενη Aντιρροπούμενη
↑ ↑
Περίσσεια
Βάσης ↓ ↑ Σή ↑ Σή ↓
Πίνακας 4.1 Πίνακας συσχέτισης της τάσης μεταβολής των τιμών των κυριότερων οξεοβασικών παραμέτρων του
αρτηριακού αίματος με τον τύπο της οξεοβασικής διαταραχής. Το γράμμα «Σ» υποδεικνύει μη μεταβολή στην τιμή της
παραμέτρου.
78
Οξεοβασική Διαταραχή pH PaCO2 HCO3-
Αναπνευστική Οξέωση
Οξεία < 7,35 > 45 mmHg Φυσιολογικό
Μερικώς αντιρροπούμενη < 7,35 > 45 mmHg > 26 mmol/L
Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό > 45 mmHg > 26 mmol/L
Αναπνευστική Αλκάλωση
Οξεία > 7,45 < 35 mmHg Φυσιολογικό
Μερικώς αντιρροπούμενη > 7,45 < 35 mmHg < 22 mmol/L
Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό < 35 mmHg < 22 mmol/L
Μεταβολική Οξέωση
Μερικώς αντιρροπούμενη < 7,35 < 35 mmHg < 22 mmol/L
Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό < 35 mmHg < 22 mmol/L
Μεταβολική Αλκάλωση
Μερικώς αντιρροπούμενη > 7,45 > 45 mmHg > 26 mmol/L
Αντιρροπούμενη (Χρόνια) Φυσιολογικό > 45 mmHg > 26 mmol/L
Πίνακας 4.2 Πίνακας συσχέτισης της μεταβολής των τιμών των κυριότερων οξεοβασικών παραμέτρων του αρτηριακού
αίματος με τον τύπο της οξεοβασικής διαταραχής. Ο πίνακας περιέχει συγκεκριμένα αριθμητικά κριτήρια για την
αξιολόγηση του τύπου της διαταραχής και της αντιρρόπησης.
Σύνοψη: Οξέωση είναι η μείωση του pH του αίματος λόγω υψηλότερης του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος
(ή λόγω μειωμένης συγκέντρωσης βάσεως). Αλκάλωση είναι η αύξηση του pH του αίματος λόγω χαμηλότερης
του φυσιολογικού συγκέντρωσης οξέος (ή λόγω αυξημένης συγκέντρωσης βάσεως). Η μεταβολική οξέωση και
μεταβολική αλκάλωση προκαλούνται πρωτογενώς λόγω της διαταραχής στην ισορροπία παραγωγής οξέων και
βάσεων στον οργανισμό και της αποβολής τους μέσω των νεφρών. Η αναπνευστική αλκάλωση και
αναπνευστική οξέωση προκαλούνται πρωτογενώς από αλλαγές στην αποβολή του CO2, λόγω πνευμονικών ή
αναπνευστικών παθήσεων. Η σχέση των Hendersοn–Hasselbalch επιτρέπει την εκτίμηση της αντιρροπιστικής
απάντησης του οργανισμού σε συγκεκριμένες διαταραχές της οξεοβασικής ισορροπίας.
4.1.5 Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση οξεοβασικών διαταραχών
Η ανάλυση των αερίων του αρτηριακού αίματος (Arterial Blood Gas Analysis ή ABG Analysis) και ο
προσδιορισμός των υπόλοιπων οξεοβασικών παραμέτρων εκτελείται προκειμένου να εκτιμηθεί η
αναπνευστική λειτουργία και η κατάσταση της οξεοβασικής ισορροπίας ενός ασθενούς. Έτσι είναι χρήσιμη
στη:
 διάγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας αναπνευστικών προβλημάτων και πνευμονικών παθή-
σεων όπως άσθμα, κυστική ίνωση, χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (COPD),
 παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας σε περίπτωση παροχής οξυγόνου με μηχα-
νική υποστήριξη σε ασθενή,
 μέτρηση της οξεοβασικής κατάστασης σε ασθενείς με νεφρική ή καρδιακή ανεπάρκεια, μη ρυθμιζό-
μενο διαβήτη, σε εκτεταμένη μόλυνση, σε διαταραχές της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας ή σε κατά-
χρηση ουσιών.
4.1.5.1 Ανάλυση Αερίων Αίματος
Η ανάλυση των αερίων του αίματος γίνεται με αυτόματο αναλυτή αερίων (blood gas analyser ή ΑΑΑ),
συνηθέστερα σε δείγμα αρτηριακού αίματος, που συλλέγεται αναερόβια, συνήθως από την κερκιδική
αρτηρία. Υπάρχουν στο διαδίκτυο πολλά σχετικά βίντεο που μπορούν να καθοδηγήσουν τον δειγματολήπτη
όσον αφορά τη δειγματοληψία αρτηριακού αίματος, που είναι περισσότερο πολύπλοκη από τη
δειγματοληψία φλεβικού αίματος.
79
Μία εναλλακτική μεθοδολογία δειγματοληψίας αποτελεί η λήψη τριχοειδούς αίματος. Αυτή είναι
ελάχιστα επώδυνη και παρεμβατική και τεχνικά απλούστερη σε σχέση με την αρτηριακή αιμοληψία, ενώ δεν
εμπεριέχει τον κίνδυνο σοβαρών επιπλοκών ενός αρτηριακού καθετηριασμού (π.χ. αιμορραγίας, θρόμβωσης,
συστημικής μόλυνσης). Αντίστοιχα πλεονεκτήματα παρουσιάζει η λήψη φλεβικού αίματος. Πολλές κλινικές
μελέτες έχουν καταδείξει ότι το τριχοειδές αίμα μπορεί να υποκαταστήσει το αρτηριακό αίμα μόνο στην
περίπτωση μέτρησης των παραμέτρων pH και PCO2 κι όχι της PO2 (Higgins, 2008). Ο ίδιος περιορισμός έχει
προταθεί και για το φλεβικό αίμα, για το οποίο υπάρχει μεγαλύτερη ασυμφωνία μεταξύ των μελετών ως προς
την κλινική σημασία του προσδιορισμού των αερίων αίματος σε αυτό (Toftegaard et al., 2009· Awasthi et al.,
2013· Delost, 2014).
Σε κάθε περίπτωση, δεν απαιτείται ιδιαίτερη προκατεργασία του δείγματος αίματος, πλην της
ανάμιξης αυτού, πριν την εισαγωγή του στον αναλυτή. Μία σειρά περιβαλλοντικών παραγόντων ή
παραγόντων σχετιζόμενων με τη δειγματοληψία, μπορεί όμως, να επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης
των οξεοβασικών παραμέτρων. Οι κρίσιμοι παράγοντες για τη σωστή εκτίμηση των οξεοβασικών
παραμέτρων αναφέρονται στην Ενότητα 4.1.8.
Μέτρηση pH, PCO2, PO2
Στα πλαίσια της ανάλυσης των αερίων του αίματος προσδιορίζονται εργαστηριακά κατά το ελάχιστο το pH
και η PCO2 του αίματος. Συνήθως προσδιορίζεται εργαστηριακά και η PO2. Στη συνέχεια ο προσδιορισμός
της [ΗCΟ3-] γίνεται υπολογιστικά από την εξίσωση των Henderson-Hasselbalch (Εξίσωση 4.2). Ο
προσδιορισμός των τεσσάρων αυτών παραμέτρων αναφέρεται ως «ανάλυση αερίων αίματος» (blood gas
analysis).
Σχεδόν το σύνολο των μορίων οξυγόνου στο αίμα βρίσκονται δεσμευμένα σε μία μεταφορική
πρωτεΐνη που ονομάζεται αιμογλοβίνη ή αιμοσφαιρίνη (Hb, h(a)emoglobin). Μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα
του οξυγόνου του αίματος (< 3%) βρίσκεται μη δεσμευμένο και διαλυμένο στο αίμα. Κατά συνέπεια, η
μερική πίεση του οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα, PaO2, η οποία αποτελεί μέτρο μόνο των διαλυμένων/μη
δεσμευμένων μορίων οξυγόνου, δεν απεικονίζει με ακρίβεια την ολική περιεκτικότητα του αίματος σε
οξυγόνο. Έτσι, δεν αποτελεί ένδειξη της οξεοβασικής κατάστασης του οργανισμού, αλλά ασφαλώς
εξαρτάται από την πρόσληψη του οξυγόνου από τους πνεύμονες και συνεπώς απεικονίζει την
αποτελεσματικότητα της αναπνευστικής λειτουργίας.
4.1.5.2 Υπολογιζόμενες παράμετροι Οξεοβασικής Ισορροπίας
Εκτός από τις μετρούμενες παραμέτρους, υπολογίζονται και πολλές άλλες επικουρικές παράμετροι για την
λεπτομερέστερη εκτίμηση της οξεοβασικής ισορροπίας. O υπολογιστικός προσδιορισμός τους βασίζεται σε
συγκεκριμένες εξισώσεις, (Delost, 2014), όλες από τις οποίες δεν κρίνεται σκόπιμο να αναφερθούν στα
πλαίσια αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Η υπολογιζόμενη παράμετρος που συνοδεύει πάντοτε μία
ανάλυση αερίων είναι η [ΗCΟ3-]. Άλλες τέτοιες παράμετροι είναι συνηθέστερα οι παρακάτω:
Χάσμα Ανιόντων
Ο προσδιορισμός του χάσματος ανιόντων (anion gap ή AG) βoηθά στην αιτιολογική διάγνωση της
μεταβoλικής oξέωσης. Σχετίζεται και με την ηλεκτρολυτική ισορροπία (όπως θα αναπτυχθεί αναλυτικά
παρακάτω). Υπολογίζεται από τη σχέση:
Χάσμα ανιόντων ΑG = [Να+]- ([Cl-] +[ΗCΟ3-]) (Εξίσωση 4.4)
Ορισμένοι κλινικοί επιστήμονες χρησιμοποιούν την έκφραση της Εξίσωσης 4.5. για το χάσμα
ανιόντων, όπου συνυπολογίζεται και η [Κ+].
Χάσμα ανιόντων ΑG = ([Να+]+[Κ+])- ([Cl-] +[ΗCΟ3-]) (Εξίσωση 4.5)
Η μέτρηση των [Νa+], [Κ+] και [Cl-] αναπτύσσεται επίσης αργότερα στο ίδιο κεφάλαιο. Είναι
εμφανές από τις Eξισώσεις 4.4 και 4.5, ότι εάν η μεταβoλική oξέωση οφείλεται σε προσθήκη οξέων το
χάσμα ανιόντων υπολογίζεται αυξημένo (διότι αύξηση της [Η+] συνεπάγεται μείωση της [ΗCΟ3-]), κατά τη
80
μετατόπιση της Αντίδρασης 4.1 προς τα αριστερά. Αντιθέτως, εάν η μεταβoλική oξέωση oφείλεται σε
απώλεια διττανθρακικών το χάσμα ανιόντων υπολογίζεται φυσιoλoγικό, κι όχι μειωμένο, διότι οι απώλειες
των διττανθρακικών, στην περίπτωση αυτή, αντισταθμίζονται από αύξηση των χλωριόντων στον οργανισμό.
Περίσσεια Βάσης
Η τιμή της περίσσειας βάσης (base excess ή ΒΕ) δίνει την περίσσεια, πέραν των φυσιολογικών επιπέδων,
των βάσεων που υπάρχουν στο αίμα και οι οποίες μπορούν να εξουδετερώσουν τα υπάρχοντα οξέα του.
Ορίζεται ως η ποσότητα του οξέος ή βάσεως που απαιτείται για τη τιτλοδότηση 1 L του αίματος υπό
φυσιολογική PaCO2 (40 mmHg) στη φυσιολογική τιμή του pH (7,40) και θερμοκρασία 37οC. Δίνεται σε
mEq/L ή πλέον συνηθέστερα σε mmol/L. Θετική τιμή περίσσειας βάσης σημαίνει ότι υπάρχει υψηλότερη
των φυσιολογικών επιπέδων συγκέντρωση βάσης σε σχέση με τη συγκέντρωση των υπαρχόντων οξέων.
Αρνητική τιμή δηλώνει έλλειμμα βάσεων (base deficit). Συνεπώς η ιδανική τιμή της παραμέτρου είναι 0, η
οποία δηλώνει απουσία ελλείματος ή περίσσειας βάσης.
Κορεσμός Οξυγόνου
Αναφέρθηκε ότι σχεδόν το σύνολο των μορίων οξυγόνου στο αίμα βρίσκονται δεσμευμένα στη μεταφορική
πρωτεΐνη αιμοσφαιρίνη (hemoglobin ή HgB). Για τον λόγο αυτό κοινώς, μετριέται ταυτόχρονα (ή
υπολογίζεται μέσω εξίσωσης) και ο κορεσμός οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα (SaO2, oxygen saturation).
Αυτό είναι το ποσό της συνδεδεμένης με οξυγόνο αιμοσφαιρίνης, εκφραζόμενο ως κλάσμα του συνολικού
ποσού αιμοσφαιρίνης.
Στον Πίνακα 4.3 φαίνονται οι τιμές αναφοράς των κυριότερων παραμέτρων που προσδιορίζονται
από τους αναλυτές αερίων και οι οποίες σχετίζονται με την αξιολόγηση της οξεοβασικής ισορροπίας και της
πνευμονικής λειτουργίας. Οι τιμές αυτές διαφοροποιούνται ελαφρώς ανάλογα με τη βιβλιογραφική πηγή,
ιδίως όσον αφορά το χάσμα ανιόντων. Έτσι, για την αξιολόγηση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων
απαιτείται ο προσδιορισμός του διαστήματος αναφοράς από το ίδιο εργαστήριο όπου πραγματοποιείται η
ανάλυση.
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η μερική πίεση των αερίων εξαρτάται από τη θερμοκρασία και το
υψόμετρο, ενώ το pH εξαρτάται μόνο από τη θερμοκρασία. Κατά συνέπεια, θα πρέπει οι δύο αυτές
παράμετροι να καταγράφονται κατά τη λήψη του προς ανάλυση δείγματος, και μετά τον προσδιορισμό των
PO2, PCO2 και pH, οι τιμές τους να διορθώνονται σχετικά. Οι σύγχρονοι αναλυτές αερίων εκτελούν αυτή τη
διόρθωση αυτόματα. Η διόρθωση της PO2 σε περίπτωση υπερθερμίας του ασθενούς θεωρείται γενικά
απαραίτητη λόγω της σημαντικής εξάρτησης της διαλυτότητας του οξυγόνου σε υδατικά διαλύματα από τη
θερμοκρασία. Αντίθετα πολλοί κλινικοί επιστήμονες αμφισβητούν την αναγκαιότητα διόρθωσης των τιμών
pH και PCO2 σε περίπτωση υπερθερμίας του ασθενούς.
Παράμετρος Τιμή
pH 7,35 - 7,45
PaCO2 32 - 43 mmHg ♀, 35 – 46 mmHg ♂
PaO2 71 - 104 mmHg
SaO2 94 - 98%
[HCO3-] 21 - 26 mmol/L
BE (Περίσσεια Βάσης) -2,0 έως +3,0 mmol/L
8 - 12 mmol/L ή 12 - 16 mmol/L, ανάλογα με το εάν στον
AG (Χάσμα Ανιόντων)
προσδιορισμό του χρησιμοποιείται η Εξίσωση 4.4 ή 4.5 αντίστοιχα
Πίνακας 4.3 Τιμές αναφοράς (στο επίπεδο της θάλασσας για ενήλικες και στους 37 ◦C) των συνηθέστερων παραμέτρων
που προσδιορίζονται ή υπολογίζονται κατά την ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος με αναλυτή αερίων.
Στη Φωτογραφία 4.1 φαίνονται τα αποτελέσματα της ανάλυσης δείγματος αρτηριακού αίματος με
αναλυτή αερίων. Ύστερα από σύγκριση των αποτελεσμάτων αυτών με τις τιμές αναφοράς του Πίνακα 4.3,
είτε χρησιμοποιώντας τους κανόνες των Πινάκων 4.1 και 4.2, είτε το νομόγραμμα του Σχήματος 4.3, είτε τις
81
υπολογιστικές μηχανές του διαδικτύου, σε κάθε περίπτωση, προκύπτει ότι πρόκειται για ασθενή που
παρουσιάζει διαταραχή της οξεοβασικής ισορροπίας.
Φωτογραφία 4.1 Αποτελέσματα ανάλυσης δείγματος αρτηριακού αίματος με αναλυτή αερίων.
Σύνοψη: H ανάλυση των αερίων του αίματος για την εκτίμηση της οξεοβασικής κατάστασης του οργανισμού
και της οξυγόνωσής του γίνεται με αυτόματο αναλυτή αερίων και περιλαμβάνει τον προσδιορισμο του pH, της
PCO2, της PO2, καθώς και τον υπολογισμό της [HCO3-]. Η PO2 δεν αποτελεί ένδειξη της οξεοβασικής
κατάστασης του οργανισμού, αλλά ένδειξη της πρόσληψης οξυγόνου και της ανταλλαγής αερίων και συνεπώς
της αναπνευστικής λειτουργίας του ασθενούς. Πέραν των παραπάνω μετρούμενων παραμέτρων, υπολογίζονται
και πολλές άλλες, όπως συνηθέστερα το χάσμα ανιόντων ή η περίσσεια βάσης. O υπολογιστικός προσδιορισμός
τους βασίζεται σε συγκεκριμένες εξισώσεις.
4.1.6 Εκτίμηση του Είδους της Οξεοβασικής Διαταραχής και Κλινική Σημασία των αποτελε-
σμάτων της ανάλυσης
Η μεθοδολογία της αξιολόγησης της ανάλυσης των οξεοβασικών παραμέτρων δε συγκαταλέγεται εντός των
στόχων αυτού του εργαστηριακού οδηγού. Στους Πίνακες 4.1 και 4.2 αναφέρονται κάποια γενικά κριτήρια
που μπορεί ο κλινικός επιστήμονας να ακολουθήσει προκειμένου να αξιολογήσει τον τύπο της οξεοβασικής
διαταραχής. Επιπλέον, υπολογιστικές μηχανές αυτόματης εκτίμησης του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής
(acid-base calculators) και νομογράμματα (nomograms) είναι διαθέσιμα στον κλινικό επιστήμονα,
προκειμένου να τον βοηθήσουν στην αξιολόγηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής. Σύνδεσμοι
πρόσβασης σε σχετικές υπολογιστικές μηχανές δίνoνται στο τέλος του κεφαλαίου. Στο Σχήμα 4.3
παρουσιάζεται σχετικό νομόγραμμα. Τα νομογράμματα απεικονίζουν γραφικά τις σχέσεις που συνδέουν τις
τρείς βασικές παραμέτρους της οξεοβασικής ισορροπίας (pH, PCO2 και [ΗCO3-]) και επιτρέπουν τον κατά
προσέγγιση, γραφικό υπολογισμό του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής (Hennessey & Japp, 2007· Verma
& Roach, 2010).
82
Σχήμα 4.3 Νομόγραμμα (Cogan, 1991) που συσχετίζει γραφικά τις τρείς βασικές παραμέτρους της οξεοβασικής
ισορροπίας (pH, PaCO2 και [ΗCO3-]).
Για να χαρακτηρίσουμε την οξεοβασική κατάσταση του ασθενούς με αποτελέσματα ανάλυσης

αερίων αίματος, όπως αυτά της Φωτογραφίας 4.1 (pH = 7,49, PCO2 = 42,3 mmHg και [ΗCO3-] = 32,0
mmol/L) ακολουθούμε στο νομόγραμμα την αντίστοιχη κάθετη ευθεία του pH, την αντίστοιχη οριζόντια
ευθεία της [ΗCO3-] και την αντίστοιχη καμπύλη της PCO2. Διαπιστώνουμε ότι το σημείο, όπου οι τρεις
γραμμές τέμνονται, εντάσσεται στην περιοχή με ένδειξη «μεταβολική αλκάλωση». Αυτό είναι σε συμφωνία
με την ένδειξη που προκύπτει μετά από μελέτη του Πίνακα 4.1 (μη αντιρροπούμενη μεταβολική αλκάλωση),
αλλά και με υπολογιστικές μηχανές του διαδικτύου.
Παρακάτω αναφέρονται κάποιες γενικότερες έννοιες σχετικές με την κλινική σημασία των
εργαστηριακών ευρημάτων της ανάλυσης της οξεοβασικής ισορροπίας:
Πάντοτε σε συνδυασμό με κλινικά ευρήματα, η ανάλυση των αερίων του αίματος μπορεί να
διευκολύνει τη διάγνωση και παρακολούθηση της θεραπείας. Είναι σημαντικό να τονισθεί όμως ότι η
ανάλυση των αερίων του αίματος δεν μπορεί, από μόνη της, να οδηγήσει σε συγκεκριμένη διάγνωση. Για
παράδειγμα, διαφορετικές αναπνευστικές ή πνευμονικές παθολογίες μπορούν να δώσουν πολύ ανάλογες
τιμές κατά την ανάλυση των αερίων του αίματος.
Η ανάλυση των αερίων του αίματος δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ένα διαγνωστικό τεστ για την
διάγνωση πνευμονικής παθολογίας, όταν αυτή βρίσκεται στα αρχικά στάδια της. Συνηθέστερα, σημαντική
εκτροπή των τιμών που λαμβάνονται κατά την ανάλυση των αερίων του αίματος πέραν των φυσιολογικών
δεν είναι εμφανής, πριν την εξέλιξη της παθολογίας σε προχωρημένο στάδιο.
Τα αποτελέσματα της μέτρησης των αερίων του αίματος υποδεικνύουν κατά πόσο πρόκειται για
οξέωση ή αλκάλωση και την αιτιογένεση αυτής, λόγω μεταβολικών ή αναπνευστικών διαταραχών. Κατά
κανόνα, μία φυσιολογική τιμή pH συνοδευόμενη από μη φυσιολογική τιμή PaCO2 ή [HCO3ˉ] αποτελεί
83
ένδειξη μεικτού τύπου διαταραχής. Η PaCO2 αντικατοπτρίζει την αποτελεσματικότητα του κυψελιδικού
αερισμού, ενώ η PaO2 αντικατοπτρίζει την αποτελεσματικότητα της οξυγόνωσης του αρτηριακού αίματος.
Υπό χαμηλή PaO2 η οξυγόνωση των ιστών είναι περιορισμένη και μπορεί να λάβει χώρα υποξία. Το
Κεντρικό Νευρικό Σύστημα και η καρδιά είναι περισσότερα ευαίσθητα στην υποξία με πολύ δυσμενείς
συνέπειες για τον οργανισμό.
4.1.7 Οργανολογία
4.1.7.1 Aυτόματοι Αναλυτές Αερίων
Εργαστηριακοί και Παρακλίνιοι Αναλυτές Αερίων
Ο προσδιορισμός των παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την οξεοβασική ισορροπία γίνεται με τη χρήση
αυτόματων αναλυτών αερίων (ΑΑΑ). Ένας αυτόματος αναλυτής αερίων αποτελεί κύριο διαγνωστικό
εργαλείο των μονάδων εντατικής θεραπείας, για τη διαχείριση ασθενών σε επείγουσα κατάσταση, τη
διάγνωση και υποστήριξη ασθενών πριν και μετά από χειρουργείο και των μονάδων εντατικής θεραπείας
νεογνών.
Πολύ συχνά χρησιμοποιούνται τελευταίως και φορητοί αναλυτές αερίων (portable blood gas
analysers) στην παρακλίνια ανάλυση (point-of-care testing ή POC) προκειμένου να επιταχύνεται η λήψη
των αποτελεσμάτων, και να πραγματοποιείται η ανάλυση κοντά στο χώρο περίθαλψης των ασθενών. Η
χρήση των παρακλίνιων αναλυτών αερίων έτσι, μειώνει την πιθανότητα προ-αναλυτικού σφάλματος π.χ.
λόγω ανταλλαγής αερίων μέσω του τοιχώματος της σύριγγας όπου περιέχεται το αίμα, ή λόγω συνεχιζόμενου
κυτταρικού μεταβολισμού στο απομονωμένο δείγμα κ.λπ. Άλλα σημαντικά πλεονεκτήματά τους αποτελούν η
μεγαλύτερη ευκολία χειρισμού τους και το μικρό μέγεθός τους (Chin et al., 2012· Delost, 2014).
Μειονέκτημα των παρακλίνιων αναλυτών αποτελεί το γεγονός ότι συχνά χρησιμοπιούνται από
προσωπικό που δεν είναι αρκετά και κατάλληλα εξειδικευμένο με αποτέλεσμα την αύξηση της πιθανότητας
εισαγωγής αναλυτικών σφαλμάτων κυρίως στο προ-αναλυτικό στάδιο, ή στο μετα-αναλυτικό στάδιο, εάν τα
αποτελέσματα πρέπει να μεταβιβαστούν χειρόγραφα στο κεντρικό πληροφοριακό σύστημα του εργαστηρίου.
Επιπλέον, οι παρακλίνιοι αναλυτές αερίων βασίζονται στη χρήση δισκετών μίας χρήσης, οι οποίες περιέχουν
Oλοκληρωμένα Hλεκτρονικά Kυκλώματα (microchips) με ενσωματωμένα τα ηλεκτρόδια μέτρησης και τα
διαλύματα για τη βαθμονόμηση και τον ποιοτικό έλεγχο, γεγονός που αυξάνει το κόστος της ανάλυσης
(Papadea, et al., 2002). Τέλος δεν υπάρχει σε όλες τις περιπτώσεις πλήρης συσχέτιση μεταξύ των
αποτελεσμάτων που λαμβάνονται από τους παρακλίνιους αναλυτές και τους εργαστηριακούς αναλυτές. Η
συχνή απουσία πλήρους συσχέτισης οφείλεται σε διαφορές στην ακριβή μεθοδολογία της ανάλυσης και στην
προέλευση του δείγματος αίματος (αρτηριακό ή μη) ανάμεσα στις δυο αναλύσεις (Delost, 2014).
Μέρη ενός Αναλυτή Αερίων
Μία βασική διάταξη εργαστηριακού αναλυτή αερίων περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους τμήματα
(Φωτογραφία 4.2):
 τις θέσεις εισαγωγής δείγματος: τυπικά οι σύγχρονοι αναλυτές αερίων παρέχουν περισσότερες
δυνατότητες εισαγωγής του δείγματος αίματος, είτε με αναρρόφηση από σύριγγα ή από τριχοειδικό
σωλήνα, είτε με χειρωνακτική εισαγωγή από σύριγγα,
 το θάλαμο μέτρησης, ο οποίος αποτελείται από ένα τριχοειδικό σωλήνα όπου διοχετεύεται το
αναρροφημένο, προς μέτρηση δείγμα αίματος και όπου καταλήγουν οι άκρες των ηλεκτροδίων μέτρησης
του pH, της PO2 και PCO2,
 αντλία για την αναρρόφηση και προώθηση του δείγματος στον αναλυτή,
 το ηλεκτρόδιο υάλου μέτρησης pH,
 το ηλεκτρόδιο μέτρησης PO2,
 το ηλεκτρόδιο μέτρησης PCO2,
 οθόνη χειρισμού,
 καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται κατά την ανάλυση στέλνεται στη συνέχεια σε
κάποιον υπολογιστή, όπου εκτυπώνεται ή διοχετεύεται απευθείας στο κεντρικό πληροφορικό σύστημα
του εργαστηρίου,
84
 δεξαμενή αποβλήτων: Με την ολοκλήρωση της μέτρησης, το αίμα αυτόματα μεταγγίζεται προς μία
δεξαμενή αποβλήτων, ενώ ο τριχοειδικός σωλήνας, όπου καταλήγουν οι άκρες των ηλεκτροδίων
μέτρησης εκπλένεται αυτόματα.
Ανάλογα με το μοντέλο του αναλυτή αερίων και τις ανάγκες του εργαστηρίου, μπορεί να είναι
επιπλέον ενσωματωμένα και συστήματα μέτρησης ηλεκτρολυτών (ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια, βλ. Ενότητα
4.2.6.1), μέτρησης HbO2, μέτρησης μεταβολιτών (σακχάρου ή/και γαλακτικού οξέος) και προσδιορισμού του
αιματοκρίτη. Οι αναλυτές αερίων περιλαμβάνουν επίσης ενσωματωμένα και άλλα συστήματα, που
χαρακτηρίζουν τους σύγχρονους αυτόματους αναλυτές, όπως αυτόματα συστήματα βαθμονόμησης, σύστημα
ποιοτικού ελέγχου, barcode scanner, υπολογιστή για τη διαχείριση, αποθήκευση και ανάκληση αρχείων κι
έχουν πολύ συχνά τη δυνατότητα διοχέτευσης των δεδομένων απευθείας στο κεντρικό πληροφορικό
σύστημα του εργαστηρίου (βλ. Eνότητα 7.4), (Cristalli & Manzoni 2000).
Φωτογραφία 4.2 Εργαστηριακός αναλυτής αερίων Cobas b221 από τον οίκο Roche. Ο αναλυτής διαθέτει περισσότερες
δυνατότητες εισαγωγής του δείγματος αίματος και δυνατότητα ανάλυσης 18 κλινικών παραμέτρων που είναι κοινές στη
διαχείριση ασθενών στις μονάδες εντατικής θεραπείας, μεταξύ αυτών και των αερίων αίματος
Αντιπροσωπευτικές διατάξεις φορητών παρακλίνιων αναλυτών αερίων αίματος φαίνονται στη

Φωτογραφία 4.3. Οι παρακλίνιοι ΑΑΑ αποτελούνται από τα ίδια επιμέρους τμήματα με τη διαφορά ότι τα
διαλύματα για τη βαθμονόμηση και ποιοτικό έλεγχο, τα μικροηλεκτρόδια μέτρησης (όπως και τα
αντιδραστήρια ανάπτυξης για τον τυχόν προσδιορισμό μεταβολιτών) και η δεξαμενή αποβλήτων
περιλαμβάνονται όλα σε δισκέτες μίας χρήσης που προσαρμόζονται στους αναλυτές και καθορίζουν τις
παραμέτρους που πρόκειται να μετρηθούν. Έτσι δεν απαιτείται χειρωνακτική φόρτωση των αντιδραστηρίων
και διαλυμάτων για τη βαθμονόμηση και ποιοτικό έλεγχο, ή περιοδική αντικατάσταση των ηλεκτροδίων και
των τριχοειδών σωληναρίων του θαλάμου μέτρησης ή των αντλιών.
85
Φωτογραφία 4.3 Φορητοί παρακλίνιοι αναλυτές αερίων αίματος i-STAT από τον οίκο Abbott (Α), Element POC™ από
τον οίκο Heska (Β) και TRUPOINT από τον οίκο ITC (Γ). Οι συσκευές διοχετεύουν τα δεδομένα απευθείας στο κεντρικό
πληροφορικό σύστημα του εργαστηρίου. Συνοδεύονται από μεγάλη ποικιλία δισκετών μίας χρήσης, που εισάγονται στη
συσκευή (όπως στην Β1) και καθορίζουν τις παραμέτρους (αέρια αίματος, ηλεκτρολύτες, μεταβολικές παράμετροι κ.α.) που
πρόκειται να μετρηθούν. Η φόρτωση του δείγματος αίματος γίνεται απευθείας στη δισκέτα (όπως στην Β2). Από την
ιστοσελίδα των εμπορικών οίκων Abbott, Heska και ITC.
Παρακάτω παρουσιάζονται οι βασικές αρχές λειτουργίας των ηλεκτροδίων pH και αερίων, που
περιλαμβάνει κάθε αναλυτής αερίων.
Ηλεκτρόδιο μέτρησης pH
Περιλαμβάνει ένα ηλεκτρόδιο αναφοράς (καλομέλανα ή Ag/AgCl) και ένα ηλεκτρόδιο μετρήσεως (Ag/AgCl
σε διάταξη ηλεκτροδίου υάλου). Τα ηλεκτρόδια συνδέονται μεταξύ τους και με όργανο μετρήσεως
δυναμικού. Το ηλεκτρόδιο υάλου φέρει στο κατώτερο τμήμα του ειδικά επεξεργασμένη μεμβράνη υάλου,
της οποίας η μία πλευρά βρίσκεται σε επαφή με διάλυμα ΗCl γνωστού και σταθερού pH (όπου είναι
εμβαπτισμένο το ηλεκτρόδιο Ag/AgCl) και η άλλη σε επαφή με το διάλυμα, του οποίου το pH επιθυμούμε να
προσδιορίσουμε (Σχήμα 4.4). Το ηλεκτρόδιο καλομέλανα περιέχει κεκορεσμένο διάλυμα KCl γνωστού και
σταθερού pH και είναι εμβαπτισμένο στο διάλυμα, του οποίου το pH επιθυμούμε να προσδιορίσουμε. Στο
κατώτερο τμήμα του φέρει διαπερατό διάφραγμα που επιτρέπει την ελεύθερη διακίνηση ιόντων. Τα κατιόντα
Νa+ του επιφανειακού στρώματος της υάλου, στο ηλεκτρόδιο υάλου, ανταλλάσσονται με κατιόντα Η + του
διαλύματος, εκατέρωθεν της μεμβράνης. Έτσι προκύπτει μία διαφορά δυναμικού μεταξύ υάλου και
εσωτερικού διαλύματος και μία μεταξύ υάλου και εξωτερικού διαλύματος, κάθε μία από τις οποίες είναι
ανάλογη προς τη συγκέντρωση των ιόντων υδρογόνου που περιέχονται στο αντίστοιχο διάλυμα. Το
αλγεβρικό άθροισμα αυτών των τιμών δίνει τη διαφορά δυναμικού μεταξύ των δύο διαλυμάτων, που
ευρίσκονται εκατέρωθεν της μεμβράνης. Αυτή η διαφορά δυναμικού είναι ανάλογη προς τη διαφορά των pH
των δύο διαλυμάτων. Επειδή δεν μπορεί να μετρηθεί άμεσα, μετριέται έμμεσα μέσω της ίσης διαφοράς
δυναμικού ανάμεσα στο ηλεκτρόδιο αναφοράς και μετρήσεως (ποτενσιομετρική μέθοδος). Συνηθέστερα τα
δύο ηλεκτρόδια βρίσκονται ενσωματωμένα στο συνδυασμένο ηλεκτρόδιο υάλου‐καλομέλανα το οποίο
περιλαμβάνει και αισθητήρα θερμοκρασίας.
86
Σχήμα 4.4 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου υάλου για τη μέτρηση του pH σε διάταξη αναλυτή αερίων.
Ηλεκτρόδιο μέτρησης της PCO2 (Ηλεκτρόδιο Severinghaus)
Πρόκειται ουσιαστικά για ένα τροποποιημένο ηλεκτρόδιο υάλου. Το ηλεκτρόδιο μέτρησης PCO2 διαθέτει
δύο μεμβράνες. Μία μεμβράνη από Teflon ή σιλικόνη που έρχεται σε επαφή με το δείγμα και η οποία είναι
περατή μόνο από μόρια CO2 και μία μεμβράνη υάλου. Μεταξύ των δύο μεμβρανών υπάρχει ενδιάμεσος
χώρος, που περιέχει συνήθως ηλεκτρολυτικό διάλυμα διττανθρακικών (NaCl/NaHCO3), όπως στο Σχήμα 4.5.
Το αέριο CO2 που είναι διαλυμένο στο δείγμα, διαχέεται μέσω της μεμβράνης Teflon μέσα στο
ηλεκτρολυτικό διάλυμα, όπου παράγει κατιόντα Η+ κατά τη γνωστή αντίδραση:
H2Ο + CO2 H2CΟ3 H + +HCO3 - (Αντίδραση 4.1)
Όσο περισσότερο αέριο CO2 υπάρχει στο μετρούμενο διάλυμα, τόσο μεγαλύτερη θα είναι η
παραγόμενη [Η+]. Η [Η+] υπολογίζεται με το ηλεκτρόδιο υάλου, όπως αναφέρθηκε κατά τη μέτρηση του pH.
Είναι προφανές ότι υπάρχει γραμμική συσχέτιση μεταξύ μετρούμενου pH και PCO2 στο δείγμα.
Σχήμα 4.5 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου Severinghaus για τη μέτρηση της PCO 2 σε διάταξη αναλυτή αερίων.
Ηλεκτρόδιο μέτρησης της PO2 (Ηλεκτρόδιο Clark)
Το ηλεκτρόδιο Clark περιλαμβάνει μεμβράνη, συνήθως από πολυπροπυλένιο ή Teflon, που από την
εξωτερική πλευρά της έρχεται σε επαφή με το δείγμα και η οποία είναι περατή μόνο από μόρια O 2. H
εσωτερική πλευρά της μεμβράνης έρχεται σε επαφή με ηλεκτρολυτικό ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών
(Na2HPO4/KH2PO4, KCl). Μέσα στο διάλυμα αυτό υπάρχουν εμβαπτισμένα ένα ηλεκτρόδιο λευκοχρύσου
(Pt) ως κάθοδος κι ένα ηλεκτρόδιο Ag/AgCl ως άνοδος (Σχήμα 4.6). Κατά την εφαρμογή συγκεκριμένης
87
τάσης μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων το διαχεόμενο Ο2 ανάγεται στο ηλεκτρόδιο Pt, οπότε παράγεται ρεύμα,
κατά τις αντιδράσεις:
O2 + 2H2Ο + 2e- H2O2 + 2ΟΗ- (Αντίδραση 4.2)
H2O2+ 2e- 2OH- (Αντίδραση 4.3)
To μετρούμενο ρεύμα είναι ανάλογo προς την PΟ2. Πρόκειται συνεπώς για μία αμπερομετρική
μέθοδο προσδιορισμού της PΟ2.
Σχήμα 4.6 Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροδίου Clark για τη μέτρηση της PO 2 σε διάταξη αναλυτή αερίων.
4.1.7.2 Παλμικό οξύμετρο
Τo παλμικό οξύμετρο (Pulse Oximeter) επιτρέπει με απλό, ανώδυνο και μη επεμβατικό τρόπο (χωρίς λήψη
αίματος) την επιτόπια μέτρηση του κορεσμού οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα (SaO2). Παράλληλα μετρά τους
παλμούς της καρδιάς. Είναι σημαντικό να γίνει κατανοητό ότι η παλμική οξυμετρία δεν αποτελεί
υποκατάστατο της αρτηριακής ανάλυσης των αερίων του αίματος και δεν ενδείκνυται για συνεχή
παρακολούθηση, αφού δεν δίνει ενδείξεις για το pH του αίματος ή για τις συγκεντρώσεις του CO 2 και των
HCO3- στο αίμα.
H αρχή της παλμικής οξυμετρίας βασίζεται στη διαφορετική απορρόφηση της ερυθρής και
υπέρυθρης ακτινοβολίας από την οξυγονωμένη (οξυαιμοσφαιρίνη) και μη οξυγονωμένη (αναχθείσα)
αιμοσφαιρίνη. Έτσι, η οξυγονωμένη αιμοσφαιρίνη απορροφάει περισσότερο την υπέρυθρη ακτινοβολία, ενώ
επιτρέπει περισσότερο ερυθρό φως να διέλθει. Το αντίστροφο ισχύει για την μη οξυγονωμένη αιμοσφαιρίνη.
Ο μετρητής του παλμικού οξύμετρου τοποθετείται συνηθέστερα στο δάχτυλο και εμπεριέχει δύο διόδους
εκπομπής φωτός, από τις οποίες η μία εκπέμπει στην ερυθρή περιοχή του ορατού φάσματος (στα 660 nm)
και η άλλη στην υπέρυθρη (στα 940 nm), όπως στο Σχήμα 4.7. Καθώς οι ακτίνες φωτός διαπερνούν τους
ιστούς, ένα μέρος του φωτός απορροφάται από το αίμα και τους ιστούς. Η απορρόφηση του φωτός μετράται
από φωτοανιχνευτή που δέχεται την ακτινοβολία που διέρχεται διαμέσου του δακτύλου και υπό συνθήκες
που γίνεται δυνατή η διάκριση της συνεισφοράς του αρτηριακού αίματος στην απορρόφηση. Η απορρόφηση
του φωτός σε κάθε μήκος κύματος (στην ερυθρή και υπέρυθρη περιοχή) εξαρτάται από το βαθμό της
οξυγόνωσης της αιμοσφαιρίνης μέσα στους ιστούς. Έτσι τα παλμικά οξύμετρα επιτρέπουν τη μέτρηση του
κορεσμού οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα.
Στη Φωτογραφία 4.4 φαίνεται ένα παλμικό οξύμετρο δακτύλου (fingertip pulse oximeter).
Κάποιοι συγγραφείς έχουν προτείνει την επικουρική χρήση των παλμικών οξυμέτρων, σε συνδυασμό με τους
αναλυτές αερίων για τον προσδιορισμό των οξεοβασικών παραμέτρων σε δείγμα φλεβικού αίματος, με βάση
το παρακάτω σκεπτικό: Αναφέρθηκε ότι η σημαντικότερη διαφορά στις τιμές των οξεοβασικών παραμέτρων
ανάμεσα στο φλεβικό και στο αρτηριακό αίμα έγκειται στην τιμή της PO2. Έτσι προκειμένου να γίνει
δυνατός ο προσδιορισμός των αερίων του αίματος σε δείγμα φλεβικού αίματος (η δειγματοληψία του οποίου
είναι απλούστερη και εγκυμονεί λιγότερους κινδύνους), έχει προταθεί ο προσδιορισμός των υπολοίπων
παραμέτρων με αναλυτή αερίου και ο προσδιορισμός της PO2 με οξύμετρο (Delost, 2014).
88
Σχήμα 4.7 Σχηματική αναπαράσταση της αρχής λειτουργίας του παλμικού οξύμετρου δακτύλου. Μία συσκευή παλμικού
οξυμέτρου δακτύλου περιλαμβάνει δύο διόδους εκπομπής φωτός οι οποίες κατά την εφαρμογή του οξύμετρου στο δάκτυλο
διατάσσονται επάνω από το νύχι. Η μία εκπέμπει στην ερυθρή περιοχή του ορατού φάσματος και η άλλη στην υπέρυθρη. Η
απορρόφηση του φωτός μετριέται από φωτοανιχνευτή που δέχεται την ακτινοβολία που διέρχεται διαμέσου του δακτύλου
και ο οποίος κατά την εφαρμογή του οξύμετρου διατάσσεται κάτω από το δάκτυλο.
Φωτογραφία 4.4 Παλμικό οξύμετρο δακτύλου (μοντέλο FTP101), από τον οίκο Silverline Meditech.
4.1.8 Παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης
Μία σειρά περιβαλλοντικών παραγόντων ή παραγόντων σχετιζόμενων με τη δειγματοληψία μπορεί να

επηρεάσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης των οξεοβασικών παραμέτρων. Για τη σωστή εκτίμηση των
οξεοβασικών παραμέτρων κρίσιμοι παράγοντες είναι:
1. Η πολύ σύντομη μετά τη δειγματοληψία ανάλυση του δείγματος (εντός 30 min κατά μέγιστο) και η συ-
ντήρηση αυτού στο μεταξύ διάστημα στους 2 - 4oC, ώστε να αποφευχθεί η κατανάλωση του περιεχόμενου
οξυγόνου από τα λευκά αιμοσφαίρια του αρτηριακού αίματος (με αποτέλεσμα ψευδώς μειωμένη PaO2 και
ψευδώς αυξημένη PaCO2). Το δείγμα δε θα πρέπει να διατηρείται απλώς στον πάγο διότι υπάρχει κίνδυ-
νος λύσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων, εάν αυτά παγώσουν. Καθυστέρηση στην ανάλυση του δείγματος
μπορεί να διαφοροποιήσει το αποτέλεσμα της ανάλυσης και λόγω διάχυσης των αερίων διαμέσου των
τοιχωμάτων της πλαστικής σύριγγας.
2. Η αποφυγή εισαγωγής φυσαλίδων αέρα στο δείγμα κατά τη δειγματοληψία και η απομάκρυνσή τυχόν
φυσαλίδων πριν την ανάμιξη του αίματος, με σκοπό την αποφυγή διάλυσης ατμοσφαιρικού οξυγόνου σε
αυτό. Κάτι τέτοιο θα οδηγούσε σε ψευδώς μειωμένη PaCO2 και ψευδώς αυξημένη PaO2.
3. Η χρήση ηπαρινισμένης σύριγγας (με την κατάλληλη ποσότητα και το κατάλληλο άλας ηπαρίνης) για τη
λήψη αρτηριακού αίματος. Η χρήση ηπαρινισμένης σύριγγας είναι απαραίτητη προκειμένου να αποφευ-
χθεί η πήξη του αίματος, κάτι που θα οδηγούσε στην απόφραξη του τριχοειδικού σωλήνα του θαλάμου
μέτρησης του αυτόματου αναλυτή αερίων.
4. Καθώς η μερική πίεση των αερίων είναι συνάρτηση της θερμοκρασίας και του υψόμετρου, και το pH επί-
σης εξαρτάται από τη θερμοκρασία, είναι απαραίτητη η καταγραφή της θερμοκρασίας του ασθενούς και
του υψόμετρου κατά την δειγματοληψία. Για την ακριβή αξιολόγηση των μετρούμενων μερικών πιέσεων
89
θα πρέπει στη συνέχεια να γίνεται η σχετική διόρθωση.
5. Η αποφυγή επιμόλυνσης του αρτηριακού δείγματος με φλεβικό αίμα, κάτι που θα έχει ως αποτέλεσμα
σημαντικές αλλοιώσεις στις τιμές των οξεοβασικών παραμέτρων και κυρίως ψευδώς μειωμένη τιμή PaO2.
6. Θα πρέπει να έχει ο αναλυτής κατά νου ότι το τριχοειδές ή φλεβικό αίμα μπορεί να υποκαταστήσει σε
ικανοποιητικό βαθμό το αρτηριακό αίμα μόνο στην περίπτωση μέτρησης των οξεοβασικών παραμέτρων
pH και PCO2 κι όχι της PO2.
4.2 Ηλεκτρολυτική Ισορροπία
4.2.1 Ορισμοί – Βασικές Έννοιες
Οι ηλεκτρολύτες (electrolytes) είναι ουσίες οι οποίες διαλυόμενες στο νερό (συνεπώς και στα σωματικά
υγρά) διίστανται σε θετικά και αρνητικά φορτισμένα ιόντα, καθιστώντας το διάλυμά τους ηλεκτρικά
αγώγιμο. Στα βιολογικά συστήματα συγκεκριμένα, η χρήση του όρου ηλεκτρολύτες είναι ελαφρώς
μεταποιημένη και περιλαμβάνει όλες τις διαλυμένες ουσίες στα υγρά του σώματος που φέρουν ηλεκτρικό
φορτίο (Hinwood, 2001). Οι ηλεκτρολύτες, που απαντώνται στα βιολογικά συστήματα, έχοντας σημαντικό
φυσιολογικό ρόλο είναι οι παρακάτω:
 Κατιόντα: Na+, Κ+, Ca++, Mg++

 Ανιόντα: Cl-, HCO3-, PA- (ανιόντα πρωτεϊνών, protein anions), HPO4--, SO4--, OA- (οργανικά ανιόντα,
Organic Anions). Το σύνολο των ανόργανων ανιόντων (HPO4-- & SO4--), πλην των HCO3-, αναφέρεται και
ως ΑΑ- (ανόργανα ανιόντα, inorganic anions).
Οι ηλεκτρολύτες απαντώνται στον οργανισμό τόσο ενδοκυττάρια, όσο και στον εξωκυττάριο χώρο.
Σε κάθε διαμερισματοποιημένο χώρο του οργανισμού ισχύει η αρχή της ηλεκτροουδετερότητας
(electroneutrality), σύμφωνα με την οποία το συνολικό θετικό φορτίο των περιεχόμενων εκεί ηλεκτρολυτών
είναι ίσο με το συνολικό αρνητικό τους φορτίο.
Ωσμωτική πίεση (osmotic pressure) καλείται η πίεση που αναπτύσσεται επάνω στα τοιχώματα που
περιβάλλουν ένα διάλυμα λόγω των διαλυμένων σε αυτό σωματιδίων. Η ωσμωτική πίεση καθορίζεται μόνο
από τον αριθμό των διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου του διαλύματος, ενώ είναι ανεξάρτητη της
μάζας των σωματιδίων. Η ωσμωτική πίεση απασχολεί τον κλινικό επιστήμονα, διότι, όπως θα επεξηγηθεί
στα Κεφάλαια 4.2.2 και 4.2.3, καθορίζει την ισορροπία των ηλεκτρολυτών, την οξεοβασική ισορροπία και
την ισορροπία των υγρών του οργανισμού και συνεπώς την ομαλή λειτουργία του οργανισμού.
Ως ωσμωμοριακότητα (osmolarity) - μέτρο της ωσμωτικής πίεσης - ορίζεται ο λόγος των διαλυμένων σε
ένα διάλυμα σωματιδίων, ανά μονάδα όγκου του διαλύματος:
𝛼𝜌𝜄𝜃𝜇ό𝜍 𝛿𝜄𝛼𝜆𝜐𝜇έ𝜈𝜔𝜈 𝜎𝜔𝜇𝛼𝜏𝜄𝛿ί𝜔𝜈

ωσμωμοριακότητα = ό𝛾𝜅𝜊𝜍 𝛿𝜄𝛼𝜆ύ𝜇𝛼𝜏𝜊𝜍
Μετριέται σε osmol/L ή αλλιώς Osm/L (ωσμώλια ανά λίτρο).
Ως ωσμωτικότητα (osmolality) ορίζεται ο αριθμός όλων των διαλυμένων σωματιδίων, ανά kg διαλύτη
(νερό, όσον αφορά τα βιολογικά υγρά).
𝛼𝜌𝜄𝜃𝜇ό𝜍 𝛿𝜄𝛼𝜆𝜐𝜇έ𝜈𝜔𝜈 𝜎𝜔𝜇𝛼𝜏𝜄𝛿ί𝜔𝜈

ωσμωτικότητα = 𝛽ά𝜌𝜊𝜍 𝛿𝜄𝛼𝜆ύ𝜏𝜂
Μετριέται σε osmol/kg ή Osm/kg.
Στην καθημερινή πρακτική στο κλινικό εργαστήριο οι όροι ωσμωτικότητα και ωσμωμοριακότητα
χρησιμοποιούνται δίχως διάκριση, ενώ ως μονάδα και των δύο μεγεθών χρησιμοποιείται το Osm/L. Με τον
ίδιο τρόπο, χωρίς διάκριση θα χρησιμοποιηθούν κι εδώ. Επίσης, χωρίς διάκριση, καταχρηστικά,
χρησιμοποιείται και ο όρος τονικότητα, που επίσης μετριέται σε Osm/L. Η τονικότητα (tonicity) του
90
πλάσματος εξαρτάται μόνο από τη συγκέντρωση αυτών των διαλυμένων ουσιών, που λόγω της παρουσίας
τους προκαλούν την ωσμωτική διακίνηση νερού (ωσμωτικά δραστικές ουσίες [π.χ. Νa+, γλυκόζη]). Αντίθετα,
διαλυτές ουσίες για τις οποίες δεν παρατηρείται διαβάθμιση συγκέντρωσης εκατέρωθεν της μεμβράνης (π.χ.
αλκοόλη) δεν προκαλούν την ωσμωτική διακίνηση του νερού, παρόλο που αυξάνουν την μετρούμενη
ωσμωτικότητα.
Ανάλογα με την τιμή της τονικότητάς τους σε σύγκριση με τη φυσιολογική τονικότητα του
πλάσματος, τα διαλύματα που χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική χαρακτηρίζονται ως υπότονα
(hypotonic), υπέρτονα (hypertonic) ή ισότονα (isotonic) (Lord, 1999).
Η συγκέντρωση και η ωσμωτικότητα ενός διαλύματος είναι έννοιες παραπλήσιες. Για μη
διιστάμενα υδατοδιαλυτά μόρια μάλιστα, ένα osmol ταυτίζεται με ένα mol. Για τα υδατοδιαλυτά διιστάμενα
μόρια, ο αριθμός των σωματιδίων στα οποία διίσταται το μόριο πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. Έτσι στην
περίπτωση του NaCl, εάν θεωρήσουμε ότι αυτό διίσταται πλήρως στο πλάσμα, πρέπει να λάβουμε υπόψη ότι
το κάθε μόριο δίνει δύο διαλυμένα σωματίδια, δηλ. 1 mol = 2 οsmol.
Τα δύο κυριότερα από τα απαντώμενα στα υγρά του οργανισμού μη διιστάμενα υδατοδιαλυτά
μόρια είναι η γλυκόζη και η ουρία. Συνεπώς για τη γλυκόζη (όπου MΒγλυκόζης = 180) η μοριακότητα
ταυτίζεται αριθμητικά με την ωσμωτικότητα και 1 mOsm/L = 1 mmol/L = 180 mg/L = 180 mg/10dL = 18
mg/dL. Αντιστοίχως για την ουρία μετρούμενη ως BUN (2 άτομα N ανά μόριο ουρίας, με ABN =14) ισχύει: 1
mOsm/L = 28 mg/L = 28 mg/10 dL = 2,8 mg/dL.
Στο Σχήμα 4.8 φαίνεται διαγραμματικά η κατανομή των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα φυσιολογικού
ατόμου. Τέτοια διαγράμματα στην κλινική πρακτική καλούνται «Gamblegrams».
Σχήμα 4.8 Διάγραμμα τύπου Gamblegram της κατανομής των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα φυσιολογικού ατόμου
(προσαρμοσμένο από τον Hinwood, 2001).
Σε υγιή άτομα, η τονικότητα υπολογίζεται προσθέτοντας τις συγκεντρώσεις όλων των ωσμωτικά
ενεργών σωματιδίων στο εξωκυττάριο υγρό. Καθώς τα ιόντα Νa+ (που συνιστούν σχεδόν το σύνολο των
κατιόντων του εξωκυττάριου υγρού) εξισορροπούνται από ανιόντα (κυρίως τα Cl -), υπάρχει περίπου ο ίδιος
αριθμός Na+ και ανιόντων ανά μονάδα όγκου. Επομένως, ο υπολογισμός της τονικότητας απλοποιείται
θεωρώντας ότι η ολική συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα δίνεται από το διπλάσιο της [Na +].
Βασιζόμενοι στις φυσιολογικές τιμές των παραμέτρων [Na+], [Glucose] και [Urea] (η τελευταία εκφρασμένη
ως ΒUN), προκύπτει:
Τονικότητα Πλάσματος (mmol/L) = 2[Na+] + [Urea] + [Glucose] (Εξίσωση 4.8)
Όπου οι συγκεντρώσεις [Na+], [Glucose] και [Urea] είναι εκφρασμένες σε mmol/L.
91
ή
Τονικότητα Πλάσματος (mOsm/L) =2 [Na+] + ([glucose] / 18) + (ΒUN / 2,8) (Εξίσωση 4.9)
Όπου η [Na+] είναι εκφρασμένη σε mmol/L (= mOsm/L) ενώ οι [glucose] και [urea] εκφράζονται σε mg/dL.
Η φυσιολογική τονικότητα υπολογίζεται ως:
Τονικότητα Πλάσματος (mOsm/L) = (2 *140) + (90 / 18) + (14 / 2,8) = 290 mOsm/L,
Η φυσιολογική τονικότητα (καταχρηστικά στην κλινική πρακτική και ωσμωτικότητα) είναι

συνεπώς περίπου 290 mΟsm/L.
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η ουρία συμμετέχει στον υπολογισμό της τονικότητας, για λόγους
ιστορικούς που δεν θα αναπτυχθούν περαιτέρω εδώ, παρόλο που διαχέεται ελεύθερα διαμέσου της
κυτταρικής μεμβράνης, και συνεπώς αποτελεί μη ωσμωτικά ενεργό μόριο. Επειδή όμως η συνεισφορά της
στον υπολογισμό της τονικότητας δεν αλλοιώνει σημαντικά το αποτέλεσμα, εξακολουθεί να χρησιμοποιείται
στον υπολογισμό.
Επίσης, τα ιόντα K+ (συν τα ανιόντα που τα συνοδεύουν) έχουν μια μικρή συνεισφορά στην
υπολογιζόμενη τιμή της τονικότητας. Έτσι, στην κλινική πρακτική, οι Εξισώσεις 4.8 και 4.9
χρησιμοποιούνται και διαφοροποιημένες, όπου και η [Κ+] συμμετέχει στον υπολογισμό της τονικότητας.
Λόγω όμως της μικρής βαρύτητάς της, συχνά παραλείπεται από τον υπολογισμό της τονικότητας, όπως στις
Εξισώσεις 4.8 και 4.9.
Παρ’ όλο που τα επιμέρους διαμερίσματα του οργανισμού είναι σχετικά ισοτονικά (ώστε να
διατηρείται η ομοιόσταση του οργανισμού), δηλαδή περιέχουν τον ίδιο αριθμό ωσμωτικά ενεργών
διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου διαλύματος, διαφέρουν σημαντικά ως προς τη σύσταση τους,
όσον αφορά τα περιεχόμενα στα υγρά διαλυμένα σωματίδια. Έτσι, η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών και το
είδος τους διαφέρει από διαμέρισμα σε διαμέρισμα. Το Κ+ είναι το κυριότερο κατιόν του εσωτερικού των
κυττάρων, ενώ το Νa+ είναι το κυρίαρχο κατιόν στο εξωκυττάριο υγρό. Στον εξωκυττάριο χώρο επίσης, το
ανιόν Cl- είναι κυρίαρχο, με τα ΗCO3- να αποτελούν το δεύτερο σημαντικότερο ανιόν. Αντίθετα, οι
πρωτεΐνες (PA-) και οι οργανικές ενώσεις (ΟΑ-) είναι «εγκλωβισμένες» μέσα στα κύτταρα, αποτελώντας
μαζί τη σημαντική πλειοψηφία των ενδοκυττάριων ανιόντων. Το Σχήμα 4.9 δίνει διαγραμματικά την σχετική
κατανομή των κατιόντων και ανιόντων στο πλάσμα και στο κυτταρόπλασμα.
Σχήμα 4.9 Διαγράμματα όπου παρουσιάζεται συγκριτικά η σχετική κατανομή των ηλεκτρολυτών στο πλάσμα (Α) και στον
ενδοκυττάριο χώρο (Β) φυσιολογικού ατόμου. ΑΑ - είναι το σύνολο των ανόργανων οξέων (πλην των HCO3-), ΟΑ- το
σύνολο των οργανικών οξέων, και PA- το σύνολο των ανιόντων πρωτεϊνών.
92
Σύνοψη: Οι ηλεκτρολύτες είναι διαλυμένες στα υγρά του σώματος ουσίες που φέρουν ηλεκτρικό φορτίο.
Απαντώνται στον οργανισμό τόσο ενδοκυττάρια, όσο και στον εξωκυττάριο χώρο. Τα επιμέρους διαμερίσματα
του οργανισμού περιέχουν τον ίδιο αριθμό ωσμωτικά ενεργών διαλυμένων σωματιδίων ανά μονάδα όγκου. Η
συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών και το είδος τους όμως, διαφέρει από διαμέρισμα σε διαμέρισμα. Το Κ+ είναι
το κυριότερο κατιόν του εσωτερικού των κυττάρων ενώ το Νa+ είναι το κυρίαρχο κατιόν στο εξωκυττάριο υγρό.
Σε κάθε διαμερισματοποιημένο χώρο του οργανισμού ισχύει η αρχή της ηλεκτροουδετερότητας.
4.2.2 Σημασία Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας
Οι ηλεκτρολύτες των υγρών του σώματος παίζουν ρόλο στη διατήρηση της ωσμωτικής ισορροπίας και στη
συνακόλουθη διατήρηση της ισορροπίας του νερού του σώματος και στην ανταλλαγή του. Διατηρούν επίσης
την οξεοβασική ισορροπία (pH). Διαδραματίζουν ρόλο στην καρδιακή και αναπνευστική λειτουργία, στη
διεγερσιμότητα των νεύρων και στη μυϊκή δραστηριότητα γενικότερα. Είναι τέλος απαραίτητοι σε ενζυμικές
αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένων και αντιδράσεων μεταφοράς ηλεκτρονίων.
Η ισορροπία του νερού του σώματος είναι άκρως σημαντική, διότι το νερό αποτελεί το υγρό μέσο
για τον μεταβολισμό των κυττάρων, μεταφέρει σε αυτά θρεπτικές ουσίες και οξυγόνο και βοηθά στην
αποβολή των προϊόντων του μεταβολισμού. Μαζί με τους ηλεκτρολύτες, διατηρεί τη φυσική και χημική
σύσταση των ενδοκυττάριων και εξωκυττάριων υγρών, επιτρέποντας τη φυσιολογική λειτουργία του
οργανισμού. Επίσης συμβάλλει στη ρύθμιση της θερμοκρασίας του σώματος και είναι απαραίτητο στην πέψη
των τροφών και στην απορρόφησή τους.
4.2.3 Φυσιολογία και Μηχανισμοί Ρύθμισης της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας
Είναι γνωστό ότι το σώμα ενός ενήλικα αποτελείται κατά ποσοστό 60% από νερό. Το νερό κατανέμεται σε
δύο βασικά διαμερίσματα, το εσωτερικό των κυττάρων (ενδοκυττάριο) και το εκτός των κυττάρων
διαμέρισμα (εξωκυττάριο). Μία από τις βασικές λειτουργίες της ομοιόστασης είναι η διατήρηση της
ισορροπίας (κατανομής) και η διατήρηση της σύστασης των επιμέρους υγρών του σώματος. Οι μεμβράνες
των βιολογικών συστημάτων είναι ημιδιαπερατές, δηλαδή διαπερατές για το νερό, όχι όμως και για πολλές
από τις διαλυμένες στα υγρά του οργανισμού ουσίες. Ουσίες που διαχέονται διαμέσου της κυτταρικής
μεμβράνης είναι μη φορτισμένες, μικρού μοριακού βάρους ή/και λιπόφιλες ουσίες (π.χ. η αλκοόλη, τα αέρια
αίματος, οι στεροειδείς ορμόνες). Η διάχυση αυτών των ουσιών λαμβάνει χώρα, έτσι, ώστε να εξαλειφθεί
οποιαδήποτε διαβάθμιση συγκέντρωσής τους εκατέρωθεν της μεμβράνης. Αντίθετα, διαλυτές ουσίες που δεν
διαπερνούν ελεύθερα τις κυτταρικές μεμβράνες με διάχυση είναι οι (φορτισμένοι) ηλεκτρολύτες, οι
πρωτεΐνες και γενικότερα ενώσεις μεγαλύτερου μοριακού βάρους, ή πολικές ενώσεις π.χ. η γλυκόζη. Αυτές
καλούνται ωσμωτικά δραστικές ουσίες.
Η διέλευση της πλειοψηφίας των μη ωσμωτικά ενεργών ουσιών μέσω της κυτταρικής μεμβράνης
είναι παρ’ όλα αυτά δυνατή μέσω άλλων μηχανισμών/οδών, οι οποίες όμως δεν είναι εξίσου ταχείες ή
αποτελεσματικές, όσον αφορά την εξάλειψη των διαβαθμίσεων συγκέντρωσης (ή φορτίου) εκατέρωθεν
αυτής.
Μία βασική αρχή είναι ότι όταν δύο υδατικά διαλύματα διαχωρίζονται με μία ημιδιαπερατή
μεμβράνη, όπως είναι η κυτταρική μεμβράνη, λαμβάνει χώρα μετακίνηση νερού έως ότου εξισωθεί
εκατέρωθεν της μεμβράνης ο αριθμός των διαλυμένων ωσμωτικά ενεργών σωματιδίων στη μονάδα όγκου,
δηλαδή έως ότου εξισωθεί η τονικότητα εκατέρωθεν της μεμβράνης. Η διάχυση του νερού διαμέσου της
κυτταρικής μεμβράνης, λόγω διαφοράς στη συγκέντρωση διαλυτών ουσιών που δεν μπορούν να την
διαπεράσουν με διάχυση ονομάζεται ώσμωση. Αυτή λαμβάνει χώρα από το διάλυμα με τη μικρότερη
συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών προς αυτό με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών. Εφόσον ο
ενδοκυττάριος και εξωκυττάριος χώρος διαχωρίζονται από την ημιδιαπερατή κυτταρική μεμβράνη, το
ενδοκυτταρικό υγρό βρίσκεται σε ωσμωτική ισορροπία με το εξωκυττάριο υγρό. Ένας πολύπλοκος
ομοιοστατικός μηχανισμός ελέγχει αυστηρά την ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, ώστε να παραμένει
σταθερή και η ωσμωτική πίεση στο εσωτερικό των κυττάρων. Η αναγκαιότητα αυτή οφείλεται στο ότι τα
κύτταρα του σώματος δεν μπορούν να εξισορροπούν μεγάλες αποκλίσεις από τη φυσιολογική ωσμωτική
τους πίεση: Μεγάλες αλλαγές στην ωσμωτικότητα προκαλούν την συρρίκνωση των κυττάρων ή την
αιμόλυσή τους, καταστρέφοντας την κυτταρική δομή και παρεμποδίζοντας τη φυσιολογική κυτταρική
λειτουργία (Σχήμα 4.10). Συνεπώς, η διατήρηση της σταθερότητας του όγκου των υγρών του σώματος και
93
της σύστασης των επιμέρους διαμερισμάτων επιτυγχάνεται με μία διαρκή ροή νερού και διαλυμένων ουσιών
μεταξύ αυτών.
Συμπερασματικά, η καλή λειτουργία του οργανισμού εξαρτάται από τα συστήματα ρύθμισης της
ωσμωτικότητας των υγρών του σώματος. Τα συστήματα αυτά ασκούν άμεση επίδραση στον όγκο και
ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, και λόγω ώσμωσης, έμμεση επίδραση στον όγκο και ωσμωτικότητα
του ενδοκυττάριου υγρού (Kee et al., 2004· Lippincott, 2007· Metheny, 2011· Lobo et al., 2013· Haws &
Haws, 2015).
Σχήμα 4.10 Ωσμωτική διακίνηση του νερού όταν ένα ερυθρό αιμοσφαίριο βρεθεί σε (Α) ισότονο περιβάλλον, (Β)
υπέρτονο περιβάλλον και (Γ) υπότονο περιβάλλον πλάσματος. Στην περίπτωση (Α) διασφαλίζεται η ακεραιότητα της
κυτταρικής δομής και η φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου. Στις (Β) και (Γ) προκαλείται συρρίκνωση και αιμόλυση του
κυττάρου αντίστοιχα, με αποτέλεσμα την καταστροφή της κυτταρικής δομής.
Σύνοψη: Η μετακίνηση του νερού διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης, λόγω διαφοράς στην ωσμωτική πίεση
εκατέρωθεν της μεμβράνης ονομάζεται ώσμωση. Η διαφορά στην ωσμωτική πίεση οφείλεται στη διαφορετική
ανά διαμέρισμα συγκέντρωση διαλυμένων ουσιών που δεν μπορούν να την διαπεράσουν με διάχυση.
Εφόσον ο ενδοκυττάριος και εξωκυττάριος χώρος διαχωρίζονται από την ημιδιαπερατή κυτταρική μεμβράνη,
το ενδοκυτταρικό υγρό βρίσκεται σε ωσμωτική ισορροπία με το εξωκυττάριο υγρό. Ένας πολύπλοκος
ομοιοστατικός μηχανισμός ελέγχει αυστηρά την ωσμωτικότητα του εξωκυττάριου υγρού, ώστε να παραμένει
σταθερή και η ωσμωτική πίεση στο εσωτερικό των κυττάρων. Η αναγκαιότητα αυτή οφείλεται στο ότι τα
κύτταρα του σώματος δεν μπορούν να εξισορροπούν μεγάλες αποκλίσεις από τη φυσιολογική ωσμωτική τους
πίεση: Μεγάλες αλλαγές στην ωσμωτικότητα προκαλούν την συρρίκνωση των κυττάρων ή την αιμόλυσή τους.
Μία βασική αρχή της ομοιόστασης του οργανισμού αποτελεί η διατήρηση της σταθερότητας του όγκου των
υγρών του σώματος και της σύστασης των επιμέρους διαμερισμάτων. Αυτό επιτυγχάνεται με μία διαρκή, καλά
ελεγχόμενη ροή νερού και διαλυμένων ουσιών μεταξύ αυτών.
Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι πέρα από τις μεταβολές του προσλαμβανόμενου και
αποβαλλόμενου νερού (εξωτερικό ισοζύγιο νερού), το ισοζύγιο του νερού ρυθμίζεται ακόμα από εσωτερικές
μετακινήσεις νερού μεταξύ των διαφόρων διαμερισμάτων του οργανισμού προκειμένου να διατηρείται η
ωσμωτική ισορροπία. Είναι σημαντικό να γίνει κατανοητό ότι η ρύθμιση της ωσμωτικότητας
(ωσμωρρύθμιση) και του όγκου των υγρών του σώματος (ογκορρύθμιση) είναι στενά συνδεδεμένες. Αυτό
ισχύει, διότι μεταβολές στον όγκο των υγρών του σώματος προκαλούν αλλαγή της ωσμωτικότητας. Καθώς
το νάτριο είναι το κυρίαρχο ιόν στο εξωκυττάριο υγρό, οι φυσιολογικοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τον όγκο
και την πίεση του αίματος λειτουργούν μέσω ρύθμισης της συγκέντρωσης του νατρίου στο σώμα.
Οι μηχανισμοί και όργανα που ελέγχουν την ηλεκτρολυτική ισορροπία του οργανισμού είτε μέσω
της αποβολής νερού ή ηλεκτρολυτών, είτε μέσω της πρόσληψης ή επαναρρόφησης νερού και ηλεκτρολυτών
συνοψίζονται στα παρακάτω:
 oι νεφροί μέσω της αποβολής ή επαναρρόφησης νερού και ηλεκτρολυτών,

 το γαστρεντερικό σύστημα μέσω των κοπράνων,
 το δέρμα μέσω της αποβολής υδρατμών και ιδρώτα (ηλεκτρολυτών και νερού),
 οι πνεύμονες μέσω της αποβολής υδρατμών,
94
 η οξεοβασική ισορροπία του οργανισμού,
 τα επίπεδα συγκεκριμένων ορμονών (όπως θα εξηγηθεί παρακάτω) και συνεπώς και η φυσιoλογική λει-
τουργία των αντίστοιχων αδένων,
 η καρδιά (μέσω της παραγωγής του ΑΝP, όπως θα εξηγηθεί παρακάτω).
Το όργανο που παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο στην ωσμωρρύθμιση και ογκορρύθμιση είναι οι
νεφροί. Η λειτουργία τους αυτή ρυθμίζεται ορμονικά από ωσμωϋποδοχείς (osmotic sensors) και
ογκοϋποδοχείς ή τασεοϋποδοχείς (pressure sensors) του υποθαλάμου. Οι καθημερινές μέτριες μεταβολές
στην πρόσληψη νερού και άλατος, προκαλούν αλλαγές στην τονικότητα του πλάσματος. Μικρές αυξήσεις
στην τονικότητα ενεργοποιούν τους ωσμωϋποδοχείς και δρουν στο κέντρο δίψας, ενισχύοντας το αίσθημα
της δίψας, αποσκοπώντας στην αύξηση του προσλαμβανόμενου νερού. Παράλληλα, οι ενεργοποιημένοι
ωσμωϋποδοχείς του υποθαλάμου προκαλούν έκκριση της αντιδιουρητικής ορμόνης (vasopressin ή
antidiuretic hormone ή ADH) από την υπόφυση, αποσκοπώντας στη ρύθμιση του αποβαλλόμενου νερού. Η
ADH προκαλεί επαναρρόφηση νερού στα νεφρά (προς το πλάσμα), μειώνοντας έτσι την ποσότητα του νερού
που αποβάλλεται με τα ούρα. Το αποτέλεσμα είναι η μείωση της τονικότητας του πλάσματος και η
ταυτόχρονη συμπύκνωση των ούρων. Αντιθέτως, μικρές μειώσεις στην τονικότητα προκαλούν μείωση της
έκκρισης της ADH με αποτέλεσμα τα νεφρά να εκκρίνουν περισσότερο νερό, προκαλώντας την αραίωση των
ούρων.
Στην περίπτωση μη φυσιολογικών απωλειών αίματος, ή σε αύξηση του όγκου του εξωκυττάριου
υγρού ενεργοποιούνται οι ογκοϋποδοχείς, η δράση των οποίων υπερισχύει αυτής των ωσμωϋποδοχέων.
Αυξημένος όγκος εξωκυττάριου υγρού προκαλεί αυξημένη πίεση στο τοίχωμα του αγγείου και το
αντίστροφο. Τα ερεθίσματα προσάγονται στον υποθάλαμο και κινητοποιούνται μηχανισμοί αποκατάστασης
νορμοογκαιμίας.
Τέτοιοι μηχανισμοί είναι οι παρακάτω:
 Σύστημα Ρενίνης – Αγγειοτενσίνης – Αλδοστερόνης (renin-angiotensin-aldosterone system): σε μείωση

όγκου παρατηρείται αυξημένη έκκριση της ορμόνης ρενίνης από τους νεφρούς, που οδηγεί σε αύξηση της
παραγωγής αγγειοτενσίνης ΙΙ που έχει αγγειοσυσπαστική δράση και έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της
πίεσης του αίματος. Επίσης η αγγειοτενσίνη προκαλεί αύξηση της επαναρρόφησης νατρίου από τους νε-
φρούς και έκκριση αλδοστερόνης από τον φλοιό των επινεφριδίων (η τελευταία επίσης προκαλεί αύξηση
της επαναρρόφησης νατρίου και αποβολής καλίου από νεφρούς και αίσθηση δίψας). Η κατακράτηση να-
τρίου από τα νεφρά αυξάνει την κατακράτηση νερού, που έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση του όγκου του
αίματος και της πίεσης.
 Αντιδιουρητική Ορμόνη: Mείωση στον όγκο και την πίεση του αίματος προκαλεί έκκριση ADH που δρα
στα νεφρά και αυξάνει την επαναρρόφηση του νερού.
 Νεφρός: Ελέγχει τα επίπεδα των συγκεντρώσεων των διαλυτών ουσιών και τον όγκο του νερού με απο-
βολή ή επανακράτηση κυρίως νατρίου και νερού. Συμβαίνει νεφρική αποβολή ούρων ελεύθερων νατρίου
ή αντίθετα μεγάλου φορτίου νατρίου ως απάντηση στην ελαττωμένη ή αυξημένη πρόσληψη νατρίου α-
ντίστοιχα.
 Κολπικό Νατριουρητικό Πεπτίδιο (Atrial natriuretic peptide ή ANP): Εκφράζεται στην καρδιά και ανα-
στέλλει τον άξονα ρενίνης-αγγειοτενσίνης προκαλώντας νατριούρηση (Metheny, 2011· Lobo et al., 2013·
Haws & Haws, 2015).
H ομοιοστατική απάντηση του οργανισμού προς αποκατάσταση της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας

μπορεί να προβλεφθεί με βάση την Εξίσωση 4.6, τροποποιημένη όπως παρακάτω:
𝜋𝜊𝜎ό𝜏𝜂𝜏𝛼 𝜔𝜎𝜇𝜔𝜆ί𝜔𝜈
Τονικότητα ∝ 𝜀𝜉𝜔𝜅𝜐𝜏𝜏ά𝜌𝜄𝜊𝜍 ό𝛾𝜅𝜊𝜍
Ας δούμε πως εφαρμόζεται η Εξίσωση 4.10 στην πρόβλεψη της ομοιοστατικής απάντησης του
οργανισμού σε περίπτωση περίσσειας νατρίου στον εξωκυττάριο χώρο. Εάν λοιπόν, υπάρχει περίσσεια
νατρίου (δηλ. αυξημένα ωσμώλια διαλυμένων σωματιδίων) στο αίμα, η αυξημένη τονικότητα θα
κινητοποιήσει ομοιοστατικούς μηχανισμούς που θα προκαλέσουν αύξηση του εξωκυττάριου όγκου (π.χ. με
95
πόση νερού λόγω δίψας ή με επαναρρόφηση νερού στους νεφρούς), ώστε να επανέλθει η ωσμωτικότητα σε
κανονικά επίπεδα. Αύξηση λοιπόν του αριθμητή της Εξίσωσης 4.10, αντιμετωπίζεται με ομοιοστατική
απάντηση που προκαλεί αύξηση του παρονομαστή της Εξίσωσης 4.10, ώστε να αποκατασταθεί η τονικότητα
του οργανισμού στα φυσιολογικά επίπεδα.
Γενικά η κατακράτηση νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την κατακράτηση νερού, ενώ η απώλεια
νατρίου έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια νερού.
Σύνοψη: Ένας αριθμός οργάνων και μηχανισμών ελέγχει το ισοζύγιο του νερού στον οργανισμό. Το όργανο που
παίζει τον πιο σημαντικό ρόλο στην ωσμωρρύθμιση και ογκορρύθμιση είναι οι νεφροί. Η ωσμωρρύθμιση και
ογκορρύθμιση ρυθμίζονται ορμονικά από υποδοχείς του υποθαλάμου. Αυτοί, μέσω ενδοκρινών αδένων
κινητοποιούν ποικιλία μηχανισμών αποκατάστασης νορμοογκαιμίας και φυσιολογικής τονικότητας που
περιλαμβάνουν τους νεφρούς: Η ποσότητα του νερού που διηθείται από το αίμα και αποβάλλεται στα ούρα
εξαρτάται από τον όγκο του εξωκυττάριου υγρού και την ηλεκτρολυτική σύσταση aυτού την κάθε στιγμή.
4.2.4 Διαταραχές της Ηλεκτρολυτικής Ισορροπίας

Παρακάτω αναφέρονται ο παθοφυσιολογικός μηχανισμός και η κλινική αιτία των πιο κοινών κλινικών
διαταραχών της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας (Weinstein, 2007· Lippincott, 2011· Metheny, 2011):
Υπονατριαιμία (hyponatremia, [Na+] ορού < 135 mmol/L - στην καθημερινή κλινική πράξη, [Na+] ορού <
130 mmol/L): ο βασικός παθοφυσιολογικός μηχανισμός στην υπονατριαιμία είναι η κατακράτηση νερού, η
οποία έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της [Na+] ορού και συνεπαγόμενη μείωση της ωσμωτικότητας του
πλάσματος. Η υπονατριαιμία εκδηλώνεται σε πάσχοντες από συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια, κίρρωση
του ήπατος ή νεφρική ανεπάρκεια. Αποτελεί ακόμα συχνά ιατρογενή επιπλοκή κατά τη παρεντερική
χορήγηση διαλυμάτων, όπου δεν περιέχονται κατάλληλες ποσότητες ηλεκτρολυτών. Ιδιαίτερα χαμηλές
συγκεντρώσεις [Na+] ορού < 120 mmol/L μπορεί να οδηγήσουν στην είσοδο νερού στα εγκεφαλικά κύτταρα
και την πρόκληση εγκεφαλικού οιδήματος.
Υπερνατριαιμία (hypernatremia, όταν [Na+] ορού > 145 mmol/L - στην καθημερινή κλινική πράξη, όταν
[Na+] ορού > 150 mmol/L). Η διαταραχή αυτή έχει ως συνέπεια τη μετακίνηση νερού από το εσωτερικό των
κυττάρων προς τον εξωκυττάριο χώρο (αφυδάτωση). Οι αιτίες που οδηγούν σε υπερνατριαιμία μπορεί να
είναι πολλαπλές. Η υπερνατριαιμία οφείλεται συχνότερα είτε σε απότομη αύξηση της [Na+] ορού σε
περιστατικά δηλητηρίασης με αλάτι ή μετά από σημαντική πόση θαλασσινού νερού, είτε σε σημαντική
απώλεια νερού μέσω της άδηλου αναπνοής (π.χ σε ασθενείς με πυρετό ή εκτεταμένα εγκαύματα, σε
υπερκαπνία, σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες περιβάλλοντος ή μετά από έντονη σωματική άσκηση), είτε τέλος
στην αδυναμία απόκρισης στο αίσθημα δίψας (σε βρέφη ή υπερήλικους ασθενείς). Η υπερνατριαιμία
συνεπάγεται αύξηση της ωσμωτικότητας του πλάσματος.
Υπερκαλαιμία (hyperkalemia, όταν [Κ+] ορού > 5,3 mmol/L): αυξημένα επίπεδα καλίου οφείλονται
συνηθέστερα σε δυσλειτουργία των νεφρών, αλλά μπορούν επίσης να προκληθούν και από εγκαύματα,
κάποιο άλλο είδος τραύματος, ή οποιαδήποτε παθολογική κατάσταση προκαλεί καταστροφή των κυττάρων
των ιστών. Καταστροφή των κυττάρων οδηγεί σε απελευθέρωση του Κ + που είναι το σημαντικότερο
ενδοκυτταρικό κατιόν. Υψηλά επίπεδα καλίου προκαλούν καρδιακές αρρυθμίες και μπορούν να οδηγήσουν
και σε θάνατο, λόγω καρδιακής ανεπάρκειας και ασυστολίας.
Υποκαλαιμία (hypokalemia, όταν [Κ+] ορού < 3,5 mmol/L): Μειωμένα επίπεδα καλίου πολύ συχνά
αντανακλούν μειωμένη πρόσληψη καλίου από τον οργανισμό ή αυξημένη αποβολή του λόγω απώλειας
γαστρεντερικών υγρών ή ως αποτέλεσμα της χρήσης διουρητικών. Εμφανίζεται ατονία των μυών, και μπορεί
ο ασθενής να οδηγηθεί σε καρδιακή αρρυθμία.
Υπάρχει αντίστροφη σχέση μεταξύ των μεταβολών του pH και της [Κ+]. Έτσι κατά την αλκάλωση,
μετακινούνται Η+ από τον ενδοκυττάριο χώρο στον εξωκυττάριο, ενώ κατά την οξέωση, από τον
εξωκυττάριο, προς τον ενδοκυττάριο, προκαλώντας αντίστροφη μετακίνηση Κ +. Συνεπώς όταν το pH
αυξάνεται, η [Κ+] ορού μειώνεται και αντίστροφα.
96
Διαταραχές [Cl-]: Τα επίπεδα των Cl- στον οργανισμό μεταβάλλονται παράλληλα με τα επίπεδα των ιόντων
Na+, παίζοντας τον κυριότερο ρόλο στη διατήρηση της ηλεκτρικής ουδετερότητας των διαμερισμάτων του
οργανισμού. Έτσι, χαμηλά επίπεδα Cl- μπορεί να παρουσιαστούν σε υπονατριαιμία. Υψηλά επίπεδα Cl-
μπορεί να είναι το αποτέλεσμα μειωμένης πρόσληψης υγρών, ή να εμφανιστούν σε νεφρική δυσλειτουργία.
Η [Cl-] μεταβάλλεται αντιστρόφως ανάλογα με την [ΗCO3-] στον οργανισμό, αντανακλώντας έτσι και την
οξεοβασική κατάσταση του ασθενούς. Έτσι, χαμηλά επίπεδα Cl- μπορεί να παρουσιαστούν κατά την απώλεια
οξέων από τον οργανισμό στη μεταβολική αλκάλωση, και σε χρόνια δυσλειτουργία των πνευμόνων.
PaCO2: Σχετικά με τη μέτρηση της PaCO2, ως μέτρο της συγκέντρωσης των [HCO3-] αναφερθήκαμε στις
Ενότητες 4.1.3, 4.1.4 και 4.1.5.1. Τα επίπεδα [HCO3-] ρυθμίζουν την οξεοβασική ισορροπία σε συνάρτηση
με το νάτριο, κάλιο και χλωριόντα.
Διαταραχές στην ωσμωτικότητα: Αναφέρθηκε ότι η μείωση της ωσμωτικότητας είναι αποτέλεσμα είτε
αυξημένης πρόσληψης νερού, είτε υπονατριαιμίας οφειλόμενης σε άλλο αίτιο. Πέραν της υπερνατριαιμίας, η
υπεργλυκαιμία, η υπερουριαιμία, η παρουσία εξωγενών μορίων ή συνδυασμός των παραπάνω μπορεί να
προκαλέσουν αύξηση της τιμής της ωσμωτικότητας του εξωκυττάριου υγρού.
4.2.5 Εργαστηριακές αναλύσεις για τη διάγνωση ηλεκτρολυτικών διαταραχών
Η διάγνωση των ηλεκτρολυτικών διαταραχών στηρίζεται στο ιστορικό, στην κλινική εικόνα, στην φυσική
εξέταση του ασθενούς και τέλος σε σειρά μετρήσεων και εργαστηριακών αναλύσεων: Στα πλαίσια των δύο
τελευταίων εκτιμάται ο εξωκυττάριος όγκος, αξιολογείται ο ρυθμός της διούρησης και μετρούνται η
ωσμωτική πίεση του πλάσματος και των ούρων (εναλλακτικά μπορεί να μετρηθεί το ειδικό βάρος των ούρων
αντί της ωσμωτικότητας), καθώς και η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών σε αίμα και ούρα (Lippincott, 2007·
Metheny, 2011).
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι οι παραπάνω αναλύσεις και αξιολογήσεις δεν πραγματοποιούνται στο
ενδοκυττάριο υγρό, προφανώς λόγω τεχνικών δυσκολιών. Εφόσον όμως διαταραχές στην ηλεκτρολυτική
ισορροπία στο εξωκυττάριο υγρό αντανακλούν εσωκυττάριες διαταραχές μια τέτοια ανάλυση είναι περιττή.
Ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών
Η ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών (electrolyte panel analysis) περιλαμβάνει τον προσδιορισμό
των επιπέδων των ιόντων Νa+, K+, Cl- και HCO3- (PCO2) (Foxall, 2008). Η ανάλυση των ηλεκτρολυτών
πραγματοποιείται όταν ο ασθενής έχει συμπτώματα ανισορροπίας ηλεκτρολυτών (συχνότερα νατρίου) ή
διαταραχές που σχετίζονται με μη φυσιολογικά επίπεδα αυτών. Καθώς διαταραχές στην ηλεκτρολυτική και
οξεοβασική ισορροπία μπορεί να είναι το αποτέλεσμα πολλών οξέων ή χρόνιων παθολογιών, η ανάλυση των
επιπέδων των ηλεκτρολυτών είναι πολύ κοινή σε νοσηλευόμενους ασθενείς και ασθενείς στο τμήμα
επειγόντων περιστατικών. Συνηθέστερα χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση συμπτωμάτων, που
παραπέμπουν σε καρδιακή νόσο και για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας θεραπειών σχετικών
με την αντιμετώπιση υψηλής πίεσης αίματος, καρδιακής ανεπάρκειας, και νόσων των νεφρών και του
ήπατος. Έτσι, συχνά, η ανάλυση των ηλεκτρολυτών συνδυάζεται επίσης με ανάλυση των αερίων του αίματος
και μεταβολιτών. Πέρα από την ανίχνευση διαταραχών στην ηλεκτρολυτική και οξεοβασική ισορροπία
εκτελείται και για την παρακολούθηση σχετικών θεραπειών. Έτσι, είναι χρήσιμη στην εκτίμηση της
συμμόρφωσης ασθενών με δίαιτα φτωχή σε κάποιον ηλεκτρολύτη (συνηθέστερα στο νάτριο). Τα επίπεδα
των ηλεκτρολυτών εκφράζονταν παλαιότερα συνηθέστερα σε mEq/L, ενώ πλέον περισσότερο κοινή είναι η
έκφρασή τους σε mmol/L ή mg/dL.
Διαφορική Διάγνωση
Εκτός των αναλύσεων των ηλεκτρολυτών και της ωσμωτικότητας πλάσματος και ούρων, περαιτέρω
εργαστηριακές αναλύσεις που σχετίζονται με την εκτίμηση της νεφρικής λειτουργίας απαιτούνται για τον
προσδιορισμό της αιτίας των παθολογικών επιπέδων ηλεκτρολυτών στο αίμα. Ως παράδειγμα, σε διαφορική
διάγνωση της υπερνατριαιμίας ή της υπονατριαιμίας (differential diagnosis), οι αναλύσεις περιλαμβάνουν:
 ηλεκτρολύτες πλάσματος (K+, Na+, Cl-, HCO3-),
97
 ηλεκτρολύτες ούρων 24ώρης συλλογής (K+, Na+),
 ωσμωτικότητα πλάσματος και ούρων (ή ειδικό βάρος ούρων),
 γλυκόζη ορού,
 ουρία ορού και ούρων,
 κρεατινίνη ορού,
 ουρικό οξύ ορού,
 άζωτο ουρίας αίματος (BUN),
 όγκος ούρων 24ώρου.
Επιπλέον για τη διάγνωση της υπονατριαιμίας αναλύονται τα επίπεδα κορτιζόλης (Cortisol) και
θυρεοτρόπου ορμόνης (TSH).
Η αναλυτική επεξήγηση της διαφορικής διάγνωσης των διαταραχών των ηλεκτρολυτών δεν
εντάσσεται στους διδακτικούς σκοπούς αυτού του συγγράμματος. Σύντομα θα αναφερθεί ότι εάν η αιτία της
υπονατριαιμίας οφείλεται σε ανεπαρκή πρόσληψη νατρίου, η [Na+] στα ούρα και στον ορό θα είναι χαμηλή.
Εάν, αντίθετα, η αιτία οφείλεται σε νεφρική δυσλειτουργία, η [Na+] στα ούρα θα είναι υψηλή, λόγω
νεφρικών απωλειών, ενώ στον ορό θα είναι χαμηλή. Υψηλή [Na+] ούρων και χαμηλή [Na+]ορού είναι επίσης
συμβατή με κατακράτηση νερού. Χαμηλή [Na+] ορού και υψηλή ωσμωτικότητα αποτελεί ένδειξη
υπεργλυκαιμίας ή υψηλής συγκέντρωσης ουρίας, αφού η παρουσία της γλυκόζης ή της ουρίας σε αυξημένα
επίπεδα αυξάνει τον φαινόμενο όγκο του εξωκυττάριου υγρού, μειώνοντας έτσι τη φαινόμενη συγκέντρωση
[Νa+]ορού, ενώ παράλληλα αυξάνουν και την ωσμωτικότητα σύμφωνα με την Εξίσωση 4.8. Τέλος, χαμηλή
[Na+] ορού και φυσιολογική ωσμωτικότητα αποτελεί ένδειξη υπερλιπιδαιμίας, αφού τα υψηλά λιπαρά
αυξάνουν τον φαινόμενο όγκο του εξωκυττάριου υγρού, μειώνοντας τη φαινόμενη συγκέντρωση [Νa +] ορού,
ενώ δε συμβάλουν στην ωσμωτικότητα. Χαμηλή [Na+] και χαμηλή ωσμωτικότητα μετρούνται σε
υπονατριαίμια είτε λόγω χαμηλής πρόσληψης Νa, είτε λόγω αραίωσης του Νa σε υψηλή πρόσληψη νερού.
Ένας κλινικός διαγνωστικός αλγόριθμος υπονατριαιμίας παρουσιάζεται αναλυτικά στην
βιβλιογραφία από τους Milionis και συνεργάτες (Milionis et al., 2002· Zaoutis & Chiang, 2007). Η τελευταία
βιβλιογραφική πηγή περιλαμβάνει και διαγνωστικό αλγόριθμο υπερνατριαιμίας. Τέλος, κλινικός
διαγνωστικός αλγόριθμος για την υπερκαλαιμία αναφέρεται από τους Burtis A. και συνεργάτες (Burtis et al.,
2007).
Χάσμα Ανιόντων
Μία εισαγωγή στην έννοια του χάσματος ανιόντων (anion gap [AG]) έγινε στην Ενότητα 4.1.5.2.
Υπολογίζεται από τις Εξισώσεις 4.4 ή 4.5.
ΑG = [Να+]- ([Cl- ] +[ΗCΟ3-]) (Εξίσωση 4.4)
ΑG = ([Νa+]+ [K+])- ([Cl- ] +[ΗCΟ3-]) (Εξίσωση 4.5)
Αναφέρθηκε ότι στην κλινική πρακτική το panel των ηλεκτρολυτών περιλαμβάνει τον προσδιορισμό
των επιπέδων Na+, K+, Cl- και HCO3-. Κατά συνέπεια, σύμφωνα με το γράφημα «Gamblegram» του
Σχήματος 4.8, ο υπολογισμός με την Εξίσωση 4.4 δεν περιλαμβάνει τα περίπου 7 mmol/L των υπόλοιπων
κατιόντων (Ca++, Mg++) καθώς και τα περίπου 23 mmol/L των υπόλοιπων ανιόντων του οργανισμού
(φωσφορικών, θεϊκών, οργανικών οξέων, πρωτεϊνών). Ως αποτέλεσμα, το χάσμα ανιόντων σύμφωνα με την
Εξίσωση 4.5, θα πρέπει σε ηλεκτρολυτική ισορροπία να δίνει τιμή (23 - 7) mmol/L= 16 mmol/L. Στη πράξη,
τιμές 10 - 20 mmol/L θεωρούνται μη ενδεικτικές ηλεκτρολυτικής διαταραχής.
Το χάσμα ανιόντων επηρεάζεται από αλλαγές στη συγκέντρωση των μετρούμενων αλλά και των μη
μετρούμενων ανιόντων. Η πιο κοινή μεταβολή είναι η αύξηση του χάσματος ανιόντων λόγω συσσώρευσης
όξινων μεταβολιτών (όπως κετοξέων ή ανόργανων οξέων [φωσφορικού, θειϊκού]), σε παθολογικές
καταστάσεις των νεφρών ή σε μη ελεγχόμενο διαβήτη. Λιγότερο συχνά παρατηρείται μείωση του χάσματος
ανιόντων, όπως σε περιπτώσεις υποαλβουμιναιμίας (η οποία παρατηρείται σε πολλές νόσους) ή σε αύξηση
της θετικά φορτισμένης παραπρωτεΐνης, χαρακτηριστικό εργαστηριακό εύρημα της νόσου του πολλαπλού
μυελώματος.
98
Ωσμωτικότητα
Η εκτίμηση της ωσμωτικότητας κλινικών δειγμάτων γίνεται είτε με απευθείας μέτρησής της με ωσμώμετρο,
είτε, κυρίως στην περίπτωση της ωσμωτικότητας των ούρων, έμμεσα μέσω υπολογισμού του ειδικού βάρους
των ούρων. Η τιμή ωσμωτικότητας που προσδιορίζεται με τη βοήθεια των ωσμωμέτρων (ή μέσω του ειδικού
βάρους) καλείται μετρούμενη ωσμωτικότητα (measured osmolarity). Πέραν της ενόργανης μέτρησής της,
συχνά στην κλινική πρακτική υπολογίζεται η ωσμωτικότητα με βάση άλλες προσδιοριζόμενες κλινικές
παραμέτρους μεταξύ των οποίων και η συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών (υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα ή
calculated osmolarity).
Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα
Αναφέρθηκε στην Ενότητα 4.2.1. ότι η ωσμωτικότητα του ορού οφείλεται σχεδόν εξ’ολοκλήρου στα
περιεχόμενα Νa+ και τα ανιόντα που τα συνοδεύουν. Τα μόρια της γλυκόζης επίσης έχουν μια μικρότερη
συνεισφορά στην υπολογιζόμενη τιμή της ωσμωτικότητας. Έτσι η υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα
(calculated osmolarity) προαναφέρθηκε ότι δίνεται από τις Εξισώσεις 4.8 και 4.9:
Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (mmol/L) = 2[Na+] + [urea] + [glucose] (Εξίσωση 4.8)
Όπου οι [Na+] , [glucose] και [urea] είναι εκφρασμένες σε mmol/L.
Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (mOsm/L)= 2 [Na+] + ([glucose] / 18) + (ΒUN / 2,8) (Εξίσωση 4.9)
όπου η [Na+] είναι εκφρασμένη σε mmol/L (ίσο με mOsmol/L), ενώ οι [glucose] και [urea] εκφράζονται σε
mg/dL.
Στην κλινική πρακτική, οι παραπάνω εξισώσεις χρησιμοποιούνται και διαφοροποιημένες, όπου και
η [Κ+] συμμετέχει στον υπολογισμό της ωσμωτικότητας.
Η χρησιμότητα του υπολογισμού της ωσμωτικότητας έγκειται στην έννοια του ωσμωτικού
χάσματος (Osmolal gap), όπου:
Ωσμωτικό Xάσμα = Μετρούμενη Ωσμωτικότητα − Υπολογιζόμενη Ωσμωτικότητα (Εξίσωση 4.11)
Τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής μπορεί να αποτελεί ένδειξη

υπερλιπιδαιμίας ή υπερπρωτεϊναιμίας. Στις δύο αυτές παθολογικές καταστάσεις, τα λιπίδια ή οι πρωτεΐνες
αντίστοιχα καταλαμβάνουν μεγάλο μέρος του εξωκυττάριου όγκου οδηγώντας σε προσδιορισμό ψευδώς
μειωμένης τιμής [Na+] ορού και [Κ+] ορού. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε ψευδώς μειωμένη τιμή
υπολογιζόμενης ωσμωτικότητας και κατά συνέπεια τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής.
Τιμή ωσμωτικού χάσματος υψηλότερη της φυσιολογικής μπορεί επίσης να οφείλεται σε αύξηση άλλων
ενδογενών μορίων όπως κετονικών οξέων σε κετοξέωση.
Ο υπολογισμός του ωσμωτικού χάσματος χρησιμοποιείται συχνά και στην τοξικολογία, όπου
αυξημένη τιμή του αποτελεί ένδειξη λήψης δηλητηρίου, αιθανόλης, αιθυλενικής γλυκόλης, μεθανόλης ή
ισοπροπανόλης. Η ένδειξη πρέπει ασφαλώς να επιβεβαιωθεί με χρωματογραφική ανάλυση ορού.
Καθώς τα νεφρά λειτουργούν ως ένα φίλτρο, που προσαρμόζουν τη διέλευση νερού και
διαλυμένων ουσιών ώστε να διατηρείται η ομοιόσταση του οργανισμού είναι αναμενόμενο το εύρος των
τιμών αναφοράς της ωσμωτικότητας των ούρων να είναι ιδιαίτερα μεγάλο.
Σημαντική είναι και η διαγνωστική αξία του λόγου ωσμωτικότητα ούρων 24ώρου/ωσμωτικότητα
ορού. Τιμή του λόγου αυτού μεγαλύτερης της μονάδας είναι φυσιολογική. Αντίθετα, τιμή ίση ή ελαφρώς
ανώτερη της μονάδας υποδηλώνει διαταραχή της νεφρικής λειτουργίας, εφόσον ουσιαστικά δεν λαμβάνει
χώρα διήθηση του ορoύ από τους νεφρούς. Τιμή του λόγου μικρότερη της μονάδας, μετριέται σε ασθενείς με
άποιο διαβήτη (diabetes insipidus), (Lord, 1999· Strasinger & Di Lorenzo, 2014).
99
Σχετική Πυκνότητα (Ειδικό Βάρος)
Απουσία ωσμωμέτρου, αντί της ωσμωτικότητας των ούρων μετράται εναλλακτικά η σχετική πυκνότητα
των ούρων που καλείται και ειδικό βάρος, (relative density ή specific gravity). Κάτω από καθορισμένες
συνθήκες, υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ ειδικού βάρους και ωσμωτικότητας. Ορισμένες όμως
παθολογικές καταστάσεις και η λήψη κάποιων φαρμάκων οδηγούν σε εσφαλμένη εκτίμηση της
ωσμωτικότητας, μέσω της μέτρησης του ειδικού βάρους. Έτσι η ενόργανη μέτρηση της ωσμωτικότητας
προτιμάται αυτής της σχετικής πυκνότητας, όπου υπάρχει η δυνατότητα επιλογής.
Στην κλινική ανάλυση, η σχετική πυκνότητα του ορού ή ούρων (dσχ) ορίζεται ως ο λόγος της μάζας
(mχ) ορισμένου όγκου (Vχ) του ορού ή ούρων, προς τη μάζα (mΗ2Ο) ίσου όγκου νερού (Vχ), όπως στην
Εξίσωση 4.12.
𝑚𝜒
𝑑𝜎𝜒 = (Εξίσωση 4.12)
𝑚𝛨2 𝑂
Η τιμή του ειδικού βάρους εξαρτάται από τη θερμοκρασία και κατά κανόνα η θερμοκρασία
αναφοράς είναι 20◦C. Καθώς τα ούρα είναι ουσιαστικά υδατικά διαλύματα, που περιέχουν διαλυμένα
ποικιλία συστατικών, η σχετική πυκνότητά τους αποτελεί μέτρο της πυκνότητας των συστατικών που
εμπεριέχονται. Κατά συνέπεια, το ειδικό βάρος των ούρων καθορίζεται από το πλήθος αλλά και το μέγεθος
των διαλυμένων συστατικών. Έτσι, η συνεισφορά των μεγαλύτερων σε μέγεθος μορίων στην τιμή του
ειδικού βάρους είναι μεγαλύτερη. Αντιθέτως η τιμή της ωσμωτικότητας καθορίζεται μόνο από το πλήθος των
διαλυμένων συστατικών. Έτσι, απαιτείται διόρθωση της μετρούμενης τιμής του ειδικού βάρους των ούρων
με βάση το περιεχόμενο τους σε μόρια που κλασσικά δεν απαντώνται εκεί, όπως η γλυκόζη και οι πρωτεΐνες.
Τιμή ειδικού βάρους 1,010 αντιστοιχεί σε φυσιολογική ωσμωτικότητα ούρων 320 mOsm/kg.
Καθώς όμως η ωσμωτικότητα των ούρων αποτελεί συνάρτηση των προσλαμβανόμενων με την τροφή
συστατικών, η τιμή του ειδικού βάρους μπορεί να διαφοροποιείται ελαφρώς από τη μία μέρα στην άλλη.
Μάλιστα, μη διαφοροποίηση της τιμής του ειδικού βάρους δεν θεωρείται φυσιολογική και συνήθως αποτελεί
ένδειξη νεφρικής δυσλειτουργίας (Strasinger & Di Lorenzo, 2014).
Στον Πίνακα 4.4 φαίνονται ενδεικτικές τιμές αναφοράς των κυριότερων παραμέτρων της
ηλεκτρολυτικής ισορροπίας. Οι τιμές αυτές διαφοροποιούνται ελαφρώς ανάλογα με τη βιβλιογραφική πηγή,
ιδίως όσον αφορά το χάσμα ανιόντων και την ωσμωτικότητα. Έτσι, για την αξιολόγηση των εργαστηριακών
αποτελεσμάτων απαιτείται ο προσδιορισμός του διαστήματος αναφοράς από το ίδιο εργαστήριο όπου
πραγματοποιείται η ανάλυση.
Σύνοψη: Η διάγνωση των ηλεκτρολυτικών διαταραχών στηρίζεται στο ιστορικό, στην κλινική εικόνα, στη
φυσική εξέταση του ασθενούς στη μέτρηση του εξωκυττάριου όγκου, στην αξιολόγηση του ρυθμού διούρησης,
στη μέτρηση της ωσμωτικότητας του πλάσματος και των ούρων (εναλλακτικά το ειδικό βάρος των ούρων αντί
της ωσμωτικότητας), καθώς και στη συγκέντρωση των ηλεκτρολυτών σε αίμα και ούρα..
Η ανάλυση των επιπέδων των ηλεκτρολυτών (electrolyte panel analysis) περιλαμβάνει τυπικά τον
προσδιορισμό των επιπέδων των ιόντων νατρίου, καλίου, χλωριόντων και διττανθρακικών.
Ο προσδιορισμός της ωσμωτικότητας κλινικών δειγμάτων γίνεται είτε με απευθείας μέτρησή της με
ωσμώμετρο, είτε μέσω υπολογισμού του ειδικού βάρους των ούρων, είτε τέλος υπολογίζεται βάσει εξίσωσης.
Ο υπολογιστικός προσδιορισμός του ωσμωτικού χάσματος, του χάσματος ανιόντων και του λόγου
ωσμωτικότητα ούρων 24ώρου/ωσμωτικότητα ορού έχουν επίσης διαγνωστική αξία.
Η ισορροπία των ιόντων νατρίου, καλίου, χλωριόντων και διττανθρακικών στο αίμα, αποτελεί μία καλή ένδειξη
τις λειτουργικότητας των νεφρών και της καρδιάς.
100
Κλινική Παράμετρος Τιμές Αναφοράς
[Νa+] ορού 135 - 145 mmol/L
[Κ+] ορού 3,5 - 5,5 mmol/L
[Mg++] ορού 1,5 - 2,5 mmol/L
[Ca++] ορού 4,65 - 5,28 mg/dL
[Caολικό] ορού 8,2 - 10,2 mg/dL
[Cl- ] ορού 96 - 106 mmol/L
[PO4-] ορού 2,7 - 4,5 mg/dL
Ωσμωτικότητα Ορού 275 - 298 mOsm/L
Ωσμωτικότητα Ούρων 250 - 1200 mOsm/L
Ωσμωτικότητα Ούρων 24ώρου 400 - 600 mOsm/Kg
Ειδικό Βάρος Ούρων 1,005 - 1,030
Χάσμα Ανιόντων 8 - 12 mmol/L ή 12 - 16 mmol/L, ανάλογα με το εάν στον
προσδιορισμό του χρησιμοποιείται η Εξίσωση 4.4 ή 4.5
αντίστοιχα
Ωσμωτικό Χάσμα < 10 mOsm/kg
PaCO2 32 - 43 mmHg ♀, 35 – 46 mmHg ♂
Πίνακας 4.4 Τιμές αναφοράς ηλεκτρολυτών και άλλων κλινικών παραμέτρων, που χαρακτηρίζουν την ηλεκτρολυτική
ισορροπία.
4.2.6 Οργανολογία
Προφυλάξεις κατά το προαναλυτικό στάδιο

Για τον προσδιορισμό των παραμέτρων της ηλεκτρολυτικής ισορροπίας στο εξωκυττάριο υγρό μπορεί να
χρησιμοποιηθεί ορός ή πλάσμα. Υπάρχουν μια σειρά από προφυλάξεις που πρέπει να τηρούνται κατά το
προαναλυτικό στάδιο, όπως αναφέρονται παρακάτω:
 Ο ορός και το πλάσμα πρέπει να διαχωρίζονται από τα έμμορφα συστατικά ταχύτατα μετά τη λήψη, ώστε
να μην λαμβάνει χώρα λύση κυττάρων (κι απελευθέρωση ενδοκυττάριου K +), αλλά και να αποφεύγεται
ανταλλαγή ιόντων μεταξύ ορού και μεταλλοπρωτεϊνών.
 Ως αντιπηκτικό κατά τη δειγματοληψία πρέπει να προτιμάται το ηπαρινικό αμμώνιο, χωρίς προσμίξεις
μετάλλων. Σε περίπτωση που χρησιμοποιηθούν, ως αντιπηκτικά, άλατα του EDTA με μέταλλα, ή κιτρικά
ή οξαλικά τέτοια άλατα, η συνεισφορά τους στη μετρούμενη ωσμωτικότητα του πλάσματος θα είναι ιδιαί-
τερα μεγάλη, αλλοιώνοντας το αποτέλεσμα. Επίσης, EDTA ή οξαλικά αντιπηκτικά είναι ακατάλληλα διό-
τι δεσμεύουν ιόντα Ca++ και Mg++ του δείγματος.
 Η φλεβοκέντηση κατά την αιμοληψία πρέπει να γίνεται γρήγορα ώστε να μην υπάρχει στάση του αίματος.
Σε διαφορετική περίπτωση, μέταλλα όπως το Ca++ και Mg++ είναι δυνατόν να αποσπαστούν από τις πρω-
τεΐνες που τα περιέχουν, δίνοντας ψευδώς αυξημένες συγκεντρώσεις αυτών στο αίμα.
 Aποθήκευση επί μακρόν δειγμάτων αίματος πριν την ανάλυσή των ηλεκτρολυτών πρέπει να αποφεύγεται.
Αυτό, διότι λαμβάνει χώρα λύση λευκών και ερυθρών αιμοσφαιρίων, προκαλώντας τη σημαντική αύξηση
της [K+] ορού.
4.2.6.1 Αναλύσεις ηλεκτρολυτών
Οι αναλύσεις των ηλεκτρολυτών αποτελούν από τις πιο τακτικά εκτελούμενες εργαστηριακές αναλύσεις σε
κλινικά δείγματα. Στην καθημερινή κλινική πρακτική προσδιορίζονται μόνο οι ηλεκτρολύτες Na+, K+, Cl- και
HCO3- (ο τελευταίος μέσω της PCO2). Η ανάλυση τους καλείται panel ηλεκτρολυτών (electrolyte panel).
Αρχικά θα αναφερθούν περιληπτικά δύο παλαιότερες τεχνολογίες προσδιορισμού ιόντων που πλέον έχουν
περιορισμένη εφαρμογή σε κλινικούς προσδιορισμούς ηλεκτρολυτών και στη συνέχεια θα αναπτυχθεί η
τεχνολογία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων, που πλέον σχεδόν αποκλειστικά εφαρμόζεται στον
προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών σε κλινικά δείγματα. Τέλος, θα γίνει αναφορά στην εφαρμογή
101
κλασικών μεθόδων ποσοτικής χημικής ανάλυσης για τον προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών. Ο προσδιορισμός
της PCO2 στα πλαίσια του panel ηλεκτρολυτών, πραγματοποιείται με Ηλεκτρόδιο Severinghaus, όπως
περιγράφηκε στην Ενότητα 4.1.7.1.
Φλογοφωτομετρία
Είναι γνωστό στον αναλυτικό χημικό ότι τα αλκάλια και οι αλκαλικές γαίες καιόμενα εκπέμπουν
ακτινοβολία χαρακτηριστικού χρώματος (π.χ. κόκκινου χρώματος το Ca++, ή κίτρινου χρώματος το Na+, ή
ιώδους χρώματος το Κ+). Η τεχνική της φλογοφωτομετρίας (flame spectrometry) εκμεταλλεύεται αυτήν την
ιδιότητα των αλκαλίων και αλκαλικών γαιών για τη μέτρηση της συγκέντρωσης τους σε διαλύματα αυτών,
περιλαμβανομένων και κλινικών υγρών. Η φλογοφωτομετρία βασίζεται στη θερμική διέγερση ατόμων εντός
φλόγας και τη μέτρηση της εκπεμπόμενης χαρακτηριστικής (κατά άτομο) ακτινοβολίας κατά την
αποδιέγερσή τους. Προκειμένου να επιτευχθεί η ατομοποίηση των συστατικών του υγρού δείγματος, το
δείγμα υπό μορφή αερολύματος αναμιγνύεται με καύσιμο αέριο και αέρα και εισάγεται σε φλόγα, όπου
αρχικά λαμβάνει χώρα η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του
δείγματος και ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα διεγείρονται θερμικά σε ανώτερες ενεργειακές
καταστάσεις. Η τεχνική της φλογοφωτομετρίας βρίσκει συνεπώς εφαρμογή στην κλινική ανάλυση στον
ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό ηλεκτρολυτών. Το μήκος κύματος της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας
εξαρτάται από την ταυτότητα του ηλεκτρολύτη, ιδιότητα στην οποία στηρίζεται η ταυτοποίηση του
ηλεκτρολύτη. Επίσης η ένταση της εκπεμπόμενης ακτινοβολίας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του
αναλυόμενου ηλεκτρολύτη. Αυτό επιτρέπει και τον ποσοτικό προσδιορισμό του ηλεκτρολύτη, μετά από
κατασκευή καμπύλης αναφοράς με χρήση προτύπων διαλυμάτων αυτού.
Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η περιορισμένη περιοχή γραμμικότητας αυτής και η μη
δυνατότητα εφαρμογής της σε φορητούς αναλυτές. Άλλο μειονέκτημα αποτελούν οι κίνδυνοι που συνδέονται
με τη χρήση σε εργαστήριο εύφλεκτων αερίων και με τη χρήση διάταξης με φλόγα, αλλά και ο μεγαλύτερος
χρόνος βαθμονόμησης που απαιτείται σε σχέση με τη χρήση ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων.
Τα βασικά μέρη μίας διάταξης φλογoφωτόμετρου φαίνονται διαγραμματικά στo Σχήμα 4.11.
Αναφέρονται παρακάτω, ενώ επεξηγείται σύντομα και η λειτουργία τους:
 σύστημα εισόδου του δείγματος με αναρρόφηση (sample aspirator),

 εκνεφωτής (nebulizer): Μέσω του εκνεφωτή το προς ανάλυση υγρό δείγμα μετατρέπεται σε αερόλυμα,
 καυστήρας (burner): Το αερόλυμα του δείγματoς εισάγεται στη συνέχεια στη φλόγα, όπου αρχικά λαμ-
βάνει χώρα η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του δείγμα-
τος και ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα διεγείρονται θερμικά σε ανώτερες ενεργειακές καταστά-
σεις,
 κάτοπτρο (mirror),
 αναλυτής φάσματος εκπομπής (φίλτρο ή μονοχρωμάτορας, filter ή monochromator): απομονώνει την
εκπεμπόμενη ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (π.χ. για το Na+ είναι 589 nm, για το K+ 766
nm) που ανταποκρίνεται στον ηλεκτρολύτη που ενδιαφερόμαστε να αναλύσουμε,
 ανιχνευτής (detector),
 ενισχυτής - φωτοπολλαπλασιαστής (amplifier - photomultiplier),
 καταγραφέας (recorder).
Η τεχνική είναι γνωστή και ως φλογοφασματοσκοπία εκπομπής (Flame Emission Spectroscopy ή

FES) όταν μονοχρωμάτορας, αντί φίλτρου, χρησιμοποιείται για την απομόνωση της εκπεμπόμενης
ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος (Burtis et al., 2007).
Φασματοσκοπία Ατομικής Απορρόφησης
Η τεχνική της Φασματοσκοπίας Aτομικής Απορρόφησης (Atomic Absorption Spectrometry ή ΑΑS)

βασίζεται στη μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας από άτομα που βρίσκονται στη θεμελιώδη
ενεργειακή κατάσταση, εντός φλόγας. Η τεχνική της ΑΑS χρησιμοποιείται σε μετρήσεις της συγκέντρωσης
μετάλλων/ιχνοστοιχείων σε διάφορα υποστρώματα, συμπεριλαμβανομένων και των κλινικών υγρών.
102
Προκειμένου να επιτευχθεί η ατομοποίηση των συστατικών ενός υγρού δείγματος, το δείγμα υπό μορφή
αερολύματος αναμειγνύεται με καύσιμο αέριο και αέρα και εισάγεται σε φλόγα, όπου αρχικά λαμβάνει χώρα
η εξάτμιση του διαλύτη, ενώ στη συνέχεια εξατμίζονται τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος και
ατομοποιούνται. Τα περιεχόμενα άτομα απορροφούν προσπίπτουσα ακτινοβολία, σε συγκεκριμένο μήκος
κύματος για κάθε άτομο. Ουσιαστικά πρόκειται για μία παραλλαγή της φλογοφασματοσκοπίας εκπομπής. Οι
βασικότερες διαφορές των δύο τεχνικών έγκεινται στον τρόπο διέγερσης των ατόμων (θερμικά για την FES
και μετά από απορρόφηση ακτινοβολίας για την AAS) και στο μετρούμενο σήμα (εκπομπή ακτινοβολίας ή
απορρόφηση ακτινοβολίας αντίστοιχα). Στην κλινική ανάλυση η AAS βρίσκει συνεπώς εφαρμογή στον
ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό ιχνοστοιχείων, συμπεριλαμβανομένων των ηλεκτρολυτών. Το μήκος
κύματος της απορροφούμενης ακτινοβολίας εξαρτάται από την ταυτότητα του μετάλλου, ιδιότητα στην
οποία στηρίζεται η ταυτοποίηση του ηλεκτρολύτη. Επίσης η απορρόφηση της ακτινοβολίας συγκεκριμένου
μήκους κύματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του αναλυόμενου ηλεκτρολύτη που απορροφά στο μήκος
κύματος αυτό, σύμφωνα με τον νόμο των Beer-Lambert (Κεφάλαιο 1). Αυτό επιτρέπει και τον ποσοτικό
προσδιορισμό του ηλεκτρολύτη, μετά από κατασκευή καμπύλης αναφοράς με χρήση προτύπων διαλυμάτων.
Πλεονέκτημά της AAS σε σχέση με την FES αποτελεί η αυξημένη ευαισθησία της πρώτης και η ευρύτερη
περιοχή γραμμικότητάς της (Drees & Wu, 2009).
Τα βασικά μέρη μιας διάταξης φασματοφωτόμετρου ατομικής απορρόφησης είναι τα ίδια με αυτά
μιας διάταξης φλογoφωτόμετρου, με μοναδική προσθήκη μίας λυχνίας πολλαπλών στοιχείων που εκπέμπει
ακτινοβολία χαρακτηριστικού για κάθε ηλεκτρολύτη μήκους κύματος, όπως φαίνεται στο ένθετο του
Σχήματος 4.11.
Σχήμα 4.11 Σχηματική αναπαράσταση διάταξης φλογοφωτόμετρου και φασματοφωτόμετρου ατομικής απορρόφησης. Η
λυχνία που εμφανίζεται μέσα σε ένθετο, αποτελεί τη μόνη προσθήκη που διακρίνει ένα φασματοφωτόμετρο ατομικής
απορρόφησης από ένα φλογοφωτόμετρο.
Aυτόματοι Αναλυτές Ηλεκτρολυτών
Ο προσδιορισμός των παραμέτρων που χαρακτηρίζουν την ηλεκτρολυτική ισορροπία γίνεται με τη χρήση
αυτόματων εργαστηριακών και παρακλίνιων αναλυτών (Chin et al., 2012). Πάρα πολύ συχνά οι αναλυτές
αυτοί συνδυάζονται με τους αναλυτές αερίων που περιγράφηκαν αναλυτικά στο Κεφάλαιο 4.1.7.1. Για τη
μέτρηση του panel των ηλεκτρολυτών με τους αυτόματους αναλυτές χρησιμοποιείται η τεχνολογία των
ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων. Στη Φωτογραφία 4.5 φαίνεται αυτόματος βιοχημικός αναλυτής, που
προσδιορίζει μεταξύ άλλων παραμέτρων [Κ+], [Νa+], [Cl-] με ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια.
103
Ιοντοεπιλεκτικά Ηλεκτρόδια (Ποτενσιομετρικός Προσδιορισμός)
Βασικά πλεονεκτήματα της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων (Ion Selective Electrodes ή
ISE) σε σχέση με τη Φασματοσκοπία Ατομικής Απορρόφησης ή τη Φλογοφωτομετρία αποτελούν το χαμηλό
κόστος ανάλυσης, η ταχύτητα της ανάλυσης και η ευκολία χειρισμού και ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Το
σημαντικότερο όμως πλεονέκτημα είναι η δυνατότητα προσαρμογής της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών
ηλεκτροδίων σε πολύ μικρή κλίμακα επιτρέποντας την ανάλυση του panel ηλεκτρολυτών με Oλοκληρωμένα
Hλεκτρονικά Kυκλώματα (microchips) σε παρακλίνιους αναλυτές (Ενότητα 4.1.7.1), παράλληλα με την
ανάλυση κλινικών παραμέτρων που περιγράφουν την άμεσα συνδεόμενη οξεοβασική ισορροπία του
οργανισμού.
Η αρχή λειτουργίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων είναι ανάλογη με την αρχή λειτουργίας του
ηλεκτροδίου υάλου (Ηλεκτροδίου Υδρογόνου), που αναφέρθηκε στην Ενότητα 4.1.7.1. Το συγκεκριμένο ιόν
για το οποίο είναι εκλεκτικό το ηλεκτρόδιο, διεισδύει μέσω μιας περατής από αυτό μεμβράνης από το
βιολογικό δείγμα σε ένα εσωτερικό διάλυμα ηλεκτρολύτη όπου ανάγεται στην κάθοδο (για τα κατιόντα) ή
οξειδώνεται στην άνοδο (για τα ανιόντα). Η προκύπτουσα διαφορά δυναμικού είναι ανάλογη προς τη
συγκέντρωση του διαλυμένου ιόντος. Συγκρινόμενο με το δυναμικό που αναπτύσσεται σε πρότυπα
διαλύματα γνωστής συγκέντρωσης προσδιορίζεται η άγνωστη συγκέντρωση του ηλεκτρολύτη στο δείγμα, με
βάση την εξίσωση του Nernst.
Το ηλεκτρόδιο υδρογόνου είναι το πιο κοινό ιοντοεπιλεκτικό ηλεκτρόδιο. Παρόλο που ηλεκτρόδια
επιλεκτικά για κάποια ιόντα, πράγματι λειτουργούν με ευκολία και απλότητα αντίστοιχης αυτής του
ηλεκτροδίου υάλου, αυτό δεν ισχύει για το σύνολο των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων.
Παράγοντες όπως:
 H μειωμένη εκλεκτικότητα κάποιων ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων, η οποία έχει ως αποτέλεσμα παρε-
μποδίσεις από άλλα ιόντα, που τυχόν εμπεριέχονται στο μετρούμενο διάλυμα,
 H περιορισμένη γραμμική περιοχή και υψηλότερο όριο ανίχνευσης των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων σε
σχέση με το ηλεκτρόδιο υδρογόνου,
 H ικανοποιητική λειτουργία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων μόνο εντός περιορισμένων τιμών pH,
 αποτελούν σημαντικά εμπόδια στην εφαρμογή της τεχνολογίας των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων στη
μέτρηση όλων των κλινικά σχετικών ιόντων. Παρ’ όλα αυτά, εάν ληφθούν κατάλληλες σχετικές προφυ-
λάξεις κατά την ανάλυση, η τεχνολογία των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων γίνεται ένα πολύ χρήσιμο α-
ναλυτικό εργαλείο, που επιτρέπει τον προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών σε κλινικά δείγματα με απλότητα
χειρισμού και χαμηλό κόστος ανάλυσης (Burtis et al., 2007).
Τα ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια που είναι ενσωματωμένα στους αυτόματους αναλυτές θεωρούνται
αναλώσιμα και πρέπει να αντικαθίστανται μετά από συγκεκριμένο αριθμό αναλύσεων.
Καινοτομία στον χώρο των ιοντοεπιλεκτικών ηλεκτροδίων αποτελεί η τεχνολογία Integrated
Multisensor Technology (IMT): Η τεχνολογία αυτή συνδυάζει τον παράλληλο προσδιορισμό των [K +],
[Na+], [Cl-] σε κλινικό δείγμα. Το μετρούμενο ηλεκτρικό δυναμικό είναι ανάλογο του λογάριθμου της
συγκέντρωσης του κάθε αναλύτη στο δείγμα.
104
Φωτογραφία 4.5 Αυτόματος βιοχημικός αναλυτής (Roche Hitachi 902) που διαθέτει ενσωματωμένα τρία Ιοντοεπιλεκτικά
Ηλεκτρόδια για τον προσδιορισμό [Κ+], [Νa+], [Cl-].
Κλασικές Μέθοδοι Ποσοτικής Χημικής Ανάλυσης
Μία τελευταία κατηγορία μεθοδολογιών ποσοτικού προσδιορισμού ηλεκτρολυτών, βασίζεται σε κλασικές

τεχνικές ποσοτικής χημικής ανάλυσης, όπως τιτλομετρήσεις καταβύθισης, σταθμική ανάλυση και
συμπλοκομετρικές τιτλομετρήσεις, αλλά και σε κουλομετρικές τεχνικές. Η παραπάνω κατηγορία
μεθοδολογιών εφαρμόζεται πλέον περιορισμένα στην κλινική ανάλυση δευτερευόντων ηλεκτρολυτών (Ca++,
Mg++, PΟ4--- κ.α), ενώ έχει καταστεί πρακτικά απαρχαιωμένη στην ανάλυση του panel των ηλεκτρολυτών
(K+, Na+, Cl-).
Υπάρχει στη βιβλιογραφία μία μεγάλη πληθώρα σχετικών μεθοδολογιών, οι περισσότερες από τις
οποίες βασίζονται στις παρακάτω αρχές:
 Παρουσία κατάλληλου αντιδραστηρίου, δημιουργείται έγχρωμη σύμπλοκη ένωση με τον ηλεκτρολύτη. Η
απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη στο κλινικό
δείγμα.
 Παρουσία γνωστής συγκέντρωσης κατάλληλου αντιδραστηρίου, δημιουργείται αδιάλυτη ένωση με τον
ηλεκτρολύτη, η οποία καταβυθίζεται. Το παραμένον σε διάλυμα αντιδραστήριο προσδιορίζεται ποσοτικά
μέσω σχηματισμού διαλυτού έγχρωμου συμπλόκου μετά από προσθήκη κατάλληλης ουσίας. Έτσι υπολο-
γίζεται η ποσότητα του αντιδραστηρίου που καταβυθίστηκε και εμμέσως η συγκέντρωση του ηλεκτρολύ-
τη.
 Κατάλληλο υπόστρωμα μετατρέπεται ενζυμικά σε έγχρωμο προϊόν παρουσία ενζύμου, του οποίου η δρα-
στικότητα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη. Η απορρόφηση του έγχρωμου προϊόντος
είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη στο κλινικό δείγμα.
4.2.6.2 Προσδιορισμός Ωσμωτικότητας
Μετρούμενη ωσμωτικότητα
Αναφέρθηκε ότι η ωσμωτικότητα του ορού αποτελεί δείκτη της συγκέντρωσης διαλυμένων ουσιών στο αίμα.
Είναι γνωστό ότι τα διαλυμένα σωματίδια μεταβάλλουν κάποιες φυσικοχημικές ιδιότητες των διαλυμάτων,
που ονομάζονται προσθετικές και οι τιμές των οποίων εξαρτώνται μόνο από τον αριθμό των διαλυμένων
σωματιδίων σε ορισμένο όγκο διαλύματος. Τέτοιες ιδιότητες είναι η ωσμωτική πίεση, το σημείο ζέσεως, και
το σημείο πήξεως (ή σημείο κατάψυξης). Η μέτρηση της ωσμωτικότητας του αίματος και ούρων γίνεται με
το ωσμώμετρο (osmometer) και βασίζεται στην ανάλογη σχέση μεταξύ της ωσμωτικότητας και έκτασης της
επιφερόμενης μεταβολής σε κάποια από τις παραπάνω ιδιότητες του εξεταζόμενου βιολογικού υγρού κατά
την αύξηση της συγκέντρωσης των διαλυμένων σωματιδίων στο υγρό. Η τιμή ωσμωτικότητας που
προσδιορίζεται με τη βοήθεια των ωσμωμέτρων καλείται μετρούμενη ωσμωτικότητα (measured
osmolarity).
Ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως (ωσμώμετρο κρυοπηξίας, freezing point depression osmometer)
105
Συνήθως, η λειτουργία των ωσμωμέτρων βασίζεται στη μέθοδο της κρυοπηξίας: όσο μεγαλύτερη είναι η
συγκέντρωση των διαλυμένων σωματιδίων στο βιολογικό υγρό, τόσο πιο πολύ ταπεινώνεται το σημείο
πήξεως αυτού σε σχέση με την τιμή αναφοράς. Όταν 1 mol, οποιασδήποτε μη διιστάμενης ουσίας, διαλυθεί
σε 1 kg νερού, το σημείο πήξεως ταπεινώνεται κατά 1,858°C. 1 mol ενός ηλεκτρολύτη μειώνει διαλυόμενο
το σημείο πήξεως κατά ποσό πολλαπλάσιο του 1,858°C, τόσες φορές, όσες και ο αριθμός των ιόντων στα
οποία διίσταται. Πειραματικά, το κλινικό δείγμα, το σημείο πήξεως του οποίου επιθυμούμε να
προσδιορίσουμε (πλάσμα, αίμα, ούρα) πληρώνει ειδικό περιέκτη όπου ψύχεται και στη συνέχεια
υπερψύχεται. Ο όρος υπέρψυξη (supercooling) αναφέρεται στη μείωση της θερμοκρασίας κάτω του σημείου
πήξης του δείγματος, χωρίς τον σχηματισμό κρυστάλλων. Η ψύξη και υπέρψυξη επιτυγχάνονται είτε με
κυκλοφορία ψυκτικού υγρού στο τοιχώματα ενός περιέκτη που δεν ανταλλάσσει θερμότητα με το
περιβάλλον, είτε με σύστημα peltier temperature controller. Στη συνέχεια ξεκινά η πυρηνογένεση που
ευνοείται είτε υπό απότομη δόνηση ενός αναδευτήρα, είτε υπό εμβάπτιση στο δείγμα βελόνας με πυρήνες
πάγου. Κατά την κρυστάλλωση του δείγματος, θα σημειωθεί αύξηση της θερμοκρασίας, λόγω της
απελευθέρωσης της θερμότητας κρυστάλλωσης (Σχήμα 4.12). Στη συνέχεια η θερμοκρασία θα παραμείνει
στάσιμη σε αυτή την τιμή για παρατεταμένο χρονικό διάστημα, όπου θα υπάρχει ισορροπία υγρής/στερεής
κατάστασης. Αυτή η θερμοκρασία ισορροπίας είναι το σημείο πήξεως του δείγματος και καταγράφεται με τη
βοήθεια θερμίστορα. Καθώς υπάρχει γραμμική σχέση μεταξύ ωσμωτικότητας και σημείου πήξεως, η
μέτρηση του σημείου πήξεως επιτρέπει τον προσδιορισμό της ωσμωτικότητας του δείγματος, μετά από
σύγκριση με πρότυπα διαλύματα. Αυτή είναι και η ένδειξη σε mOsm/kg H2Ο που διαβάζεται στο
ωσμώμετρο. Τα βασικά μέρη μίας τυπικής διάταξης ωσμώμετρου ταπείνωσης σημείου πήξεως
παρουσιάζονται στο Σχήμα 4.13.
Σχήμα 4.12 Τυπική καμπύλη μεταβολής της θερμοκρασίας με το χρόνο κατά τη μέτρηση της ωσμωτικότητας κλινικού
δείγματος με ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως (προσαρμοσμένο από Abele, 1963).
106
Σχήμα 4.13 Σχηματικό διάγραμμα διάταξης μέτρησης της ωσμωτικότητας με βάση την ταπείνωση του σημείου πήξεως.
4.2.6.3 Εκτίμηση Εξωκυττάριου Όγκου
Ο εξωκυττάριος όγκος (Extracellular fluid volume ή EFV) εκτιμάται με τη χορήγηση στον ασθενή κάποιας
ουσίας η οποία δεν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη αλλά διέρχεται διαμέσου των τριχοειδών πόρων.
Φυσικά η παραδοχή ότι το σύνολο της χορηγούμενης ουσίας διαλυόμενο κατανέμεται πλήρως, ομοιόμορφα
και μόνο στο εξωκυττάριο υγρό προϋποθέτει ότι αυτή δε μεταβολίζεται ή δεν απεκκρίνεται μέχρι τη στιγμή
της μέτρησης. Καθώς η μη απέκκριση είναι αναπόφευκτη, σχετική διόρθωση είναι απαραίτητη για τη σωστή
εκτίμηση του εξωκυττάριου όγκου. Συχνά στην εκτίμηση του εξωκυττάριου όγκου χορηγείται ραδιενεργή
ινουλίνη. Εάν χορηγήθηκαν VA mL της ουσίας συγκέντρωσης [Α] και σε δείγμα ορού προσδιορίσθηκε η
ουσία σε συγκέντρωση [Β], τότε ο όγκος του εξωκυττάριου υγρού (Extracellular Fluid Volume ή EFV)
υπολογίζεται από την εξίσωση:
[𝐴]
EFV= VA x (Εξίσωση 4.13)
[𝐵]
4.2.6.4 Μέτρηση Ειδικού Βάρους (Σχετικής Πυκνότητας)
Διαθλασιμετρία
Η τεχνική της διαθλασιμετρίας (refractometry) βασίζεται στη μέτρηση του δείκτη διάθλασης (refractive
index), ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος της ταχύτητας του φωτός στον αέρα, προς την ταχύτητα του φωτός στο
αναλυόμενο διάλυμα. Ο δείκτης διάθλασης εξαρτάται από τον αριθμό και το μέγεθος των διαλυμένων
σωματιδίων μέσα στο διάλυμα. Πλεονέκτημα της τεχνικής αποτελεί ο πολύ μικρός απαιτούμενος όγκος
δείγματος, η ταχύτητα και απλότητα της ανάλυσης, η ευκολία καθαρισμού του οργάνου πριν την επόμενη
χρήση και η μηδενική απαιτούμενη προκατεργασία δείγματος. Το σημαντικότερο μειονέκτημά της είναι η
ανάγκη διόρθωσης της μετρούμενης τιμής της σχετικής πυκνότητας των ούρων για την περιεχόμενη γλυκόζη
και πρωτεΐνες. Η μέτρηση του ειδικού βάρους εφαρμόζεται συχνά στην ανάλυση τυχαίων δειγμάτων ούρων,
ούρων 24ώρου και σπανιότερα άλλων σωματικών υγρών. Παραδοσιακά αποτελεί από τις σημαντικότερες
τεχνικές παρακολούθησης της νεφρικής λειτουργίας.
Επίσης, καθώς ο δείκτης διάθλασης του πλάσματος ή ορού εξαρτάται κυρίως από τη συγκέντρωση
της ολικής πρωτεΐνης αυτού, υπάρχουν διαθλασίμετρα που μετρούν την ολική πρωτεΐνη ορού (εμμέσως,
μετά τη μέτρηση του δείκτη διάθλασης αυτού) (Drees & Wu, 2009).
107
Στο Σχήμα 4.14 φαίνεται διαγραμματικά μία τυπική διάταξη φορητού αναλογικού διαθλασίμετρου,
ενώ στη Φωτογραφία 4.6 παρουσιάζεται η φωτογραφία ενός κλινικού φορητού διαθλασίμετρου. Για τη
μέτρηση, προστίθενται μόνο λίγες σταγόνες του υγρού δείγματος στην επιφάνεια του πρίσματος μέτρησης
και καλύπτονται με το πρίσμα φώτισης/καπάκι. Η μπροστινή άκρη του διαθλασίμετρου (αριστερή άκρη στη
Φωτογραφία 4.5) στη συνέχεια προσανατολίζεται προς μια πηγή φωτός (π.χ διάχυτο ηλιακό φως). Το φως
διαθλάται καθώς περνά μέσα από το υγρό δείγμα και οι διαθλώμενες ακτίνες φωτίζουν μέρος της κλίμακας
του διαθλασίμετρου. Η μέτρηση διαβάζεται στην κλίμακα από τον παρατηρητή, ο οποίος καταγράφει την
ένδειξη της κλίμακας στο φωτεινό/σκιερό όριο. Ένα διαθλασίμετρο περιλαμβάνει τυπικά περισσότερες
κλίμακες, όπου διαβάζεται παράλληλα τουλάχιστον η ένδειξη του ειδικού βάρους και δείκτη διάθλασης
(όπως στη Φωτογραφία 4.5.Β). Για τη βαθμονόμηση του οργάνου χρησιμοποιείται απεσταγμένο νερό και
ρυθμίζεται χειρωνακτικά η κλίμακα με τη βοήθεια διορθωτικού κοχλία στην ένδειξη ειδικού βάρους 1,000
πάντα σε θερμοκρασία δωματίου στους 20◦C.
Πέραν των αναλογικών διαθλασίμετρων υπάρχουν και ψηφιακά διαθλασίμετρα, όπου η
βαθμονόμηση γίνεται αυτόματα με απεσταγμένο νερό. Υπάρχουν διαθλασίμετρα με αυτόματη αντιστάθμιση
θερμοκρασίας, και άλλα όπου η αντιστάθμιση γίνεται από τον χρήστη με χρήση κατάλληλου πίνακα. Τέλος
υπάρχουν και μη φορητά διαθλασίμετρα που περιλαμβάνουν σύστημα θερμοστάτισης του δείγματος στους
20◦C.
Σχήμα 4.14 Τυπική διάταξη φορητού αναλογικού διαθλασίμετρου.
Φωτογραφία 4.6 (A) Κλινικό φορητό διαθλασίμετρο που επιτρέπει τη μέτρηση του δείκτη διάθλασης (ND) του ειδικού
βάρους ούρων (U.G.) καθώς και τη μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης ορού (S.P) (εμπορικού οίκου ATAGO). Καταγράφει τη
θερμοκρασία του δείγματος και διορθώνει αυτόματα τις τιμές του δείκτη διάθλασης που παρέχει. (B). Πολλαπλή κλίμακα
του συγκεκριμένου κλινικού διαθλασίμετρου, όπου διαβάζονται ταυτόχρονα ο δείκτης διάθλασης, το ειδικό βάρος ούρων
καθώς και η πρωτεΐνη ορού.
108
Εμβαπτιζόμενες ταινίες
Οι εμβαπτιζόμενες ταινίες (reagent strips) έχουν προσροφημένα μόρια πολυμερούς με επαναλαμβανόμενες

καρβοξυλικές ομάδες, καθώς και μόρια πεχαμετρικών δεικτών. Ο βαθμός διάστασης των καρβοξυλικών
ομάδων του πολυμερούς καθορίζεται από την ιοντική ισχύ του διαλύματος. Συνεπώς, κατά την εμβάπτιση
των ταινιών στο βιολογικό δείγμα απελευθερώνονται πρωτόνια που οδηγούν σε μείωση του pH, και σε
αντίστοιχο χρωματισμό των δεικτών. Σύγκριση του λαμβανόμενου χρώματος με κατάλληλο χρωματολόγιο
βαθμονομημένο με δείγματα ούρων γνωστού ειδικού βάρους επιτρέπει τον οπτικό προσδιορισμό του ειδικού
βάρους στο άγνωστο δείγμα ούρων. Σημαντικά πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η ταχύτητα και η
απλότητα της ανάλυσης, η δυνατότητα απευθείας εφαρμογής της σε θολερά δείγματα και η μη ανάγκη
διόρθωσης του αποτελέσματος για την περιεχόμενη γλυκόζη ή πρωτεΐνη, σε συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μέχρι
7,5 g/L. Μειονεκτήματα της είναι η περιορισμένη ακρίβειά της ιδιαίτερα σε αλκαλικά δείγματα ούρων και η
έλλειψη ανταπόκρισης σε τυχόν περιεχόμενα, μη ιονικά μόρια.
Συχνά οι εμβαπτιζόμενες ταινίες προσδιορισμού του ειδικού βάρους των ούρων (Φωτογραφία 4.7)
επιτρέπουν τον ταυτόχρονο προσδιορισμό πολλών άλλων κλινικών παραμέτρων με διαγνωστική αξία για τη
νεφρική λειτουργία. Υπάρχουν στο εμπόριο και αναλυτές που σαρώνουν τις εμβαπτιζόμενες ταινίες μετά την
εμβάπτισή τους στο δείγμα ούρων για τον ποσοτικό προσδιορισμό. Η πειραματική διαδικασία συνίσταται
στην εμβάπτιση της ταινίας στο δείγμα ούρων, στο σύντομο στέγνωμα αυτής για την απομάκρυνση της
περίσσειας των ούρων και στην μέτρηση της ωσμωτικότητας είτε με τη βοήθεια σαρωτή είτε οπτικά.
Φωτογραφία 4.7 (Α) Εμβαπτιζόμενες ταινίες για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό σειράς κλινικών παραμέτρων με
διαγνωστική αξία για τη νεφρική λειτουργία, μεταξύ άλλων και του ειδικού βάρους των ούρων. (Β). Σαρωτής για την
αυτόματη ανάγνωση της τιμής των μετρούμενων παραμέτρων. Από τον οίκο Changchun Matenu Medical Apparatus Ltd.
4.3.1 Οξεοβασική Ισορροπία
Προκειμένου να επιτευχθεί η εξοικείωση των φοιτητών με τη χρήση αυτόματου αναλυτή αερίων αίματος,
αλλά και να καταδειχθεί η σημασία της προέλευσης του δείγματος αίματος, προτείνεται ο συγκριτικός
προσδιορισμός των παραμέτρων pH, PCO2, PO2 και ο υπολογισμός της [HCO3-] σε δείγματα φλεβικού και
αρτηριακού αίματος ικανού αριθμού ασθενών. Ως πρότυπο προτείνεται η συγκριτική μελέτη των Awasthi
και συνεργατών (Awasthi et al., 2013).
Κατά την μελέτη, δείγμα αρτηριακού και φλεβικού αίματος λήφθηκε ταυτόχρονα σε ηπαρινισμένη
σύριγγα από πλήθος 45 ασθενών μονάδας εντατικής θεραπείας. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε μοντέλο
αναλυτή αερίων ABL 555 series (Radiometer, Copenhagen, Denmark) και ακολούθησε η στατιστική
109
επεξεργασία των αποτελεσμάτων με υπολογισμό του Συντελεστή Γραμμικής Συσχέτισης του Pearson. Η
μελέτη απέδειξε καλή συσχέτιση μεταξύ των παραμέτρων pH (συντελεστής συσχέτισης 0,95), PCO2
(συντελεστής συσχέτισης 0,83), και [HCO3-] (συντελεστής συσχέτισης 0,98). Αντιθέτως δεν βρέθηκε καλή
συσχέτιση μεταξύ των τιμών PO2 που μετρήθηκαν σε αρτηριακό και φλεβικό αίμα (συντελεστής συσχέτισης
< 0,3). Στον Πίνακα 4.5 φαίνονται τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της συγκεκριμένης μελέτης.
Στην προτεινόμενη εργαστηριακή άσκηση πρέπει να συμπληρωθεί πίνακας αντίστοιχος του 4.5. Για
τον υπολογισμό του Συντελεστή Γραμμικής Συσχέτισης του Pearson μπορούν να χρησιμοποιηθούν
αυτόματες υπολογιστικές μηχανές του διαδικτίου.
Οξεοβασική Αρτηριακό αίμα Φλεβικό αίμα Συντελεστής

Παράμετρος (M.O. ± SD) (M.O. ± SD) συσχέτισης (r)
pH 7,418 ±0,117 7,365 ±0,11 0,95
PCO2 36,37 ±13,336 41,958±15,496 0,83
PO2 97,669 ± 44,44 36,63 ± 12,49 0,21
[HCO3-] 21,876 ±6,718 23,390±6,821 0,98
Πίνακας 4.5 Σύγκριση οξεοβασικών παραμέτρων μεταξύ αρτηριακού και φλεβικού αίματος (Awasthi et al., 2013).
4.3.2 Ηλεκτρολυτική Ισορροπία
4.3.2.1 Ανάλυση panel ηλεκτρολυτών με τεχνολογία ΙΜΤ
Προκειμένου να επιτευχθεί η εξοικείωση των φοιτητών με τη χρήση αυτόματου αναλυτή που χρησιμοποιεί
το σύστημα IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών ορού αλλά και με τη διαδικασία
βαθμονόμησης και ελέγχου αραίωσης, προτείνεται η παρακάτω άσκηση.
Στη Φωτογραφία 4.8. φαίνεται η εκτύπωση αυτόματου αναλυτή τύπου Siemens Dimension Xpand
Plus που χρησιμοποιεί το σύστημα QuikLYTE IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών ορού. Ο
πολυαισθητήρας (multisensor) είναι αναλώσιμο εξάρτημα του αυτόματου αναλυτή και πρέπει να
αντικατασταθεί είτε μετά από 5 ημέρες χρήσης, είτε μετά από ανάλυση 1000 δειγμάτων.
Εμπορικά διαθέσιμα πρότυπα διαλύματα απαιτούνται για τη βαθμονόμηση (calibration) του πολυαισθητήρα.
Το σύστημα IMT προχωρεί αυτόματα σε βαθμονόμηση δύο σημείων, κάθε δύο ώρες, ή νωρίτερα, σε
περίπτωση αντικατάστασης προτύπων, ή αντικατάστασης ιοντοεπιλεκτικού πολυ-ηλεκτροδίου
(πολυαισθητήρα). Στη σελίδα Α της εκτύπωσης φαίνεται η τιμή της κλίσης της καμπύλης βαθμονόμησης που
προέκυψε μετά από βαθμονόμηση δύο σημείων με χρήση των προτύπων Α και Β για το κάθε
προσδιοριζόμενο ιόν. Ο κατασκευαστής του αναλυτή δίνει ως αποδεκτές τιμές κλίσης (σε mv/decade) των
καμπυλών βαθμονόμησης τις ακόλουθες:
Na: 53 έως 65
K: 53 έως 65
Cl: - 40 έως -55
Με βάση τις παραπάνω τιμές και σε συνδυασμό με την εκτύπωση της Φωτογραφίας 4.8.Α φαίνεται
ότι η συγκεκριμένη βαθμονόμηση υπήρξε επιτυχής.
Πέραν της βαθμονόμησης ο αναλυτής σε τακτική βάση πραγματοποιεί έλεγχο αραίωσης (Dilution
Check), όπως αυτός τα αποτελέσματα του οποίου φαίνονται στη Φωτογραφία 4.8.Β. Ο έλεγχος αραίωσης
ελέγχει την ακρίβεια 1:10 αραίωσης ειδικού, εμπορικά διαθέσιμου αντιδραστηρίου, γνωστής συγκέντρωσης
σε Κ+ και Na+. Πραγματοποιούνται 5 επαναλήψεις αραιώσεων από την αντλία της διάταξης QuikLYTE IMT.
Tα λαμβανόμενα αποτελέσματα συγκρίνονται με τη γνωστή συγκέντρωση Κ + και Na+ (bottle) και
υπολογίζεται ο μέσος όρος (mean), τυπική απόκλιση (SD) και η ακρίβεια των τιμών (% bias). Τιμές bias
μεταξύ ± 1% θεωρούνται αποδεκτές. Ο έλεγχος αραίωσης έχει ιδιαίτερη σημασία στον προσδιορισμό του
panel ηλεκτρολυτών στα ούρα, όπου απαιτείται αραίωση του δείγματος πριν τον προσδιορισμό. Εφόσον η
ακρίβεια (Φωτογραφία 4.8.B) υπολογίστηκε σε 0.00% (< ± 1%) ο έλεγχος αραίωσης γίνεται δεκτός και ο
αναλυτής μπορεί να προχωρήσει στον καθαυτό προσδιορισμό των ηλεκτρολυτών.
110
Φωτογραφία 4.8 Εκτύπωση αυτόματου αναλυτή τύπου Siemens Dimension Xpand Plus που χρησιμοποιεί το σύστημα
QuikLYTE IMT για τον προσδιορισμό του panel ηλεκτρολυτών. (Α) Βαθμονόμηση, (Β) Έλεγχος Αραίωσης.
4.3.2.2 Ποσοτικός προσδιορισμός Ca++ σε ορό με χρωματομετρική μέθοδο
Στη Φωτογραφία 4.9 παρουσιάζεται πρωτόκολλο τελικού σημείου προσδιορισμού Ca ++ σε ορό και ούρα με
χρωματομετρική μέθοδο. Η αρχή της μεθόδου έγκειται στο ότι σε ουδέτερο περιβάλλον το ασβέστιο αντιδρά
με την εξωγενώς προστιθέμενη ένωση Arsenazo III προς σχηματισμό σύμπλοκης ένωσης κυανού χρώματος,
που απορροφά στα 650 nm (Αντίδραση 4.4). Η αύξηση της απορρόφησης στα 650 nm είναι ανάλογη της
συγκέντρωσης του ασβεστίου στο δείγμα. Ανάλογη σύμπλοκη ένωση υπό τις ίδιες συνθήκες δίνει το Mg ++.
Προκειμένου να αναιρεθεί η παρεμπόδιση των ιόντων μαγνησίου, το πρωτόκολλο περιλαμβάνει παράλληλη
προσθήκη περίσσειας 8-υδροξυκινολίνης. H 8-υδρόξυκινολίνη δίνει αδιάλυτη σύμπλοκη ένωση με το Mg++,
με αποτέλεσμα την απομάκρυνσή του από το υπερκείμενο.
Arsenazo III + Ca++ προϊόν κυανού χρώματος (Αντίδραση 4.4)
Σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα προστίθενται 3,5 mL αντιδραστηρίου εργασίας. Αυτό αποτελείται

από ρυθμιστικό διάλυμα 100 mM Goods pH 6,5, 5 mM 8-υδροξυκινολίνη, 0,2 mM Arsenazo III, διαβρέκτη
και σταθεροποιητές. Ο σωλήνας πωματίζεται και προθερμαίνεται σε υδρόλουτρο στους 37 οC. Εάν δεν
υπάρχει η δυνατότητα προθέρμανσης στους 37οC, επισημαίνεται ότι το αντιδραστήριο εργασίας θα πρέπει να
έχει έρθει τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της επώασης με το τυφλό, άγνωστο και
πρότυπο.
Μετά την προθέρμανση, σε έναν νέο δοκιμαστικό σωλήνα προστίθεται ο ορός αραιωμένα ή 1:3
ούρα (20 μL). Σε δεύτερο σωλήνα προστίθεται 20 μL προτύπου, ενώ σε τρίτο δοκιμαστικό σωλήνα 20 μL
νερού. Και στους τρεις σωλήνες προστίθεται αμέσως μετά 1 mL από το προθερμασμένο αντιδραστήριο
εργασίας. Οι σωλήνες πωματίζονται και ακολουθεί ανάμιξη. Οι τρεις δοκιμαστικοί σωλήνες επωάζονται σε
υδρόλουτρο στους 37οC. Η προσθήκη του διαλύματος εργασίας σηματοδοτεί την έναρξη της αντίδρασης,
οπότε ξεκινάει και η καταγραφή του χρόνου. Σύμφωνα με τη σύσταση του κατασκευαστή του kit, η
καταγραφή της απορρόφησης πρέπει να γίνει σε 5 min μετά την έναρξη της αντίδρασης. Στον κατάλληλο
χρόνο οι σωλήνες αποσύρονται από το υδρόλουτρο, επανέρχονται σε θερμοκρασία δωματίου και
φωτομετράται το περιεχόμενο τους στα 650 nm. Για το μηδενισμό του φωτόμετρου χρησιμοποιείται νερό. Οι
τιμές της απορρόφησης που μετρούνται καταγράφονται. Είναι σημαντικό η μέτρηση της απορρόφησης για το
τυφλό, πρότυπο και δείγμα να γίνει στο ίδιο μήκος κύματος και χρησιμοποιώντας κυψελίδα με ίδιο μήκος
διαδρομής της ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος.
111
Ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του αγνώστου γίνεται στη συνέχεια σύμφωνα με την Eξίσωση
2.1.
Φωτογραφία 4.9 Πρωτόκολλο τελικού σημείου προσδιορισμού Ca++ σε ορό και ούρα με χρωματομετρική μέθοδο.
112
Για την κατανόηση της σχετικής με την οξεοβασική ισορροπία φυσιολογίας παρακολουθήστε τα animations
στις ιστοσελίδες:
 http://www.johnwiley.net.au/highered/interactions/media/Balancing/content/Balancing/ur6a/screen0.swf
(τελευταία προσπέλαση 5/2015).
 http://www.dnatube.com/video/2045/NurseReviewOrg--Animation-on-Acid-Base-Balance (τελευταία προ-
σπέλαση 5/2015).
 http://highered.mheducation.com/sites/0072495855/student_view0/chapter25/animation__gas_exchange_
during_respiration.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
Για την κατανόηση της φυσιολογίας σχετικά με την ηλεκτρολυτική ισορροπία και την ισορροπία των υγρών
του σώματος παρακολουθήστε τα animations:
 https://www.wisc-online.com/Learn/career-clusters/health-science/nur1203/fluid-and-electrolytes
 http://highered.mheducation.com/sites/9834092339/student_view0/chapter38/animation_-_osmosis.html
 http://highered.mheducation.com/sites/0072495855/student_view0/chapter20/animation__hormonal_com
munication.html
Για την κατανόηση του σκεπτικού της ερμηνείας των τιμών μίας ανάλυσης αερίων στα πλαίσια της
διάγνωσης της οξεοβασικής διαταραχής παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες:
 http://www.youtube.com/watch?v=d1lSiWrPn5g (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 https://www.youtube.com/watch?v=WUf-cPpnrXw (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
Για πρόσβαση σε υπολογιστική μηχανή για την εκτίμηση του τύπου της οξεοβασικής διαταραχής
ακολουθήστε έναν από τους παρακάτω συνδέσμους:
 http://www.medcalc.com/acidbase.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://www.manuelsweb.com/abg.htm, δέχεται μόνο ακέραιες τιμές για όλες τις παραμέτρους, πέραν του
pH (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 https://www.easycalculation.com/chemistry/abg-analysis-calculator.php, δέχεται μόνο ακέραιες τιμές για
όλες τις παραμέτρους, πέραν του pH (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
Για επίδειξη παρακλίνιου, φορητού αναλυτή αερίων παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες:
 https://www.abbottpointofcare.com/products-services/istat-handheld (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://www.heska.com/Products/Lab-Systems/Element-POC-Analyzer.aspx (τελευταία προσπέλαση
1/5/2015).
 Για επίδειξη εργαστηριακού αναλυτή αερίων παρακολουθήστε τo βίντεο στην ιστοσελίδα:
http://www.cobas.com/content/internet/product/cobas/en/home/product/point-of-care-testing/cobas-b-
221-system.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της παλμικής οξυμετρίας και της χρήσης του παλμικού οξύμετρου
παρακολουθήστε το βίντεο στην ιστοσελίδα: https://www.youtube.com/watch?v=2v3rae-73jc (τελευταία
 Για επίδειξη δειγματοληψίας αρτηριακού ή τριχοειδούς αίματος παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσε-
λίδες: https://www.youtube.com/watch?v=y-lGLnMMgVQ για δειγματοληψία αρτηριακού αίματος (τελευ-
 https://www.youtube.com/watch?v=k7V2lPf_aK8 για δειγματοληψία τριχοειδούς αίματος (τελευταία προ-
σπέλαση 1/5/2015).
Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της φασματοσκοπίας ατομικής απορροφησης και της σχετικής
πειραματικής διαδικασίας ανάλυσης παρακολουθήστε τα βίντεο στις ιστοσελίδες:
 https://www.youtube.com/watch?v=2v3rae-73jc (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/pushmovies/AAS.gif (τελευταία προσπέλαση 5/2015).
Για επίδειξη της αρχής λειτουργίας της φλογοφωτομετρίας με φλογοφωτόμετρο παρακολουθήστε τα βίντεο
στις ιστοσελίδες:
 http://vlab.amrita.edu/?sub=2&brch=193&sim=1351&cnt=2964 (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://vlab.amrita.edu/?sub=2&brch=193&sim=1351&cnt=4 (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Για επίδειξη του πειραματικού προσδιορισμού της ωσμωτικότητας με ωσμώμετρο παρακολουθήστε το
βίντεο στην ιστοσελίδα:
http://www.aicompanies.com/index.cfm/AiUniversity/TheoryandBenefitsofFreezingOsmometry/Freezing_
113
Point_Thermodynamics (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Για επίδειξη του πειραματικού προσδιορισμού του ειδικού βάρους των ούρων με εμβαπτιζόμενες ταινίες
παρακολουθήστε το βίντεο στην ιστοσελίδα: http://www.drugcheck.com/hc_uc-healthscreen-10.html
 Για πρόσβαση σε υπολογιστική μηχανή για τον υπολογισμό του συντελεστή γραμμικής συσχέτισης του
Pearson ακολουθήστε έναν από τους παρακάτω συνδέσμους:
 http://www.alcula.com/calculators/statistics/correlation-coefficient/ (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://www.socscistatistics.com/tests/pearson/Default2.aspx (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Φωτογραφία 4.2 http://www.cobas.com/content/internet/product/cobas/en/home/product/point-of-care-

testing/cobas-b-221 system.html (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015).
 Φωτογραφία 4.3 Abbott, https://www.abbottpointofcare.com/products-services/istat-handheld (τελευταία
προσπέλαση 1/7/2015), Heska, http://www.heska.com/Products/Lab-Systems/Element-POC-Analyzer.aspx
 ITC. http://www.zoll.com/au/medical-products/testing/itc-trupoint/ (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015).
 Φωτογραφία 4.4 http://www.silverlinemeditech.com/pulse-oximeter.html (τελευταία προσπέλαση
1/7/2015).
 Φωτογραφία 4.6 http://www.atago.net/product/?l=en&f=products_clinical.html (τελευταία προσπέλαση
1/7/2015).
 Φωτογραφία 4.7 http://www.weiku.com/products/8350002/Urinalysis_analyzer.html (τελευταία προσπέ-
λαση 1/7/2015).
 Φωτογραφία 4.9 www.biosis.com.gr (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015).
Αναφορές
1. ΓΙΑΜΠΙΔΟΥ, Α., ΜΥΡΙΑΝΘΕΥΣ, Π., ΜΠΑΛΤΟΠΟΥΛΟΣ, Γ. (2010) Ερμηνεία Αερίων Αρτηριακού
Αίματος: Διαταραχές Οξεοβασικής Ισορροπίας. Αθήνα: Συχνές Ερωτήσεις στην Πνευμονολογία, Περιοδικές
εκδόσεις της Ελληνικής Πνευμονολογικής Εταιρείας. Διαθέσιμο στο:
http://www.hts.org.gr/assets/files/biblia_epe/syxnes_erotiseis_pneumonologia.pdf
2. ΤΙΤΟΠΟΥΛΟΣ, Η. (2001) Κλινική Ερμηνεία των Αερίων Αρτηριακού Αίματος. Η Ιατρική Σήμερα, 36, p.
39-42. Διαθέσιμο στο: http://www.isth.gr/images/uploads/TITOPOULOS.pdf
3. ΦΥΤΟΥ-ΠΑΛΛΗΚΑΡΗ, Α. (2005) Θεωρία Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος.
4. ABELE, E. (1963) The physical background to freezing point osmometry and its medical-biological
applications. Am J Med Electronics, 2, p. 32-41.
5. AWASTHI, S., RANI, R., MALVIYA, D. (2013) Peripheral venous blood gas analysis: An alternative to
arterial blood gas analysis for initial assessment and resuscitation in emergency and intensive care unit
patients. Anesth Essays Res, 7, p. 355-58.
6. BUCHER, L. (2005; pp. 630-37) Arterial puncture (Procedure). AACN procedure manual for critical care,
Lynn-McHale Wiegand, D.J., Carlson, K. 5th Ed. New York: Churchill Livingstone-Elsevier.
7. BURTIS, A., ASHWOOD, R., BRUNS, E., (2007) Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular
Diagnostics. 5th Ed. New York: Churchill Livingstone-Elsevier.
8. CHIN, D., LINDER, V., SIA, S.K. (2012) Commercialization of microfluidic point-of-care diagnostic
devices. Lab Chip, 12, p. 2118-134.
9. COGAN, G. (1991) Fluid & Electrolytes: Physiology & Pathophysiology. Norwalk: Appleton & Lange.
10. CRISTALLI, C. & MANZONI, A. (2000; pp. A1-A11) Basics of Blood Gas Instrumentation. In: The
Biomedical Engineering Handbook: 2nd Ed., Bronzino, J. D (ed). New York: CRC Press LLC.
11. DELOST, M. (2014; pp. 151-174). Blood Gas and Critical Care Analyte Analysis. In: Equipment for
Respiratory Care, Volsko T.A., Chatburn, R.L., and El-Khatib, M.F. (ed.). New York: J&B Learning,
Burlington.
12. DREES, C. & WU, B. (2009; pp. 130-165) Analytical Techniques, In: Clinical Chemistry: Techniques,
Principles, Correlations (6th Ed.). Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA.
114
13. FOXALL, F. (2008) Arterial Blood Gas Analysis: An Easy Learning Guide. New York: M&K Update
Ltd.
14. GAW, A., MURPHY, J., SRIVASTAVA, R., COWAN, A., O'REILLY, J. (2013) Clinical Biochemistry:
An Illustrated Colour Text. 5th Ed. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA.
15. HAWS, J. & HAWS, S. (2015) Fluids, Electrolytes and Acid-Base Balance: a Guide for Nurses. 1st Ed.
Charleston: CreateSpace.
16. HENNESSEY, M. & JAPP, G. (2007) Arterial Blood Gases Made Easy. 1st Ed. New York: Churchill
Livingstone-Elsevier.
17. HIGGINS, C. (2008) Capillary-blood gases: To arterialize or not. MLO Online. p. 42-47.
18. HINWOOD, G. (2001) A Textbook of Science for the Health Professions. 4th Ed., Nelson Thornes Ltd,
Cheltenham.
19. KEE, L., PAULANKA, J., PURNELL, D. (2004) Fluids and Electrolytes with Clinical Applications: A
Programmed Approach. 7th Ed. New York: Delmar Learning.
20. LIPPINCOTT, W. (2005) Just the facts: Fluids and Electrolytes. Philadelphia: Lippincott, Williams &
Wilkins, Ambler PA.
21. LIPPINCOTT, W. (2007) Straight A's in Fluids and Electrolytes. Lippincott, Williams & Wilkins,
Ambler PA.
22. LIPPINCOTT, W. (2011) Fluid & Electrolytes Made Incredibly Easy, 5th Ed. Philadelphia: Lippincott,
Williams & Wilkins, Ambler PA.
23. LOBO, N., LEWINGTON, P., ΕLLISON, P. (2013) Basic Concepts of Fluid and Electrolyte Therapy.
Melsungen: Bibliomed. Διαθέσιμο στο:
http://www.bbraun.com/documents/Knowledge/Basic_Concepts_of_Fluid_and_Electrolyte_Therapy.pdf
24. LORD, R. (1999) Osmosis, osmometry, and osmoregulation. Postgrad Med J, 75, p. 67-73.
25. METHENY, N. (2011) Fluid and Electrolyte Balance: Nursing Considerations. 5th Ed. Sudbury: Jones &
Bartlett Publishers.
26. MILIONIS, J., LIAMIS, L., ELISAF, S. (2002) Clinical diagnostic algorithm for hyponatremia Can Med
Assoc J, 166, p. 1056-62.
27. PAPADEA, C., FOSTER, J., GRANT, S., BALLARD S.A., CATE J.C., SOUTHGATE, W.M.,
PUROHIT, D.M. (2002) Evaluation of the i-STAT Portable Clinical Analyzer for Point-of-Care Blood
Testing in the Intensive Care Units of a University Children’s Hospital. Ann Clin Lab Sci, 32, p. 231-43.
28. STRASINGER, K. & SCHAUB DI LORENZO (2014) Urinalysis and Body Fluids. 6th Ed. Philadelphia:
FA Davis Company.
29. TOFTEGAARD, M., REES, E. et al. (2009) Evaluation of a method for converting venous values of
acid–base and oxygenation status to arterial values. Emerg. Med. J, 26, p. 268 -72.
30. VERMA, B. & ROACH, P. (2010) The interpretation of arterial blood gases. Aust Prescr, 33, p. 124-29.
31. WEINSTEIN, S. (2007) Plumer's Principles and Practice of Intravenous Therapy, 8th Ed. Philadelphia:
Lippincott, Williams & Wilkins, Ambler PA.
32. WHO (2010) WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. Geneva: WHO.
33. ZAOUTIS, B. & CHIANG, W. (2007) Comprehensive Pediatric Hospital Medicine. Philadelphia: Mosby
Inc.
115
ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ
ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ – ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ
ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΤΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό επιχειρείται μια εισαγωγή στις περισσότερο χρησιμοποιούμενες μεθόδους
ηλεκτροφόρησης στη κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Οι τεχνικές ηλεκτροφόρησης
χρησιμοποιούνται στο κλινικό εργαστήριο για το διαχωρισμό μακρομορίων, όπως οι πρωτεΐνες, οι
λιποπρωτεΐνες, τα ένζυμα και τα ισοένζυμά τους κ.α. και στη συνέχεια για τον υπολογισμό των επιμέρους
κλασμάτων με σκοπό την άμεση ή έμμεση διάγνωση νοσολογικών καταστάσεων. Περιγράφονται αναλυτικά
αρκετές βασικές τεχνικές ηλεκτροφόρησης, αλλά γίνεται αναφορά και σε πιο εξειδικευμένες και σύγχρονες
τεχνικές, όπως η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση. Τέλος, επισημαίνεται η χρησιμότητα των τεχνικών αυτών στην
κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική.
Το πέμπτο κεφάλαιο του βιβλίου βασίζεται σε βασικές γνώσεις βιοχημείας και κλινικής χημείας. Θα
χρειαστούν βασικές γνώσεις όσον αφορά τα βιολογικά μακρομόρια.
5.1 Η ηλεκτροφόρηση ως βασική μέθοδος διαχωρισμού των πρωτεϊνών

Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μία τεχνική διαχωρισμού και εν συνεχεία προσδιορισμού μίγματος ουσιών
μεγάλου μοριακού βάρους, όπως π.χ. πρωτεϊνών, λιποπρωτεϊνών, νουκλεϊκών οξέων (DNA, RNA), ενζύμων
και ισοενζύμων ή μορίων με μικρότερο μοριακό βάρος, όπως πεπτίδια ή ακόμη και μίγματος ουσιών με
μικρό μοριακό βάρος, όπως π.χ. αμινοξέα, βάσεις κ.α. Εφαρμόζεται ακόμη και σε περιπτώσεις κυττάρων. Με
λίγα λόγια μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε δείγμα περιέχει χημικές ενώσεις που φέρουν φορτίο.
Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης χρησιμοποιείται (Καρκαλούσος, 2012):
Α) για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό μορίων ποικίλου μοριακού βάρους ενός μίγματος,
Β) για τον προσδιορισμό μοριακού βάρους,
Γ) για τον προσδιορισμό της καθαρότητας ενός δείγματος,
Δ) για την απομόνωση, τον καθαρισμό και χαρακτηρισμό ουσιών, π.χ. πρωτεϊνών, κ.α.
Η ηλεκτροφόρηση βρίσκει εφαρμογές στην βιοχημεία και κλινική χημεία, στην μοριακή βιολογία,
στην φαρμακολογία και τοξικολογία, στην εγκληματολογία και άλλες επιστήμες.
Η ηλεκτροφόρηση είναι απλή, φθηνή και εύκολα εφαρμόσιμη τεχνική, θεμελιώδες εργαλείο στην
μοριακή βιολογία και στην εργαστηριακή διαγνωστική ιατρική.
5.2 Οι βασικές αρχές της Ηλεκτροφόρησης

Η ηλεκτροφόρηση αποτελεί μια μέθοδο διαχωρισμού (Σχήμα 5.1), κατά την οποία φορτισμένα μόρια (π.χ.
πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα) μετακινούνται υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου στο εσωτερικό πηκτών ή
διαλυμάτων. Διαφορετικά μόρια κινούνται με διαφορετικές ταχύτητες και τα συστατικά ενός μίγματος
διαχωρίζονται εάν βρεθούν μέσα σε κατάλληλο ηλεκτρικό πεδίο.
116
Ηλεκτροφόρηση αμινοξέων επί χάρτου
Άνοδος Κάθοδος
Animation 5.1 H διαδικασία της ηλεκτροφόρησης.
Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των φορτισμένων μορίων εξαρτάται κυρίως από (Λιανίδου, 2015;
Νταλαμάγκα, 2015):
 Το καθαρό φορτίο: αρνητικά φορτισμένα μόρια (ανιόντα) μετακινούνται προς την άνοδο (+), ενώ θετικά
φορτισμένα μόρια (κατιόντα) μετακινούνται προς την κάθοδο (-). Τα μόρια που φέρουν υψηλό σθένος με-
τακινούνται γρηγορότερα προς το ηλεκτρόδιο με το αντίθετο φορτίο από μόρια με μικρότερο σθένος.
 Το μέγεθος: η αντίσταση (λόγω της τριβής) που υφίστανται τα μόρια που κινούνται μέσα σε ένα διάλυμα
ή μία πηκτή, έχει ως συνέπεια τα μικρά μόρια να κινούνται γρηγορότερα από τα μεγάλα.
 Το σχήμα: η τριβή επηρεάζεται από το σχήμα του μορίου, με αποτέλεσμα η κινητικότητα να είναι διαφο-
ρετική ανάμεσα σε σφαιρικές και ινώδεις πρωτεΐνες ή ανάμεσα σε γραμμικό και κυκλικό DNA.
 Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου: όσο αυξάνεται η τάση του πεδίου, τόσο αυξάνεται και η κινητικό-
τητα. Όμως, υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί στη χρήση υψηλής τάσης, έτσι ώστε να μην αναπτυχθούν
θερμικά φαινόμενα.
5.2.1 Παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της Ηλεκτροφόρησης

Οι κυριότεροι παράγοντες που επηρεάζουν την τεχνική της ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.1) είναι: το pH, η
ιοντική ισχύς, η ιοντική σύσταση, η ένταση, η θερμοκρασία, ο χρόνος και το υπόστρωμα.
Παράγοντες Επίδραση
pH Τροποποίηση φορτίου πρωτεϊνών και αποτελεσματικής κίνησης. Σπάνια επηρεάζει τη
δομή και οδηγεί σε μετουσίωση.
Ιοντική ισχύς Τροποποίηση ισχύος και έντασης. Με την αύξηση της ιοντικής ισχύος μειώνεται η
κινητικότητα και αυξάνεται η έκλυση θερμότητας.
Ιοντική σύσταση Κινητικότητα μορίων
Ένταση Κινητικότητα ανάλογη (συνήθως) της έντασης.
Θερμοκρασία Εκτροπή των κλασμάτων. Η υψηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει μετουσίωση
των πρωτεϊνών, ενώ η χαμηλή θερμοκρασία μπορεί να προκαλέσει διήθηση, αλλά δεν
μεταβάλει τον διαχωρισμό.
Χρόνος Ο διαχωρισμός αυξάνει με το χρόνο, αλλά παρατηρείται διήθηση των κλασμάτων.
Υπόστρωμα Το μέγεθος των πόρων επηρεάζει την ταχύτητα της κινητικότητας των συστατικών
Πίνακας 5.1 Παράγοντες που επηρεάζουν την ηλεκτροφόρηση.
117
Animation 5.2 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών με βάση το μοριακό βάρος.
5.2.2 Τα Υποστρώματα της Ηλεκτροφόρησης

Τα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στην ηλεκτροφόρηση είναι αδρανή υλικά και μπορούν να είναι
επίπεδα, κυλινδρικά ή σε μορφή σφαιριδίων (πηκτή με πόρους). Στην περίπτωση των επίπεδων πηκτών
επιτυγχάνεται η εισαγωγή μεγαλύτερων ποσοτήτων δείγματος, ενώ οι κυλινδρικές πηκτές εμφανίζουν
μεγαλύτερη ευαισθησία.
Ως υπόστρωμα μπορεί να χρησιμοποιηθούν τα παρακάτω:

 πηκτή αγαρόζης,
 πηκτή αμύλου,
 πηκτή πολυακρυλαμιδίου,
 οξική κυτταρίνη,
 διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman.
Πηκτή αγαρόζης
 Είναι διαυγής και επιτρέπει την μέτρηση της οπτικής πυκνότητας των ζωνών.
 Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και DNA (Πίνακας 5.4).
Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης (σύσταση: όξινη καρραγενάση και ουδέτερη αγαρόζη [D-
γαλακτόζη και 3,6-ανυδρο-L-γαλακτόζη]). Πηκτές αγαρόζης σε μορφή σφαιριδίων, συγκέντρωσης 2 - 10%,
ονομάζονται Sepharose™ (Pharmacia, LKB, π.χ. Sepharose 4B είναι πηκτή 4% σε αγαρόζη) και διατίθενται
σε διάφορες ενεργοποιημένες μορφές.
Πηκτή αμύλου
 Χρησιμοποιείται για την ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης.
Το άμυλο είναι πολυσακχαρίτης και βρίσκεται σε μορφή μίγματος διαλυτής αμυλόζης (20%) και
αδιάλυτης αμυλοπηκτίνης (80%). Μερική υδρόλυση της αμυλοπηκτίνης οδηγεί σε μίγμα ολιγοσακχαριτών,
τις δεξτρίνες. Οι δεξτρίνες με επιχλωροϋδρίνη (C3H5OCl) παρέχουν το υλικό Sephadex (εμπορική
118
ονομασία), το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως ως υλικό πλήρωσης χρωματογραφικών στηλών και ως υλικό
ακινητοποίησης (ηλεκτροφόρηση), μετά την ενεργοποίηση του με BrCN.
Πηκτή πολυακρυλαμιδίου
 Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων (Πίνακας 5.4).
Συνθετικά πολυμερή, όπως τα συμπολυμερή διαφόρων υδρόφιλων ακρυλικών μονομερών

(ακρυλικού οξέος, ακρυλαμιδίου, μεθακρυλικού οξέος) χρησιμοποιούνται ως υλικά ακινητοποίησης, π.χ.
παράγωγα του πολυακρυλαμιδίου διατίθενται με διάφορες εμπορικές ονομασίες όπως:
1. Bio-Gel CM (ακρυλαμίδιο/ακρυλικό οξύ),
2. Bio-Gel P (ακρυλαμίδιο/Ν,Ν΄-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο),
3. Enzaryl AA (ακρυλαμίδιο/p-νιτροακρυλαμίδιο/Ν,Ν΄-μεθυλενο-δις-ακρυλαμίδιο),
4. Enzaryl AH (ακρυλαμίδιο/N-ακρυλοϋλο-Ν’-t-βουτυλοξυκαρβονυλο-υδραζίνη).
Το πήκτωμα του πολυακρυλαμιδίου είναι ουδέτερο, τρισδιάστατο πλέγμα υδρογονανθράκων

συνδεδεμένων με μεθυλενομάδες. Προκύπτει από το πολυμερισμό δύο συστατικών: α) των μονομερών
ακρυλαμιδίου (MBA) και β) του Ν,Ν1-μεθυλενο-bis-ακρυλαμιδίου (ή απλώς bis), το οποίο παίζει
συνεκτικό ρόλο στο πήκτωμα. Η αντίδραση πολυμερισμού γίνεται με την προσθήκη υπερθειϊκού αμμωνίου
(ammoniumpersulfate, APS) και του Ν,Ν,Ν1Ν1,-τετραμεθυλεθυλενοδιαμίνης (TEMED) (Σχήμα 5.1).
Το μέγεθος των πόρων του πλέγματος που σχηματίζεται κυμαίνεται με βάση τα παρακάτω:
 Την ολική συγκέντρωση ακρυλαμίδης (%Τ) και ΜΒΑ (%C, crosslinker) και
 τη σχετική συγκέντρωση της ΜΒΑ ως προς την ακρυλαμίδη. Τα πηκτώματα με μικρή συγκέντρωση
πολυακρυλαμίδηςέχουν μεγαλύτερους πόρους και το αντίστροφο.
Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση

των πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες
ηλεκτροφορήσεις (Σχήμα 5.2) εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη
και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή.
Οξική κυτταρίνη
Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό πρωτεϊνών.
Η κυτταρίνη είναι πολυσακχαρίτης και αποτελείται από πλήθος μορίων γλυκόζης συνδεδεμένα με
(1,4)-β-γλυκοζιτικούς δεσμούς. Κάθε μόριο γλυκόζης έχει τρία ελεύθερα υδροξύλια. Κατά τη μερική ή
ολική νίτρωση (HNO3/H2SO4) ή ακετυλίωση (οξικός ανυδρίτης/H2SO4) της κυτταρίνης, λαμβάνονται τα
παράγωγα της (τρι-)νιτρικής ή (τρι-)οξικής κυτταρίνης, τα οποία σε μορφή μεμβρανών χρησιμοποιούνται
ευρέως για την ακινητοποίηση βιομορίων (ηλεκτροφόρηση) ή ως φράγματα διάχυσης.
Διηθητικό χαρτί ή χαρτί Whatman
Εμφανίζει φαινόμενα προσρόφησης ουσιών και για το λόγο αυτό δεν χρησιμοποιείται.
119
Σχήμα 5.1 Η χημική δομή του πυκτώματος ακριλαμίδης.
5.2.3 Χρώση κλασμάτων

Η χρώση των διαχωρισθέντων κλασμάτων (ζωνών) αποτελεί σημαντικό στάδιο των ηλεκτροφορητικών
τεχνικών (Πίνακας 5.2). Η χρώση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ένα στάδιο ή διαδοχικά σε πολλά στάδια,
με τη χρήση δύο ή και περισσοτέρων χρωστικών. Οι χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες, όπως π.χ. η
νυνιδρίνη για τις αζωτούχες ομάδες των νουκλεϊκών οξέων, πρωτεϊνών, κ.α. Από την άλλη μεριά οι
χρωστικές μπορεί να είναι εξειδικευμένες για πρωτεΐνες, γλυκοπρωτεϊνες, λιπίδια κ.α. Για τη χρώση των
πρωτεϊνών ορού χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Amido black (απορρόφηση στα 640 nm), Ponceau S (520
nm), Coomassie Brilliant Blue (595 nm), Bromophenol Blue (600 nm), Nigrosin (540 nm) κ.α. Για το
διαχωρισμό ισοενζύμων: ενζυμικές αντιδράσεις με NADH ή NADPH, με τελικό αποτέλεσμα την παραγωγή
φορμαζάνης (570 nm). Με τη χρήση της Coomassie Brilliant Blue μπορεί να ανιχνευθεί 1 μg πρωτεΐνης σε
συγκεκριμένο κλάσμα. Η χρώση όμως με νιτρικό άργυρο γίνεται 100 φορές πιο ευαίσθητη και μπορεί να
ανιχνευτεί 1 ng πρωτεΐνης σε συγκεκριμένο κλάσμα.
Για την χρώση και ανίχνευση των λιποπρωτεϊνών χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Oil Red O (520
nm), Sudan Black (600 nm), Sudan Red 7B (540 nm), κ.α. (Μακέδου, 2015). Ειδικά για ραδιοενεργά
ιχνηθετημένα δείγματα η ανίχνευση γίνεται με τη βοήθεια της αυτοραδιογραφίας.
120
Σχήμα 5.2 Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου.
Βιομόρια Χρωστικές
Περισσότερο Λιγότερο χρησιμοποιούμενες
χρησιμοποιούμενες
Πρωτεΐνες  
Coomassie Brilliant Blue R250 Amido black
 Νιτρικός άργυρος  Ponceau S
 Bromophenol blue
 Nigrosin
DNA  Βρωμιούχο αιθίδιο  Bromophenol blue
 Νιτρικός άργυρος
Λιποπρωτεϊνες  Oil Red Ο
 Sudan Black Β
 Periodic Acid
Πίνακας 5.2 Παραδείγματα χρησιμοποιούμενων χρωστικών, ανά κατηγορία βιομορίων .
5.2.4 Καθήλωση και ανίχνευση των συστατικών μείγματος

Για την καθήλωση και την ανίχνευση των συστατικών μείγματος χρησιμοποιούνται είτε άμεσες, είτε
έμμεσες μέθοδοι.
Έμμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται διάφορες χημικές αντιδράσεις, περισσότερο ή
λιγότερο εξειδικευμένες για την ανίχνευση συστατικών, όπως η χρώση πρωτεϊνών και των συστατικών
τους, ενζυμικές αντιδράσεις, κ.α.
Άμεση καθήλωση: στη περίπτωση αυτή προσδιορίζονται οι φυσικές ιδιότητες των συστατικών και
συγκεκριμένα:
Α) Προσδιορισμός απορρόφησης στα 280 nm (τρυπτοφάνη, τυροσίνη, φαινυλαλανίνη), στα 220 nm, στα
210 nm, κ.λπ. Τα νουκλεϊκά οξέα απορροφούν πιο έντονα στα 260 nm. Σε περίπτωση που το πρωτεϊνικό
121
δείγμα περιέχει και νουκλεϊκά οξέα, για το προσδιορισμό της πρωτεΐνης χρησιμοποιείται ο παρακάτω
τύπος:
Πρωτεΐνη (mg/mL) = 1,55 A280 – 0,76 A260 (Εξίσωση 5.3)
Η μέθοδος αυτή είναι ιδιαίτερα απαραίτητη για πρωτεΐνες στα όρια του 0,5 έως 1,5 mg/mL.
Β) Άμεσος προσδιορισμός με φθορισμό. Η μέθοδος είναι χιλιάδες φορές πιο ευαίσθητη από την
φασματοφωτομετρία και την χρωματομετρία.
Γ) Προσδιορισμός του δείκτη διάθλασης του εκάστοτε συστατικού.
5.2.5 Πυκνομετρία (densitometry)

Η πυκνομετρία αποτελεί μία από τις μεθόδους για την ποσοτική εκτίμηση των συστατικών της
ηλεκτροφορητικής τεχνικής (Σχήμα 5.3). Συνήθως τα χρωματισμένα και στεγνά των ηλεκτροφορημάτων
των πρωτεϊνών αναλύονται με πυκνομετρική ανάλυση της μεμβράνης ή της πηκτής. Με τη μέθοδο αυτή η
ποσότητα κάθε κλάσματος μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της απορρόφησης. Συνεπώς, η συγκέντρωση του
κάθε κλάσματος πρέπει να είναι ευθέως ανάλογη της απορρόφησης.
Σχήμα 5.3 Διαγραμματική απεικόνιση λειτουργίας πυκνόμετρου.
5.2.6 Εργαστηριακά όργανα και σκεύη Ηλεκτροφόρησης

Για τις περισσότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης απαιτούνται τα παρακάτω όργανα και σκεύη (Kaplan et al.,
2003· Δημητριάδης, 2015):
 τροφοδοτικό,
 λουτρό ηλεκτροφόρησης,
 ηλεκτρόδια,
 υπόστρωμα,
122
 διηθητικό χαρτί (Watmann),
 διαλύτες,
 απορρυπαντικά μετουσίωσης πρωτεϊνών (SDS, Urea, Lithium Dodecyl Sulfate, BRij 35, CHAPSO, κ.α.)
 χτενάκια (Applicator - για την εναπόθεση του δείγματος, συνήθως 1 - 10 μL, παράλληλα με το δείγμα
φορτώνεται μάρτυρας και πρότυπο),
 λουτρό χρωματισμού και αποχρωματισμού – σταθεροποίησης,
 επιφανειακά ηλεκτρόδια,
 υπολογιστής,
 pH-μετρο,
 ρυθμιστές θερμοκρασίας,
 δείκτες ηλεκτροφορητικής κινητικότητας,
 δείκτες για πρότυπα και μάρτυρες.
5.2.7 Το βιολογικό δείγμα

Στις τεχνικές ηλεκτροφόρησης μπορούν να χρησιμοποιηθούν πολλά και διαφορετικά δείγματα ποικίλης
προέλευσης, π.χ. ορός, εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ούρα. Επίσης πλάσμα, πλευριτικό υγρό, αλλά και βιοψίες
από ιστούς, σπανίως και ομάδες κυττάρων. Ανάλογα με την τεχνική ηλεκτροφόρησης που χρησιμοποιείται
και την συγκέντρωση πρωτεϊνών του δείγματος μπορεί να χρησιμοποιηθεί φυσικό ή προκαταβολικά
επεξεργασμένο βιολογικό δείγμα.
5.2.8 Διαχωριστική ικανότητα - τεχνικές ηλεκτροφόρησης

Η διαχωριστική ικανότητα είναι η δυνατότητα της μεθόδου να διαχωρίσει το μίγμα ουσιών σε όσο το
δυνατόν περισσότερα κλάσματα. Τα είδη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης διακρίνονται με βάση την
διαχωριστική τους ικανότητα, η οποία είναι συνάρτηση των παρακάτω παραγόντων:
 υποστρώματος,
 pH του διαλύματος,
 έντασης και ισχύος,
 θερμοκρασίας στο δοχείο ηλεκτροφόρησης,
 τρόπου χρώσης – εμφάνισης των κλασμάτων (ζωνών) και του προσδιορισμού τους,
 κινητικότητα των ουσιών του μίγματος, κ.α.
Κατά την εφαρμογή του ηλεκτρικού πεδίου τα λιγότερα ευκίνητα ιόντα ακολουθούν τα
περισσότερο ευκίνητα και για το λόγο αυτό, για τα λιγότερο ευκίνητα εφαρμόζεται πιο μεγάλη ισχύς.
Ειδικά οι πρωτεΐνες έχουν μέση κινητική ικανότητα, δηλαδή ενδιάμεση μεταξύ των πιο ευκίνητων και των
λιγότερο ευκίνητων ιόντων και για αυτό τον λόγο ο διαχωρισμός τους εξαρτάται από τη συγκέντρωση και
το φορτίο.
5.2.9 Ταξινόμηση τεχνικών Ηλεκτροφόρησης

Η ταξινόμηση των τεχνικών ηλεκτροφόρησης πραγματοποιείται με ποικίλα κριτήρια, όπως το είδος του
υποστρώματος, τη διάταξη της πηκτής, το σχήμα της πηκτής, την ποσότητα του δείγματος, τις συνθήκες στις
οποίες πραγματοποιείται η τεχνική, κ.α. (Πίνακας 5.3).
Κριτήριο ταξινόμησης Είδος ηλεκτροφόρησης

Είδος υποστρώματος Χάρτου Οξικής Αγαρόζης Πολυακρυλαμίδης Πηκτής
κυτταρίνης αμύλου
Διάταξη πηκτής Οριζόντια Κατακόρυφη
Σχήμα πηκτής Επίπεδη Κυλινδρική
Συνθήκες τεχνικής Μη Αποδιατακτική
αποδιατακτική
Ποσότητα δείγματος Παρασκευαστική Αναλυτική
123
Πίνακας 5.3 Είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης.
Οι κυριότερες τεχνικές ηλεκτροφόρησης είναι:
 ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης,

 ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου,
 τριχοειδής ηλεκτροφόρηση,
 δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση,
 ισοηλεκτρική εστίαση.
Στον Πίνακα 5.4. παρουσιάζονται τα βασικά είδη τεχνικών ηλεκτροφόρησης και τα μόρια ή κλάσματα που
κατά κανόνα διαχωρίζονται με αυτές.
Είδος Διαχωρισμός Μορίων ή Κλασμάτων

ηλεκτροφόρησης
Πηκτής αγαρόζης Πρωτεΐνες ορού Ισοένζυμα (π.χ. Λιποπρωτεΐνες Νουκλεϊκά οξέα

LDH, ALP, CK, (DNA, RNA)
αιμοσφαιρινών, κ.α.)
Πηκτής Πρωτεΐνες ορού Ισοενζύμα Νουκλεϊκά οξέα
πολυακρυλαμιδίου (DNA, RNA)
Τριχοειδής Πρωτεΐνες, Πεπτίδια Σάκχαρα Φαρμακευτικές Νουκλεϊκά οξέα
ηλεκτροφόρηση Ουσίες (DNA, RNA),
ολιγονουκλεοτιδίωνκαι
Αλληλούχιση DNA
Δισδιάστατη Πρωτεΐνες
ηλεκτροφόρηση
Ισοηλεκτρική Πρωτεΐνες
εστίαση
Πίνακας 5.4 Είδη βασικών τεχνικών ηλεκτροφόρησης και διαχωρισμός μορίων/κλασμάτων.
Παρακάτω, παρουσιάζονται ορισμένα μόνο χαρακτηριστικά που αφορούν κάποιες από τις τεχνικές
ηλεκτροφόρησης.
5.3 Τα χαρακτηριστικά ορισμένων τεχνικών Hλεκτροφόρησης

5.3.1 Ηλεκτροφόρηση σε Oξική Κυτταρίνη και Nιτρική Kυτταρίνη
Τα υλικά αυτά επιτρέπουν την ανάλυση πολύ μικρών δειγμάτων. Η χρώση του ηλεκτροφορήματος, όταν
πρόκειται για χρώση πρωτεϊνών πάνω σε οξική κυτταρίνη, γίνεται συνήθως με Ponceau S. Πλεονεκτήματα
της ηλεκτροφόρησης σε κυτταρίνη (σε σχέση με το χαρτί) αποτελούν:
 η μεγαλύτερη ευαισθησία της μεθόδου,
 ο πιο ευδιάκριτος διαχωρισμός των ζωνών,
 η μικρότερη προσρόφηση των πρωτεϊνών,
 η μικρή παρατήρηση «ουράς» σε κάθε επιμέρους κλάσματος, κ.α.
5.3.2 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Αγαρόζης
Η αγαρόζη είναι ουδέτερος, καθαρός πολυσακχαρίτης και χρησιμεύει για το διαχωρισμό σχεδόν όλων των
βιολογικών μακρομορίων με συγκεκριμένο ηλεκτρικό φορτίο. Υπάρχουν εξειδικευμένοι τύποι αγαρόζης, π.χ.
για την ανοσοηλεκτροφόρηση ή για την παρασκευή στο εργαστήριο πηκτών, οι οποίες επιτρέπουν τον
διαχωρισμό συστατικών στη βάση της διάχυσης και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των βιομορίων.
124
Η αγαρόζη διαλύεται σε υδατόλουτρο και παραμένει υγρή σε θερμοκρασία έως 40οC. Ο
χρωματισμός και ο αποχρωματισμός είναι εύκολες διαδικασίες. Το μέγεθος των πόρων και ο μοριακός ηθμός
εξαρτώνται από τη συγκέντρωση της αγαρόζης. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις εξασφαλίζεται μικρότερο
μέγεθος πόρων. Η συγκέντρωση της αγαρόζης κυμαίνεται συνήθως από 0,4 έως 4% (w/v). Το πάχος της
πηκτής κυμαίνεται από 0,1 έως 5 mm. Το μέγεθος των πόρων συγκριτικά με την ακρυλαμίδη, είναι
μεγαλύτερο. Το τελευταίο καθιστά την αγαρόζη περισσότερο χρήσιμη σε ανοσοηλεκτροφορητικές τεχνικές.
Η διαύγεια της πηκτής μπορεί να βελτιωθεί με ξέπλυμα αυτής με 15% γλυκερόλης.
Η ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για το διαχωρισμό πρωτεϊνών μεγάλου
μοριακού βάρους, πρωτεϊνικών συμπλόκων και νουκλεϊκών οξέων (50 - 30.000 βάσεων). Σήμερα
χρησιμοποιούνται παραλλαγές της συγκεκριμένης ηλεκτροφόρησης, με σκοπό την αύξηση της διαχωριστικής
της ικανότητας.
Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης αποτελούν:

 η ανοσοηλεκτροφόρηση,
 η ανοσοηλεκτροφόρηση τύπου ρουκέτας ή ζώνης,
 η ανοσοηλεκτροφόρηση πολλαπλών πηκτών,
 η δισδιάστατη διασταυρούμενη ανοσοηλεκτροφόρηση με ενδιάμεσες πηκτές,
 η ανοσοπροσήλωση και
 η ηλεκτροφόρηση αγχιστείας.
Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα αγαρόζης

αποτελούν:
 η ηλεκτροφόρηση παλλόμενου πεδίου και
 η ηλεκτροφόρηση comet.
5.3.3 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aκρυλαμιδίου

Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιβραδύνουν τη μετανάστευση των
πρωτεϊνών περίπου ανάλογα με το λόγο φορτίου προς μάζα. Χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες
ηλεκτροφορήσεις, εξασφαλίζοντας μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν
να πραγματοποιηθούν είτε σε συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς αυτή. Το μέσο μέγεθος της πηκτής
ακρυλαμιδίου με συγκέντρωση από 5 έως 10% είναι αποτελεσματικό για διαχωρισμό πρωτεϊνών από 15.000
έως 250.000 Da (ή σύμφωνα με άλλους επιστήμονες από 5.000 έως 200.000 Da) και νουκλεοτιδίων από 5
έως 2.000 βάσεις (Αντωνέλλου & Παπασιδέρη, 2015).
Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα πολυακρυλαμιδίου

αποτελούν:
 η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες,
 η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες,
 η ηλεκτροφόρηση κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες παρουσία SDS (SDS PAGE),
 η ισοηλεκτρική εστίαση (IEF),
 η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2D).
Εξειδικευμένες τεχνικές διαχωρισμού νουκλεϊκών οξέων με ηλεκτροφόρηση σε υπόστρωμα

πολυακρυλαμιδίου αποτελούν (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001):
 η ηλεκτροφόρηση κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες,
 η ηλεκτροφόρηση σε παρασκευαστικά πηκτώματα κάτω από μετουσιωτικές συνθήκες,
 η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου αλληλουχία (sequencing) κάτω από μετουσιωτικές
συνθήκες,
 η ηλεκτροφόρηση κάτω από διαβαθμισμένη συγκέντρωση μετουσιωτικού παράγοντα (DGGE),
 η ηλεκτροφόρηση διαβαθμισμένης θερμοκρασίας (TGGE),
 η ηλεκτροφόρηση μονόκλωνου DNA κάτω από μη μετουσιωτικές συνθήκες. Τεχνική SSCPA.
125
5.3.4 Ηλεκτροφόρηση πηκτής Aμύλου
Το άμυλο σπάνια χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα. Διαθέτει μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από την
αγαρόζη, αλλά η προετοιμασία της πηκτής είναι δύσκολη. Χρησιμοποιείται συνήθως σε παρασκευαστική
ηλεκτροφόρηση.
5.4 H Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση

Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση (Σχήμα 5.4) αποτελεί μια μοντέρνα τεχνική διαχωρισμού και ανάλυσης.
Βασικά χαρακτηριστικά της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης είναι (Hu, 1996):
1. ο διαχωρισμός των μορίων πραγματοποιείται με κίνηση διαμέσου τριχοειδούς σωλήνα (περιέχει ρυθμι-
στικό διάλυμα),
2. η μετακίνηση εξαρτάται από το φορτίο και το μοριακό βάρος,
3. η μικρή εσωτερική διάμετρος του τριχοειδούς σωλήνα (30 - 70 mm),
4. χαρακτηριστικό της τεχνικής αποτελεί η υψηλή τάση (10 - 30 kV), το ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο (100-500
V/cm) σε σχετικά λίγα Ampere (0 - 300 mA) και ισχύς (0,6 W),
5. η ευαισθησία της τεχνικής αυξάνει, είτε με την αύξηση της εσωτερικής διαμέτρου του τριχοειδούς σωλή-
να αποκλειστικά στη θέση της ανίχνευσης, είτε με την χρήση μεμβράνης στην αρχή του σωλήνα, με σκο-
πό την έκλουση συστατικών που παρεμποδίζουν την ανάλυση,
6. η ταχύτητα διαχωρισμού των συστατικών μπορεί να επιτευχθεί σε 10 – 15 λεπτά και σε ορισμένες περι-
πτώσεις σε πιο μεγάλο χρονικό διάστημα,
7. ο τριχοειδής σωλήνας μπορεί να χρησιμοποιηθεί εκ νέου μετά το πέρας της τεχνικής, μετά από διαδικασία
αναγέννησης,
8. η ανίχνευση μέσω κατάλληλου ανιχνευτεί μπορεί να πραγματοποιηθεί α) με UV-VIS ανίχνευση, β) με
συνδυασμό UV – Laser γ) φθορισμομετρικά, δ) με έμμεση UV – φθορισμομετρία - αμπερομετρία, ε) με
αμπερομετρία, στ) φασματοφωτομετρία μάζας, κ.α.,
9. ορισμένοι από τους ανιχνευτές μπορούν να ανιχνεύσουν μάζες από 10-5 έως 10-16 mol,
10. ο συνδυασμός της συγκεκριμένης τεχνικής με άλλες, όπως η HPLC, GC, MS, PCR, κ.α.,
11. τα διαχωρισθέντα συστατικά προσδιορίζονται μέσω ανιχνευτή και καταγράφονται με μορφή κορυφών.
Κάθε ουσία που διέρχεται από τον ανιχνευτή καταγράφεται σε διάγραμμα με μορφή κορυφής απορρόφη-
σης και κατ’ αυτό τον τρόπο στο τέλος λαμβάνεται διάγραμμα απορρόφησης συναρτήσει του χρόνου.
Βασικά πλεονεκτήματα της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης αποτελούν:

 η μικρή απαιτούμενη ποσότητα δείγματος (από 1 έως 50 nL),
 η μεγάλη διαχωριστική ικανότητα,
 η μικρή κατανάλωση διαλυτών,
 η ανάλυση διάφορων βιολογικών υγρών (αίμα, ορός, πλάσμα, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, πλευριτικό υγρό,
δείγματα βιοψιών κ.α.),
 η εισαγωγή του δείγματος στην ηλεκτροφόρηση χωρίς προαπαιτούμενη επεξεργασία,
 η υψηλή αναλυτική ικανότητα – επαναληψιμότητα και ακρίβεια,
 η δυνατότητα άμεσης λήψης ποσοτικών αποτελεσμάτων και
 η αυτοματοποίηση της τεχνικής.
Η οργανολογία της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης περιλαμβάνει:

 μία γεννήτρια υψηλής διαφοράς δυναμικού,
 δύο ηλεκτρόδια,
 δύο ρεζερβουάρ ρυθμιστικών διαλυμάτων,
 τριχοειδή σωλήνα και
 έναν ανιχνευτή.
126
Σχήμα 5.4 Αναπαράσταση οργανολογίας τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης.
Σήμερα χρησιμοποιούνται διάφορα επιμέρους είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (Πίνακας 5.5).
Είδη Τριχοειδούς Διαχωρισμός Ουσιών

Ηλεκτροφόρησης
Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Στηρίζεται στις διαφορετικές ταχύτητες μετακίνησης των ιόντων στο ρυθμιστικό
ζώνης διάλυμα, που οφείλονται στις διαφορετικές ηλεκτροφορητικές κινητικότητες των
διαλυτών και συστατικών. Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό ιόντων, πεπτιδίων,
ορμονών, πρωτεϊνών κ.α.
Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Στηρίζεται στο μέγεθος διαλυτών συστατικών καθώς μετακινούνται μέσα από τους
πηκτής πόρους της πηκτής (μοριακός ηθμός). Χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό κυρίως
υδατανθράκων, πρωτεϊνών, λιπιδίων, απο-λιποπρωτεϊνών, ορμονών, προϊόντων
DNA, κ.α.
Τριχοειδής ισοταχοφόρηση Μηδενική ηλεκτροωσμωτική ροή - EOF (κίνηση διαλύτη μαζί με διαλυμένες σε
αυτόν ουσίες, και κατεύθυνση αντίθετη από αυτή του ηλεκτρικού ρεύματος). Αρχή
κινητού ορίου (moving boundary). Χρησιμοποιείται για ανάλυση μικρών μορίων,
βιταμινών, ορμονών και πεπτιδίων.
Μικκυλιακή ηλεκτροκινητική Στηρίζεται στη κατανομή διαλυτών συστατικών μεταξύ της μικκυλιακής φάσης και
τριχοειδής χρωματογραφία της διαλυτής φάσης. Χρησιμοποιείται για ανάλυση φαρμάκων, μεταβολιτών,
προϊόντων DNA, κ.α.
Τριχοειδής Στηρίζεται στη βάση των διαφορετικών χρωματογραφικών ιδιοτήτων (πολικότητα ή
ηλεκτροχρωματογραφία λιποφιλικότητα του αναλύτη) και της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας
Τριχοειδής ισοηλεκτρική Με βάση τα ισοηλεκτρικά τους σημεία. Χρησιμοποιείται για διαχωρισμό πρωτεινών,
εστίαση πεπτιδίων, κ.α.
Πίνακας 5.5 Είδη τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης.
Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση ζώνης στηρίζεται στην ηλεκτροφορητική ικανότητα των μορίων και
την ηλεκτροοσμωτική ροή. Το φαινόμενο της ηλεκτροοσμωτικής ροής οφείλεται στην φορτισμένη
127
εσωτερική επιφάνεια του τριχοειδούς. Ο βαθμός ιονισμού εξαρτάται από το pH του ρυθμιστικού διαλύματος.
Το αρνητικά φορτισμένο τοίχωμα του τριχοειδούς έλκει τα θετικά φορτισμένα ιόντα του ρυθμιστικού
διαλύματος, δημιουργώντας μια διπλοστοιβάδα φορτισμένων ιόντων. Όταν εφαρμόζεται διαφορά δυναμικού,
τα κατιόντα της διπλοστοιβάδας μεταναστεύουν προς την κάθοδο μεταφέροντας μόρια νερού, με αποτέλεσμα
τη δημιουργία μιας ροής ρυθμιστικού διαλύματος προς την κατεύθυνση του αρνητικά φορτισμένου
ηλεκτροδίου. Συνεπώς, οτιδήποτε βρίσκεται μέσα στο ρυθμιστικό διάλυμα μετακινείται μέσω
ηλεκτροοσμωτικής ροής (Σχήμα 5.5).
Σχήμα 5.5 Παραγωγή ηλεκτρο-ωσμωτικής ροής προς την κάθοδο στην ηλεκτροφόρηση τριχοειδών.
Στην τριχοειδή ηλεκτροφόρηση μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείγμα τα διάφορα βιολογικά

υγρά, κύτταρα, δείγματα βιοψίας, κ.α. Μπορούν να διαχωριστούν πρωτεΐνες, πεπτίδια, αμινοξέα, ένζυμα,
ισοένζυμα, αιμοσφαιρίνες, γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (βλ. Ενότητα 5.7), γλυκοζυλιωμένες πρωτεΐνες,
λιποπρωτεΐνες, υδατάνθρακες, ορμόνες, ηλεκτρολύτες, φάρμακα, κ.α.
5.5 Η Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη (ηλεκτροφόρηση ζώνης)

Αρχή της μεθόδου
Η ηλεκτροφόρηση είναι μία μέθοδος διαχωρισμού μεγαλομοριακών ουσιών ή και κυττάρων ενός μίγματος.
Η ηλεκτροφόρηση στηρίζεται στο γεγονός πως όταν μέσα σε ένα διάλυμα ηλεκτρολύτη βαπτιστούν δύο
ηλεκτρόδια και εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο, τότε τα φορτισμένα μόρια κινούνται με βάση το φορτίο τους
αντίστοιχα προς τον έναν ή τον άλλο πόλο.
Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος
Οι πρωτεΐνες του ορού του αίματος, όπως η αλβουμίνη και οι σφαιρίνες (α1, α2, β και γ) μπορούν να
προσδιοριστούν με βιοχημικές μεθόδους. Στις πρωτεΐνες του πλάσματος συμπεριλαμβάνεται και το
ινωδογόνο.
128
Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού
Τα πρωτεϊνικά μόρια του ορού με την επίδραση ηλεκτρικού ρεύματος μετακινούνται προς την άνοδο ή την
κάθοδο με διαφορετική ταχύτητα ανάλογα με το φορτίο τους (Καρκαλούσος, 2012).
Είναι γνωστό πως οι πρωτεΐνες ιονίζονται, όπως και τα αμινοξέα. Ο ιονισμός εξαρτάται από το pH.
Οι πρωτεΐνες λόγω των πολλών διαφορετικών ομάδων στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων ιονίζονται ως
κατιόντα και ένα μέρος ως ανιόντα. Δηλαδή, συμπεριφέρονται ως πολυηλεκτρολύτες (πολυϊόντα).
Το pH στο οποίο οι πρωτεΐνες δεν φέρουν καθαρό ηλεκτρικό φορτίο ονομάζεται ισοηλεκτρικό
σημείο και συμβολίζεται με pI. Στη προκειμένη περίπτωση η πρωτεΐνη έχει ολικό φορτίο ίσο με το μηδέν.
Όταν το pH του περιβάλλοντος είναι όξινο σε σχέση με το pI της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται θετικά.
Σε μια τέτοια περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την κάθοδο. Στην αντίθετη περίπτωση, όταν το pH του
περιβάλλοντος είναι βασικό σε σχέση με το pI της πρωτεΐνης, αυτή φορτίζεται αρνητικά. Σε μια τέτοια
περίπτωση η πρωτεΐνη κινείται προς την άνοδο. Όταν το pH του περιβάλλοντος είναι ίσο με το pΙ και
συνεπώς το φορτίο της πρωτεΐνης είναι ίσο με το μηδέν, η πρωτεΐνη δεν μετακινείται.
Η ταχύτητα (U) με την οποία κινείται ένα πρωτεϊνικό μόριο εξαρτάται:
 από το φορτίο του,
 από την ισχύ του ηλεκτρικού πεδίου,
 από το μέσο διαχωρισμού,
 από το ΜΒ των κλασμάτων, κ.λπ.
Όπως έχουμε περιγράψει υπάρχουν πολλές μέθοδοι ηλεκτροφόρησης, από τις πιο απλές είναι η
ηλεκτροφόρηση ζώνης όπου η ηλεκτροφόρηση σταματά στο σημείο που οι πρωτεΐνες σχηματίζουν
ξεχωριστές ζώνες.
Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης μπορούμε να χρωματίσουμε τα κλάσματα και να τα
προσδιορίσουμε ποσοτικά. Η χρώση γίνεται με διάφορες κατάλληλες χρωστικές όπως το Red Ponceau S, το
κυανούν του Coomassie, το αμιδομέλαν, κ.α., που αντιδρούν με τις βασικές ομάδες των πρωτεϊνών.

5.6.1 Αντιδραστήρια και αναλώσιμα
Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού σε μη μετουσιωτικές συνθήκες θα χρησιμοποιηθούν τα

παρακάτω αντιδραστήρια και αναλώσιμα:
 ρυθμιστικό διάλυμα: TEB (0,12 M Tris, 5 mM EDTA, 15 mM βορικό οξύ, pH 8,6),
 διάλυμα χρωστικής (Ponceau S),
 διάλυμα αποχρωματισμού και σταθεροποίησης,
 μεμβράνες οξικής κυτταρίνης,
 διηθητικό χαρτί,
 αποστειρωμένα γυάλινα πλακάκια,
 γυάλινοι ράβδοι.
Ως αντιδραστήρια μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε επίσης:

 ρυθμιστικό διάλυμα: 0,05 Μ βαρβιτουρικό pH 8,6,
 διάλυμα χρώσης: 0,5% w/v Ponceau S σε 5% w/v TCA (τριχλωροοξικό οξύ),
 διάλυμα αποχρωματισμού: 5% v/v CH3COOH.
5.6.2 Συσκευές και υλικά
Για την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού θα χρησιμοποιηθούν οι παρακάτω συσκευές:

Συσκευή ηλεκτροφόρησης που περιλαμβάνει (Φωτογραφία 5.1):
 βάση ηλεκτροφόρησης,
 γέφυρα ηλεκτροφόρησης,
129
 applicator (χτένα),
 dispocard Holder,
 λουτρό ηλεκτροφόρησης,
 τροφοδοτικό,
 αυτόματες πιπέτες (10 μL ή 20 μL).
Φωτογραφία 5.1 Συσκευή ηλεκτροφόρησης(τροφοδοτικό και λουτρό) χάρτου ή οξικής κυτταρίνης.
5.6.3 Προετοιμασία της διαδικασίας
Η προετοιμασία πριν την ηλεκτροφόρηση αποτελεί βασική προϋπόθεση για την επιτυχία της. Συγκεκριμένα
απαιτείται η προετοιμασία:
 του συστήματος,
 της βάσης της ηλεκτροφόρησης,
 των μεμβρανών και
 των δειγμάτων.
5.6.4.1 Προετοιμασία του συστήματος
Πρώτο βασικό στάδιο αποτελεί η αποσύνδεση του λουτρού από το τροφοδοτικό και το γέμισμα των δύο
διαμερισμάτων του με 400 mL ρυθμιστικού διαλύματος (Φωτογραφία 5.2).
Φωτογραφία 5.2 Σύστημα ηλεκτροφόρησης.
130
5.6.4.2 Προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης
Δεύτερο σημαντικό στάδιο της προετοιμασίας αποτελεί η προετοιμασία της βάσης της ηλεκτροφόρησης, την
οποία γεμίζουμε με 80 mL από το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα. Στη βάση τοποθετούμε τη γέφυρα της
ηλεκτροφόρησης (Φωτογραφία 5.3).
Φωτογραφία 5.3 Βάση και γέφυρα ηλεκτροφόρησης.
5.6.4.2 Προετοιμασία των μεμβρανών
Οι μεμβράνες οξικής κυτταρίνης τοποθετούνται σε μία μικρή λεκάνη με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα στο
οποίο πραγματοποιείται η ηλεκτροφόρηση. Αρχικά τοποθετείται στην επιφάνεια του ρυθμιστικού διαλύματος
και στη συνέχεια τη βυθίζουμε στο υγρό. Η μεμβράνη παραμένει στο διάλυμα για πέντε λεπτά και στη
συνέχεια μεταφέρεται και τοποθετείται μεταξύ δύο διηθητικών φύλλων. Με μία γυάλινη ράβδο
απομακρύνουμε τη περίσσεια του ρυθμιστικού διαλύματος, χωρίς να στεγνώσει η μεμβράνη,
απομακρύνοντας ταυτόχρονα τυχόν φυσαλίδες, που υπάρχουν πάνω σε αυτή. Η μεμβράνη τοποθετείται στη
γέφυρα με προσοχή ώστε να είναι τεντωμένη και επίπεδη, ώστε να μην εμποδίζεται η μετακίνηση των
δειγμάτων και ο διαχωρισμός των κλασμάτων. Για περισσότερες από μία μεμβράνες χρησιμοποιούνται νέα
φύλλα διηθητικού χαρτιού (Φωτογραφία 5.4).
Φωτογραφία 5.4 Μεμβράνη οξικής κυτταρίνης.
5.6.4.3 Προετοιμασία των δειγμάτων
Τα δείγματα τοποθετούνται στο ονομαζόμενο dispocard, το οποίο έχει προκαταβολικά τοποθετηθεί στη θήκη
του. Το dispocard που θα χρησιμοποιήσουμε, ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων προς εξέταση, διαθέτει
131
σε κάθε σειρά τέσσερις, έξι ή οκτώ θέσεις δειγμάτων. Με αυτόματη πιπέτα τοποθετούμε την κατάλληλη
ποσότητα ορού ασθενούς σε κάθε θέση του dispocard.
Οι τύποι των dispocard που μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε είναι:
 Micro (D8, D6M, D6),

 semimicro (D4, D4MS, D4M),
 macro (D2).
5.6.4.4 Τοποθέτηση των δειγμάτων στη μεμβράνη
Με τη χρήση του κατάλληλου applicator (χτενάκι) που ταιριάζει στο dispocard παίρνουμε τα δείγματα
τοποθετώντας το χτενάκι κάθετα πάνω στο dispocard (Φωτογραφία 5.5). Το χτενάκι τοποθετείται στη
συνέχεια κάθετα πάνω στη μεμβράνη για 10 περίπου δευτερόλεπτα, ώστε να πραγματοποιηθεί η μεταφορά
των δειγμάτων στην μεμβράνη (το δείγμα προς την κάθοδο).
Φωτογραφία 5.5 Dispocard και Applicator (χτενάκι) ηλεκτροφόρησης.
Τεχνική ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών ορού
Τα επιμέρους βήματα έχουν ως εξής (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001):
1. Αφαιρείται το καπάκι του λουτρού.

2. Η γέφυρα μεταφέρεται από τη βάση της ηλεκτροφόρησης μέσα στο λουτρό, έχοντας υπόψη ότι ο διαχω-
ρισμός των πρωτεϊνών θα γίνει προς την άνοδο.
3. Επιλογή της κατάλληλης τάσης.
4. Τοποθετείται το καπάκι του λουτρού.
5. Τίθεται σε λειτουργία το τροφοδοτικό.
Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τάση ίση με 0,5 mA/cm για μία ώρα. Όμως οι
προτεινόμενες τάσεις με βάση τον τύπο του dispocard, που χρησιμοποιήσαμε έχουν ως εξής:
 Micro (D8, D6M, D6): 250 Vdc 20 - 25 min,

 Semimicro (D4, D4MS, D4M): Vdc 30 -35 min,
 Macro (D2): Vdc 35 - 40 min.
Στο τέλος του χρόνου κλείνουμε το διακόπτη του τροφοδοτικού και αφαιρούμε το καπάκι του
λουτρού. Σηκώνουμε τη γέφυρα, διατηρώντας τη μεμβράνη σε οριζόντιο επίπεδο. Απομακρύνουμε τη
μεμβράνη από τη γέφυρα και κόβουμε τις προεκτάσεις τους στα σημεία, όπου υπάρχουν διάτρητες γραμμές.
132
5.6.4.5 Χρώση των κλασμάτων
Γεμίζουμε μία λεκάνη με διάλυμα κατάλληλης χρωστικής (Φωτογραφία 5.6) και βαπτίζουμε τη μεμβράνη
για δέκα λεπτά. Η χρωστική συμπλέκεται με τις πρωτεΐνες προσδίδοντας σε αυτές κόκκινο χρώμα.
Φωτογραφία 5.6 Χρωστική Ponceau S και το διάλυμα αποχρωματισμού.
5.6.4.6 Αποχρωματισμός και Διαφανοποίηση της μεμβράνης
Σε μία άλλη λεκάνη τοποθετούμε διάλυμα αποχρωματισμού και διαφανοποίησης (Φωτογραφία 5.5). Με μία
λαβίδα η μεμβράνη μεταφέρεται από το διάλυμα χρωματισμού στο διάλυμα αποχρωματισμού και
διαφανοποίησης. Με τη λαβίδα ή με μία γυάλινη ράβδο αναδεύουμε ελαφρά. Το διάλυμα αντικαθίσταται με
νέο έως ότου η μεμβράνη αποχρωματιστεί πλήρως. Μετά το τέλος του αποχρωματισμού παραμένουν
χρωματισμένες μόνο οι ζώνες των πρωτεϊνών.
Η μεμβράνη τοποθετείται σε γυάλινο αποστειρωμένο πλακάκι, το οποίο τοποθετείται σε κλίβανο
θερμοκρασίας 120 - 180οC για 5 - 10 λεπτά. Στη συνέχεια η μεμβράνη, εφόσον είναι πλέον στεγνή και ξηρή,
μπορεί να φωτομετρηθεί.
Η φωτομέτρηση πραγματοποιείται στα 525 nm (εφόσον έχουμε χρησιμοποιήσει χρωστική Red
Ponceau S) ή στα 620 nm εάν έχει γίνει χρώση με Amido schwartz.
5.6.4.7 Πυκνομετρία (Densitometry)
Η πυκνομετρία πραγματοποιείται με ειδικό όργανο (Σχήμα 5.6), το οποίο καταγράφει και απεικονίζει τις
ποσότητες των πρωτεϊνικών κλασμάτων με ειδικό γραμμικό διάγραμμα (Φωτογραφία 5.7).
Σχήμα 5.6 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού σε οξική κυτταρίνη. Ηλεκτρογράφημα – υπολογισμός κλασμάτων με τη χρήση
133
πυκνομέτρου (Φωτογραφία 5.7). Το δεξιό διάγραμμα είναι παθολογικό αφού οι γ σφαιρίνες κατέχουν ποσοστό 19% έναντι
18% που είναι το ανώτερο όριο (Πίνακας 5.6).
Φωτογραφία 5.7 Πυκνόμετρο (Minidensit – Densitometer – SEAC).
5.6.4.8 Υπολογισμοί
Καταγράφουμε τις οπτικές απορροφήσεις και τις προσθέτουμε. Υπολογίζουμε το ποσοστό επί τοις εκατό του
κάθε κλάσματος. Εάν με κάποια άλλη μέθοδο προσδιορίσουμε το ολικό ποσό των πρωτεϊνών του ορού, τότε
μπορούμε να βρούμε το ποσό του κάθε κλάσματος.
Ο υπολογισμός μπορεί να γίνει και με Scanner. Σε αυτή την περίπτωση πρέπει να
διαφανοποιήσουμε υποχρεωτικά την μεμβράνη (ταινία) μετά τον χρωματισμό. Με τη βοήθεια του Scanner
βρίσκουμε το ποσοστό κάθε κλάσματος που μας δίδεται απ’ ευθείας από τον καταγραφέα.
5.6.4.9 Διαγνωστική αξία των αποτελεσμάτων
Κατά την ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών ορού λαμβάνονται πέντε ταινίες, κάθε μία εκ των οποίων
αντιστοιχεί σε μία από τις εξεταζόμενες πρωτεΐνες (Σχήματα 5.7, 5.8):
 λευκωματίνη (η πιο παχιά και απομακρυσμένη από το σημείο έναρξης του διαχωρισμού),
 α1-σφαιρίνη (η δεύτερη κατά σειρά),
 α2-σφαιρίνη (η τρίτη κατά σειρά),
 β-σφαιρίνη (η τέταρτη κατά σειρά),
 γ-σφαιρίνη (η τελευταία κατά σειρά και η πλησιέστερη στο σημείο έναρξης του διαχωρισμού των κλα-
σμάτων).
Η ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών του ορού βοηθά στην εκτίμηση διαφόρων παθολογικών

καταστάσεων όπως: η απώλεια πρωτεϊνών, οι φλεγμονές, οι γαμμαπάθειες, κ.α. Στον Πίνακα 5.6 δίνονται
ενδεικτικά οι φυσιολογικές τιμές πρωτεϊνών ορού (συνίσταται κάθε εργαστήριο να προσδιορίσει το δικό του
εύρος τιμών).
Πρωτεΐνες Ποσοστό (%) g/L

Αλβουμίνες 55,0 – 69,0 35 – 44
α1 σφαιρίνη 1,5 – 4,0 1-3
α2 σφαιρίνη 8,0 – 13,0 5-8
β σφαιρίνες 7,0 – 15,0 4 - 10
γ σφαιρίνες 9,0 – 18,0 5 - 12
Πίνακας 5.6 Εκατοστιαία αναλογία πρωτεϊνών.
134
Η διαγνωστική αξία των πρωτεϊνικών κλασμάτων δίνεται για διάφορες παθήσεις στον Πίνακα 5.7.
Στον πίνακα προσδιορίζονται οι περιπτώσεις, στις οποίες παρατηρείται αύξηση ή μείωση ενός ή
περισσοτέρων κλασμάτων (Πλαγεράς & Παπαϊωάννου, 2001· Devlin, 2009).
Παθήσεις Πρωτεΐνες Ορού

Αλβουμίνη Σφαιρίνες
α1 α2 β γ
Αποφρακτικός ίκτερος 
Χρόνιος ηπατικός ίκτερος  
Κίρρωση του ήπατος   
Νεφρωσικό σύνδρομο    
Οξείες λοιμώξεις  
Χρόνιες λοιμώξεις   
Παθήσεις κολλαγόνου   
Οξείς τραυματισμοί   
Βαρύς διαβήτης  
Μυέλωμα & μακροσφαιριναιμίες   
Πίνακας 5.7 Διαγνωστική αξία πρωτεϊνικών κλασμάτων ορού.
Σχήμα 5.7 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα.
135
Σχήμα 5.8 Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών: Πρωτεϊνόγραμμα ασθενούς με μονοκλωνική γαμμαπάθεια
(Monoclonalgammopathy, Multiple Myeloma).
5.7 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων

5.7.1 Ηλεκτροφόρηση Ισοενζύμων Γαλακτικής Αφυδρογονάσης (LDH)
Η γαλακτική αφυδρογονάση ή γαλακτική δεϋδρογενάση (Lactate Dehydrogenase ή LDH) αποτελεί ένζυμο

του κυτταροπλάσματος και καταλύει την μετατροπή του γαλακτικού οξέος σε πυροσταφυλικό οξύ (Σχήμα
5.9).
Πυροσταφυλικό Γαλακτικό
Σχήμα 5.9 Η καταλυόμενη αντίδραση από την LDH.
Το συγκεκριμένο ένζυμο βρίσκεται σε πολλούς ιστούς. Ιδιαίτερα σε μεγάλες συγκεντρώσεις

βρίσκεται στο μυοκάρδιο, τους νεφρούς, το ήπαρ και τους σκελετικούς μύες. Σε μικρότερες συγκεντρώσεις
απαντά στα ερυθρά αιμοσφαίρια, τους πνεύμονες, τον εγκέφαλο και το πάγκρεας. Στον ορό βρίσκεται σε
πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις (τουλάχιστον 500 φορές). Αυτό σημαίνει, πως η αύξηση της LDH στον ορό
δεν μπορεί να αποτελεί ειδικό δείκτη βλάβης των κυττάρων, λόγω του ότι βρίσκεται ευρέως κατανεμημένη
στον οργανισμό. Συνεπώς, η όποια διαγνωστική αξία της εργαστηριακής διερεύνησης της LDH
επιτυγχάνεται με τη διάκριση της ιστικής προέλευσης των ισοενζύμων της και της κλινικής εικόνας του
ασθενούς (Φύτου-Παλλικάρη, 2005).
Με την τεχνική της ηλεκτροφόρησης μπορούν να διακριθούν τα πέντε (5) διαφορετικά ισοένζυμα
της LDH (Σχήμα 5.10) με βάση τον αριθμό των υπομονάδων Η (Heart) και Μ (Muscle) που περιέχουν. Τα
ισοένζυμα της LDH δίνονται στον Πίνακα 5.14 (Koomn & Roehm, 2007).
136
Σχήμα 5.10 Ηλεκτροφορητική ικανότητα (διαχωρισμός) των ισοενζύμων της LDH. Ta αποτελέσματα κρίνονται
φυσιολογικά σύμφωνα και με τον Πίνακα 5.14.
Ισοένζυμα
Υπομονάδες Τιμές Αναφοράς (%) * Όργανο
LDH
LDH-1 H4 17 - 27 Στην καρδιά και στα ερυθρά αιμοσφαίρια
(σε μικρότερες ποσότητες στο φλοιό του
LDH-2 H3M 28 - 38 εγκεφάλου καιστους νεφρούς).
Στους πνεύμονες, το σπλήνα, το πάγκρεας &

LDH-3 H2M2 19 - 27
τον πλακούντα.
LDH-4 HM3 5 – 16
Στους σκελετικούς μύες, το ήπαρ και το
LDH-5 M4 5 – 16
δέρμα.
Ολική LDH 200 - 480 U/L
* Οι τιμές αναφοράς σχετίζονται με την μέθοδο ηλεκτροφόρησης οξικής κυτταρίνης.
Πίνακας 5.14 Ισοένζυμα-υπομονάδες της γαλακτικής αφυδρογονάσης/όργανο και tιμές aναφοράς.
Αύξηση της ολικής LDH με φυσιολογική κατανομή των ισοενζύμων μπορεί να παρατηρηθεί σε
έμφραγμα του μυοκαρδίου, χρόνια καρδιακή ανεπάρκεια και ηπατικές νόσους. Στον Πίνακα 5.15 δίνονται
ορισμένες από τις μεταβολές, που σχετίζονται με τα ισοένζυμα της LDH και αντίστοιχες παθολογικές
καταστάσεις (Loeffler 2007· Gaw et al., 2010).
137
Αύξηση ισοενζύμων LDH Παθολογικές καταστάσεις
Οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου *
Κακοήθης αναιμία, Μεγαλοβλαστική αναιμία
LDH-1 ή & LDH-2
Δρεπανοκυτταρική αναιμία
Οξεία νέκρωση του φλοιού του νεφρού
Πνευμονική εμβολή
Διαταραχές του κολλαγόνου
Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια
LDH-2, LDH-3 & LDH-4
Καταστροφή αιμοπεταλίων έπειτα από μετάγγιση
Λοιμώδης μονοπυρήνωση
Λεμφώματα, Λεμφοκυτταρική λευχαιμία
Κίρρωση, ηπατίτιδα, Οξεία ηπατική συμφόρηση
Τραυματισμός σκελετικών μυών
LDH-5
Εγκαύματα, Δερματομυοσίτιδα
Νεοπλασίες Κ.Ν.Σ
* Σήμερα για τη διάγνωση-παρακολούθηση του οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου χρησιμοποιούνται CK, CK-MB
και τροπονίνη Ι και Τ.
Πίνακας 5.15 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις των ισοενζύμων της LDH σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις.
5.7.2 Η Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Αλκαλικής Φωσφατάσης
Η αλκαλική φωσφατάση (Alkaline phosphatase ή ALP) υδρολύει τα φωσφορικά άλατα σε αλκαλικό pH 6,0 –
8,0. Η ALP κατανέμεται ευρέως σε πολλούς ιστούς, όπως στους οστεοβλάστες των ιστών, το ήπαρ, τον
πλακούντα, τους νεφρούς, το εντερικό τοίχωμα και τους γαλουχούντες μαστικούς αδένες. Με την
ηλεκτροφορητική τεχνική επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός και ο προσδιορισμός των ισοενζύμων της και είναι
δυνατή η επιβεβαίωση της πηγής προέλευσής της. Τα κύρια ισοένζυμα της ALP και οι τιμές αναφοράς
δίνονται στον Πίνακα 5.16.
Ισοένζυμα ALP Ποσοστό επί της ολικής ALP (%) Τιμές αναφοράς (U/L)
Οστικό 8 – 67 2 4 - 146
Ηπατικό 18 – 72 24 - 158
Εντερικό 0 - 22 0 - 22
Πλακουντιακό 0
Ολική ALP 25 - 100 U/L
Πίνακας 5.16 Κύρια ισοένζυμα και τιμές αναφοράς των ισοενζύμων της ALP.
Στα φυσιολογικά άτομα, η αλκαλική φωσφατάση του ορού προέρχεται σχεδόν αποκλειστικά από τα
ισοένζυμα του ήπατος και των οστών. Μερικές φορές, ελάχιστες ποσότητες προέρχονται από το έντερο και
σε περιόδους κυοφορίας και γαλουχίας, από τον πλακούντα και το μαστό (Σχήμα 5.11).
138
Σχήμα 5.11 Ηλεκτροφόρηση ισοενζύμων ALP (Ηλεκτροφητική κινητικότητα ισοενζύμων σε άτομο φυσιολογικό, με
ηπατική και πάθηση οστών).
Η ολική ALP αυξάνεται φυσιολογικά στις παρακάτω περιπτώσεις:

 κατά την κύηση, μετά το 2ο τρίμηνο (πλακουντιακό ισοένζυμο),
 σε αναπτυσσόμενα παιδιά (οστικό ισοένζυμο),
 μετά από πρόσληψη τροφής σε άτομα ομάδας αίματος Ο και Β Lewis θετικά, που εκκρίνουν την ουσία Η
της ομάδας αίματος (εντερικό ισοένζυμο).
Η πιο κοινή αιτία αυξημένης ολικής ALP είναι η ηπατοχολική νόσος. Οι τιμές της ολικής ALP είναι
παθολογικές στο 60% των περιπτώσεων. Σε συνδυασμό με τρανσαμινάσες και γGT βοηθά στην διαφορική
διάγνωση χολοστατικών καταστάσεων. Τα επίπεδα της ALP είναι υψηλά σε σχέση προς τις τιμές των
τρανσαμινασών σε χολόσταση και φυσιολογικά σε απουσία χολόστασης. Σε νόσους του ήπατος
φυσιολογικές ή ελάχιστα αυξημένες τιμές ALP σε συνδυασμό με υψηλές τιμές γGT υποδηλώνουν αλκοολική
ηπατική νόσο (Murray et al., 2011· Nelson & Cox, 2008).
Στον Πίνακα 5.17 δίνονται οι μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις.
139
Αύξηση της ALP Μείωση της ALP
 Νόσος του Paget  Υποθυρεοειδισμός
 Υπερπαραθυρεοειδισμός  Αναιμία
 Οστεομαλακία  Υποφωσφαταιμία
 Ραχίτιδα  Σκορβούτο
 Μεταστατικό καρκίνωμα οστών  Αχονδροπλασία κ.α.
 Οστεογενές σάρκωμα
 Κάταγμα οστών
 Μυέλωμα
 Νόσος του Hodgkin
 Σύνδρομο Cushing
 Μεγαλακρία
 Οξεία και χρόνια ιογενής ηπατίτιδα
 Αλκοολική ηπατίτιδα
 Κίρρωση ήπατος
 Αποφρακτικός ίκτερος
 Χολική κίρρωση
 Λοιμώδης μονοπυρήνωση
 Πρωτοπαθές ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα
 Καρκίνος ωοθήκης
 Καρκίνος όρχεων
 Ηπατικές μεταστάσεις
 Ελκώδης κολίτιδα κ.α.
Πίνακας 5.17 Μεταβολές της ALP σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις.
5.7.3 H Ηλεκτροφόρηση των Ισοενζύμων της Κρετανικής Κινάσης
Η κρεατινική κινάση (Creatine Kinase ή CK) αποτελεί ένα ένζυμο το οποίο καταλύει την αντιστρεπτή
μεταφορά φωσφορικού από την τριφωσφορική αδενοσίνη (ATP) στην κρεατινίνη.
𝐶𝐾
Κρεατινίνη + ATP → Φωσφορική κρεατινίνη + ADP
Με την διαδικασία αποθηκεύεται φωσφορικό υψηλής ενέργειας σε μορφή σταθερότερη του ATP. Η
CK βρίσκεται σε πολλούς ιστούς του ανθρώπινου οργανισμού. Οι μεγαλύτερες συγκεντρώσεις απαντούν στο
σκελετικό μυ, στον καρδιακό μυ, στον θυρεοειδή, στον εγκέφαλο και στον προστάτη. Σε μικρότερες
συγκεντρώσεις βρίσκεται στο ήπαρ, τους νεφρούς, τους πνεύμονες κ.α. Η αύξηση της CK του ορού
αποδίδεται κατά κύριο λόγο σε βλάβη γραμμωτών σκελετικών ή καρδιακών μυών (Σχήμα 5.12). Η
συγκέντρωση της CK του ορού αυξάνεται από 3 - 6 ώρες μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου και φτάνει μια
μέγιστη τιμή μετά από 24 ώρες.
140
Σχήμα 5.12 Γραφική παράσταση συγκέντρωσης βιοδεικτών στο αίμα μετά από έμφραγμα.
Η κρεατινική κινάση είναι ένα διμερές και αποτελείται από 2 υπομονάδες: Μ και Β. Η Μ
υπομονάδα κυριαρχεί στο σκελετικό μυ και η Β υπομονάδα κυριαρχεί στον εγκέφαλο. Τρία ισοένζυμα τα
οποία διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά συμπεριφέρονται ως διμερή: το CK-BB (CK1) αποτελείται από 2 Β
υπομονάδες [κυρίως στον εγκέφαλο], το CK-MB (CK2) αποτελείται από μία υπομονάδα Μ και μία Β
[κυρίως στην καρδιά] και το CK-MM (CK3) που αποτελείται από 2 υπομονάδες Μ [κυρίως στους
σκελετικούς μυς και στην καρδιά]. Με την ηλεκτροφόρηση τα ισοένζυμα αυτά διαχωρίζονται και
προσδιορίζονται (Σχήμα 5.13).
Σχήμα 5.13 Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός ισοενζύμων CK (Πίνακας 5.18).
141
Στον Πίνακα 5.18 δίνονται τα ισοένζυμα της CK και οι τιμές αναφοράς τους. Η δοκιμασία δεν πρέπει
να εκτελείται για επίπεδα της ολικής CK ≤ 150 U/L.
Ισοένζυμα CK Θέση Τιμές αναφοράς ως %

CK-BB (CK1) Κυρίως στον εγκέφαλο 0
CK-MB (CK2) Κυρίως στην καρδιά 0-3
CK-MM (CK3) Κυρίως στους σκελετικούς μυς και στην καρδιά 97 - 100
Πίνακας 5.18 Ισοένζυμα της CK και οι φυσιολογικές τους τιμές.
5.8 Ηλεκτροφόρηση Αιμοσφαιρίνης (Γλυκοζυλιωμένη Αιμοσφαιρίνη)
Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης [Hb] συμβάλλει στον προσδιορισμό των επιμέρους ειδών φυσιολογικών
αιμοσφαιρινών στο αίμα, όπως της αιμοσφαιρίνης Α, της αιμοσφαιρίνης Α2, της αιμοσφαιρίνης F, ή
παθολογικών αιμοσφαιρινών, όπως οι S, C, E κ.α. Η σημασία της ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών συμβάλλει
στη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών (κληρονομικές παθήσεις που οφείλονται σε μεταλλάξεις των
γονιδίων υπεύθυνων για την σύνθεση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης) (Φωτογραφία 5.8).
Αιμοσφαιρινοπάθειες είναι η δρεπανοκυτταρική αναιμία, η μεσογειακή αναιμία (ή θαλασσαιμία), κ.α. Η
συγκεκριμένη εξέταση αποτελεί ρουτίνα του προγεννητικού ελέγχου για την διάγνωση ή μη
αιμοσφαιρινοπαθειών στην αρχόμενη κύηση.
Φωτογραφία 5.8 Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης.
Οι φυσιολογικές αιμοσφαιρίνες του ανθρώπινου οργανισμού είναι η Α, η Α1 και η F. Η

αιμοσφαιρίνη Α (ή Α1) αποτελεί το βασικό συστατικό της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, ενώ η Α2 αποτελεί
μόνο το 2 - 3% της φυσιολογικής. Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη F είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου και
μετά τη γέννηση αντικαθίσταται από την Α1.
Η αιμοσφαιρίνη S είναι μία παθολογική αιμοσφαιρίνη που συνδέεται με τη δρεπάνωση των ερυθρών
αιμοσφαιρίων και την δρεπανοκυταρική αναιμία. Στη δρεπανοκυτταρική αναιμία, τα ερυθρά αιμοσφαίρια
έχουν σχήμα δρεπάνου), αντί του φυσιολογικού σφαιρικού, με αποτέλεσμα την πρόωρη καταστροφή τους,
που οδηγεί στην αναιμία (Φωτογραφία 5.9) (Αντωνέλου & Παπασιδέρη, 2015).
142
Φωτογραφία 5.9 Ερυθρά αιμοσφαίρια με φυσιολογικό σχήμα (σφαιρικό) και με παθολογικό σχήμα (σχήμα δρεπάνου).
Η κάθε μία από τις παραπάνω αιμοσφαιρίνες έχει κάποιο ηλεκτρικό φορτίο, συνεπώς μία καλή
μέθοδος διαχωρισμού τους είναι η διάβαση τους μέσα από ηλεκτρικό πεδίο. Κατά τη διάρκεια της
ηλεκτροφόρησης τα συστατικά της αιμοσφαιρίνης διαχωρίζονται σε ευδιάκριτες χρωματισμένες ζώνες, που
συγκρίνονται με τις ζώνες φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, για να εξαχθεί το ποσοστό του κάθε συστατικού.
Στον Πίνακα 5.19 δίνονται οι τιμές για φυσιολογικές και κάποιες αιμοσφαιρινοπάθειες, που μπορεί να
διαφέρουν από εργαστήριο σε εργαστήριο (Ζαμπέτα, 2015).
Αιμοσφαιρίνες Φυσιολογικά Ποσοστά Ποσοστά σε Παθολογικές Καταστάσεις

Ενήλικες Παιδιά Μεσογειακ Μεσογειακή Hg H Δρεαπανοκυττ
(%) ή Αναιμία Αναιμία αρική Αναιμία
(στίγμα)
ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ
Α (ήΑ1) 95 - 98
Α2 2-3 4 – 5,8 <2
F 0,8 – 2,0 6 μήνες: 8 2–5 10 – 90
> 6 μήνες: 1–2
Νεογνά (Hgb
F): 50–80
ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕΣ
S 0 70 - 98
Πίνακας 5.19 Ποσοστά (%) αιμοσφαιρινών σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις.
Αύξηση της παραγωγής της HbF κατά την ενήλικη ζωή, οφείλεται κυρίως:
 σε μεταλλάξεις που ρυθμίζουν θετικά την παραγωγή της HbF, γνωστές ως Κληρονομική Παραμονή της
HbF (HPFH), όπου η HbF κυμαίνεται από 3 - 20%,
 σε μεταλλάξεις που προκαλούν Μεσογειακή Αναιμία (δβ-ΜΑ), όπου η HbF κυμαίνεται από 5 - 20%, και
 σε περιπτώσεις πασχόντων από Μεσογειακή Αναιμία ή Δρεπανοκυτταρική Αναιμία, όπου η επαγωγή της
παραγωγής της HbF βελτιώνει την αιματολογική κατάσταση και την κλινική εικόνα των ασθενών και
 σε υψηλό ποσοστό της HbF που παράγεται (20 - 40%) σε περιπτώσεις συνδυασμών της ετερόζυγης β-
μεσογειακής αναιμίας και HPFH.
Πολλές φορές για την διάγνωση σακχαρώδους διαβήτη και προδιαβήτη ή για την παρακολούθηση
διαβητικών ατόμων και την υποβοήθηση λήψης θεραπευτικών αποφάσεων, απαιτείται ο προσδιορισμός της
γλυκιωμένης αιμοσφαιρίνης, η οποία αποτελεί το 5 - 8% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Η γλυκιωμένη
(γλυκοζυλιωμένη) αιμοσφαιρίνη (HbΑ1c) αποτελεί μια φυσιολογική μορφή της αιμοσφαιρίνης, που
βρίσκεται συνδεδεμένη με την γλυκόζη. Η αιμοσφαιρίνη συνδέεται μη ενζυμικά με την γλυκόζη σε
περίπτωση υπεργλυκαιμίας. Όσο πιο υψηλή είναι η συγκέντρωση της γλυκόζης, τόσο πιο υψηλή είναι και η
συγκέντρωση της γλυκιωμένης αιμοσφαιρίνης. Η τιμή της HbA1c εξαρτάται από τη μέση συγκέντρωση
143
της γλυκόζης του αίματος τις τελευταίες 3 με 6 εβδομάδες, γι’ αυτό και αποτελεί δείκτη της πορείας
της νόσου (Marshall & Bangert, 2001).
Σχήμα 5.14 Αντιστοίχιση τιμών σακχάρου (τιμές γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης και τιμές γλυκόζης αίματος [μέσο
ισοδύναμο πλάσματος]).
Η τιμή της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης εκφράζεται σε εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής

αιμοσφαιρίνης. Στα φυσιολογικά άτομα η τιμή αυτή είναι η εξής: HbA1 (A1a, A1b, A1c) = 5,0 - 8,0%, μέση
τιμή 6,5% HbA1c = 4,5 - 6,5%, μέση τιμή 5,0% Στους διαβητικούς ασθενείς, στους οποίους δεν ελέγχονται τα
επίπεδα της γλυκόζης, η τιμή του αιμοσφαιρινικού κλάσματος είναι σαφώς αυξημένο (2 - 3 φορές πάνω από
τη φυσιολογικό) (Μάλιου, 2015).
Σχήμα 5.15 Εφαρμογή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης (ανάλυση HbA1c σε φυσιολογικό και σε άτομο με διαβήτη).
144
Eπίδειξη χειρισμού αναλυτή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης, https://www.youtube.com/watch?v=9cSzlZClocw.

https://youtu.be/VujI8foF8tk?t=86
 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, https://www.youtube.com/watch?v=z2D7ZkT3aOo (τελευταία προσπέλαση

1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, https://www.youtube.com/watch?v=nWIWSk9Yz5Q (τελευταία προσπέλα-
ση 1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, https://www.youtube.com/watch?v=k7wByuIXdg8 (τελευταία προσπέλαση
1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, https://www.youtube.com/watch?v=bj70asFPWfE (τελευταία προσπέλα-
ση 1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης, https://www.youtube.com/watch?v=-e_fzMBwOC4 (τελευταία προσπέ-
λαση 1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση πηκτής (gel), https://www.youtube.com/watch?v=6_4AY3lYRgo (τελευταία προσπέλαση
1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση δισδιάστατη, https://www.youtube.com/watch?v=3wFh0z7so8w (τελευταία προσπέλαση
1/8/2015).
 Hλεκτροφόρηση αγαρόζης, https://www.youtube.com/watch?v=vq759wKCCUQ (τελευταία προσπέλαση
1/8/2015).

 Σχήμα 5.4 http://www.doping.chuv.ch/en/lad_home/lad-prestations-laboratoire/lad-prestations-
laboratoire-appareils/lad-prestations-laboratoire-appareils-ec.htm (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Σχήμα 5.5 http://www.doping.chuv.ch/en/lad-ec-zone-eng.jpg (τελευταία προσπέλαση 1/7/2015).
 Σχήμα 5.6 http://www.hygeia.gr/page.aspx?p_id=176 (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015).
145
 Σχήμα 5.8
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Monoclonal_gammopathy_Multiple_Myeloma.png#mediaviewer/
File:Monoclonal_gammopathy_Multiple_Myeloma.png (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015).
 Σχήμα 5.11 http://www.interlab-srl.com/en/test-menu/alp-isoenzymes-electrophoresis-kit (τελευταία προ-
σπέλαση, 1/4/2015).
 Σχήμα 5.12 http://www.diagnosticsupport.gr/ctni.htmL (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015).
 Σχήμα 5.14 http://www.ioanninamed.gr/index.php/topics/common-disease/65-diabetes-mellitus/203-
glycated-hemoglobin (τελευταία προσπέλαση, 1/4/2015).
 Σχήμα 5.15 http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0103-50532003000200016 (τελευ-
ταία προσπέλαση, 1/4/2015).
Aναφορές
1. ΑΝΤΩΝΕΛΟΥ, Μ. & ΠΑΠΑΣΙΔΕΡΗ, Ι. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμί-

δης – διαχωρισμός πρωτεϊνών ερυθροκυτταρικής μεμβράνης. Διαθέσιμο στο: http://multimedia.biol.uoa.gr
(τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
2. ΔΑΡΜΗ, Θ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών. ΤΕΙ Αθήνας. στο:
http://users.teiath.gr/tieedu/Web_TIE/Practical_Works/Thalia_Darmi (τελευταία προσπέλαση 26-2-
2015).
3. ΔΗΜΗΤΡΙΑΔΗΣ, Ι. (2015) Θεωρία και Πράξη των τεχνικών ηλεκτροφόρησης, ανοσοκαθήλωσης και ανο-
σοηλεκτροφόρησης. Διαθέσιμο στο: www.hellabio.com/dat/hellabio_storage (τελευταία προσπέλαση 26-2-
2015).
4. ΖΑΜΠΕΤΑ, Δ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο:www.mednet.gr (τελευταία προσπέλαση: 26-
2-2015).
5. ΠΕΤΡΟΣ, Κ., & ΑΥΓΟΥΣΤΙΝΟΣ, Α. (2015) Εργαστηριακές ασκήσεις βιολογίας. Διαθέσιμο στο:
www.class.eap.gr (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
6. ΦΥΤΟΥ-ΠΑΛΛΗΚΑΡΗ , Α. (2005). Θεωρία Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος.
7. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2012) Αρχές Ηλεκτροφόρησης. 1η έκδοση. Αθήνα: ΑΤΕΙ Αθήνας.
8. ΛΙΑΝΙΔΟΥ, Ε. (2015) Ηλεκτροφορητικές τεχνικές.
www.chem.uoa.gr/courses/Separations/Lianidou_electrophoresis.pdf (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
9. ΜΑΚΕΔΟΥ, Γ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών – λιποπρωτεϊνών. τελευταία προσπέλαση 26-2-2015.
http://www.eibbe.gr/details.php?id=13 (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
10. www.pharm.auth.gr (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
11. ΜΑΛΛΙΟΥ, Κ. (2015) Ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης. Διαθέσιμο στο: http://emedi.gr (τελευταία προ-
σπέλαση 26-2-2015)
12. ΝΤΑΛΑΜΑΓΚΑ, Μ. (2015) Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών, Πρακτική Εργαστηριακή Προσέγγιση. Διαθέσιμο
στο: www.eibbde.gr (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
13. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2001) Βασικά θέματα βιοχημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις
Π.Χ. Πασχαλίδης.
14. ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. & ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. (2011) Εξειδικευμένα θέματα κλινικής χημείας. Aθήνα: Ιατρι-
κές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.
15. ΣΑΟΥΛΗ, Ζ. (2015) Αιμοσφαιρινοπάθειες. Διαθέσιμο στο: www.aimatologos-saouli.gr/demosieuseis-
mou/aimosphairinopatheies (τελευταία προσπέλαση: 26-2-2015).
16. BAYNES, J. & DOMINICZAK, M. (2002) Ιατρική Βιοχημεία. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου.
η
17. BECKETT, G., WALKER, S., RAE, P., ASHBY, P. (2010) Κλινική Βιοχημεία. 7 έκδοση. Αθήνα:
Eκδόσεις Παρισιάνου.
18. DEVLIN, Μ. (2009) Βιοχημεία - Κλινικοί Συσχετισμοί Τόμος Ι & II. Αθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πα-
σχαλίδης.
19. HU, Y. (1996) The capillary electrophoresis. New York: Springer-Verlag.
20. KAPLAN, A., JACK, R., OPHEIM, K., TOIVOLA, B., LYON, A. (2003) Κλινική Χημεία – Δοκιμασίες
και Τεχνικές. 4η έκδοση. Αθήνα: Εκδόσεις Πασχαλίδης.
21. KOOLMAN, J. & ROEHM, K. (2007) Eγχειρίδιο Βιοχημείας. Αθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλί-
δης.
146
22. LOEFFLER, G. (2007) Βασικές Αρχές Βιοχημείας με στοιχεία Παθοβιοχημείας. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις
Π.Χ. Πασχαλίδης.
23. MARSHALL, W. & BANGERT, S. (2001) Κλινική Χημεία. Αθήνα: Εκδόσεις: Π. Χ. Πασχαλίδης (μετά-
φραση από το πρωτότυπο, Elsevier Inc).
24. MURRAY, R., BOTHAM, K., RODWELL, V., BENDER, D., KENNELLY, P., WEI, L., ANTHONY, P.
(2011) Harper’s Εικονογραφημένη Βιολογική Χημεία. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης.
25. NELSON, L. & COX, Μ. (2008) Αρχές της βιοχημείας. 1η έκδοση. Aθήνα: Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πα-
σχαλίδης.
26. GAW, A., MURPHY, M., COWAN, R., O’REILLY, D., STEWART, M., SHEPHERD, J. (2010) Κλινική
Βιοχημεία. 4η έκδοση. Αθήνα: Eκδόσεις Παρισιάνου.
27. ΣΠΑΝΟΣ, Ε. (2001) Κλινική χημεία. Αθήνα: Βιοϊατρική.
28. ΠΑΠΑΘΑΝΑΣΙΟΥ, Α. (2011) Γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη. Διαθέσιμο στο:
http://www.ioanninamed.gr (τελευταία προσπέλαση 26-2-2015).
147
ΑΝΟΣΟΧΗΜΙΚΟΙ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΙ
ΒΑΣΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ELISA
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι σημαντικότερες ανοσοχημικές τεχνικές και συγκεκριμένα οι αρχές
μεθόδων των ανοσοενζυμικών τεχνικών, των ραδιοανοσοενζυμικών τεχνικών και της χημειοφωταύγειας. Και
οι τρεις τεχνικές αποτελούν τους βασικούς τρόπους προσδιορισμών πρωτεϊνών ποιοτικά ή ποσοτικά.
Χρησιμοποιούν και οι τρεις αντισώματα αλλά επιπλέον ένζυμα, ραδιοισότοπα και χημικές ενώσεις
φωταύγειας.
Επίσης, θα περιγραφούν οι ανοσοχημικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται στη κλινική χημεία με τη
μορφή IVDs (βλ. Κεφάλαια 7 & 9). Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στις ανοσοενζυμικές μεθόδους και ιδιαίτερα
στην τεχνική ELISA, η οποία αποτελεί και την πλέον διαδεδομένη ανοσοχημική μέθοδο, λόγω της ευκολίας
της χρήσης της από την άποψη του εξοπλισμού, της τεχνικής, της ασφάλειας, αλλά και της ποικιλίας των
πρωτεϊνικών μορίων που μπορούν να προσδιοριστούν με αυτή.
Στο κεφάλαιο αυτό, θα διδαχθούν τεχνικές που βασίζονται μεταξύ άλλων στην απορρόφηση του φωτός.
Κατά συνέπεια είναι απαραίτητη η γνώση του Kεφαλαίου 1, που αφορά στις βασικές αρχές φωτομετρίας και
χρωματομετρικών αναλύσεων.
Oι ανοσοχημικοί προσδιορισμοί, όπως υπονοεί και η ονομασία τους, αναφέρονται σε εκείνη την κατηγορία
των αναλυτικών μεθόδων που συνδυάζουν τεχνολογίες χημείας και ανοσολογίας. Πρακτικά αναφέρονται
στις μεθόδους που χρησιμοποιούν τουλάχιστον μία φορά αντισώματα. Δεδομένου ότι τα αντισώματα
συνδέονται μόνο με πρωτεΐνες, είναι προφανές ότι οι μέθοδοι αυτοί χρησιμοποιούνται μόνο για τον ποσοτικό
ή ποιοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών και όχι άλλης οργανικής ή ανόργανης ένωσης.
Οι διαφορετικές αρχές μεθόδων που εφαρμόζουν, απαιτούν, όπως είναι αναμενόμενο, διαφορετικές
τεχνολογίες από τις φωτομετρικές αναλύσεις, δηλαδή διαφορετικά όργανα, διαφορετικά αντιδραστήρια και
διαφορετικούς αναλυτές. Η σύγχρονη τεχνολογία όμως, έχει οδηγήσει στην κατασκευή πολύ-αναλυτών, που
συνδυάζουν φωτομετρικές και ανοσοχημικές τεχνικές στην ίδια πλατφόρμα, μειώνοντας έτσι σημαντικά
κόστη σε υλικούς και ανθρώπινους πόρους.
6.2 Η βασική αρχή των Ανοσοχημικών τεχνικών
Οι ανοσοχημικοί αναλυτές μετρούν με ειδικό ανιχνευτή το σήμα που παράγεται από κάποια χημική
αντίδραση. Αυτή η χημική αντίδραση πυροδοτείται από την ένωση της πρωτεΐνης με το αντίσωμα και της
δημιουργίας ενός ανοσοσυμπλέγματος (Διαμαντής et al., 1987). Επειδή δε, μέσα στον οργανισμό τα
αντισώματα ενώνονται με αντιγόνα, οι πρωτεΐνες αυτές ονομάζονται γενικά «αντιγόνα», αν και πολλές φορές
απέχουν από την πραγματική έννοια του αντιγόνου της ανοσολογίας. Μπορεί δηλαδή να είναι πραγματικά
αντιγόνα, υπό την ανοσολογική έννοια, αλλά μπορεί να είναι και αντισώματα (π.χ. αντισώματα έναντι ιών)
καθώς και απτένια. Τα απτένια είναι πρωτεΐνες που διεγείρουν τον οργανισμό για την παραγωγή
αντισωμάτων παρά μόνο ύστερα από τη σύνδεση τους με μεγαλύτερες από αυτά πρωτεΐνες.
Υπάρχει μεγάλη ποικιλία ανοσοχημικών τεχνικών, ανάλογα με το σήμα που μετράται από αυτές,
τον αριθμό των αντισωμάτων που συμμετέχουν στις χημικές αντιδράσεις, αλλά και στον διαχωρισμό των
ανοσοσυμπλόκων (σύνδεση αντιγόνων – αντισωμάτων) από τα υπόλοιπα μέρη του διαλύματος. Στον Πίνακα
6.1 καταγράφονται οι σημαντικότερες κατηγορίες τους.
148
Θα πρέπει εδώ να τονιστεί, ότι στις ανοσοχημικές μεθόδους η μετατροπή της απορρόφησης σε
συγκέντρωση δεν είναι τόσο απλή όπως στις φωτομετρικές αναλύσεις. Σε αντίθεση με τις φωτομετρικές
αναλύσεις, οι καμπύλες βαθμονόμησης στις ανοσοχημικές αντιδράσεις δεν είναι πάντα ευθείες γραμμές
(Σχήμα 6.1). Οπότε δεν ισχύει η «απλή μέθοδος των τριών» που γνωρίσαμε στις φωτομετρικές αναλύσεις
τελικού σημείου (βλ. Κεφάλαια 1 & 2).
Σχήμα 6.1 Πιθανές καμπύλες αναφοράς σε ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές ανοσοχημικές μεθόδους. Οι
κατασκευαστές αναλυτών και αντιδραστηρίων προσπαθούν σήμερα να προσαρμόσουν τις καμπύλες αναφοράς σε ευθεία
γραμμή για να αυξήσουν την ευαισθησία τους.
Ανάλογα με το σήμα
Χρωματική αντίδραση Κρούσεις ραδιοϊσοτόπων Ένταση παραγόμενου φωτός
Ανοσοενζυμικές μέθοδοι Ραδιοανοσολογικές μέθοδοι Χημειοφωταύγεια
Ανάλογα με τον αριθμό των αντισωμάτων που συμμετέχουν στην αντίδραση
Ένα αντίσωμα Δύο αντισώματα
Ανταγωνιστικές μέθοδοι Μη ανταγωνιστικές μέθοδοι
Ανάλογα με τον διαχωρισμό ανοσοσυμπλόκων
Διαλυτό ανοσοσύμπλοκο Ακινητοποιημένο ανοσοσύμπλοκο
Ομογενείς μέθοδοι Ετερογενείς μέθοδοι
Πίνακας 6.1 Οι βασικές κατηγορίες των ανοσοχημικών μεθόδων.
6.3 Οι κατηγορίες των Ανοσοχημικών τεχνικών
6.3.1 Ομογενείς και Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι
Από τις δύο αυτές κατηγορίες συνηθέστερες είναι οι ετερογενείς μέθοδοι και από αυτές η ELISA (Enzyme
Linked Immunoassay Antibody) είναι αυτή που χρησιμοποιείται πολύ στις δια χειρός μεθόδους (manual).
Στις ετερογενείς μεθόδους τα αντισώματα είναι προσκολλημένα πάνω σε στερεή επιφάνεια (Σχήμα
6.2α). Τέτοιες συνηθισμένες επιφάνειες είναι ο πλαστικός πυθμένας των πηγαδιών (wells) μιας πλάκας
μικροτιτλοδότησης, ο πυθμένας γυάλινων ή συνηθέστερα πλαστικών σωληναρίων και η επιφάνεια
σφαιριδίων latex ή μαγνητικών σφαιρών. Οι ετερογενείς μέθοδοι επιλέγονται για αντιγόνα που έχουν την ίδια
χημική συμπεριφορά, είτε είναι ενωμένα με αντιγόνα, είτε όχι.
149
Αντίθετα, στις ομογενείς ανοσοχημικές μεθόδους τα ανοσοσύμπλοκα παραμένουν σε διαλυτή
μορφή μέσα στο διάλυμα αντίδρασης (Σχήμα 6.2β). Στις ομογενείς μεθόδους τα ενωμένα με τα αντισώματα
αντιγόνα έχουν διαφορετική συμπεριφορά από τα μη συνδεδεμένα. Έτσι, είναι δυνατή η μέτρησή τους, χωρίς
να χρειάζεται να απομακρυνθούν τα μη συνδεδεμένα. Αυτή η ιδιότητα των αντιγόνων στις ομογενείς
μεθόδους τις καθιστά εύκολα αυτοματοποιήσιμες, χωρίς αυτό να σημαίνει ότι δεν μπορούν να
αυτοματοποιηθούν και οι ετερογενείς μέθοδοι.
Σχήμα 6.2 Η σύνδεση αντιγόνων και αντισωμάτων σε ετερογενείς και ομογενείς μεθόδους. Κάθε αντίσωμα (συμβολίζεται
ως Υ λόγω του σχήματος του) μπορεί να ενωθεί με ένα ή δύο ίδια αντιγόνα σε εξειδικευμένες θέσεις που ονομάζονται
Fab1,2 καθώς και με μία σταθερή επιφάνεια με την τρίτη κενή θέση που ονομάζεται Fc.
6.3.2 Οι διαφορές των Ανοσοχημικών μεθόδων ανάλογα με τον Ιχνηθέτη
Υπάρχουν πολλών ειδών ιχνηθέτες που χρησιμοποιούνται στις ανοσοχημικές τεχνικές. Σε γενικές γραμμές
διακρίνονται σε ένζυμα, ραδιοισότοπα και μόρια χημειοφωταύγειας.
6.3.2.1 Όταν ο Ιχνηθέτης είναι Ένζυμο – οι Ανοσοενζυμικές μέθοδοι
Από τους τρεις διαφορετικούς ιχνηθέτες, αυτοί που προκαλούν μεγαλύτερη καθυστέρηση στην ολοκλήρωση
της μεθόδου είναι τα ένζυμα, αφού απαιτείται η αντίδραση τους με το υπόστρωμα και ο σχετικός επιπλέον
χρόνος επώασης. Παρ’ όλα αυτά οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι είναι οι πλέον διαδιδόμενες λόγω του εύκολου
και ασφαλούς χειρισμού τους.
Τριών ειδών ένζυμα χρησιμοποιούνται στις ανοσοενζυμικές μεθόδους. Και τα τρία καταλύουν
χρωμογόνα και φθορίζοντα υποστρώματα (Πίνακας 6.2).
Τα χρωμογόνα υποστρώματα οδηγούν στη παραγωγή έγχρωμου διαφανούς διαλύματος, το οποίο
μπορεί να απορροφήσει φως συγκεκριμένου μήκους κύματος. Ό,τι ακριβώς γίνεται δηλαδή, και στις
φωτομετρικές μεθόδους, όπου η μετατροπή της απορρόφησης σε συγκέντρωση βασίζεται στον γνωστό νόμο
του Lambert-Beer: A = ε d C (βλ. Ενότητα 1.6). Η απορρόφηση του φωτός μετράται σε κατάλληλο
φωτόμετρο που μετατρέπει την απορρόφηση σε συγκέντρωση χρησιμοποιώντας συγκεκριμένη καμπύλη
αναφοράς.
Αντίθετα, τα φθορίζοντα υποστρώματα παράγουν φθορισμό ύστερα από τη διέγερση τους με φως
συγκεκριμένου μήκους κύματος. Η ένταση του φθορισμού μετατρέπεται σε συγκέντρωση, βάση καμπύλης
αναφοράς, κατά κανόνα σε ειδικό αναλυτή. Γενικά τα φθορίζοντα υποστρώματα αποτελούν τη βασική
επιλογή στις αυτοματοποιημένες ανοσοενζυμικές μεθόδους.
Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι χαρακτηρίζονται από πολύ μεγάλη ποικιλία, αφού υπάρχουν
ετερογενείς (η γνωστή ELISA) αλλά και πολλές ομογενείς μέθοδοι (Σχήμα 6.3). Όπως και οι υπόλοιπες
ανοσοχημικές μέθοδοι διαιρούνται σε ανταγωνιστικές (Σχήμα 6.4) μη ανταγωνιστικές μεθόδους (Σχήμα 6.5).
150
Σχήμα 6.3 Τα τυπικά στάδια μιας μεθοδολογίας ELISA. Αριστερά φαίνεται μία ανταγωνιστική μεθοδολογία, όπου τα
ακινητοποιημένα αντισώματα δέχονται τα αντιγόνα του δείγματος, καθώς και τα σημασμένα αντιγόνα με κατάλληλο ένζυμο.
Δεξιά φαίνεται μία μη ανταγωνιστική μεθοδολογία, όπου τα αντιγόνα του ασθενούς καλύπτουν σχεδόν εξ’ολοκλήρου τα
ακινητοποιημένα αντισώματα και δέχονται πάνω τους μία δεύτερη ομάδα σημασμένων αντισωμάτων με κατάλληλο ένζυμο.
Και στις δύο περιπτώσεις το ένζυμο αντιδρά με το υπόστρωμα και παράγει έγχρωμο σήμα.
Σχήμα 6.4 Η διάταξη αντισωμάτων και αντιγόνου στις ανταγωνιστικές μεθόδους. Το ελεύθερο αντιγόνο προέρχεται από
τον ασθενή και δεσμεύει θέσεις σύνδεσης του σημασμένου αντιγόνου με κατάλληλο ιχνηθέτη.
151
Σχήμα 6.5 Η διάταξη αντισωμάτων και αντιγόνου στις μη ανταγωνιστικές μεθόδους. Το ελεύθερο αντιγόνο ενώνεται με
δύο αντισώματα εκ των οποίων το ένα (στις ετερογενείς μεθόδους) το ακινητοποιεί πάνω στη στερεή επιφάνεια και το
δεύτερο φέρει τον ιχνηθέτη που θα παράγει το σήμα για τον μέτρηση.
Ένζυμο Είδος Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος

ενζύμου κύματος
(nm)
Υπεροξειδάση Οξειδάση 2,2-άζινο δις-(3- ABTS 415
(ΗRP) αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-
σουλφονικό οξύ
3,3’,5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη TMB 450
Oρθo-φαινυλενοδιαμίνη OPD 492
Φθορίζοντα υποστρώματα Συντόμευση
π-υδροξυφαινυλοξεικό οξύ HPAA
3-(π-υδροξυφαινυλο) προπιονικό οξύ HPPA
Αλκαλική Υδρολάση Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος
φωσφατάση κύματος
(ALP) π-φωσφορική νιτροφαινόλη pNPP 405
4-μεθυλο φωσφορική ουμπελιφερόνη MUP
β- Υδρολάση Χρωμογόνα υποστρώματα Συντόμευση Μήκος
γαλακτοσιδάση κύματος
(β-GAL) o-νιτροφαινυλ-β-D- oNPG 420
γαλακτοπυρανοσίδη
Ερυθρό χλωροφαινόλης-β-D- CPRG 571
γαλακτοπυρανοσίδης
4-μεθυλουμπελιφερολ-β-D γαλακτοπυρανοσίδη MUG
Πίνακας 6.2 Τα κυριότερα υποστρώματα που χρησιμοποιούνται σε ανοσοενζυμικές μεθόδους (Ρίζος, 1994).
6.3.2.2 Όταν ο Ιχνηθέτης είναι Ραδιοισότοπο – οι Ραδιοανοσολογικές μέθοδοι
Οι ραδιοανοσολογικές μέθοδοι (RIA, IRMA) (Σχήμα 6.6) αποτελούν την παλαιότερη ανοσοχημική μέθοδο
(Yellow & Berson, 1959). Για την εφαρμογή τους έχουν κατά καιρούς χρησιμοποιηθεί διάφορα
ραδιοισότοπα, αλλά σήμερα αυτό που χρησιμοποιείται ευρέως είναι το 125I. To 125I έχει χρόνο ημίσειας ζωής
60 ημέρες, δηλαδή μέσα σε 60 ημέρες η ραδιενέργεια που εκπέμπει μειώνεται στο 50%. Aυτός ο χρόνος είναι
ικανοποιητικός για διαγνωστική χρήση.
Σε αντίθεση με τις ανοσοενζυμικές μεθόδους δεν είναι εύκολη η πλήρη αυτοματοποίηση τους, ενώ
έχουν το μεγάλο πλεονέκτημα της πολύ υψηλής ευαισθησίας, της ικανοποιητικής ταχύτητας, του χαμηλού
κόστους και της εύκολης σχετικά δημιουργίας των αντίστοιχων μεθόδων. Μειονέκτημα τους είναι η
επικινδυνότητα των ραδιοισοτόπων.
152
Το σήμα που μετράται στις ραδιοανοσολογικές μεθόδους είναι οι κρούσεις ανά λεπτό (cpm). Με
την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς είναι δυνατή η μετατροπή των κρούσεων σε συγκέντρωση
του αντιγόνου. Υπάρχουν ανταγωνιστικές (Σχήματα 6.4, 6.6) και μη ανταγωνιστικές ραδιοανοσολογικές
μέθοδοι (Σχήματα 6.5 & 6.6), όπου ανταγωνίζεται ή όχι το μετρούμενο αντιγόνο του ασθενούς (ψυχρό
αντιγόνο), με το αντιγόνο του αντιδραστηρίου που περιέχει ραδιοισότοπο (θερμό αντιγόνο) (Ευαγγελάτος,
1999).
Σχήμα 6.6 Τα τρία βασικά στάδια στις ραδιοανοσολογικές μεθόδους. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική μέθοδος (RIA),
όπου το θερμό αντιγόνο (αυτό που φέρει το ραδιοισότοπο 125Ι) ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά φαίνεται η
μη ανταγωνιστική μέθοδος (IRMA), όπου το ραδιοισότοπο είναι ενωμένο με αντίσωμα το οποίο ενώνεται με το
ακινητοποιημένο αντίγονο του ασθενούς από δεύτερο αντίσωμα.
6.3.2.3 Όταν ο Ιχνηθέτης είναι μόριο Φωταύγειας – η Χημειοφωταύγεια
Η χημειοφωταύγεια (CIA, ICMA) είναι το φυσικό φαινόμενο της παραγωγής φωτεινής ακτινοβολίας από μία
εξώθερμη χημική αντίδραση (A+B). Η οξειδοαναγωγική αυτή αντίδραση παρέχει την ενέργεια σε προϊόν
της, ώστε αυτό να διεγερθεί (C*). Καθώς αμέσως αποδιεγείρεται για να επιστρέψει σε σταθερή ενεργειακή
κατάσταση (C), εκπέμπει χαρακτηριστική φωτεινή ακτινοβολία (hv). Η συνολική αντίδραση περιγράφεται
απλοποιημένα από την εξίσωση: A + B → C* → C + hν
Η απόδοση της αντίδρασης σε φωτεινή ακτινοβολία, δηλαδή ο αριθμός των φωτονίων ανά μόριο
αντιδρώντος, εκφράζεται από τον «λόγο απόδοσης» που ισούνται με το κλάσμα: αριθμός εκπεμπόμενων
φωτονίων / αριθμός μορίων Α ή Β. Η μέγιστη τιμή του λόγου είναι η μονάδα, προς την οποία πλησιάζει η
εκπομπή του φωτός, που παράγει το έντομο της πυγολαμπίδας κατά την οξείδωση του μορίου της
λουσιφερόλης. Στην εργαστηριακή πάντως τεχνολογία το σήμα της χημειοφωταύγειας ονομάζεται «σχετική
μονάδα φωτός» (Relative Light Unit).
Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα σήμερα μόρια παραγωγής φωταύγειας είναι οι κυκλικές
υδραζίδες (λουμινόλη, ισολουμινόλη, αμινικά παράγωγα της ισολουμινόλης), οι εστέρες της ακριδίνης, τα
διοξετάνια και τα άλατα του ρουθηνίου.
Η χημειοφωταύγεια αποτελεί τη νεώτερη ανοσοχημική μέθοδο και την πλέον αυτοματοποιημένη.
Είναι ταχύτατη, προσεγγίζει την ευαισθησία των ραδιοανοσολογικών μεθόδων, αλλά παράλληλα είναι
ασφαλέστερη από αυτές. Οι μέθοδοι της χημειοφωταύγειας έχουν όμως μεγάλο κόστος, δεδομένου ότι
παρέχονται πλήρως αυτοματοποιημένες. Υπάρχουν ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές μέθοδοι
χημειοφωταύγειας (Σχήμα 6.7).
153
Σχήμα 6.7 Τα τρία βασικά στάδια στις μεθόδους χημειοφωταύγειας. Το σχήμα αναπαριστάνει μία άμεση ετερογενή
μέθοδο, όπου τα αντισώματα είναι ακινητοποιημένα πάνω σε μεταλλικές μπίλιες. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική
μέθοδος (CIA), όπου το σημασμένο αντιγόνο (φέρει εστέρα ακριδίνης) ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά
φαίνεται η μη ανταγωνιστική μέθοδος (ICMA, όπου ο εστέρας ακριδίνης είναι ενωμένος με αντίσωμα το οποίο ενώνεται
με το ακινητοποιημένο αντίγονο του ασθενούς από δεύτερο αντίσωμα.
6.3.3 Ανταγωνιστικοί και μη Ανταγωνιστικοί μέθοδοι
Μία σημαντική διαφοροποίηση των ανοσοχημικών μεθόδων είναι αυτή μεταξύ ανταγωνιστικών και μη
ανταγωνιστικών μεθόδων. Η επιλογή μεταξύ των δύο αυτών μεθοδολογιών μεθόδων έχει να κάνει με τον
αριθμό των «επιτόπων» πάνω στο αντιγόνο που πρόκειται να μετρηθεί. Οι επίτοποι είναι θέσεις πάνω στα
αντιγόνα στις οποίες ενώνονται τα αντιγόνα.
Όταν το αντιγόνο έχει δύο επιτόπους μπορεί να συνδεθεί με δύο αντισώματα ίδια ή διαφορετικά.
Αυτά τα αντιγόνα μπορεί να είναι ορμόνες π.χ. TSH, δείκτες καρκίνου π.χ. CEA, Ferr, TSH, PSA, αλλά και
αντιγόνα των ιών HBV, HIV, HCV. H μέθοδος αυτή ονομάζεται μη ανταγωνιστική ή αλλιώς Sandwitch. Σε
αυτή την περίπτωση το αντιγόνο ακινητοποιείται μεταξύ δύο αντισωμάτων. Το πρώτο αντίσωμα είναι
σταθερά ενωμένο πάνω σε στερεή φάση και το δεύτερο φέρει τη σήμανση (Σχήμα 6.5). Σε αυτή την
περίπτωση το σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του αντιγόνου και αυξάνεται, όσο αυξάνεται η
συγκέντρωσή του (Σχήμα 6.1α).
Αντίθετα, όταν το αντιγόνο έχει ένα μόνο επίτοπο, χρησιμοποιούνται οι ανταγωνιστικές μέθοδοι.
Στις ανταγωνιστικές μεθόδους το αντιγόνο είναι σε έλλειψη και καταλαμβάνει ένα μέρος μόνο από τις
διαθέσιμες θέσεις σύνδεσης των αντισωμάτων. Σε αυτή την περίπτωση το αντιγόνο του ασθενούς
ανταγωνίζεται άλλο αντιγόνο που φέρει σήμανση (Σχήμα 6.4). Κατά συνέπεια το παραγόμενο σήμα είναι
αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης του αντιγόνου δηλαδή αυξάνεται, όσο μειώνεται το παραγόμενο
σήμα (Σχήμα 6.1β).
Γενικά, οι μη ανταγωνιστικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται για αντιγόνα μεγαλύτερου μοριακού
βάρους από αυτά των ανταγωνιστικών μεθόδων, αφού οι τελευταίες χρησιμοποιούνται ακόμα και για τον
προσδιορισμό απτενίων, που έχουν πολύ μικρό σχετικά μοριακό βάρος. Επιπλέον, είναι ταχύτερες και με
πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία. Η υψηλή τους ευαισθησία οφείλεται και στην καμπύλη αναφοράς τους, η
οποία συνηθέστερα είναι ευθεία γραμμή σε αντίθεση με τις ανταγωνιστικές που συνήθως είναι σιγμοειδής
(Σχήμα 6.1).
154
ΕΙΑ Aνοσοενζυμική μέθοδος
SFIA Φθορισμο-ανοσοενζυμική μέθοδος
ELISA Ανοσο-απορροφητική μέθοδος συνδεδεμένου ενζύμου
RIA Ραδιοανοσολογική μέθοδος
IRMA Ραδιοανοσομετρική μέθοδος
RAST Ραδιοαλλεργιοαπορροφητική μέθοδος
RIST Ραδιοανοσοαπορροφητική μέθοδος
CIA Ανοσοχημειοφωταύγεια
ICMA Ανοσοχημειοφωταυγειομετρική μέθοδος
eCLIA/ECL Ηλεκτροχημειοφωταύγεια
FPIA Ανάλυση πολωμένου φθορισμού
PACIA Μικροσωματιδιακή ανοσοενζυμική ανάλυση
ICIA Τεχνολογία δέσμευσης ιόντων
ΕΜΙΤ Aνοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος
LOCI Ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου
FETI Μέθοδος μεταφοράς φθορισμομετρικής ενέργειας
TR-FIA Mέθοδος χρονικά διαχωριζομένου φθορισμού
SL-FIA Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί με επισημασμένο υπόστρωμα
DELFIA Ανοσοφθορισμομετρική ενισχυμένη διάσταση λανθανιδών
Πίνακας 6.3 Αυτοματοποιημένες ανοσοχημικές μέθοδοι.
Παράμετροι απόδοσης Ανοσοχημικές μέθοδοι

ΕΙΑ - ELISA RIA - IRMA CIA, CLIA
Ευαισθησία Πολύ καλή Πολύ υψηλή Υψηλή
Ακρίβεια Υψηλή Υψηλή Υψηλή
Σταθερότητα Υψηλή Μέτρια Υψηλή
αντιδραστηρίου
Τεχνικός εξοπλισμός Φθορισμόμετρο Μετρητής γ ή β ακτινοβολίας Φωταυγειόμετρο
Φωτόμετρο Αυτόματος αναλυτής
Γυμνό μάτι
Αυτόματος αναλυτής
Νομικές υποχρεώσεις Όχι Ναι Όχι
Εξειδίκευση προσωπικού Μέτρια Υψηλή Μέτρια
Χρόνος εξέτασης * ** *
Αυτοματισμός Ναι Ναι Ναι
Πίνακας 6.4 Σύγκριση των τριών κατηγοριών ανοσοχημικών μεθόδων (Ρίζος, 1994).
6.4 Οι Ετερογενείς Ανοσοχημικές μέθοδοι, η ELISA
Για να γίνουν κατανοητές οι ανοσοχημικές μέθοδοι θα περιγραφεί αναλυτικά η κυριότερη εκπρόσωπος

αυτών η ELISA. Δεδομένου ότι η ELISA είναι ιδιαίτερα ασφαλής για την υγεία των χειριστών και δεν
απαιτεί αυτόματο εξοπλισμό αποτελεί την καλύτερη επιλογή για τη διδασκαλία των ανοσοχημικών μεθόδων
στο εργαστήριο κλινικής χημείας.
155
Στις ανοσοενζυμικές μεθόδους ο ιχνηθέτης είναι ένζυμο. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται είναι τα
HRP, ALP και β-GAL (Πίνακας 6.2) και τα υποστρώματα τους μπορεί να είναι χρωμογόνα ή φθορισμογόνα.
Από αυτά, τα χρωμογόνα υποστρώματα χρησιμοποιούνται τόσο σε αυτόματες, όσο και σε χειρονακτικές
μεθόδους, ενώ αντίθετα τα φθορισμογόνα υποστρώματα χρησιμοποιούνται αποκλειστικά πλέον σε
αυτόματους αναλυτές. Η επιλογή κάθε ενζύμου και υποστρώματος γίνεται με βάση την προσδοκώμενη
ευαισθησία, επαναληψιμότητα, ταχύτητα αντίδρασης, τυχόν παρεμβολές στην αναλυτική μέθοδο και άλλα
κ.α. Για παράδειγμα τα φθορισμογόνα υποστρώματα εξασφαλίζουν μεγαλύτερη ευαισθησία από τα
χρωμογόνα. Η υπεροξειδάση απαιτεί μικρότερη επώαση από τα άλλα δύο ένζυμα, ενώ η αλκαλική
φωσφατάση και η β-γαλακτοσιδάση εξασφαλίζουν καλύτερη επαναληψιμότητα, μετά από μεγάλο χρόνο
επώασης.
Οι ανοσοενζυμικές μέθοδοι μπορεί να είναι ανταγωνιστικές και μη ανταγωνιστικές, ομογενείς ή
ετερογενείς. Ειδικότερα εδώ θα αναφερθούμε στις ετερογενείς μεθόδους σε αυτές δηλαδή, που ένα από τα
αντισώματα του αντιγόνου είναι κολλημένο πάνω σε στερεή επιφάνεια. Η προσκόλληση αυτή εξασφαλίζεται
με τις παρακάτω μεθόδους (Ternynck & Avrameas, 1988):
1. Ένωση αντισώματος με πλαστική επιφάνεια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές και κυρίως υδρόφοβες δυνά-
μεις. Είναι η πιο συνηθισμένη περίπτωση, αφού χρησιμοποιείται στα «πηγαδάκια» των πλακών ELISA.
2. Ένωση αντισώματος με μαγνητικά σφαιρίδια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές δυνάμεις. Xρησιμοποιείται
σε αυτόματες μεθόδους χημειοφωταύγειας κ.α.
3. Ένωση αντισώματος με σφαιρίδια πολυακρυλαμίδης, κυτταρίνης, αγαρόζης. Γίνεται με χημικό δεσμό
και χρησιμοποιείται σε αυτόματες μεθόδους.
4. Ένωση αντισώματος με γυάλινα σωληνάρια. Γίνεται με ηλεκτροστατικές δυνάμεις, αλλά δεν χρησιμο-
ποιείται ιδιαίτερα σε αντιδραστήρια IVDs.
Η ένωση αντιγόνου – αντισώματος γίνεται εύκολα λόγω της χημικής συγγένειας των δύο μορίων.
Αντίθετα, η ένωση ενζύμου - υποστρώματος απαιτεί συγκεκριμένες χημικές συζεύξεις, δηλαδή χημικές
γέφυρες. Οι συζεύξεις αυτές άλλοτε εξασφαλίζουν απλά τη σταθερή ένωση ενζύμου και αντισώματος και
άλλοτε ενισχύουν σημαντικά το παραγόμενο σήμα.
Αυτές οι συζεύξεις γίνονται με (Λιβανίου, 1998):
Υπεριωδικό νάτριο. Χρησιμοποιείται αποκλειστικά για τη σύζευξη της υπεροξειδάσης με αντισώματα μέσω
της υδατανθρακικής περιοχής του αντισώματος και της υπεροξειδάσης. Επειδή η υδατανθρακική περιοχή δεν
συμμετέχει συνήθως στην ένωση ενζύμου και αντισώματος δεν επηρεάζεται η ενζυμική δραστικότητα.
 Γλουταλδεύδη. Εξασφαλίζει τη διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ ενζύμου και αντισώματος μέσω των
ελεύθερων ε-αμινομάδων της λυσίνης.
 Σύμπλεγμα αβιδίνης – βιοτίνης και στρεπταβιδίνης - βιοτίνης.
Η βιοτίνη είναι μία μικρή πρωτεΐνη (ΜΒ = 244 D) που ανήκει στη κατηγορία των βιταμινών (βιταμίνες Η,
Β7). Βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Η βιοτίνη
μπορεί να ενωθεί με πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες μεταξύ των οποίων ένζυμα και αντισώματα,
δημιουργώντας μεταξύ τους μία γέφυρα ανάμεσα στο ένζυμο και το αντίσωμα. Λόγω μεγέθους όμως, μπορεί
να ενωθεί είτε με το ένα, είτε με το άλλο. Για να επιτελέσει επομένως τον ρόλο της χρειάζεται ένα ακόμα
ενδιάμεσο μόριο. Αυτό μπορεί να είναι είτε η αβιδίνη, είτε η στρεπταβιδίνη.
Η αβιδίνη είναι ένα μόριο με 4 ενεργά κέντρα (ΜΒ περίπου 65000 D) με τα οποία μπορεί να
αντιδράσει με τη βιοτίνη, αλλά και πολλές άλλες πρωτεΐνες με μη ειδικό τρόπο (Σχήμα 6.8). Βρίσκεται σε
πολλά κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο σε πολλές μεταβολικές διαδικασίες. Στην εργαστηριακή
τεχνολογία χρησιμοποιείται για την ένωσή της με το μόριο της βιοτίνης, όχι όμως με τόσο ισχυρή χημική
συγγένεια, όπως συμβαίνει με το μόριο της στρεπταβιδίνης. Πλεονεκτεί από τη στρεπταβιδίνη στο ότι
παράγεται εύκολα από αυγά κότας.
Η στρεπταβιδίνη παρόμοια με την αβιδίνη είναι ένα τετραμερές μόριο μοριακού βάρους 60.000 D.
Σε αντίθεση με την αβιδίνη επιτυγχάνει ειδική σύνδεση με τη βιοτίνη λόγω της διαφορετικής αμινοξικής της
ακολουθίας. Η παραγωγή της όμως, είναι δυσκολότερη και μεγαλύτερου κόστους, αφού προέρχεται από τον
Streptomyces avidinii.
156
Σχήμα 6.8 Αναπαράσταση της ένωσης των συμπλεγμάτων βιοτίνης – αβιδίνης και βιοτίνης – στρεπταβιδίνης. Τα δύο αυτά
συμπλέγματα έχουν τη δυνατότητα να ενώνονται με πολλά ένζυμα αυξάνοντας έτσι σημαντικά το παραγόμενο σήμα.
6.4.1 Βασικά αντιδραστήρια και αναλώσιμα που περιέχονται στα kits της ELISA
1. Πηγαδάκια μικροτιτλοδότησης: Πρόκειται για πλαστική πλάκα που περιέχει 96 μικροπηγαδάκια (mi-
crowells) και είναι επικαλυμμένα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης που θέλουμε να με-
τρήσουμε. Ο όγκος των αντιδραστηρίων που μπορούν να χωρέσουν, είναι περίπου 300 μL (Σχήμα 6.9).
Διατηρούνται στο ψυγείο και σε κάποιες περιπτώσεις και σε θερμοκρασία δωματίου. Σε κάθε όμως περί-
πτωση είναι απαραίτητο να παραμείνουν σε στεγνό περιβάλλον, αφού η αυξημένη θερμοκρασία θα αλ-
λοιώσει τα προσκολλημένα σε αυτά αντισώματα.
2. Βαθμονομητές (standards ή calibrators). Για τους ποσοτικούς προσδιορισμούς χρησιμοποιούνται πολλά
standards, συνήθως 1 έως 6. Πρόκειται για μικρά φιαλίδια του 1 mL έτοιμα προς χρήση. Χρησιμοποιού-
νται για τη δημιουργία της καμπύλης αναφοράς (calibration).
3. Διαλύματα ελέγχου (control samples). Πρόκειται για μικρά φιαλίδια συνήθως των 0,5 mL με διαφορετι-
κού χρώματος καπάκια για να ξεχωρίζουν.
4. Σύζευγμα ενζύμου (conjugate). Περιέχει αντίσωμα ενωμένο με ένζυμο. Eίναι έτοιμο προς χρήση.
5. Υπόστρωμα (substrate). Είναι η ουσία που θα αντιδράσει με το ένζυμο του conjugate. Αυτή η χημική
αντίδραση θα παράγει χρώμα του οποίου η ένταση θα μετρηθεί στο φωτόμετρο.
6. Διάλυμα τερματισμού της αντίδρασης (stop solution). Πρόκειται για ένα ισχυρό οξύ (H2SO4), που χρησι-
μεύει για τη διακοπή της αντίδρασης ενζύμου και υποστρώματος. Αμέσως μετά μπορεί να γίνει η φωτο-
μέτρηση.
7. Διάλυμα πλύσης (wash solution). Πρόκειται για ένα συμπυκνωμένο διάλυμα (π.χ. 40Χ), το οποίο πρέπει
να αραιωθεί πριν τη χρήση του με απεσταγμένο νερό. Παρόλα αυτά διατηρείται στο ψυγείο για περιορι-
σμένο χρονικό διάστημα. Συνηθισμένα απορρυπαντικά είναι τα BND (5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο) και
το ΜΙΤ (2-μεθυλ-4-ισοθειαζολ-3-όνη).
Σχήμα 6.9 Πλάκα μικροτιτλοδότησης της ELISA. Όλες οι πλάκες έχουν από 96 πηγαδάκια.
157
6.4.2 Υλικά και Εξοπλισμός που δεν παρέχονται με τα kits
To εργαστήριο που εκτελεί μεθόδους ELISA χρειάζεται εξοπλισμό αναλωσίμων και ηλεκτρονικών
συσκευών. Σήμερα στην αγορά κυκλοφορούν αυτόματοι αναλυτές ELISA, που μπορούν να εξυπηρετήσουν
ταυτόχρονα από δύο έως πολύ περισσότερες πλάκες ELISA (Φωτογραφία 6.1). Μπορούν να
πραγματοποιήσουν όλα τα στάδια, όπως προαραίωση δειγμάτων, τοποθέτηση δειγμάτων και
αντιδραστηρίων, πλυσίματα, φωτομέτρηση και αυτόματο υπολογισμό των συγκεντρώσεων. Απευθύνονται
όμως σε εργαστήρια που έχουν μεγάλο αριθμό δειγμάτων.
Φωτογραφία 6.1 Αυτόματοι αναλυτές ELISA διαφόρων εταιρειών (Human, Menarini, Biobase). Kάθε αναλυτής μπορεί
να τρέχει τουλάχιστον δύο πλάκες ELISA ταυτόχρονα.
Η ELISA είναι μία μέθοδος που με λίγα σχετικά όργανα μπορεί να «τρέξει» σε μικρό διαγνωστικό
εργαστήριο, ερευνητικό ίδρυμα, ακόμα και σε εκπαιδευτικό.
Απαραίτητα όργανα Προαιρετικά όργανα

Μονή πιπέττα ενός ή ρυθμιζόμενου όγκου Αυτόματη πλυστική συσκευή
Διηθητικό χαρτί για το τίναγμα των πλακών ELISA Πιπέττα 8 ή 12 καναλιών
Φωτόμετρο ELISA Θάλαμο υγρασίας (όπου χρειάζεται)
Πλαστικό κάλυμμα για την αποφυγή εξάτμισης (όπου
χρειάζεται)
Πίνακας 6.5 Βασικός και προαιρετικός εξοπλισμός για την εκτέλεση της μεθόδου ELISA.
6.4.3 Τα βασικά στάδια της μεθοδολογίας ELISA
Παρακάτω θα περιγραφούν τα στάδια μιας τυπικής ELISA δύο σταδίων (Σχήμα 6.3). Η ΕLISA δύο σταδίων,
σε αντίθεση με την ταχύτερη ELISA ενός σταδίου, περιλαμβάνει στάδια επώασης και πλύσης πριν την
τοποθέτηση του συνδέτη. Αυτό εξασφαλίζει την απομάκρυνση ουσιών, που μπορεί να προκαλέσουν
παρεμβολές στις ανοσοχημικές μεθόδους (βλ. στο τέλος του Κεφαλαίου). Το μειονέκτημα της είναι ότι
απαιτεί μεγαλύτερο χρόνο επώασης από την ELISA ενός σταδίου και για αυτό επιλέγεται όπου πραγματικά
χρειάζεται καλό πλύσιμο και διαχωρισμός ουσιών.
1. Απόψυξη των αντιδραστηρίων (Φωτογραφία 6.2). Δείγματα, υλικά αναφοράς, υλικά ελέγχου, αντιδρα-
στήρια και πλάκες μικροτιτλοδότησης πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου, πριν τη χρήση τους.
Χωρίς αυτήν, μπορεί να προκύψουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
158
Φωτογραφία 6.2 Ένα τυπικό kit ELISA (της εταιρείας ReQuest). Φαίνεται η πλάκα μικροτιτλοδότησης ή πλάκα ELISA,
τα διαλύματα των conjugate, stop, wash, enzyme και substrate, καθώς και τα μικρά σωληνάρια των controls και των
calibrators.
2. Τοποθέτηση βαθμονομητών. Κατά κανόνα εισάγονται 100 μL ή και 50 μL σε κάθε πηγαδάκι. Η απόρ-
ριψη από την αυτόματη πιπέττα γίνεται προσεκτικά στα τοιχώματα του πηγαδιού, χωρίς να σχηματίζονται
φυσαλίδες (Σχήμα 6.10). Οι βαθμονομητές μπαίνουν πάντα εις διπλούν, ξεκινώντας από τον βαθμονομη-
τή με τη μεγαλύτερη ή μικρότερη συγκέντρωση και προχωρώντας στη συνέχεια κατά αύξουσα ή φθίνου-
σα σειρά αντίστοιχα.
Σχήμα 6.10 Η σωστή απόρριψη δείγματος και αντιδραστηρίων μέσα στα πηγαδάκια της πλάκας ELISA.
3. Tοποθέτηση δειγμάτων ελέγχου. Τοποθετούνται 100 μL ή 50 μL σε κάθε πηγαδάκι και σε κάθε περί-
πτωση σε ίση ποσότητα με τα δείγματα. Υπάρχει θετικό και αρνητικό δείγμα ελέγχου καθένα από τα ο-
ποία έχει όρια ελέγχου, τα οποία δεν πρέπει να παραβιαστούν από τη συγκέντρωση των δειγμάτων ελέγ-
χου που θα υπολογιστούν στην πορεία. Προτείνεται τα δείγματα ελέγχου και τα δείγματα των ασθενών να
τοποθετούνται εις διπλούν.
4. Τοποθέτηση δειγμάτων. Τοποθετούνται 100 μL ή 50 μL δείγματος ασθενών σε κάθε πηγαδάκι. Αν και
είναι ασφαλέστερο να τοποθετούνται επίσης εις διπλούν συνηθίζεται να μπαίνουν και μονά δείγματα. Σε
πολλές περιπτώσεις τα δείγματα πρέπει να αραιωθούν πρώτα με κατάλληλο διαλύτη. Αυτό όμως δεν είναι
απαραίτητο για τους βαθμονομητές και τα δείγματα ελέγχου.
5. Επώαση. Σε αυτό το στάδιο, η επώαση απαιτείται για την πρόσδεση των αντιγόνων (βαθμονομητών,
δειγμάτων ελέγχου, δειγμάτων ασθενών) στα αντισώματα που είναι ακινητοποιημένα στον πυθμένα. Γίνε-
ται σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Σε πολλά kits αυτή η επώαση πα-
ραλείπεται.
6. Έκπλυση. Αποσκοπεί στην απομάκρυνση των αντιγόνων που δεν προσδέθηκαν και γενικά όλων των συ-
στατικών των δειγμάτων, που δεν χρειάζονται για τις περαιτέρω αντιδράσεις. Γίνεται με ειδικό απορρυ-
159
παντικό που έχει παρασκευαστεί σε κατάλληλη ποσότητα, πριν τη χρήση. Κατά την πλύση τοποθετούνται
100 μL wash σε κάθε πηγαδάκι. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται τουλάχιστον 3 φορές. Το πλύσιμο μπορεί
να γίνει με αυτόματο μηχάνημα εκπλύσεως για ELISA (Φωτογραφία 6.3) ή χειρονακτικά χρησιμοποιώ-
ντας απλή, ηλεκτρονική ή οκτακάναλη πιπέττα (Σχήμα 6.11). Στο τέλος των πλυσιμάτων τα πηγαδάκια
αποστραγγίζονται για να μην έχουν υλικό ή φυσαλίδες.
Φωτογραφία 6.3 Αυτόματα πλυστικά ELISA διαφόρων εταιρειών (Biotek, Thermo). Αν και η έκπλυση των πλακών
ELISA μπορεί να γίνει και χειρονακτικά με τη βοήθεια οκτακάναλης πιπέττας, το αυτόματο πλύσιμο είναι γρήγορο και
αποτελεσματικό.
Σχήμα 6.11 Τύποι πιπεττών που μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμασίες ELISA. Πιπέττες με ένα, οκτώ ακόμα και με
δώδεκα ρύγχη μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν.
7. Τοποθέτηση συνδέτη. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα. Συνήθως τοποθετούνται 100 μL
αλλά κάθε kit έχει δικές του οδηγίες. Σε πολλά kits o συνδέτης ενώνεται απευθείας με τα αντιγόνα, χωρίς
να προηγείται αραίωση ή πλύση.
8. Επώαση. Γίνεται σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Συνήθως η επώαση
αυτή καταναλώνει το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, περίπου μία ώρα με ανοχή ± 5 λεπτά.
9. Έκπλυση. Γίνεται με ειδικό απορρυπαντικό, που έχει παρασκευαστεί σε κατάλληλη ποσότητα πριν τη
χρήση.
10. Τοποθέτηση υποστρώματος. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα. Συνήθως τοποθετούνται
100 μL. Μόλις τοποθετηθεί το υπόστρωμα αρχίζουν τα δείγματα βαθμονομητών, ελέγχου και ασθενών να
αλλάζουν χρώμα. Η ύπαρξη χρώματος είναι ενδεικτική θετικής αντίδρασης.
11. Επώαση. Γίνεται συνήθως σε θερμοκρασία δωματίου και ο χρόνος ποικίλει ανάλογα με το kit. Συνήθως
είναι ο μικρότερος χρόνος σε διάρκεια. Αν το υπόστρωμα είναι το TMB (τρι-μεθυλο-βενζιδίνη), τότε η
επώαση θα πρέπει να γίνει στο σκοτάδι.
12. Τοποθέτηση διαλύματος τερματισμού. Τοποθετείται αμέσως μετά το υπόστρωμα χωρίς ενδιάμεσο πλύ-
σιμο. Τοποθετείται σε όλα τα πηγαδάκια ίση ποσότητα (100 μL). Μόλις τοποθετηθεί το διάλυμα τερματι-
σμού στα πηγαδάκια, αυτά παίρνουν το τελικό τους χρώμα.
13. Υπολογισμός των απορροφήσεων. Ο προσδιορισμός γίνεται σε ειδικό φωτόμετρο για πλάκες ELISA
(Φωτογραφία 6.4). Συνιστάται να γίνεται σε δύο μήκη κύματος, για να εξαλείφονται τυχόν παρεμβολές
στο χρώμα από αιμοσφαιρίνη, χολερυθρίνη κ.α. Το τελικό χρώμα παραμένει σταθερό συγκεκριμένο χρο-
νικό διάστημα, που συνήθως παρατείνεται εάν διατηρηθούν στο ψυγείο.
160
Φωτογραφία 6.4 Φωτόμετρα για πλάκες ELISA. Διαδοχικά μοντέλα της ίδιας εταιρείας (Stat Fax), που δείχνουν και την
εξέλιξη του αυτοματισμού (διαδοχικά τα μοντέλα 303+, 2100, 4300, 4400).
14. Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων και των controls γίνεται υπολογιστικά μετά την
κατασκευή πρότυπης καμπύλης. Η καμπύλη είναι σιγμοειδής ή γραμμική και οι υπολογισμοί των συγκε-
ντρώσεων των δειγμάτων και των controls μπορούν να γίνουν είτε με γραφικό, είτε με μαθηματικό τρόπο.
6.5 Εργαστηριακό μέρος

Παραδείγματα Ανταγωνιστικής και μη Ανταγωνιστικής ELISA
Η ανταγωνιστική και η μη ανταγωνιστική ELISA δεν διαφέρουν τόσο στα στάδια της ανάλυσης, όσο στην
φιλοσοφία τους που αντικατοπτρίζεται και στους υπολογισμούς μετατροπής της απορρόφησης σε
συγκέντρωση.
Η βασική πορεία εργασίας για τις μεθόδους ELISA είναι περίπου η ίδια για ανταγωνιστικές και μη
ανταγωνιστικές μεθόδους. Σε αυτό το κεφάλαιο, θα δούμε δύο παραδείγματα από ανταγωνιστική και μη
ανταγωνιστική ELISA από εμπορικά kit της διεθνούς αγοράς.
6.5.1 Ο προσδιορισμός της FT3 με ELISA
H oρμόνη FΤ3 προσδιορίζεται ευρέως σε νοσήματα του θυροειδούς. Οι τιμές αναφοράς της είναι 1,4 – 4,2
pg/mL. Έχει μοριακό βάρος 651 D. Είναι δηλαδή μια εξαιρετικά μικρή πρωτεΐνη. Προσδιορίζεται με
ανταγωνιστική μέθοδο, αφού δεν διαθέτει πάνω από ένα επίτοπο για να συνδέεται με αντισώματα anti-FT3.
Για το παράδειγμα, επιλέχτηκε το αντιδραστήριο FΤ3 της Leico technologies. Ο κατασκευαστής του
ακολουθεί διαδικασία ανάλυσης παρόμοια με αυτή που περιγράφηκε, με την επισήμανση ότι τοποθετούνται
από 50 μL δείγματος και το διάλυμα του συνδέτη μπαίνει αμέσως μετά τα δείγματα χωρίς επώαση. Είναι
δηλαδή ELISA ενός σταδίου. Χρησιμοποιεί 6 βαθμονομητές με συγκεντρώσεις 0, 0,6, 1,3, 4, 8 και 16 pg/mL.
H ποιότητα της ανάλυσης ελέγχεται με δύο δείγματα ελέγχου, ένα με χαμηλή συγκέντρωση, εύρους 0,5 – 0,8
pg/mL (Low control) και ένα με υψηλή συγκέντρωση εύρους 8,4 – 12,4 pg/mL (High control). Τα
προσκολλημένα αντισώματα προέρχονται από εμβολιασμό προβάτου, το ένζυμο είναι το HRP και το
υπόστρωμα το TMB.
Στο παράδειγμα που περιγράφουμε όλα τα δείγματα μπαίνουν εις διπλούν. Αυτό είναι ιδιαίτερα
χρήσιμο στις δοκιμασίες ELISA, αφού δεν ιδιαίτερα επαναλήψιμες. Στην αρχή μπαίνουν οι βαθμονομητές,
ακολουθεί το «χαμηλό» και μετά το «υψηλό» δείγμα ελέγχου και κατόπιν με τη σειρά τα δείγματα (Πίνακας
6.6).
161
Cal 1 Cal 5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts 21 Pts 25 - - -
Cal 3 Low Ctrl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 Pts 27 - - -
Cal 3 Low Ctrl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 Pts 27 - - -
Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 Pts 28 - - -
Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 Pts 28 - - -
Πίνακας 6.6 Πίνακας δειγμάτων που έχουν τοποθετηθεί στα πηγαδάκια της ELISA για τον προσδιορισμό της FT3.
Το υπόστρωμα TMB που χρησιμοποιείται στην ανάλυση παράγει μπλε χρώμα, που μετατρέπεται σε
κίτρινο μετά την προσθήκη του διαλύματος τερματισμού (Σχήμα 6.12). Η απορρόφηση του τελικού
διαλύματος μετριέται στα 450 nm. Η πλάκα φωτομετρήθηκε σε ειδικό φωτόμετρο για πλάκες ELISA
(Φωτογραφία 6.4) και υπολογίστηκαν οι τιμές των απορροφήσεων (Πίνακας 6.7). Ως ανταγωνιστική μέθοδος
η απορρόφηση μειώνεται, όσο αυξάνει η συγκέντρωση.
Σχήμα 6.12 Οι χρωματικές αποχρώσεις μιας πλάκας ELISA μετά από την εκτέλεση ενός ανταγωνιστικού προσδιορισμού.
Φαίνονται οι χρωματικές διαβαθμίσεις των βαθμονομητών και των δειγμάτων ελέγχου στις στήλες 1 και 2. Τα υπόλοιπα
είναι δείγματα ασθενών που έχουν «τρέξει» εις διπλούν.
2,063 0,558 0,645 0,895 2,012 2,145 3,021 0,125 1,654 0 0 0

2,138 0,589 0,652 0,875 2,211 2,156 2,365 0,225 1,625 0 0 0
1,815 0,335 0,336 0,521 1,856 0,541 0,546 0,356 0,584 0 0 0
1,866 0,345 0,315 0,546 1,825 0,523 0,321 0,346 0,521 0 0 0
1,546 1,513 0,241 0,658 1,652 0,348 0,254 0,875 0,845 0 0 0
1,595 1,521 0,223 0,689 1,645 0,356 0,299 0,888 0,84 0 0 0
0,983 0,547 1,925 0,921 0,752 1,854 0,221 0,658 0,254 0 0 0
0,968 0,543 1,9 0,912 0,745 1,865 0,102 0,653 0,125 0 0 0
Πίνακας 6.7 Πίνακας υποθετικών τιμών απορρόφησης σε ανταγωνιστική μέθοδο. Oι μηδενικές τιμές αντιπροσωπεύουν την
έλλειψη δείγματος σε αυτές τις θέσεις.
162
Συγκέντρωση Μέση τιμή
Βαθμονομητής βαθμονομητή A1 A2 Α1 , Α2 CV% Ai/A0%
Cal 1 0 2,063 2,138 2,15 2,5 100
Cal 2 0,6 1,815 1,866 1,84 2,0 88
Cal 3 1,3 1,546 1,595 1,57 2,2 75
Cal 4 4 0,983 0,968 0,98 1,1 46
Cal 5 8 0,558 0,589 0,57 3,8 27
Cal 6 16 0,335 0,345 0,34 2,1 16
Πίνακας 6.8 Oι τιμές συγκεντρώσεων των βαθμονομητών και των αντίστοιχων απορροφήσεων καθώς και ο υπολογισμός
του λόγου Αi/Α0% στις ανταγωνιστικές μεθόδους.
Χρησιμοποιώντας τις τιμές συγκέντρωσης και απορρόφησης των βαθμονομητών (Πίνακας 6.8)
κατασκευάζεται η καμπύλη αναφοράς. Σχεδιάζεται για αυτό σύστημα αξόνων, όπου στον οριζόντιο άξονα
τοποθετούνται οι τιμές των βαθμονομητών και στον κάθετο άξονα o λόγος %Αi/Αο. Ο λόγος αυτός εκφράζει
τη μείωση της απορρόφησης σε σχέση με την απορρόφηση του μηδενικού βαθμονομητή (Cal 1) (Σχήμα
6.13).
𝛢
%𝛢𝑖 /𝐴𝑜 = 𝛢 𝑖 𝑥100% (Εξίσωση 6.1)
𝑜
H τιμή Ai είναι η τιμή απορρρόφησης κάθε βαθμονομητή, δείγματος ελέγχου ή ασθενούς. Στη
περίπτωση όμως που χρησιμοποιούνται διπλά δείγματα, τότε η τιμή Αi είναι η μέση τιμή των δύο δειγμάτων.
Τα φωτόμετρα ELISA μπορούν να προγραμματιστούν να μετρούν μονά ή διπλά δείγματα και να υπολογίζουν
αυτόματα τις μέσες τιμές. Η τιμή Αο είναι η απορρόφηση του μηδενικού βαθμονομητή, είτε η μέση τιμή των
δύο μηδενικών βαθμονομητών.
Σχήμα 6.13 Καμπύλη αναφοράς σε ανταγωνιστική μέθοδο. Κανονικά είναι πολυωνυμική καμπύλη, η οποία όμως
μετατρέπεται συνήθως σε γραμμική μετά από λογαριθμοποίηση του ενός άξονα.
6.5.1.1 Η κατασκευή της Καμπύλης Αναφοράς
Ανεξάρτητα από το αν το εργαστήριο θα «τρέξει» διπλά δείγματα ελέγχου ή ασθενών, οι βαθμονομητές

«μπαίνουν» πάντα δύο φορές. Κατά συνέπεια, οι τιμές απορρόφησης που χρησιμοποιούνται στη κατασκευή
163
της καμπύλης αναφοράς είναι οι μέσες τιμές των δύο απορροφήσεων κάθε βαθμονομητή. Ο λόγος που
«τρέχουν» διπλοί βαθμονομητές είναι για να μπορεί να ελεγχθεί η εγκυρότητα τους. Έτσι δεν θα πρέπει οι
δύο τιμές να διαφέρουν πολύ μεταξύ τους. Το μέτρο της διαφοράς τους είναι ο συντελεστής μεταβλητότητας
(CV%) ο οποίος δεν πρέπει να υπερβεί ένα συγκεκριμένο ποσοστό π.χ. 10%. Εάν οι απορροφήσεις ενός
βαθμονομητή διαφέρουν πάνω από 10%, τότε θα πρέπει να αφαιρεθεί η απορρόφηση που είναι φανερό ότι
δεν ταιριάζει με τις γειτονικές της. Η δυνατότητα αυτή υπάρχει σε όλα τα φωτόμετρα ELISA, πολύ δε
περισσότερο αν χρησιμοποιηθεί λογιστικό φύλλο.
Στο παράδειγμα μας, η καμπύλη αναφοράς έχει σχεδιαστεί σε λογιστικό φύλλο (Excel) (Σχήμα
6.14) και χαρακτηρίζεται ως πολυωνυμική. Η εξίσωση βαθμονόμησης έχει υπολογιστεί αυτόματα από το
λογιστικό φύλλο και φαίνεται πάνω στο σχήμα της καμπύλης μαζί με τον συντελεστή συσχέτισης R2. Ο
συντελεστής συσχέτισης R2 δείχνει τη συσχέτιση μεταξύ των δύο μεγεθών, της συγκέντρωσης και της
απορρόφησης. Τιμές R2 κοντά στη μονάδα (R2 ≈ 1) θεωρούνται ικανοποιητικές.
Οι πολυωνυμική εξίσωση επιλύεται όμως δύσκολα. Για τον λόγο αυτό προτιμάται η μετατροπή της
σε γραμμική. Η μετατροπή γίνεται με τη λογαριθμοποίηση (δεκαδικός λογάριθμος) των συγκεντρώσεων. Η
γραμμική εξίσωση είναι απλούστερη εξίσωση, στην οποία η συγκέντρωση υπολογίζεται ως ακολούθως:
y = αx + b (Εξίσωση 1.14)
ή Α1/Αο = α log10([FT3]) + b (Εξίσωση 6.2)
Σχήμα 6.14 Μετατροπή πολυωνυμικής σε γραμμική εξίσωση αναφοράς, μετά από τη λογαριθμοποίηση του οριζόντιου
άξονα των συγκεντρώσεων.
Σύμφωνα με την εξίσωση 6.3 και το αντίστοιχο διάγραμμα (Σχήμα 6.14) στον οριζόντιο άξονα
βρίσκεται ο δεκαδικός λογάριθμος της συγκέντρωσης του FT3 και στον κάθετο άξονα ο λόγος A1/Aο. Ο
άγνωστος στην προηγούμενη εξίσωση είναι ο log10([FT3]) ο οποίος ισούται με:
log10([FT3]) = ((Α1/Αο) – b)/a (Εξίσωση 6.3)
Η συγκέντρωση του FT3 υπολογίζεται από τη μετατροπή του λογάριθμου σε ακέραιο.
Aν log10([FT3]) = D τότε [FT3] = 10D (Εξίσωση 6.4)
6.5.1.1.1 H αξιολόγηση των Τιμών Απορρόφησης
164
Οι τιμές απορρόφησης αξιολογούνται, με βάση τους παρακάτω κανόνες:
 Καμιά τιμή συγκέντρωσης ασθενούς δεν μπορεί να δοθεί, εάν οι τιμές των δειγμάτων ελέγχου δεν
βρίσκονται μέσα στα προβλεπόμενα όρια. Μειονέκτημα των αναλύσεων ELISA είναι ότι τα δείγματα
ελέγχου «τρέχουν» μαζί μ’εκείνα των ασθενών και σε περίπτωση αστοχίας τους δεν υπάρχει η δυνατότητα
να γίνουν επιδιορθωτικές ενέργειες, πριν «τρέξουν» τα δείγματα.
 Δεν πρέπει οι τιμές των δύο απορροφήσεων να έχουν μεγάλη διαφορά μεταξύ τους, δηλαδή μεγάλη
διασπορά. Συνήθως οι κατασκευαστές των kit αναφέρουν μέχρι πόσο επιτρέπεται να είναι αυτή η διαφορά
π.χ. ο συντελεστής μεταβλητότητας των δύο τιμών να μην υπερβαίνει το 10%. Φυσικά για να γίνει αυτός ο
έλεγχος θα πρέπει τα δείγματα να «μπαίνουν» διπλά. Αν αυτό γίνεται μόνο για τους βαθμολογητές, ο
έλεγχος περιορίζεται σε αυτούς. Εάν οι απορροφήσεις ενός βαθμονομητή διαφέρουν υπερβολικά μεταξύ
τους, τότε θα πρέπει να αφαιρεθεί η απορρόφηση που είναι φανερό ότι δεν ταιριάζει με τις γειτονικές της
και η καμπύλη να ξαναυπολογιστεί. Εάν αυτό όμως συμβεί σε δείγματα ελέγχου και ασθενών, τότε θα
πρέπει να αξιολογηθεί η διαφορά με γνώμονα την κλινική σημασία του αποτελέσματος.
 Κάθε μεθοδολογία ELISA έχει ένα συγκεκριμένο εύρος μέτρησης, που ξεκινά από την τιμή
ποσοτικοποίησης και φτάνει μέχρι το όριο γραμμικότητας. Τιμές συγκέντρωσης μικρότερες από την τιμή
ποσοτικοποίησης (βλ. Κεφάλαιο 1 και 9) δίνονται απλά μικρότερες από αυτήν και τιμές συγκέντρωσης
μεγαλύτερες από το όριο γραμμικότητας δεν δίνονται καθόλου. Στη τελευταία περίπτωση γίνεται αραίωση
του δείγματος και νέα μέτρηση. Το τελικό αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί τον συντελεστή αραίωσης.
Στο παράδειγμα της FT3 της συγκεκριμένης εταιρείας το εύρος μέτρησης ξεκινά από την τιμή του
μηδενικού βαθμονομητή και εκτείνεται λίγο πάνω από την τιμή του τελευταίου βαθμομονητή (18 pg/mL).
 Tιμές απορρόφησης μικρότερες από το όριο ποσοτικοποίησης ή μεγαλύτερες από το όριο γραμμικότητας
(βλ. Κεφάλαιο 9) δεν χρησιμοποιούνται στον υπολογισμό της συγκέντρωσης των δειγμάτων των ασθενών.
Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος υπολογίζεται μεγαλύτερη από το όριο γραμμικότητας, τότε θα πρέπει
το δείγμα αυτό να αραιωθεί και να γίνει νέος προσδιορισμός.
Σύμφωνα με τα παραπάνω πριν την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων (Πίνακας 6.8) θα πρέπει να
γίνει αξιολόγηση των απορροφήσεων (Πίνακας 6.7) για το αν η καμπύλη αναφοράς είναι έγκυρη. Φαίνεται
λοιπόν, ότι η διασπορά των απορροφήσεων είναι αποδεκτή (CV%<10%) αλλά και ότι μειώνονται με
προβλεπόμενο τρόπο από την αρχική τους μέγιστη τιμή. Κατά συνέπεια, η ανάλυση μπορεί να προχωρήσει
στο επόμενο στάδιο, δηλαδή στον σχεδιασμό της καμπύλης αναφοράς και στον υπολογισμό της εξίσωσης
αναφοράς (Εξισώσεις 1.14, 6.2).
Τα αποτελέσματα που υπολογίζονται από τις εξισώσεις 6.3 και 6.4 περιλαμβάνουν και τιμές
ασθενών που δεν μπορούν να δοθούν (Πίνακας 6.9). Π.χ. ο ασθενής 3 (Pts = 3) έχει τιμή συγκέντρωσης πάνω
από το όριο γραμμικότητας. Ο ασθενής αυτός θα λάβει τιμή > 18 pg/mL. Το ίδιο θα συνέβαινε και για τους
ασθενείς 20, 21 και 28, εάν δεν είχαν μεγάλη διασπορά οι τιμές απορρόφησης τους (CV > 10%). Για αυτούς
τους ασθενείς θα πρέπει οι μετρήσεις να επαναληφθούν και το ίδιο θα πρέπει να γίνει και για τους ασθενείς
17 και 18. To δείγμα του ασθενή 3 που ήταν πάνω από το όριο γραμμικότητας θα αραιωθεί και θα γίνει νέα
ανάλυση.
165
Μέση τιμή
Δείγμα A1 A2 Α1, Α2 CV% Ai/A0% Αποτέλεσμα CV%
Low C 1,51 1,52 72 0,4 72 1,3 0,4
High C 0,55 0,54 26 0,5 26 9,7 0,5
Pts 1 0,65 0,65 31 0,8 31 7,8 0,8
Pts 2 0,34 0,32 16 4,6 16 15,4 4,6
Pts 3 0,24 0,22 11 5,5 11 18,7 5,5
Pts 4 1,93 1,90 92 0,9 91 0,6 0,9
Pts 5 0,90 0,88 43 1,6 42 4,8 1,6
Pts 6 0,52 0,55 25 3,3 25 10,0 3,3
Pts 7 0,66 0,69 31 3,3 32 7,4 3,3
Pts 8 0,92 0,91 44 0,7 44 4,5 0,7
Pts 9 2,01 2,21 96 6,7 101 0,4 6,7
Pts 10 1,86 1,83 88 1,2 88 0,7 1,2
Pts 11 1,65 1,65 79 0,3 79 1,0 0,3
Pts 12 0,75 0,75 36 0,7 36 6,4 0,7
Pts 13 2,15 2,16 102 0,4 102 0,3 0,4
Pts 14 0,54 0,52 26 2,4 25 10,0 2,4
Pts 15 0,35 0,36 17 1,6 17 14,6 1,6
Pts 16 1,85 1,87 88 0,4 89 0,6 0,4
Pts 17 3,02 2,37 144 17,2 128 0,1 17,2
Pts 18 0,55 0,32 26 36,7 21 12,3 36,7
Pts 19 0,25 0,30 12 11,5 13 17,1 11,5
Pts 20 0,22 0,10 11 52,1 8 21,7 52,1
Pts 21 0,13 0,23 6 40,4 8 21,1 40,4
Pts 22 0,36 0,35 17 2,0 17 14,6 2,0
Pts 23 0,88 0,89 42 1,0 42 4,8 1,0
Pts 24 0,66 0,65 31 0,5 31 7,7 0,5
Pts 25 1,65 1,63 79 1,3 78 1,0 1,3
Pts 26 0,58 0,52 28 8,1 26 9,6 8,1
Pts 27 0,85 0,84 40 0,4 40 5,2 0,4
Pts 28 0,25 0,13 12 48,1 9 20,5 48,1
Πίνακας 6.9 Oι τιμές συγκεντρώσεων των ασθενών και των δειγμάτων ελέγχου.
Οι γραμμικές καμπύλες αναφοράς έχουν πολύ μεγαλύτερη ευαισθησία από τις μη γραμμικές, αφού
μετατρέπουν το παραγόμενο σήμα του ιχνηθέτη σε συγκέντρωση με αναλογικό τρόπο. Αυτός άλλωστε είναι ο
λόγος που μετατρέπεται η πολυωνυμική καμπύλη σε γραμμική (Σχήμα 6.14).
6.5.2 Ο Προσδιορισμός της TSH με ELISA
166
O προσδιορισμός της TSH γίνεται με μη ανταγωνιστική μέθοδο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί το ίδιο ένζυμο
και υπόστρωμα με τον προσδιορισμό της FT3, οπότε η όλη αναλυτική διαδικασία είναι παρόμοια. Δεδομένου
ότι υπάρχουν πολλές ομοιότητες με το προηγούμενο παράδειγμα, θα επικεντρωθούμε στη καμπύλη αναφοράς
και στον υπολογισμό των συγκεντρώσεων των ασθενών.
Οι τιμές αναφοράς για την TSH είναι 0,4 – 4,2 μU/mL. Χρησιμοποιούνται 6 βαθμονομητές με
συγκεντρώσεις 0, 0,5, 2, 5, 10, 25 μU/mL και δύο δείγματα ελέγχου, ένα χαμηλού επιπέδου με συγκέντρωση
0,6 – 1,3 μU/mL και ένα υψηλού επιπέδου με συγκέντρωση 6,4 – 8,4 μU/mL. Στον Πίνακα 6.10 φαίνεται η
σειρά τοποθέτησης βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου και δειγμάτων ασθενών. Στον Πίνακα 6.11 φαίνονται
και οι απορροφήσεις όλων των δειγμάτων βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου και δειγμάτων ασθενών (Σχήμα
6.15).
Σχήμα 6.15 Οι χρωματικές αποχρώσεις μιας πλάκας ELISA, μετά από την εκτέλεση ενός μη ανταγωνιστικού
προσδιορισμού. Όλα τα δείγματα έχουν «τρέξει» εις διπλούν.
Cal 1 Cal5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts 21 - - - -

Cal 1 Cal 5 Pts 1 Pts 5 Pts 9 Pts 13 Pts 17 Pts 21 - - - -
Cal 3 Low Cttl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 - - - -
Cal 3 Low Cttl Pts 3 Pts 7 Pts 11 Pts 15 Pts 19 Pts 23 - - - -
Cal 4 High Ctrl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 - - - -
Cal 4 High Cttl Pts 4 Pts 8 Pts 12 Pts 16 Pts 20 Pts 24 - - - -
Πίνακας 6.10 Πίνακας δειγμάτων που έχουν τοποθετηθεί στα πηγαδάκια της ELISA σε μη ανταγωνιστικό προσδιορισμό.
0,061 1,412 0,348 0,895 0,426 0,214 2,145 4,154 0 0 0 0

0,064 1,426 0,34 0,875 0,421 0,213 2,156 4,126 0 0 0 0
0,159 2,684 0,387 0,521 0,521 0,845 0,541 0,654 0 0 0 0
0,154 2,726 0,365 0,546 0,546 0,822 0,523 0,632 0 0 0 0
0,398 0,280 0,248 0,658 0,658 1,652 0,348 0,321 0 0 0 0
0,39 0,274 0,265 0,689 0,689 1,645 0,356 0,333 0 0 0 0
0,8 0,923 0,879 0,921 0,921 0,752 1,854 0,221 0 0 0 0
0,823 0,921 0,821 0,912 0,912 0,745 1,845 0,102 0 0 0 0
Πίνακας 6.11 Πίνακας υποθετικών τιμών απορρόφησης σε ανταγωνιστική ELISA.
167
Για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων θα πρέπει να σχεδιαστεί καμπύλη αναφοράς.
Προηγουμένως θα πρέπει να μελετηθούν οι διπλές απορροφήσεις των βαθμονομητών. Παρατηρείστε ότι η
απορρόφηση Α2 του βαθμονομητή 5 (Πίνακας 6.12) δεν είναι σωστή για δύο λόγους. Πρώτον, ενώ η αύξηση
των απορροφήσεων είναι γραμμική και αναμένεται, με βάση τη συγκέντρωση των βαθμονομητών 3 και 4, ο
διπλασιασμός της απορρόφησης του βαθμονομητή 5, η τελευταία είναι πολύ μεγαλύτερη. Το πρόβλημα
εντοπίζεται στην πολύ μεγάλη διασπορά των δύο απορροφήσεων του βαθμονομητή 5 (CV% = 29%). Η λύση
είναι η αφαίρεση της απορρόφησης Α2 (2,154), οπότε αντί του μέσου όρου θα χρησιμοποιηθεί μόνο η
απορρόφηση Α1 (1,419).
Συγκέντρωση Μέσος
Βαθμονομητής Α1 Α2 CV%
βαθμονομητή όρος
Cal 1 0 0,061 0,064 0,06 3,4
Cal 2 0,5 0,159 0,154 0,16 2,3
Cal 3 2 0,398 0,39 0,39 1,4
Cal 4 5 0,8 0,823 0,81 2,0
Cal 5 10 1,419 2,154 1,783 29,4
Cal 6 25 2,684 2,726 2,7 1,1
Πίνακας 6.12 Οι συγκεντρώσεις των βαθμονομητών και οι απορροφήσεις τους σε μη ανταγωνιστική ELISA.
Από τους Πίνακες 6.10, 6.11 φαίνεται ότι οι βαθμονομητές, τα δείγματα ελέγχου και τα δείγματα
ασθενών μπήκαν εις διπλούν, κάτι, που όπως ειπώθηκε είναι επιθυμητό στις αναλύσεις ELISA. Από τον
Πίνακα 6.12 σχεδιάζεται η καμπύλη αναφοράς, η οποία τώρα είναι γραμμική (Σχήμα 6.16).
Σχήμα 6.16 Η γραμμική καμπύλη αναφοράς στην μη ανταγωνιστική μέθοδο.
Η καμπύλη αναφοράς στη μη ανταγωνιστική μέθοδο έχει τη μορφή:
y = αx + b (Εξίσωση 1.14)
ή Abs = α [TSH] + b (Εξίσωση 6.5)
Σύμφωνα με την εξίσωση παλινδρόμησης που υπολόγισε το λογιστικό φύλλο ισχύει:
168
Abs = 0,1047 [TSH] + 0,1833 (Εξίσωση 6.6)
ή [TSH] = (Abs – 0,1833)/0,1047 (Eξίσωση 6.7)
Είναι φανερό, ότι οι μη ανταγωνιστικές μέθοδοι έχουν απλούστερες καμπύλες και εξισώσεις
αναφοράς. H γραμμική τους σχέση εξασφαλίζει μεγαλύτερη ευαισθησία από τις ανταγωνιστικές μεθόδους.
Φυσικά και αυτές οι αναλύσεις έχουν τους ίδιους περιορισμούς με τις ανταγωνιστικές μεθόδους.
Όπως και στις ανταγωνιστικές μεθόδους οι τιμές των δειγμάτων ελέγχου (Πίνακας 6.13) θα πρέπει
να είναι μέσα στα προβλεπόμενα όρια (όπως εδώ), οι συγκεντρώσεις να μην υπερβαίνουν το εύρος μέτρησης
και όταν χρησιμοποιούνται διπλές απορροφήσεις η διασπορά τους (CV%) να μην υπερβαίνει ένα
συγκεκριμένο όριο (π.χ. 10%). Κατόπιν όλων αυτών αποτελεί παράδοξο η συγκέντρωση του ασθενούς 20 του
οποίου οι δύο απορροφήσεις έχουν μεγάλη διαφορά μεταξύ τους (CV = 52%). Κανονικά η ανάλυση του
δείγματος αυτού πρέπει να επαναληφθεί, αλλά επειδή και οι δύο απορροφήσεις είναι πολύ μικρές κάτι τέτοιο
θεωρείται φυσιολογικό αφού πρόκειται για απορρροφήσεις κοντά στο τυφλό. Για τον ασθενή αυτόν η τιμή
που θα δοθεί είναι συγκέντρωση μικρότερη από το όριο ποσοτικοποίησης (< 0,01 mU/μL).
Δείγμα A1 A2 Μέση τιμή CV% Αποτέλεσμα

Low Ctrl 0,280 0,274 0,277 1,53 0,89
High Ctrl 0,923 0,921 0,922 0,15 7,06
Pts 1 0,348 0,34 0,6485 1,64 1,53
Pts 2 0,387 0,365 0,3255 4,14 1,84
Pts 3 0,248 0,265 0,232 4,69 0,70
Pts 4 0,879 0,821 2,082 4,82 6,37
Pts 5 0,426 0,421 0,4235 0,83 2,29
Pts 6 0,521 0,546 0,5335 3,31 3,34
Pts 7 0,658 0,689 0,6735 3,25 4,68
Pts 8 0,921 0,912 0,9165 0,69 7,00
Pts 9 0,214 0,213 0,2135 0,33 0,29
Pts 10 0,845 0,822 0,8335 1,95 6,21
Pts 11 1,652 1,645 1,6485 0,30 13,99
Pts 12 0,752 0,745 0,7485 0,66 5,40
Pts 13 2,145 2,156 2,1505 0,36 18,79
Pts 14 0,541 0,523 0,532 2,39 3,33
Pts 15 0,348 0,356 0,352 1,61 1,61
Pts 16 1,854 1,865 1,8595 0,42 16,01
Pts 17 4,154 4,126 4,14 0,48 37,79
Pts 18 0,654 0,632 0,643 2,42 4,39
Pts 19 0,321 0,333 0,327 2,59 1,37
Pts 20 0,221 0,102 0,1615 52,10 -0,21
Pts 21 0,387 0,365 0,376 4,14 1,84
Pts 22 0,356 0,346 0,351 2,01 1,60
Pts 23 0,875 0,888 0,8815 1,04 6,67
Pts 24 0,658 0,653 0,6555 0,54 4,51
Πίνακας 6.13 Πίνακας απορροφήσεων και αποτελεσμάτων για τον υπολογισμό της TSH.
169
6.6 Παρατηρήσεις και επιπλέον πληροφορίες για τις Καμπύλες Βαθμονόμησης
6.6.1 Μονά ή Διπλά δείγματα;
Όπως αναφέρθηκε στα προηγούμενα πειράματα, είναι πολύ χρήσιμο τα δείγματα να «τρέχουν» εις διπλούν.
Αυτό βοηθά πολύ στην αξιοπιστία των αποτελεσμάτων ELISA. Εάν αυτό δεν μπορεί να γίνει για πρακτικούς
ή οικονομικούς λόγους, θα πρέπει τουλάχιστον να τρέχουν εις διπλούν οι βαθμονομητές (Video 6.1).
6.6.2 H Διχρωματική Ανάλυση
Η προσθήκη του διαλύματος τερματισμού (H2SO4) μετατρέπει το τελικό χρώμα των αντιδράσεων σε
αποχρώσεις του κίτρινου. Η ένταση του κίτρινου χρώματος μπορεί να δεχτεί παρεμβολές από χημικές ουσίες
ίδιου χρώματος π.χ. της χολερυθρίνης. Για τον λόγο αυτό, συνιστάται να μετρώνται δύο διαφορετικές
απορροφήσεις με δύο διαφορετικά μήκη κύματος. Συνήθως, εκτός από το μήκος κύματος που συνιστάται για
το συγκεκριμένο υπόστρωμα, μετράται και η απορρόφηση στα 650 nm. Σε αυτό το μήκος κύματος απορροφά
η χολερυθρίνη και άλλες ουσίες ίδιου χρώματος.
6.6.3 Άλλοι τρόποι υπολογισμού των Εξισώσεων Αναφοράς
Οι εξισώσεις βαθμονόμησης που παρουσιάστηκαν στα δύο προηγούμενα παραδείγματα είναι εξισώσεις
παλινδρόμησης (Eνότητα 1.16) (Κουππάρης, 1994). Δεν αποτελούν όμως τον μοναδικό τρόπο υπολογισμού
τους.
Ένας άλλος τρόπος που προσφέρεται στα φωτόμετρα ELISA είναι η μέθοδος «σημείο προς σημείο»
(point to point). Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο τα σημεία της καμπύλης αναφοράς ενώνονται μεταξύ τους με
ευθύγραμμα τμήματα κάθε ένα από τα οποία ορίζεται με τη δική του εξίσωση της μορφής y = αx + β (Σχήμα
6.17). Tο φωτόμετρο ανάλογα με την απορρόφηση κάθε δείγματος επιλέγει την κατάλληλη εξίσωση y = αx +
β. Προφανώς η μαθητική αυτή μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοστεί στις γραμμικές καμπύλες αναφοράς οι
οποίες, ούτως ή άλλως, ορίζονται από μία εξίσωση y = αx + β.
Σχήμα 6.17 Καμπύλη αναφοράς τύπου point to point για τον προσδιορισμό της FT3. Η καμπύλη αναφοράς αποτελείται από
πέντε ευθύγραμμα τμήματα που ορίζονται από πέντε εξισώσεις y = ax + b.
170
Πολύ καλύτερες επιλογές από τις εξισώσεις regression και point to point είναι οι καμπύλες spline. H
επιλογή spline υπάρχει σε πολλά φωτόμετρα ELISA και πλεονεκτεί στο ότι με τη βοήθεια συνδυασμού
εξισώσεων η καμπύλη αναφοράς περνά από τη συντομότερη απόσταση μεταξύ των σημείων των
βαθμονομητών. Η μέθοδος spline μπορεί να εφαρμοστεί και σε γραμμικές και σε μη γραμμικές καμπύλες
αναφοράς.
Η κατασκευή των καμπύλων αναφοράς έχει σημαντικό οικονομικό κόστος, λόγω των πολλών
βαθμονομητών και αναλύσεων που απαιτούνται στις περισσότερες ανοσοχημικές μεθόδους. Επιπλέον, οι
πολλές αναλύσεις που απαιτούν, αυξάνουν την πιθανότητα σφάλματος που σημαίνει νέα καθυστέρηση και
κόστος. Για τον λόγο αυτό, πολλοί αυτόματοι ανοσοχημικοί αναλυτές επιλέγουν να ενωματώσουν μέσα στα
λογισμικά τους τα αριθμητικά δεδομένα μιας πλήρους καμπύλης (master curve), έτσι ώστε κάθε φορά ο
χρήστης του αναλυτή να χρειάζεται μόνο να την προσαρμόζει στις ιδιαιτερότητες της ανάλυσης. Έτσι, αντί
της κατασκευής πολύπλοκων σιγμοειδών καμπυλών μπορούν να χρησιμοποιηθούν μόνο δύο βαθμονομητές,
όπως γίνεται στις γραμμικές καμπύλες αναφοράς. Από τους δύο βαθμονομητές θα παραχθεί ένας
μαθηματικός συντελεστής με τον οποίο θα πολλαπλασιάζεται το παραγώμενο σήμα κάθε δείγματος ασθενούς
για να γίνει ο υπολογισμός της συγκέντρωσης του.
6.7 Στοιχεία για τις άλλες Ανοσοχημικές μεθόδους
Οι υπόλοιπες ανοσοχημικές μέθοδοι, ραδιοανοσοενζυμικές, χημειοφωταύγειας, ετερογενείς και ομογενείς, αν

και έχουν σημαντικές διαφορές από την ELISA, αυτές περιορίζονται στο αναλυτικό στάδιο. Αντίθετα, η
δημιουργία των καμπυλών αναφοράς έχει σημαντικές ομοιότητες. Ο ένας άξονας είναι πάντα οι τιμές της
συγκέντρωσης των βαθμονομητών και ο άλλος οι τιμές του σήματος (Abs, RLU, cpm). Σε όλες τις
ανταγωνιστικές μεθόδους η καμπύλη βαθμονόμησης αυξάνεται σε σχέση με την τιμή του σήματος και σε
όλες τις μη ανταγνωνιστικές μεθόδους η καμπύλη μειώνεται. Μέθοδοι όπως regression, point-to-point και
spline χρησιμοποιούνται εξίσου.
6.7.1 Χημειοφωταύγεια
Η χημειοφωταύγεια αποτελεί την πλέον διαδεδομένη σήμερα ανοσοχημική μέθοδο (Γρηγόρη 2011· Ζερβού
1998; Νικολού 2000). Η δυνατότητα αυτοματισμού, ο σύντομος χρόνος απόδοσης των αποτελεσμάτων καθώς
και η υψηλή ευαισθησία, την καθιστούν πρώτη επιλογή για μεγάλους κατασκευαστικούς οίκους με πολύ
γνωστά μοντέλα αναλυτών (Dimension, Cobas, Elecsys, Achitect, Centaur κ.α.). Θα παρουσιαστούν εδώ λίγα
στοιχεία για τις σύγχρονες παραλλαγές της βασικής μεθοδολογίας CHIA.
6.7.1.1 Έμμεση ή Ενισχυμένη Χημειοφωταύγεια
Η έμμεση χημειοφωταύγεια βασίζεται στη παραγωγή φωτός μέσω μίας ενζυμικής αντίδρασης, κάτι που
άλλωστε συμβαίνει και στη φύση και συγκεκριμένα στο έντομο της πυγολαμπίδας, η οποία χρησιμοποιεί ως
υπόστρωμα την λουσιφερόλη. Οι αναλυτές χρησιμοποιούν αντίστοιχα την φωσφορική διοξετάνη την οποία
αποφωσφορυλιώνουν με την ALP. Μόλις η διοξετάνη χάσει τον φωσφόρο της καθίσταται ασταθής και
παράγεται έτσι φως μέχρις ότου εξαντληθεί το υπόστρωμα της ALP.
𝛬𝜊𝜐𝜎𝜄𝜑𝜀𝜌ά𝜎𝜂,𝛭𝑔_+2
Λουσιφερόλη + ΑΤΡ + Ο2 ⇒ ADP + CO2 + hν (Αντίδραση 6.1)
Έμμεση χημειοφωταύγεια χρησιμοποιούν οι αναλυτές Immulite της εταιρείας Siemens. Οι αναλυτές
χρησιμοποιούν ως υπόστρωμα τη φωσφορική διοξετάνη, την οποία αποφωσφορυλιώνουν με την αλκαλική
φωσφατάση (ALP). Μόλις η διοξετάνη χάσει τον φωσφόρο της καθίσταται ασταθής και παράγονται φωτόνια
των οποίων η ενέργεια τους είναι ανάλογη της ποσότητας της φωσφορικής διοξετάνης. Το φως παράγεται
συνεχώς μέχρις ότου εξαντληθεί το υπόστρωμα της ALP. Το γεγονός ότι με τη μέθοδο αυτή παράγεται
συνεχώς φως επιτρέπoνται πολλαπλές μετρήσεις στο ίδιο δείγμα αυξάνοντας την αξιοπιστία της μεθόδου.
6.7.1.2 Η Άμεση/Μικροσωματιδιακή Χημειοφωταύγεια
171
Το φως στην άμεση χημειοφωταύγεια παράγεται απ’ευθείας από τον ιχνηθέτη (εστέρας ακριδίνης), χωρίς τη
χρήση ενζύμου (Γρηγόρη, 2011). Το γεγονός αυτό συντομεύει τον χρόνο ανάλυσης. Η τεχνολογία αυτή όπως
τουλάχιστον χρησιμοποιείται από τους αναλυτές Advia Centaur της Siemens χρησιμοποιεί τη διμεθυλική
μορφή των εστέρων ακριδίνης. Για την παραγωγή φωτός οι εστέρες ακριδίνης οξειδώνονται από το
υπεροξείδιο του υδρογόνου και η έκλυση φωτός μεγιστοποιείται με τη μετατροπή του περιβάλλοντος από
όξινο σε βασικό. Η ταχύτητα των αναλύσεων με τους εστέρες ακριδίνης οφείλεται και στο μέγεθος των
εστέρων ακριδίνης που είναι κατά πολύ μικρότεροι από το μόριο της αλκαλικής φωσφατάσης. Κατά συνέπεια
δεν εμποδίζονται οι γειτονικές θέσεις δέσμευσης των τμημάτων Fab των αντισωμάτων που είναι δεσμευμένα
πάνω στα μαγνητικά μικροσωματίδια.
Τα παραμαγνητικά σωματίδια (Paramagnetic particles ή PMP) είναι οξείδια του σιδήρου που έχουν
την ιδιότητα να έλκονται από μαγνήτη. Πάνω στα PMP συγκολλούνται αντισώματα τα οποία καλούνται
γενικά στερεή φάση. Κατά τη διάρκεια της επώασης το αντιγόνο που θέλουμε να μετρήσουμε συνδέεται με τα
αντισώματα της στερεής φάσης. Μετά τη σύνδεση αυτή τα PMP έλκονται από μαγνήτες οι οποίοι τα
ακινητοποιούν πάνω τους. Τα μόρια του διαλύματος που δεν συνδέθηκαν με τα PMP ξεπλένονται. Με τα
PMP κολλημένα πάνω στους μαγνήτες προστίθεται το υπεροξείδιο του υδρογόνου και ξεκινά η αντίδραση
(Animation 6.1).
Αnimation 6.1 Τα βασικά στάδια της χημειοφωταύγειας με παραμαγνητικά σφαιρίδια. Eδώ τa αντισώματα είναι
ακινητοποιημένα πάνω σε μεταλλικές μπίλιες που αποτελούν τη στερεή φάση. Αριστερά φαίνεται η ανταγωνιστική μέθοδος,
όπου το σημασμένο αντιγόνο με εστέρα ακριδίνης ανταγωνίζεται το αντιγόνο του ασθενούς. Δεξιά φαίνεται η μη
ανταγωνιστική μέθοδος, όπου οι εστέρες ακριδίνης των conjugate αντισωμάτων ενώνονται με όλα τα ακινητοποιημένα
αντίγονα της στερεής φάσης.
Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται με μικρές παραλλαγές και από τους αναλυτές Architect της
εταιρείας Αbbott. Συμβολίζεται ως CMIA από τα αρχικά Chemilescence Microparticles Immunoassay.
Στηρίζεται όπως και άλλες μέθοδοι στην σύνδεση αντιγόνων με συνδεδεμένα, πάνω σε μαγνητικά σφαιρίδια,
αντισώματα (Animation 6.2).
172
Αnimation 6.2 Αναπαράσταση της μικροσωματιδιακής ανοσοχημειοφωταύγειας. Οι πρωτεΐνες που συνδέονται με
παραμαγνητικά σφαιρίδια, με την επίδραση αντισωμάτων, διαχωρίζονται από τις υπόλοιπες πρωτεΐνες του δείγματος.
Φωτογραφία 6.1 Η φόρτωση του φωταυγειόμετρου (ή λουμινόμετρου) με φιαλίδια βαθμονομητών, δειγμάτων ελέγχου
ποιότητας (controls) και δειγμάτων ασθενών κατά τον προσδιορισμό ορμονών με ενζυμική χημειοφωταύγεια.
6.7.1.3 Η Ανοσοχημειοφωταύγεια Καναλιού Οξυγόνου
Η ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου (Luminescent oxygen channeling immunoassay ή LOCI)

βασίζεται στην αλληλεπίδραση δύο σωματιδίων latex, τα sensibead και chemibead, που βρίσκονται σε
κοντινή απόσταση (Σχήμα 6.18). Το sensibead περιέχει τη βαφή φθαλοκυανίνη και φέρει αντισώματα ειδικά
για το αντιγόνο που θέλουμε να προσδιορίσουμε. Τα αντισώματα του sensibead ενώνονται και με τα
σωματίδια chemibead, που περιέχουν στρεπταβιδίνη και μία οργανική ένωση τύπου ολεφίνης. Η κοντινή αυτή
173
απόσταση μεταξύ των σωματιδίων sensibead και chemibead έχει σαν αποτελέσμα, όταν το sensibead
διεγερθεί με κατάλληλο μήκος κύματος, η φθαλοκυανίνη που περιέχει, να εκπέμψει μονήρη οξυγόνο που
αμέσως θα αντιδράσει με το γειτονικό chemibead και θα παράξει φως.
Σχήμα 6.18 Αναπαράσταση της ανοσοχημειοφωταύγειας καναλιού οξυγόνου.
6.7.1.4 Ηλεκτροχημειοφωταύγεια
Η ηλεκτροχημειοφωταύγεια (Electrochemilescence Immunoassay ή eCLIA) χρησιμοποιεί ως ιχνηθέτη το

ρουθήνιο, το οποίο δεν ενεργοποιείται χημικά όπως τα άλλα μόρια (πχ εστέρες ακριδίνης, λουσιφερόλη),
αλλά με την εφαρμογή διαφοράς δυναμικού (mV). Αυτό έχει ως πλεονέκτημα τον καλύτερο έλεγχο της
αντίδρασης. Η eCLIA θεωρείται σήμερα η πιο ευαίσθητη (δηλαδή μπορεί να μετρήσει πολύ μικρές
συγκεντρώσεις) και προηγμένη αυτοματοποιημένη ανοσοχημική μέθοδος.
Τα άλατα του χηλικού συμπλόκου του ρουθηνίου [τρις(διπυριδυλ)-ρουθηνίου, (Ru(bpy)32+)]
έχουν τη δυνατότητα όταν ανάγονται να παράγουν φως. Η αντίδραση παραγωγής φωτός από το σύμπλοκο
Ru(bpy)32+ προϋποθέτει και την ταυτόχρονη χρησιμοποίηση της τριπροπυλαμίνης (ΤΡΑ). Η όλη αντίδραση
λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου (Σχήμα 6.19). Εκεί η ρίζα TPA+ και το Ru(bpy)33+
αντιδρούν μεταξύ τους και το Ru(bpy)33+ μετατρέπεται σε Ru(bpy)32+. Αυτή η μεταφορά ενέργειας
δημιουργεί μία διεγερμένη κατάσταση, η οποία είναι ασταθής και επιστρέφει γρήγορα στην αρχική
κατάσταση με την εκπομπή ενός φωτονίου στα 620 nm. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται συνεχώς. Η
ρίζα TPA ανάγεται σε παραπροϊόντα τα οποία δεν επηρεάζουν την αντίδραση της χημειοφωταύγειας, επειδή
όμως εξαντλείται θα πρέπει να βρίσκεται σε περίσσεια. Στο τέλος της αντίδρασης το ρουθήνιο αναγεννάται
και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολλούς κύκλους παραγωγής φωτονίων. Καθώς εξαντλείται η ποσότητα
της TPA, που βρίσκεται στο ηλεκτρικό πεδίο, η ισχύς του φωτός (σήμα) μειώνεται με αργό ρυθμό από το
μέγιστο σημείο που έφτασε αρχικά. Το σύμπλοκο ρουθηνίου αναγεννάται συνεχώς και το σύμπλοκο
αντιγόνου – αντισώματος παράγει στο τέλος πολλά φωτόνια.
174
Σχήμα 6.19 Αναπαράσταση της αρχής μεθόδου της ηλεκτροχημειοφωταύγειας (Roche diagnostics, 1998).
6.8 Οι Ομογενείς Ανοσοενζυμικοί προσδιορισμοί
Όπως αναφέρθηκε στην εισαγωγή, ως ομογενείς ανοσοχημικοί προσδιορισμοί καλούνται εκείνοι στους
οποίους δεν απαιτείται ο διαχωρισμός συνδεδεμένου και ασύνδετου με τα αντισώματα αντιγόνου. Αυτό
πρακτικά σημαίνει ότι δεν χρειάζεται να γίνονται εκπλύσεις μεταξύ των διαδοχικών σταδίων της μεθόδου,
χαρακτηριστικό γνώρισμα των ετερογενών μεθόδων. Στις ομογενείς μεθόδους η διάκριση μεταξύ
συνδεδεμένου και ασύνδετου αντιγόνου βασίζεται στις διαφορετικές χημικές και φυσικές ιδιότητες τους και
σε αυτές οφείλεται η μεγαλύτερη ποικιλία των ομογενών προσδιορισμών σε σχέση με τους ετερογενείς. Θα
αναφερθούμε παρακάτω σε μερικές από τις πιο χαρακτηριστικές.
6.8.1 Η Ανοσοενζυμική Ενισχυμένη μέθοδος
Η ανοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος (Enzyme Multiplied Immunoassay Τechnique ή EMIT

χρησιμοποιείται ευρέως για τη μέτρηση ναρκωτικών και φαρμακευτικών ουσιών. Ο ιχνηθέτης της μεθόδου
είναι το ένζυμο αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6-PD).
D-γλυκόζη-6-φωσφορική + NAD(P) ⇔D-γλυκονο-δ-λακτόνη-6-φωσφορική + NAD(P)H2 (Aντίδραση 6.2)

Το ένζυμο αυτό όταν προστίθεται σε διάλυμα που περιέχει το αντιγόνο, δηλ. το φάρμακο ή τη
ναρκωτική ουσία, ενώνεται μαζί του και σχηματίζει σύμπλοκο. Στο σύμπλοκο αυτό το ένζυμο είναι ενεργό,
αλλά η ενεργότητα του μειώνεται, μόλις το σύμπλοκο ενζύμου-φαρμάκου ενωθεί με το ειδικό για το αντιγόνο
αντίσωμα. Η μείωση της ενεργότητας οφείλεται στο γεγονός ότι το αντίσωμα δεσμεύει το ενεργό κέντρο του
ενζύμου και έτσι εμποδίζεται η σύνδεση του ενζύμου με το υπόστρωμα του, την 6-φωσφορική γλυκόζη.
Η μέθοδος είναι ανταγωνιστικού τύπου. Όσο περισσότερο φάρμακο υπάρχει στον ορό του ασθενούς
τόσο περισσότερο από αυτό θα συνδεθεί με τα αντισώματα και άρα λιγότερο σύμπλοκο ενζύμου-φαρμάκου
θα συνδεθεί με τα εναπομείναντα αντισώματα. Το φωτόμετρο του αναλυτή μετρά την απορρόφηση του
NADH της οποίας η μέγιστη τιμή εμφανίζεται σε διαφορετικό μήκος κύματος από το συνένζυμο NAD+.
6.8.2 Ο Πολωμένος Φθορισμός
Η μέθοδος του πολωμένου φθορισμού (Fluorescence Polarization Immunoassay ή FPIA) είναι

ανταγωνιστικού τύπου και χρησιμοποιεί ως ιχνηθέτη τη φθορίζουσα ουσία φλουορεσκείνη (FITC) (Λιανίδου,
1994). Εδώ το ελεύθερο αντιγόνο (Ag) και ο συνδεδεμένος ιχνηθέτης (Ag-FITC) ανταγωνίζονται για το πιο
θα ενωθεί με το αντίσωμα (Ab), σύμφωνα με το παρακάτω σχήμα.
175
Ag Ab-Ag
+ Ab →
Ag-FITC Ab-Ag-FITC
Μετά το πέρας της αντίδρασης τα μόρια που μπορούν να φθορίσουν μέσα στο διάλυμα είναι τα Ag-
FITC και τα Ab-Ag-FITC. Για τη διάκριση των δύο συμπλόκων χωρίς να προηγηθεί ο διαχωρισμός τους
(ομογενής προσδιορισμός) εφαρμόζεται στο διάλυμα πολωμένη ακτινοβολία διεγέρσεως. Πολωμένη
ονομάζεται η ακτινοβολία της οποίας όλα τα σωματίδια ταλαντώνονται στο ίδιο επίπεδο. Η πολωμένη
ακτινοβολία διεγέρσεως διεγείρει τη FITC οπότε αυτή παράγει πράσινο χρώμα. Αν το μοριακό βάρος του
συμπλόκου είναι μεγάλο (Ab-Ag-FITC), τότε το φως που παράγεται από τη FITC είναι πολωμένο. Αντίθετα
στο μικρό σύμπλοκο FITC (Ag-FITC) το παραγόμενο φως δεν είναι πολωμένο (Σχήμα 6.20). Κατάλληλοι
ανιχνευτές μετρούν το πολωμένο φως και κατά συνέπεια και την ποσότητα του αντιγόνου. Όσο μεγαλύτερη
είναι η συγκέντρωση του Ag του δείγματος, τόσο μικρότερη είναι η ακτινοβολία φθορισμού (ανταγωνιστική
μέθοδος).
Σχήμα 6.20 Αναπαράσταση της ομογενούς μεθόδου του πολωμένου φθορισμού. Τα αντιγόνα του δείγματος ανταγωνίζονται
όμοια αντιγόνα σημασμένα με τη φθορίζουσα ουσία FITC. Μόνο τα σημασμένα ανοσοσυμπέγματα πολώνουν το φώς που τα
διεγείρει.
6.8.3 Η Μικροσωματιδιακή Ανάλυση
Η μικροσωματιδιακή ανάλυση (Particle Counting Immunoassay ή PACIA) είναι μια αυτοματοποιημένη

ανταγωνιστσική ανοσοχημική μέθοδος. Δεν χρησιμοποιεί ενζυμική ανάλυση, αλλά παρ όλα αυτά εξετάζεται
μαζί με τις ανοσοενζυμικές μεθόδους, διότι πολλοί ανοσοενζυμικοί αναλυτές εκτελούν και τη
μικροσωματιδιακή ανάλυση. Η αρχή της μεθόδου είναι παρόμοια με τις συγκολλητινοαντιδράσεις.
Σε αυτή χρησιμοποιούνται μικρά σφαιρίδια latex, που είναι επικαλυμμένα με αντισώματα έναντι
του αναζητούμενου αντιγόνου. Τα αντιγόνα του ορού του ασθενούς προκαλούν τη συγκόλληση των
σφαιριδίων. Το πλήθος των συγκολλήσεων εκτιμάται από τη μέτρηση των μη-συγκολλημένων σφαιριδίων,
που διέρχονται μέσα από συσκευή παρόμοια με τον κυτταρομετρητή ροής (Σχήμα 6.21). Είναι ανταγωνιστική
μέθοδος.
176
Σχήμα 6.21 Αναπαράσταση των τριών σταδίων της αυτόματης μικροσωματιδιακής ανάλυσης.
6.9 Παράγοντες που επηρεάζουν τις Ανοσοχημικές αναλύσεις
Είναι πολλοί οι παράγοντες που μπορούν να επιδράσουν στις ανοσοχημικές αναλύσεις και να δώσουν
ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Άλλοι παράγοντες οφείλονται σε τεχνικά προβλήματα της ανάλυσης
(Πίνακας 6.14) και άλλες φορές σε προβλήματα που σχετίζονται με τη συμπεριφορά των αντισωμάτων των
αντιδραστηρίων (Δεσύμπρης, 1994).
6.9.1 Το φαινόμενο του Αγκίστρου
Το φαινόμενο του αγκίστρου (hook effect) εμφανίζεται σε δείγματα πολύ υψηλής συγκέντρωσης τα οποία
ψευδώς φαίνονται με μηδενική συγκέντρωση. Σε αυτή τη περίπτωση, το αντιγόνο είναι σε τόσο υψηλή
συγκέντρωση, που ο όγκος τους δημιουργεί παρεμβολές στη σύνδεση γειτονικών αντιγόνων με τα
αντισώματα της αντίδρασης. Η αντιμετώπιση του προβλήματος έγκειται στη προ-αραίωση του δείγματος
από τον αναλυτή, αλλά και στη γνώση του ιατρικού ιστορικού του ασθενούς. Εάν ο αναλυτής δεν μπορεί
να λύσει το πρόβλημα με προαραίωση, τότε από τη γνώση του ιατρικού ιστορικού θα πρέπει να εντοπιστεί
έγκαιρα το πρόβλημα και να γίνει προ-αραίωση χειρονακτικά από τον χρήστη του αναλυτή.
6.9.2 Τα Eτερόφιλα Αντισώματα
Πρόκειται για αντισώματα που αναπτύσσονται στον ορό ορισμένων ανθρώπων έναντι των αντισωμάτων
που χρησιμοποιούνται στις ανοσοχημικές τεχνικές. Τα αντισώματα αυτά παράγονται από τον εμβολιασμό
177
ζώων με ανθρώπινα αντιγόνα. Συνήθως τα ετερόφιλα αντισώματα εμφανίζονται στον ορό ατόμων, που
πάσχουν από κάποια φλεγμονή και το ανοσοποιητικό τους σύστημα είναι εξαιρετικά διεγερμένο. Η σύνδεση
των ετερόφιλων αντισωμάτων με τα αντισώματα του αντιδραστηρίου δεσμεύει τα τελευταία, οπότε δεν
αντιδρά ο ιχνηθέτης και το αποτέλεσμα βγαίνει αρνητικό.
6.9.3 Τα Αυτοαντισώματα
Μια πολύ σπάνια περίπτωση αναφέρεται σε ανθρώπινα αντισώματα, που δεσμεύουν τα αντιγόνα του
ανθρώπου που θέλουμε να μετρήσουμε. Τα αντισώματα αυτά ονομάζονται αυτοαντισώματα και σε αυτά
περιλαμβάνεται πχ η παρουσία αντιθυρεοειδικών αντισωμάτων anti-TG. Τα αντισώματα αυτά συνδέονται με
τη θυρεοσφαιρίνη του ασθενούς (TG) με αποτέλεσμα αυτή να μην μπορεί να ενωθεί με τα αντισώματα του
αντιδραστηρίου.
6.9.4 Τα Θεραπευτικά Αντισώματα
Σήμερα όλο και περισσότερο χρησιμοποιούνται αντισώματα σε θεραπείες, κυρίως του καρκίνου. Το
αποτέλεσμα είναι να αναπτύσσουν ορισμένα άτομα αντισώματα έναντι των ποντικιών (ΗΑΜΑ) από τα οποία
παράγονται κυρίως τα μονοκλωνικά θεραπευτικά αντισώματα. Τα αντισώματα HAMA μπορούν να
προκαλέσουν ψευδώς θετικά ή ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.
6.9.5 Άλλοι ανοσολογικοί παράγοντες που παρεμβαίνουν στις μετρήσεις
Εκτός από τις προηγούμενες ισχυρές ανοσολογικές παρεμβολές μπορούν να επιδράσουν και άλλες, έστω και
με λιγότερο φανερά αποτελέσματα. Για παράδειγμα, οι ρευματοειδείς παράγοντες (RF) μπορεί να
επιδράσουν με το τμήμα Fc των αντισωμάτων που περιέχονται στα αντιδραστήρια των ανοσοχημικών
μεθόδων, εμποδίζοντας έτσι, τη σύνδεση του αντιγόνου. Παρόμοιες παρεμβολές μπορούν να κάνουν και οι
πρωτεΐνες του συμπληρώματος προς αντισώματα κονίκλου, που χρησιμοποιούνται ως αντιδραστήρια.
Προβλήματα Αίτια Πιθανές λύσεις
Τα αντιδραστήρια
χρησιμοποιήθηκαν σε λάθος Ελέγξτε το φύλλο οδηγιών και επαναλάβετε τη
σειρά ή κάποιο στάδιο δοκιμασία.
δοκιμασίας παραλήφτηκε.
Δεν αραιώθηκαν τα δείγματα με

Ελέγξτε την αραίωση των δειγμάτων πριν την
τον κατάλληλο διαλύτη, (εφόσον
έναρξη της τεχνικής.
απαιτείται).
Χωρίς σήμα/Μη
εμφάνιση χρώματος
Δεν παρασκευάστηκε σωστά ή Όλα τα προϊόντα σύζευξης περιέχονται σε κάθε kit
δεν είχε αποθηκευτεί σωστά το κάθε παρτίδας. Εάν απαιτείται η αραίωση του
αντιδραστήριο του συνδέτη αρχικού διαλύματος, πρέπει συμπύκνωμα και
(conjugate). διαλύτης να αναμιγνύονται σε σωστές ποσότητες.
Προσθήκη μη επαρκούς
Έλεγχος προσθήκης σωστής ποσότητας
ποσότητας αντισώματος ή
αντισώματος.
παράληψη της προσθήκης του.
Παράληψη προσθήκης Έλεγχος προσθήκης διαλύματος υποστρώματος

διαλύματος υποστρώματος. κατάλληλης συγκέντρωσης.
178
Το ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης
Παρασκευή φρέσκου διαλύματος έκπλύσης.
περιέχει αζωτούχο νάτριο.
Η θερμοκρασία του δωματίου πρέπει να είναι 18 -

Η θερμοκρασία του εργαστηρίου 25°C. Αποφύγετε να εκτελείτε την τεχνική κάτω
είναι πολύ χαμηλή. από αεραγωγούς κλιματισμού ή κοντά σε
παράθυρα.
Μη σωστή παρασκευή του Παρασκευάστε φρέσκο διάλυμα εκπλύσης

διαλύματος εκπλύσης (wash). σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή του Kit.
Χρησιμοποιήθηκε χρόνος
Ακολουθείτε τους χρόνους επωάσεων, που
επωάσεων μικρότερος από το
προτείνει ο κατασκευαστής.
Χαμηλής έντασης σήμα αναμενόμενο.
Τα αντιδραστήρια ήταν σε πολύ Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια είναι σε
χαμηλή θερμοκρασία. θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση.
Βεβαιωθείτε για την ημερομηνία λήξης των
αντιδραστηρίων, που αναγράφεται στη
Τα αντιδραστήρια έχουν λήξει.
συσκευασία, τόσο με ανοιχτή, όσο και κλειστή
συσκευασία.
Το φωτόμετρο ή άλλη αυτόματη
συσκευή ήταν ρυθμισμένη σε Έλεγχος μήκους κύματος και βαθμονόμηση εκ
λάθος μήκος κύματος ή δεν είχε νέου της συσκευής.
βαθμονομηθεί σωστά.
Ανεπαρκής ποσότητα αντιγόνου Χρήση της σωστής ποσότητας αντιγόνου, όπως

ασθενούς. προτείνει ο κατασκευαστής.
Ανεπαρκής ποσότητα Χρήση της σωστής ποσότητας αντισώματος, όπως
αντισώματος. προτείνει ο κατασκευαστής.
Το αντιδραστήριο του Χρησιμοποιήστε υψηλότερη συγκέντρωση
υποστρώματος ήταν πολύ αραιό. αντιδραστηρίου ανίχνευσης.
Χρησιμοποιήθηκε νερό κακής
Ελέγξτε την ποιότητα του νερού που
ποιότητας κατά την παρασκευή
χρησιμοποιείται.
του διαλύματος πλύσης.
Το διάλυμα υποστρώματος έχει Βεβαιωθείτε ότι το υπόστρωμα είναι άχρωμο, πριν
αλλοιωθεί. από την προσθήκη στην πλάκα.
Υψηλής έντασης
υπόβαθρο (high Αυξήστε τον αριθμό των εκπλύσεων. Βεβαιωθείτε
Ανεπαρκές πλύσιμο ή κακή
backround) ότι παρέχονται τουλάχιστον 400 μL του διαλύματος
απόδοση πλύσης.
εκπλύσης σε κάθε κυψελίδα ανά πλύση.
Απομακρύνετε τη μικροβιακή μόλυνση με έκπλυση

Μικροβιακή μόλυνση του του συστήματος με αραιό διάλυμα χλωρίνης (10%
συστήματος ύδρευσης. κατ’ όγκο) που ακολουθείται από μεγάλη ποσότητα
απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού.
Η συσκευή ανάγνωσης των

αποτελεσμάτων ήταν ρυθμισμένη Ελέγξτε το μήκος κύματος του φωτομέτρου.
σε λάθος μήκος κύματος ή δεν Βαθμονομείστε σωστά το φωτόμετρο.
είχε βαθμονομηθεί σωστά.
179
Η αντίδραση γίνεται συνήθως θερμοκρασία
Η θερμοκρασία του εργαστηρίου δωματίου 18 - 25°C. Αποφύγετε την εργασία κάτω
ήταν πολύ υψηλή ή πολύ χαμηλή. από αεραγωγούς κλιματισμού ή κοντά σε
παράθυρα.
Τα αντιδραστήρια περιείχαν
Βεβαιωθείτε ότι χρησιμοποιήθηκαν τα σωστά
προσμίξεις ή δεν
αντιδραστήρια, και ότι δεν έχει γίνει επιμόλυνση.
παρασκευάστηκαν σωστά.
Τα πηγαδάκια της πλάκας ήταν Χρησιμοποιήστε πολυκάναλες πιπέτες χωρίς να
μολυσμένα. αγγίξετε την πλάκα.
Εξασφαλίστε ότι οι πλάκες και τα αντιδραστήρια
Οι πλάκες δεν είναι στη σωστή
βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη
θερμοκρασία.
χρήση.
Η παρασκευή των διαλυμάτων υποστρώματος

Ανάπτυξη χρώματος με πρέπει να γίνεται αμέσως πριν από τη χρήση.
Το ανοσοσύμπλεγμα είναι
αργό ρυθμό. Βεβαιωθείτε ότι τα αντιδραστήρια δεν έχουν λήξει,
αδύναμο.
έχουν αποθηκευτεί σωστά, και χρησιμοποιούνται
στη σωστή συγκέντρωση.
Παρουσία προσμείξεων, όπως αζίδιο του νατρίου

Τα διαλύματα των και το υπεροξείδιο μπορεί να επηρεάσουν την
αντιδραστηρίων έχουν αντίδραση υποστρώματος. Αποφύγετε τη χρήση
επιμολυνθεί. αντιδραστηρίων που περιέχουν αυτά τα
συντηρητικά.
Πίνακας 6.14 Συνηθισμένα τεχνικά προβλήματα, αιτίες και λύσεις τους σε μεθόδους ELISA.
180
Ο ποσοτικός προδιορισμός των αυτοαντισωμάτων anti-ds DNA με ELISA, https://youtu.be/1I9v95_I7hg.
 Παρουσίαση αυτόματου αναλυτή Human

https://www.youtube.com/watch?v=tDp8aWrVkXQ&feature=plcp (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Μάθημα ELISA από το πανεπιστήμιο Michigan (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015).
https://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-M (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Τα στάδια ανταγωνιστικής και μη ανταγωνιστικής ELISA
https://www.youtube.com/watch?v=Kb26nQVMHds (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της ELISA: https://www.youtube.com/watch?v=6Ue1Hd3dyaQ (τε-
λευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της ELISA: https://www.youtube.com/watch?v=lNxZxJtvB94 (τε-
λευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Manual τεχνική ELISA: https://www.youtube.com/watch?v=Tp61S-2F2B4 (τελευταία προσπέλαση
15/1/2015).
 Αναπαράσταση με κινούμενα σχέδια της τεχνικής DELFIA
https://www.youtube.com/watch?v=NrJbjuSXb8c (τελευταία προσπέλαση 15/1/2015).
 Σχήμα 6.11 http://www.labnews.co.uk (τελευταία προσπέλαση 20/1/2015).
181
Αναφορές
1. ΓΡΗΓΟΡΗ Κ. (2011) Η τεχνική της χημειοφωταύγειας. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
2. ΕΥΑΓΓΕΛΑΤΟΣ, Π. (1994) Ραδιοανοσοαναλύσεις. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
3. ΔΕΣΥΠΡΗΣ, Α. (1994) Ενδογενείς παράγοντες που παρεμβαίνουν στις ανοσοαναλύσεις. Αθήνα: Σεμινάριο
της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
4. ΔΙΑΜΑΝΤΗΣ, Φ., ΣΙΣΚΟΣ, Α., ΠΑΠΑΝΑΣΤΑΣΙΟΥ-ΔΙΑΜΑΝΤΗ, Α. (1987) Μαθήματα κλινικής χη-
μείας. Αθήνα: Εκδόσεις Λύχνος.
5. ΖΕΡΒΟΥ, Ε. (1988) Χημειοφωταύγεια, Αθήνα: Σεμινάριο ανοσολογίας 16ος κύκλος.
6. ΚΑΛΟΚΑΙΡΙΝΟΣ, Κ. (1994) Ανοσοχημειοφωταύγεια. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
7. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (1994) Χημειομετρία ανοσοχημικών προσδιορισμών. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-
ΚΒ.
8. ΚΟΚΚΑΛΙΑΡΗΣ, Δ. (2011) Ανοσοενζυμικές δοκιμασίες. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
9. ΛΙΒΑΝΙΟΥ, Ε. (1994) Ενίσχυση σήματος στις ανοσοαναλύσεις, Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
10. ΛΙΑΝΙΔΟΥ, Σ. (1994) Εφαρμογές του φθορισμού στους ανοσοχημικούς προσδιορισμούς. Αθήνα: Σεμινά-
ριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
11. ΜΟΥΡΑΤΗ, Ο. (2015) Προσδιορισμός ανασυνδυσμένης GH με χημειοφωταύγεια. Αθήνα: ΤΕΙ Αθήνας.
12. ΝΙΚΟΛΟΥ, Χ. (2000) Η χημειοφωταύγεια στις ανοσοαναλύσεις, Αθήνα: Σεμινάριο ανοσολογίας 18ος κύ-
κλος
13. ΠΑΥΛΑΤΟΥ, Π. (1997) Ανοσολογία. Αθήνα: Ιατρικές εκδόσεις Λίτσας.
14. ΡΙΖΟΣ, Δ. (1994) Ανοσοενζυμικές τεχνικές. Αθήνα: Σεμινάριο της ΕΕΚΧ-ΚΒ.
15. COBA CORNING (1995) Οδηγίες χρήσης του αναλυτή ACS: 180.
16. TERNYNCK, T. & AVRAMEAS, S. (1988) Ανοσοενζυμικές τεχνικές. Αθήνα: Ελληνικό Ινστιτούτο Pas-
teur.
17. ROCHE DIAGNOSTICS (1998) Οδηγίες χρήσης του αναλυτή Elecsys 2010.
18. ROITT, I., BROSTOFF, J., MALE, D. (1995) Ανοσολογία. Αθήνα: Εκδόσεις Γρ. Παρισιάνος
182
ΑΥΤΟΜΑΤΟΙ ΑΝΑΛΥΤΕΣ
ΚΑΙ ΣΥΓΧΡΟΝΗ BΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ
ΣΤΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ
Σύνοψη
Aπό την πρώτη επινόηση αυτόματου αναλυτή από τον Leonard Skeggs, μέχρι τα σημερινά υπεραυτόματα
αρθρωτά συστήματα και από τα απλά φωτόμετρα της δεκαετίας του ‘50, μέχρι τα microchips του σήμερα,
έχουν περάσει πολλές δεκαετίες. Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφεί η ιστορική διαδρομή των
σημαντικότερων διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που σημάδεψαν την εξέλιξη των αυτόματων αναλυτικών
συστημάτων.
Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στα σύγχρονα αναλυτικά συστήματα (πλατφόρμες που συνδυάζουν
χρωματομετρικές και ανοσοχημικές τεχνικές), στις μικροδιατάξεις, στα εργαστηριακά συστήματα
πληροφοριών και στις τάσεις του μέλλοντος (βιοαισθητήρες).
Το παρόν κεφάλαιο θα αναφερθεί σε τεχνολογίες που χρησιμοποιούνται στους αυτόματους αναλυτές.

Δεδομένου ότι οι αναλυτές αυτοί υλοποιούν με αυτόματο τρόπο γνωστές μεθοδολογίες, που γίνονται και με
ημιαυτόματες ή με μεθόδους δια χειρός, ο αναγνώστης θα πρέπει να έχει μελετήσει το Κεφάλαιο 1
(φωτομετρία) και το Κεφάλαιο 7 (ανοσοχημικές μέθοδοι).
Ο «πατέρας» του αναλυτή τυχαίας προσπέλασης ήταν αναμφισβήτητα ο Leonard T. Skeggs Jr. (1918 - 2002).
Στα Σχήματα 7.1, 7.2 παρουσιάζονται ορισμένα κρίσιμα σκαριφήματα από το βασικό Δίπλωμα Ευρεσιτε-
χνίας (ΔΕ) του Skeggs, στη λογική του οποίου στηρίχθηκαν σε μεγάλο βαθμό, οι πολυάριθμοι αυτόματοι
αναλυτές για τις επόμενες δεκαετίες.
Η αλβουμίνη προσδιορίζεται απευθείας στον αραιωμένο ορό, με τη χρήση χρώσης HABA. Το υπό-
λοιπο του δείγματος διέρχεται από ένα διαλύτη και το μη διαλυτό μέρος του ρεύματος χρησιμοποιείται για
τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης και του CO2. Το διαλυτό μέρος χρησιμοποιείται για να μετρηθεί η
γλυκόζη και η ουρία, καθώς και η συγκέντρωση ιόντων νατρίου και καλίου, μέσω φλογοφωτομετρίας. Οι
«έγχρωμες» ροές επιβραδύνονται υδραυλικά, μέσω σπειροειδών σωλήνων διαφόρων μηκών, ώστε οι κορυ-
φές από ένα δεδομένο δείγμα να φθάνουν στο χρωματόμετρο σε αλληλουχία και να καταγράφονται με τη
σειρά άφιξής τους.
O πρώτος πολλαπλός αναλυτής περιγράφεται στο περιοδικό Clinical Chemistry (Skeggs &
Hochstrasser, 1964) και έδωσε εξαιρετικά αναλυτικά αποτελέσματα, με ρυθμό 20 δειγμάτων ανά ώρα. Απέ-
δειξε την ορθότητα της ιδέας και οδήγησε στην πολύ επιτυχημένη διάταξη SMA 12/60, που χρησιμοποιήθη-
κε και στον πρώτο αναλυτή με ελεγχόμενη εισαγωγή φυσαλίδων, η οποία μείωσε το θόρυβο και επέτρεπε
ρυθμό 60 δειγμάτων ανά ώρα. Το αποκορύφωμα της σειράς ήταν ότι ο SMAC (Sequential Multiple Analyzer
Computer) πραγματοποιούσε 20 αναλύσεις για κάθε δείγμα, ανά 20 δευτερόλεπτα και ήταν ο πρόδρομος των
μελλοντικών αναλυτών τυχαίας προσπέλασης (Φωτογραφίες 7.1, 7.2).
183
Σχήμα 7.1 Η κάτοψη του αυτόματου συστήματος τροφοδότησης δειγμάτων του πρώτου αναλυτή του Skeggs L.T. (Skeggs,
1955).
Χρειάστηκαν αρκετά χρόνια και πολλές προσπάθειες για να αναπτυχθούν αυτοματοποιημένοι ανα-
λυτές και για τις ανοσοχημικές δοκιμασίες (Σχήμα 7.3). Μια από τις πρώτες επιτυχημένες προσεγγίσεις περι-
γράφεται στην αίτηση Δ.Ε. JPS63295964 (A) (Σχήμα 7.4).
Για να επιτευχθεί η ταχύτερη δυνατή ανοσολογική ανάλυση, με την έγχυση ενός δείγματος σε μι-
κροπλάκες και για να μεταφερθούν αυτόματα σε τμήματα του αναλυτή, για να εγχυθούν σε κατάλληλο αντι-
δραστήριο, ν’ αναδευθούν, να επωαστούν, να πλυθούν και να ανιχνευτεί η αντίδραση, χρειάζεται ο αναλυτής
να είναι εφοδιασμένος με ένα τμήμα έγχυσης δείγματος 1, ένα τμήμα έγχυσης αντιδραστηρίου 2, ένα τμήμα
πλύσης 3, ένα τμήμα ανάδευσης 4, ένα τμήμα επώασης 5 και ένα τμήμα ανίχνευσης 6 (Σχήμα 7.3).
184
Σχήμα 7.2 Η τομή του αυτόματου συστήματος τροφοδότησης δειγμάτων του Διπλώματος Ευρεσιτεχνίας (ΔΕ) του L.T.
(Skeggs, 1955).
Φωτογραφία 7.1 Φωτογραφία του SMAC και γράφημα τιμών από τον SMA 12/60 με όλες τις τιμές που εμπίπτουν στην
σκιασμένη «κανονική» περιοχή τιμών (Skeggs, 1955).
185
Φωτογραφία 7.2 Ο SMAC διέθετε ήδη εκτυπωτή αποτελεσμάτων και ένα στοιχειώδες σύστημα διαχείρισης δεδομένων
(Skeggs, 1955).
Σχήμα 7.3 Η δομή ανοσολογικού αναλυτή, όπως περιγράφεται στην αίτηση Δ.Ε. JPS63295964.
186
Σχήμα 7.4 Αιτήσεις Δ.Ε. σχετιζόμενες με χημικούς αναλυτές ανά έτος.
Ο χειριστής τοποθετεί μια μικροπλάκα για την έγχυση του δείγματος στο τμήμα 1 και το δείγμα
(π.χ. ορός) εγχέεται αυτόματα στο set της μικροπλάκας. Κατόπιν, η μικροπλάκα μεταφέρεται στο τμήμα έγ-
χυσης του αντιδραστηρίου 2, το δείγμα αναδεύεται στο τμήμα 4, επωάζεται στο τμήμα 5 για ένα ορισμένο
χρονικό διάστημα και στη συνέχεια, η αντίδραση μεταξύ του δείγματος και του αντιδραστηρίου ανιχνεύεται
στο τμήμα ανίχνευσης 6.
Οι μικροπλάκες εκπλένονται στο τμήμα. Οι δράσεις του κάθε τμήματος ελέγχονται από το τμήμα ε-
λέγχου 8. Έτσι, η μικροπλάκα μεταφέρεται αυτόματα στους επιμέρους τομείς, επιτρέποντας στην ανοσοεν-
ζυμική αντίδραση να γίνει γρήγορα και με υψηλή ακρίβεια.
Η αναλυτική ιστορική προσέγγιση όλων αυτών των καινοτομιών, δεν αποτελεί σκοπό αυτού του κε-
φαλαίου. Εντούτοις, από τα λίγα ζητήματα που αναφέρθηκαν, δεν μένει καμιά αμφιβολία ότι μετά την εμφά-
νιση των αυτόματων αναλυτών τυχαίας προσπέλασης του Skeggs, το σύγχρονο κλινικό εργαστήριο, σύμφω-
να με τα λεγόμενά του, είναι: «... μια πιο ταπεινή, λιγότερο ευπροσάρμοστη και πολύ τεχνική θέση εργασίας,
όμως, μέσα σ’ αυτό γίνονται πολύ περισσότερα πράγματα, με πολύ μικρότερο κόστος και με μεγαλύτερη ακρί-
βεια από ποτέ» (Skeggs, 2000).
Είναι σημαντική πάντα η μελέτη της ιστορίας για να καταλάβουμε πώς φθάσαμε στο παρόν, και να
προετοιμαστούμε για το μέλλον, που ήδη μας «χτυπάει την πόρτα».
Έτσι, στη συνέχεια θα εξετάσουμε τις επιμέρους συνιστώσες και λειτουργικές μονάδες των σύγχρο-
νων αυτόματων αναλυτών και συγκεκριμένα:
Πλήρη οπτικά συστήματα αυτόματων αναλυτών

 Πηγές Φωτός (UV,VIS, NIR): λυχνίες Wo, Xe, D2, HAL, LEDs, LASERs
 Κατάτμηση της φωτεινής δέσμης
 Φίλτρα, φράγματα, σχισμές, μηχανικά στροφεία κ.λπ.
 Υλικά και μορφές των κυψελίδων
 Ανιχνευτές (PMs, Δίοδοι, CCDs)
Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν χρωματομετρικές, ανοσοχημικές κ.λπ. αναλύσεις

 Οπτικές Μέθοδοι: χρωματομετρία, φασματοσκοπία, νεφελομετρία, κ.λπ.
 Ιχνηθέτες-Αντιδράσεις: κινητικές/τελικού σημείου, ανταγωνιστικές/Sandwich, ανοσο-ενζυμικές φθορι-
σμού, χημειο-φωταύγειας κ.λπ.
 Διαχείριση δειγμάτων, επωάσεων και χρόνου με μΡ
Προαναλυτική-αναλυτική και μεταναλυτική διαδικασία.

 Τοποθέτηση δειγμάτων
187
 Ροή δειγμάτων → Διεπαφές: Υγρή (χημεία) → Οπτική (μέτρηση) → Ηλεκτρική (αναλογική έξοδος) →
DAC → Data-bus → Δειγματοληψία → Επεξεργασία → Παρουσίαση & αρχειοθέτηση αποτελεσμάτων
→ Απομάκρυνση αποβλήτων & προσωρινή φύλαξη δειγμάτων (επαναλήψεις)
 Διεπαφές Ανθρώπου – Αναλυτή - Δικτύου: PC/LIS/HIS/Web
Αναδυόμενες τεχνολογίες που θα επηρεάσουν σύντομα την αυτοματοποιημένη ανάλυση

 Μικροδιατάξεις (microarrays) για την παράλληλη ανίχνευση πολλών παραγόντων
 Οπτικοί, ηλεκτροχημικοί, μαγνητικοί, μικρο- και νανο- ηλεκτρομηχανικοί βιοαισθητήρες
 «Εξωτικές» τεχνολογίες (μαγνητοχημικές, WGM, κβαντικές κηλίδες κ.λπ.) σε νανο-επίπεδο, για την ανί-
χνευση βομορίων, ιών και κυττάρων
7.2 Πλήρη Οπτικά Συστήματα Αυτόματων Αναλυτών

Το οπτικό σύστημα ενός σύγχρονου αυτόματου βιοχημικού αναλυτή περιλαμβάνει πάντα τις ακόλουθες συ-
νιστώσες:
1. πηγές φωτός (UV, VIS, NIR),
2. σύστημα κατάτμησης της φωτεινής δέσμης,
3. σύστημα επιλογής του κατάλληλου μήκους κύματος (μονοχρωμάτορας),
4. μια μορφή κυψελίδας τοποθέτησης ή συνήθως ροής του προς ανάλυση δείγματος,
5. ένα σύστημα κατάλληλου ανιχνευτή ή ανιχνευτών.
Πηγές φωτός (UV, VIS, NIR): Κάθε αναλυτής περιλαμβάνει πάντα μια τουλάχιστον πηγή φωτός
και μια σειρά, συνήθως περιστρεφόμενων, οπτικών φίλτρων, με διαφορετικά χαρακτηριστικά μετάδοσης του
φωτός. Φωτίζεται έτσι, το προς ανάλυση δείγμα, με φως κατάλληλου μήκους κύματος (λ), διαμορφούμενου
κάθε φορά διαμέσου του κατάλληλου οπτικού φίλτρου. Κατά την περιστροφή του τροχού των φίλτρων, έ-
χουμε διαδοχικά τη μεταγωγή τους στη διαδρομή του φωτός από την εν λόγω πηγή. Με τον τρόπο αυτό
προσδιορίζονται τα αναλυτικά χαρακτηριστικά του υπό ανάλυση δείγματος, βάσει των οπτικών πληροφο-
ριών που λαμβάνονται.
Ως πηγές φωτός των αναλυτικών διατάξεων χρησιμοποιούνται:
 Λυχνίες ξένον (Xe). Διαθέτουν συνεχές φάσμα (250 - 800 nm), ένταση ακτινοβολίας περίπου ανάλογη
προς την ροή του ρεύματος μέσω της λυχνίας, απαιτούν όμως εκκινητή ιονισμού υψηλής τάσης (kV) του
Xe, για τη δημιουργία τόξου (σκανδαλισμός, triggering), (Σχήμα 7.5).
 Λυχνίες αλογόνου-βολφραμίου (HAL-Wo). Διαθέτουν συνεχές φάσμα (360 - 2500 nm). Το νήμα του
βολφραιμίου (Wo) (Σ.Τ. 3800°C) εξαχνώνεται συνεχώς, παράγοντας ατμό Wo, που συμβάλλει στη φωτο-
βολία, ενώ το αλογόνο (HAL) χρησιμεύει στην ανακύκλωση του Wo, που εξατμίζεται από το νήμα, μέσω
αντίστροφης χημικής αντίδρασής του με το Wo (Σχήμα 7.6).
 Λυχνίες δευτερίου (D2). Διαθέτουν συνεχές φάσμα (180 - 400 nm, UV). Χρησιμοποιούν νήμα και άνοδο
νικελίου (Ni) για τη δημιουργία τόξου μεταξύ τους (300 - 500 V εκκίνηση, 100 - 200 V λειτουργία) που
διεγείρει τα ηλεκτρόνια (e-) των μoρίων D2, πηγή εκπομπής UV, κατά την επιστροφή τους στην αρχική
τους κατάσταση (αποδιέγερση) (Σχήμα 7.7).
 Πηγές μονοχρωματικού φωτός βασισμένων σε ημιαγωγούς LEDs, LASERs κ.λπ. Η δίοδος LASER (LD),
είναι ένα ηλεκτρικά αντλούμενο LASER ημιαγωγών, στο οποίο το δραστικό μέσον σχηματίζεται από μία
p-n επαφή μιας διόδου ημιαγωγού, παρόμοια με αυτές που βρίσκονται σε μια δίοδο εκπομπής φωτός
(LED). Τα quantum dots (QDs) – LASERs είναι LASER ημιαγωγών, που χρησιμοποιούν κβαντικές τε-
λείες ως ενεργό μέσο. Λόγω του «στενού» κβαντικού περιορισμού των φορέων φορτίου σε κβαντικές τε-
λείες, τα QDs–LASERs παρουσιάζουν μια ηλεκτρονική δομή, παρόμοια με τα άτομα. Τα QDs–LASERs
βρίσκονται πιο κοντά στις επιδόσεις των LASERs αερίων και δεν εμφανίζουν μερικές από τις αρνητικές
πτυχές των παραδοσιακών LASERs ημιαγωγών, που βασίζονται π.χ. σε χύδην ημιαγώγιμα υλικά, όπως το
εύρος διαμόρφωσης, το κατώφλιο εκπομπής, τη σχέση έντασης-θορύβου κ.λπ. Η ενεργή περιοχή, μπορεί
επίσης να κατασκευάζεται για να λειτουργεί σε διαφορετικά μήκη κύματος, μεταβάλλοντας το μέγεθος
και τη σύνθεση του LASER κβαντικής τελείας, που δεν ήταν διαθέσιμα προηγουμένως. Αποτελούν τις
αναδυόμενες εναλλακτικές και μικροσκοπικές πηγές μονοχρωματικού φωτός στο άμεσο μέλλον, στην in
vitro διαγνωστική τεχνολογία (Σχήματα 7.8, 7.9).
188
Σχήμα 7.5 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής λυχνίας ξένου (Xe).
Σχήμα 7.6 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής λυχνίας αλογόνου-βολφραμίου (HAL-Wo).
189
Σχήμα 7.7 Το χαρακτηριστικό φάσμα εκπομπής του δευτερίου (D2) (Tokunaga, 2007).
Σχήμα 7.8 Χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QD-LASERs εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρο-
νολογίας προτεραιότητας (1990-2014).
190
Σχήμα 7.9 Χρονική εξέλιξη των σχετιζόμενων με QDs εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας συναρτήσει της χρονολογίας
προτεραιότητας (1990-2014).
Το σύστημα κατάτμησης (chopping) της φωτεινής δέσμης περιλαμβάνει συνήθως ένα μηχανικά
περιστρεφόμενο δίσκο και χρησιμοποιείται ευρέως στις αναλυτικές εργαστηριακές διατάξεις, για την μετα-
βολή της συνεχούς φωτοβολίας μιας πηγής φωτός, σε περιοδική, επιτρέποντας έτσι την δειγματοληψία της
έντασής της, συναρτήσει του χρόνου. Για να είναι αποτελεσματικό, ένα οπτικό σύστημα κατάτμησης θα πρέ-
πει να έχει μια σταθερή και επαρκή ταχύτητα περιστροφής και αρκετές οπές, ώστε η ταχύτητα δειγματολη-
ψίας να οδηγεί στην ελαχιστοποίηση του θορύβου (κριτήριο Nyquist–Shannon). Υπάρχει και η δυνατότητα
«ηλεκτρονικής» κατάτμησης με κυκλώματα χρονισμού, που ρυθμίζουν διακόπτες on-off, όταν απαιτούνται
υψηλότερες συχνότητες δειγματοληψίας.
Σχήμα 7.10 Δύο συνηθισμένα σχήματα περιστρεφόμενων δίσκων κατάτμησης της φωτεινής δέσμης σε οπτικές διατάξεις
αναλυτικών συσκευών (λόγος κατάτμησης 1:3 για ίδια ω).
Μονοχρωμάτορας: Ο αναλυτής διαθέτει ένα τμήμα φωτοανίχνευσης του μονοχρωματικού φωτός, που διέρ-
χεται από το δείγμα και προσπίπτει στον κατάλληλο φωτοανιχνευτή, ο οποίος εξάγει σήματα που αντιστοι-
χούν προς το ανιχνευόμενο φως και αναλύει τα χαρακτηριστικά του εν λόγω δείγματος. Το μονοχρωματικό
φως παράγεται από τις πηγές φωτός (UV, VIS, NIR), που περιγράψαμε προηγουμένως, αφού το εκπεμπόμε-
νο φως διέλθει από το κάθε φορά κατάλληλο για την ανίχνευση φίλτρο, μιας διάταξης μονοχρωμάτορα, το
191
οποίο επιτρέπει την διέλευση μιας πολύ στενής περιοχής μηκών κύματος (π.χ. 340 nm +/- 3 nm) από κάθε
χρησιμοποιούμενο φίλτρο.
Σχήμα 7.11 Φωτοανίχνευση, ηλεκτρικά σήματα και χρονοσειρές δεδομένων οδηγούν στο καθορισμό των δειγμάτων και
στο αναλυτικό αποτέλεσμα (Tokunaga et al., 2007).
Το τμήμα αυτό του αναλυτή (Σχήμα 7.11) δημιουργεί αναλυτικά δεδομένα χρονοσειρών, επί τη
βάσει των ειδικών σημάτων που αποκτώνται από τους κατάλληλους φωτο-ανιχνευτές, οι οποίοι μετατρέπουν
την φωτεινή ροή σε ηλεκτρικά μεγέθη (τάση ή ρεύμα) και μετά από επεξεργασία των ηλεκτρικών πια σημά-
των, δημιουργούνται χρονοσειρές δεδομένων, με αποτέλεσμα να καθίσταται δυνατή η ανάλυση και ο χαρα-
κτηρισμός του υπό ανίχνευση δείγματος.
Οι μονοχρωμάτορες στους σύγχρονους αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές (Σχήμα 7.12) περιλαμβά-
νουν φίλτρα (όχι απορρόφησης αλλά «συμβολής»), πρίσματα (σπανίως πια), φράγματα περίθλασης, ελεγχό-
μενες και σταθερές σχισμές, μηχανικά στροφεία κ.λπ.
192
Σχήμα 7.12 Προοπτική της δομής της φωτεινής πηγής, του τροχού των φίλτρων του μονοχρωμάτορα και του λοιπού οπτι-
κού συστήματος (ανιχνευτές, ηλεκτρονικά κ.λπ.) (Tokunaga et al., 2007).
Σχήμα 7.13 Λεπτομέρεια της δομής της φωτεινής πηγής, του τροχού των φίλτρων, του μονοχρωμάτορα και του λοιπού
οπτικού συστήματος (Tokunaga et al., 2007).
Τα διχροϊκά φίλτρα περίθλασης (Σχήμα 7.13) είναι καθοριστικά για την ποιότητα του αναλυτή.
Κατασκευασμένα από δύο ημιδιαφανείς στρώσεις, διαχωρίζονται από διηλεκτρικό υλικό. Το πάχος του
διηλεκτρικού καθορίζει το μήκος κύματος του φωτός που διέρχεται και μόνο το φως που ανακλάται δύο
φορές, θα είναι συμφασικό και θα βγει από το φίλτρο. Τα κύματα με διαφορά φάσης υπόκεινται σε
καταστροφική περίθλαση. Η διαπερατότητα είναι συνήθως 50 - 90% και το τυπικό φασματικό εύρος ζώνης
είναι από 3 nm, το συνηθέστερο πρότυπο 10 nm και το ευρυζωνική 20 – 50 nm.
Η κυψελίδα τοποθέτησης (17) ή συνηθέστερα, κυψελίδα ροής του προς ανάλυση δείγματος, είναι
ένα μικρό μόνο μέρος ενός ολοκληρωμένου και περίπλοκου υδραυλικού συστήματος ροής, όπως φαίνεται
στο διάγραμμα ροής ενός βιοχημικού αναλυτή (Σχήμα 7.14), που δείχνει τη διαδρομή του ρευστού
193
δείγματος, μέσω της αντλίας (65) προς τις διάφορες φυσικές συνιστώσες του συστήματος. Είναι
κατασκευασμένη από πλαστικό ή χαλαζία (για να είναι διαφανής στην ακτινοβολία UV) και αποτελεί το
σημείο τομής του υδραυλικού και του οπτο-ηλεκτρονικού κυκλώματος ενός σύγχρονου αυτόματου
βιοχημικού αναλυτή.
Τέλος, ένα σύστημα κατάλληλου Ανιχνευτή/Ανιχνευτών, συμπληρώνει/νουν το oπτικό τμήμα ενός
αναλυτή. Ιστορικά έχουν χρησιμοποιηθεί φωτολυχνίες, φωτοκύτταρα, φωτοδίοδοι, φωτοκρυσταλλοτρίοδοι,
φωτοπολλαπλασιαστές κ.λπ. Σήμερα χρησιμοποιούνται κυρίως συστοιχίες φωτοδιόδων σχηματισμένες πάνω
σε ημιαγωγούς και διατάξεις Charge-Coupled Devices (CCDs).
Σχήμα 7.14 Το διάγραμμα ροής ενός βιοχημικού αναλυτή, που δείχνει τη διαδρομή του ρευστού δείγματος, προς διάφορες
φυσικές συνιστώσες του συστήματος (Ricchio & Samuel, 1993).
194
Σχήμα 7.15 Η δομή συστοιχίας διόδων Si ευαίσθητης στον προσδιορισμό της θέσης κάθε συμβάντος ανίχνευσης φωτονίου
(Frach, 2014).
Σχήμα 7.16 Μια διάταξη ανίχνευσης φωτονίων (Shah et al., 2014).
195
Ένας ανιχνευτής φωτονίων (10) περιλαμβάνει μία διάταξη ανιχνευτών (12) που εσωκλείει
ανιχνευτές (14) μεμονωμένων φωτονίων διόδων χιονοστιβάδας (Single Photon Avalanche Diodes ή
SPAD) διαμορφωμένων, ώστε να αποκρίνονται σε «πρόσκρουση» ενός φωτονίου. Το κύκλωμα
ενεργοποίησης (34) είναι διαμορφωμένο έτσι, ώστε να παράγει ένα σήμα που αποκρίνεται στην χιονοστιβάδα
του ανιχνευτή SPAD της συστοιχίας διόδων. Κατάλληλα κυκλώματα (20, 22) είναι διαμορφωμένα, ώστε να
αποθηκεύουν τις συντεταγμένες θέσης του ανιχνευτή SPAD που ενεργοποιείται. Τα κυκλώματα έχουν
ρυθμιστεί για να αποκρίνονται σε σήματα ενεργοποίησης. Ο μετατροπέας χρόνου σε ψηφιακές
καταγραφές (Time to Digital Converter ή TDC) (28) μπορεί να δημιουργήσει μια ψηφιακή σφραγίδα χρόνου
για το σήμα ενεργοποίησης.
Σχήμα 7.17 Η δομή ενός ανιχνευτή «συζευγμένου φορτίου» (CCD).
Ο ανιχνευτής συζευγμένου φορτίου (CCD), είναι ένας καταχωρητής ολίσθησης, μια πολύ μικρή
πλάκα, πάνω στην οποία βρίσκονται διατεταγμένα μερικά εκατομμύρια στοιχεία ενός ημιαγώγιμου υλικού,
συνήθως δίοδοι πυριτίου, ευαίσθητου στο φως, που χρησιμεύει για τη λήψη ειδώλων. Όταν ο ανιχνευτής
εκτίθεται σε μια φωτεινή πηγή, σε καθένα απ' αυτά τα στοιχεία απελευθερώνονται ηλεκτρικά φορτία
(ηλεκτρόνια), σε ευθεία αναλογία με τα φωτόνια που πέφτουν πάνω στο στοιχείο. Μετά την έκθεση στο φως,
ο αριθμός των συγκεντρωμένων ηλεκτρονίων στο κάθε στοιχείο καθορίζει τη φωτεινότητα του αντίστοιχου
σημείου, πάνω στην οθόνη του υπολογιστή με τον οποίο είναι συνδεδεμένος ο ανιχνευτής CCD και η
φωτογραφημένη εικόνα ανασυντίθεται σημείο προς σημείο στην οθόνη. Στην in vitro διαγνωστική δεν
χρησιμοποιείται κατά κανόνα σε αυτόματους αναλυτές, αλλά κυρίως σε διατάξεις ψηφιακών οπτικών αλλά
και ηλεκτρονικών μικροσκοπίων.
7.3 Αναλυτικές λύσεις που συνδυάζουν Χρωματομετρικές, Ανοσοχημικές κ.λπ.

αναλύσεις
Οι οπτικές μέθοδοι: χρωματομετρία, φασματοσκοπία, νεφελομετρία κ.λπ. χρησιμοποιούνται συχνά σε
διάφορους τύπους αυτόματων αναλυτών. Στη συνέχεια θα παρουσιασθούν μερικές σύγχρονες διατάξεις, ό-
πως αυτές περιγράφονται σε πολύ πρόσφατα δημοσιευμένες αιτήσεις χορήγησης αντίστοιχων Δ.Ε.
196
Μια συσκευή ή ένα τμήμα χρωματομετρίας (Σχήμα 7.18) ενός αυτόματου αναλυτή, περιλαμβάνει
μια μονάδα που ακτινοβολεί την υπό εξέταση επιφάνεια με φως και μια μονάδα απεικόνισης που καταγράφει
μια εικόνα της υπό εξέταση ή μέτρηση επιφάνειας. Η μονάδα περιλαμβάνει μια πηγή φωτός, φακό και κα-
τευθυντήρα που μετατρέπει το φως που εκπέμπεται από την πηγή σε παράλληλη δέσμη και μια κινούμενη
διάταξη αλλαγής της κατεύθυνσης της κίνησης της δέσμης φωτός, διατηρώντας τον παραλληλισμό της «κε-
φαλής» της. Η διάταξη εναλλαγής της διεύθυνσης μετακινήσεως, είναι τοποθετημένη παράλληλα προς την
επιφάνεια ανίχνευσης και η κατεύθυνση του οπτικού άξονα του φακού με τον κατευθυντήρα, συμπίπτει με
την κάθετο προς την επιφάνεια αυτή.
Σχήμα 7.18 Μία διαγραμματική απεικόνιση, που δείχνει τη διαμόρφωση μιας συσκευής χρωματομετρίας (Funamoto &
Tatsuaki, 2015).
197
Σχήμα 7.19 Άνω μία σχηματική προοπτική άποψη που δείχνει τη δομή ενός φίλτρου και κάτω μία διαγραμματική εγκάρ-
σια τομή της πλάγιας όψης που δείχνει τη δομή του φίλτρου (Funamoto & Tatsuaki, 2015).
Οι λεπτομέρειες για τις βασικές αρχές φωτομετρίας και χρωματομετρικών αναλύσεων, έχουν ήδη
παρουσιασθεί στο Κεφάλαιο 1.
Στους σύγχρονους αυτόματους αναλυτές χρησιμοποιούμε ιχνηθέτες, αντιδράσεις κινητικές ή/και
τελικού σημείου, ανταγωνιστικές ή/και Sandwich, ανοσοενζυμικές, φθορισμού, χημειο-φωταύγειας
κ.λπ., ώστε να επιτύχουμε την πολισχιδή λειτουργία του αναλυτή, την επιθυμητή οικονομία υλικών και την
επιδιωκόμενη αναλυτική ποιότητα. Θα παρουσιάσουμε ενδεικτικά μερικές σχετικές τεχνικές λεπτομέρειες,
δεδομένου ότι οι βασικές αρχές έχουν ήδη παρουσιασθεί στα Κεφάλαια 2 και 3.
Παραθέτουμε στη συνέχεια μια πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης Δ.Ε. (Σχήμα 7.20), που
περιγράφει μια νέα μέθοδο ανοσοανίχνευσης ηλεκτρο-χημειοφωταύγειας στη περιοχή του εγγύς υπερύ-
θρου (ΝΙR). Η εφεύρεση περιγράφει μια μέθοδο, που περιλαμβάνει:
 Ένα πρώτο στάδιο που συνδέει κβαντικές τελείες στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (ΝΙR-QDs) και δευ-
τερογενή αντισώματα.
 Στο δεύτερο στάδιο διεξάγεται μια ανοσολογική αντίδραση τύπου Sandwich (βλ. Κεφάλαιο 6) και συ-
γκροτείται ένας ανοσοαισθητήρας ηλεκτρο-δημιουργούμενης χημειοφωταύγειας.
 Στο τρίτο στάδιο, χρησιμοποιείται ένας ανοσοαισθητήρας για να εκτελέσει ανοσοανίχνευση.
Η περιγραφόμενη μέθοδος είναι απλή στα βήματα, καλή σε λειτουργικότητα και ικανή στο να απο-
τρέπει αποτελεσματικά, πιθανές παρεμβολές, οφειλόμενες σε ηλεκτροχημικές διαδικασίες και σε παρεμβολές
φωτός προερχομένου από τους ιστούς του βιολογικού υποβάθρου και τέλος διαθέτει υψηλή ευαισθησία, α-
κρίβεια και καλή επαναληπτικότητα. Η χρήση κβαντικών τελειών στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου είναι μια
ενδιαφέρουσα «πρόκληση από το μέλλον» και παραμένει προς διαπίστωση η αναλυτική αποτελεσματικότητα
της μεθόδου στη πράξη στα επόμενα χρόνια, αν και εφ’ όσον η μέθοδος εφαρμοσθεί στη κλινική πράξη.
198
Σχήμα 7.20 Η φασματική κατανομή της εκπομπής των ΝΙR-QDs (Guizheng et al., 2012) στη περιγραφείσα μέθοδο
ανοσοανίχνευσης ηλεκτρο-χημειοφωταύγειας στη περιοχή του εγγύς υπερύθρου (ΝΙR).
Στη συνέχεια, θα αναφερθούμε σε μια πολύ πρόσφατη εκδοχή μιας «παλιάς» μεθόδου, της
νεφελομετρίας και μιας συσκευής για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης αιωρούμενων σωματιδίων, σε μία
συστοιχία δοχείων δειγμάτων, όπως παρουσιάζεται στην πολύ πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης
Δ.Ε. WO 2015026794 Α1 [14] (Σχήμα 7.21). Η νεφελομετρία είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται στην
Ανοσολογία, για τον προσδιορισμό των επιπέδων των διαφόρων πρωτεϊνών του πλάσματος στο αίμα. Αυτό
επιτυγχάνεται με τη μέτρηση της θολερότητας σε ένα υδατικό εναιώρημα πρωτεϊνών, με την διέλευση φωτός
μέσα από το δείγμα που μετράται. Η μέτρηση γίνεται μέσω της μέτρησης του φωτός, που διέρχεται μέσω
ενός δείγματος, σε μια γωνία, συνήθως 30ο και 90ο.
Στην εν λόγω αίτηση χορήγησης Δ.Ε. περιγράφονται συσκευές, μέθοδοι και συστήματα, που είναι
κατάλληλα για τον ταχύ και ταυτόχρονο προσδιορισμό της συγκέντρωσης αιωρούμενων σωματιδίων σε ένα
δείγμα. Αυτές επιτρέπουν την ταχεία και ταυτόχρονη αποτίμηση μεγάλου αριθμού συστοιχιών φρεατίων με
δείγματα, διαμορφωμένες σε ένα ενιαίο δοχείο. Για παράδειγμα, τα δείγματα που περιέχονται σε δισδιάστατη
συστοιχία ή πλάκα μικρο-τίτλου, μπορούν να μετρηθούν, χωρίς την ανάγκη μετακίνησης των κεφαλών
ανάγνωσης ή της μετακίνησης του δοχείου των δειγμάτων. Αυτό το σύστημα νεφελομετρίας επιτρέπει στο
χρήστη την ταχεία και ταυτόχρονη μέτρηση της συγκέντρωσης των σωματιδίων σε πολλά δείγματα, να
ρυθμίσει την συγκέντρωση των σωματιδίων στο δείγμα, με ένα σύστημα χειρισμού του δείγματος, και
κατόπιν να επιτρέπει την εκ νέου μέτρηση της συγκέντρωσης των δειγμάτων, προκειμένου να επιτευχθεί μια
επιθυμητή συγκέντρωση.
199
Σχήμα 7.21 Οι βασικές συνιστώσες του συστήματος νεφελομετρίας (Klaus, 2015) που μετράει την συγκέντρωση
σωματιδίων σε όλα τα φρεάτια με το δείγμα του δοχείου (2) χωρίς μετακινήσεις. Αυτό γίνεται χάρη στην ύπαρξη των
πηγών φωτός (8, 9) του κατόπτρου (12) και της συστοιχίας φωτοηλεκτρικών διατάξεων, συνήθως διόδων.
Η διαχείριση δειγμάτων, αραιώσεων, αναμείξεων, επωάσεων, χρόνου κ.λπ. σε ένα σύγχρονο

αναλυτή με μΡs είναι η αναγκαία και ικανή προϋπόθεση για την επιτυχή εκπλήρωση της αποστολής του. Η
περιγραφή όλων των σχετικών ελέγχων και τακτικών διαχείρισης αυτών των παραμέτρων, δεν αποτελεί
στόχο του παρόντος εργαστηριακού συγγράμματος.
Για το λόγο αυτό παρατίθεται ο έλεγχος ορισμένων παραμέτρων, όπως αντικατοπτρίζονται σε μια
πρόσφατα δημοσιευμένη αίτηση χορήγησης Δ.Ε. US 20140220693A1 (Σχήματα 7.22, 7.23).
Στο Σχήμα 7.22 το έμβολο (66) κινείται προς τα κάτω σε προκαθορισμένη απόσταση, ενώ η άκρη
του καθετήρα δειγματοληψίας (15) βυθίζεται σε ένα δείγμα για να το εισάγει μέσα στον καθετήρα. Ένας
αισθητήρας πίεσης (26) ανιχνεύει τη διακύμανση της πίεσης κατά τη λειτουργία της αναρρόφησης, ένας
μετατροπέας A/D μετατρέπει τα αναλογικά σε ψηφιακά σήματα, για να τα στείλει σε μια μονάδα
επεξεργασίας σήματος (76). Η μονάδα επεξεργασίας σήματος (76) εξάγει τα δεδομένα των μεταβλητών της
κυματομορφής αναρρόφησης, για τον υπολογισμό της στατιστικής απόστασης D από την ομάδα κανονικών
δεδομένων. Από τη σύγκριση κρίνεται ότι υπάρχει μια ανωμαλία στη λειτουργία αναρρόφησης, όταν η
στατιστική απόσταση D είναι μεγαλύτερη ή ίση με την τιμή κατωφλίου. Όταν η στατιστική απόσταση D
είναι μικρότερη από την τιμή κατωφλίου, προχωρεί η λειτουργία εκκένωσης του δείγματος. Στο Σχήμα 7.23
παρουσιάζεται το όλο σχηματικό διάγραμμα του εν λόγω αναλυτή.
200
Σχήμα 7.22 Σύστημα αναρρόφησης ελεγχόμενο από μικροεπεξεργαστή (Yamazaki et al., 2014).
Σχήμα 7.23 Σχηματικό διάγραμμα του αναλυτή του σχήματος 7.22 (Yamazaki et al., 2014).
Σχήμα 7.24 Το λεπτομερές διάγραμμα ροής του λογισμικού, που εφαρμόζει τον αλγόριθμο ελέγχου της δειγματοληψίας
μέσω του μκροεπεξεργαστή (Ahmad et al., 2007).
Με ανάλογους αλγορίθμους (Σχήμα 7.24) σε παρόμοιες διατάξεις αυτόματων αναλυτών, πάσης

φύσεως, καθίσταται εφικτή η διαχείριση της δειγματοληψίας, των δειγμάτων, των επαναλαμβανόμενων
αραιώσεων και αναμείξεων, του απαραίτητου χρόνου επώασης, ανάλογα με την εξέταση κ.λπ. με την χρήση
μικροεπεξεργαστών και κατάλληλων αλγορίθμων και αντίστοιχου λογισμικού.
Τα παραδείγματα που αναφέρθηκαν, περιγράφουν ειδικές περιπτώσεις της ακολουθίας ενεργειών που
γίνονται μέσα σε έναν αυτόματο αναλυτή και που σχηματικά μπορεί να αποδοθούν ως ακολούθως:
201
Διεπαφές: Υγρή (Χημεία) → Οπτική (Μέτρηση) → Ηλεκτρική (Αναλογική Έξοδος) → ADC →
(Analog/Digital, Ψηφιακή) → Data-bus → Δειγματοληψία → Επεξεργασία → Παρουσίαση → Αποτελέσματα
→ Διεπαφές Ανθρώπου  Αναλυτής  PC  LIS  HIS  Διαδίκτυο.
Στην επόμενη ενότητα, θα παρουσιαστεί μια σημαντική κατηγορία συστημάτων, που συμπληρώνουν
προαναλυτικά και μεταναλυτικά (τουλάχιστον) ολοκληρώνουν και αναβαθμίζουν ουσιωδώς την αναλυτική
διαδικασία, τα εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών (Laboratory Ιnformation Systems, LIS).
7.4 Εργαστηριακά Συστήματα Πληροφοριών
Tα εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών αποτελούν μια ειδική κατηγορία λογισμικού, η οποία λαμβάνει,
επεξεργάζεται και αποθηκεύει πληροφορίες που προκύπτουν στα in vitro διαγνωστικά εργαστήρια. Τα
συστήματα αυτά συχνά διασυνδέονται με άλλες διατάξεις, εγκαταστάσεις, συνήθως αυτόματους αναλυτές
και συστήματα πληροφοριών, όπως τα νοσοκομειακά συστήματα πληροφοριών (Ηospital Ιnformation
Systems, HIS).
Το LIS είναι προσαρμοσμένο λογισμικό στην διευκόλυνση μιας ευρείας ποικιλίας εργαστηριακών
μοντέλων ροής εργασίας. Η απόφαση επιλογής για ένα συγκεκριμένο τύπο LIS είναι ένα σημαντικό και
δύσκολο εγχείρημα για όλα τα εργαστήρια. Η επιλογή προμηθευτή, συνήθως απαιτεί μήνες έρευνας και
σχεδιασμού, ενώ η εγκατάσταση διαρκεί από μερικούς μήνες ως λίγα χρόνια, ανάλογα με την
πολυπλοκότητα της οργάνωσης.
Υπάρχουν πολλές παραλλαγές των LIS, καθώς υπάρχουν και πολλά είδη εργαστηριακής δομής και
οργάνωσης, από συστήματα που προσφέρουν πλήρη λύση για να διαχειριστεί ένα μεγάλο Νοσοκομείο τις
εργαστηριακές του ανάγκες, ενώ άλλες ειδικεύονται σε συγκεκριμένες ενότητες εφαρμογών, όπως:
 Κλινική χημεία
 Αιματολογία
 Ανοσολογία
 Αιμοδοσία και ιατρική των μεταγγίσεων
 Χειρουργική παθολογία
 Ανατομική παθολογία
 Κυτταρομετρία ροής
 Μικροβιολογία
Τα LIS είναι εντελώς απαραίτητα στα εργαστήρια κλινικής χημείας, αιματολογίας κ.λπ. και συχνά
είναι μέρος μιας ολοκληρωμένης λύσης πληροφορικής, στην οποία συμμετέχουν πολλές ανόμοιες
εφαρμογές. Η χρήση ενός LIS είναι ένα ουσιώδες κομμάτι για το κλινικό φάσμα των συστημάτων
πληροφορικής και συμβάλλει σημαντικά στη συνολική περίθαλψη, που παρέχεται στους ασθενείς. Το LIS
χρησιμοποιείται σε ενδονοσοκομειακό περιβάλλον ή σε εξωτερικά ιατρεία και σε πολλές περιπτώσεις
σχεδιάζεται, ώστε να υποστηρίζει και τις δύο περιπτώσεις. Στα εξωτερικά ιατρεία, η αλληλεπίδραση με το
LIS συχνά ξεκινά από τον ιατρό, αφού αυτός έχει καταλήξει σε μια αρχική υπόθεση διάγνωσης. Όταν ένας
ασθενής εισαχθεί στο νοσοκομείο, το σύστημα χρησιμοποιείται για την παραγγελία εργαστηριακών
δοκιμασιών, για την παροχή υποστήριξης στην επεξεργασία των δειγμάτων, για να παραλαμβάνονται τα
αποτελέσματα από τους αναλυτές και την παράδοση των εργαστηριακών εκθέσεων προς το θεράποντα ιατρό.
Μια εντολή (αίτημα) εργαστηριακών δοκιμασιών τοποθετείται στο σύστημα, συνήθως από έναν
ιατρό ή άλλο αρμόδιο, και περιέχει έναν κατάλογο δοκιμών που εκτελούνται σε ένα ή περισσότερα δείγματα
του ασθενούς, παραδείγματος χάρη αίμα ή ούρα. Σε πολλές περιπτώσεις, κάθε εντολή εντοπίζεται με ένα
μοναδικό «ταξινομητή», που είναι συνήθως ένας αριθμός και αναφέρεται συχνά ως προσθήκη. Συχνά, τα
διαφορετικά δείγματα θα συλλεχθούν, σε διαφορετικούς σωλήνες, διαφορετικού χρώματος πώμα και κάτω
από κατάλληλες συνθήκες, όπως π.χ. είδος αντιπηκτικού, υλικό σωλήνα κ.λπ. για κάθε συσκευή ανάλυσης
που θα επεξεργαστεί τα δείγματα. Το κατάλληλο δείγμα λαμβάνεται από τον ασθενή και ταυτοποιείται με
έναν μοναδικό αριθμό δείγματος, συνήθως με μια ετικέτα με γραμμικό κώδικα (bar code), που χορηγείται
από το LIS. Πειραματικά ακόμα, η ανάγνωση των στοιχείων του δείγματος, γίνεται μέσω κατάλληλα
συμπληρωμένου κωδικού του RFID (Radio-Frequency Identification), π.χ. σε ορισμένες αιμοδοσίες.
202
Το LIS μπορεί επίσης να προγραμματισθεί να τυπώνει ετικέτες με μοναδικό κωδικό κατά αιμοληψία,
παρέχοντας την δυνατότητα να ακολουθηθεί, και στο επίπεδο διαδοχικών αιμοληψιών, η αλυσίδα της
επιτήρησης από το σημείο λήψης από τον ασθενή, μέχρι το σημείο απόρριψης του δείγματος. Η ιεραρχία
Δείγμα - Αιμοληψία – Ασθενής είναι δενδροειδής ή συνδέεται η ταυτότητα του ασθενούς με την ταυτότητα
του δείγματος, μέσα από το δημογραφικό ιατρικό αρχείο (φάκελο) του ασθενούς, εφ’ όσον αυτό είναι
δυνατόν. Αφού συλλεχθεί το δείγμα, αποστέλλεται ή μεταφέρεται στο κατάλληλο εργαστήριο για την
επεξεργασία του σε μια παρτίδα αναλύσεων (batch). Με την παραλαβή του στο κατάλληλο εργαστήριο, το
δείγμα πρέπει πάλι να καταγραφεί, εντοπισθεί και ταυτοποιηθεί στο LIS, είτε παλαιότερα με το χέρι, είτε
αυτοματοποιημένα, ώστε να αρχίσει η επεξεργασία του, συνήθως από αυτοματοποιημένους αναλυτές.
Το LIS παρακολουθεί μια πύλη επικοινωνίας, για τις τυχόν ερωτήσεις και μεταφορτώνει τα
αιτήματα, όταν αυτά τίθενται. Σε περιπτώσεις όπου το LIS διαβιβάζει στοιχεία, όπως οι εξατομικευμένες
εκθέσεις και την ευελιξία των εργαστηρίων, σε ό,τι αφορά στους τρόπους παράδοσης των αποτελεσμάτων,
είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τον καθορισμό της επιτυχία τους στην αγορά. Τα χαρακτηριστικά που
υποστηρίζουν τα LIS συνήθως είναι:
 Έλεγχος και καταγραφή ασθενών

 Είσοδος εντολών
 Επεξεργασία δειγμάτων
 Λειτουργία Stat (ανάλογα με τον αναλυτή) για προτεραιότητα κάποιων δειγμάτων
 Είσοδος αποτελεσμάτων
 Δημιουργία εργαστηριακών εκθέσεων (αναφορών)
 Δημογραφικά στοιχεία ασθενών/ιατρών
 Βασισμένη στον ιστό είσοδος εντολών και αναζήτηση
 Αποστολή ηλεκτρονικά εκθέσεων: διεπαφές HL7- ιατρικά Αρχεία (EMRs)
Πέρα από τα τυπικά LIS, υπάρχουν και τα συστήματα διαχείρισης εργαστηριακών πληροφο-
ριών (Laboratory Ιnformation Μanagement Systems, LIMS), τα οποία χρησιμοποιoύνται σε πολύ μεγάλα
διαγνωστικά και ερευνητικά εργαστήρια, στον εργαστηριακό έλεγχο φαρμακευτικών εταιρειών, στη παρα-
γωγή και στον έλεγχο της ποιότητας της παραγωγής αντιδραστηρίων κ.λπ.
Αναλυτικά καλύπτουν την διαχείριση:

 των δειγμάτων
 των εργαστηριακών χρηστών,
 των αναλυτών,
 των προτύπων.
 Άλλων εργαστηριακών λειτουργιών, όπως:
 Η τιμολόγηση,
 η διαχείριση υλικών,
 η αυτοματοποίηση της ροής εργασίας.
Τα LIMS έχουν εισάγει σημαντικές αλλαγές στον βιοεργαστηριακό τομέα.
Υψηλοί ρυθμοί παραγωγής εργαστηριακών αποτελεσμάτων είναι πολύ συχνά αναγκαίοι:

 Στον τομέα της μελέτης καταλληλότητας φαρμάκων,
 στη διαδικασία ελέγχου γονιδίων,
 στο χειρισμό δειγμάτων DNA και εντοπισμού γονοτύπου,
 στην διαλογή πρωτεϊνών κ.λπ.
203
Σχήμα 7.25 Διάγραμμα ροής του λογισμικού, που δείχνει μια υποδειγματική αρχιτεκτονική για το συντονισμό της εισόδου
εργαστηριακών δοκιμών, και δρομολόγησης των αποτελεσμάτων των εργαστηριακών δοκιμών.
Σχήμα 7.26 Σχηματικό διάγραμμα διασύνδεσης του συστήματος με άλλες μονάδες (δεξιά) σύμφωνα με την περιγραφή στην
αίτηση χορήγησης Δ.Ε. US 20070294103 A1 (Αhmad et al., 2007).
204
Σχήμα 7.27 Μια τυπική και λεπτομερή αρχιτεκτονική ενός σύγχρονου εργαστηριακού συστήματος πληροφοριών (LIS).
7.5 Αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες

Η πρόοδος στη βιοϊατρική τεχνολογία και στη μοριακή βιολογία, έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια, στην
ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης και ενίσχυσης των ακολουθιών βάσεων του DNA, ιχνηθέτησης και ανίχνευσης
ακολουθιών αμινοξέων των πρωτεϊνών, αλλά και στην εξερεύνηση των νανοδομών. Ξεκινώντας από τις
διαθέσιμες σήμερα τεχνικές και μεθοδολογίες ανίχνευσης, θα γίνει μια προσπάθεια να ανιχνεύσουμε τι μας
επιφυλάσσει η καινούργια δεκαετία, σε ό,τι αφορά στις αναδυόμενες εργαστηριακές τεχνολογίες. Οι
προσδοκίες για νέες, καινοτόμες και αποτελεσματικές μεθόδους ανίχνευσης, έχουν ήδη εστιασθεί διεθνώς, σε
τρεις κυρίως πολλά υποσχόμενους τομείς της Έρευνας και Ανάπτυξης (R&D), οι οποίοι περιλαμβάνουν:
 Μικροδιατάξεις (microarrays, biochips) για την παράλληλη ανίχνευση πολλών παραγόντων με διάφορες
ανιχνευτικές διαδικασίες.
 Μικροσκοπικούς βιοαισθητήρες ικανούς να ανιχνεύουν παθογόνους παράγοντες.
 Μικρο- και νανοτεχνολογίες που αξιοποιούν φυσικά φαινόμενα σε ατομικό επίπεδο, και μπορούν να
χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση βιομορίων, ιών και κυττάρων.
Στη συνέχεια, στις ενότητες αυτές, θα μελετηθούν οι σημαντικότερες δημοσιευμένες εργασίες και θα
γίνει προσπάθεια, αφού συνδυαστούν με τα αντίστοιχα έγγραφα βιομηχανικής ιδιοκτησίας, να εξαχθούν
αξιοποιήσιμα συμπεράσματα, για το μέλλον του in vitro διαγνωστικού εργαστηριακού ελέγχου.
Οι μικροδιατάξεις για την παράλληλη ανίχνευση διαφορετικών βιομορίων προσφέρουν θεωρητικά
το πλεονέκτημα παράλληλης ανίχνευσης των ακολουθιών πυρηνικών οξέων ή πρωτεϊνών και συνεπώς
αντιγόνων ή αντισωμάτων με διαφορετική εξειδίκευση. Έχουν σχεδιασθεί και κατασκευασθεί πολυάριθμα
σχήματα microarray/chips, ανάλογα με τη φύση, το σχήμα και το μέγεθος της επιλεγμένης επιφάνειας, τις
στρατηγικές ακινητοποίησης των ανιχνευτικών βιομορίων και τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους ανίχνευσης,
τα οποία βρήκαν εφαρμογή κυρίως στην έρευνα για την ανάλυση του ανθρωπίνου γονιδιώματος και άλλων
γονιδιωμάτων. Βρίσκουν ήδη εφαρμογές στην ανοσοαιματολογία, κυρίως με τον συνδυασμό υβριδισμού με
ανιχνευτικά βιομόρια (probes), στη συνέχεια με παράλληλη πολλαπλή ενίσχυση του υπό ανίχνευση
γονιδιωματικού DNA και τέλος με την αποτίμηση των αποτελεσμάτων, μέσω οπτικών μεθόδων φθορισμού ή
205
χημειοφωταύγειας. Το μεταβλητό επίπεδο μολυσματικότητας των γονιδιωμάτων των παθογόνων, περιπλέκει
την παράλληλη ανίχνευση σε microarray. Η πολυπλεξία παράλληλων αλυσιδωτών αντιδράσεων
πολυμεράσης (PCR), προερχομένων από ιικά ή βακτηριακά νουκλεοτίδια, για την ταυτόχρονη ανίχνευση
διαφορετικών παθογόνων, περιορίζεται προς το παρόν, σε 2 - 4 το πολύ παράγοντες (π.χ. HIV 1/2, HCV και
HBV).
Οι τεχνικές σμίκρυνσης στη γονιδιωματική, σε συνδυασμό με την υψηλού ρυθμού απόδοσης
αναγνώριση της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων, που αρχικά αναπτύχθηκαν για την έρευνα, έκαναν δυνατή
τη στόχευση μέχρι 1000 γονιδιωμάτων παθογόνων παραγόντων, επάνω σε μια μόνο μικροδιάταξη, η οποία
φέρει μέχρι 10000 ανιχνευτικά ολιγονουκλεοτίδια. Μετά από την εξαγωγή των πυρηνικών οξέων από το
δείγμα και τη τυχαία ενίσχυσή τους με PCR, ανιχνευτικές ακολουθίες επισημασμένες με ένα φθοριόχρωμα,
υβριδοποιούνται επάνω στο microchip και ανιχνεύονται οπτικά οι κατανομές των φθοριζουσών «ψηφίδων».
Όμως, η μέθοδος αυτή παραμένει εξαιρετικά περίπλοκη για την καθημερινή κλινική ρουτίνα και λόγω της
απαίτησης προχωρημένων μεθόδων βιοπληροφορικής, για την αποτίμηση των μικροδιατάξεων.
Σε επίπεδο πρωτεϊνών, όλες οι μικροδιατάξεις που προτείνονται μέχρι σήμερα, για χρήση στην in
vitro διαγνωστική, αποτελούν κυρίως επίπεδα υποστηρίγματα, πάνω στα οποία έχουν συνδεθεί αντιγόνα ή
αντισώματα. Αυτά τα συστήματα αντιστοιχούν σε μικρογραφημένες ανοσοχημικές δοκιμασίες και
προσφέρουν το πλεονέκτημα του παραλληλισμού, του μειωμένου κόστους ανά δοκιμασία ανίχνευσης των
επιμέρους πρωτεϊνών, υψηλή αναλογία σήματος προς θόρυβο, και το χαμηλό κόστος εξοπλισμού ανίχνευσης.
Όμως, η χρήση χημειοφωταύγειας έχει μειονεκτήματα σε επίπεδο δυναμικής περιοχής ανίχνευσης και
πολυπλεξίας, ενώ η αποτίμηση μπορεί να εκτελεσθεί μόνο μια φορά, όπως και με τη σήμανση με ραδιενεργά
ισότοπα. Τέλος, οι μικροδιατάξεις για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών σε συνδυασμό με την μέθοδο
φασματομετρίας μάζας SELDI-TOF-MS (Surface-Enhanced LASER Desorption Ionization Time-of-Flight
Mass Spectrometry) αποτελούν το βασικό εργαλείο έρευνας στη σύγχρονη πρωτεωμική, αλλά η χρήση τους
στη κλινική πρακτική είναι προς το παρόν πολύ δύσκολη. Οι συνηθέστερα σήμερα χρησιμοποιούμενες
μέθοδοι ρουτίνας για την ανίχνευση παθογόνων, στηρίζονται στη καλλιέργεια και την μέτρηση αποικιών
βακτηρίων, σε ανοσοχημικές μεθόδους και σε παραλλαγές της PCR. Στη περίπτωση των ελέγχων για την
ανίχνευση παθογόνων παραγόντων, οι συγκεντρώσεις του ανθρώπινου γονιδιωματικού DNA, μπορεί να είναι
πολλές τάξεις μεγέθους υψηλότερη από τα πυρηνικά οξέα των παθογόνων στόχων. Ενώ οι διάφορες
μικροδιατάξεις, είναι χρήσιμα εργαλεία για την υψηλού ρυθμού ροής φόρτου ανάλυση βιομορίων, η χρήση
τους σε επίπεδο κλινικής διαγνωστικής, περιορίζονται, προς το παρόν τουλάχιστον, από το απαγορευτικά
υψηλό κόστος και το απαιτούμενο χρονικό διάστημα για την ενίσχυση και σήμανση των δειγμάτων.
Οι δυσκολίες μεταφοράς της θετικής εμπειρίας της εφαρμογής μικροδιατάξεων από την έρευνα στη
καθημερινή κλινική και εργαστηριακή πρακτική, για την παράλληλη ανίχνευση διαφορετικών βιομορίων, δεν
σημαίνει ότι οι τεχνολογίες αυτές δεν έχουν μέλλον. Ένας τρόπος υπέρβασης αυτών των περιορισμών είναι η
ανάπτυξη νέων, βελτιωμένων μεθόδων για την προετοιμασία, τη σήμανση των δειγμάτων και την ανίχνευση
της πληροφορίας από αυτά.
Οι νέες αναδυόμενες σμικρυσμένες τεχνικές, οι οποίες βασίζονται στο συνδυασμό βιοαισθητήρων
και μικρο- και νανοτεχνολογιών, ενδέχεται να προσφέρονται μεσοπρόθεσμα για εφαρμογή, στην πιο
αποτελεσματική και λιγότερο δυσβάσταχτη οικονομικά, ανίχνευση μολυσματικών παραγόντων. Οι
νανοτεχνολογίες περιλαμβάνουν τεχνικές, που αφορούν στη παραγωγή, στη παρατήρηση και στη μέτρηση
αντικείμενων, δομών και συστημάτων διαστάσεων 1 - 100 nm. Οι νανοτεχνολογίες φθάνουν στη κλίμακα
του μεμονωμένου κυττάρου, ιού ή μεγαλο-βιομορίου (το DNA έχει περίπου 2,5 nm πλάτος, ενώ τα
πρωτεϊνικά μόρια μεταξύ 1 και 20 nm), με αποτέλεσμα να υπερβαίνουν ορισμένα τρέχοντα τεχνολογικά
εμπόδια και να επιτρέπουν πολλές παράλληλες και άμεσες συγκρίσεις και μετρήσεις, των υπό εξέταση
βιολογικών στόχων, καθώς και την ενσωμάτωση διαφόρων αναλυτικών βημάτων, από την προετοιμασία των
δειγμάτων μέχρι την ανίχνευση, μέσα σε ένα μεμονωμένο μικρογραφημένο σύστημα.
206
Σχήμα 7.28 Τυπική αναπαράσταση μιας μικροσυστοιχίας σε δύο μεγεθύνσεις (MacBeath, 2000).
Σχήμα 7.29 Κάτοψη και τομή ενός biochip σύμφωνα με την περιγραφή στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε. WO2015016315
(A1): H πλάκα (100) είναι εφοδιασμένη με συστοιχίες (120) που έχουν πλήθος εσοχών οι οποίες διαμορφώνονται με
διαχωριστικά (22) τοιχώματα (Isami et al., 2015).
Ο συνδυασμός νανο-αντικειμένων και νανο-συστημάτων, προσφέρει νέες προοπτικές αποφυγής των

διαδικασιών πολλαπλασιασμού και σήμανσης των στόχων στην in vitro διαγνωστική και δημιουργεί βάσιμες
ελπίδες στην επιστημονική κοινότητα, για την επίτευξη μιας τέτοιας δυνατότητας πολυπλεξίας στις
ανιχνευτικές μεθόδους, που θα επιτρέπει την ανίχνευση ενός πλήθους βιομορίων, ιών ή βακτηρίων
ταυτόχρονα, δημιουργώντας νέες δυνατότητες για τις εφαρμογές τους στην ανίχνευση μολυσματικών
παραγόντων.
Τα φυσικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων, συχνά εμφανίζουν νέες ιδιότητες καθώς το
μέγεθος των επιμέρους συνιστωσών τους μειώνεται, πλησιάζοντας τη τάξη μεγέθους των 10 -9 m,
καθιστώντας τα κατάλληλα για την εφαρμογή τους στην in vitro διαγνωστική. Αυτό πιθανόν οφείλεται στην
αύξηση του αριθμού των επιφανειακών δραστικών ατόμων, σχετικά με το συνολικό αριθμό τους μέσα στο
σωμάτιο. Έτσι, η αυξανόμενη διαθέσιμη περιοχή επιφάνειας για την ένωση μορίων-ανιχνευτών, επιτρέπει
την αποδοτικότερη σύνδεση των υπό ανίχνευση στόχων και καθιστά πολλά νανοϋλικά, όπως π.χ.
φθορίζοντες νανο-κρύσταλλοι ημιαγώγιμων υλικών (κβαντικές κηλίδες), νανοσωμάτια χρυσού, μαγνητικά
μόρια κ.λπ. επιλέξιμα για την χρήση τους σε βιοαισθητήρες.
Ένας βιοαισθητήρας μπορεί να οριστεί ως μια συμπαγής αναλυτική συσκευή, που ενσωματώνει ένα
βιολογικό ή βιομιμητικό στοιχείο, και είναι συνδεμένος ή ενσωματωμένος μέσα σε έναν κατάλληλο
μετατροπέα. Χρησιμοποιείται για να ανιχνεύσει, να μεταβιβάσει, και να καταγράψει ημιποσοτικές ή
207
ποσοτικές πληροφορίες για ένα φαινόμενο που σχετίζεται με μια αντίστοιχη βιοχημική ή (παθο-)
φυσιολογική αλλοίωση. Η επιλογή του στοιχείου της «βιοαναγνώρισης» εξαρτάται από έναν μεγάλο αριθμό
παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων της ειδικότητας, της ευαισθησίας, των όρων αποθήκευσης, και της
λειτουργικής και περιβαλλοντικής σταθερότητας. Η επιλογή εξαρτάται επίσης, από το στόχο ενδιαφέροντος
(αντιγόνο, πυρηνικό οξύ, μολυσματικός παράγοντας, πρωτεΐνη, άλλη χημική ένωση, κ.λπ.) και έχουν
χρησιμοποιηθεί ως τέτοιοι βιοϋποδοχείς, διάφορα βιομόρια, ιοί, κύτταρα κ.λπ. Ανάλογα με τη μέθοδο
μεταγωγής, οι βιοαισθητήρες ταξινομούνται σε:
 Οπτικούς,
 ηλεκτροχημικούς,
 μαγνητικούς,
 μικρο- και νάνο- ηλεκτρομηχανικούς κ.λπ.
Στη συνέχεια, θα παρουσιασθούν επιλεκτικά, με καινοτομικά και πολλά υποσχόμενα έγγραφα
βιομηχανικής ιδιοκτησίας, οι εξελίξεις στο σημαντικό αυτό τομέα, εστιασμένες κυρίως στην καταλληλότητά
τους για την ανίχνευση παθογόνων παραγόντων.
Οι οπτικοί βιοαισθητήρες βασίζονται στο φθορισμό ή στον επιφανειακό συντονισμό πλασμονίων
(Surface Plasmon Resonance ή SPR) και χρησιμοποιούνται ευρύτατα στις βιοχημικές αναλύσεις, λόγω της
ευαισθησίας τους και της ειδικότητάς τους. Ο φθορισμός προσφέρεται να συνδεθεί με άλλες τεχνολογίες
αναφοράς, όπως η PCR ή η ELISA. Παρά τη μεγάλη πρόοδο που έχει σημειωθεί στη σμίκρυνση και την
αυτοματοποίηση των μεθόδων, απαιτείται ακόμα περαιτέρω σοβαρή βελτίωση, που θα επιτρέψει την
πολλαπλή ανίχνευση των μολυσματικών παραγόντων στο αίμα ή τον ορό και την αντικατάσταση της
δαπανηρής και περίπλοκης ιχνηθέτησης με τις συμβατικές φθορίζουσες ουσίες.
Η SPR είναι ιδιαίτερα ελκυστική ως εναλλακτική μέθοδος ανίχνευσης μορίων χωρίς ιχνηθέτη.
Απαιτείται μια επιφάνεια υάλου, που καλύπτεται με μια λεπτή επίστρωση χρυσού με ακινητοποιημένα
αντισώματα, η οποία φωτίζεται από την πίσω πλευρά της με το πολωμένο φως ενός LASER και μετράται το
ανακλώμενο φως. Η ενέργεια των φωτονίων μεταφέρεται στα ηλεκτρόνια στην επιφάνεια του χρυσού και ως
εκ τούτου, η σύνδεση μορίων-στόχων, στα αντισώματα της επιφάνειας αυτής του βιοαισθητήρα, αλλάζει τη
συχνότητα συντονισμού του συμπλόκου, άρα και τη τιμή της γωνίας που πραγματοποιείται ο συντονισμός, η
οποία αποτελεί τη παράμετρο αναγνώρισης των μορίων-στόχων. Τα κύρια μειονεκτήματα της μεθόδου SPR
είναι η πολυπλοκότητά της, οι υψηλές δαπάνες εξοπλισμού, και η ευαισθησία σε μη εξειδικευμένη σύνδεση
βιομορίων, στην επιφάνεια μέτρησης του βιοαισθητήρα.
Εκτός από την SPR, υπάρχει μια σειρά αναδυόμενων μικρογραφημένων τεχνικών, όπως το
ολοκληρωμένο συμβολόμετρο Mach-Zehnder (ΜΖΙ), το συμβολόμετρο Young, το συντονιζόμενο κάτοπτρο,
το Δακτυλιοειδές οπτικό αντηχείο, οι φωτονικοί κρύσταλλοι κ.λπ. Αυτές οι τεχνικές επαναφέρουν «παλιές»
δοκιμασμένες μεθόδους οπτικής ανίχνευσης, βασισμένες σε «κλασικά» φαινόμενα, όπως η συμβολή και η
περίθλαση, η μετατόπιση του μήκους κύματος κ.λπ. προσαρμοσμένες όμως, στις νέες τεχνολογικές που μας
δίδουν οι μικροσκοπικές πηγές LASER διόδων, η σμίκρυνση και μικρογράφηση «παραδοσιακών» τεχνικών.
Οπτικοί βιοαισθητήρες Όριο Aνίχνευσης (pg/mm2)
Συντονισμού Πλασμονίων Επιφανείας 0,50 – 1,00

Ολοκληρωμένο Συμβολόμετρο Mach-Zehnder (ΜΖΙ) 0,06
Συμβολόμετρο Young 0,70
Συντονιζόμενο Κάτοπτρο 0,10
Δακτυλιοειδές Αντηχείο 0,50 – 1,00
Φωτονικοί κρύσταλλοι 0,10
Πίνακας 7.1 Οπτικοί βιοαισθητήρες και τα αντίστοιχα όρια ανίχνευσης που επιτυγχάνουν.
Για παράδειγμα (Shimoyama et al., 2012), οι αισθητήρες Συντονισμού Πλασμονίων Επιφανείας

(SPR) διαθέτουν μια μεταλλική δομή φράγματος, που συντονίζεται από το προσπίπτον φως (από LASER
Διόδων), μέσα από ένα άνοιγμα, το οποίο μεταδίδεται μέσω ενός υποστρώματος, ώστε να επηρεάσει τον
208
βαθμό συντονισμού του προσπίπτοντος φωτός. Το φως πέφτει πάνω στην όψη ενός φωτοηλεκτρικού
μετατροπέα. Ένα ηλεκτρόδιο εξόδου του σήματος του φωτοηλεκτρικού μετατροπέα, επιτρέπει την μέτρηση
της διακύμανσης της τάσης εξόδου και τον εντοπισμό του σημείου συντονισμού, που εξαρτάται από τη
γεωμετρία του ανιχνευόμενου μορίου.
Σχήμα 7.30 Σχηματική απόδοση της αρχής ανίχνευσης SPR σύμφωνα με την περιγραφή στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε.
JP2012233779 A (Shimoyama et al., 2012).
Ένα τελείως διαφορετικό δρόμο ακολουθούν τεχνικές που προτιμούν, όχι την απάλειψη της
σήμανσης π.χ. του φθορισμού, αλλά την αντικατάσταση του οπτικού ιχνηθέτη, συνήθως oργανικά
φθοριοχρώματα, που απαιτούν ακριβείς και χρονοβόρες διαδικασίες σήμανσης. Ακόμα διαθέτουν ευρύτατα
φάσματα εκπομπής, που περιορίζουν τις δυνατότητες συνδυασμού τους, ιδιαίτερα σε μικροδιατάξεις. Τέλος,
είναι ευαίσθητα στην φωτοεξασθένηση της εκπομπής τους.
Η αντικατάσταση γίνεται από νέα ανόργανα νανοϋλικά, όπως οι πολλά υποσχόμενοι φθορίζοντες
νανοκρύσταλλοι ημιαγώγιμων υλικών (κβαντικές κηλίδες). Μια κβαντική κηλίδα είναι ένας ημιαγωγός, του
οποίου τα εξιτόνια (excitons), δηλαδή οι δεσμευμένες καταστάσεις ενός ηλεκτρονίου του και μιας θετικά
φορτισμένης «οπής» του, που έλκονται μεταξύ τους με ηλεκτροστατικές δυνάμεις Coulomb, περιορίζονται
και στις τρεις διαστάσεις, του εν λόγω νανοκρυστάλλου. Τα εξιτόνια είναι ηλεκτρικά ουδέτερα, οιονεί
σωματίδια (ημισωμάτια), τα οποία υπάρχουν σε μονωτές, ημιαγωγούς και σε ορισμένα υγρά και θεωρούνται
ως στοιχειώδεις μορφές διέγερσης της συμπυκνωμένης ύλης, που μπορούν να μεταφέρουν ενέργεια, χωρίς τη
μεταφορά ηλεκτρικού φορτίου. Οι ιδιότητες της κβαντικής κηλίδας είναι ανάμεσα σε αυτές του ευμεγέθους
ημιαγωγού και των διακριτών μορίων.
Οι κβαντικές κηλίδες έχουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με τα χρησιμοποιούμενα σήμερα
οργανικά φθοριοχρώματα για την επισήμανση νουκλεοτιδίων ή πρωτεϊνών, γιατί αποτελούνται από έναν
πυρήνα ημιαγωγού (π.χ. CdSe) με κατάλληλη επένδυση (π.χ. ZnS), η οποία τον συνδέει με ένα περίβλημα
πρωτεϊνών (π.χ. Maltose Binding Protein ή ΜBP, συνδυασμένη με Cyanine Dye ή CD) για την άμεση
σύνδεση πάνω του, των υπό ανίχνευση βιομορίων. Η MBP συνδυασμένη με την CD αυτό-συναρμολογείται
προκαλώντας έτσι, συντονισμό Foerster και μεταφορά ενέργειας, από τη χρωστική-δέκτη στο δότη QD. Με
την σύνδεσή της με την μαλτόζη που περιέχεται στο αντιδραστήριο, η MBP υφίσταται προσαρμοστική
αλλαγή της απόχρωσής της ανάμεσα στο λευκό και το κίτρινο, εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση του
βιομορίου (π.χ. μια άλλη πρωτεΐνη) που ανιχνεύεται, προκαλώντας με τον τρόπο αυτό, αλλαγή της έντασης
της φωτοφωταύγειας.
Οι κβαντικές κηλίδες εξασφαλίζουν ένα πολύ στενό και ιδιαίτερα υψηλής φωτοβολίας φάσμα
εκπομπής, με μήκος κύματος ελεγχόμενο από το μέγεθος του ημιαγωγού νανοκρυστάλλου. Παράλληλα, τα
φάσματα απορρόφησης και εκπομπής είναι πολύ καλά διαχωρισμένα, ενώ ταυτόχρονα αυξάνουν την
ευαισθησία και εξαλείφουν τα φαινόμενα του αυτο-φθορισμού. Αυτές οι αξιοπρόσεκτες ιδιότητες που
οφείλονται στο νανο-μέγεθος των QDs, μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην ανίχνευση ιών σε οιονεί
πραγματικό χρόνο, ενώ η μέθοδος προσφέρεται και για ανίχνευση σε πλήρες αίμα. Ο συνδυασμός τριών
χρωμάτων και 10 διαφορετικών επιπέδων έντασης, επιτρέπει θεωρητικά την παραγωγή 103 διεγέρσιμων και
ανιχνεύσιμων συμπλοκών, από μια μοναδική πηγή φωτός, δημιουργώντας εν δυνάμει μια μορφή ενός
209
φασματικού βιο-γραμμωτού κώδικα (Spectral bio-barcoding), κατάλληλου για πολλαπλή και ταυτόχρονη
ανίχνευση βιομορίων και κατά συνέπεια ιικών σωματίων κ.λπ. Εντούτοις, στην πράξη παραμένει δύσκολη η
σύνθεση των QDs και η ενσωμάτωσή τους σε μικρογραφημένα συστήματα.
Σχήμα 7.31 Η εμφάνιση του κβαντικού εντοπισμού και η διαμόρφωση του ενεργειακού χάσματος, σύμφωνα με το μέγεθος
του νανοκρυστάλλου της κβαντικής τελείας (Durniak et al., 2015).
Η πρόοδος της έρευνας και η αναγκαιότητα λιγότερο τοξικών υλικών οδήγησαν στην ανάγκη
ανάπτυξης νέων τύπων QDs και υλικών με παρόμοιες ιδιότητες. Έτσι, σήμερα έχουμε:
 «παραδοσιακές» κβαντικές τελείες ημιαγωγών,
 LASERs Διόδων και κβαντικών τελειών,
 QDs πυριτίου, άνθρακα και κυρίως γραφενίων,
 μεταλλικά νανοσυμπλέγματα (Nanoclusters ή NC), ως πηγή φωτοφωταύγειας.
Ακόμα και η συνοπτική περιγραφή (Σπυρόπουλος, 2014) όλων των ανωτέρω παραλλαγών είναι
πέραν των στόχων ενός εργαστηριακού συγγράμματος. Όμως, η δυναμική της έρευνας τα τελευταία 10
χρόνια, δείχνει ότι υπάρχουν δικαιολογημένες προσδοκίες, τα επόμενα χρόνια να έχουμε μια μεγάλης
κλίμακας αξιοποίησης των QDs στην ΙVD, ιδιαίτερα στην κυτταρομετρία ροής, σε βιοϊατρικές
πολυχρωματικές εφαρμογές και σε εφαρμογές πολυπλεξίας μικροσυστοιχιών.
Σχήμα 7.32 Σχηματικά οι μέθοδοι για την παρασκευή διαφόρων τύπων (Zhu, 2013) βιοσυζυγών-QDs.
210
Σχήμα 7.33 Ο αριθμός των Δ.Ε. (Σπυρόπουλος, 2014) που σχετίζονται με QDs & NCs.
Οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες βασίζονται στις μετρήσεις αλλαγών ηλεκτρικών μεγεθών, που

συνεπάγονται οι αλληλεπιδράσεις του δείγματος με την επιφάνεια του βιοαισθητήρα. Ανάλογα με τα
επηρεαζόμενα ηλεκτρικά μεγέθη, ταξινομούνται σε αισθητήρες ρεύματος, τάσης, σύνθετης αντίστασης (ή
εμπέδησης), χωρητικότητας, αγωγιμότητας κ.λπ. Οι βιοαισθητήρες ρεύματος είναι σήμερα οι πλέον
διαδεδομένοι στο χώροι της ιατρικής, όπως π.χ. τα ηλεκτρόδια Clark για την ανίχνευση του οξυγόνου στην
εντατική ιατρική, τα οξειδοαναγωγικά ηλεκτρόδια για την γλυκόζη στην εργαστηριακή ιατρική κ.λπ. Καθώς
όμως οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες σμικρύνονται φθάνοντας στη περιοχή του μικρομέτρου (10 -6 m) και
του νανομέτρου (10-9 m), οι βιοαισθητήρες σύνθετες αντίστασης, προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα για
διαγνωστική χρήση, καθώς επιτρέπουν την ανίχνευση και μέτρηση των αλληλεπιδράσεων αντιγόνων -
αντισωμάτων σε οιονεί πραγματικό χρόνο και χωρίς την ανάγκη επισήμανσης ενός εξ’ αυτών, δεδομένου ότι
το σύμπλοκο μπορεί να αναγνωρισθεί από την αλλαγή που επιφέρεται από αυτό, στη σύνθετη αντίσταση
στην επιφάνεια του βιοαισθητήρα και το μετρούμενο σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης του υπό
ανίχνευση μορίου.
Επίσης, οι ηλεκτροχημικοί βιοαισθητήρες δεν επηρεάζονται από τη θολερότητα του δείγματος, από
το φυσικό φθορισμό ορισμένων βιομορίων ή από την εξασθένηση του φωτός από ορισμένες ουσίες, όπως οι
οπτικοί βιοαισθητήρες. Η απαιτούμενη οργανολογία μέτρησης είναι απλή, οικονομική, και σμικρύνεται
εύκολα, ενώ η μέθοδος προσφέρεται και για ηλεκτροχημική φασματοσκοπία σύνθετης αντίστασης,
δηλαδή τη ταξινόμηση των βιομορίων, ανάλογα με την διαφορά της μετρούμενης σύνθετης αντίστασής τους
ή αγωγιμότητας τους μέσα στο δείγμα. Τέλος, λόγω των αγώγιμων ιδιοτήτων των πυρηνικών οξέων, οι
ηλεκτροχημικοί αισθητήρες προσφέρονται επίσης, και για την ανίχνευση επιλεγμένων ακολουθιών
νουκλεοτιδίων γονιδιωματικού υλικού, με τη χρήση ως μοριακών ανιχνευτών, απταμερών ακινητοποιημένων
σε νανοσωματίδια χρυσού, στην επιφάνεια του αισθητήρα. Η ιδιότητα αυτή μπορεί να αποδειχθεί ιδιαίτερα
σημαντική για την δημιουργία στο μέλλον, μεθόδων συνδυασμένης ανίχνευσης, τόσο γονιδιωματικού
υλικού, όσο και αντισωμάτων, ανάλογα με το στάδιο της λοίμωξης, για τον εντοπισμό αιματογενώς
μεταδιδομένων παραγόντων, με ενιαίο και χαμηλού κόστους εξοπλισμό μέτρησης.
Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν χρησιμοποιηθεί στη βιοϊατρική τεχνολογία για μια μεγάλη χρονική
περίοδο και την τελευταία δεκαετία χρησιμοποιούνται ως υπόστρωμα στη καθήλωση κατάλληλων βιομορίων
για ανίχνευση νουκλεοτιδίων ή πρωτεϊνών. Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν χρησιμοποιηθεί ως δείκτες σε
πολυάριθμες ηλεκτροχημικές, αγωγιμομετρικές, αλλά και σε οπτικές τεχνικές και σε αντίστοιχους
βιοαισθητήρες, στους τελευταίους σε συνδυασμό τους με ιόντα αργύρου σε διαλύματα υδροκινόνης, μιας
τεχνικής που έχει τις ρίζες της στην τεχνολογία της φωτογραφίας και επανέρχεται σε αναδυόμενες
211
νανοτεχνικές φθορισμού, που επιτρέπουν την πραγματοποίηση τεχνικών «sandwich» ELISA σε
νανοκλίμακα.
Τέλος, εκτός από «ηλεκτροχημικές» προσεγγίσεις στη νανοκλίμακα, πρέπει να σημειωθεί ότι
εμφανίζονται και ενδιαφέρουσες «μαγνητοχημικές» εφαρμογές, με τη χρήση μαγνητικών νανοσωματιδίων.
Αυτές αξιοποιούνται τόσο για την σήμανση όσο και για τον «καθαρισμό» μέσω αυτής της σήμανσης,
πυρηνικών οξέων ή πρωτεϊνών, αλλά και για την ίδια την ανίχνευσή τους, μέσα από την αξιοποίηση των
παραμαγνητικών ιδιοτήτων σφαιριδίων κατάλληλου νανοϋλικού, να μεταβάλλουν το μαγνητικό πεδίο γύρω
τους. Με τον τρόπο αυτό να καθίσταται δυνατός ο εντοπισμός και η ταυτοποίηση τους, μέσω μαγνητικών
μετατροπέων και εφικτή η εμπλοκή τους στην «μαγνητική ιχνηθέτηση» ανοσοχημικών δοκιμασιών ή PCR.
Στη συνέχεια περιγράφεται ενδεικτικά μια πολύ πρόσφατη αίτηση Δ.Ε. CN104034777 (A). Η αίτηση
περιγράφει μια μέθοδο παρασκευής και εφαρμογής ενός ηλεκτροχημικού βιοαισθητήρα, με βάση
τροποποιημένο με νανο-πορώδη χρυσό, τρισδιάστατο ηλεκτρόδιο αδάμαντος και με πρόσμιξη βορίου
(Boron-Doped Diamond ή BDD). Περιγράφεται μέθοδος στερέωσης εστεράσης της ακετυλοχολίνης και η
εφαρμογή της στην ανίχνευση υπολειμμάτων οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων, καθώς η μέθοδος μπορεί
να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση της επιφάνειας, επιταχύνοντας τη μεταφορά ηλεκτρονίων και
βελτιώνοντας με τον τρόπο αυτό, την ηλεκτροκαταλυτική δραστηριότητα και τη βελτίωση της ευαισθησίας
ανίχνευσης.
Σχήμα 7.34 Μέθοδος παρασκευής και εφαρμογής ηλεκτροχημικών βιοαισθητήρων που βασίζονται σε ηλεκτρόδιο
αδάμαντος με νανο-πορώδη χρυσό με προσμίξεις βορίου (Wei Min et al., 2014).
Οι νανομηχανικοί βιοαισθητήρες είναι μια νέα αναδυόμενη κατηγορία βιοαισθητήρων υψηλής

ευαισθησίας, αμέσου ανίχνευσης και ελεύθερων ιχνηθέτησης, που συνδέει την αναγνώριση βιομορίων με
(νανο-)μηχανική κίνηση. Διακρίνονται σε νανομηχανικούς βιοαισθητήρες, που κατά περίπτωση μπορεί να
είναι οπτο-νανομηχανικοί ή/και ηλεκτρο-νανομηχανικοί. Οι πλέον υποσχόμενες τέτοιες διατάξεις
περιλαμβάνονται στο Πίνακα 7.2.
Η πιεζοηλεκτρική ανίχνευση βασίζεται συνήθως στη μέτρηση των μεταβολών στη συχνότητα
συντονισμού ενός κρυστάλλου χαλαζία (Quartz Crystal Microbalance ή QCM), μετά από μια αλλαγή στη
μάζα του κρυστάλλου, που προκαλείται από την αλληλεπίδρασή του με ένα βιολογικό «στόχο» π.χ. ένα
αντιγόνο, ένα αντίσωμα, ένα τμήμα DNA κ.λπ. Με ανάλογο τρόπο λειτουργούν, αξιοποιώντας την μεταβολή
της μηχανικής συχνότητας συντονισμού μικροδοκών, μικροδιαύλων ακουστικών αντηχείων, διαμορφωμένων
πάνω σε μικρο-ηλεκτρομηχανικά συστήματα κ.λπ., και οι υπόλοιποι μικρο- και νανο βιοαισθητήρες.
Αυτοί οι βιοαισθητήρες εμφανίζουν προς το παρόν μικρότερη ευαισθησία από τους αντίστοιχους
οπτικούς και περαιτέρω μελέτες διεξάγονται για να αξιολογηθεί η σταθερότητα της επιφάνειάς τους σε
βιολογικά υγρά, για να ερευνηθούν προβλήματα σχετικά με την αναγέννηση των δραστικών τους
επιφανειών, για το βαθμό ειδικότητας της σύνδεσής τους με πρωτεΐνες, και για τον απαιτούμενο αντίστοιχο
χρόνο επώασης, ώστε να αποτελέσουν μια αξιόπιστη και οικονομική πλατφόρμα για την in vitro
διαγνωστική.
212
213
Όριο Aνίχνευσης
Νανομηχανικοί Βιοαισθητήρες
(pg/mm2 )
Μικροϊσορροπίας Χαλαζία 10,00
Συντονιζόμενοι Μικροδοκοί 0,01-10,00
Ακουστικό Αντηχείο Μικρο-Η/Μ Συστημάτων 100,00
Αναρτημένο Αντηχείο Μικροδιαύλων 0,10
Πίνακας 7.2 Οπτικοί βιοαισθητήρες και τα αντίστοιχα όρια ανίχνευσης.
Ένας ιδιαίτερα «εξωτικός» βιοαισθητήρας (Whispering Gallery Mode ή WGM), έλκει τη καταγωγή
του ονόματός του, από το γνωστό από πολύ παλιά ακουστικό φαινόμενο της «Στοάς που ψιθυρίζει», που
γίνεται άμεσα αντιληπτό στους επισκέπτες της κυκλικής στοάς του τρούλου του Ναού του Αγίου Παύλου
στο Λονδίνο. «Αν κάποιος επισκέπτης ψιθυρίσει κάτι, στραμμένος προς το τοίχο της Κυκλικής Στοάς, ένας
άλλος επισκέπτης που βρίσκεται στο εκ διαμέτρου αντίθετο σημείο της στοάς, μπορεί να ακούσει τον ψίθυρο, αν
πλησιάσει το αυτί του στον τοίχο, ενώ, αν ο πρώτος επισκέπτης φωνάξει δυνατά και απ’ ευθείας (απόσταση ~
42 m) στον δεύτερο, η φωνή του θα εξασθενήσει από την απόσταση και θα χαθεί στην οχλαγωγία των πολλών
επισκεπτών του τρούλου του Ναού». Το φαινόμενο οφείλεται στη δημιουργία από το ψίθυρο ακουστικών
κυμάτων, που οδεύουν με μικρές απώλειες κατά μήκος της περιφέρειας της κυκλικής στοάς και γίνονται
ευκρινώς ακουστά, εφόσον δεν συναντήσουν κάποιο εμπόδιο π.χ. κάποιους άλλους εύσωμους επισκέπτες
καθισμένους κοντά στο τοίχο, οπότε η ένταση και η χροιά του ψιθύρου, μεταβάλλεται συναρτήσει του
αριθμού και της σωματικής τους διάπλασης.
Αν βάλουμε στη θέση του τρούλου του Ναού του Αγίου Παύλου ένα κοίλο μικροσφαιρίδιο από
πυριτιούχο υλικό, στην επιφάνεια του οποίου έχουμε συνδέσει νουκλεοτίδια, πεπτίδια, πρωτεΐνες, κ.λπ. για
να συνδεθεί το υπό ανίχνευση βιομόριο (στη θέση του ευτραφούς επισκέπτη!) και αντικαταστήσουμε το
ψίθυρο ανάμεσα στους δύο επισκέπτες, με ένα LASER μεταβαλλόμενου μήκους κύματος και ένα κατάλληλο
φωτοανιχνευτή, τότε η παραμόρφωση της έντασης και της χροιάς του ψιθύρου, μεταλλάσσεται σε αντίστοιχη
μετρήσιμη μεταβολή της έντασης της δέσμης του LASER, που δημιουργεί σε νανοκλίμακα, οπτικά κύματα,
τα οποία οδεύουν με μικρές απώλειες κατά μήκος της περιφέρειας του κοίλου μικροσφαιριδίου, και
παρουσιάζουν βύθιση της έντασής τους, σε μια περιοχή μηκών κύματος, ανάλογα με τη γεωμετρία του
συνδεδεμένου βιομορίου. Από την παραμόρφωση αυτή μπορούμε να ανιχνεύσουμε και να ταυτοποιήσουμε
τα τυχόν συνδεόμενα βιομόρια και το πλήθος τους.
Σχήμα 7.35 Το ακουστικό φαινόμενο WGM.
214
Σχήμα 7.36 Διέγερση του ισημερινού WGM μικροσφαιριδίων με εφήμερη σύζευξη με ένα κύμα κατευθυνόμενο μέσα σε
μια κωνική οπτική ίνα (δεξιά). Οι θέσεις συντονισμού ανιχνεύονται ως βυθίσεις στο μεταδιδόμενο φως Τ σε συγκεκριμένα
μήκη κύματος LASER (Vollmer et al., 2008∙ Cai et al., 2000).
Η ταυτοποίηση των βιομορίων, μπορεί να ελεγχθεί ανεξάρτητα και με την σήμανση τους, στη
διάρκεια της επώασης με κβαντικές κηλίδες, μια προσέγγιση που μεγιστοποιεί μεν την ευαισθησία και
κυρίως την ειδικότητα της μεθόδου, αυξάνει όμως δραματικά την περιπλοκότητα και το κόστος της. Η
μηχανικής (ακουστικής) προέλευσης, οπτική μέθοδος στη σημερινή εφαρμογή της, δείχνει χαρακτηριστικά
την δυνατότητα απόδοσης, ποιοτικά νέου καινοτομικού περιεχομένου, σε «παλιά» φαινόμενα, στη σύγχρονη
έρευνα, στον αναδυόμενο κόσμο του «πολύ μικρού».
Σχήμα 7.37 Η κατανομή 1119 εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας (1990-2010) που εντοπίσθηκαν στις τρεις
σημαντικότερες ομάδες βιοαισθητήρων (οπτικοί. ηλεκτροχημικοί και νανο-αισθητήρες).
215
Σχήμα 7.38 Χρονική εξέλιξη του αριθμού των αιτήσεων Δ.Ε. για την ίδια χρονική περίοδο.
Η ενσωμάτωση βιοαισθητήρων και μεθόδων σε μικρογραφημένες διατάξεις: Ενώ ορισμένοι

τομείς της in vitro διαγνωστικής έχουν αλλάξει σημαντικά τα τελευταία 15 χρόνια, σε άλλους τομείς δεν
επαληθεύθηκαν οι αναμενόμενες ριζικές αλλαγές. Πολλές από τις εξωτικές τεχνολογίες που εμφανίστηκαν
(π.χ. microarrays, biomarkers, γενετικές εξετάσεις κ.λπ.), δεν χρησιμοποιούνται ακόμα ιδιαίτερα έξω από την
έρευνα, παρά την ύπαρξη ορισμένων αξιοπρόσεχτων εξαιρέσεων. Σε επίπεδο αγοράς, μόνον οι in vitro
διαγνωστικές δοκιμασίες στο σημείο φροντίδας (παρακλίνιες εξετάσεις ή Point of Care Techniques ή PοCΤ)
και οι μοριακές μέθοδοι παρουσιάζουν συνεχή ανάπτυξη μέσα στην συνολική αγορά των IVD. Μολονότι
πολλές δεκάδες εμπορικά διαθέσιμων διαγνωστικών δοκιμασιών έχουν ήδη εγκριθεί από το FDA στις ΗΠΑ,
για χρήση χωρίς συνταγή και για κατ’ οίκον εφαρμογή, η αγορά περιορίζεται ακόμα σε μεγάλο βαθμό στις
ίδιες περιοχές (διαβήτης, πηκτικότητα, εγκυμοσύνη, αέρια αίματος, καρδιακοί δείκτες κ.λπ.), οι οποίες και
παράγουν τον μεγάλο όγκο των πωλήσεων.
Τα ευρηματικά συστήματα Lab-on-a-Chip (LOC) φαίνεται και αυτά να μην έχουν επιτύχει ακόμα
ικανοποιητικά τον συνδυασμό μικροηλεκτρονικής, μικρορευστομηχανικής, βιολογίας και χημείας, σε χαμηλό
κόστος, με αξιοπιστία και επαναληπτικότητα, κατάλληλη για μεγάλης κλίμακας παραγωγή. Παρ’ όλα αυτά, η
ανάπτυξη πολλών νέων μεθόδων, όπως φαίνεται από την αξιολόγηση των τίτλων βιομηχανικής ιδιοκτησίας
που κάναμε, βασίζεται στις πολυσχιδείς υπό ανάπτυξη νανοτεχνολογίες, που ήδη περιγράφτηκε εν συντομία
και μπορούν να ενσωματωθούν σε διάφορες μορφές μικροδιατάξεων, κυρίως πλευρικής μικροροής. Είναι
γεγονός ότι πολλά από τα χαρακτηριστικά των αναδυομένων αυτών τεχνολογιών, δημιουργούν βάσιμες
προσδοκίες για την υπέρβαση των περιορισμών, που εμπόδισαν την ταχύτερη και πληρέστερη ενσωμάτωση
τους σε κατάλληλες και για την κλινική πράξη μικροδιατάξεις.
Στο γράφημα του Σχήματος 7.38 παρουσιάζεται η παράλληλη εξέλιξη των εγγράφων βιομηχανικής
ιδιοκτησίας κατ' έτος (1990 - 2010) για τις τρεις σημαντικότερες ομάδες βιοαισθητήρων (οπτικοί,
ηλεκτροχημικοί και νάνο-αισθητήρες). Στα μέσα της πενταετίας 2006 – 2010, διακρίνεται μια έντονη
συσσώρευση δραστηριότητας η οποία ανακόπτεται πιθανά από την οικονομική κρίση μετά το 2008. Εδώ
πρέπει να ληφθεί υπ’ όψη και το υποχρεωτικό 18μηνο που μεσολαβεί από την ημερομηνία υποβολής της
αίτησης ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας μέχρι την δημοσίευσή της.
Στον Πίνακα 7.3 που ακολουθεί, παρουσιάζεται η ταυτότητα επιλεγμένων εγγράφων βιομηχανικής
ιδιοκτησίας ιδιαίτερου ενδιαφέροντος, τα οποία αφορούν σε ευρεσιτεχνίες σχετικές με ανοσοχημικές
δοκιμασίες, ηλεκτροχημικούς βιοαισθητήρες, μεθόδους βασισμένες στο φθορισμό, μοριακά διαγνωστικά και
με γενικότερα συστήματα πλευρικής ροής, περιοχές ιδιαίτερου ενδιαφέροντος για την εκτίμηση των
μελλοντικών εξελίξεων στην ανίχνευση αιματογενώς μεταδιδομένων παραγόντων.
216
Αναδυόμενες Αριθμός Ταυτότητα Εγγράφων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας Ιδιαιτέρου
Μέθοδοι/Τεχνικές Εγγράφων ενδιαφέροντος
US2003146100A1
Ανοσοχημικές US2005130226A1 US2005214866A1
17 US2006263818A1
Δοκιμασίες US2009317844A1 US2010203550A1
WO2010025190A1
Ηλεκτροχημικοί JP2005292021A
13 US6478938B1 US2008156646A1
Βιοαισθητήρες US2010252452A1
EP0834848A2 US5946083A US6191847B1
Μέθοδοι US6239906B1 US2001050810A1 US2006219939A1
βασισμένες στο 18 US2006263818A1 WO2004008098A2 WO2009051416A1
Φθορισμό WO2006085948A2 WO2007044029A2 WO2009051416A1
WO2009054647A2 WO2009082706A1 WO2009098605A1
US6007690A US6074827A US6344326B1
US2002119482A1 US2003146100A1 US2003224436A1
Μοριακά
15 US2006096691A1 US2007202522A1 US2008003600A1
Διαγνωστικά
US2008220421A1 US2009061413A1 US2009170064A1
US2010330575A1 WO9940174A1 WO2009156916A2
US20040214253A1 US20070224689A1 US20090211345A1
Συστήματα
15 US20090305290A1 US20100092945A1 US20100297611A1
Πλευρικής Ροής
WO0062060 WO2008156415A1 WO2010009206A2
Πίνακας 7.3 Η ταυτότητα επιλεγμένων εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας ιδιαίτερου ενδιαφέροντος.
Η δεύτερη γενιά βιοαισθητήρων θα συμβάλλει στην ανάπτυξη ιδιαίτερα αποτελεσματικών

μικρογραφημένων συστημάτων. Οι νέες φυσικές και χημικές αρχές σύνδεσης και ανίχνευσής που
χρησιμοποιούνται σε αυτά τα συστήματα, συνδυάζουν μικρο- και νανοτεχνολογίες και υπόσχονται
εξαιρετικά επίπεδα ευαισθησίας φέρνοντας πιο κοντά στην ανάπτυξη λογικού κόστους δοκιμασιών, για την
ανίχνευση νουκλεοτιδίων και πεπτιδίων. Εντούτοις, ακόμα δεν υπάρχει μια καθολικά αποδεκτή πλατφόρμα
κλινικής αξιοποίησης των μικρογραφημένων συστημάτων, που εκμεταλλεύονται τις νανοτεχνολογίες,
μολονότι τα πειραματικά ερευνητικά δεδομένα, αναδεικνύουν ότι είναι εξίσου αποτελεσματικά και
ανθεκτικά, με τις χρησιμοποιούμενες πλατφόρμες, των καταξιωμένων δοκιμασιών ELISA ή PCR.
Κλείνοντας, θα παρουσιάσουμε ενδεικτικά μια πολύ πρόσφατη αλλά και ιδιαίτερα ενδιαφέρουσα
αίτηση Δ.Ε. για ένα σχετικά «γενικευμένο» υπόδειγμα LOC, που περιλαμβάνει:
Μια είσοδο δείγματος για τη λήψη ενός υγρού δείγματος και ένα τμήμα προετοιμασίας του
δείγματος (Sample Preparation Module ή SPM), συζευγμένη με την είσοδο του δείγματος. Η SPM
περιλαμβάνει: ένα θάλαμο ανάμειξης, ένα θάλαμο αντιδραστηρίου, που περιέχει ένα αντιδραστήριο, μια
ημιπερατή μεμβράνη, προσανατολισμένη μεταξύ του θαλάμου αναμείξεως και του θαλάμου αντιδραστηρίου
και μια συντονιζόμενη πηγή ενέργειας, που αναγκάζει επιλεκτικά τα περιεχόμενα του θαλάμου
αντιδραστηρίου, να επεκταθούν και να περάσουν μέσα από την ημι-περατή μεμβράνη, στο θάλαμο
αναμίξεως, για την ανάμιξη του αντιδραστηρίου με το υγρό δείγμα. Το LOC περιλαμβάνει περαιτέρω ένα
μικροδίαυλο συζευγμένο στο SPM. Μια πηγή φωτός και μια οπτική μονάδα, πλησίον του μικροδιαύλου,
καθώς και ένας αριθμό φακών, εντός της οπτικής μονάδας, που κάθε φακός έχει μια διαφορετική ενεργή
εστιακή απόσταση, για τη δημιουργία μιας ενιαίας σύνθετης εικόνας, ενός αντικειμένου που διέρχεται μέσω
του μικροδιαύλου.
217
Σχήμα 7.39 Ένα υποδειγματικά απλό Lab-on-a-chip.
Σχήμα 7.40 Λεπτομερής περιγραφή ενός lab-on-a-chip.
218
Σχήμα 7.41 Ένα πολύ λεπτομερές σχηματικό διάγραμμα, όπως περιγράφεται στην αίτηση χορήγησης Δ.Ε.
US20150037215 A1 (Durniak et al., 2015).
Η ανασκόπηση εκατοντάδων εγγράφων βιομηχανικής ιδιοκτησίας έδειξε ότι το πλήθος των

διαθέσιμων καινοτόμων προσεγγίσεων είναι μεγάλο και μένει να αναπτυχθούν στην επόμενη δεκαετία,
συνδυασμοί τους, ικανοί να καλύψουν με το καλύτερο δυνατό τρόπο, τις απαιτήσεις, τόσο της ποιότητας,
όσο και του κόστους, της σύγχρονης IVDs τεχνολογίας.
219
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο
 Σχήμα 7.17 http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdanatomy.html
Αναφορές
1. AHMAD, AZMAT, Z. et al. (2007) Αutomated laboratory test ordering and result tracking. US
20070294103 (A1), Publication Date: 20/12/2007, Assignee: Cerner Innovation Inc., Overland Park,
KS, USA.
2. CAI, Μ., PAINTER, Ο., VAHALA, .J. (2000) Observation of Critical Coupling in a Fiber Taper to a
Silica-Microsphere Whispering-Gallery Mode System. Phys. Review Letters, 85, p. 3.
3. DURNIAK, Τ., FRIEDLANDER, R., KRAEMER, J.R. (2015) Lab on a chip, US20150037215 A1,
Publication Date: 05/02/2015, Assignee: International Business Machines Corporation.
4. FRACH, T. (2014) Position-sensitive readout modes for digital Si-Photomultiplier Arrays, MX
2014001272 (A). Assignee: Koninkl. Philips NV, NL.
5. FUNAMOTO, TATSUAKI (2015) Colorimetry Apparatus, US 20150042996, Publication Date:
12/02/2015, Assignee: SEIKO-EPSON Corporation.
6. GUIZHENG, Z., SHUFENG, L., GUODONG, L. (2012) Near-infrared electro-generated Chemilumi-
nescence Immuno-Detection method. CN102749452 (A) Publication Date: 24/10/2012, Assignee:
Univ. Shandong.
7. ISAMI, TADAO et al. (2015) Plate, Production Method for Plate, Biochip Observation Method, and
Screening Method. WO2015016315 (A1), Publication Date: 05-02-2015 Assignee: Nikon Corp. JP.
8. KANAI, S., et al. (2014) Position sensitive solid-state photomultipliers, systems and methods. US Pa-
tent 8884240, Granted on November 25, 2014, Assignee: Radiation Monitoring Devices, Inc. USA.
9. ΚLAUS, W., BERND, T., TIMOTHY, R., HANSEN. (2015) Nephelometry method and apparatus for
determining the concentration of suspended particles in an array of sample containers, WO
2015026794 (A1), Publication Date: 26/02/2015, Assignee: Becton, Dickinson & Company.
10. MACBEATH, G. & SCHREIBER L. (2000) Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput
Function Determination. Science 08/09/2000, Vol. 289 www.sciencemag.org (τελευταία προσπέλαση
1/3/2015).
11. ΟΛΖΙΕΡΣΚΥ, Α. (2006) Μελέτη και Ανάπτυξη Συστοιχιών Νανοκρυσταλλιτών Ημιαγωγών σε Μήτρα
Μονωτικού για Εφαρμογές σε Μνήμες. Αθήνα: EΚΠΑ.
12. Olympus Specialized Microscopy Techniques: Anatomy of a CCD, accessed on:
http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/concepts/ccdanatomy.html (τελευταία προσπέ-
λαση 1/3/2015).
13. RICCHIO, SAMUEL, G., et al. (1993) Automatic chemistry analyzer. US Patent 5213762, Granted on
May 25/1993. Assignee: Beckman Instr. USA.
14. SHIMOYAMA, ISAO et al. (2012) SPR Sensor and inspection system mounting SPR sensor. P
2012233779 (A), Publication Date: 29/11/2012, Assignee: Univ. of Tokyo, Olympus Corp.
15. SKEGGS, L., & HOCHSTRASSER H. (1964) Multiple automatic sequential analysis. Clin Chem 10.
p. 918.
16. SKEGGS, L. (1955) Automatic analyzing apparatus, US Patent 2879141, Assignee: Technicon, Instr,
USA.
17. SKEGGS, L. (2000) Persistence ... and Prayer: From the Artificial Kidney to the Auto-Analyzer. Clin
Chem, 46, p. 1425-36.
18. ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ, B. (2011) Αναδυόμενες σμικρυσμένες τεχνικές στην ανίχνευση μεταδιδομένων με
τη μετάγγιση παραγόντων: Μια εκτίμηση στην πορεία τους βασισμένη στην ανασκόπηση σχετικών
τίτλων Βιομηχανικής Ιδιοκτησίας. Haema, 2(1), p.122-134.
19. ΣΠΥΡΟΠΟΥΛΟΣ, Β. (2014) Ορισμένες προοπτικές των Κβαντικών Τελειών (Quantum Dots) στην in
vitro Διαγνωστική. Πρακτικά 12ου Πανελλήνιου Συνέδριου Κλινικής Χημείας, Αθήνα, 7-8 Νοεμβρίου
2014.
20. TAKIGUCHI, Y. (1988) Immuno Analyzer. JP S63295964 (A). Filing Date: 02/12/1988, Assignee:
Toshiba Corp., Japan.
220
21. TZAVARAS, A, & SPYROPOULOS, B. (2013) An overview of crucial functional components of
modern Clinical Chemistry automated analyzers. Regional European Congress of Biomedical
Laboratory Science. p. 5-7.
22. TOKUNAGA, KAZUTOSHI, YAMAMOTO, NORIMASA. (2007) Analyzer. US 20080158552, Fil-
ing Date: 27/12/2007, Assignee: Sysmex Corporation Analyzer. Japan.
23. VOLLMER, F., ARNOLD, S., KENG, D. (2008) Single virus detection from the reactive shift of a
whispering-gallery mode. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105(208). p. 20701 -
20704.
24. WEI & MIN et al. (2014) Preparation method and application of electrochemical biosensor based on
three-dimensional nano-porous gold-modified boron-doped diamond electrode. CN 104034777 (A),
Publication Date: 10/09/2014, Assignee: Univ. Henan Technol.
25. YAMAZAKI, I., NISHIDA, M., KAMIHARA, K., TAMEZANE, H. (2014) Automatic analyzer. US
20140220693 (A1), Publication Date: 07/08/2014, Assignee: Hitachi High-Technologies Corporation.
26. ZHU, J. et al. (2013) Quantum Dots for DNA Biosensing, Springer Briefs in Molecular Science, 2013
(VIII).
221
ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΨΗΛΗΣ ΠΙΕΣΗΣ (ΑΠΟΔΟΣΗΣ)
(HPLC) ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ
ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΚΑΙ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό επεξηγούνται οι βασικές αρχές ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού και παρουσιάζονται
οι κυριότερες έννοιες και η ορολογία με τις οποίες περιγράφεται μια χρωματογραφική ανάλυση. Μεταξύ των
χρωματογραφικών τεχνικών που περιγράφονται δίνεται έμφαση στην Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης
και στη Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας, που εφαρμόζονται περισσότερο στην κλινική ανάλυση. Η
περιγραφή επικεντρώνεται στη συνέχεια στην περισσότερο χρησιμοποιούμενη υγρή χρωματογραφία υψηλής
πίεσης βασιζόμενη στη χρωματογραφία προσρόφησης, στην εφαρμογή αυτής στον ποιοτικό και ποσοτικό
προσδιορισμό και στη μεθοδολογία ανάπτυξης πρωτοκόλλου χρωματογραφικού διαχωρισμού. Προβάλλονται
οι κύριες εφαρμογές της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης στην κλινική ανάλυση και παρουσιάζεται
αναλυτικά το παράδειγμα προσδιορισμού της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Το κεφάλαιο ολοκληρώνεται
με πειραματικό παράδειγμα προσδιορισμού φαρμακευτικής ουσίας στον ορό.
Δεν υπάρχει κάποιο συγκεκριμένο προαπαιτούμενο κεφάλαιο σε αυτό το βιβλίο. Ως προαπαιτούμενες
γνώσεις όμως, μπορούν να θεωρηθούν οι έννοιες της πολικότητας των μορίων, των χαρακτηριστικών
ομάδων των οργανικών μορίων και της διαλυτότητας αυτών.
Ο όρος χρωματογραφία (chromatography) περιλαμβάνει πλήθος αναλυτικών τεχνικών που εφαρμόζονται

κοινώς στον διαχωρισμό των συστατικών μιγμάτων ουσιών. Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού
εφαρμόζονται ευρύτατα για τη διαπίστωση της παρουσίας ή μη συστατικών σε μίγματα τα οποία περιέχουν
ένα περιορισμένο αριθμό άλλων ουσιών/προσμίξεων, γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η
επιβεβαίωση της ταυτότητας των συστατικών του μίγματος προαπαιτεί τον χρωματογραφικό διαχωρισμό
αυτών με σκοπό την απομόνωσή τους. Ακολουθεί ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με χημικές ή
φασματοσκοπικές τεχνικές.
Πέραν των εφαρμογών της στην κλινική ανάλυση, η χρωματογραφία χρησιμοποιείται ευρύτατα στη
φαρμακευτική ανάλυση, την ανάλυση τροφίμων και περιβαλλοντικών δειγμάτων, στη βιοχημική έρευνα,
όπως και στην καθημερινή πρακτική ενός συνθετικού χημικού εργαστηρίου και αλλού. Σε συνδυασμό με
επακόλουθη συζευγμένη τεχνική ανίχνευσης (tandem chromatography), κυρίως με φασματοσκοπικές
τεχνικές όπως UV/Vis, MS ή IR, η χρωματογραφία αποτελεί το αναγκαίο προκαταρκτικό στάδιο όχι μόνο
για τον ποιοτικό χαραχτηρισμό, αλλά και τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαχωριζόμενων ουσιών
μεταβολιτών φαρμάκων κ.α. Τέλος, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως μέθοδος απομόνωσης των συστατικών
ενός μίγματος στην φυτοχημεία, χημεία φυσικών προϊόντων κ.α. (προπαρασκευαστική χρωματογραφία,
preparatory chromatography).
Κάθε χρωματογραφική τεχνική περιλαμβάνει μία κινητή φάση (mobile phase), η οποία ρέει
μεταφέροντας τις διαχωριζόμενες ουσίες – συστατικά ενός μίγματος- μέσω μίας στατικής φάσης (static
phase). Η κινητή φάση αποτελείται από ένα διαλύτη ή σύστημα διαλυτών, ενώ η στατική φάση από πορώδες
στερεό υλικό ή από υγρό καθηλωμένο σε στερεό υπόστρωμα. Ο διαχωρισμός των συστατικών στη
χρωματογραφία βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό αλληλεπίδρασης του κάθε συστατικού με τις δύο φάσεις,
ο οποίος καθορίζεται από την αγχιστεία (φυσικοχημική συγγένεια) του συστατικού με την κάθε φάση). Κάθε
μόριο μίας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται πάρα πολλές φορές μεταξύ της
222
κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης (όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται
λόγω αγχιστείας κ.τ.λ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1).
Σχήμα 8.1 Αρχή διαχωρισμού συστατικών μίγματος με την τεχνική της χρωματογραφίας. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται
βάσει της διαφορετικής αγχιστείας των συστατικών με την κινητή και στατική φάση. Αναπαρίσταται η πορεία μορίων δύο
διαφορετικών ουσιών διαμέσου μίας στήλης. Το μπλε μόριο κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και συνεπώς
παρασύρεται από αυτήν ταχύτερα, διότι δεν αλληλεπιδρά ισχυρά με τη στατική φάση. Αντίθετα το κίτρινο μόριο
αλληλεπιδρά ισχυρότερα με τη στατική φάση, με αποτέλεσμα να επιβραδύνεται. Κατά συνέπεια το κίτρινο συστατικό θα
κινείται βραδύτερα από το μπλε, με αποτέλεσμα τον διαχωρισμό τους.
Η διαφορετική αυτή αγχιστεία οφείλεται στις διαφορές των συστατικών του μίγματος σε ορισμένα
φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους, όπως π.χ. διαφορές στο μέγεθος του μορίου, το φορτίο, την πτητικότητα
και τη διαλυτότητα. Η αγχιστεία αυτή περιγράφεται από τον συντελεστή κατανομής Κ (partition
coefficient) ο οποίος ορίζεται ως:
Κ=Cs/Cm (Εξίσωση 8.1)
όπου:
C: η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στη στατική φάση και
Cm η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας στην κινητή φάση.
Ο συντελεστής κατανομής εκφράζεται δηλαδή από το λόγο της συγκέντρωσης της ουσίας στη
στατική φάση προς τη συγκέντρωση της ουσίας στην κινητή φάση. Η κατανομή αυτή καθορίζεται από τα
φυσικοχημικά χαρακτηριστικά της ουσίας, αλλά και από τη φύση της κινητής, όπως και της στατικής φάσης.
Η παράμετρος Κ είναι μία χαρακτηριστική σταθερά για τη δεδομένη χημική ένωση και το ζεύγος
στατικής/κινητής φάσης, σε μια δεδομένη θερμοκρασία. Έτσι, μία ουσία που αλληλεπιδρά ισχυρά με τη
στατική φάση «επιβραδύνεται» σε σχέση με μία ουσία που κατανέμεται πιο σημαντικά στην κινητή φάση και
«παρασύρεται ταχύτερα» από αυτή. Ως αποτέλεσμα, οι δύο ουσίες διαχωρίζονται. Πρέπει να τονισθεί ότι ο
χρωµατογραφικός διαχωρισµός είναι το αποτέλεσµα επαναλαµβανοµένων ισορροπιών των συστατικών
µεταξύ των δύο φάσεων κατά τη µετακίνησή τους. Είναι προφανές, ότι προκειμένου να διαχωριστούν δύο
ουσίες θα πρέπει να διαφέρουν οι συντελεστές κατανομής αυτών.
Σύνοψη: Οι χρωματογραφικές τεχνικές διαχωρισμού εφαρμόζονται στο διαχωρισμό συστατικών μιγμάτων που
περιέχουν περιορισμένο αριθμό προσμίξεων γνωστής, ως επί το πλείστον, ταυτότητας. Η επιβεβαίωση της
ταυτότητας των διαχωριζόμενων ουσιών απαιτεί επακόλουθη ανάλυση των απομονούμενων συστατικών με
χημικές ή φασματοσκοπικές τεχνικές.
Σύνοψη: Σε ένα χρωματογραφικό διαχωρισμό οι δύο φάσεις επιλέγονται έτσι, ώστε τα συστατικά του δείγματος
να κατανέμονται μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης σε διαφορετικό βαθμό και συνεπώς να
καθυστερούν περισσότερο ή λιγότερο και να διαχωρίζονται.
8.2 Διάκριση Χρωματογραφικών τεχνικών
Οι χρωματογραφικές τεχνικές μπορούν να ομαδοποιηθούν, με διάφορα κριτήρια. Έτσι, με βάση το

μέσο στο οποίο τοποθετείται η στατική φάση, μία βασική διάκριση γίνεται με κριτήριο τη χρωματογραφία
στήλης και την επίπεδη χρωματογραφία, ενώ με βάση το είδος της κινητής και στατικής φάσης,
διακρίνουμε την υγρή χρωματογραφία και την αέρια χρωματογραφία. Τέλος, ανάλογα με το μηχανισμό
αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την στατική φάση, οι
223
χρωματογραφικές τεχνικές διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής, ιονανταλλαγής,
µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας.
8.2.1 Χρωματογραφία Στήλης
Στη χρωματογραφία στήλης (column chromatography) η στατική φάση βρίσκεται ως πληρωτικό υλικό
ακινητοποιημένη στο εσωτερικό στήλης κατασκευασµένης από αδρανές υλικό (π.χ. από ύαλο ή ανοξείδωτο
χάλυβα). Η κινητή φάση διέρχεται υπό συνεχή ροή διαμέσου της στήλης. Η διέλευση της κινητής φάσης
γίνεται είτε λόγω βαρύτητας, είτε υπό υψηλή πίεση, που επιτυγχάνεται με τη χρήση αντλίας. Από τη στιγμή
που θα εισαχθεί το δείγμα στην κορυφή της στήλης, τα επιμέρους συστατικά του δείγματος υφίστανται
διαδοχικές κατανομές μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης. Το κλάσμα κάθε συστατικού, που
βρίσκεται κάθε στιγμή στην κινητή φάση, μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Για το κάθε
μόριο κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης. Η ταχύτητα
μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής τους στην
στατική φάση, ως προς το χρόνο παραμονής τους στην κινητή φάση και είναι ανάλογη του συντελεστή
κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις. Είναι ευνόητο ότι ο διαχωρισμός των επιμέρους συστατικών
είναι εφικτός με την προϋπόθεση, ότι αυτά έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής. Κατά την πρόοδο
της ανάλυσης, ο διαχωρισμός των συστατικών γίνεται αποτελεσματικότερος. Με την ολοκλήρωση της
πορείας τους στη στήλη, τα συστατικά θα έχουν διαχωρισθεί, οπότε θα εξέλθουν σε διαφορετικούς χρόνους
από τη στήλη. Ο διαχωρισμός ενός δείγματος στα επιμέρους συστατικά του υπό τη συνεχή ροή της κινητής
φάσης στη χρωματογραφία στήλης παρουσιάζεται υπό τη μορφή επίδειξης στο Animation 8.1.
Animation 8.1 O διαχωρισμός των συστατικών ενός μίγματος (εδώ σημειώνονται με κίτρινο και μπλε χρώμα) σε
χρωματογραφία στήλης.
Σύνοψη: Στη χρωματογραφία στήλης ορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της
στήλης. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης. Τα επιμέρους συστατικά του
δείγματος, με την προϋπόθεση, ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακινούνται με διαφορετική
μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες.
8.2.2 Επίπεδη Χρωματογραφία
Στην επίπεδη χρωματογραφία (planar chromatography) η στατική φάση εμφανίζεται ως επίπεδη

επιφάνεια π.χ. τμήμα γυαλιού ή φύλλου αλουμινίου επικαλυμένο με προσροφητικό υλικό στην
χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (Thin Layer Chromatography ή TLC), ή φύλλο κελουλόζης στην
χρωματογραφία χάρτου (paper chromatography). Και στα δύο αυτά είδη χρωματογραφίας, η κινητή φάση
κινείται διαμέσου της στατικής φάσης, λόγω τριχοειδών φαινομένων και βαρύτητας.
Στην TLC, (Animation 8.2) η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα
πηκτής διοξείδιου του πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό, όπως πλάκα γυαλιού ή
224
φύλλο αλουμινίου. Το διάλυμα του υπό εξέταση δείγματος και οι κατάλληλοι μάρτυρες τοποθετούνται ως
κηλίδες στη γραμμή εκκίνησης, κοντά στο κατώτερο άκρο της πλάκας. Η πλάκα στη συνέχεια τοποθετείται
μετά σε θάλαμο ανάπτυξης, στον πυθμένα του οποίου βρίσκεται το σύστημα των διαλυτών της κινητής
φάσης, ενώ ο υπερκείμενος χώρος είναι κορεσμένος σε ατμούς των διαλυτών. Με τη βοήθεια τριχοειδών
φαινομένων η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, μέχρι το μέτωπο του διαλύτη να φθάσει λίγα
εκατοστά πριν το άνω άκρο της. Επειδή η στατική φάση αποτελείται από πηκτή οξειδίου του πυριτίου
διαθέτει επιφανειακές υδροξυλομάδες που της προσδίδουν πολικό χαρακτήρα. Κατά την ανάλυση η
στοιβάδα οξειδίου του πυριτίου κορέννυται με νερό. Κατά συνέπεια αλληλεπιδρά ισχυρότερα με πολικές
ενώσεις. Έτσι, οι ουσίες που περιέχονται στο υπό εξέταση δείγμα, μετακινούνται στην πλάκα με διαφορετική
ταχύτητα ανάλογα με την πολικότητα τους, με τις λιγότερο πολικές ουσίες να κατανέμονται σημαντικότερα
στην λιγότερο πολική κινητή φάση και να προπορεύονται. Με τον τρόπο αυτό τα συστατικά ενός μίγματος
διαχωρίζονται και σχηματίζουν αυτόνομες κηλίδες επάνω στην πλάκα. Είναι προφανές ότι τα συστατικά του
μίγματος θα έχουν διανύσει ίση απόσταση από τη γραμμή εκκίνησης με τους αντίστοιχους μάρτυρες.
Οι κηλίδες γίνονται διακριτές είτε στο υπεριώδες φως (Φωτογραφία 8.1), είτε μετά από ψεκασμό με
ειδικά αντιδραστήρια (Φωτογραφία 8.2). Αυτά αντιδρώντας με την προς ανίχνευση ουσία δίνουν
χαρακτηριστικές αντιδράσεις, κατά τις οποίες παράγεται έγχρωμο προϊόν. Συχνά απαιτείται και θέρμανση
της πλάκας για την επιτάχυνση της αντίδρασης ανίχνευσης. Εναλλακτικά, γίνεται εμβάπτιση της πλάκας σε
διάλυμα που περιέχει τα κατάλληλα αντιδραστήρια ανίχνευσης. Η ταυτοποίηση των συστατικών ενός
μίγματος βασίζεται λοιπόν στην απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες, που αναπτύσσονται παράλληλα με
το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες
ουσίες.
Animation 8.2 Επιμέρους στάδια ανάπτυξης και συνακόλουθης ταυτοποίησης τριών άγνωστων δειγμάτων παράλληλα με
δύο μάρτυρες με χρωματογραφία TLC.
Φωτογραφία 8.1 Θάλαμος υπεριώδους (στην φωτογραφία αυτή από τον οίκο CAMAG) για την παρατήρηση των κηλίδων
των δειγμάτων πάνω σε πλάκα TLC. Υπό το υπεριώδες φως οι ουσίες διακρίνονται ως έγχρωμες κηλίδες κατά την εξέταση
της πλάκας.
225
Φωτογραφία 8.2 Σύστημα ψεκασμού χρωστικής σε πλάκα TLC (στη φωτογραφία αυτή από τον οίκο Labfriend. Κατά τον
ψεκασμό πραγματοποιείται χαρακτηριστική αντίδραση ανίχνευσης οπότε οι ουσίες διακρίνονται πλέον ως έγχρωμες
κηλίδες.
Σύνοψη: Στην TLC η στατική φάση συνηθέστερα αποτελείται από μία λεπτή στοιβάδα πηκτής διοξείδιου του
πυριτίου (silica gel) η οποία επικαλύπτει στερεό επίπεδο υλικό. Η ανάπτυξη γίνεται κατακόρυφα, όπου με τη
βοήθεια τριχοειδών φαινομένων, η πλάκα διαβρέχεται από την κινητή φάση, H ταυτοποίηση των συστατικών
ενός μίγματος γίνεται με βάση την ίση απόσταση που έχουν διανύσει μάρτυρες που αναπτύσσονται παράλληλα
με το προς διαχωρισμό μίγμα, σε συνδυασμό με τις χαρακτηριστικές αντιδράσεις που δίνουν οι διαχωριζόμενες
ουσίες.
8.2.3 Αέρια Χρωματογραφία
Στην αέρια χρωματογραφία (Gas Chromatography ή GC) χρησιμοποιείται αέρια κινητή φάση και ως στατική
φάση χρησιμοποιείται είτε στήλη με στερεό πληρωτικό υλικό, είτε τριχοειδής στήλη (capillary column).
Συχνά υπάρχει λεπτή στοιβάδα υγρού υψηλού σημείου ζέσεως, ακινητοποιημένου στην επιφάνεια του
αδρανούς στερεού υποστρώματος. Πάνω από αυτήν ρέει αδρανές αέριο (φέρον αέριο, carrier gas) το οποίο
αποτελεί την κινητή φάση. Στην περίπτωση αυτή μιλάμε για χρωματογραφία αερίου-υγρού.
Η αέρια χρωματογραφία έχει σχετικά περιορισμένη εφαρμογή, διότι είναι κατάλληλη για την
ανάλυση μιγμάτων πτητικών μόνο ουσιών (όπως αρωμάτων). Επίσης εφαρμόζεται στην ανάλυση ουσιών που
καθίστανται πτητικές - χωρίς όμως να διασπώνται - με σημαντική άνοδο της θερμοκρασίας (Σχήμα 8.2). Το
δείγμα ενίεται στον εισαγωγέα, όπου εξατμίζεται ταχύτατα και εισάγεται σε χρωματογραφική στήλη
(στατική φάση) καθώς παρασύρεται από το αδρανές φέρον αέριο (κινητή φάση). Ο διαχωρισμός
επιτυγχάνεται με κατανομή του αναλύτη μεταξύ της αέριας κινητής και της υγρής ή στερεής στατικής φάσης.
O διαχωρισμός πραγματοποιείται σε υψηλές θερμοκρασίες και γι’αυτό το λόγο η στήλη είναι εγκλεισμένη σε
φούρνο. Συνέπεια των παραπάνω είναι ότι η εφαρμογή της GC περιορίζεται στο διαχωρισμό σχετικά μικρού
μοριακού βάρους ουσιών (εφόσον η πτητικότητα μειώνεται στις μεγαλύτερου μοριακού βάρους ενώσεις).
Σχήμα 8.2 Σχηματική αναπαράσταση της βασικής διάταξης ενός αερίου χρωματογράφου (από την ιστοσελίδα του
εμπορικού οίκου Agilent.
226
8.2.4 Υγρή Χρωματογραφία
Στην υγρή χρωματογραφία (Liquid Chromatography ή LC) η κινητή φάση είναι υγρή, ενώ η στατική φάση
μπορεί να είναι στερεή ή υγρή. Η LC βρίσκει ευρύτατη εφαρμογή, σε αντίθεση με την αέρια χρωματογραφία,
με μοναδικό περιορισμό τη δυνατότητα διαλυτοποίησης των αναλυόμενων ουσιών στην κινητή φάση. Μη
πτητικές και θερμοευαίσθητες ενώσεις διαχωρίζονται αποκλειστικά με υγρή χρωματογραφία. Παρακάτω, θα
αναπτυχθεί εκτενώς η θεωρία και μεθοδολογία της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης.
8.2.5 Άλλες Χρωματογραφικές τεχνικές
Aνάλογα με το μηχανισμό αλληλεπίδρασης που επικρατεί ανάμεσα στις ουσίες προς διαχωρισμό και την
στατική φάση, οι χρωματογραφικές τεχνικές διακρίνονται σε χρωµατογραφία προσρόφησης, κατανοµής,
ιονανταλλαγής, µοριακού αποκλεισµού και χηµικής συγγένειας.
 Στη χρωματογραφία προσρόφησης (adsorption chromatography) ο διαχωρισμός των διαφόρων ουσιών

βασίζεται στο διαφορετικό βαθμό προσρόφησής τους στη στατική φάση. Οι αλληλεπιδράσεις που λαμβά-
νουν χώρα ανάμεσα στον αναλύτη και τη στατική φάση οφείλονται κυρίως σε αλληλεπιδράσεις διπόλου-
διπόλου, van der Waals και σε δεσμούς υδρογόνου (Σχήμα 8.3).
Σχήμα 8.3 Χρωματογραφία προσρόφησης: O κόκκινος αναλύτης προσροφάται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με
τον μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει.
 Η χρωματογραφία κατανομής (partition chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό μη ιοντικών

πολικών ενώσεων. Στην επιφάνεια του αδρανούς στερεού υποστρώματος υπάρχει ακινητοποιημένη λεπτή
στοιβάδα υγρού (υψηλού σημείου ζέσεως). Ο διαχωρισμός στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των
συστατικών ενός μείγματος μεταξύ της υγρής κινητής και της υγρής στατικής φάσης (Σχήμα 8.4).
Σχήμα 8.4 Χρωματογραφία κατανομής: O κόκκινος αναλύτης κατανέμεται ισχυρότερα στην στατική φάση σε σχέση με τον
μπλε, οπότε καθυστερεί να εξέλθει.
227
 Η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρι-
σμό ενώσεων με μοριακό βάρος μεγαλύτερο από 10.000 Da. Eφαρμόζεται συνεπώς στην ανάλυση και το
χαρακτηρισμό των πολυμερών ενώσεων (συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών). Ο διαχωρισμός γίνεται
με βάση το μέγεθος (και το σχήμα) των μορίων των αναλυόμενων ενώσεων: ενώ τα μικρά μόρια καθυ-
στερούν εισερχόμενα στους πόρους των σωματιδίων της στατικής φάσης, τα μεγάλα μόρια δεν εισέρχο-
νται στους πόρους της στατικής φάσης. Έτσι, τα τελευταία εξέρχονται πρώτα από τη στήλη (Σχήμα 8.5).
Σχήμα 8.5 Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού: ο κόκκινος αναλύτης εισχωρώντας στους πόρους της στατικής φάσης
καθυστερεί να εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους.
 Η χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion exchange chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό ιοντι-

κών ενώσεων. Ο διαχωρισμός οφείλεται στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυόμε-
νων ιόντων και των φορτισμένων ομάδων της στατικής φάσης (Σχήμα 8.6).
Σχήμα 8.6 Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής: Ο αρνητικά φορτισμένος κόκκινος αναλύτης αλληλεπιδρά με

ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με τις θετικά φορτισμένες ομάδες της στατικής φάσης, οπότε καθυστερεί να εξέλθει.
 Η χρωματογραφία χημικής συγγένειας (affinity chromatography) εφαρμόζεται στο διαχωρισμό εναντι-

ομερών ενώσεων. Οι προσδιοριζόμενες ενώσεις δεσμεύονται εκλεκτικά σε υποκαταστάτες, οι οποίοι είναι
ακινητοποιημένοι στη στατική φάση (Σχήμα 8.7).
228
Σχήμα 8.7 Χρωματογραφία χημικής συγγένειας: Ο κόκκινος αναλύτης δεσμεύεται από τη στατική φάση στην οποία
υπάρχει ακινητοποιημένος υποκαταστάτης με εκλεκτική συγγένεια για τον κόκκινο αναλύτη. Κατά συνέπεια, καθυστερεί να
εξέλθει σε σχέση με τους υπόλοιπους.
8.2.6 Χρωματογραφία HPLC
H χρωματογραφία HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ή High Performance Liquid

Chromatography – Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Πίεσης ή Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης)
αποτελεί σημαντικά εξελιγμένη μορφή της χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή φάση πλέον δεν ρέει υπό
την επίδραση της βαρύτητας, αλλά με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και επιτρέπει τη
χρήση χρωματογραφικών στηλών με μικρό μέγεθος σωματιδίων υλικού πλήρωσης. Η χρήση μικρoύ
μεγέθους σωματιδίων υλικού πλήρωσης αυξάνει το εμβαδόν της επιφάνειας της στατικής φάσης, που είναι
διαθέσιμο να αλληλεπιδράσει με τα μόρια που μεταφέρονται μέσω της κινητής φάσης. Κατά συνέπεια,
βελτιώνεται ο διαχωρισμός των αναλυόμενων μορίων και μειώνεται σημαντικά το μέγεθος της στήλης που
απαιτείται για έναν διαχωρισμό.
Στη συνέχεια θα επικεντρωθούμε στην εφαρμογή της HPLC στη χρωματογραφία προσρόφησης,
που είναι και η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη. Ανάλογα με τη σχέση της πολικότητας μεταξύ της στατικής
και της κινητής φάσης διακρίνονται δύο είδη χρωματογραφίας προσρόφησης υψηλής πίεσης: HPLC
κανονικής φάσης και HPLC αντίστροφης φάσης.
Σύνοψη: H χρωματογραφία HPLC αποτελεί παραλλαγή της κλασικής χρωματογραφίας στήλης, όπου η κινητή
φάση ρέει με τη βοήθεια αντλίας. Αυτό επιταχύνει την ανάλυση και μειώνει πολύ σημαντικά το μέγεθος της
στήλης που απαιτείται για έναν διαχωρισμό. Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC βρίσκονται αποκλειστικά σε
υγρή μορφή.
8.2.6.1 Η HPLC Κανονικής Φάσης
Στην HPLC κανονικής φάσης ως πληρωτικό υλικό χρησιμοποιείται κάποιο πολικό υλικό, όπως οξείδιο του
πυριτίου (SiO2) ή οξείδιο του αργιλίου (Al2O3). Η πολικότητα των υλικών αυτών οφείλεται στις
υδροξυλομάδες που περιέχουν. Αντίθετα, η κινητή φάση είναι μειωμένης πολικότητας. Κοινώς
χρησιμοποιούνται μη πολικοί διαλύτες, όπως εξάνιο ή χλωροφόρμιο, ενώ δεν περιέχεται στην κινητή φάση
νερό. Έτσι, οι πολικές ενώσεις στο διαχωριζόμενο μίγμα αλληλεπιδρούν ισχυρότερα με την πολική στατική
φάση, σε σύγκριση με τις άπολες ενώσεις (Σχήμα 8.8). Συνεπώς, οι λιγότερο πολικές ενώσεις διασχίζουν τη
στήλη ταχύτερα και εκλούονται από αυτήν νωρίτερα. Η κατακράτηση ενός πολικού μορίου από τη στατική
φάση οφείλεται στη προσρόφηση αυτού. Η έκλουση των πολικών μορίων από τη χρωματογραφική στήλη
επιτυγχάνεται με την αύξηση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την πορεία της ανάλυσης. Με την
αύξηση της πολικότητας της, περισσότερα μόρια διαλύτη αλληλεπιδρούν με τη στατική φάση
ανταγωνιζόμενα τις προσροφημένες ουσίες για θέσεις πρόσδεσης. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική
(με προγραμματισμένη μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης) έκλουση των προσροφημένων
πολικών μορίων.
229
Η HPLC κανονικής φάσης χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό χημικών ενώσεων που δεν
διαλύονται στο νερό ή που υδρολύονται (και συνεπώς δε συνιστάται η παραμονή τους σε υδατικό
περιβάλλον). Επίσης, βρίσκει μεγάλη εφαρμογή στον διαχωρισμό ισομερών ουσιών.
Στο Σχήμα 8.8 φαίνεται ο χρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος
αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια, που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα
μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε. Εφόσον
η στατική φάση είναι πολική, η κατακράτηση των κίτρινων μορίων θα είναι ισχυρότερη. Αντίθετα, η μπλε
ουσία θα κατακρατείται λιγότερο ισχυρά από τη στατική φάση. Μέτριας ισχύος θα είναι η κατακράτηση των
μορίων της κόκκινης ουσίας. Η μπλε ουσία επίσης θα συναγωνίζεται εντονότερα με τα μόρια της επίσης
άπολης κινητής φάσης για θέσεις πρόσδεσης στη στατική φάση. Έτσι τα μόρια της μπλε ουσίας θα
προπορεύονται στο διαχωρισμό. Προκειμένου να επιτευχθεί η έκλουση της κόκκινης και στη συνέχεια και
της κίτρινης ουσίας σε εύλογο χρονικό διάστημα, αυξάνεται η πολικότητα της κινητής φάσης, αμέσως μετά
την έκλουση της μπλε ουσίας.
Ένας απλός κανόνας που ισχύει είναι: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια
ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα
αντίστοιχης της στατικής φάσης.
Σχήμα 8.8 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC κανονικής φάσης, μίγματος αποτελούμενου από τριών τύπων μόρια
που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά
αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε.
Σύνοψη: Στην HPLC κανονικής φάσης η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο του πυριτίου και είναι πολική,
ενώ η κινητή φάση είναι μη πολική. Οι πολικές ενώσεις θα προσροφούνται ισχυρότερα στη στατική φάση και
συνεπώς οι άπολες ενώσεις θα εκλούονται πρώτες από τη στήλη.
Σύνοψη: Σε οποιοδήποτε διαχωρισμό προπορεύονται τα μόρια ουσιών με πολικότητα αντίστοιχης της κινητής
φάσης, ενώ καθυστερούν αυτά με πολικότητα αντίστοιχης της στατικής φάσης. Στη χρωματογραφία ισχύει η
αρχή «τα όμοια διαχωρίσουν τα όμοια», που εφαρμόζεται εδώ με την έννοια ότι πολικές στήλες απαιτούνται για
το διαχωρισμό πολικών ενώσεων και το αντίστροφο.
8.2.6.2 Η HPLC Αντίστροφης Φάσης
Το αντίστροφο της HPLC κανονικής φάσης, είναι η HPLC αντίστροφης φάσης (reversed phase HPLC ή
RP-HPLC) (Σχήμα 8.9). Εδώ ο διαχωρισμός οφείλεται στην προσρόφηση υδρόφοβων μορίων σε υδρόφοβη
στατική φάση, υπό την ροή κινητής φάσης αυξημένης πολικότητας. Η στατική φάση αποτελείται από οξείδιο
πυριτίου συζευγμένο με διάφορες ομάδες, όπως αλκύλια (ακετύλιο, δεκαοκτύλιο, οκτύλιο), φαινύλιο, διόλες,
αμινομάδες, κυανομάδες κ.α., οι οποίες προσδίδουν στη στατική φάση ιδιαίτερα άπολο χαρακτήρα. Η κινητή
φάση αποτελείται από μείγματα οργανικών διαλυτών (μεθανόλη, ακετονιτρίλιο, κ.ά.) με υδατικά ρυθμιστικά
διαλύματα ή με νερό. Η έκλουση των προσροφημένων μορίων από τη χρωματογραφική στήλη επιτυγχάνεται
με τη μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης κατά την αύξηση του περιεχόμενου σε αυτή ποσοστού του
οργανικού διαλύτη. Η μείωση της πολικότητας της κινητής φάσης ελαττώνει την υδρόφοβη αλληλεπίδραση
230
μεταξύ των προσροφημένων μορίων και της στατικής φάσης: είναι προφανές ότι όσο πιο άπολο είναι ένα
διαχωριζόμενο μόριο, τόσο περισσότερο χρόνο θα αλληλεπιδράσει με την άπολη στατική φάση και τόσο
υψηλότερη θα είναι η συγκέντρωση του οργανικού διαλύτη στην κινητή φάση, που θα απαιτείται για να
επιτευχθεί η αποδέσμευσή του. Ως αποτέλεσμα επιτυγχάνεται η εκλεκτική έκλουση των άπολων μορίων από
τη χρωματογραφική στήλη (Σχήμα 8.9). Είναι προφανές ότι με αντιστροφή της πολικότητας της κινητής και
της στατικής φάσης, αντιστρέφεται και η σειρά έκλουσης των τριών συστατικών του μίγματος (Σχήματα 8.8
και 8.9).
Σχήμα 8.9 Xρωματογραφικός διαχωρισμός, με HPLC αντίστροφης φάσης, μίγματος αποτελούμενου από μόρια τριών
τύπων που εδώ παρουσιάζονται ως κίτρινες, κόκκινες και μπλε ζώνες. Τα μόρια αυτά ακολουθούν την παρακάτω σειρά
αυξανόμενης πολικότητας: κίτρινο > κόκκινο > μπλε.
Όπως αναφέρθηκε, στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, η επιφάνεια του

προσροφητικού μέσου έχει τροποποιηθεί με την πρόσδεση μακριών αλυσίδων υδρόφοβων μορίων (Σχήμα
8.10). Πολύ κοινώς τέτοια μόρια είναι υδρογονάνθρακες – τυπικά αποτελούμενοι από 4 ή 8 ή 18 άτομα
άνθρακα - μετατρέποντας την στατική φάση σε άπολη. Οι στήλες με τα παραπάνω προσροφητικά μέσα
ονομάζονται C4 ή C8 ή C18, αντίστοιχα. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με RP-
HPLC βρίσκουν οι στήλες C18.
Σχήμα 8.10 Σχηματική αναπαράσταση της στατικής φάσης από την οποία αποτελείται μία στήλη RP-HPLC C18.
Μη πολικά μόρια στο διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες

υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η
χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC και
γενικότερα η περισσότερο κοινώς χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού ουσιών για αναλυτικούς
σκοπούς.
231
Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης, στην επιφάνεια του προσροφητικού υλικού
βρίσκονται προσδεμένες μακριές αλυσίδες υδρογονάνθρακα. Η κινητή φάση είναι πολική. Μη πολικά μόρια στο
διαχωριζόμενο δείγμα προσροφούνται ισχυρά στις αλυσίδες υδρογονάνθρακα, ενώ τα πολικά μόρια κινούνται
ταχύτερα διαμέσου της στήλης και εκλούονται νωρίτερα. Η χρωματογραφία HPLC αντίστροφης φάσης είναι η
πιο κοινώς χρησιμοποιούμενη μορφή της HPLC. Περισσότερες εφαρμογές στο διαχωρισμό μικρών μορίων με
RP-HPLC βρίσκουν οι στήλες C18.
8.3 Οργανολογία HPLC
Μία βασική εργαστηριακή διάταξη υγρής χρωματογραφίας περιλαμβάνει τα παρακάτω επιμέρους μέρη και
φαίνεται στη Φωτογραφία 8.3 και στο Σχήμα 8.11:
 Περιέκτες διαλυτών: Οι διαλύτες που θα αποτελέσουν την κινητή φάση βρίσκονται αποθηκευμένοι σε
ειδικές φιάλες. Η κινητή φάση είναι απαραίτητη για τη μεταφορά των δειγμάτων μέσα από το σύστημα
της υγρής χρωματογραφίας.
 Απαερωτής κενού: Ο απαερωτής εξασφαλίζει την απαέρωση της κινητής φάσης, ώστε να είναι εφικτός ο
έλεγχος της πίεσης στη χρωματογραφική στήλη.
 Αντλία (pump): Η αντλία εξασφαλίζει τη συνεχή άντληση και προώθηση της κινητής φάσης διαμέσου του
συνόλου του συστήματος, από τους περιέκτες των διαλυτών μέχρι το δοχείο συλλογής των αποβλήτων
του συστήματος, υπό ρυθμιζόμενη υψηλή πίεση και ροή.
 Σύστημα εισαγωγής δείγματος (injection system/ injector valve): περιλαμβάνει βρόγχο σταθερού όγκου ή
αυτόματο σύστημα εισαγωγής, μεταβλητού (προεπιλεγμένου) όγκου έγχυσης. Βρίσκεται πριν τη
χρωματογραφική στήλη και επιτρέπει την εισαγωγή του δείγματος στη ροή της κινητής φάσης.
 Χρωματογραφική στήλη (column): στη στήλη επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός του μίγματος στα συστατικά
του. Εφόσον ο διαχωρισμός καθορίζεται και από τη θερμοκρασία, η στήλη εμπεριέχεται σε
θερμοστατούμενο κλίβανο (column oven).
 Ανιχνευτής (detector): Η ανίχνευση των ουσιών που εξέρχονται της στήλης γίνεται συνεχώς, κυρίως με
φασματομετρία UV/Vis, όπου το παραγόμενο από τον ανιχνευτή φως προσπίπτει σε κυψελίδα συνεχούς
ροής από χαλαζία και μετριέται η απορρόφηση του φωτός.
Οι ανιχνευτές που κυρίως χρησιμοποιούνται στην HPLC είναι οι παρακάτω:
 ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους (UV/Vis Detector),

 ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων (Diode Array Detector ή DAD),
 αγωγιμομετρικοί ανιχνευτές (Conductivity Detector),
 ανιχνευτές δείκτη διάθλασης (Refractive Index Detector)
 φασματογράφοι μάζας MS (Mass Spectroscopy Detector ή MS Detector)
 ανιχνευτής Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Ανιχνευτής ΝΜR) (Nuclear Magnetic Resonance De-
tector, NMR Detector),
 ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές (Electrochemical Detector),
 φθορισμομετρικοί ανιχνευτές (Fluorescence Detector).
Oι ανιχνευτές ορατού-υπεριώδους και οι ανιχνευτές συστοιχίας φωτοδιόδων, που είναι και οι πιο
συχνά απαντούμενοι, έχουν περιγραφεί στην Ενότητα 7.2. Επίσης, αρκετά συχνά χρησιμοποιούνται και
φασματογράφοι μάζας.
 Καταγραφικό: Το μετρούμενο σήμα που καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια μιας ανάλυσης
στέλνεται στη συνέχεια σε κάποιον υπολογιστή που παράγει το χρωματογράφημα της ανάλυσης.
 Δεξαμενή αποβλήτων: Είναι η δεξαμενή όπου συλλέγεται η κινητή φάση μαζί με τα περιεχόμενα
συστατικά του δείγματος. Όταν είναι επιθυμητή η συλλογή κλασμάτων της κινητής φάσης, (όπως στην
προπαρασκευαστική HPLC), χρησιμοποιείται αυτόματος κλασματοσυλλέκτης (fraction collector).
232
Φωτογραφία 8.3 Τυπική εργαστηριακή διάταξη χρωματογραφίας HPLC (του οίκου Dionex).
Σχήμα 8.11 Διάγραμμα εργαστηριακής διάταξης υγρής χρωματογραφίας HPLC.
Σύνοψη: Η διέλευση των εκλουόμενων ουσιών ανιχνεύεται με τη βοήθεια ανιχνευτή που βρίσκεται αμέσως
μετά τη χρωματογραφική στήλη. Συνηθέστερα πρόκειται για ανιχνευτή UV/Vis, που σε μία κυψελίδα συνεχούς
ροής, η ποσότητα του απορροφούμενου φωτός θα εξαρτάται από την ουσία που διέρχεται διαμέσου της ακτίνας
της προσπίπτουσας ακτινοβολίας κάθε στιγμή. Οι διαλύτες της κινητής φάσης δε θα πρέπει να απορροφούν στο
μήκος κύματος, όπου παρακολουθείται η έκλουση της ουσίας που μας ενδιαφέρει.
8.4 Σύνοψη των βασικών σταδίων της Χρωματογραφίας Στήλης
Τα βασικά στάδια που περιγράφηκαν για το διαχωρισμό και την ανίχνευση των συστατικών ενός μίγματος
κατά την ανάλυση του με χρωματογραφία στήλης συνοψίζονται στα παρακάτω:
1. Kαθορισμένη ποσότητα δείγματος ενίεται στην κινητή φάση στην αρχή της στήλης.
2. Το δείγμα μετακινείται στη στήλη υπό τη συνεχή ροή της κινητής φάσης.
3. Τα επιμέρους συστατικά του δείγματος κατανέμονται μεταξύ της στατικής και της κινητής φάσης.
4. Το κλάσμα κάθε συστατικού που βρίσκεται στην κινητή φάση μετακινείται υπό τη συνεχή ροή της κινη-
τής φάσης.
5. Για το κάθε μόριο την κάθε στιγμή επέρχεται νέος καταμερισμός μεταξύ κινητής και στατικής φάσης.
233
6. Η ταχύτητα μετακίνησης των μορίων κάθε συστατικού εξαρτάται από το κλάσμα του χρόνου παραμονής
τους στην κινητή φάση ως προς το χρόνο παραμονή τους στην στατική φάση και είναι ανάλογη του συ-
ντελεστή κατανομής του συστατικού στις δύο φάσεις.
7. Tα επιμέρους συστατικά, με την προϋπόθεση ότι έχουν διαφορετικούς συντελεστές κατανομής, μετακι-
νούνται με διαφορετική μέση ταχύτητα μέσα στη στήλη, με αποτέλεσμα να διαχωρίζονται σε ζώνες.
8. Τα συστατικά εξέρχονται από τη στήλη και ανιχνεύονται από κατάλληλο ανιχνευτή που βρίσκεται στην
έξοδο της στήλης.
8.4.1 Σύγκριση HPLC/TLC
Στον Πίνακα 8.1 σημειώνονται τα κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση
με την HPLC, των δύο χρωματογραφικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται περισσότερο στην κλινική
ανάλυση.
Κριτήριο TLC LC
Κόστος εργαστηριακού εξοπλισμού Χαμηλό Υψηλό
Κατανάλωση διαλύτη Χαμηλή Υψηλή
Ευελιξία σε σχέση με ποικιλία αναλυόμενων ουσιών, συμβατότητα με pH και
Μεγάλη Πιο περιορισμένη
διαλύτες
Δυνατότητα εφαρμογής των δειγμάτων χωρίς προηγούμενη κατεργασία Ναι Όχι
Ικανότητα παράλληλης ανάλυσης περισσότερων δειγμάτων Ναι Όχι
Δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισμού Ημιποσοτική Ποσοτική μέθοδος
μέθοδος
Ευαισθησία Κατά κανόνα Κατά κανόνα
χαμηλότερη υψηλότερη
Επαναληψιμότητα Χαμηλότερη Υψηλή
Ταχύτητα ανάλυσης ανά δείγμα Χαμηλή Υψηλή
Διαχωριστική ικανότητα Χαμηλή Υψηλή
Πίνακας 8.1 Κυριότερα συγκριτικά πλεονεκτήματα / μειονεκτήματα της TLC σε σχέση με την HPLC. Με έντονο χρώμα
είναι σημειωμένα τα πλεονεκτήματα σε σχέση με τα μειονεκτήματα. Ο πίνακας αναφέρεται στη συζευγμένη με
(φασματοσκοπικές κυρίως) μεθόδους ανίχνευσης HPLC.
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι είναι σημαντικό να γνωρίζει ο κλινικός επιστήμονας και τις δύο αυτές
κύριες χρωματογραφικές τεχνικές ανάλυσης. Η δε χρωματογραφία HPLC είναι η κατεξοχήν
χρωματογραφική αναλυτική τεχνική, που χρησιμοποιείται σήμερα στην κλινική (κι όχι μόνο) έρευνα.
8.5 Βασικές έννοιες που περιγράφουν μία Xρωματογραφική ανάλυση
Παρακάτω παρουσιάζονται σύντομα οι σημαντικότερες έννοιες, που περιγράφουν μία

χρωματογραφική ανάλυση:
Χρωματογράφημα
Όπως ήδη αναπτύχθηκε, σε κάθε χρωματογραφικό διαχωρισμό μια διαχωριζόμενη ουσία κατανέμεται μεταξύ
της στατικής και της κινητής φάσης, κινούμενη ταυτόχρονα προς την έξοδο της στήλης (ή γενικότερα προς
το άκρο της στατικής φάσης) υπό την ροή της κινητής φάσης. Έτσι, κατά τον διαχωρισμό δημιουργούνται
μετακινούμενες ζώνες μέσα στη στήλη, οι οποίες τελικά ανιχνεύονται κατά τη δίοδο τους από τον ανιχνευτή
και καταγράφονται ως διακριτές κορυφές. Η γραφική παράσταση του μετρούμενου από τον ανιχνευτή
234
μεγέθους προς το χρόνο μετά την εισαγωγή του δείγματος στη στήλη, καλείται χρωματογράφημα
(chromatograph).
Κάθε μόριο μίας ουσίας κατά τη μετανάστευσή του μέσω της στήλης μετακινείται
«ανταλλασσόμενο» πάρα πολλές φορές μεταξύ της κινητής φάσης (όπου διαλύεται) και της στατικής φάσης
(όπου προσροφάται ή κατανέμεται ή δεσμεύεται λόγω αγχιστείας κ.λπ.) και αντίστροφα (Σχήμα 8.1). Μερικά
μόρια της ίδιας ουσίας κινούνται με λίγο διαφορετική ταχύτητα, επειδή τυχαία περνούν στην κινητή φάση
λίγο περισσότερο χρόνο από τον μέσο χρόνο παραμονής, αλλά και λόγω της πολλαπλότητας των διαδρομών,
που μπορεί να ακολουθήσει ένα μόριο μέσα στη στήλη (Σχήμα 8.12). Ως αποτέλεσμα παρατηρείται μια
συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή, που αποδίδει τη μέση
συμπεριφορά των μορίων της ουσίας. Η κατανομή αυτή προσεγγίζει μία κατανομή κατά Gauss δίνοντας το
γνωστό κωδωνοειδές σχήμα των κορυφών σε ένα χρωματογράφημα (Σχήμα 8.13).
Το εύρος της ζώνης αυξάνεται καθώς αυτή κινείται προς την έξοδο της στήλης, διότι παρέχεται
περισσότερος χρόνος κατά τον οποίο λαμβάνουν χώρα περισσότερες μετακινήσεις μορίων μεταξύ της
στατικής και της κινητής φάσης. Το εύρος της ζώνης λοιπόν είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της
ουσίας στη στήλη (Σχήμα 8.14) και αντιστρόφως ανάλογο προς την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης.
Σχήμα 8.12 Σχηματική αναπαράσταση της πορείας δύο διαφορετικών μορίων της ίδιας ουσίας διαμέσου της
χρωματογραφικής στήλης. Καθώς οι πορείες που ακολουθούν έχουν λίγο διαφορετικά μήκη, το ένα μόριο θα προπορεύεται
ελαφρώς του άλλου, με αποτέλεσμα μία συμμετρική διασπορά της κατανομής των μορίων γύρω από μια μέση τιμή.
Σχήμα 8.13 Χρωματογράφημα (χρωματογράφημα) που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που
περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Η
κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε διαφορετικό συστατικό του μίγματος.
235
Σχήμα 8.14 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία
κανονικής φάσης (Α) και αντίστροφης φάσης (Β). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών είναι α>β>γ,
ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το Β.
Παρατηρούμε ότι το εύρος της κορυφής είναι ανάλογο προς τον χρόνο παραμονής της κάθε ουσίας στη στήλη. Αυτό είναι
περισσότερο διακριτό στο συγκεκριμένο χρωματογράφημα για τα συστατικά α και γ.
Σύνοψη: Η γραφική παράσταση της απόκρισης του ανιχνευτή συναρτήσει του χρόνου μετά την εισαγωγή του
δείγματος στη στήλη καλείται χρωματογράφημα. Στο χρωματογράφημα η κάθε κορυφή αντιστοιχεί σε
διαφορετική ουσία. Το σύνολο των μορίων κάθε διαχωριζόμενης ουσίας εξέρχονται από τη χρωματογραφική
στήλη σε μικρό εύρος χρόνων, δίνοντας διευρυμένες κωδωνοειδείς κορυφές με κατανομή κατά Gauss.
Χρόνος κατακράτησης ή χρόνος ανάσχεσης, tR
Ο χρόνος κατακράτησης (retention time) tR, είναι ο χρόνος που απαιτείται, ώστε μία συγκεκριμένη ουσία να
«ταξιδέψει» διαμέσου της στήλης από την είσοδο αυτής μέχρι τον ανιχνευτή. Η εκκίνηση μέτρησης του
χρόνου κατακράτησης γίνεται την στιγμή που το δείγμα εισάγεται με ένεση στη στήλη. Το χρονικό διάστημα
μετά την ένεση και μέχρι το μέγιστο της κορυφής έκλουσης μίας ουσίας ονομάζεται χρόνος κατακράτησης
(Σχήμα 8.15).
Ο χρόνος κατακράτησης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μιας ουσίας, υπό αυστηρά
καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Έτσι, για μία συγκεκριμένη ουσία ο χρόνος κατακράτησης
καθορίζεται από:
- την πίεση που ασκείται στη στήλη (η οποία με τη σειρά της καθορίζει την ταχύτητα ροής της κινητής φά-
σης),
- την φύση της στατικής φάσης (υλικό πληρώσεως και μέγεθος σωματιδίων αυτού),
- την ακριβή σύσταση της κινητής φάσης (διότι η σύσταση καθορίζει το συντελεστή κατανομής μεταξύ
κινητής και στατικής φάσης),
- τη θερμοκρασία της στήλης (καθότι ο συντελεστής κατανομής εξαρτάται από τη θερμοκρασία του διαχω-
ρισμού).
Σύνοψη: Σε μία χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και
μέγεθος σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης, θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται επακριβώς,
προκειμένου μία χρωματογραφική ανάλυση να είναι επαναλήψιμη.
Ο χρόνος παραµονής των µορίων του δείγµατος στην κινητή φάση είναι ο ίδιος για όλα τα
συστατικά του δείγµατος και ονοµάζεται νεκρός χρόνος, t0. Ο νεκρός χρόνος είναι ο χρόνος που απαιτείται
για ένα µη κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό να διέλθει από τη στήλη, δηλαδή με άλλα λόγια
είναι ο χρόνος κατακράτησης ενός συστατικού που δεν αλληλεπιδρά καθόλου με τη στατική φάση της
στήλης. Προφανώς η ταχύτητα μετανάστευσης της μη κατακρατούμενης ουσίας είναι ίση προς τη μέση
ταχύτητα των μορίων της κινητής φάσης. Σε ένα χρωματογράφημα, όπως αυτό του Σχήματος 8.15, ένα µη
κατακρατούµενο από τη στατική φάση συστατικό αποτυπώνεται ως μία κορυφή, που εξέρχεται πολύ
σύντομα μετά την ένεση του δείγματος.
236
Είναι προφανές ότι ο καθαρός χρόνος παραμονής ενός συστατικού στη στατική φάση για ένα
συστατικό που αλληλεπιδρά σε κάποιο βαθμό με αυτήν (ανηγµένος χρόνος κατακράτησης [tR’]) ισούται µε
τη διαφορά του χρόνου κατακράτησης και του νεκρού χρόνου, δηλαδή:
tR’= tR-t0 (Εξίσωση 8.2).
Σύνοψη: Υπό καθορισμένες χρωματογραφικές συνθήκες ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας αποτελεί
χαρακτηριστική σταθερά της ουσίας και χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή της.
Σχήμα 8.15 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού φαρμάκου το οποίο περιέχει
παρακεταμόλη (ακεταμινοφαίνη), καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται η ταυτότητα της κάθε κορυφής και οι
χρόνοι κατακράτησης της κάθε ουσίας-δραστικού συστατικού (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC.
Σημειώνεται επίσης, ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t0.
Συντελεστής κατακράτησης ή παράγοντας κατακράτησης ή παράγοντας χωρητικότητας
Ο συντελεστής κατακράτησης k’ (retention factor ή capacity factor) επίσης, περιγράφει τη μετανάστευση

των διαλυμένων ουσιών στη στήλη και αποτελεί ποσοτικό μέτρο της τάσης ενός συγκεκριμένου είδους
μορίων να προσροφάται στη στατική φάση. Χρησιμοποιείται πολλές φορές αντί του χρόνου ανάσχεσης, διότι
εξαρτάται λιγότερο από τις πειραματικές συνθήκες της ανάλυσης. Ο παράγοντας κατακράτησης ισούται µε
τον λόγο του χρόνου που παραµένει η ουσία Α στη στατική φάση προς τον χρόνο που αυτή παραµένει στην
κινητή φάση:
𝑡𝑅′ 𝑡𝑅 −𝑡𝑜
𝑘′ = 𝑡0
= 𝑡𝑜
Όπου tR ο χρόνος κατακράτησης της προσδιοριζόμενης ουσίας, tR’ ο ανηγμένος χρόνος

κατακράτησης και t0 είναι ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης. Στο Σχήμα 8.16 φαίνεται ο τρόπος υπολογισμού
του παράγοντα κατακράτησης δύο ουσιών.
237
Σχήμα 8.16 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη,
καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη. Σημειώνονται ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας η οποία αντιστοιχεί στις κορυφές 1
και 4 και ο νεκρός χρόνος της ανάλυσης t0 (προσαρμοσμένο από τεχνικό δελτίο του οίκου SIELC). Ενδεικτικά,
σημειώνεται επίσης, ο τρόπος υπολογισμού του παράγοντα κατακράτησης των ουσιών που αντιστοιχούν στις κορυφές 1 και
4.
Κατά την ανάπτυξη χρωματογραφικών μεθόδων, στοχεύουμε να εξασφαλίσουμε παράγοντες

κατακράτησης με τιμές μεταξύ 5 και 20 για καθένα από τα διαχωριζόμενα συστατικά. Τέτοιοι παράγοντες
κατακράτησης εγγυώνται καλό διαχωρισμό κι όχι πολύ μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Για τιµές k’ < 5, η
έκλουση είναι αρκετά ταχεία και δεν επιτρέπει ακριβή προσδιορισµό του tR. Για τιµές k’ > 20, η ουσία
κατακρατείται πολύ ισχυρά από τη στατική φάση, µε αποτέλεσµα πιθανότατα µη ικανοποιητικό διαχωρισµό
και μεγάλους χρόνους ανάλυσης. Στο χρωματογράφημα του Σχήματος 8.16 ο παράγοντας κατακράτησης για
την ταχύτερα εκλουόμενη κορυφή (Kορυφή 1) είναι 6,4 (> 5), ενώ για την κορυφή που εκλούεται βραδύτερα
(Kορυφή 4) είναι 28,44 (> 20). Στην περίπτωση της κορυφής 4, εφόσον δεν υπάρχει στη στήλη άλλος
αναλύτης, εξίσου ισχυρά κατακρατούμενος, ώστε να παρατηρείται αλληλεπικάλυψη κορυφών, ο μεγάλος
παράγοντας κατακράτησης δεν εμποδίζει την ανάλυση. Ο μεγάλος όμως χρόνος ανάλυσης που απαιτείται
είναι ανεπιθύμητος λόγω της καθυστέρησης της ανάλυσης, αλλά και της μεγαλύτερης κατανάλωσης
διαλυτών (και συνεπώς της αύξησης του κόστους) που αυτός συνεπάγεται.
Με βάση τα όσα αναφέρθηκαν παραπάνω, ο παράγοντας κατακράτησης µπορεί να µεταβληθεί
κυρίως µε µεταβολή της ταχύτητας ροής της κινητής φάσης, της θερµοκρασίας της στήλης και του
συστήματος των διαλυτών. Έτσι, μεταβάλλοντας τις χρωματογραφικές συνθήκες στην περίπτωση της
ανάλυσης του Σχήματος 8.16 θα μπορούσαμε να επιτύχουμε εξίσου ικανοποιητικό διαχωρισμό με
μικρότερους όμως παράγοντες κατακράτησης, κυρίως για τους ισχυρά κατακρατούμενους αναλύτες, δηλ. με
μεγαλύτερη οικονομία χρόνου και διαλυτών.
Εύρος κορυφής (peak width), W
Κατά το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος μέσω μίας στήλης συμβαίνει αραίωση του δείγματος
που ενέθηκε. Ως αποτέλεσμα, η ζώνη που περιέχει το καθένα από τα διαχωρισμένα συστατικά διευρύνεται
διαρκώς κατά την εξέλιξη του διαχωρισμού. Έτσι η κάθε κορυφή που καταγράφεται από τον ανιχνευτή έχει
238
ένα συγκεκριμένο εύρος, που καλείται εύρος κορυφής (peak width), W. Το εύρος της κορυφής υπολογίζεται
γραφικά, όταν οι κορυφές αποδοθούν κατά προσέγγιση ως τρίγωνα. Ο τρόπος υπολογισμού του εύρους της
κορυφής για τα συστατικά 3 και 4 του αναλγητικού που αναλύθηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο των
Σχημάτων 8.13, 8.15 και 8.16, φαίνεται στο Σχήμα 8.17.
Διαχωριστική ικανότητα στήλης (Resolution), Rs
Η διαχωριστική ικανότητα (resolution), Rs, αποτελεί ποσοτικό μέτρο της ικανότητας μίας στήλης να
διαχωρίσει δύο προσδιοριζόμενες ουσίες (που αναλύονται υπό ένα συγκεκριμένο πρωτόκολλο). Δύο ουσίες
θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως, όταν το Rs είναι ίσο τουλάχιστον με 1,5.
Υπολογίζεται από τη σχέση:
𝑡𝑅2 −𝑡𝑅1
𝑅𝑠 = (Εξίσωση 8.4)
0,5 (𝑊2 +𝑊1 )
Όπου tR2 είναι ο χρόνος κατακράτησης μιας ουσίας και tR1 ο χρόνος κατακράτησης της ουσίας που
εκλούεται αμέσως πριν στο χρωματογράφημα. W2 και W1 είναι το εύρος της αντίστοιχης κορυφής
(προπορευόμενης και επακόλουθης) στη βάση της κορυφής.
Σχήμα 8.17 Γραφικός υπολογισμός του εύρους των κορυφών σε χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση με
RP-HPLC αναλγητικού που περιέχει παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη (προσαρμοσμένο από τεχνικό
δελτίο του οίκου SIELC, και υπολογισμός της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης για τα συστατικά 3 και 4.
Στo Σχήμα 8.18 φαίνεται η μεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών (συστατικών) σε
χρωματογράφημα μίγματος τους, με μεταβολή της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης κατά την αλλαγή
των χρωματογραφικών συνθηκών.
239
Σχήμα 8.18 Mεταβολή της επικάλυψης των κορυφών δύο αναλυτών σε χρωματογράφημα μίγματός τους, με μεταβολή της
διαχωριστικής ικανότητας της στήλης από Rs=0,5 (Α) σε Rs=1,0 (Β) και Rs=1,5 (Γ), κατά την αλλαγή των
χρωματογραφικών συνθηκών.
Σε ένα διαχωρισμό όπου η διαχωριστική ικανότητα μεταξύ δύο αναλυτών είναι ίση με 1,0, υπάρχει 4%
αλληλεπικάλυψη των κορυφών. Σε μικρότερες τιμές διαχωριστικής ικανότητας η αλληλεπικάλυψη είναι
σημαντική, ενώ πρακτικά δύο κορυφές θεωρείται ότι διαχωρίζονται πλήρως όταν Rs ≥ 1,5.
Βλέπουμε ότι στο χρωματογραφικό διαχωρισμό του Σχήματος 8.18, η διαχωριστική ικανότητα
της στήλης είναι πολύ ικανοποιητική, όταν Rs ≥ 1,5.
Σύνοψη: Η διαχωριστική ικανότητα Rs μιας στήλης αποτελεί ένα ποσοτικό μέτρο της ικανότητάς της να
διαχωρίσει δύο αναλύτες. Πρακτικά ο διαχωρισμός δύο ουσιών θεωρείται πλήρης όταν Rs ≥ 1,5.
Αριθμός θεωρητικών πλακών και ύψος θεωρητικής πλάκας
Ο αριθμός των θεωρητικών πλακών (plate number), N, και το ύψος της θεωρητικής πλάκας (plate
height), H, είναι καθαρά θεωρητικά μεγέθη. Χρησιμοποιούνται προκειμένου να συγκριθεί η αποδοτικότητα
χρωματογραφικών στηλών.
Το μοντέλο των θεωρητικών πλακών κάνει την υπόθεση ότι μία χρωματογραφική στήλη
αποτελείται από έναν μεγάλο αριθμό ξεχωριστών πλακών (μικρών τμημάτων στήλης). Η είναι το μήκος της
στήλης που αντιστοιχεί σε μία θεωρητική πλάκα, το οποίο καλείται ύψος της θεωρητικής πλάκας. Ν είναι ο
αριθμός των θεωρητικών πλακών που υπάρχουν σε μία στήλη, όπως φαίνεται στο Σχήμα 8.19. Όσο
περισσότερο πακτωμένο είναι το πληρωτικό υλικό στη στήλη και όσο μικρότερη είναι η διάμετρος των
σωματιδίων του, τόσο μικρότερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής πλάκας. Κάθε μόριο μιας ουσίας κατά τη
μετανάστευσή του μέσω της στήλης, μετακινείται όντας σε ισορροπία μεταξύ της κινητής φάσης (όπου
διαλύεται) και της στατικής φάσης της κάθε θεωρητικής πλάκας με την οποία αλληλεπιδρά. Είναι προφανές
ότι όσο μικρότερη είναι η τιμή του μεγέθους Η, τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των θεωρητικών πλακών
Ν που εμπεριέχονται σε μία στήλη και συνεπώς τόσο αποτελεσματικότερος είναι ο διαχωρισμός. Είναι
σημαντικό να έχει κανείς κατά νου ότι οι θεωρητικές πλάκες δεν υπάρχουν στην πραγματικότητα μέσα σε
μία στήλη, απλώς βοηθούν στην κατανόηση των διεργασιών σε αυτή.
Τα μεγέθη Ν και Η σχετίζονται επίσης με τη διεύρυνση των κορυφών (δηλαδή με το εύρος W) και
συνδέονται με τις σχέσεις:
𝐿 𝐿 𝑊2
𝐻= = (Εξίσωση 8.5)
𝑁 16 𝑡𝑅 2
𝐿 16 𝑡𝑅 2
Ν= = (Εξίσωση 8.6)
𝛨 𝑊2
όπου L το μήκος της στατικής φάσης και W το εύρος της κορυφής.
240
Με βάση τις παραπάνω εξισώσεις, τα μεγέθη Ν και Η μπορούν να υπολογισθούν για το κάθε
συστατικό από το χρωματογράφημα της ανάλυσης.
Από τις παραπάνω σχέσεις διαπιστώνεται ότι όσο μεγαλύτερο είναι το ύψος μίας θεωρητικής
πλάκας, τόσο πιο διευρυμένες εμφανίζονται οι κορυφές κατά το διαχωρισμό. Εφόσον η αποδοτικότητα μίας
στήλης είναι ανάλογη του Ν και αντιστρόφως ανάλογη του Η, αλλά και η διεύρυνση των κορυφών είναι
ανάλογη του Η, τότε, είναι επιθυμητή η χρήση στηλών με μικρό Η και μεγάλο Ν.
Σχήμα 8.19 Σχηματική απόδοση της έννοιας των χρωματογραφικών θεωρητικών πλακών.
Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς

αναλύτες σε ένα μείγμα.
Τα μεγέθη Ν και Η είναι αυτά που κατεξοχήν αναφέρονται από τους οίκους χρωματογραφικού
εξοπλισμού, ως μέτρα αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας μίας στήλης να διαχωρίζει συγκεκριμένη
ομόλογη σειρά αναλυτών. Ως παράδειγμα, μια αναλυτική χρωματογραφική στήλη με Ν = 40.000 πλάκες/ m
προτιμάται σε σχέση με αυτή με N = 30.000 πλάκες/m. Η πρώτη παράγει επίσης στενότερες κορυφές για το
ίδιο συστατικό, υπό τις ακριβώς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Θα πρέπει όμως να σημειωθεί ότι, εάν μία
στήλη διαχωρίζει αποτελεσματικά μία συγκεκριμένη ομόλογη σειρά χημικών ενώσεων (π.χ. τα αμινοξέα),
δεν σημαίνει ότι είναι εξίσου καλή στο διαχωρισμό άλλης ομόλογης σειράς χημικών ενώσεων, όπως π.χ. τις
αλκοόλες.
Σύνοψη: Μέτρο της αποδοτικότητας μίας στήλης αποτελούν τα θεωρητικά μεγέθη N και H. Η αποδοτικότητα
μίας στήλης είναι ανάλογη του αριθμού των πλακών που θεωρητικά περιέχει η στήλη (Ν) και αντιστρόφως
ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Επίσης, η διεύρυνση των χρωματογραφικών κορυφών
είναι ανάλογη του θεωρητικού ύψους της κάθε πλάκας (Η). Οι χρωματογραφικές στήλες έχουν διαφορετικό
αριθμό θεωρητικών πλακών για διαφορετικούς αναλύτες σε ένα μίγμα.
8.6 Ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός με Χρωματογραφία HPLC

8.6.1 Ποιοτικός προσδιορισμός
Ο ποιοτικός προσδιορισμός έχει ως σκοπό να διερευνήσει και πιστοποιήσει την ταυτότητα μίας ουσίας που
διαχωρίζεται με HPLC από τα υπόλοιπα συστατικά του δείγματος.
Υπάρχουν δύο διακριτές περιπτώσεις:
1. Όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού του δείγματος που θέλουμε να διακρίνουμε, οπότε η
κορυφή του συστατικού που μας ενδιαφέρει πρέπει να ταυτοποιηθεί. Στην περίπτωση αυτή η ταυτοποίηση
γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής (ή καλύτερα τον συντελεστή κατακράτησης) που
λαμβάνεται κατά την ανάλυση δείγματος και προτύπου της καθαρής ουσίας (Σχήμα 8.20). Είναι
απαραίτητο, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι έγκυρη, η ανάλυση δείγματος και προτύπου να
διεξαχθεί υπό τις ακριβώς ίδιες πειραματικές συνθήκες. Αυτό σημαίνει χρησιμοποιώντας την ίδια στήλη
(σε ό, τι αφορά στα τεχνικά χαρακτηριστικά της, συμπεριλαμβανομένου και του πληρωτικού υλικού), ίδια
σύσταση και ροή κινητής φάσης, καθώς και ίδια θερμοκρασία ανάλυσης. Επίσης, τα γεωμετρικά
241
χαρακτηριστικά των δύο κορυφών θα πρέπει να είναι όμοια, προκειμένου η αντιστοίχιση να είναι
ασφαλής, και γι’ αυτό το λόγο το συστατικό ενδιαφέροντος στο πρότυπο και στο δείγμα θα πρέπει να
βρίσκεται σε παρόμοια συγκέντρωση. Εάν το χρωματογραφικό σύστημα έχει έναν επιλεκτικό ανιχνευτή,
όπως ανιχνευτή συστοιχίας διόδων ή ανιχνευτή φθορισμού, το λαμβανόμενο φάσμα της κορυφής
ενδιαφέροντος ή το μετρούμενο σήμα επιβεβαιώνουν την ταυτοποίηση, σε συνδυασμό με τον συντελεστή
κατακράτησης. Για μεγαλύτερη ασφάλεια στην αντιστοίχιση, ιδίως όταν το χρωματογραφικό σύστημα
δεν συνδυάζεται με κάποιον επιλεκτικό ανιχνευτή, θα πρέπει το δείγμα και το πρότυπο να αναλυθούν σε
μία παράλληλη ανάλυση υπό διαφορετικές χρωματογραφικές συνθήκες, σε σχέση με την πρώτη ανάλυση.
Και στη δεύτερη ανάλυση ο χρόνος ανάσχεσης προτύπου και κορυφής ενδιαφέροντος θα πρέπει να
συμπίπτουν απόλυτα. Τέλος, μια άλλη μεθοδολογία που εφαρμόζεται κοινώς για την ταυτοποίηση
κορυφής, όταν είναι γνωστή η ταυτότητα του συστατικού που μας ενδιαφέρει, είναι ο εμβολιασμός του
δείγματος με το γνωστό πρότυπο. Σ’ αυτή τη μεθοδολογία η απουσία εμφάνισης νέας κορυφής, και
παράλληλα η ενίσχυση της υπάρχουσας κορυφής του συστατικού με διατήρηση της συμμετρίας της,
επιβεβαιώνει την ταυτότητα της κορυφής.
2. Όταν δεν είναι γνωστή η ταυτότητα των συστατικών του δείγματος. Στην περίπτωση αυτή ενδείξεις για
την ταυτότητα της κορυφής λαμβάνονται με σύζευξη του διαχωρισμού με HPLC με κάποιον ανιχνευτή
που βοηθάει στην ταυτοποίηση, όπως ανιχνευτή NMR ή MS. Θα πρέπει να τονισθεί ότι επιβεβαίωση της
ταυτότητας με τουλάχιστον δύο ή συνήθως περισσότερες χημικές τεχνικές είναι απαραίτητη.
Σύνοψη: Ο ποιοτικός προσδιορισμός γνωστής ουσίας που διαχωρίζεται με HPLC γίνεται με βάση τον κοινό
χρόνο ανάσχεσης και τη κοινή συμμετρία της κορυφής αυτής στο δείγμα και πρότυπο, που αναλύονται υπό τις
ίδιες συνθήκες. Η ταυτοποίηση μπορεί να επιβεβαιωθεί με διατήρηση της σύμπτωσης των χρόνων ανάσχεσης
και της συμμετρίας των κορυφών, είτε σε παράλληλη ανάλυση δείγματος και προτύπου υπό άλλες
χρωματογραφικές συνθήκες, είτε υπό τον εμβολισμού του δείγματος με πρότυπο.
Σχήμα 8.20 Χρωματογράφημα που λαμβάνεται κατά την ανάλυση προτύπου καφεϊνης, σύμφωνα με τις χρωματογραφικές
συνθήκες του Σχήματος 8.16. Η ταυτοποίηση της κορυφής της καφεϊνης στο χρωματογράφημα του φαρμάκου του
Σχήματος 8.16 γίνεται με βάση το χρόνο ανάσχεσης της κορυφής της καφεϊνης που λαμβάνεται κατά τις δύο αναλύσεις (t R
= 6,19 min και 6,24 min για το μείγμα και το πρότυπο αντίστοιχα).
8.6.2 Ποσοτικός προσδιορισμός
Αναφέρθηκε ήδη ότι ο χρόνος ανάσχεσης αποτελεί χαρακτηριστική σταθερά μίας ουσίας, υπό αυστηρά
καθορισμένες πειραματικές συνθήκες. Προκειμένου, λοιπόν, να ταυτοποιηθούν οι αναλύτες στους οποίους
οφείλονται οι κορυφές ενός χρωματογραφήματος, είναι απαραίτητο να συγκριθεί το χρωματογράφημα που
προκύπτει κατά την ανάλυση ενός δείγματος με αυτό που λαμβάνεται κατά την ανάλυση πρότυπων
διαλυμάτων, τα οποία περιέχουν γνωστούς αναλύτες. Είναι απαραίτητο να αναλυθεί το δείγμα και τα
πρότυπα υπό τις ακριβείς ίδιες χρωματογραφικές συνθήκες. Είναι επίσης σημαντικό να έχουμε μία γενική
γνώση των αναμενόμενων αναλυτών στο δείγμα μας ήδη πριν την ανάλυση, προκειμένου να επιλεγούν τα
κατάλληλα πρότυπα.
242
Οι μετρήσεις σε μια οποιαδήποτε χρωματογραφική τεχνική ανάλυσης είναι σχετικές και απαιτούν
τη βαθμονόμηση των χρωματογράφων με διαλύματα προτύπων παραπλήσιας συστάσεως με τα δείγματα. Οι
κυριότερες μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση αναφέρθηκαν στο Kεφάλαιο 1. Είναι
προφανές ότι όσο μεγαλύτερη είναι η συγκέντρωση της αναλυόμενης ουσίας, τόσο μεγαλύτερο θα είναι το
εμβαδό της προκύπτουσας κορυφής (εφόσον περισσότερα μόρια της ουσίας θα ανιχνεύονται από τον
ανιχνευτή). Μάλιστα η σχέση αυτή είναι ανάλογη. Η ποσοτικοποίηση, λοιπόν, σε μια χρωματογραφική
ανάλυση γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής, το οποίο είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση
της ουσίας, μετά την κατασκευή κατάλληλης καμπύλης αναφοράς. Τέτοιο παράδειγμα ποσοτικοποίησης
περιλαμβάνεται στο πειραματικό μέρος (βλ. Ενότητα 8.9) που ακολουθεί.
Στο Σχήμα 8.21 φαίνεται η υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων διαφορετικών συγκεντρώσεων
μιας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές
συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής, το οποίο υπολογίζεται αυτόματα από το λογισμικό που
υποστηρίζει το σύστημα της χρωματογραφίας, φαίνεται στο ένθετο. Εκεί, φαίνεται και η συγκέντρωση της
ουσίας που έδωσε την κάθε κορυφή. Από τα δεδομένα του ένθετου είναι φανερό ότι το εμβαδόν αυξάνεται
ανάλογα με την αύξηση της συγκέντρωσης του αναλύτη. Είναι επίσης λογικό και εμφανές από το γράφημα,
ότι ο χρόνος έκλουσης δεν μεταβάλλεται με τη μεταβολή της συγκέντρωσης της ουσίας. Σημειώνεται ότι
μονάδα μέτρησης του εμβαδού στην περίπτωση ανιχνευτή UV/Vis είναι η μονάδα mAU∙min.
Σχήμα 8.21 Υπέρθεση δύο χρωματογραφημάτων συγκεντρώσεων CA και CB μίας ουσίας. Και στις δύο περιπτώσεις η
ουσία αναλύθηκε υπό τις ακριβώς όμοιες χρωματογραφικές συνθήκες. Το εμβαδόν της κάθε κορυφής σημειώνεται στο
ένθετο.
Επίσης, ισχύει και η αναλογία του ύψους της κορυφής με την ποσότητα του αναλύτη.
Θα πρέπει να γίνει κατανοητό ότι κατά την ποσοτικοποίηση δύο ουσιών που περιέχονται σε ένα
μίγμα, είναι απαραίτητο να κατασκευαστεί καμπύλη αναφοράς για καθένα από τα συστατικά του μίγματος,
χρησιμοποιώντας για κάθε καμπύλη αναφοράς την αντίστοιχη πρότυπη ουσία. Αυτό θα πρέπει να γίνει, διότι
δεν υπάρχει αναλογία μεταξύ του εμβαδού της κορυφής της μίας ουσίας και της συγκέντρωσης της δεύτερης
ουσίας. Αυτό οφείλεται στο ότι η κάθε ουσία απορροφάει στο συγκεκριμένο μήκος κύματος στο UV/Vis
(όπου ελέγχεται η απορρόφηση) έχοντας διαφορετικό συντελεστή μοριακής απόσβεσης.
Έτσι, παρατηρώντας απλώς το χρωματογράφημα π.χ. του Σχήματος 8.13 δεν είναι δυνατόν να
αποφανθούμε, εάν η ουσία 1 βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση σε σχέση με την ουσία 2 και το
αντίθετο. Προκειμένου να γίνει σύγκριση της συγκέντρωσης των δύο ουσιών θα πρέπει να κατασκευασθούν
δύο καμπύλες αναφοράς, μία για την κάθε ουσία.
Σύνοψη: Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης μιας αναλυόμενης ουσίας σε μία χρωματογραφική ανάλυση,
γίνεται βάσει του εμβαδού της επιφάνειας της χρωματογραφικής κορυφής της ουσίας. Αυτό είναι ανάλογο της
συγκέντρωσης της ουσίας. Ο ποσοτικός προσδιορισμός είναι δυνατός μετά την κατασκευή κατάλληλης
καμπύλης αναφοράς, χρησιμοποιώντας πρότυπα της ουσίας διαφορετικής συγκέντρωσης.
243
8.6.3 Οι προδιαγραφές μίας αναλυτικής Χρωματογραφικής στήλης HPLC
Οι κύριες παράμετροι που χαρακτηρίζουν μία αναλυτική χρωματογραφική στήλη αναφέρονται παρακάτω. Οι
βέλτιστες τιμές των παραμέτρων αυτών είναι διαφορετικές ανάλογα με την τάξη της ουσίας που μας
ενδιαφέρει να προσδιορίσουμε. Ο κάθε εμπορικός οίκος προτείνει στήλες με συγκεκριμένες προδιαγραφές,
ανάλογα με τις ανάγκες του αναλυτή.
1. Διαστάσεις της στήλης. Καθώς οι στήλες είναι σωληνοειδείς, οι διαστάσεις μιας στήλης δίνονται υπό την
μορφή (εσωτερική διάμετρος στήλης x μήκος στήλης). Π.χ. στήλη (4,6 x 250 mm) σημαίνει στήλη εσω-
τερικής διαμέτρου 4,6 mm και μήκους καλυμένου με πληρωτικό υλικό, 250 mm.
2. Μέγεθος σωματιδίων υλικού και μέγεθος πόρων υλικού. Το πιο κοινό πληρωτικό υλικό είναι το οξείδιο
του πυριτίου, συνήθως χημικά τροποποιημένο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. Το μέγεθος σωματιδίων
του οξειδίου του πυριτίου κυμαίνεται μεταξύ 3 και 50 µm. Το μικρότερο μέγεθος των σωματιδίων του
πληρωτικού υλικού γενικά δίνει καλύτερους διαχωρισμούς. Το μέγεθος των πόρων (διάμετρος των πό-
ρων) του πληρωτικού υλικού κυμαίνεται γενικά μεταξύ 100 - 1000 Å. Για το διαχωρισμό σχετικά μικρών
μορίων περισσότερο κοινή είναι η διάμετρος πόρων 100 Å.
3. Είδος στατικής φάσης.
Προδιαγραφές της στήλης που αναφέρονται είναι:

- το διάστημα των τιμών pH, όπου η στήλη λειτουργεί αποτελεσματικά, χωρίς φθορά του πληρωτικού.
υλικού.
- η μέγιστη πίεση στην οποία μπορεί να υποβληθεί μια στήλη χωρίς αλλαγή στο ύψος της θεωρητικής
πλάκας και τον αριθμό των θεωρητικών πλακών για έναν διαχωρισμό.
Στην πειραματική άσκηση που περιγράφεται πιο κάτω η χρωματογραφική στήλη που θα
χρησιμοποιηθεί είναι η Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex.
Αυτό σημαίνει ότι πρόκειται για στήλη αντίστροφης φάσης C18, εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150
mm με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού
υλικού 120 Å.
8.7 Παραδείγματα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού
Προκειμένου να εντοπιστούν οι βέλτιστες συνθήκες ενός χρωματογραφικού διαχωρισμού, ο αναλυτής

καλείται να επιλέξει καταρχήν την περισσότερο κατάλληλη στατική φάση και κατόπιν την βέλτιστη κινητή
φάση και το πρωτόκολλο διαχωρισμού.
8.7.1 Η επιλογή της Στατικής Φάσης
Στην επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς της αναλυτικής στήλης) λαμβάνονται υπ’όψη τα παρακάτω
χαρακτηριστικά/προδιαγραφές της στήλης σε συνδυασμό με τη μοριακή δομή (δηλ. την ομόλογη σειρά, την
πολικότητα, το μέγεθος μορίου κ.α.) της προσδιοριζόμενης ουσίας αλλά και των προσμίξεων που
αναμένονται στο αναλυόμενο δείγμα:
 το μέγεθος των μορίων του υλικού πληρώσεως,
 τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά της στήλης,
 η φύση της ομάδας που είναι δεσμευμένη στο υπόστρωμα, η οποία καθορίζει και την εκλεκτικότητα της
στατικής φάσης,
 η διάμετρος των πόρων του υλικού πληρώσεως,
 η σταθερότητα της στήλης στη μεταβολή του pH,
 η περιεκτικότητα της στήλης σε ελεύθερα σιλανολικά υδροξύλια. Όσο μεγαλύτερο είναι το ποσοστό τους
τόσο πιο πολική είναι η στήλη και τόσο ασθενέστερη είναι η συγκράτηση των μη πολικών ενώσεων.
244
Όλοι οι εμπορικοί οίκοι χρωματογραφικών στηλών παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τις
παραπάνω προδιαγραφές της στήλης, αλλά και αναλυτικές μελέτες της απόδοσης της στήλης σε σχέση με τα
φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αναλυόμενου μορίου και των αναμενόμενων προσμίξεων.
Ένας γενικός κανόνας που πρέπει να ακολουθείται από τον αναλυτή είναι ότι «η στατική φάση
πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την(ις) προσδιοριζόμενη(ες) ένωση(εις)». Στο Σχήμα 8.22 που
ακολουθεί φαίνεται το διαφορετικό χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση του ίδιου
μίγματος ουσιών, όταν χρησιμοποιούνται στήλες αντίστροφης φάσης C8 ή C18. Για τη συγκεκριμένη
ανάλυση η χρήση της στήλης C18 προσφέρει καλύτερο διαχωρισμό των κορυφών 3 και 4.
Σχήμα 8.22 Επίδραση του μήκους της αλυσίδας που είναι προσδεμένη στο προσροφητικό υλικό στηλών αντίστροφης
φάσης στον διαχωρισμό μίγματος θειαμίνης (1), νικοτιναμίδιου (2), νικοτινικού οξέος (3), οροτικού οξέος (4),
αμινοβενζοϊκού οξέος (5). Στο ανώτερο χρωματογράφημα χρησιμοποιήθηκε στήλη C8, ενώ στο κατώτερο στήλη C18. Και
στις δύο αναλύσεις οι στήλες είχαν τις ίδιες διαστάσεις, ίδιο μέγεθος σωματιδίων προσροφητικού υλικού και ίδιο μέγεθος
πόρων. Επίσης, και στις δύo περιπτώσεις η ίδια κινητή φάση και ταχύτητα ροής χρησιμοποιήθηκαν (προσαρμοσμένο από
τεχνικό δελτίο του οίκου ARC Sciences.
8.7.2 Η επιλογή της Κινητής Φάσης
Όπως αναφέρθηκε, η διαχωριστική ικανότητα Rs εξαρτάται από τον αριθμό των θεωρητικών πλακών Ν της
στήλης και τον παράγοντα συγκράτησης k’. Μετά την επιλογή της στατικής φάσης (συνεπώς και την επιλογή
του αριθμού θεωρητικών πλακών Ν), επιλέγεται η κινητή φάση, έτσι ώστε ο παράγοντας k' να είναι μεταξύ 5
και 20. Η βελτιστοποίηση της παραμέτρου k΄ επιτυγχάνεται κυρίως με αλλαγές στη σύσταση και ταχύτητα
ροής της κινητής φάσης και δευτερευόντως με αλλαγές στη θερμοκρασία της ανάλυσης.
Σε μία χρωματογραφική ανάλυση εφαρμόζονται κυρίως δύο διαφορετικές τεχνικές έκλουσης: η
ισοκρατική έκλουση (isocratic elution) και η βαθμιδωτή έκλουση (gradient elution). Στην ισοκρατική
έκλουση η κινητή φάση έχει σταθερή σύσταση καθ’όλη τη διάρκεια της ανάλυσης, ενώ στη βαθμιδωτή
έκλουση η σύσταση της κινητής φάσης έχει προγραμματιστεί να μεταβάλλεται κατά την ανάλυση είτε
γραμμικά (linear gradient), είτε σε διακριτά βήματα (step gradient). To Σχήμα 8.23 παρουσιάζει βασικά
πρωτόκολλα βαθμιδωτής και ισοκρατικής έκλουσης και τα χρωματογραφήματα που λαμβάνονται σε κάθε
περίπτωση κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος. Είναι φανερό ότι στη συγκεκριμένη ανάλυση η μεταβολή
του πρωτοκόλλου έκλουσης από ισοκρατική σε βαθμιδωτή είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του εύρους των
κορυφών, αλλά και τη σημαντική μείωση του χρόνου της ανάλυσης. Το τελευταίο έχει ιδιαίτερη σημασία,
επειδή οι διαλύτες υψηλής καθαρότητας που απαιτούνται στην υγροχρωματογραφία είναι ιδιαίτερα υψηλού
κόστους.
245
Σχήμα 8.23 Χρωματογραφήματα που λήφθηκαν κατά την ισοκρατική (Α) και βαθμιδωτή (Β) έκλουση μίγματος ουσιών 1-9
που αναλύθηκαν σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας. Τα αντίστοιχα πρωτόκολλα έκλουσης φαίνονται στα Α’ και Β’. Η
ισοκρατική ανάλυση και βαθμιδωτή ανάλυση έδωσαν συγκρίσιμη διαχωριστική ικανότητα κρίσιμου ζεύγους, αλλά η
βαθμιδωτή έκλουση υπερτερεί στη συγκεκριμένη ανάλυση στο ότι απαιτείται πολύ μικρότερος χρόνος ανάλυσης και στο ότι
δίνει κορυφές μικρότερου εύρους (Schellinger & Carr, 2006).
Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η επιλογή του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού επιτυγχάνεται

μόνο μετά από πολλαπλές διαδοχικές δοκιμές. Στις δοκιμές αυτές, κάθε προηγούμενο πρωτόκολλο δίνει τις
κατευθυντήριες αρχές, για την επιλογή του επόμενου πρωτόκολλου.
Έχοντας αλλάξει τις χρωματογραφικές συνθήκες, η βελτίωση του χρωματογραφικού διαχωρισμού
διαπιστώνεται με υπολογισμό της μεταβολής της διαχωριστικής ικανότητας της στήλης, σε ό, τι αφορά ένα
κρίσιμο ζεύγος αναλυτών. Ως κρίσιμο ζεύγος αναλυτών χαρακτηρίζεται το ζεύγος αυτό για το οποίο
καταγράφεται η χαμηλότερη διαχωριστική ικανότητα. Π.χ. για τον διαχωρισμό, που φαίνεται στο Σχήμα 8.23
και για το πρωτόκολλο Α, το κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 3-4, ενώ για το πρωτόκολλο Β,
κρίσιμο ζεύγος είναι το ζεύγος των αναλυτών 8-9.
Άλλες παράμετροι που εξετάζονται προκειμένου να διαπιστωθεί η καταλληλότητα ενός
πρωτοκόλλου είναι ο απαιτούμενος χρόνος της ανάλυσης και κυρίως η επαναληψιμότητα της ανάλυσης, σε
ό, τι αφορά στο εμβαδό/ύψος των κορυφών, καθώς και το εύρος της γραμμικής περιοχής της καμπύλης
αναφοράς.
Στο Σχήμα 8.24 φαίνεται το χρωματογραφικό προφίλ του μίγματος ουσιών α, β, γ των Σχημάτων
8.8 και 8.9, μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία κανονικής φάσης (Α) όπως στο Σχήμα 8.8 και
αντίστροφης φάσης (Β), όπως στο Σχήμα 8.9. Η μεταβολή της πολικότητας της κινητής φάσης μειώνει τη
246
διαχωριστική ικανότητα (σε Rs < 1,5), αλλά και το χρόνο της ανάλυσης. Προκειμένου να εντοπιστεί το
βέλτιστο πρωτόκολλο διαχωρισμού θα πρέπει ο αναλυτής να πειραματισθεί με την πολικότητα της κινητής
φάσης μεταβάλλοντας την διαδοχικά μεταξύ των δύο ακραίων τιμών του Σχήματος 8.24. Οι βέλτιστες
συνθήκες θα είναι αυτές που θα δώσουν Rs≥1,5 σε συνδυασμό με τον ελάχιστο χρόνο ανάλυσης.
Σχήμα 8.24 Χρωματογραφικό προφίλ του ίδιου μίγματος ουσιών α, β, γ μετά από ανάλυση τους με χρωματογραφία
κανονικής φάσης (Α και Α’) και αντίστροφης φάσης (Β και Β’). Η σχέση της πολικότητας των διαχωριζόμενων ουσιών
είναι α>β>γ, ενώ κατά τον διαχωρισμό η κινητή φάση είναι χαμηλής πολικότητας για το Α και υψηλής πολικότητας για το
Β. Μεταβάλλοντας την πολικότητα της κινητής φάσης σε μέση πολικότητα (στα Α’ και Β΄) η διαχωριστική ικανότητα της
στήλης μειώνεται. Ταυτόχρονα όμως μειώνεται και ο χρόνος της ανάλυσης.
8.7.3 Παράδειγμα βελτίωσης Χρωματογραφικού διαχωρισμού Σιμβαστατίνης σε ορό

Στο παρακάτω παράδειγμα παρουσιάζεται η πορεία που ακολουθήθηκε προκειμένου να γίνει δυνατός ο
ποσοτικός προσδιορισμός σιμβαστατίνης (αντιλιπιδικός παράγοντας), που προστέθηκε εξωγενώς σε ορό. Ο
προσδιορισμός της περιγράφεται στο πειραματικό μέρος (Ενότητα 8.9) που ακολουθεί.
1. Εφόσον η σιμβαστατίνη είναι ένα μόριο χαμηλής πολικότητας, επιλέχθηκε η χρωματογραφία HPLC αντί-
στροφης φάσης για τον διαχωρισμό της.
Αρχικά «έτρεξαν» πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης σε διαφορετικές συνθήκες σύστασης κινητής
φάσης και ταχύτητας ροής αυτής (Φωτογραφίες 8.4-8.7). Τα πρότυπα αναλύθηκαν σε στήλη Acclaim 120,
C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου Dionex.
Φωτογραφία 8.4 Χρωματογράφημα πρότυπου διαλύματος σιμβαστατίνης με κινητή φάση ακετονιτρίλιο: νερό = 70:30 και
ταχύτητα ροής αυτής 0,7 mL/min. Ο χρόνος έκλουσης της κορυφής της σιμβαστατίνης είναι t R = 12,62 min.
247
248
2. Στη συνέχεια έτρεξε ορός ελεύθερος σιμβαστατίνης σε κάθε μία από τις πειραματικές συνθήκες που ε-
φαρμόστηκαν, προκειμένου να διαπιστωθεί ποιες συνθήκες είναι οι καταλληλότερες, δηλαδή υπό ποιες
συνθήκες οι ενδογενείς κορυφές του ορού δεν συνεκλούονται με την κορυφή της σιμβαστατίνης.
Φωτογραφία 8.8 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία
δηλώνει τη θέση, όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία
ακετονιτριλίου:νερού = 80:20, ταχύτητα ροής 0,9 mL/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών.
249
Φωτογραφία 8.9 Χρωματογραφικό προφίλ ορού χωρίς την προσθήκη εξωγενούς σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ευθεία
δηλώνει τη θέση όπου θα εκλούονταν η σιμβαστατίνη υπό τις ίδιες πειραματικές συνθήκες (κινητή φάση με αναλογία
ακετονιτριλίου:νερού = 70:30, ταχύτητα ροής 0,9 mL/min), σύμφωνα με τα πρότυπα των προηγούμενων φωτογραφιών.
Φωτογραφία 8.10 Xρωματογράφημα ορού μετά την εξωγενή προσθήκη σιμβαστατίνης. Η πορτοκαλί ένδειξη υποδεικνύει
την κορυφή της σιμβαστατίνης. Η ανάλυση έγινε με κινητή φάση με αναλογία ακετονιτριλίου:νερού = 70:30 και ταχύτητα
ροής 0,9 mL/min.
250
Στην Φωτογραφία 8.8 φαίνεται ότι υπάρχει μία ενδογενής κορυφή του ορού που εκλούεται στο
χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης. Κατά συνέπεια, δεν θα ήταν δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της
σιμβαστατίνης υπό τις συνθήκες αυτές. Αντίθετα, όπως φαίνεται στο χρωματογράφημα της Φωτογραφίας 8.9
δεν υπάρχει ενδογενής κορυφή του ορού που να εκλούεται στο χρόνο έκλουσης της σιμβαστατίνης, οπότε
γίνεται δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης, υπό τις συνθήκες του χρωματογραφήματος
της Φωτογραφίας 8.9.
Σύνοψη: Στην ανάπτυξη του βέλτιστου πρωτόκολλου διαχωρισμού ένας πρώτος κανόνας που πρέπει να
λαμβάνεται υπόψη είναι ότι «η στατική φάση πρέπει να έχει παρόμοια πολικότητα με την προσδιοριζόμενη
ένωση». Η επιλογή του πρωτόκολλου μεταβολής της κινητής φάσης γίνεται με πολλαπλές δοκιμές και με
κριτήρια πρωτίστως το διαχωρισμό της κορυφής ενδιαφέροντος από προσμίξεις αλλά και το συνδυασμό
μέγιστου εύρους γραμμικής περιοχής της καμπύλης αναφοράς, την επαναληψιμότητα του εμβαδού/ύψους των
κορυφών και τον απαιτούμενο χρόνο της ανάλυσης.
Σύνοψη: Σε μια χρωματογραφική ανάλυση οι παράμετροι ταχύτητα ροής κινητής φάσης, υλικό πληρώσεως και
μέγεθος/διάμετρος πόρων σωματιδίων στήλης, διαστάσεις στήλης και θερμοκρασία στήλης πρέπει να ορίζονται
επακριβώς προκειμένου η ανάλυση να είναι επαναλήψιμη.
8.8 Εφαρμογές της HPLC στην Κλινική Ανάλυση

Τα πιο κοινά πεδία εφαρμογών της χρωματογραφίας HPLC στη κλινική ανάλυση αποτελούν:
 Η τοξικολογική ανάλυση. Η HPLC χρησιμοποιείται συχνά στην ιατροδικαστική και στην εγκληματολογι-
κή έρευνα και ιδιαίτερα στον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων (επιπέδων) ουσίων ή μεταβολιτών τους,
ναρκωτικών, δηλητηρίων και φαρμάκων σε τοξικές δόσεις, στα βιολογικά υγρά.
 Η θεραπευτική παρακολούθηση φαρμάκων (φαρμακοκινητικός έλεγχος). Ο προσδιορισμός των επιπέδων
ενός φαρμάκου στον ορό έχει νόημα στην θεραπευτική παρακολούθηση της επίδρασης ή της συγκέντρω-
σης αυτού, με στόχο την προσαρμογή μιας μεμονωμένης δόσης του φαρμακευτικού προϊόντος.
 Η ανάλυση κλινικών αναλυτών με διαγνωστικό ενδιαφέρον, για τους οποίους οι φωτομετρικές μέθοδοι
προσδιορισμού παρουσιάζουν μικρή εκλεκτικότητα. Τέτοιο παράδειγμα αποτελεί η περίπτωση της γλυ-
κοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης.
8.8.1 Προσδιορισμός των επιπέδων της Γλυκοζυλιωμένης Αιμοσφαιρίνης και άλλων

Αιμοσφαιρινικών κλασμάτων με HPLC
Ο ευρύτερα αποδεκτός δείκτης για την παρακολούθηση της νόσου του σακχαρώδη διαβήτη και την
αξιολόγηση της μεσοπρόθεσμης αποτελεσματικότητας της εφαρμοζόμενης θεραπείας, αποτελούν τα επίπεδα
της αιμοσφαιρίνης A1c (HbA1c). Η HbA1c αποτελεί το κυριότερο κλάσμα της γλυκοζυλιωμένης
αιμοσφαιρίνης. Η γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη είναι το ποσοστό της αιμοσφαιρίνης που έχει υποστεί
γλυκοζυλίωση. Η παρουσία HbA1c σε ποσοστό μεγαλύτερο του 6,5% της ολικής αιμοσφαιρίνης αποτελεί
ένδειξη διαβήτη. Σύμφωνα με την Αμερικανική Διαβητολογική Εταιρεία (American Diabetes Association ή
ADA), η προδιαβητική κατάσταση χαρακτηρίζεται από την παρουσία HbA1c μεταξύ 5,7-6,4%. Δεδομένου
ότι τα ερυθρά αιμοσφαίρια (με μέση διάρκεια ζωής περί των 100 - 120 ημερών) που περιέχουν την
αιμοσφαιρίνη, συνεχώς ανανεώνονται, το ποσοστό γλυκοζυλίωσης της αιμοσφαιρίνης μεταβάλλεται κι αυτό,
ανάλογα με τη γλυκόζη του αίματος. Καθώς η γλυκοζυλίωση της αιμοσφαιρίνης είναι μη αναστρέψιμη, η
τιμή της HBA1c ενσωματώνει τις διακυμάνσεις του σακχάρου του αίματος στο διάστημα των τελευταίων 2-3
μηνών και αντανακλά τη μέση τιμή του τελευταίου. Σήμερα, τα επίπεδα της HbA1c θεωρούνται ως το πιο
αξιόπιστο κριτήριο μεταβολικού ελέγχου. Έχει αποδειχθεί η συσχέτιση μεταξύ επιπέδων HbA 1c και
μακροχρόνιου κινδύνου πιθανών επιπλοκών του σακχαρώδη διαβήτη, όπως και του τακτικού ελέγχου των
επιπέδων HbA1c με την αποτελεσματικότητα του γλυκαιμικού ελέγχου των ασθενών (Delamater, 2006).
Επιπλέον, ο ποσοτικός προσδιορισμός των επιμέρους αιμοσφαιρινικών κλασμάτων έχει κλινικό
ενδιαφέρον στη διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθείων, σε περιπτώσεις θαλασσαιμίας ή άλλων αναιμιών (Clarke &
Higginsa, 2000).
Παλαιότερα, η κλασική ηλεκτρόφορηση εφαρμόζονταν πολύ συχνά στην κλινική ανάλυση HbA1c.
Η τεχνική αυτή έχει πλέον αντικατασταθεί είτε από τη χρωματογραφία HPLC είτε από την τριχοειδική
251
ηλεκτροφόρεση, είτε από ανοσομεθόδους. Τα πλεονεκτήματα της HPLC έναντι της κλασικής
ηλεκτροφόρησης συνοψίζονται κυρίως στην μεγαλύτερη ταχύτητα ανάλυσης της πρώτης, τη δυνατότητα
ανίχνευσης περισσότερων παθολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων και τον μεγαλύτερο αυτοματισμό της.
Επίσης, η χρήση φωτομετρικών μεθόδων προσδιορισμού αιμοσφαιρίνης έχει πλέον εκλείψει στην κλινική
βιοχημική ανάλυση.
Η Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής Ιατρικής (IFCC, 2002) ενέκρινε το 2002
δύο εναλλακτικές μέθοδους αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της HbA1c στα πλαίσια του
γλυκαιμικού ελέγχου. Και οι δύο μέθοδοι βασίζονται στην ενζυματική πρωτεόλυση της αιμοσφαιρίνης που
οδηγεί στην αποκοπή ενός εξαπεπτιδίου από το άμινο-τελικό άκρο της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης. Τα
γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια διαχωρίζονται στη συνέχεια από τα μη γλυκοζυλιωμένα εξαπεπτίδια με
χρωματογραφία RP-HPLC. Στην πρώτη μεθοδολογία χρησιμοποιείται ως ανιχνευτής φασματογράφος μάζας
με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού (HPLC-ESI/MS). Στη δεύτερη μεθοδολογία η RP-HPLC στήλη συνοδεύεται
από ανιχνευτή UV και είναι συζευγμένη με σύστημα τριχοειδικής ηλεκτροφόρεσης, επίσης με ανιχνευτή UV
(HPLC-CE). Οι υψηλές τεχνικές απαιτήσεις, σε συνδυασμό με το κόστος και τη μεγάλη διάρκεια των
αναλύσεων με τις παραπάνω μεθόδους, απέτρεψε την ευρεία υιοθέτησή τους από τα κλινικά εργαστήρια ανά
τον κόσμο.
Σήμερα, τα κλινικά εργαστήρια παγκοσμίως που μετρούν τα επίπεδα HbA1c στα πλαίσια
γλυκαιμικού ελέγχου ασθενών, χρησιμοποιούν μεθόδους εγκεκριμένες κατά το NGSP (National
Glycohemoglobin Standardization Program, Εθνικό Πρόγραμμα Προτυποποίησης Γλυκοζυλιωμένης
Αιμοσφαιρίνης) των ΗΠΑ. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στη χρωματογραφία HPLC, είτε στην
τριχοειδική ηλεκτροφόρηση, είτε σε ανοσομεθόδους.
Οι εγκεκριμένες μέθοδοι HPLC χρησιμοποιούν κυρίως τη χρωματογραφία κατιοντικής
ανταλλαγής. Πολύ συχνά χρησιμοποιούνται οι στήλες κατιοντικής ανταλλαγής PolyCAT A. Σε αυτές, η
στατική φάση είναι οξείδιο του πυριτίου, όπου έχουν συζευχθεί αλυσίδες πολυασπαρτικού οξέος. Οι μέθοδοι
αυτοί επιτρέπουν το διαχωρισμό της HbA1c και τον εκλεκτικό ποσοτικό προσδιορισμό αυτής. Παράλληλα,
είναι κατάλληλες για τον ποσοτικό προσδιορισμό των διαφόρων άλλων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων, για τη
διάγνωση αιμοσφαιρινοπαθειών.
Συνήθως τα σύγχρονα διαγνωστικά εργαστήρια διαθέτουν πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα
HPLC, που χρησιμοποιούνται αποκλειστικά ως αναλυτές αιμοσφαιρινοπαθειών. Αυτά διαθέτουν
ολοκληρωμένα συστήματα βαθμονόμησης και ποιοτικού ελέγχου, προκατεργασίας δείγματος με αιμόλυση
ολικού αίματος και αυτόματο δειγματολήπτη. Τέτοια είναι τα συστήματα του οίκου Bio-Rad (California,
USA). Οι αναλυτές αιμοσφαιρίνης της Biorad, Variant II (Turbo) και D-10™ Hemoglobin Testing System
ως παράδειγμα, διαθέτουν ενσωματωμένα προγράμματα ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού HbA1c
και θαλασσαιμίας (Wajcman, 2003). Πριν τη χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιείται από το
αυτοποιημένο σύστημα αιμόλυση ολικού αίματος με χρήση αιμολυτικού αντιδραστηρίου. Το πρωτόκολλο
HbA1c χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής και η έκλουση επιτυγχάνεται με χρήση βαθμίδας
ιοντικής ισχύος. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415
nm και 690 nm (βλ. Ενότητα 2.4.1.3). Στον υπολογισμό του εμβαδού της επιφάνειας της κορυφής που
αντιστοιχεί στην HbA1c εξαιρείται η συνδρομή της ασταθούς HbA1c (labile HbA1c) και καρβαμυλιωμένων
αιμοσφαιρινών. Με το ενσωματωμένο πρόγραμμα θαλασσαιμίας επιτυγχάνεται ο καθορισμός μέσα σε λίγα
λεπτά του ποσοστού των HbA2 και HbF και η προκαταρκτική ανίχνευση άλλων κοινώς απαντούμενων, μη
φυσιολογικών αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το πρωτόκολλο χρησιμοποιεί στήλη κατιοντικής ανταλλαγής
3,0 × 0,46 cm και η έκλουση πραγματοποιείται στους 32 ± 1°C, με ταχύτητα ροής 2 mL/min, με χρήση
βαθμίδας pH και ιοντικής ισχύος που επιτυγχάνεται με δύο φωσφορικά ρυθμιστικά διαλύματα (Wajcman,
2003).

8.9.1 Προσδιορισμός συγκέντρωσης Σιμβαστατίνης σε ορό
8.9.1.1 Αρχή της μεθόδου
Η σιμβαστατίνη συνταγογραφείται για την μείωση των επιπέδων της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων
στο αίμα. Πρόκειται για μια λακτόνη η οποία στον οργανισμό μετατρέπεται πολύ εκτενώς στο αντίστοιχο
υδροξυοξύ, που αποτελεί και τη φαρμακολογικά ενεργή μορφή. Σε μοριακό επίπεδο δρα αναστέλλοντας το
ένζυμο της αναγωγάσης του 3-υδροξυ-3-μεθυλογλουταρικού συνενζύμου Α.
252
Ο φαρμακοκινητικός προσδιορισμός των επιπέδων ενός φαρμάκου στον ορό, παίζει σημαντικό
ρόλο στην θεραπευτική παρακολούθηση της δράσης του φαρμάκου, με στόχο τον καθορισμό της ιδανικής
δοσολογίας του συγκεκριμένου ασθενή. Στην περίπτωση της σιμβαστατίνης, λόγω της εκτενούς μετατροπής
της στο υδροξυοξύ, τα επίπεδα του προφαρμάκου δεν ανιχνεύονται στον ορό, ενώ ανιχνεύονται τα επίπεδα
της φαρμακολογικά ενεργής μορφής (υδροξυοξύ) (Bews et al., 2014). Για καθαρά διδακτικούς λόγους, στην
άσκηση αυτή επιχειρείται ο ποσοτικός προσδιορισμός της σιμβαστατίνης σε δείγμα ορού όπου αυτή έχει
προστεθεί εξωγενώς.
O χρόνος ανάσχεσης tR αποτελεί το κριτήριο ταυτοποίησης των ουσιών που αναλύονται
χρωματογραφικά. Για σταθερές παραμέτρους ανάλυσης (υλικό πλήρωσης και διαστάσεις στήλης, ταχύτητα
ροής κινητής φάσης, θερμοκρασία και σύσταση του συστήματος έκλουσης) ο χρόνος ανάσχεσης είναι
σταθερός και χαρακτηρίζει την εκλουόμενη ουσία. Το εμβαδόν της χρωματογραφικής κορυφής της
αναλυόμενης ουσίας ή το μέγιστο ύψος αυτής χρησιμοποιούνται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της, διότι
αυτά είναι ανάλογα της συγκέντρωσης της αναλυόμενης ουσίας.
Τα δείγματα που αναλύονται με HPLC πρέπει να βρίσκονται αποκλειστικά σε υγρή μορφή.
Συνήθης προκατεργασία αυτών αποτελούν η αραίωση και η διήθηση. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης
του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας
πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Αν είναι δυνατόν, τα πρότυπα παρασκευάζονται στο ίδιο μητρικό
υλικό με τα δείγματα. Στο συγκεκριμένο προσδιορισμό, προκειμένου να ληφθούν υπ’όψη οι όποιες απώλειες
σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε
ορό και εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου.
8.9.1.2 Σκεύη – αντιδραστήρια - όργανα
 Φίλτρα σύριγγας Millipore (0,22 µm),

 σύριγγες ινσουλίνης,
 μικροσύριγγα ακριβείας Hamilton 100 μL,
 χρωματογραφική Στήλη Acclaim 120, C18, 3 µm Analytical (4,6 x 150 mm) του εμπορικού οίκου
Dionex,
 ογκομετρικές φιάλες,
 γυάλινοι δοκιμαστικοί σωλήνες,
 ακετονιτρίλιο HPLC grade,
 υπερκάθαρο νερό (HPLC grade).
 Πρότυπη ουσία: European Pharmacopoeia (EP) Reference Standard Σιμβαστατίνης (CAS Number 79902-
63-9, ΜB = 418,57) από οίκο Sigma.
 Υγρός χρωματογράφος υψηλής απόδοσης (Ultimate 3000, Dionex), που περιλαμβάνει αντλία παλινδρό-
μησης τεσσάρων διαλυτών Ultimate 3000 Pump (Pump LPG-3400 A), θερμοστατούμενο χώρο Column
Compartment (TCC-3100) και ανιχνευτή Συστοιχίας φωτοδιόδων UV-Vis (PDA 3000) από τον οίκο
Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA.
 Στήλη αντίστροφης φάσης Acclaim 120 C18 (Dionex), εσωτερικής διαμέτρου 4,6 mm, μήκους 150 mm
με μέγεθος σωματιδίων πληρωτικού υλικού 3 μm και με διάμετρο πόρων σωματιδίων πληρωτικού υλικού
120 Å.
Σύνοψη: Τα σκεύη θα πρέπει να είναι πολύ καθαρά, γεγονός που εξασφαλίζεται με τον περιοδικό καθαρισμό
τους με 2% w/v διχρωμικό κάλιο (όταν διαπιστωθεί ότι υπάρχουν προσμίξεις στα αναλυόμενα πρότυπα).
Καθημερινά πλένονται με ακετονιτρίλιο ή υπερκαθαρό νερό, ανάλογα με το προηγούμενο περιεχόμενο τους. Οι
διαλύτες της κινητής φάσης θα πρέπει να έχουν απαερωθεί (π.χ με συνεχή διοχέτευση αδρανούς αερίου, ή με
διήθηση τους μέσα από ειδικές μεμβράνες, είτε με χρήση υπερήχων) και να είναι ελεύθεροι μικροβιακού
φορτίου (π.χ. με τη διοχέτευσή τους μέσω φίλτρου με διάμετρο πόρων 0,22 μm). Συνήθως τα συστήματα HPLC
διαθέτουν απαερωτές κενού, αμέσως μετά τους περιέκτες των διαλυτών, που απαερώνουν την κινητή φάση.
8.9.1.3 Παράμετροι της ανάλυσης
 Σύστημα έκλουσης: Ισοκρατική έκλουση με κινητή φάση 70% v/v ακετονιτρίλιο: 30 % v/v νερό
253
 Πίεση κινητής φάσης: 200 - 3000 psi
 Ταχύτητα ροής κινητής φάσης: 0,9 mL/min
 Θερμοκρασία έκλουσης: 25°C
 Χρόνος ανάλυσης: 15 min
 Ενέσιμη ποσότητα δείγματος: 20 μL (χρησιμοποιείται βρόγχος χωρητικότητας 20 μL στο σύστημα ει-
σαγωγής δείγματος)
 Καταγραφή απορρόφησης: στα 237 nm επί 15 min
8.9.1.4 Παρασκευή και έγχυση των πρότυπων διαλυμάτων
Παρασκευάζουμε έξι πρότυπα διαλύματα σιμβαστατίνης συγκεντρώσεως 0 μΜ, 1,25 μΜ, 2,5 μΜ,
5,0 μΜ, 10 μΜ και 12,5 μΜ. Για τη διάλυση της σιμβαστατίνης χρησιμοποιείται υπερκάθαρο ακετονιτρίλιο
(HPLC grade), που έχει υποβληθεί σε απαέρωση.
Για την κάθε ανάλυση, εισάγουμε με έγχυση 20 μL κάθε προτύπου στη στήλη, εκτελώντας
τουλάχιστον δύο επαναλήψεις ανά πρότυπο. Ξεκινο ύμε από το πρότυπο μικρότερης συγκέντρωσης και
αναλύουμε διαδοχικά τα υπόλοιπα πρότυπα, κατά σειρά αυξανόμενης συγκέντρωσης. Μετρούμε την
απορρόφηση στα 237 nm επί 15 min. Υπό το επιλεγμένο πρωτόκολλο ανάλυσης η κορυφή της
σιμβαστατίνης εκλούεται στα 10,60 min.
Σύνοψη: Απαιτείται μεγάλη προσοχή στην καθαριότητα της μικροσύριγγας Hamilton. Η σύριγγα εκπλένεται
αρχικά επανειλημμένα με τον διαλύτη, στον οποίο βρίσκεται διαλυμένο το πρότυπο και στη συνέχεια με το
πρότυπο διάλυμα ή το δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί. Πρέπει να αποφεύγονται οι φυσαλίδες κατά την
εισαγωγή του δείγματος.
Επίσης, ο βρόγχος ανάλυσης θα πρέπει να έχει πληρωθεί με όγκο μεγαλύτερο από το τριπλάσσιο της
χωρητικότητας του βρόγχου με το πρότυπο ή δείγμα που πρόκειται να αναλυθεί, προκειμένου ο περιεχόμενος σε
αυτόν όγκος να είναι ο προδιαγραφόμενος. Ο όγκος του δείγματος που υπερβαίνει την χωρητικότητα του
βρόγχου απορρίπτεται στη δεξαμενή αποβλήτων.
8.9.1.5 Προετοιμασία του άγνωστου δείγματος
Σε 200 μL πλάσματος προσθέτουμε εξωγενώς σιμβαστατίνη (κατά βούληση σε τελική συγκέντρωση 1,25 -
10 μM) και στη συνέχεια 400 μL ακετονιτρίλιο. Αναδεύουμε στο vortex, αφήνουμε το διάλυμα σε ηρεμία
στους 2 – 8°C επί 30 min και φυγοκεντρούμε στα 10.000 x g επί 10 min. Το υπερκείμενο υγρό αναρροφάται
με πλαστική σύριγγα και διοχετεύεται μέσω κατάλληλου φίλτρου σύριγγας (0,22 µm, Millipore) σε καθαρό
δοκιμαστικό σωλήνα. Ακολουθεί η εισαγωγή 20 μL του «άγνωστου» δείγματος στη στήλη. Γίνονται δύο
εγχύσεις (ενέσεις) από το κάθε άγνωστο. Μεταξύ του τελευταίου αναλυόμενου προτύπου και του πρώτου
αναλυόμενου αγνώστου πρέπει να παρεμβληθεί ένεση καθαρού ακετονιτριλίου, προκειμένου να διαπιστωθεί
ότι στη στήλη δεν παραμένουν υπολείμματα προτύπου.
Σύνοψη: Προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που
την περιέχει, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και η εκχύλιση αυτών να γίνεται με διπλάσιο
όγκο ακετονιτριλίου, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου.
8.9.1.6 Επεξεργασία αποτελεσμάτων
Όπως αναφέρθηκε, κάνουμε δύο εγχύσεις από το κάθε πρότυπο διαλύματα και το δείγμα. Σημειώνουμε τους
χρόνους ανάσχεσης (tR), για κάθε επανάληψη και κάθε συγκέντρωση πρότυπης ουσίας. Ταυτοποιούμε την
σιμβαστατίνη στον ορό συγκρίνοντας τον χρόνο ανάσχεσης της σιμβαστατίνης των προτύπων με τους
χρόνους ανάσχεσης των χρωματογραφικών κορυφών στο χρωματογράφημα του ορού. Ολοκληρώνουμε τις
αντίστοιχες κορυφές, σημειώνουμε το εμβαδόν τους (ή το μέγιστο ύψος), υπολογίζουμε τον μέσο όρο των
εμβαδών (ή του μέγιστου ύψους) των χρωματογραφικών κορυφών των δύο επαναλήψεων για κάθε πρότυπο
και δείγμα, και κατασκευάζουμε καμπύλη αναφοράς.
254
Στον Πίνακα 8.2 σημειώνονται οι τιμές εμβαδού των χρωματογραφικών κορυφών της
σιμβαστατίνης που λήφθηκαν κατά τη χρωματογραφική ανάλυση των προτύπων της σιμβαστατίνης,
σύμφωνα με τις παραπάνω συνθήκες.
Μέσο εμβαδόν
[Σιμβαστατίνη] κορυφής
μΜ (mAU∙min)
0 0,002
1,25 1,627
2,5 3,728
5 6,692
10 13,164
12,5 17,846
Πίνακας 8.2 Μέσο εμβαδόν των κορυφών της σιμβαστατίνης κατά τη χρωματογραφική ανάλυση δύο επαναλήψεων των
προτύπων.
Από τις τιμές του πίνακα κατασκευάστηκε η παρακάτω καμπύλη αναφοράς (Σχήμα 8.25):
Σχήμα 8.25 Καμπύλη αναφοράς ποσοτικού προσδιορισμού σιμβαστατίνης. Σημειώνεται η εξίσωση της ευθείας (εξίσωση
παλινδρόμησης) και o συντελεστής συσχέτισης R2.
Με βάση την καμπύλη αναφοράς, υπολογίζεται η συγκέντρωση σιμβαστατίνης του «άγνωστου»

δείγματος ορού. Έτσι, εάν το δείγμα ορού έδωσε κορυφή σε χρόνο που ταυτίζεται με το t R της σιμβαστατίνης
μέσου εμβαδού 2 mAU∙min, αντικαθιστώντας όπου y = 2,0 λαμβάνουμε χ = 1,48 μΜ. Επειδή όμως το δείγμα
αραιώθηκε 1:3 κατά τη διαδικασία της εκχύλισης η συγκέντρωση της σιμβαστατίνης σε αυτό θα είναι 3 x
1,48 = 4,44 μΜ.
Θα πρέπει να ληφθεί υπόψη ότι λόγω απωλειών σιμβαστατίνης κατά την εκχύλιση του ορού που
την περιέχει, η υπολογιζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου είναι ψευδώς χαμηλότερη της πραγματικής.
Προκειμένου να ληφθούν υπ’όψη οι όποιες απώλειες, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων σε ορό και
εκχύλιση αυτών με ακετονιτρίλιο, ακριβώς όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου.
255
Σύνοψη: Στη χρωματογραφία HPLC ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα γίνεται με
βάση πρότυπη καμπύλη αναφοράς που κατασκευάζεται ενίοντας πρότυπα διαλύματα της καθαρής ουσίας. Τα
πρότυπα παρασκευάζονται αν είναι δυνατόν στο ίδιο μητρικό υλικό με τα δείγματα. Προκειμένου μάλιστα να
ληφθούν υπόψη οι όποιες απώλειες του αναλύτη κατά την προκατεργασία των δειγμάτων πριν την
υγχροχρωματογραφική ανάλυσή τους, προτείνεται η προετοιμασία των προτύπων στη μήτρα και υποβολή αυτών
στην προκατεργασία,να γίνεται ακριβώς, όπως και κατά την προετοιμασία του αγνώστου.
8.9.2 Παράδειγμα προσδιορισμού HbA1c με HPLC

Άλλο εξελιγμένο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου είναι το HPLC HA-8140 της εταιρίας
Menarini Diagnostics (Florence, Italy) (John et al., 1997). Ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης HA 8140 διαθέτει
σύστημα αυτόματης τροφοδοσίας δειγμάτων και ανάγνωσης bar code. Το σύστημα παραλαμβάνει αυτόματα
3 μL ολικού αίματος από το φιαλίδιο που περιέχει το προς ανάλυση δείγμα και ακολουθεί η αιμόλυση του
δείγματος με προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος τετραπυροφωσφορικού, pH 6,0. Το αιμολυμένο δείγμα
διατηρείται για 2 min στους 48◦C, προκειμένου να απομακρυνθεί η ασταθής HbA1c (labile HbA1c). Στη
συνέχεια το αιμόλυμα εισάγεται με ένεση σε στήλη αντίστροφης φάσης κατιοντικής ανταλλαγής, όπου
υπάρχει καθηλωμένο συμπολυμερές μεθακρυλικού οξέος και μεθακρυλικού εστέρα (Micronex A1c-HSII
στήλη, Sekisui Chemical Co., Tokyo, Japan). Η στήλη θερμοστατείται στους 40◦C. Η έκλουση
πραγματοποιείται με ταχύτητα ροής 2 mL/min κι ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με βαθμίδα ιοντικής ισχύος/
pH. Η ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός στηρίζονται σε διχρωματική ανάλυση στα 415 nm και 500
nm (βλ. Ενότητα 2.4.1.3). O συνολικός χρόνος ανάλυσης είναι μόνο 4 min. Μειονέκτημα του αναλυτή
αιμοσφαιρίνης HA 8140 είναι η παρεμβολή καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινικών κλασμάτων στην HbA1c
κορυφή (Meijs, 2008).
Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως εκατοστιαίο ποσοστό της ολικής αιμοσφαιρίνης. Στη
Φωτογραφία 8.11 παρουσιάζεται το χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση
αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα HPLC HA-8140 και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών.
Εκεί φαίνεται ότι το κλάσμα ΗbΑ1c αντιστοιχεί στις κορυφές P4 και P5. Η παρουσία μικρής κορυφής υπό τη
μορφή «ώμου» (shoulder, κορυφή P4) στη βασική κορυφή της ΗbΑ1c είναι κοινή σε πολλά πρωτόκολλα
διαχωρισμού αιμοσφαιρινικών κλασμάτων. Το σχετικό εκατοστιαίο ποσοστό της HbA1c (% HbA1c) δίνεται
από το άθροισμα της σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές 4 και 5. Το
ποσοστό %ΗbΑ1c στη συγκεκριμένη ανάλυση είναι 6,6% και υποδεικνύει κακή ρύθμιση του διαβήτη. Το
συνολικό ποσοστό της ολικής γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (%HbA1) προέρχεται από το άθροισμα της
σχετικής εκατοστιαίας περιεκτικότητας που αντιστοιχεί στις κορυφές P1 μέχρι και P5, ενώ στη μη
γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη (HbA0) αντιστοιχεί η κορυφή P6. Το άθροισμα HbA1 + HbA0 δίνει την ολική
αιμοσφαιρίνη.
256
Φωτογραφία 8.11 Χρωματογραφικό προφίλ που λαμβάνεται κατά την ανάλυση αιμολύματος ασθενούς με το σύστημα
HPLC HA-8140. Αναγράφεται και η ολοκλήρωση των λαμβανόμενων κορυφών.
Ένα πιο σύγχρονο αυτοματοποιημένο σύστημα γλυκαιμικού ελέγχου του ίδιου εμπορικού οίκου
(Menarini Diagnostics, Florence, Italy) είναι ο αναλυτής αιμοσφαιρίνης Hb-9210. Ο χρωματογραφικός
διαχωρισμός εδώ βασίζεται στη μέθοδο χημικής συγγένειας βορονικού οξέος. Η στήλη που χρησιμοποιείται
έχει καθηλωμένα σε στερεό υπόστρωμα παράγωγα του βορονικού οξέος, με τα οποία δίνουν ενώσεις
συναρμογής οι ομάδες 1,2-cis-διόλης της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης. Ομάδες 1,2-cis-διόλης δεν
υπάρχουν στη μη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη. Έτσι όταν αιμόλυμα διέρχεται διαμέσου της στήλης, μόνο
τα κλάσματα της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης αλληλεπιδρούν με αυτήν, με αποτέλεσμα να
διαχωρίζονται. Η έκλουσή τους επιτυγχάνεται στη συνέχεια με χρήση κατάλληλου αντιδραστηρίου έκλουσης
που συναγωνίζεται τη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη για τις θέσεις πρόσδεσης. Η έκλουση του
γλυκοζυλιωμένου κλάσματος ανιχνεύεται με φωτομέτρηση στα 413 nm. Η εφαρμοζόμενη μέθοδος αποτρέπει
κάθε παρεμβολή στο αποτέλεσμα των κύριων παθολογικών αιμοσφαιρινών, της ασταθούς HbA1c και
καρβαμυλιωμένων αιμοσφαιρινών και συνεπώς πλεονεκτεί σε σχέση με το αναλυτή HA-8140.
257
Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο
Σύντομη παρουσίαση χρήσης αυτόματου αναλυτή HPLC για τον προσδιορισμό της σιμβαστατίνης,
https://youtu.be/g7YoD2mmnCU.

 Aρχή μεθόδου χρωματογραφίας στήλης: http://chemsite.lsrhs.net/FlashMedia/html/columnChrom.html
 Αρχή μεθόδου ΤLC http://pharmaxchange.info/press/2012/11/thin-layer-chromatography-tlc-principle-
with-animation/ (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 http://www.thelearningodyssey.com/Graphics/Content/vs/em/Medias/html/a439-thin-layer-
chromatography.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Διαχωρισμός μίγματος φαινόλης (C6H5OH)/τολουολίου (C6H5CH3) με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας.
Η φαινόλη είναι πιο πολική από το τολουόλιο, λόγω της παρουσίας του υδροξυλίου στο μόριο της και αλ-
ληλεπδρά ισχυρότερα με την πολική στατική φάση. Κατά συνέπεια θα καθυστερεί σε σχέση με το μόριο
του τολουολίου, το οποίο θα προπορεύεται: http://pharmaxchange.info/press/2012/11/thin-layer-
chromatography-tlc-principle-with-animation/ (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Αρχή μεθόδου χρωματογραφίας χάρτου. Στην παρουσίαση αυτή, παρουσιάζεται προσομοίωση του δια-
χωρισμού μίγματος αποτελούμενου από μία μπλε και μία κίτρινη ουσία. Στην επίδειξη παρέχεται η δυνα-
τότητα της προσομοίωσης του διαχωρισμού μεταβάλλοντας το βαθμό προσρόφησης των διαχωριζόμενων
ουσιών στο χαρτί καθώς και τη διαλυτότητα αυτών στην κινητή φάση:
http://chemsite.lsrhs.net/FlashMedia/html/paperChrom.html (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Αρχή μεθόδου χρωματογραφικού διαχωρισμού με HPLC αντίστροφης φάσης:
https://www.youtube.com/watch?v=r06S7UO1DF4 (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Παρουσίαση του βρόγχου εισαγωγής του δείγματος σε διάταξη:
http://www.instrumentalchemistry.com/liquidphase/pages/sampleloop.htm (τελευταία προσπέλαση
1/5/2015).
 Αρχή μεθόδου και βασική οργανολογία της τεχνικής HPLC:
https://www.youtube.com/watch?v=IUwRWn9pEdg (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
258
 Χρωματογραφικός διαχωρισμός μπλε και κόκκινης ουσίας με HPLC: μόλις κάθε ουσία εξέρχεται από τη
στήλη, διέρχεται από τον ανιχνευτή και το σήμα που μετράται από αυτόν καταγράφεται σε συνάρτηση με
το χρόνο που μεσολάβησε από την ένεση του δείγματος. Η γραφική παράσταση που προκύπτει, το χρω-
ματογράφημα, περιέχει για το συγκεκριμένο διαχωρισμό δύο κορυφές έκλουσης, καθεμία για κάθε ε-
κλουόμενη ουσία: http://studyhplc.com/hplcinstrument.php (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
Πηγές φωτογραφιών με προέλευση από το διαδίκτυο

 Φωτογραφία 8.1 www.camag.com (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Φωτογραφία 8.2 www.labfriend.com (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Σχήμα 8.12 http://www.sielc.com/Compound-Caffeine.htm (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
 Σχήμα 8.17 http://www.sielc.com/Compound-Caffeine.html (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
 Σχήμα 8.22
http://arcsciences.com/Editor/assets/imtakt/imtakt%20brochures,%20apps%20and%20ppts/as_imtakt_uni
son-uk_c8_c18_phenyl.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/5/2015).
259
Αναφορές
1. ΣΟΥΛΙΟΥ, Ε., ΣΥΜΕΩΝΙΔΗΣ, Γ., ΜΟΥΣΛΕΧ, Τ., ΑΡΧΑΝΙΩΤΑΚΗ, Μ., ΔΙΖΑ, Ε., ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥ-
ΛΟΥ, Β. (1998) Σύγκριση μεθόδων προσδιορισμού της γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης, Ελληνικά Δια-
βητολογικά Χρονικά, 11, p. 67-73.
2. BEWS, H. et al. (2014) Simultaneous quantification of simvastatin and simvastatin hydroxy acid in blood
serum at physiological pH by ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
(UHPLC/MS/MS). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. p. 947-48.
3. CLARKE, M. & HIGGINSA, N. (2000) Laboratory Investigation of Hemoglobinopathies and Thalasse-
mias: Review and Update. Clin Chem, 46, p. 1284-90.
4. DELAMATER, Μ. (2006) Clinical Use of Hemoglobin A1c to Improve Diabetes Management, Clin Dia-
betes, 24, p.6-8.
5. GREILING, H. & RUEDIGER R. (1991) HPLC in clinical chemistry: Selected topics and clinical applica-
tions Microchim. Chim Acta, 104, p. 135-43.
6. HEFTMANN, E. (2004) Chromatography, Part A: Fundamentals and Techniques, Part B: Applications.
6th ed. Amsterdam: Elsevier.
7. INTERNATIONAL FEDERATION OF CLINICAL CHEMISTRY AND LABORATORY MEDICINE
(IFCC) (2002) Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c in Human Blood. Clin
Chem Lab Med, 40, p. 78-89.
8. JOHN, G., BRACONNIER, F., MIEDEMA, K., AULESA, C., PIRAS, G. (1997) Evaluation of the
Menarini-Arkray HA 8140 hemoglobin A1c analyzer. Clin Chem, 43, p. 968-75.
9. KAZAKEVICH, V. & LOBRUTTO, R. (2007) HPLC for pharmaceutical scientists. New Jersey: John
Wiley & Sons Inc.
10. MEIJS, L., DIJKHORST-OEI, T., VAN LOO, R., BOSMA, J., WEYKAMP, W., WIELDERS J. P.M.
(2008) Does carbamylated hemoglobin still affect the analysis of HbA1c in uremic and hyperglycemic pa-
tients? Clin Chem Lab Med, 46, p. 1791–92.
11. NEUE, D. (1997) HPLC Columns—Theory, Technology, and Practice. New York: Wiley-VCH.
12. POOLE, F. (2002) The Essence of Chromatography. Amsterdam: Elsevier.
13. SCHELLINGER, P. & CARR, W. (2006) Isocratic and gradient elution chromatography: A comparison in
terms of speed, retention reproducibility and quantitation. J Chromatogr A, 1109, p. 253–66.
14. SNYDER, R., KIRKLAND, J., GLAJCH, L. (1997) Practical HPLC Method Development, 2nd ed. New
York: Wiley-Interscience.
15. SPANGENBERG, Β., POOLE, F., WEINS, C. (2011) Quantitative Thin-Layer Chromatography: A Prac-
tical Survey. New York: Springer.
16. WAJCMAN, H. (2003) Analysis of Hemoglobins and Globin Chains by High-Performance Liquid Chro-
matography. In: Methods in Molecular Medicine, vol. 82: Hemoglobin Disorders: Molecular Methods and
Protocols. Totowa: Humana Press Inc.
17. http://www.chem.uoa.gr/courses/instrumental/Intro_GC_2013_03.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/1/2015).
18. http://www.ngsp.org/docs/methods.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
19. http://arcsciences.com/Editor/assets/imtakt/imtakt%20brochures,%20apps%20and%20ppts/as_imtakt_uni
son-uk_c8_c18_phenyl.pdf (τελευταία προσπέλαση 1/4/2105).
20. http://www.menarinidiagnostics.gr/Proihonta/Analythes-aimosphairhines/Hb-9210 (τελευταία προσπέλα-
ση 1/4/2015).
260
IVD ΠΡΟЇΟΝΤΑ-ΕΣΩΚΛΕΙΣΤΑ ΦΥΛΛΑΔΙΑ ΤΩΝ
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΠΟΥ
ΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΥΝ
Ο ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΤΙΜΩΝ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΚΑΙ ΑΛΛΕΣ
ΣΧΕΤΙΚΕΣ ΑΠΑΙΤΗΣΕΙΣ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι απαιτήσεις της αγοράς και της διεθνούς Επιστημονικής κοινότητας
για τα in vitro διαγνωστικά προϊόντα και αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια Κλινικής
Χημείας: ποιες πληροφορίες πρέπει να περιλαμβάνονται στα εσώκλειστα φυλλάδια τους που αφορούν στη
σωστή φύλαξη και χρήση τους και ποιες πρέπει να είναι οι ιδιότητές τους.
Ιδιαίτερη έμφαση θα δοθεί στα κλινικά και αναλυτικά χαρακτηριστικά τους που πρέπει να ελεγχθούν
και να αναφερθούν από τους κατασκευαστές. Ανάμεσά τους και ο προσδιορισμός των τιμών αναφοράς που
είναι και το χαρακτηριστικό που χρησιμοποιείται περισσότερο από τους κλινικούς ιατρούς ώστε να πάρουν
τη ορθή απόφαση για τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση του ασθενούς.
Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα του κλινικού εργαστηρίου. Δεν
υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από άλλα κεφάλαια. Γνώσεις από τη Στατιστική και τη Χημειομετρία θα
ήταν χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου. Μικρή εισαγωγή σε αυτό το κεφάλαιο
γίνεται και στο δεύτερο μέρος του Κεφαλαίου 1 όπου γίνεται αναφορά στα όρια ανίχνευσης και
ποσοτικοποίησης των αναλυτικών μεθόδων.
9.1 Εισαγωγή για τα IVDs

Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα Κλινικά εργαστήρια οφείλουν να πληρούν συγκεκριμένες
προδιαγραφές πριν κυκλοφορήσουν στην αγορά, ενώ η χρήση και η παραγωγή τους πρέπει να τελεί κάτω
από συνεχή παρακολούθηση από τις αρμόδιες αρχές (Regulatory authorities) και από τους αρμόδιους κοινο-
ποιημένους οργανισμούς (Notified Bodies) αντίστοιχα. Είναι πολύ σημαντικό να υπάρχει αποτελεσματικός
μηχανισμός επαγρύπνησης (vigilance), ώστε να προληφθούν η λανθασμένη χρήση τους αλλά και οι λανθα-
σμένες ιατρικές επιλογές που μπορούν να οδηγήσουν σε σοβαρές επιπλοκές ή ακόμη και σε θάνατο του α-
σθενούς.
Για την Ελλάδα ισχύει η Οδηγία 98/79/EC που αφορά στη διακίνηση και τον έλεγχο των in vitro δια-
γνωστικών ιατροτεχνολογικών προϊόντων (IVD, βλ. Κεφάλαιο 7) στην Ευρωπαϊκή Ένωση (Directive, 1998).
Στην κατηγορία αυτή ανήκουν όλα τα προϊόντα που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια: τα εμπο-
ρικά διαθέσιμα διαγνωστικά kits των κατασκευαστών (manufacturers), αλλά και τα αντιδραστήρια που χρη-
σιμοποιούνται για τις εσωτερικές μεθόδους του εργαστηρίου (in-house tests ή αλλιώς LTDs, laboratory-
developed tests) μόνο για διαγνωστική χρήση (και όχι για ερευνητικούς σκοπούς). Ουσιαστικά στην κατηγο-
ρία αυτή ανήκουν όλα τα αντιδραστήρια ή τα αναλώσιμα ή ο εξοπλισμός τα οποία χρησιμοποιούνται για τη
διενέργεια εργαστηριακών εξετάσεων που καλύπτονται οικονομικά μερικώς ή ολικώς από τα συστήματα υ-
γείας ανά τον κόσμο (κρατικούς και ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς).
Τα αντιδραστήρια τα οποία συμμορφώνονται με την οδηγία αυτή κυκλοφορούν στα κράτη-μέλη της
Ευρωπαϊκής Ένωσης με το χαρακτηριστικό σήμα CE (Conformité Europeéne) για IVD (Σχήμα 9.1). Η οδη-
γία αυτή οδήγησε σε αύξηση της ασφάλειας της χρήσης των συγκεκριμένων αντιδραστηρίων αλλά και της
καινοτομίας για τα προϊόντα που είτε παράγονται είτε εισάγονται στην Ευρωπαϊκή Ένωση κατ’ αντιστοιχία
με άλλες περιοχές του πλανήτη όπως π.χ. στις ΗΠΑ όπου ισχύουν οι οδηγίες του FDA (Food and Drug Ad-
ministration). Ωστόσο, είναι γεγονός ότι από την υιοθέτηση της Οδηγίας 98/79/EC το 1998 έως τώρα, έχουν
261
προκύψει καινούργια δεδομένα καθώς έχουν εισαχθεί πολλές νέες εργαστηριακές παράμετροι αλλά και υ-
πάρχει αυξημένη πίεση από ευρωπαϊκές ενώσεις ασθενών και Οργανισμούς Υγείας για βελτιωμένη ποιότητα
και ασφάλεια όλων αυτών των αντιδραστηρίων Στην ισχύουσα οδηγία προβλέπονται απαιτήσεις επικύρωσης
της χρήσης και αυξημένου στατιστικού ελέγχου της παραγωγής μόνο όσων αντιδραστηρίων χρησιμοποιού-
νταν για την ανάλυση παραμέτρων κυρίως της Λίστας Α (HIV1/2, HTLV, HBV, HCV, HDV, ABO, Rhesus)
και κατά δεύτερο λόγο της Λίστας Β (TORCH panel, HLA A/B/DR, τρισωμία 21, φαινυλοκετονουρία, PSA,
παρακλίνια ανίχνευση γλυκόζης).
Πολλές επιστημονικές ενώσεις - ανάμεσά τους και η IFCC (International Federation of Clinical
Chemistry) και η EFLM (European Federation of Laboratory Medicine) - βοήθησαν μέσω συμμετοχών με-
λών τους σε ομάδες εργασίας, επιτροπές και διεθνή φόρα στο να ζητηθεί η αναθεώρηση της οδηγίας
98/79/EC και μάλιστα να αναβαθμισθεί πλέον σε Κανονισμό (Regulation), κάτι που θα έχει ως αποτέλεσμα
την αυστηροποίηση του θεσμικού πλαισίου. Μετά από δημόσια διαβούλευση με τους ενδιαφερόμενους φο-
ρείς που διήρκεσε περίπου 2 χρόνια, η Ευρωπαϊκή επιτροπή (Commission) στις 26/09/2012 δημοσίευσε προ-
τεινόμενο Κανονισμό και ξεκίνησαν οι διαδικασίες για την ψήφισή του. Στο Ευρωπαϊκό Κοινοβούλιο (Euro-
parliament) ψηφίστηκε με σημαντικές τροποποιήσεις στις 24 Οκτωβρίου 2013 και έκτοτε γίνεται διαπραγμά-
τευση με το Ευρωπαϊκό συμβούλιο (council) που αντιπροσωπεύεται από τις εκάστοτε Προεδρίες ώστε τα 3
μέρη (trilogue) να καταλήξουν σε συμφωνία για το τελικό κείμενο. Έχουν ήδη συμφωνηθεί τα ακόλουθα:
 Ο προτεινόμενος κανονισμός θα στηρίζει την προτεινόμενη από την GHTF (Global Harmonization Task
Force, πλέον το νέο όνομα της είναι International Medical Device Regulators Forum) ορθολογική κατά-
ταξη των αντιδραστηρίων σε 4 κατηγορίες (από το A έως το D) με βάση 7 κανόνες (rules-based classifica-
tion) που αξιολογούν τον ατομικό και δημόσιο κίνδυνο του νοσήματος που ελέγχει το υπό εξέταση αντι-
δραστήριο.
 Η κατάταξη αυτή θα αντιστοιχεί σε αυξανόμενες απαιτήσεις τόσο στον κατασκευαστή για τη διατήρηση
συστημάτων ολικής διαχείρισης ποιότητας (total quality management system ή TQM) και για την υποβο-
λή πλήρους φακέλου (Summary Technical Documentation ή STED) με τη σχετική τεκμηρίωση για την
αναλυτική και κλινική επικύρωση των παραγόμενων αντιδραστηρίων όσο και στην εκάστοτε ελέγχουσα
Αρχή για επιτόπιους ελέγχους της συμμόρφωσης του κατασκευαστή (Conformity assessment). Η αλυσίδα
παραγωγής και διακίνησης θα μπορεί να ελέγχεται και με μη-προγραμματισμένες επιθεωρήσεις (unan-
nounced audits).
 Το κάθε αντιδραστήριο θα φέρει μοναδιαίο αριθμό UDI (unique device identification) με το οποίο θα
ταυτοποιείται τόσο το είδος του όσο και η παρτίδα παραγωγής. Η παρακολούθηση προβλημάτων που α-
πορρέουν από τη χρήση των IVD αντιδραστηρίων (post-market surveillance), μέσω του αριθμού UDI θα
καταχωρείται στην εξειδικευμένη βάση δεδομένων EudaMed.
Επίσης αναφορικά με τα in-house tests που χρησιμοποιούνται για διαγνωστική χρήση κυριαρχεί η
άποψη ότι θα επιτρέπονται για όλες τις κατηγορίες αντιδραστηρίων, αρκεί να εκτελούνται από κλινικά εργα-
στήρια διαπιστευμένα σύμφωνα με το πρότυπο ISO15189 το οποίο απαιτεί πλήρη επικύρωση των in-house
μεθόδων που χρησιμοποιούν (EN ISO 15189: 2012).
Συμπερασματικά, η προτεινόμενη κατάταξη θα πολλαπλασιάσει σημαντικά τον αριθμό των εργα-
στηριακών παραμέτρων με αυξημένες απαιτήσεις και κατά συνέπεια και το τελικό κόστος σε κατασκευαστές
και εργαστήρια. Στόχος βέβαια του νέου κανονισμού θα πρέπει να είναι ο συγκερασμός των απόψεων του
κοινού για αυξημένη ασφάλεια αλλά και των κατασκευαστών, ώστε να συνεχίσουν να παράγουν και να προ-
σφέρουν αντιδραστήρια στην Ευρωπαϊκή αγορά καθώς επίσης και να βελτιώνουν τα προϊόντα τους ή να ανα-
ζητούν λύσεις σε σπάνια νοσήματα (Favaloro et al., 2011).
262
Σχήμα 9.1 Χαρακτηριστικό σήμα για CE marking που πρέπει να υπάρχει στην ετικέτα και τα εσώκλειστα ενός IVD αντι-
δραστηρίου (πρέπει να έχει μέγεθος μικρότερο των 5 mm).
9.2 Γενικές προδιαγραφές των IVDs

Τα ΙVD προϊόντα πρέπει να έχουν σχεδιασθεί και κατασκευασθεί με τέτοιο τρόπο ώστε, εφ’ όσον χρησιμο-
ποιηθούν για την ενδεικνυόμενη χρήση και με τρόπο σύμφωνο με τις οδηγίες του κατασκευαστή, να μη θέ-
τουν σε κίνδυνο ούτε τους ασθενείς αλλά ούτε και το εργαστηριακό προσωπικό που τα χειρίζεται. Εάν υπάρ-
χουν κίνδυνοι για τους ανωτέρω χρήστες αυτοί πρέπει να ελαχιστοποιηθούν και οι χρήστες να ενημερωθούν
για τυχόν υπολειπόμενο κίνδυνο ή άλλους περιορισμούς (limitations) στη χρήση τους. Η επίδοση τους δεν
πρέπει να επηρεάζεται από τις συνθήκες μεταφοράς και αποθήκευσης (σύμφωνα πάντα με τις οδηγίες του
κατασκευαστή). Πρέπει να είναι κατάλληλα προς κλινική χρήση, συνεπώς πρέπει να πληρούν τις προδιαγρα-
φές που έχουν τεθεί για τη διαγνωστική ευαισθησία και τη διαγνωστική ειδικότητα. Πρέπει να επιτυγχάνουν
τα αναλυτικά χαρακτηριστικά τα οποία έχει υπολογίσει και έχει αναφέρει ο κατασκευαστής στον φάκελο
STED, ώστε να εκδώσει το πιστοποιητικό συμμόρφωσης και να πάρει το σήμα CE για IVD (Declaration of
conformity). Τα χαρακτηριστικά αυτά πρέπει να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια των προϊόντων αυ-
τών με τις οδηγίες χρήσης (θα αναφερθούν εκτενέστερα στις επόμενες Ενότητες 9.3 - 9.4). Η ιχνηλασιμότητα
τους (όπου υπάρχει μετρητική ιδιότητα) πρέπει να αναφέρεται σε πρότυπες μεθόδους ή υλικά αναφοράς υ-
ψηλής τάξης, όπου υπάρχουν (οι έννοιες αυτές θα αναφερθούν εκτενέστερα στο επόμενο Κεφάλαιο 10).
Πιο ειδικά τα ΙVD προϊόντα πρέπει:
 Να είναι σχεδιασμένα ώστε να φέρουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες κατά την παραγωγή τους για
να μη διαρρέουν και να μην επιμολύνουν τους μεταφορείς και το προσωπικό που τα αποθηκεύει και τα
χειρίζεται.
 Όταν περιέχουν μικροοργανισμούς ή άλλα βιολογικά υλικά, να έχουν ελάχιστο κίνδυνο μετάδοσης λοί-
μωξης. Πρέπει να κατασκευάζονται με ελεγχόμενες περιβαλλοντικά συνθήκες σε καθαρές εγκαταστάσεις.
Να χρησιμοποιούνται επικυρωμένες μέθοδοι για την αποστείρωση όσων ΙVD προϊόντων έχουν χαρακτη-
ρισθεί ανάλογα και φέρουν την αντίστοιχη σήμανση.
 Πρέπει να είναι εργονομικά κατασκευασμένα και να μην επηρεάζεται η απόδοσή τους από εξωτερικούς
παράγοντες όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρασία και θερμοκρασία. Να είναι, κατά το δυνατόν,
φιλικά προς το περιβάλλον κατά την ασφαλή απόρριψή τους.
 Όταν είναι κατασκευασμένα να εκπέμπουν ραδιενέργεια, η ποσότητα αυτής πρέπει να είναι ελεγχόμενη
και οι χρήστες να είναι ενήμεροι για το είδος της και τους τρόπους προστασίας τους. Πρέπει τα ΙVD προ-
ϊόντα με ραδιενεργά υλικά να φέρουν εμφανώς την ειδική σήμανση.
 Να είναι ασφαλή, όταν συνδέονται με το ηλεκτρικό ρεύμα (για την αποφυγή ηλεκτροπληξιών) ή με το
υδραυλικό δίκτυο ή με αέριο (όπου χρειάζεται). Ιδιαίτερη φροντίδα πρέπει να υπάρχει, ώστε να μην επη-
ρεάζονται ηλεκτρομαγνητικά άλλες συσκευές στον ίδιο χώρο. Οι δονήσεις και ο θόρυβος που προκαλούν
πρέπει να είναι ο ελάχιστος δυνατός. Εάν αποτελούνται από κινητά μέρη και υπάρχουν μηχανικοί κίνδυ-
νοι κατά τη συναρμολόγηση ή την αποσυναρμολόγηση τους (πχ. κατά τη συντήρησή τους), οι κατάλληλες
προφυλάξεις πρέπει να είναι γνωστές.
263
9.3 Ετικέτα και εσώκλειστα φυλλάδια των IVDs
Κάθε ΙVD προϊόν πρέπει να συνοδεύεται από επαρκείς πληροφορίες εκ μέρους του κατασκευαστή η
οποία να εμπεριέχεται στην ετικέτα και στα εσώκλειστα φυλλάδια με τις οδηγίες χρήσης. Η χρήση συμβό-
λων, σημάτων κινδύνου ή/και χρωματικής επισήμανσης είναι υποχρεωτική και γίνεται με βάση σχετικά ε-
ναρμονισμένα πρότυπα (harmonized standards).
Η ετικέτα ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιέχει τα ακόλουθα:
 όνομα και διεύθυνση του κατασκευαστή και, εάν πρόκειται για εισαγόμενο είδος στην Ευρωπαϊκή Ένω-
ση, να περιλαμβάνει επιπλέον και το όνομα και τη διεύθυνση του εξουσιοδοτημένου αντιπροσώπου,
 ταυτοποίηση του είδους και του περιεχομένου,
 ένδειξη STERILE για αποστειρωμένο είδος ή αναφορά σε μικροβιολογικό φορτίο (όπου απαιτείται),
 αριθμό παρτίδας παραγωγής του αντιδραστηρίου (lot number) ή τον σειριακό αριθμό (serial number) του
εξοπλισμού,
 ημερομηνία λήξεως ασφαλούς χρήσης του,
 συνθήκες χειρισμού και αποθήκευσής του,
 τυχόν προειδοποιητικά σύμβολα ή ενδείξεις χρήσης.
Οι οδηγίες χρήσης στο εσώκλειστο φυλλάδιο ενός ΙVD προϊόντος πρέπει να περιλαμβάνουν τα κάτωθι:
 δεδομένα από την ετικέτα εκτός του αριθμού παρτίδας ή εξοπλισμού και της ημερομηνία λήξεως,
 ημερομηνία και αριθμό έκδοσης (version) της οδηγίας χρήσης,
 σκοπό χρήσης και περιορισμούς (όπου υπάρχουν),
 κατάλογο περιεχομένων με αναφορά σε συγκεντρώσεις ουσιών, (όπου χρειάζεται),
 συνθήκες αποθήκευσης και χρόνο σταθερότητας, όταν ανοιχθεί η συσκευασία,
 προφυλάξεις από μηχανικούς ή βιολογικούς ή ραδιενεργούς κινδύνους,
 τι άλλο είδος εξοπλισμού ή τι άλλα αντιδραστήρια απαιτούνται,
 είδος των δειγμάτων για τα οποία είναι κατάλληλο,
 αρχή της μεθόδου,
 τον τρόπο συναρμολόγησης ή ελέγχου του εξοπλισμού ή της ανασύστασης διαλυμάτων ή της αραίωσης
των δειγμάτων ή της αποστείρωσης υλικών (όπου απαιτούνται),
 πρωτόκολλο εργασίας,
 τυχόν μαθηματική σχέση που απαιτείται για την εξαγωγή του αναλυτικού αποτελέσματος ή τυχόν λογι-
σμικό το οποίο απαιτείται,
 εάν απαιτείται ειδική εκπαίδευση για το προσωπικό που θα το χειρισθεί,
 τρόπο και συχνότητα βαθμονόμησης,
 ιχναλησιμότητα της μεθόδου με πιστοποιημένο υλικό αναφοράς ή σύγκριση με μέθοδο αναφοράς (θα α-
ναφερθεί στο Kεφάλαιο 10),
 αναλυτικά χαρακτηριστικά της μεθόδου (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.4),
 οδηγία για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότητας,
 τιμές αναφοράς (θα αναφερθούν στην Ενότητα 9.5),
 τρόπο ασφαλούς απόρριψης των αποβλήτων ή και ανακύκλωσης, όπου είναι αυτό δυνατό,
 προφυλάξεις για τυχόν έκθεση σε εξωτερικούς παράγοντες, όπως πίεση, ηλεκτρομαγνητικά πεδία, υγρα-
σία και θερμοκρασία,
 οδηγίες για το τι χρειάζεται να γίνει σε περίπτωση που η συσκευασία έχει πειραχθεί ή αλλοιωθεί,
 συχνότητα συντήρησης.
Αυξημένες απαιτήσεις υπάρχουν για τα ΙVD προϊόντα αυτοεξέτασης (self-testing) καθώς αποτε-
λούν μια ιδιαίτερη κατηγορία των παρακλίνιων (POCT βλ. Κεφάλαιο 7) προϊόντων: εκτελούνται από τον
κοινό άνθρωπο στην οικία του και όχι από εκπαιδευμένο εργαστηριακό προσωπικό. Συνεπώς πρέπει να είναι
σχεδιασμένα έτσι, ώστε η επίδοσή τους να μην εξαρτάται ιδιαίτερα από την τεχνική και το περιβάλλον του
χρήστη.
264
Πρέπει να είναι επισημασμένα με ανάλογη ετικέτα και οι οδηγίες χρήσης να είναι απλές και ξεκάθα-
ρες ώστε να αποφεύγονται λάθη στο χειρισμό και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Όπου είναι εφικτό,
πρέπει να υπάρχουν τρόποι ελέγχου από το χρήστη, ώστε να εξασφαλιστεί ότι εκτελεί κατάλληλα τη διαδι-
κασία ανάλυσης. Οι οδηγίες χρήσης πρέπει να ερμηνεύουν ένα αποτέλεσμα ως θετικό ή αρνητικό ή απροσ-
διόριστο και να υποδεικνύουν τη πιθανότητα ψευδώς αρνητικού ή θετικού αποτελέσματος. Πρέπει να είναι
σαφές στον χρήστη ότι δεν μπορεί να λάβει ιατρικές αποφάσεις, εάν δεν επικοινωνήσει με τον θεράποντα
ιατρό και ότι, εάν το προϊόν χρησιμοποιείται για παρακολούθηση θεραπείας, ότι δεν πρέπει να αλλάξει το
θεραπευτικό του σχήμα, εάν δεν είναι κατάλληλα εκπαιδευμένος.
9.4 Αναλυτικά χαρακτηριστικά των ΙVD αντιδραστηρίων

Τα αναλυτικά χαρακτηριστικά των IVD προϊόντων που έχουν μετρητική ιδιότητα (measuring function) όπως
π.χ. τα kit αντιδραστηρίων, λαμβάνονται από δεδομένα επικύρωσης (validation) η οποία εκτελείται από
τους κατασκευαστές. Ελέγχονται δε, σύμφωνα με τις διεθνείς ισχύουσες προδιαγραφές. Είναι τα ακόλουθα
τα οποία πρέπει και να αναφέρονται στα εσώκλειστα φυλλάδια (Λειμονή, 2006· Κουππάρης, 2008·
EURACHEM/LGC, 1998· Μητρόπουλος, 2003· Thompson et al., 2002· Παναγιωτάκης, 2003):
1) Μεθοδολογικά χαρακτηριστικά (methodology characteristics):
- Αναλυτική ευαισθησία (analytical sensitivity): να μην συγχέεται με το όριο ανίχνευσης, είναι ουσιαστι-
κά η κλίση της καμπύλης αναφοράς σήματος (signal) προς συγκέντρωση C (dS/dC) ή μάζα μετρούμενης ου-
σίας.
- Αναλυτική ειδικότητα (analytical specificity): τα αντιδραστήρια ανιχνεύουν μόνο τη ζητούμενη παρά-

μετρο και δεν έχουν διασταυρούμενη δραστικότητα (cross reactivity) με άλλες παρεμφερείς ή όχι ουσίες. Εάν
υπάρχει παρεμβολή (interference) με ουσίες παρεμποδιστές, αυτή πρέπει να αναφέρεται.
2) Χαρακτηριστικά επίδοσης (performance characteristics):
– Πιστότητα (precision): μετράει τη διασπορά επαναλαμβανόμενων αποτελεσμάτων σε ένα δείγμα και

αντανακλά το τυχαίο σφάλμα της μεθόδου (random error) όταν η μέθοδος εκτελείται κάτω από ρητά προκα-
θορισμένες συνθήκες. Μέτρα της μη-πιστότητας (imprecision) αποτελούν η τυπική απόκλιση SD (Standard
Deviation) και η σχετική τυπική απόκλιση RSD (Relative Standard Deviation) ή αλλιώς, ο συντελεστής με-
ταβλητότητας CV (Coefficient of Variation) όπως αυτός ορίζεται στην Εξίσωση 9.1:
𝑆𝐷×100
𝐶𝑉 = 𝛭έ𝜎𝜊𝜍 ό𝜌𝜊𝜍 𝜇𝜀𝜏𝜌ή𝜎𝜀𝜔𝜈
Υποσύνολα αποτελούν: α) η επαναληπτικότητα r (repeatability) που εκτελείται σε βραχύ χρονι-

κό διάστημα συνήθως εντός της ίδιας αναλυτικής σειράς (within-run) ή τουλάχιστον εντός της ίδιας ημέρας
(within-day) και β) η ενδιάμεση αναπαραγωγιμότητα R (intermediate reproducibility) που εκτελείται
μεταξύ διαφορετικών αναλυτικών σειρών ή ημερών (between-run, between days). Αναμένεται ότι SDR>SDr.
Συστήνεται να εκτελείται σε βάθος χρόνου (έως 3-6 μήνες) εντός του ίδιου εργαστηρίου με διαφορετικές
παρτίδες αντιδραστηρίου και διαφορετικούς χρήστες. Για τη λήψη δεδομένων πιστότητας χρησιμοποιούνται
2 ή 3 επίπεδα συγκεντρώσεων της υπό εξέταση εργαστηριακής παραμέτρου (φυσιολογικό, άνω- ή κάτω του
φυσιολογικού) σε συνθετικά δείγματα ελέγχου (synthetic controls) ή/και σε πραγματικά δείγματα ασθενών ή
υγιών μαρτύρων. Με στατιστική ανάλυση ANOVA από τα δεδομένα σε διαφορετικά επίπεδα συγκεντρώσε-
ων μπορεί να ληφθεί μια μόνο τιμή πιστότητας, η συνδυασμένη πιστότητα (combined precision). Με την
αναπαραγωγιμότητα σχετίζεται και το χαρακτηριστικό της αντοχής (ruggedness) της μεθόδου, όταν εκτε-
λείται η μέτρηση με διαφορετικές παρτίδες αντιδραστηρίου σε διαφορετικά αναλυτικά συστήματα ή/και ερ-
γαστήρια με διαφορετικούς χειριστές. Επίσης όταν λαμβάνονται δεδομένα πιστότητας με μικρές προσχεδια-
σμένες μεταβολές του πρωτοκόλλου εργασίας (π.χ. μεταβολή στις συνθήκες αποθήκευσης, pH, θερμοκρασί-
ας, χρόνου επώασης κλπ.) τότε έχουμε εικόνα της ανθεκτικότητας (robustness) της μεθόδου.
Ως προδιαγραφή αποδοχής της πιστότητας του αντιδραστηρίου, συνήθως χρησιμοποιείται, εάν υπάρ-
χει, η βιολογική μεταβλητότητα (biological variation) η οποία εκφράζει την περιοδική και τυχαία διακύ-
265
μανση γύρω από μια πραγματική τιμή in vivo. Τέτοια δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας μπορούν να α-
νευρεθούν στη βιβλιογραφία (Ricos et al., 1999) ή στο διαδίκτυο (π.χ. στον διαδικτυακό τόπο
www.westgard.com). Έτσι ορίζεται ότι η μέγιστη μη-πιστότητα πρέπει να είναι CVmax ≤ 0,5 CVbw όπου bw
είναι η ενδο-ατομική βιολογική μεταβλητότητα (inter-individual, bw) στο ίδιο άτομο με τη πάροδο του
χρόνου. Όταν δεν υπάρχουν δεδομένα βιολογικής μεταβλητότητας, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η εξίσωση
Horwitz (Εξίσωση 9.2) όπου C είναι η συγκέντρωση της μετρούμενης ουσίας:
𝐶𝑉 ≤ 2(1−0,5𝑙𝑜𝑔𝐶) (Εξίσωση 9.2)
– Ορθότητα (trueness): είναι η διαφορά του μέσου όρου των μετρήσεων από την αληθή τιμή λόγω συστη-
ματικού σφάλματος της μεθόδου (systematic error) όταν αυτή εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες εργασί-
ας. Μέτρα της μη-ορθότητας αποτελούν συνήθως η απόλυτη διαφορά ή αλλιώς μεροληψία (bias) ή η ε-
κατοστιαία διαφορά (Β%). Ιδανικά λαμβάνεται με πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ειδάλλως με κατάλλη-
λα δείγματα εσωτερικού ελέγχου controls -είτε εμπορικώς διαθέσιμα είτε του ίδιου του kit αντιδραστηρί-
ων- που διαθέτουν τιμή στόχο. Το z-score ορίζεται με βάση την Εξίσωση 9.3 ως:
𝛢𝜋𝜊𝜏έ𝜆𝜀𝜎𝜇𝛼 𝜇𝜀𝜃ό𝛿𝜊𝜐 – 𝛵𝜄𝜇ή 𝜎𝜏ό𝜒𝜊𝜍 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

𝑧= (Εξίσωση 9.3)
𝑆𝐷𝜇𝜀𝜏𝜌ή𝜎𝜀𝜔𝜈
Επίσης εκτίμηση της ορθότητας λαμβάνεται και από την επίδοση της μεθόδου σε συμμετοχή σε ενδο-
εργαστηριακές συγκρίσεις (ring trials, interlaboratory comparisons) και σχήματα ικανότητας (proficiency
testing) ή εξωτερικού ελέγχου ποιότητας (EQAs, external quality assessments). Στην περίπτωση αυτή, ορίζε-
ται αντίστοιχα ο δείκτης SDI (standard deviation index), όπου στην εξίσωση 9.2 αντί της τιμής στόχου χρη-
σιμοποιείται η τιμή consensus, που λαμβάνεται από στατιστική επεξεργασία του συνόλου των εργαστηρίων
(μετά την αφαίρεση των ακραίων τιμών, outliers). Και οι δύο δείκτες υποδεικνύουν το ίδιο: την απόσταση σε
τιμές τυπικής απόκλισης που φέρει το αποτέλεσμα της μεθόδου από την εκάστοτε ιδανική (ή αληθή) τιμή. Η
μέθοδος που χρησιμοποιεί το IVD αντιδραστήριο είναι άριστη όταν οι δείκτες z ή SDI είναι < 1, ενώ είναι
οριακή καλή, όταν είναι μεταξύ 2 και 3 και μη αποδεκτή, όταν υπερβαίνει το 3.
Ένας άλλος τρόπος ελέγχου της ορθότητας είναι η ανάκτηση (recovery) όταν προστίθεται μικρή πο-
σότητα μετρούμενης ουσίας σε υψηλή συγκέντρωση σε ένα λευκό (τυφλό) ή θετικό δείγμα (spiking). Συνί-
σταται η ανάμειξη 9:1 ενός δείγματος χαμηλής συγκέντρωσης και ενός βαθμονομητή υψηλής συγκέντρωσης
καθώς με τον τρόπο αυτό ελέγχεται και η ύπαρξη επίδρασης του υποστρώματος (αλλιώς, της μήτρας) του
δείγματος (matrix effect). Η ανάκτηση είναι άριστη όταν είναι μεταξύ 95-105%, ενώ είναι πολύ καλή, όταν
είναι μεταξύ 90 - 110%.
Ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ορθότητας του αντιδραστηρίου (εφ’ όσον υπάρχουν δεδομένα
βιολογικής μεταβλητότητας) ορίζεται το μέγιστο bias (%) στην εξίσωση 9.4 όπου bg είναι η διατομική βιο-
λογική μεταβλητότητα (intra-individual, bg) μεταξύ διαφόρων ατόμων:
𝑀𝑎𝑥 𝐵𝑖𝑎𝑠 (%) < 0,25 √(𝐶𝑉𝑏𝑤)2 + (𝐶𝑉𝑏𝑔)2 (Εξίσωση 9.4)
– Ακρίβεια (accuracy): είναι το άθροισμα της ορθότητας και της πιστότητας της μεθόδου που θα ληφθεί
από μία μόνο μέτρηση και ουσιαστικά δείχνει την αξιοπιστία της. Στο Σχήμα 9.2 δίνονται παραδείγματα: α)
ορθής μεθόδου χωρίς όμως καλή πιστότητα β) μη ορθής μεθόδου χωρίς καλή πιστότητα γ) μη ορθής μεθόδου
με καλή πιστότητα και τέλος δ) αξιόπιστης μεθόδου με καλή ακρίβεια: ορθή και με καλή πιστότητα.
266
Σχήμα 9.2 Παραδείγματα μεθόδων με διαφορετική ακρίβεια σε σχέση με την ορθότητα και την πιστότητα.
Μέτρο της ανακρίβειας (inaccuracy) είναι το μέγιστο ολικό αναλυτικό σφάλμα που ισούται με το
άθροισμα του συστηματικού και του τυχαίου σφάλματος. Στο Σχήμα 9.3 φαίνονται διαγραμματικά όλες οι
τιμές που μπορεί να πάρει το σφάλμα σε μέτρηση παραμέτρου όπου το τυχαίο σφάλμα διαθέτει κανονική
κατανομή κατά Gauss: τότε το μέγιστο τυχαίο σφάλμα για διάστημα εμπιστοσύνης 95% είναι δύο φορές η
τυπική απόκλιση και εάν προσθέσουμε και το συστηματικό σφάλμα λαμβάνουμε το ολικό αναλυτικό σφάλμα
(συμβαίνει όταν οι δύο συνιστώσες του σφάλματος δρουν προς την αντίθετη κατεύθυνση).
Σχήμα 9.3 Ολικό σφάλμα σε μετρήσεις με κανονική κατανομή.
267
Έχει ορισθεί ως προδιαγραφή για την αποδοχή της ακρίβειας ότι το αποδεκτό ολικό σφάλμα TEa (To-
tal allowable error) πρέπει να πληροί την Εξίσωση 9.5:
𝛵𝛦𝑎 < 𝜇έ𝛾𝜄𝜎𝜏𝜊 𝜀𝜋𝜄𝜏𝜌𝜀𝜋𝜏ό 𝜎𝜐𝜎𝜏𝜂𝜇𝛼𝜏𝜄𝜅ό 𝜎𝜑ά𝜆𝜇𝛼 + 1,65 × (𝜇𝜀𝛾ί𝜎𝜏𝜊 𝜀𝜋𝜄𝜏𝜌𝜀𝜋𝜏ό 𝜏𝜐𝜒𝛼ί𝜊 𝜎𝜑ά𝜆𝜇𝛼) (Ε-
ξίσωση 9.5)
– Όριο ανίχνευσης (limit of detection ή LOD)
Μπορεί να ορισθεί με στατιστικό τρόπο μετά από επαναλαμβανόμενες μετρήσεις ενός λευκού (τυ-
φλού, blank) δείγματος και ενός πολύ αραιού δείγματος (ή control) με πείραμα επαναληπτικότητας.
Στην αρχή υπολογίζεται το LOB (limit of blank) με μετρήσεις του λευκού (Εξίσωση 9.6):
𝐿𝑂𝐵 = 𝛭έ𝜎𝜊𝜍 ό𝜌𝜊𝜍 𝜇𝜀𝜏𝜌ή𝜎𝜀𝜔𝜈 (𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘) + 1,645 × 𝑆𝐷𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 (Εξίσωση 9.6)
Κατόπιν στην Εξίσωση 9.7 υπολογίζεται το LOD με αντικατάσταση από την Εξίσωση 9.6 και λόγω
του ότι SDblank ≈ SDαραιού προκύπτει:
𝐿𝑂𝐷 = 𝐿𝑂𝐵 + 1,645 × 𝑆𝐷𝛼𝜌𝛼𝜄𝜊ύ ≈ 𝛭έ𝜎𝜊𝜍 ό𝜌𝜊𝜍 𝜇𝜀𝜏𝜌ή𝜎𝜀𝜔𝜈 (𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘) + 3,3 × 𝑆𝐷𝛼𝜌𝛼𝜄𝜊ύ (Εξίσωση 9.7)
Για ευκολία ορίζουμε LOD = 3,3 × SDαραιού, καθώς ο μέσος όρος του λευκού δείγματος μπορεί να
θεωρηθεί μηδέν.
Εναλλακτικά, με εμπειρικό τρόπο και με μέτρηση πολύ αραιών δειγμάτων ορίζεται το LOD ως η
συγκέντρωση της μετρούμενης παραμέτρου η οποία μπορεί να ανιχνευθεί στο ~95% των μετρήσεων (π.χ. 19
στις 20 προσπάθειες) ή ακόμη καλλίτερα, με στατιστική probit ανάλυση.
Το όριο ανίχνευσης είναι ένα πολύ χρήσιμο αναλυτικό χαρακτηριστικό στη σύγκριση ικανότητας δια-
φορετικών μεθόδων και ιδιαίτερα σε αυτές τις παραμέτρους όπου υπάρχει μεγάλη κλινική σημασία. Απαιτεί-
ται η αναφορά του από τον κατασκευαστή και στις ποιοτικές ή ημιποσοτικές μεθόδους.
– Όριο ποσοτικοποίησης (limit of quantification ή LOQ ή Lower limit of quantification ή LLQ):
Ορίζεται με στατιστικό τρόπο ως 3,3 × LOD (συνεπώς με βάση τα ανωτέρω: LOQ = ~10 × SD αραιού)
Εναλλακτικά, ορίζεται ως η χαμηλότερη συγκέντρωση της παραμέτρου όπου η μέθοδος ακόμη διαθέτει ικα-
νοποιητικό CV (π.χ. 20% στις ανοσοχημικές δοκιμασίες).
– Γραμμικότητα (linearity) μεθόδου και αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range)
Εκτελείται με τουλάχιστον 6 πρότυπα διαλύματα ή βαθμονομητές (calibrators) ή δείγματα σε σειρια-

κή αραίωση πυκνού βαθμονομητή, εις τριπλούν (σε τουλάχιστον 5 καμπύλες αναφοράς). Αφού αποκλει-
σθούν οι ακραίες τιμές, γίνεται έλεγχος με γραμμική παλινδρόμηση (linear regression simple ή κατά
Deming). Όταν r2  0,99 το μοντέλο γραμμικότητας είναι καλό και γίνονται αποδεκτά όλα τα σημεία της κα-
μπύλης αναφοράς και ορίζεται το αναλυτικό εύρος μέτρησης (measuring range ή αλλιώς, analytical
measuring interval, AMR ή απλά measuring interval) ως: LOQ – όριο γραμμικότητας (μέγιστος αποδε-
κτός βαθμονομητής). Διαφορετικά, γίνεται απόρριψη των σημείων μη-γραμμικότητας και μικραίνει το εύρος
μέτρησης. Σημειώνεται ότι, όταν γίνεται αραίωση των δειγμάτων, προκύπτει και το αναφερόμενο εύρος (re-
portable range) το οποίο θα είναι πάντοτε ευρύτερο του AMR.
Για τα τελευταία αυτά αναλυτικά χαρακτηριστικά συνήθως δεν υπάρχουν προδιαγραφές, όμως οι κα-
τασκευαστές των IVD αντιδραστηρίων οφείλουν να τα μετρήσουν και να τα αναφέρουν. Επίσης αναφέρουν
και τη σύγκριση της μεθόδου (method comparison) τους με πρότυπη μέθοδο αναφοράς ή με άλλη παλαιό-
τερη διαθέσιμη και αποδεκτή διεθνώς μέθοδο. Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με ευρύ πεδίο τιμών με-
τράται ένας μεγάλος αριθμός δειγμάτων (> 40, εις διπλούν) και με τις δύο μεθόδους και γίνεται συγκριτικό
διάγραμμα και στατιστική ανάλυση με γραμμική παλινδρόμηση (κατά Deming ή Passing-Bablock) (Linnet,
268
1998· Passing Bablok, 1984). Καταρχήν, ελέγχεται εάν υπάρχει αποδεκτό εύρος τιμών (r > 0,975). Η συμ-
φωνία των μεθόδων ελέγχεται ως εξής: δεν υπάρχει αναλογική μεροληψία όταν η κλίση (slope) της παλιν-
δρόμησης είναι μεταξύ 0,95 - 1,05 ενώ δεν υπάρχει σταθερή μεροληψία όταν εκτελώντας t-test της τεταγμέ-
νης του κάθετου άξονα (intercept) με το μηδέν υπολογίζεται ότι το p > 0,5. Εναλλακτικά, μπορεί να γίνει και
διάγραμμα διαφοράς τιμών (Difference plot κατά Bland-Altman) μεταξύ των δύο μεθόδων (Bland Altman,
1986). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποσοτική με μικρό εύρος τιμών, μπορεί και να γίνει απλά ένα t-test κατά
ζεύγη (paired). Όταν η νέα μέθοδος είναι ποιοτική, τότε μπορεί να υπολογιστεί το ποσοστό συμφωνίας θετι-
κών/αρνητικών (% Concordance) και να υπολογισθεί ο συντελεστής kappa (> 0,8 όταν υπάρχει μεγάλη συμ-
φωνία) ή να γίνει Mc Nemar’s στατιστικό τεστ.
9.5 Προσδιορισμός τιμών αναφοράς

Η ερμηνεία των αποτελεσμάτων των κλινικών εργαστηρίων υποβοηθείται σημαντικά από την ύπαρξη τιμών
αναφοράς (reference values) ανά παράμετρο. Τα όρια των τιμών αναφοράς (reference limits) είναι συνή-
θως δύο και το διάστημα μεταξύ τους καλείται διάστημα ή εύρος τιμών αναφοράς (reference interval ή
range). Σε ορισμένες παραμέτρους δεν υπάρχουν τιμές αναφοράς αλλά όρια αποφάσεων (decision limits)
για τη λήψη θεραπείας (π.χ. στη χοληστερόλη, στη γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη κ.λπ.). Δεν πρέπει να πα-
ραβλεφθεί το γεγονός ότι η παρακολούθηση σημαντικών μεταβολών μιας παραμέτρου ακόμη και εντός του
διαστήματος αναφοράς μπορεί να υποδηλώνει αρχή νοσήματος (συνεπώς παλαιότερα καλούνταν λανθασμέ-
να φυσιολογικές τιμές). Προκύπτουν από στατιστική επεξεργασία των μετρήσεων της παραμέτρου σε «φαι-
νομενικά υγιή» πληθυσμό αναφοράς (reference population) ο οποίος είναι κατάλληλα επιλεγμένος
(Dybkaer, 1982). Ο προσδιορισμός τους ακολουθεί τα παρακάτω βήματα:
1. Απαριθμούνται όλοι οι παράγοντες βιολογικής και αναλυτικής μεταβλητότητας για την υπό μέτρηση πα-
ράμετρο με βάση τη βιβλιογραφία.
2. Με βάση την ανωτέρω λίστα καθορίζονται κριτήρια αποκλεισμού (exclusion criteria) και κριτήρια
διαχωρισμού του πληθυσμού αναφοράς (partition criteria). Στα πρώτα μπορεί να ανήκουν π.χ. μια ο-
ξεία ή χρόνια παθολογική κατάσταση, η χρόνια λήψη φαρμάκων, η παχυσαρκία, η εγκυμοσύνη, το κάπνι-
σμα, η μακροχρόνια κατανάλωση αλκοόλ ή ναρκωτικών, η εντατική άσκηση κλπ. Τα δεύτερα είναι συνή-
θως το φύλο, η ηλικία, η φυλή κ.λπ. καθώς αυτά αποτελούν συνήθως παράγοντα για διαφορετικά όρια τι-
μών αναφοράς ή ακόμη και για αποκλεισμό των συγκεκριμένων ατόμων.
3. Έγγραφη συγκατάθεση των συμμετεχόντων στον προσδιορισμό των τιμών αναφοράς και συμπλήρωση
κατάλληλου ερωτηματολογίου.
4. Με βάση τα κριτήρια αποκλεισμού και τις απαντήσεις στο ερωτηματολόγιο, αποκλεισμός ορισμένων
συμμετεχόντων και προετοιμασία των υπολοίπων για τη σωστή δειγματοληψία.
5. Λήψη των δειγμάτων και απαρέγκλιτη τήρηση των κατάλληλων προαναλυτικών συνθηκών για τη συλλο-
γή, το χειρισμό, τη μεταφορά και την αποθήκευσή τους.
6. Ανάλυση των δειγμάτων και έλεγχος του ιστογράμματος των αποτελεσμάτων ώστε να απαλειφθούν τυχόν
ακραίες τιμές.
7. Στατιστική ανάλυση είτε α) με παραμετρικό τρόπο όταν η κατανομή των μετρούμενων τιμών ακολουθεί
την κανονική κατανομή (ή την ακολουθεί μετά από κατάλληλο μετασχηματισμό) και χρήση του μέσου
όρου και της τυπικής απόκλισης για την εύρεση του εύρους των τιμών αναφοράς με κάλυψη του 95% του
πληθυσμού, είτε β) με μη-παραμετρικό τρόπο. Στη δεύτερη περίπτωση απαιτούνται τουλάχιστον 120
δείγματα (όμως σε μερικές περιπτώσεις όπως π.χ. σε παιδιατρικό πληθυσμό ή σε ιδιαίτερα ακριβές εξετά-
σεις ή σε ιδιαίτερα δύσκολες ως προς τη δειγματοληψία εξετάσεις, ο αριθμός αυτός δεν είναι δυνατόν να
συμπληρωθεί, οπότε συνίσταται να είναι τουλάχιστον 40). Με αυτόν τον τρόπο ευρίσκεται η διάμεσος τι-
μή και ορίζεται το διάστημα τιμών αναφοράς ως το διάστημα μεταξύ 2,5ου και 97,5ου εκατοστημορίου.
Για ορισμένες παραμέτρους όπως π.χ. τους καρκινικούς ή τους καρδιακούς δείκτες το διάστημα αυτό
μπορεί να διευρυνθεί π.χ. μεταξύ 1ου και 99ου εκατοστημορίου. Το διάστημα εμπιστοσύνης (confidence in-
terval) για κάθε όριο αναφοράς δεν πρέπει να ξεπερνάει το 1/5 του διαστήματος των τιμών αναφοράς.
Η μεταφορά τιμών αναφοράς για την ίδια παράμετρο από μια αναλυτική μέθοδο σε μια άλλη ή σε άλλο ανα-
λυτικό σύστημα στο εργαστήριο μπορεί να γίνει με ένα από τους ακόλουθους δύο τρόπους:
269
Α) Ουσιαστικά με σύγκριση μεθόδων ή αναλυτικών συστημάτων με μετρήσεις ίδιων δειγμάτων (όχι απαραί-
τητα δειγμάτων από πληθυσμό αναφοράς) και με τον τρόπο που προαναφέρθηκε στο 9.4: επισκοπείται η
γραμμική παλινδρόμηση και εάν η κλίση είναι κοντά στο 1 και εντός προκαθορισμένων ορίων, τότε
μπορεί να εκληφθεί ως συμπέρασμα ότι δεν υπάρχει συστηματική διαφορά. Συνεπώς μπορεί να γίνει η
μεταφορά των τιμών αναφοράς.
Β) με σύγκριση των πληθυσμών αναφοράς είτε με βιβλιογραφικά και γεωγραφικά, εθνολογικά κλπ. κριτήρια
είτε με επαλήθευση των τιμών αναφοράς ως εξής: γίνεται επιλογή 20 δειγμάτων πληθυσμού αναφοράς
με ίδια κριτήρια αποκλεισμού και διαχωρισμού και, εάν μετά την απαλοιφή ακραίων τιμών ≤ 2 τιμές με-
τρήσεων εντοπίζονται εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε η μεταφορά των τιμών αναφοράς γίνεται
αποδεκτή. Εάν είναι 3 ή 4 τα δείγματα εκτός του διαστήματος αναφοράς, τότε επαναλαμβάνεται η δια-
δικασία για άλλα 20 δείγματα. Εάν είναι πάνω από 4, τότε πρέπει να ξεκινήσει από την αρχή η πλήρης
διαδικασία προσδιορισμού των τιμών αναφοράς.
270
Αναφορές
1. ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2008) Σημειώσεις Χημειομετρίας. Αθήνα: Πανεπιστήμιο Αθηνών.
2. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε. (2006; pp. 32-40) Επαλήθευση Αναλυτικών Μεθόδων Κλινικών Εργαστηρίων. In:
Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, Αθήνα:
Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας.
3. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp.86-98) Χαρακτηριστικά και αξιολόγηση αναλυτικών μεθόδων. In:
Αναλυτική Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων 1ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, Ed. Αθήνα: Ελληνική
Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας.
4. ΠΑΝΑΓΙΩΤΑΚΗΣ, Ο. (2003; pp.52-85) Αναλυτικά σφάλματα και υπολογισμός τους. In: Αναλυτική
Αξιολόγηση Εργαστηριακών Μετρήσεων. 1ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο. Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής
Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας.
5. FAVALORO, E., PLEBANI, M., LIPPI, G. (2011) Regulation of in vitro diagnostics (IVDs) for use in
clinical diagnostic laboratories: towards the light or dark in clinical laboratory testing? Clin Chem Lab
Med, 49, p. 1965-73.
6. RICOS, C., ALVAREZ, V., CAVA F. et al. (1999) Current databases on biological variation: pros, cons
and progress. Scand J Clin Lab Invest, 59, p. 491-500.
7. THOMPSON, M., ELLISON, SL., WOOD, R. (2002) Harmonized guidelines for single-laboratory
validation of methods of analysis. Pure Appl Chem, 74, p. 835-55.
8. Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro
diagnostic medical devices. Official Journal of the European Communities 1998; L331: 1-37.
9. EN ISO 15189: 2012 Medical laboratories Requirements for quality and competence. 3rd ed.
10.EURACHEM/LGC. (1998) The fitness for purpose of analytical methods.
11.PASSING, H., BABLOK, W. (1984) Comparison of several regression procedures for method comparison
studies and determination of sample sizes. Application of linear regression procedures for method
comparison studies in Clinical Chemistry, Part II. J.Clin Chem Clin Biochem., 22, p. 431-45.
12.LINNET, K. (1998) Performance of Deming regression analysis in case of misspecified analytical error
ratio in method comparison studies. Clin Chem, 44, p. 1024-31.
13.BLAND, J.M., ALTMAN, D.G. (1986) Statistical methods for assessing agreement between two methods
of clinical measurement. Lancet, 1, p. 307-10.
14.DYBKAER, R. (1982) International federation of clinical chemistry (IFCC) the theory of reference
values. Part 6. Presentation of observed values related to reference values. J.Clin.Chem.Clin.Biochem., 20,
p. 841-5.
271
ΥΛΙΚΑ ΑΝΑΦΟΡΑΣ - ΙΧΝΗΛΑΣΙΜΟΤΗΤΑ
ΔΙΑΠΙΣΤΕΥΣΗ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ
Η ΕΝΝΟΙΑ ΤΗΣ ΑΒΕΒΑΙΟΤΗΤΑΣ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφεί η χρήση των υλικών αναφοράς, από τους κατασκευαστές και τα
εργαστήρια, ώστε να εξασφαλισθούν η τυποποίηση και η ιχνηλασιμότητα των μεθόδων και των
αντιδραστηρίων που παράγουν ή χρησιμοποιούν αντίστοιχα. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν υλικά αναφοράς
για όλες τις παραμέτρους της εργαστηριακής ιατρικής, σε ορισμένες δε μόνο, υπάρχει διαθεσιμότητα για την
ανώτερη τάξη αυτών των υλικών, τα ονομαζόμενα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς. Πρόκειται για υλικά τα
οποία είναι παγκοσμίως αναγνωρισμένα, διαθέτουν πιστοποιητικό και τιμή αβεβαιότητας.
Θα εξηγηθεί η έννοια της αβεβαιότητας και θα δοθεί σχετικό παράδειγμα προσδιορισμού της σε
ποσοτική μέτρηση παραμέτρου κλινικής χημείας. Η ιχνηλασιμότητα με υλικά αναφοράς, η διακρίβωση του
εξοπλισμού και η εκτίμηση της αβεβαιότητας είναι ιδιαίτερα σημαντικές απαιτήσεις για την εκπλήρωση των
προαπαιτούμενων και για τη διαπίστευση των κλινικών εργαστηρίων κατά ISO 15189. Όλα τα κλινικά
εργαστήρια πρέπει να προσπαθήσουν προς αυτή την κατεύθυνση καθώς η διαπίστευση αποτελεί την
ισχυρότερη απόδειξη ότι ένα εργαστήριο διαθέτει ποιότητα και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα.
Στο παρόν κεφάλαιο θα διδαχθούν γνώσεις χρήσιμες για την καθημερινότητα στο κλινικό εργαστήριο.
Υπάρχουν προαπαιτούμενες γνώσεις από τα Kεφάλαια 1 και 9. Οι γνώσεις από τη Στατιστική και τη
Χημειομετρία θα ήταν επίσης χρήσιμες για την κατανόηση βασικών αρχών του κεφαλαίου.
10.1 Υλικά αναφοράς – Ιχνηλασιμότητα

Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται από τα κλινικά εργαστήρια οφείλουν να διαθέτουν ιχνηλασιμότη-
τα (traceability), όπου βέβαια αυτό είναι δυνατόν: η ιχνηλασιμότητα ορίζεται ως η ιδιότητα του αποτελέ-
σματος μιας μέτρησης ή της τιμής ενός βαθμονομητή (calibrator) να συσχετισθεί με γνωστά υλικά αναφο-
ράς (reference materials), συνήθως εθνικά ή διεθνή πρότυπα, μέσω μιας άρρηκτης αλυσίδας συγκρίσεων
που έχουν όλα γνωστές αβεβαιότητες (EURACHEM/CITAC, 2003; Ευαγγελόπουλος et al., 2006; Λειμονή,
2008). Θα πρέπει να γίνει η διευκρίνιση ότι ο όρος ιχνηλασιμότητα ενίοτε χρησιμοποιείται και για τη δυνα-
τότητα που υπάρχει στο εργαστήριο, όταν μέσω του συστήματος ποιότητας μπορεί να ανευρεθεί ανά πάσα
στιγμή το ποιος, που, πότε, έκανε κάτι κατά την προ-αναλυτική, αναλυτική και μετα-αναλυτική φάση μιας
κλινικής δοκιμής (sample, document, instrument, material traceability). Επίσης, αναφορικά με την έννοια της
αβεβαιότητας (uncertainty) απαιτείται να αναφερθεί ήδη από αυτή την Ενότητα, ότι συνδέεται με το απο-
τέλεσμα μιας μέτρησης και είναι η διασπορά των τιμών, που λογικά μπορούν να αποδοθούν στη προσδιορι-
ζόμενη παράμετρο (JCGM 100:2008, 2008· Λυκόκα et al., 2006).
Ιδανικά για κάθε μια μετρήσιμη εργαστηριακή παράμετρο (measurand), αφού ορισθεί το συστατικό
που μας ενδιαφέρει (component) και το είδος της ποσότητας (kind of quantity π.χ. συγκέντρωση, ενεργότητα,
αριθμός σωματιδίων κ.λπ.) που πρέπει να μετρηθεί σε ένα ορισμένο υπόστρωμα (π.χ. ορός), καθώς και η μο-
νάδα μέτρησης, απαιτούνται πρότυπη μέθοδος μέτρησης, που θα μπορεί να εφαρμόζεται σε εξειδικευμένα
εργαστήρια αναφοράς, και πρότυπο υλικό αναφοράς. Ωστόσο είναι λίγες οι παράμετροι που διαθέτουν πλή-
ρες σύστημα αναφοράς: και πρότυπη μέθοδο και πρότυπο υλικό (περίπου 65) (Panteghini, 2009).
Τα υλικά αναφοράς ανήκουν στη μεγάλη οικογένεια των υλικών ελέγχου ποιότητας (quality control
materials ή QCM) μαζί με τους βαθμονομητές και τα controls: είναι υλικά που ελέγχονται για την ομοιογέ-
νεια και σταθερότητα τους (π.χ. ακόμη και μετά από 6 μήνες σε συνθήκες επιταχυνόμενης αποικοδόμησης
στους 45 °C ή/και 65 °C, και ενίοτε με ανοιχτά σωληνάρια) (Emons et al., 2006· Emons, 2006).
272
Σχήμα 10.1 Οικογένεια υλικών ελέγχου ποιότητας (με μπλε χρώμα οι βαθμονομητές και οι ιδιότητες τους και με κόκκινο
χρώμα τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς και οι ιδιότητες τους) από (Emons et al., 2006∙ Emons, 2006).
Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς (certified reference materials ή CRMs ή αλλιώς standard

reference materials ή SRMs) είναι τα ανώτερα ιεραρχικά υλικά αναφοράς και διαθέτουν πιστοποιητικό, το
οποίο αναφέρει τη ταυτότητα (με βάση τη δομή ή τη λειτουργία) και την ποσότητα του μετρούμενου
συστατικού μαζί με δηλωμένη αβεβαιότητα, την ιχνηλασιμότητα του στο διεθνές SI σύστημα ή σε άλλη
πρότυπη μέθοδο και τις οδηγίες ανασύστασης, εάν π.χ. είναι λυοφιλοποιημένο στερεό ή τις οδηγίες
αποθήκευσης, εάν είναι υγρό. Επίσης, αναφέρει την καθαρότητά του ή το ποσοστό υγρασίας, (εάν υπάρχει)
και τις αντίστοιχες μεθόδους ελέγχου, αλλά και όταν δεν είναι καθαρή ουσία, σε τι υπόστρωμα εντοπίζεται
(καθαρό διαλύτη ή ανθρώπινο ορό ή οτιδήποτε άλλο) (Dybkaer, 1991· European co-operation for
Accreditation, 2003a· Μητρόπουλος, 2003). Τα υλικά αυτά παρασκευάζονται από διεθνείς οργανισμούς ή
συμπράξεις επιστημονικών ενώσεων ή εμπορικές εταιρείες όπως οι JRC-IRMM, NIST, WHO, NIBSC, CDC,
ATCC/Coriell, NGRL, LGC, Acrometrix, Advanced Biotechnologies, MMQCI κ.λπ. Στο τέλος του
κεφαλαίου υπάρχουν παραπομπές για εύρεση υλικών αναφοράς μέσω διαδικτύου.
Τα πιστοποιημένα υλικά αναφοράς είναι κατάλληλα για την επικύρωση της ορθότητας μιας μεθόδου,
τη βαθμονόμηση, τον έλεγχο γραμμικότητας, την εύρεση του ορίου ανίχνευσης (κεφάλαιο 9) και ενίοτε, όταν
το υπόστρωμα προσομοιάζει το αντίστοιχο του δείγματος των ασθενών και για τον εσωτερικό έλεγχο ποιότη-
τας. Όταν πιστοποιημένα υλικά αναφοράς δεν είναι διαθέσιμα για τη μέθοδο που το εργαστήριο επιθυμεί να
επικυρώσει ή επαληθεύσει, τότε μπορεί να χρησιμοποιήσει υλικά από εργαστήρια αναφοράς ή από διεργα-
στηριακά σχήματα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας. Εάν και τέτοια υλικά δεν υπάρχουν, τότε μόνο το εργα-
στήριο θα στραφεί στα εμπορικά διαθέσιμα control (π.χ. από τον κατασκευαστή ή καλύτερα, εάν υπάρχουν,
από άλλη εταιρεία που παρασκευάζει controls και είναι ανεξάρτητη από τον κατασκευαστή του αντιδραστη-
ρίου). Για να γίνουν περισσότερο αντιληπτά τα ανωτέρω, παρατίθεται ως παράδειγμα στο Σχήμα 10.2 το
πλήρες σύστημα αναφοράς για την ποσοτική παράμετρο της γλυκόζης με δύο πιστοποιημένα υλικά αναφο-
ράς και δύο μεθόδους αναφοράς (primary, secondary) και το οποίο είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στους κατασκευ-
αστές σχετικών αντιδραστηρίων αλλά και στα εργαστήρια για την ιχνηλασιμότητα της μεθόδου που παρά-
γουν ή χρησιμοποιούν.
273
Σχήμα 10.2 Σύστημα αναφοράς για τον ποσοτικό προσδιορισμό της γλυκόζης με δύο πρότυπες μεθόδους αναφοράς (σταθ-
μική ανάλυση και φασματοσκοπία μάζας με τεχνική αραίωσης ισοτόπου ID-MS), που εκτελούνται από εργαστήρια αναφο-
ράς και δύο πιστοποιημένα υλικά αναφοράς: ένα πρωτοταγές (primary), το οποίο αποτελείται από καθαρή κρυσταλλική
γλυκόζη και ένα δευτεροταγές (secondary) που χρησιμοποιεί υπόστρωμα ίδιο με τα δείγματα των ασθενών.
Αφού υπάρχει ιχνηλασιμότητα με πρότυπο υλικό ή/και πρότυπη μέθοδο, στη συνέχεια αναλαμβάνει
ο κάθε κατασκευαστής να παρασκευάσει τους δικούς του βαθμονομητές: αρχικά τον master βαθμονομητή
εργασίας για τη βαθμονόμηση της εσωτερικής μεθόδου που έχει επιλέξει (μπορεί να διαθέτει περισσότερες
από μία) και στη συνέχεια το βαθμονομητή του προϊόντος (product) του αντιδραστηρίου που διαθέτει στα
εργαστήρια («πελάτες») για συγκεκριμένη μέθοδο και για συγκεκριμένο αναλυτή που διαθέτουν. Όπως πα-
ρατηρούμε στο Σχήμα 10.3, η ιχνηλασιμότητα της μεθόδου είναι μέγιστη στα αρχικά στάδια, ενώ η αβεβαιό-
τητα της μέτρησης είναι αντιστρόφως ανάλογη και μεγαλύτερη στα τελικά στάδια όταν παραλαμβάνεται και
το τελικό αποτέλεσμα από τον ασθενή από το εργαστήριο ρουτίνας.
274
Σχήμα 10.3 Αλυσίδα της ιχνηλασιμότητας μιας μεθόδου από το εργαστήριο αναφοράς στον κατασκευστή και κατόπιν στον
«καταναλωτή» που είναι το εργαστήριο ρουτίνας (Berding et al., 2010).
Η παρασκευή του master βαθμονομητή είναι πολύ κρίσιμη για τη διαχρονική ακρίβεια της μεθόδου
που προσφέρει ο κατασκευαστής, καθώς ο κατασκευαστής οφείλει να ελέγχει σε τακτά χρονικά διαστήματα
την ιχνηλασιμότητα. Μόνο με αυτόν τον τρόπο, δηλαδή με συνεχείς βαθμονομήσεις, αποδόσεις τιμών και
εσωτερικό έλεγχο ποιότητας, όπως φαίνεται στη στρατηγική που ακολουθείται στο Σχήμα 10.4Α, διασφαλί-
ζεται η τυποποίηση (standardization) της μεθόδου (Berding et al., 2010· Panteghini, 2009). Ο master βαθ-
μονομητής μπορεί να είναι είτε ένα πιστοποιημένο (εάν υπάρχει) υλικό αναφοράς και οι αραιώσεις του, είτε
ένα σετ δειγμάτων ασθενών τα οποία έχουν μετρηθεί με πρότυπη μέθοδο και διαθέτουν ένα ευρύ εύρος τι-
μών. Συνεπώς αυτά τα δείγματα χρησιμοποιεί ο κατασκευαστής για τη βαθμονόμηση της επιλεγμένης μεθό-
δου του (Σχήμα 10.4Β). Ο master βαθμονομητής διαμοιράζεται σε ισομερίδια (aliquots) σε βαθιά κατάψυξη
για όσο χρονικό διάστημα θεωρείται ότι είναι σταθερός. Παράλληλα φυλάσσονται με ανάλογο τρόπο άλλα
δείγματα ασθενών που χρησιμοποιούνται για τη σύγκριση μεταξύ της επιλεγμένης μεθόδου του κατασκευα-
στή και της πρότυπης μεθόδου. Για την ισοδυναμία των μεθόδων πρέπει να ισχύουν τα προαναφερθέντα
στην Ενότητα 9.4, δηλαδή η κλίση του διαγράμματος σύγκρισης να μην διαφέρει στατιστικά από το 1 και η
τεταγμένη στον κάθετο άξονα από το 0 (Σχήμα 10.4C).
275
Α
Β C
Σχήμα 10.4 Τυποποίηση της μεθόδου ενός κατασκευαστού (έχει αφαιρεθεί το όνομά του για ευνόητους λόγους) για τον
ποσοτικό προσδιορισμό της τεστοστερόνης: Α) διαδοχική σειρά τεσσάρων βαθμονομήσεων (Cal0-Cal3) και πέντε αποδό-
σεων τιμών (value assignments I-V) με χρήση δύο προτύπων μεθόδων της σταθμικής ανάλυσης και του ID-MS σε ζυγισμέ-
νη καθαρή ουσία (δεν υπάρχει πιστοποιημένο υλικό αναφοράς), Β) βαθμονόμηση Cal1 με τη βοήθεια δειγμάτων μετρημέ-
νων με ID-MS και C) σύγκριση της επιλεγμένης από τον κατασκευαστή και της ID-MS μεθόδου με άλλα δείγματα ασθενών
τα οποία χρησιμοποιούνται ως εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (QC R1) (Berding, et al., 2010).
276
Πρέπει να τονισθεί ότι, όταν χρησιμοποιούνται για τη βαθμονόμηση μιας μεθόδου, τα υλικά ανα-
φοράς ή οι βαθμονομητές πρέπει να συμπεριφέρονται εναλλάξιμα (commutable) με τα κλινικά δείγματα
δηλαδή να συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο (να συνδέονται με το σήμα της μεθόδου με την ίδια μαθημα-
τική σχέση) (Miller et al., 2011). Η έννοια αυτή μπορεί να γίνει καλύτερα αντιληπτή εάν παρατηρήσουμε
προσεκτικά στο διάγραμμα σύγκρισης της μεθόδου του κατασκευστού με μια άλλη (κατά προτίμηση πρότυ-
πη) μέθοδο που εντοπίζονται οι τιμές των συγκεκριμένων υλικών (Σχήμα 10.5).
Σχήμα 10.5 Στο αριστερό σχήμα, τα υλικά αναφοράς ή οι βαθμονομητές συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο όπως τα κλι-
νικά δείγματα γι’αυτό και συνεντοπίζονται στη γραμμή παλινδρόμησης της σύγκρισης δύο μεθόδων ενώ το ίδιο δεν συμ-
βαίνει στο δεξιό σχήμα: εδώ υπάρχει πρόβλημα εναλλαξιμότητας (commutability) (Miller et al., 2011).
Σε παραμέτρους όπου δεν υπάρχουν ούτε πιστοποιημένα υλικά αναφοράς ούτε πρότυπες μέθοδοι
υπάρχει πραγματικά διεθνές πρόβλημα, καθώς ο κάθε κατασκευαστής παράγει τους δικούς του βαθμονομη-
τές χωρίς να υπάρχει ιχνηλασιμότητα, με συνέπεια να μην μπορεί να υπάρξει αξιόπιστη φορητότητα των α-
ποτελεσμάτων των ασθενών. Απαιτείται ιδιαίτερη προσπάθεια από τις επιστημονικές εταιρείες για τη δημι-
ουργία κατάλληλων υλικών αναφοράς, ώστε να υπάρχει τουλάχιστον διεθνώς μια εναρμόνιση των μεθόδων
(harmonization).
10.2 Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων

Το ακρωνύμιο της παγκόσμιας οργάνωσης-δικτύου για την τυποποίηση (International Organization for
Standardization) είναι για όλες τις γλώσσες το ίδιο και είναι το ISO, το οποίο προήλθε από την ελληνική
λέξη «ίσος». Είναι δε ενδεικτικό του στόχου αυτού του παγκόσμιου φορέα, ο οποίος ιδρύθηκε το 1946 και
έχει ως μέλη εθνικούς οργανισμούς τυποποίησης, να εκδίδει - μέσω τεχνικών επιτροπών - πρότυπα για την
εναρμόνιση των προϊόντων και υπηρεσιών σε διάφορους τομείς της οικονομίας σε όλα τα κράτη-μέλη. Την
Ελλάδα αντιπροσωπεύει σε αυτόν τον οργανισμό ο Ελληνικός Οργανισμός Τυποποίησης (ΕΛ.Ο.Τ.).
Η εφαρμογή προτύπων και στα κλινικά εργαστήρια προέκυψε από την ανάγκη για τεκμηρίωση και
αμοιβαία αναγνώριση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων, που διακινούνται και παρέχονται παγκοσμίως.
Αυτό οδηγεί σε μια ελεύθερη διακίνηση των υπηρεσιών των κλινικών εργαστηρίων διεθνώς, ισοδυναμία
ελέγχων σε όλα τα κράτη-μέλη, εναρμόνιση μέσω ομοιόμορφης εφαρμογής οδηγιών, αποδοχή της
αξιοπιστίας αποτελεσμάτων και δημόσιων πιστοποιητικών από όλα τα κράτη και υγιή ανταγωνισμό, ο οποίος
αποβαίνει τελικά προς όφελος του «πελάτη-ασθενή» (Μπακέας, 2006). Στη σύγχρονη ιατρική πρακτική, ο
ρόλος του κλινικού εργαστηρίου γίνεται ολοένα και πιο σημαντικός για τη διάγνωση, πρόγνωση,
παρακολούθηση και θεραπευτική αγωγή των ασθενών. Η απαίτηση συνεπώς για εργαστηριακά
αποτελέσματα ακριβή και αξιόπιστα είναι προφανής και αναγκαία (Βογιατζάκης, 2007).
277
Ένα κλινικό εργαστήριο πέραν της φήμης του, που ασφαλώς δεν αποτελεί μετρήσιμη και
αντικειμενική ιδιότητα, μπορεί να επιδείξει κάποια από τα ακόλουθα επίσημα έγγραφα σε ιατρούς ή
ασθενείς, τα οποία θα αποδεικνύουν την αξία του:
Αδειοδότηση (licensing): επίσημη άδεια λειτουργίας από το κράτος σε ένα εργαστήριο ότι με βάση τη
νομοθεσία μπορεί να διεξάγει εργαστηριακές μετρήσεις.
Πιστοποίηση (certification): γραπτή βεβαίωση από διαπιστευμένο φορέα πιστοποίησης ότι το

εργαστήριο «συμμορφώνεται» σε ένα Πρότυπο ή σε μια Οδηγία με την εφαρμογή συστήματος διαχείρισης
ποιότητας.
Διαπίστευση (accreditation): επίσημη αναγνώριση από τον αρμόδιο Εθνικό φορέα ότι ένα
εργαστήριο είναι «τεχνικά επαρκές» να διεξάγει συγκεκριμένες δοκιμασίες.
Μερικά από τα ανωτέρω έγγραφα είναι υποχρεωτικά ανάλογα με τη νομοθεσία κάθε κράτους, ενώ
άλλα αναμένεται να γίνουν με τη πάροδο του χρόνου, π.χ. στην Ευρώπη είναι υποχρεωτική η διαπίστευση
στη Γαλλία και στη Ρουμανία σε όλα τα κλινικά εργαστήρια, στο Βέλγιο και στη Γερμανία μόνο σε εκείνα
που παρέχουν γενετικά αποτελέσματα ή/και νεογνικό έλεγχο. Σε άλλα κράτη η κάλυψη ή η αποζημίωση από
δημόσιους ή ιδιωτικούς ασφαλιστικούς οργανισμούς για εκτέλεση παραπεμπτικών με εργαστηριακές
εξετάσεις, γίνεται μόνο όταν αυτές διενεργούνται από διαπιστευμένα εργαστήρια.
Φορείς πιστοποίησης μπορεί να υπάρχουν πολλοί, ωστόσο μόνο ένας αρμόδιος φορέας διαπίστευσης
λειτουργεί ανά χώρα. Στην Ελλάδα είναι το Ε.ΣΥ.Δ (Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης) το οποίο έχει ενταχθεί
μαζί με τον ΕΛ.Ο.Τ. και το Ε.Ι.Μ. (Ελληνικό Ινστιτούτο Μετρολογίας) στο Εθνικό Σύστημα Υποδομών
Ποιότητας (Ε.Σ.Υ.Π.). Το Ε.ΣΥ.Δ συμμετέχει σε συμφωνίες αμοιβαίας αναγνώρισης με πολλούς
αντίστοιχους εθνικούς φορείς άλλων χωρών, αλλά και με ανώτερους διακρατικούς οργανισμούς, όπως η EA
(European co-operation for Accreditation) και η ILAC (International Laboratory Accreditation Cooperation).
Οι φορείς πιστοποίησης διαπιστεύονται για πιστοποίηση σε διάφορους τομείς, από τον φορέα διαπίστευσης.
Το κατάλληλο πρότυπο για τα κλινικά εργαστήρια είναι το ISO 15189, το οποίο αρχικά συντάχθηκε το
2003 από την τεχνική επιτροπή TC 212 για να αναθεωρηθεί στη συνέχεια το 2007 και προσφάτως το 2012
(Huisman, 2012· International Standards Organisation, 2012). Το πρότυπο έχει και διοικητικές και
διαχειριστικές απαιτήσεις, οι οποίες είναι παρόμοιες με αυτές του προτύπου πιστοποίησης ISO 9001:2000
και από το Σεπτέμβριο του 2009 υπάρχει διεθνή συμφωνία με βάση την οποία θεωρείται ότι τα
διαπιστευμένα εργαστήρια πληρούν ταυτόχρονα τις απαιτήσεις πιστοποίησης κατά ISO 9001.
Τα οφέλη της διαπίστευσης ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO 15189 είναι πολλά για το
εργαστήριο, τους ασθενείς και το κράτος. Για το εργαστήριο είναι η απόδειξη ότι εφαρμόζει σύστημα
ποιότητας, είναι τεχνικά επαρκές και παράγει αξιόπιστα αποτελέσματα, σύμφωνα με διεθνή πρότυπα. Η
κάλυψη των απαιτήσεων του προτύπου επιφέρει αρχικά οικονομικό «κόστος ποιότητας» στο εργαστήριο,
ωστόσο εκτιμάται ότι μέσω των μειωμένων επαναλήψεων των εργαστηριακών εξετάσεων, των μειωμένων
άστοχων ενεργειών του εργαστηρίου, αλλά και της αυξημένης ικανοποίησης των ιατρών και των ασθενών, η
οποία δημιουργεί αυξημένο κύρος στο εργαστήριο, μακροπρόθεσμα δημιουργούνται οικονομικά οφέλη. Για
τους ασθενείς διασφαλίζει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων τους και οδηγεί σε μικρότερη ανάγκη για
επανέλεγχο (ειδικά, όταν πρέπει να μεταβούν στο εξωτερικό). Για τους κρατικούς φορείς, υπάρχει
αυξημένη εμπιστοσύνη για τη λήψη αποφάσεων στον τομέα της Υγείας με βάση τεκμηριωμένα δεδομένα,
μείωση της «αβεβαιότητας» και αύξηση της αποτελεσματικότητας των ελέγχων.
Οι κυριότερες από τις διοικητικές απαιτήσεις που εξετάζει το πρότυπο ISO 15189:2012 αναφέρονται
στη συνέχεια επιγραμματικά (International Standards Organisation, 2012· Μπακέας, 2006): α)
οργανόγραμμα – ορισμός υπευθύνου ποιότητας, β) σύστημα ποιότητας και εγχειρίδιο ποιότητας, γ)
συμβάσεις-υπηρεσίες και προμήθειες, δ) τήρηση και έλεγχος αρχείων, ε) αρχείο παραπόνων, στ) καταγραφή
και έλεγχος μη συμμορφώσεων (non-conformities), ζ) διορθωτικές και προληπτικές ενέργειες (corrective and
preventive actions), η) διεξαγωγή εσωτερικών επιθεωρήσεων (internal audits), θ) θέσπιση δεικτών ποιότητας
(quality indicators) και ι) ανασκόπηση από τη διοίκηση (management review). Η λειτουργία ενός
συστήματος ποιότητας ασφαλώς απαιτεί γραφειοκρατική εργασία κατά την εγκατάστασή του, αλλά και τη
278
διατήρησή του, ωστόσο τα πέντε σημεία στα οποία πρέπει να επικεντρωθούν οι εργαστηριακοί επιστήμονες
και είναι και τα πιο δύσκολα, αλλά και τα πιο σημαντικά για την αναγνώριση της «τεχνικής επάρκειας»
ενός κλινικού εργαστηρίου κατά ISO15189 είναι τα ακόλουθα (Κρούπης, 2008· Κρούπης, 2009· Σταθάκη-
Φερδερίγου et al., 2006):
Α) Υποδομή εργαστηρίου: Το προσωπικό πρέπει να είναι επαρκές σε αριθμό και γνώσεις και να
ακολουθεί πρόγραμμα συνεχιζόμενης εκπαίδευσης. Οι εγκαταστάσεις πρέπει να είναι άριστες ως προς την
άνεση και την ασφάλεια χώρου και φιλικές ως προς το περιβάλλον (κατάλληλη διαχείριση βιολογικών
αποβλήτων). Πρέπει να λαμβάνεται μέριμνα για την ασφάλεια του προσωπικού από δυνητικά επικίνδυνα
δείγματα και αντιδραστήρια. Ο κρίσιμος μετρητικός εξοπλισμός για τη λειτουργία ενός εργαστηρίου πρέπει
να διακριβώνεται για την ορθή λειτουργία του ως προς τα διεθνή πρότυπα όταν υπάρχουν ή να γίνεται
έλεγχος καλής επίδοσης (performance check), όταν αυτά δεν υπάρχουν. Ψυγεία, καταψύκτες, φυγόκεντροι,
vortex, ζυγοί και πεχαμετρικές συσκευές πρέπει να καθαρίζονται και να συντηρούνται.
Β) Επιλογή των κατάλληλων εργαστηριακών μεθόδων για τις υπό διαπίστευση παραμέτρους με
βάση τη βιβλιογραφία και συγκεκριμένους στόχους (π.χ. ελάττωση του εργαστηριακού σφάλματος, κλινική
χρησιμότητα) και τα πρακτικά χαρακτηριστικά της εφαρμογής της (application characteristics): είδος και
ποσότητα δείγματος, ταχύτητα προσδιορισμού και χρόνος απόκρισης του εργαστηρίου, είδος δοκιμασίας
(π.χ. screening test), απαιτούμενοι χειρισμοί του δείγματος, απαιτούμενες γνώσεις από το προσωπικό,
κόστος, συχνότητα βαθμονόμησης εξοπλισμού και μεθόδου, διαθεσιμότητα υλικών ελέγχου ποιότητας,
δυνατότητα αποθήκευσης του δείγματος κ.λπ. (Κρούπης, 2008· Κρούπης, 2009). Οι παράμετροι για τις
οποίες διαπιστεύεται το εργαστήριο και οι αντίστοιχοι μέθοδοι και υποστρώματα περιγράφονται πλήρως στο
επίσημο πεδίου διαπίστευσης, ΕΠΕΔ (scope of accreditation) το οποίο αναρτάται στο διαδίκτυο. Υπάρχει
σύσταση και οδηγία, ώστε στο μέλλον τα εργαστήρια να διαπιστεύονται σε πιο «ευέλικτο πεδίο» (flexible
scope) και με τον τρόπο αυτό να διευκολυνθεί η ταχεία εισαγωγή καινοτόμων μεθοδολογιών από το
εργαστήριο (Thelen et al., 2015). Οι μέθοδοι πρέπει να περιγράφονται επαρκώς στο εγχειρίδιο των μεθόδων
και να ακολουθεί η σύνταξη τυποποιημένων οδηγιών (Standard Operating Procedures ή SOPs) για την
κατάλληλη εφαρμογή τους από το προσωπικό του εργαστηρίου. Η πιστή εκτέλεση των ανωτέρω μεθόδων,
αλλά και των κανόνων της ορθής εργαστηριακής πρακτικής (Good Laboratory Practice ή GLP), πρέπει
να είναι αντικείμενο συχνών εσωτερικών επιθεωρήσεων.
Πρέπει να γίνεται προσπάθεια μείωσης της προ-αναλυτικής διακύμανσης με κατάλληλες οδηγίες

προς το προσωπικό, τους «χρήστες» (ιατρούς) και τους «πελάτες» (ασθενείς) για τη σωστή προετοιμασία του
ασθενούς, για τη δειγματοληψία στο σωστό χρονικό σημείο αναφορικά με τη πορεία της νόσου (specimen
timing), τη σωστή επιλογή αντιπηκτικού για το σωληνάριο δειγματοληψίας, τη σωστή ταυτοποίηση του
δείγματος, το σωστό χειρισμό και την ταχεία μεταφορά του δείγματος, τη θερμοκρασία μεταφοράς και
αποθήκευσής του έως την ώρα του προσδιορισμού, τη σωστή φυγοκέντρηση κ.λπ. (Guder et al., 2003).
Επίσης πρέπει να ελέγχονται και οι μετα-αναλυτικές διαδικασίες, που αφορούν την τήρηση των χρονικών
διαστημάτων για τη φύλαξη των δειγμάτων, τη σωστή μεταφορά των ληφθέντων δεδομένων και των
αποτελεσμάτων (π.χ. ιδανικά μέσω Laboratory Information System ή LIS) και τέλος το σωστό τρόπο
παρουσίασης στην έκθεση των αποτελεσμάτων (report). Το πρότυπο περιλαμβάνει επίσης, μέριμνα για την
ασφάλεια του εργαστηριακού υπολογιστικού συστήματος καθώς και για τον κώδικα Δεοντολογίας στην
εργαστηριακή Ιατρική (αναφορικά με τη συλλογή προσωπικών δεδομένων και δειγμάτων, το ιατρικό
απόρρητο, την πρόσβαση και την διατήρηση αρχείων με εργαστηριακά αποτελέσματα και τις οικονομικές
συναλλαγές του εργαστηρίου).
Γ) Επικύρωση ή επαλήθευση μεθόδων. Το εργαστήριο καλείται απλά να επαληθεύσει (verification)

τις μεθόδους που επιλέγει όταν αυτές είναι πρότυπες μέθοδοι αναφοράς ή αποδεκτές τυποποιημένες (π.χ.
εγκεκριμένες από το FDA ή IVD-CE αντιδραστήρια ή kits), καλείται δηλαδή να αποδείξει ότι στα «δικά του
χέρια», στις δικές του εργασιακές συνθήκες, με το δικό του προσωπικό και εξοπλισμό, μπορεί να επιτύχει τα
ίδια ή καλύτερα αποτελέσματα στα χαρακτηριστικά επίδοσης από αυτά που αναφέρει ο κατασκευαστής. Εάν
επιλέξει να αναπτύξει δική του εσωτερική in-house μέθοδο, τότε πρέπει να διεξάγει πειράματα
βελτιστοποίησης (optimization), να τα καταγράψει κατάλληλα (documentation) και στη συνέχεια να
επικυρώσει τη μέθοδο ως προς: α) τα αναλυτικά χαρακτηριστικά που περιγράφηκαν στην Ενότητα 9.4 και
β) τα κλινικά χαρακτηριστικά (clinical validation). Η μέθοδος προς διαπίστευση πρέπει να δίνει
ικανοποιητικά αποτελέσματα για τον ενδεικνυόμενο σκοπό (fit for purpose), ο οποίος είναι η ανίχνευση
279
ενός νοσήματος (πρέπει λοιπόν η μέθοδος να διαθέτει ικανοποιητική διαγνωστική κλινική ευαισθησία και
ειδικότητα, αρνητική και θετική προβλεπτική αξία). Επίσης πρέπει να έχει κλινική αξία (clinical utility),
δηλαδή, να είναι χρήσιμη στη διάγνωση και στη θεραπεία του ασθενούς και όχι να έχει απλά ερευνητική
χρήση. Οπου είναι δυνατόν, πρέπει να αποδεικνύεται η ιχνηλασιμότητα των μετρήσεων με σύγκριση με
μεθόδους αναφοράς και η χρήση πιστοποιημένων υλικών αναφοράς, όπως προαναφέρθηκε στην Ενότητα
10.1 (Panteghini, 2009). Στις ποσοτικές μεθόδους οφείλει να εκτιμήσει την αβεβαιότητά τους (Ενότητα
10.3)
Δ) Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11).
Ε) Εξωτερικός έλεγχος ποιότητας (βλ. Κεφάλαιο 11).
Η μη επιτυχής επίδοση του εργαστηρίου σε οποιονδήποτε από τους ανωτέρω πέντε τομείς οι οποίοι
αποτελούν τους «πυλώνες της ποιότητας» αποτελεί σοβαρή μη συμμόρφωση (non conformity) και μπορεί
να αποτελέσει αιτία για τη μη απονομή ή για την απώλεια της διαπίστευσης του, είτε κατά την αρχική
αξιολόγηση, είτε και κατά την ετήσια επιτήρηση ή την επαναξιολόγηση ανά τετραετία, αντίστοιχα (Κρούπης,
2014).
10.3 Αβεβαιότητα
Η έννοια της αβεβαιότητας αντιμετωπίστηκε παγκοσμίως αρχικά με σκεπτικισμό από τα κλινικά εργαστήρια,
καθώς είχαν συνηθίσει στη χρήση του ολικού σφάλματος. Όμως το ολικό σφάλμα αθροίζει δύο ποσότητες,
εκ των οποίων η μία - η μεροληψία - έχει πρόσημο και αυτό αποτελεί πρόβλημα στον ακριβή υπολογισμό
του (Kallner, 2013). Η αβεβαιότητα ορίζεται ως η διασπορά των τιμών που λογικά μπορούν να αποδοθούν
στη προσδιοριζόμενη παράμετρο (Ευαγγελόπουλος et al., 2006· CLSI, 2012· Λεϊμονή, 2008· Λυκόκα et al.,
2006· EURACHEM/CITAC CG4, 2000· JCGM 100:2008, 2008· JCGM 200:2008, 2008).
Η εκτίμηση της αβεβαιότητας εκτός από το ότι πλέον αποτελεί απαίτηση της διαπίστευσης κατά ISO
15189 είναι πολύ χρήσιμη: α) στην εκτίμηση της ορθότητας της μεθόδου, εάν μετρηθεί ένα πιστοποιημένο
υλικό αναφοράς και συγκριθεί η τιμή μέτρησης με την πιστοποιημένη τιμή, β) στη σύγκριση δύο τιμών που
προέρχονται από το ίδιο εργαστήριο με την ίδια μέθοδο, γ) στη σύγκριση δύο μεθόδων και την επιλογή αυτής
με τη μικρότερη αβεβαιότητα και δ) στη λήψη θεραπείας σε σχέση με ένα κλινικό όριο απόφασης ή μια
κρίσιμη τιμή (Σχήμα 10.6). Συνεπώς, η αβεβαιότητα δεν υπονοεί την αμφιβολία για την αξιοπιστία του
αποτελέσματος, αντίθετα μας δίνει αυξημένη σιγουριά για το εύρος στο οποίο βρίσκεται η πραγματική τιμή.
Σχήμα 10.6 Η χρήση της αβεβαιότητας μιας μέτρησης σε σχέση με ένα ανώτερο όριο λήψης θεραπευτικής απόφασης: οι
περιπτώσεις I και IV είναι με βεβαιότητα πάνω και κάτω από το κρίσιμο αυτό όριο ενώ το ίδιο δεν ισχύει για τις
περιπτώσεις II και III (EURACHEM/CITAC, 2007).
280
Μία μέθοδος για τη γραφική απεικόνιση των πηγών αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μίας μέτρησης
είναι το διάγραμμα Ishikawa ή διάγραμμα αιτίας και αποτελέσματος (cause and effect diagram) ή
διάγραμμα ψαροκόκαλο (fish-bone diagram), καθώς μοιάζει με τον σκελετό ψαριού (Σχήμα 10.7).
Δημιουργήθηκε από τον καθηγητή χημικής μηχανικής του Πανεπιστημίου του Τόκιο Kaoru Ishikawa το
1968, αρχικά για την μέθοδο της ανάλυσης αιτίας και αποτελέσματος (Cause and Effect Analysis) και ως ένα
εργαλείο για τον έλεγχο ποιότητας, αλλά στη συνέχεια άρχισε να χρησιμοποιείται και για άλλες μεθόδους.
Σχήμα 10.7 Το διάγραμμα ψαροκόκαλο καταδεικνύει τις πιθανές πηγές αβεβαιότητας στο αποτέλεσμα μιας μετρούμενης
ποσότητας (Καπετανστρατάκη, 2015).
Παρ’ όλο που είναι πολύ σημαντικό να ελαχιστοποιούμε τις αβεβαιότητες που σχετίζονται με την
προ-αναλυτική και τη μετα-αναλυτική φάση πριν και μετά τη μέτρηση, η αβεβαιότητα της μέτρησης που
μπορεί πιο εύκολα να υπολογίσει το κλινικό εργαστήριο αφορά μόνο τις αβεβαιότητες που προκύπτουν από
το σύστημα της μέτρησης, δηλαδή από την προετοιμασία του δείγματος έως και τη λήψη του αποτελέσματος
της μέτρησης.
Ο καθορισμός των μεταβλητών από τις οποίες αποτελείται η συνάρτηση μέτρησης (measurement func-
tion) y = f(x1, x2, x3,…xn), της επιρροής τους και ο υπολογισμός των τυπικών τους αβεβαιοτήτων και των
αλληλεπιδράσεών τους στο μοντέλο καλείται προϋπολογισμός αβεβαιότητας (uncertainty budget). Η αβε-
βαιότητα συνήθως, εκφράζεται μαθηματικά ως τυπική απόκλιση ή ως σχετική τυπική απόκλιση (βλ. Ενότητα
2.1) και οι αβεβαιότητες που σχετίζονται με τις επί μέρους ποσότητες, όταν είναι εκφρασμένες ως τυπικές
αποκλίσεις ονομάζονται τυπικές αβεβαιότητες (standard uncertainties) και συμβολίζονται ως u(x) ή ux.
Οι τυπικές αβεβαιότητες μπορούν να εκτιμηθούν είτε πειραματικά με στατιστική ανάλυση μίας σειράς
από μετρήσεις (Τύπου Α), είτε από άλλες πηγές πληροφόρησης (Τύπου Β, π.χ. δεδομένα κατασκευαστών,
βιβλιογραφία, προηγούμενη εμπειρία κ.λπ.), είτε από έναν συνδυασμό των δύο αυτών μεθόδων. Η επιλογή
εξαρτάται από την φύση της μέτρησης και την διαθεσιμότητα της απαιτούμενης πληροφορίας. Στη συνέχεια
οι τυπικές αυτές αβεβαιότητες συνδυάζονται, για να δώσουν τη συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα uc(y)
(combined standard uncertainty) της μέτρησης με τη χρήση των κανόνων μετάδοσης σφάλματος (error
propagation rules). Οι ακόλουθοι κανόνες είναι οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι (Καπετανστρατάκη, 2015):
1) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x1 ± x2 και τα x1 και x2 είναι ανεξάρτητα μεταξύ τους
(δηλαδή η συμμεταβλητότητα cov(x1, x2) = 0), τότε η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα του y δίνεται από
την Εξίσωση 10.1:
uc (y) = u(x1 ± x2 ) = √u2 (x1 ) + u2 (x2 ) (Εξίσωση 10.1)
2) Όταν η συνάρτηση μέτρησης έχει τη μορφή y = x1 x2 ή y = x1/x2 και τα x1 και x2 είναι ανεξάρτητα (δηλα-
δή cov(x1, x2) = 0), τότε η σχετική συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα (relative combined uncertainty)
του y δίνεται από την Εξίσωση 10.2:
281
uc (y) u(x1 ∗x2 ) u(x1 ⁄x2 ) u(x1 ) 2 u(x2 ) 2
= (ή = ) = √( ) +( ) (Εξίσωση 10.2)
|y| |x1 ∗x2 | |x1 ⁄𝑥2 x1 x2
όπου το |y| αντιστοιχεί στην απόλυτη τιμή της συνάρτησης και επομένως η συνδυασμένη τυπική αβεβαιότητα
δίνεται από την εξίσωση 10.3:
u(x1) 2 u(x2) 2
uc (y) = |y| ∗ √( ) +( ) (Εξίσωση 10.3)
x1 x2
Όταν τα x1 και x2 δεν είναι ανεξάρτητα [cov(x1, x2) ≠ 0] ή υπάρχει ύψωση σε δύναμη ή λογαρίθμηση ισχύουν
άλλοι κανόνες.
Για να υπάρχει ένα επίπεδο εμπιστοσύνης που αντιστοιχεί σε μία καθορισμένη πιθανότητα, η συνδυ-
ασμένη αβεβαιότητα πολλαπλασιάζεται με έναν συντελεστή κάλυψης k (coverage factor):
U(y) = ±k ∗ uc (y) (Εξίσωση 10.4)
Επομένως, η αβεβαιότητα που προκύπτει μετά από τον πολλαπλασιασμό με τον συντελεστή αυτό
ονομάζεται διευρυμένη αβεβαιότητα U(y) (expanded uncertainty) της μέτρησης. Το διάστημα που προκύ-
πτει με τη χρήση k = 2 δίνει 95% εμπιστοσύνη ότι η πραγματική τιμή βρίσκεται εντός του διαστήματος, ενώ
για k = 3 το επίπεδο εμπιστοσύνης είναι 99%. Αυτές οι τιμές όμως προϋποθέτουν ότι η κατανομή των ποσο-
τήτων επιρροής y είναι κανονική και ότι ο υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας έγινε με
την εκτίμηση ενός ικανοποιητικού αριθμού παρατηρήσεων n (συνήθως n > 10).
Η αβεβαιότητα μέτρησης μπορεί να εκτιμηθεί με δύο διαφορετικές προσεγγίσεις:

Bottom up modeling approach: Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην πλήρη κατανόηση των αιτιών από
τις οποίες εξαρτάται η αβεβαιότητα ενός αποτελέσματος και της επιρροής τους στη συνάρτηση μέτρησης. Η
μέθοδος αυτή συνήθως αναφέρεται ως μέθοδος GUM (Guide to the Expression of Uncertainty in Measure-
ment) (JCGM 100:2008, 2008).
Top down modeling approach: Η μέθοδος αυτή που χρησιμοποιείται συνηθέστερα από τα κλινικά
εργαστήρια και περιγράφεται με ένα παράδειγμα στη συνέχεια. Χρησιμοποιεί στατιστικές αρχές για να εκτι-
μήσει απευθείας την συνολική αβεβαιότητα ενός συστήματος μέτρησης, συνήθως με την εκτίμηση πειραμα-
τικών δεδομένων από ειδικά πρωτόκολλα, από έλεγχο ποιότητας (Quality Control ή QC data) ή από επαλή-
θευση μίας μεθόδου. Ιδανικά οι αβεβαιότητες που εκτιμώνται από τις δύο μεθόδους θα πρέπει να είναι παρό-
μοιες.
Σύνοψη των βημάτων με τη μέθοδο top down
Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας.

Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας (uprec ).
Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας της μέτρησης (ubias ) με χρήση των u(Cref ) και urep .
Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας.
Εάν η τιμή της μεροληψίας δεν είναι στατιστικά σημαντική τότε uc = uprec , αλλιώς:
uc = √ubias 2 + uprec 2 (Εξίσωση 10.5)
Επανεξέταση και αν είναι απαραίτητο, επαναξιολόγηση των πηγών με μεγάλη αβεβαιότητα.
Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας- Παρουσίαση των αποτελεσμάτων.
282
283
Παράδειγμα:
Εκτίμηση της αβεβαιότητας μέτρησης για την κρεατινίνη στον ανθρώπινο ορό με τη μέθοδο top down
(Καπετανστρατάκη, 2015).
Βήμα 1: Προσδιορισμός της μετρούμενης ποσότητας (συγκέντρωσης)
Μετρούμενη ποσότητα Ποσό της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ανθρώπινο ορό
Μονάδες mmol/L
Διαδικασία μέτρησης Φασματοφωτομετρική διαδικασία Jaffe με αλκαλικό διάλυμα πικρικού οξέος
Ιχνηλασιμότητα NIST SRM 967a
Βήμα 2: Υπολογισμός της ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας
Τα δεδομένα για την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα για ορό ελέγχου ποιότητας λήφθηκαν
για τουλάχιστον 6 μήνες και έδωσαν μέση τιμή 0,4041 mmol/L και τυπική απόκλιση 0,01136 mmol/L με CV
2,81%. Στο διάστημα αυτό οι συνθήκες αναπαραγωγιμότητας περιλάμβαναν διαφορετικές παρτίδες
αντιδραστηρίων και βαθμονομητών, αρκετές αλλαγές στους χειριστές καθώς και συντήρηση ρουτίνας στα
όργανα.
Βήμα 3: Υπολογισμός της μεροληψίας
Η πιστοποιημένη τιμή της συγκέντρωσης για το υγρό υλικό αναφοράς για την κρεατινίνη που
αποκτήθηκε από το NIST (National Institute of Standards and Technology) με κωδικό SRM 967a 0,3427 ±
0,0072 mmol/L. Η αβεβαιότητα της πιστοποιημένης τιμής είναι μία διευρυμένη αβεβαιότητα για επίπεδο
εμπιστοσύνης 95%. Επομένως, για τον υπολογισμό της τυπικής αβεβαιότητας του πιστοποιημένου δείγματος
u(Cref) αρκεί να διαιρέσουμε τη διευρυμένη του αβεβαιότητα με k = 2:
u(Cref) = U/2 = 0,0072/2 = 0,0036 mmol/L
και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα:
0,0036
𝑢(𝐶𝑟𝑒𝑓 ) = × 100% = 1,05%
0,3427
Για να ελεγχθεί η ορθότητα της μεθόδου του εργαστηρίου, εκτελούνται 10 μετρήσεις του υλικού
αναφοράς κρεατινίνης κάτω από συνθήκες επαναληψιμότητας και υπολογίζεται η τυπική αβεβαιότητα
επαναληψιμότητας, urep. Από τις μετρήσεις, λαμβάνεται μέση τιμή 0,3518 mmol/L και υπολογίζεται η τυπική
απόκλιση 0,0076 mmol/L.
Επομένως, μπορούμε τώρα να υπολογίσουμε την αβεβαιότητα επαναληψιμότητας, από τη σχέση:
𝑆𝐷 0,0076
𝑢𝑟𝑒𝑝 = = = 0,0024 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝐿
√𝑛 √10
Και να την εκφράσουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα:
0,0024
urep = ∗ 100% = 0,68%
0,3518
Τέλος, υπολογίζουμε την τιμή και την αβεβαιότητα της μεροληψίας, σύμφωνα με την Εξίσωση 10.5:
b = x̅ − xref = 0,3518 − 0,3427 = 0,0091 mmol/L
284
ubias = √u(Cref )2 + urep 2 = √0,00362 + 0,00242 = 0,0043 mmol/L
και την εκφράζουμε ως σχετική τυπική αβεβαιότητα:
ubias = √u(Cref )2 + urep 2 = √1,052 + 0,682 = 1,25%
Βήμα 4: Υπολογισμός της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας
Αρχικά θα πρέπει να εκτιμηθεί εάν η μεροληψία είναι στατιστικά σημαντική και αυτό μπορεί να
γίνει με ένα από τους κάτωθι τρόπους:
α) Με σύγκριση της μεροληψίας (0,0091 mmol/L) με τη διευρυμένη Ubias = 2 * ubias = 2 * 0,0043 = 0,0086
mmol/L (k = 2). Εφ’όσον η απόλυτη τιμή της μεροληψίας είναι μεγαλύτερη της αβεβαιότητας, τότε η
μεροληψία είναι σημαντική και το αποτέλεσμα της μέτρησης του υλικού αναφοράς από το εργαστήριο
διαφέρει στατιστικά από την πιστοποιημένη του τιμή.
β) Με t-test: σύγκριση της μέσης τιμής των μετρήσεων επαναληψιμότητας με την πιστοποιημένη τιμή του
υλικού αναφοράς και έλεγχο εάν το p < 0,05.
γ) Πιο απλά όμως με εμπειρικό τρόπο, το ubias μπορεί να συγκριθεί με την ενδοεργαστηριακή
αναπαραγωγιμότητα uprec και να ελεγχθεί εάν υπερβαίνει το 10%:
ubias 1,25%
= = 0,445 => ubias = 44,5% uprec
uprec 2,81%
Από τη στιγμή λοιπόν που η αβεβαιότητα της μεροληψίας με όλους τους ανωτέρω τρόπους είναι
σημαντική σε σχέση με την ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα, πρέπει να συμπεριληφθεί στην εκτίμηση
της συνδυασμένης τυπικής αβεβαιότητας uc μιας μέτρησης:
𝑢𝑐 = √𝑢𝑏𝑖𝑎𝑠 2 + 𝑢𝑝𝑟𝑒𝑐 2 = √1,252 + 2,812 = 3,075%
Βήμα 5: Υπολογισμός της διευρυμένης αβεβαιότητας
Για τον υπολογισμό της διευρυμένης αβεβαιότητας U θα χρησιμοποιήσουμε για συντελεστή

κάλυψης το 2 έτσι ώστε να έχουμε 95% επίπεδο εμπιστοσύνης:
U = k x uc = 2 x 3,075% = 6,15%
Παρουσίαση των αποτελεσμάτων:
Έστω ότι η τιμή της συγκέντρωσης της κρεατινίνης ενός ασθενούς με την ανωτέρω μέθοδο στον
αναλυτή (μοναδιαία μέτρηση) του εργαστηρίου ευρέθη 0,1453 mmol/L. Η διευρυμένη αβεβαιότητα της τιμής
αυτής με k = 2, είναι 6,15% x 0,1453 = 0,0089 mmol/L. Το μετρούμενο αποτέλεσμα της κρεατινίνης για το
δεδομένο άτομο είναι: 0,1453 ± 0,0089 mmol/L. Η αληθής τιμή με επίπεδο εμπιστοσύνης της τάξης του 95%
εντοπίζεται στο διάστημα [0,1453 - 0,0089 έως 0,1453 + 0,0089] ή αλλιώς [0,1364 – 0,1542] mmol/L.
Σχόλια: Συνήθως στα κλινικά εργαστήρια δεν χρησιμοποιούνται περισσότερα από δύο σημαντικά ψηφία, συνε-
πώς το αποτέλεσμα κρεατινίνης του ασθενούς με την αβεβαιότητα αναγράφεται ως 0,15 ± 0,01 mmol/L
(European co-operation for Accreditation, 2003b). Το γεγονός ότι η μεροληψία είναι σημαντική σε μια μέθοδο
που είναι ιχνηλάσιμη, πρέπει να οδηγήσει το εργαστήριο σε διορθωτικές ενέργειες για την εξάλειψη ή τη μείωση
285
του λάθους π.χ. με διόρθωση τιμής μέσω λογισμικού, με επαναβαθμονόμηση κ.λπ. (EURACHEM/CITAC CG4,
2000∙ JCGM 100:2008, 2008).
Πηγές από το διαδίκτυο για εύρεση υλικών αναφοράς

 http://www.nist.gov/srm/index.cfm (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015)
 https://ec.europa.eu/jrc/en/reference-materials (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015)
 http://www.nibsc.org/products/brm_product_catalogue.aspx (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015)
 http://www.who.int/bloodproducts/ref_materials/en/ (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015)
Αναφορές
1. ΒΟΓΙΑΤΖΑΚΗΣ, Ε.Δ. (2007) Αξιολόγηση της ποιότητας των εργαστηριακών εξετάσεων. Αρχεία
Ελληνικής Ιατρικής, 24, p. 58-78.
2. ΕΥΑΓΓΕΛΟΠΟΥΛΟΣ, Α.Α., ΘΩΜΑΪΔΗΣ, Ν.Σ., ΚΟΥΠΠΑΡΗΣ, Μ. (2006) Αβεβαιότητα και
ιχνηλασιμότητα στο βιοχημικό εργαστήριο: νέα θεώρηση κλασικών όρων. Δελτίον Ελληνικής
Μικροβιολογικής Εταιρείας, 51, p. 82-94.
3. ΚΑΠΕΤΑΝΣΤΡΑΤΑΚΗ, Μ. (2015) Στατιστικές μέθοδοι για την επαλήθευση και τον έλεγχο ποιότητας
εργαστηριακών μεθόδων. ΜΠΣ Βιοστατιστική, Ιατρική Σχολή και Τμήμα Μαθηματικών Πανεπιστημίου
Αθηνών.
4. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2014) Διαπίστευση, πιστοποίηση, έλεγχος ποιότητας κλινικών εργαστηρίων. Ελληνικά
Αρχεία AIDS, 22, p. 4-9.
5. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2009; pp. 17-24) Διαπίστευση εργαστηρίων Μοριακής Διαγνωστικής κατά ISO 15189,
8o Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας, ed., Πάτρα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής Χημείας-Κλινικής
Βιοχημείας.
6. ΚΡΟΥΠΗΣ, Χ. (2008; pp. 19-30) Διαπίστευση κλινικών εργαστηρίων κατά ISO 15189: εφαρμογή στις
δοκιμές κυτταρομετρίας ροής, 5o Πανελλήνιο Συνέδριο Κυτταρομετρίας, ed., Ολυμπία: Ελληνική
Εταιρεία Κυτταρομετρίας.
7. ΛΕΪΜΟΝΗ, Ε.Δ. (2008) Διακρίβωση εξοπλισμού-ιχνηλασιμότητα, In: Πιστοποίηση και Διαπίστευση
εργαστηρίων: πρακτικές διαδικασίες και οδηγίες εφαρμογής, Αθήνα: Ελληνική Αιματολογική Εταιρεία.
8. ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ., ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΊΓΟΥ, Α.
(2006; pp. 41-52) Αβεβαιότητα μετρήσεων στην Κλινική Χημεία, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση Κλινικών
Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία Κλινικής
Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας.
9. ΜΗΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, Σ. (2003; pp. 14-25) Πρότυπα υλικά και μέθοδοι - Οροί ελέγχου, In: Ο έλεγχος
ποιότητας στο εργαστήριο Κλινικής Χημείας, 2ο Εκπαιδευτικό Σεμινάριο, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία
Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας.
10. ΜΠΑΚΕΑΣ, Ε. Β. (2006; pp. 7-11) Διαπίστευση Εργαστηρίων Δοκιμών, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση
Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία
11. ΣΤΑΘΑΚΗ-ΦΕΡΔΕΡΙΓΟΥ, Α., ΠΟΥΛΑΚΗ, Ε., ΠΡΙΓΚΟΣ, Ν., ΛΥΚΟΚΑ, Ε. Χ., ΠΙΠΕΡΑΚΗ, Κ.
(2006; pp. 53-6) Οδηγίες διασφάλισης ποιότητας κλινικών εργαστηρίων, In: Πιστοποίηση-Διαπίστευση
Κλινικών Εργαστηρίων, 1ο Σεμινάριο Συνεχιζόμενης Εκπαίδευσης, ed., Αθήνα: Ελληνική Εταιρεία
12. BERDING, C., CIESIOLKA, T., FISCHER, A., & EHRHARDT, V. (2010) Procedures of
Standardization of Clinical Chemistry and Immuno Assays from Roche Diagnostics Roche Diagnostics
AG.
13. DYBKAER, R. (1991) Reference materials--a main element in a coherent reference measurement system.
Eur.J.Clin Chem Clin Biochem, 29, p. 241-6.
14. CLSI (2012) C51-A Expression of measurement uncertainty in Laboratory Medicine; Approved Guideline
Wayne, PA, Clinical and Laboratory Standards Institute.
15. EMONS, H., FAJGELJ, A., VAN DER VEEN, A.M.H. et al., (2006) New definitions on reference
materials. Accred Qual Assur, 10, p. 576-8.
286
16. EMONS, H. (2006) The 'RM family'—Identification of all of its members. Accred.Qual Assur, 10, p. 690-
1.
17. EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003a) EA 4/14: The Selection and Use
of Reference Materials.
18. EURACHEM/CITAC (2003) Traceability in Chemical Measurement. A guide to achieving comparable
results in chemical measurement.
19. EURACHEM/CITAC CG4 (2000) Quantifying uncertainty in analytical measurement, 2nd ed.
20. EURACHEM/CITAC (2007) Use of uncertainty information in compliance assessment.
21. EUROPEAN CO-OPERATION FOR ACCREDITATION (EA) (2003b) EA-4/16: EA guidelines on the
expression of uncertainty in quantitative testing.
22. GUDER, W.G., NARAYANAN, S., WISSER, H., & ZAWTA, B. (2003) Samples: from the patient to the
laboratory. The impact of preanalytical variables on the quality of laboratory results, 3rd ed. Weinheim,
Wiley-VCH.
23. HUISMAN, W. (2012) European medical laboratory accreditation. Present situation and steps to
harmonisation. Clin Chem Lab Med, 50, p. 1147-52.
24. KALLNER, A. (2013) Estimation of uncertainty in measurements in the clinical laboratory.
Clin.Chem.Lab Med., 51, p. 2249-51.
25. MILLER, G.W., MYERS, G.L., LOU, G.M. et al., (2011) Roadmap for harmonization of clinical
laboratory measurement procedures. Clin Chem, 57, p. 1108-17.
26. PANTEGHINI, M. (2009) Traceability as a unique tool to improve standardization in laboratory
medicine. Clin Biochem, 42, p. 236-40.
27. INTERNATIONAL STANDARDS ORGANISATION (2012) ISO 15189: Medical Laboratories-
particular requirements for quality and competence.
28. THELEN, M.H., VANSTAPEL, F.J., KROUPIS, C. et al., (2015) Flexible scope for ISO 15189
accreditation: a guidance prepared by the European Federation of Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine (EFLM) Working Group Accreditation and ISO/CEN standards (WG-A/ISO). Clin Chem Lab
Med, 53, p. 1173-80.
29. JCGM 200:2008 (2008) International vocabulary of metrology - Basic and general concepts and
associated terms (VIM), 3rd ed.
30. JCGM 100:2008 (2008) Evaluation of measurement data-Guide to the expression of uncertainty in
measurement (GUM), 1st ed.
287
Ο ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΣΤΙΣ ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΑΝΑΛΥΣΕΙΣ
ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ
Σύνοψη
Βασικό καθήκον κάθε αναλυτή στο κλινικό εργαστήριο είναι εκτός των άλλων και ο έλεγχος ποιότητας των
αποτελεσμάτων που εξάγει. Ο έλεγχος ποιότητας προϋποθέτει πολλές γνώσεις στατιστικής, οι οποίες
ποικίλουν ανάλογα με τις αναλύσεις που αναφέρονται (ποσοτικές, ημιποσοτικές, ποιοτικές). Το κεφάλαιο
αυτό θα εστιάσει στον έλεγχο της ποιότητας των ποσοτικών αναλύσεων, που αποτελούν την πλειοψηφία στα
κλινικά εργαστήρια. Θα αναφερθούν επίσης, τα είδη των σφαλμάτων και λαθών που γίνονται στα
εργαστήρια και θα κατηγοριοποιηθούν στις επιμέρους κατηγορίες τους (τυχαία, συστηματικά). Ειδικότερα,
τα αναλυτικά σφάλματα θα αναλυθούν σε σχέση με την έλλειψη ακρίβειας και πιστότητας που προκαλούν
και θα περιγραφούν οι μαθηματικοί τρόποι υπολογισμού και των δύο. Σε ό, τι αφορά στις μεθόδους
στατιστικού ελέγχου ποιότητας, θα περιγραφούν χωριστά ο εσωτερικός και ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας
που χρησιμεύουν αντίστοιχα για τον υπολογισμό της έλλειψης επαναληψιμότητας (ή επαναληπτικότητας) και
ακρίβειας της αναλυτικής μεθόδου.
Το παρόν κεφάλαιο βασίζεται στις γνώσεις όλων των προηγούμενων κεφαλαίων, ειδικά όσων αφορούν
αναλύσεις και αρχές μεθόδου. Προαπαιτούμενα κεφάλαια είναι το Κεφάλαιο 9 (τα εσώκλειστα φυλλάδια των
αντιδραστηρίων) και 10 (πιστοποιημένα υλικά αναφοράς).
11.1 Βασικές έννοιες
Τα διαγνωστικά εργαστήρια, σε καθημερινή βάση, φροντίζουν για τη διασφάλιση της ποιότητας (Quality
Assurance) των αποτελεσμάτων τους.
Συχνά στα διαγνωστικά εργαστήρια παρατηρούνται σφάλματα που αφορούν τις αναλυτικές
μεθόδους και την ποιότητα των υλικών - αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται, καθώς και λάθη ως
αποτέλεσμα ανθρώπινης απροσεξίας του επιστημονικού εργαστηριακού προσωπικού.
Συνήθως, ο έλεγχος αξιοπιστίας των εργαστηριακών αποτελεσμάτων σχετίζεται ή ταυτίζεται με τον
αναλυτικό έλεγχο ποιότητας. Όμως, ο αναλυτικός έλεγχος ποιότητας θα πρέπει να αποτελεί τμήμα ενός
ευρύτερου συστήματος διαχείρισης της ποιότητας, που ονομάζεται διαχείριση ολικής ποιότητας (Total
Quality Management).
Η διαχείριση ολικής ποιότητας περιλαμβάνει όλες τις φάσεις λειτουργίας ενός εργαστηρίου, που
διασφαλίζουν την ακρίβεια (accuracy) και την πιστότητα (precision) σε όλα τα βήματα των διαδικασιών,
από την αρχική παραγγελία μιας εξέτασης (προ-αναλυτικό στάδιο) μέχρι την ανάλυση (αναλυτικό στάδιο)
και τη τελική διανομή των αποτελεσμάτων (μετα-αναλυτικό στάδιο). Οι παράγοντες, στους οποίους πιθανόν
να οφείλονται διακυμάνσεις ή τα σφάλματα στα αποτελέσματα των αναλύσεων μπορούν να διακριθούν σε
τρεις κατηγορίες:
 προ-αναλυτικής φάσης (pre-analytical errors),
 αναλυτικής φάσης (analytical errors) και
 μετα-αναλυτικής φάσης (post-analytical errors).
11.1.1 Προ-αναλυτικοί παράγοντες
Σχετίζονται με την μη αλλοίωση της δομής και της συγκέντρωσης της υπό προσδιορισμό ένωσης ή στοιχείου
στο βιολογικό δείγμα, προηγούνται της εργαστηριακής ανάλυσης και κυρίως αφορούν:
 την κατάσταση του ασθενούς (βιολογικοί και μη βιολογικοί παράγοντες),
288
 την προετοιμασία του ασθενούς πριν τη δειγματοληψία,
 τη δειγματοληψία,
 την εσφαλμένη ταυτοποίηση του δείγματος (π.χ. αναγραφή λανθασμένου ονόματος),
 τη συλλογή, μεταφορά και φύλαξη του βιολογικού δείγματος,
 τον χειρισμό του δείγματος (π.χ. αραίωση του δείγματος),
 τη φυγοκέντρηση,
 την κατάσταση του δείγματος (ορός αιμολυμένος ή λιπαιμικός),
 τις αντιπηκτικές ουσίες,
 τις ιδιότητες της προσδιοριζόμενης ουσίας, κ.α.
11.1.2 Αναλυτικοί παράγοντες
Αφορούν στην εργαστηριακή ανάλυση και σχετίζονται με τη λειτουργία των οργάνων και των αυτόματων
αναλυτών.
Η αναλυτική διαδικασία ξεκινά από τη στιγμή που φτάνει στο εργαστήριο το προς ανάλυση δείγμα
και τελειώνει με την αποστολή της έκθεσης των αποτελεσμάτων. Ενδεικτικά, οι αναλυτικοί παράγοντες
σχετίζονται με:
 λανθασμένη επιλογή μεθόδου ανάλυσης,
 μη σωστή λειτουργία των οργάνων,
 κακή βαθμονόμηση,
 κακή συντήρηση βαθμονομητών, ορών ελέγχου, αντιδραστηρίων και άλλων χημικών,
 λανθασμένη εκτέλεση του πρωτοκόλλου της μεθόδου προσδιορισμού,
 τη καθαρότητα των σκευών και των οργάνων (π.χ. κυψελίδων),
 την ελλιπή εκπαίδευση του προσωπικού, κ.α.
11.1.3 Μετα-αναλυτικοί παράγοντες
Περιλαμβάνουν κυρίως γραφειοκρατικά λάθη, όπως:

 λάθος αναγραφή των αποτελεσμάτων στα απαντητικά δελτία,
 απόδοση αποτελεσμάτων σε λάθος ασθενή,
 καθυστέρηση της απάντησης, κ.α.
Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων – μετρήσεων από μεγάλα νοσοκομεία έχει δείξει, πως η
πλειοψηφία των λαθών και σφαλμάτων (περίπου 90%) αφορούν κύρια τη προ-αναλυτική και τη μετα-
αναλυτική φάση και οφείλονται στον ανθρώπινο παράγοντα. Τα λάθη στις δύο αυτές φάσεις ονομάζονται
gross errors. Τα λάθη αυτά σήμερα έχουν ελαχιστοποιηθεί σημαντικά, λόγω της μηχανογράφησης των
εργαστηρίων και της χρήσης πολύτιμων στατιστικών εργαλείων.
11.1.4 Διαχείριση ολικής ποιότητας
Η διαχείριση ολικής ποιότητας περιλαμβάνει όλες εκείνες τις δραστηριότητες του εργαστηρίου που μπορούν
να εκφράσουν την ποιότητά του (Σχήμα 11.1), όπως:
 σχεδιασμό της ποιότητας (Quality Planning),
 εργαστηριακές διαδικασίες (Quality Laboratory Processes),
 έλεγχο ποιότητας (Quality Control),
 αποτίμηση της ποιότητας (Quality Assessment),
 βελτίωση της ποιότητας (Quality Improvement),
 πρότυπα ποιότητας (Quality Standards).
289
Σχήμα 11.1 Διαγραμματική απεικόνιση της «διαχείρισης ολικής ποιότητας».
Με βάση τα παραπάνω ο σχεδιασμός και η παρακολούθηση της αναλυτικής ποιότητας συμβάλλει

στον εντοπισμό και στη λήψη μέτρων για τη διόρθωση των σφαλμάτων και λαθών που εμφανίζονται κατά τη
διάρκεια των αναλύσεων.
Ο αναλυτικός έλεγχος ποιότητας περιλαμβάνει δύο παράλληλους και συμπληρωματικούς
μηχανισμούς ελέγχου:
 τον ενδο-εργαστηριακό, εσωτερικό έλεγχο (Internal Quality Control),
 τον δι-εργαστηριακό (εξωτερικό) έλεγχο (External Quality Assessment).
Ο εσωτερικός έλεγχος ποιότητας εφαρμόζεται σε καθημερινή βάση και έχει ως στόχο την
πιστοποίηση της επαναληπτικότητας και της ακρίβειας της μεθόδου ως προς ένα εσωτερικό πρότυπο
(standard). Τα αποτελέσματα των ελέγχων αυτών επεξεργάζονται στατιστικά με διάφορες μεθόδους για:
 τον εντοπισμό των σφαλμάτων σε πραγματικό χρόνο και τη λήψη διορθωτικών μέτρων,
 τη διαπίστευση των εργαστηριακών αποτελεσμάτων.
Ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος (External Quality Control) είναι προαιρετικός, εφαρμόζεται ως προς
ένα εξωτερικό πρότυπο από έναν εξωτερικό φορέα και βασίζεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης του ίδιου
δείγματος, σε τακτά χρονικά διαστήματα από έναν μεγάλο αριθμό εργαστηρίων. Η σύγκριση και η σύγκλιση
των επιδόσεων μεταξύ των εργαστηρίων αποτελεί έναν από τους δύσκολους στόχους του εξωτερικού
ελέγχου ποιότητας.
Κατά κανόνα, ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος (Σχήμα 11.2) αφορά κυρίως την επαναληπτικότητα
(τυχαία σφάλματα), ενώ ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος σχετίζεται με την ακρίβεια (συστηματικά
σφάλματα).
290
Σχήμα 11.2 Οι βασικοί ορισμοί και κατευθύνσεις του ελέγχου ποιότητας στα κλινικά εργαστήρια.
Ο εντοπισμός και η λήψη διορθωτικών μέτρων για την αποφυγή ή την εξάλειψη λαθών αποτελεί
καθημερινή απασχόληση του επιστημονικού προσωπικού των εργαστηρίων. Προς αυτή τη κατεύθυνση
συμβάλλουν συγκεκριμένα διεθνή πρότυπα (π.χ. ISO/IEC 15189: 2012).
11.1.5 Ταξινόμηση Λαθών και Σφαλμάτων
Στην κλινική χημεία ο όρος σφάλμα (Error ή Ε) αποτυπώνει τη διαφορά μεταξύ του αποτελέσματος της
εργαστηριακής μας ανάλυσης και της πραγματικής τιμής της συγκέντρωσης μιας ουσίας που προσδιορίζεται.
Ο προσδιορισμός ενός σφάλματος προσδιορίζεται σύμφωνα με τη σχέση:
Ε = μ - xi (Εξίσωση 7.1)
Όπου Ε το σφάλμα, μ η πραγματική τιμή και xi η εργαστηριακή τιμή.
Τα σφάλματα διακρίνονται σε:

 τυχαία σφάλματα,
 συστηματικά σφάλματα,
 λοιπά σφάλματα.
Τα τυχαία σφάλματα σχετίζονται με την επαναληπτικότητα (repeatability), ή και την

αναπαραγωγιμότητα (reproducibility), ενώ τα συστηματικά σφάλματα σχετίζεται με την έννοια ακρίβεια
(accuracy).
Μέτρο της επαναληπτικότητας αποτελεί η τυπική απόκλιση (Standard Deviation, SD ή s), η οποία
μπορεί να υπολογιστεί από την παρακάτω σχέση:
∑1𝑁(𝑥𝑖 −𝑥̅ )2
𝑆𝐷 ή 𝑠 = √ 𝑁−1
όπου:
SD ή s η τυπική απόκλιση,
Ν ο αριθμός των παρατηρήσεων,
xi η εκάστοτε τιμή,
𝑥̅ η μέση τιμή.
291
Επειδή η τυπική απόκλιση έχει μονάδες (αυτές των μετρήσεων), πολλές φορές, για την αποφυγή
λαθών, υπολογίζεται ένα άλλο μέγεθος, ο συντελεστής απόκλισης (coefficient of variation, CV). Αυτός
δίνεται από τη σχέση:
𝑆𝐷 𝑥 100
𝐶𝑉% = (Εξίσωση 7.3)
𝑥̅
Όπως βλέπουμε από την παραπάνω σχέση, ο συντελεστής μεταβλητότητας δίνει το μέτρο της
αναλυτικής διακύμανσης των μετρήσεων, δηλαδή τη σταθερή απόκλιση προς τη μέση τιμή των μετρήσεων,
επί τοις %. Είναι συνεπώς ανεξάρτητος από τις μονάδες μέτρησης και αντιπροσωπεύει ένα μέτρο σχετικής
διασποράς των τιμών.
11.2 Εσωτερικός Έλεγχος Ποιότητας
11.2.1 Ακρίβεια και Ολικό Σφάλμα (Total Error)
Η ακρίβεια (βλ. Ενότητα 9.2) χρησιμοποιείται πλέον ως γενικός όρος και αντιπροσωπεύει την εγγύτητα
(συμφωνία, closeness) του αποτελέσματος ενός προσδιορισμού από τη πραγματική ή αληθή τιμή (true ή
correct) της ουσίας που υπάρχει στο δείγμα (αποδεκτής τιμής αναφοράς) ή με άλλα λόγια τον βαθμό
ταύτισης της προσδιοριζόμενης και της πραγματικής τιμής.
Η ακρίβεια δεν εκφράζεται με τιμές. Το μαθηματικό μέτρο της ακρίβειας προσδιορίζεται με την
ανακρίβεια ή έλλειψη ακρίβειας (inaccuracy), η οποία αποτελεί μέτρο του ολικού σφάλματος,
συμπεριλαμβάνοντας το συστηματικό και τυχαίο σφάλμα (βλ. Σχήμα 9.3).
Oλικό σφάλμα (Total Error) = Συστηματικό Σφάλμα + Z ∙ Τυχαίο Σφάλμα (Εξίσωση 7.4)
όπου Z ο συντελεστής με βάση το διάστημα εμπιστοσύνης (Δ.Ε.) (π.χ. για Δ.Ε. 95%, ο Ζ έχει τιμή 1,96).
Η ακρίβεια αποτελεί κριτήριο για τα λεγόμενα «συστηματικά σφάλματα», δηλαδή σφάλματα που
οφείλονται στα όργανα μέτρησης, στα αντιδραστήρια, κ.α. και ειδικά για τα ένζυμα, λάθη στη θερμοκρασία
επώασης (υψηλότερες ή χαμηλότερες), με αποτέλεσμα καλή επαναληπτικότητα και κακή ακρίβεια. Τα
συστηματικά σφάλματα είναι μιας «κατεύθυνσης» (Σχήμα 11.3).
Σχήμα 11.3 Επαναληπτικότητα και ακρίβεια μετρήσεων (Aaser Abdealazim, 2012).
Μέτρο των συστηματικών σφαλμάτων - ακρίβειας αποτελεί το μέγεθος Βias, που υπολογίζεται από
την σχέση:
Bias = xi - 𝑥̅ (Εξίσωση 7.5)
292
Στα κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται συνήθως επικυρωμένες μέθοδοι από τις κατασκευάστριες
εταιρείες. Το σφάλμα της μέτρησης μπορεί να είναι τυχαίο (xi-…) ή συστηματικό (…-μ). Ελλείψει
συστηματικού σφάλματος η ακρίβεια εκφράζεται μόνο από το τυχαίο σφάλμα, δηλαδή το συντελεστή
διακύμανσης CV (πιστότητα). Παρουσία συστηματικού σφάλματος, δηλαδή (…-μ) >> SD, το σφάλμα
αποδίδει το μέτρο της ορθότητας (truness) της μεθόδου. Έτσι, το (…-μ) εκφράζει την ορθότητα της μεθόδου
και το (xi-μ) την ακρίβεια. Δηλαδή:
Σφάλμα μέτρησης = Συστηματικό σφάλμα + τυχαίο σφάλμα (Εξίσωση 7.6)
ή (xi – μ) = (𝑥̅ − 𝜇) + (xi - 𝑥̅ ) (Εξίσωση 7.7)
ή Ακρίβεια = Ορθότητα + Πιστότητα (Εξίσωση 7.8)
Η ακρίβεια έχει πολύ μεγάλη σημασία διότι τα συστηματικά σφάλματα των μετρήσεων, πρέπει να
είναι όσο το δυνατόν μικρότερα, ώστε τα αποτελέσματα:
 να είναι συγκρίσιμα με την πάροδο του χρόνου,
 να είναι συγκρίσιμα μεταξύ διαφορετικών εργαστηρίων, νοσοκομείων,
 να μπορούν να αξιολογηθούν με βάση εθνικά ή διεθνή πρότυπα και κριτήρια αξιολόγησης.
11.2.2 Μέθοδοι ελέγχου ακρίβειας
H στατιστική δοκιμασία t-student
Πρώτη περίπτωση
Ανάλυση ενός μόνο δείγματος (π.χ. ανάλυση υλικού αναφοράς (CRM) ή ορού ελέγχου (QC), με γνωστή
τιμή αναφοράς (μ).
Πραγματοποιείται μέτρηση του δείγματος Ν φορές και από τις λαμβανόμενες μετρήσεις υπολογίζεται η μέση
τιμή και η τυπική απόκλιση. Στη συνέχεια εφαρμόζεται η δοκιμασία t (t-student test) για τον έλεγχο ύπαρξης
στατιστικά σημαντικής διαφοράς μεταξύ της μέσης τιμής (Χmean) και της τιμής αναφοράς (μ), ως εξής:
Υπολογίζεται μία τιμή για την παράμετρο t με τη βοήθεια της σχέσης:
μ - xmean N (Εξίσωση 7.9)

t exp 
S
όπου texp η προσδιοριζόμενη τιμή t και s η τυπική απόκλιση.
Η τιμή texp συγκρίνεται με μία θεωρητική τιμή του t (ttheor), η οποία βρίσκεται με τη βοήθεια πίνακα,
για συγκεκριμένη στάθμη εμπιστοσύνης (π.χ. στάθμη εμπιστοσύνης 95%) και βαθμούς ελευθερίας f, όπου f
= Ν-1.
Αν texp < ttheor τότε συμπεραίνεται ότι δεν υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ της μέσης
τιμής που υπολογίσαμε και της τιμής αναφοράς, και συνεπώς η μέθοδος είναι ακριβής.
Παράδειγμα
Υλικό αναφοράς για την εξέταση γλυκόζη, έχει τιμή αναφοράς μ = 150 mg/dL. Πραγματοποιείται
προσδιορισμός της γλυκόζης εις 5-πλουν (Ν = 5) με μέση τιμή της Xmean = 158 mg/dL και τυπική απόκλιση S
= 7,8 mg/dL. Να αξιολογηθεί η ακρίβεια της μεθόδου.
Υπολογίζουμε την τιμή t μέσω της σχέσης:
150 - 158 5
t exp   2,293
7,8
293
Από κατάλληλο πίνακα βρίσκουμε την θεωρητική τιμή του t, για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και
για 4 βαθμούς ελευθερίας, ttheor = 2,776.
Στη συνέχεια συγκρίνουμε την υπολογιζόμενη τιμή του t με την θεωρητική και παρατηρούμε ότι
texp = 2,293 < ttheor = 2,776. Συνεπώς, δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ της μέσης τιμής και
της τιμής αναφοράς και άρα η μέθοδος στερείται συστηματικού σφάλματος. Το παρατηρούμενο σφάλμα
[(158-150) / 150] x 100 = 5,3% είναι τυχαίο, ίδιας τάξης μεγέθους με τη %RSD = (7,8/158) x 100 = 4,9%.
Δεύτερη Περίπτωση
Ανάλυση ενός δείγματος με γνωστή τιμή αναφοράς (Χαναφ) που συνοδεύεται από τυπική απόκλιση
(Sαναφ), η οποία υπολογίστηκε από αριθμό Ναναφ αναλύσεων, μέσω άλλης πρότυπης μεθόδου.
Στην περίπτωση αυτή, πρώτα ελέγχουμε, εάν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των τυπικών
αποκλίσεων των δύο συγκρινόμενων μεθόδων, με τη βοήθεια της δοκιμασίας F, ως εξής:
Υπολογίζεται η τιμή Fexp μέσω της σχέσης:
Fexp = S21 / S22 (Εξίσωση 7.10)
όπου S1 η μεγαλύτερη τυπική απόκλιση.
Ακολούθως, βρίσκουμε τη θεωρητική τιμή του F (Ftheor), για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και f = N1
+ N2 -2 βαθμούς ελευθερίας.
Στη συνέχεια συγκρίνουμε την υπολογιζόμενη τιμή του Fexp με τη θεωρητική Ftheor και αν Fexp <
Ftheor τότε συμπεραίνεται ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των συγκρινόμενων τυπικών
αποκλίσεων των δύο μεθόδων, ενώ, εάν συμβαίνει το αντίθετο, τότε η διαφορά είναι σημαντική.
Σημείωση: Για να προχωρήσουμε στην εξέταση ύπαρξης συστηματικού σφάλματος, θα πρέπει να μην υπάρχει
στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο συγκρινόμενων μεθόδων.
Αν ισχύει η ανωτέρω προϋπόθεση, τότε:

 Αναλύεται το δείγμα με την υπό αξιολόγηση μέθοδο Νμεθ - φορές και βρίσκεται η μέση τιμή Xmean και η
τυπική απόκλιση Sμεθ.
 Εφαρμόζεται η δοκιμασία t (t-student test) για τον έλεγχο ύπαρξης στατιστικά σημαντικής διαφοράς με-
ταξύ Χmean και τιμής αναφοράς Χαναφ, με τη βοήθεια της σχέσης:
X αναφ  X mean N1 N 2
t exp  (Εξίσωση 7.11)
S12 N1  N 2
Όπου S1-2 η συνδυασμένη τυπική απόκλιση, η οποία υπολογίζεται μέσω της σχέσης:
S12 (N 1  1)  S 22 (N 2  1)
S12  (Εξίσωση 7.12)
N1  N 2  2
Δείγμα ουσίας Α με τιμή αναφοράς Χαναφ = 216 mg/dL και τυπική απόκλιση Sαναφ = 6,4 mg/dL (Ναναφ = 5)
αναλύεται με την υπό αξιολόγηση μέθοδο εις 7-πλουν (Ν2 = 7). Βρέθηκε μέση τιμή Xmean = 196 mg/dL και
τυπική απόκλιση S = 5,8 mg/dL. Να αξιολογηθεί η ακρίβεια της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε.
Πρώτα εξετάζουμε, εάν υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων
των δύο μεθόδων.
Υπολογίζεται η τιμή του Fexp: Fexp = S21 / S22 = 6,42 / 5,82 = 1,218
294
Η θεωρητική τιμή του Ftheor = 6,89 (95%, f = 10). Επειδή Ftest < Ftheor συνεπάγεται ότι δεν υπάρχει
σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ των τυπικών αποκλίσεων των δύο μεθόδων. Άρα, οι δύο
επαναληπτικότητες είναι στατιστικά ισοδύναμες και μπορούμε να προχωρήσουμε στην εξέταση της
ακρίβειας της μεθόδου που εφαρμόσαμε.
Για το σκοπό αυτό:
Υπολογίζεται η συνδυασμένη τυπική απόκλιση: S1-2  40,9(4)  33,6(6)  6,0 mg/dL
5 7  2
Υπολογίζεται η τιμή του t: texp = 5,66. Από κατάλληλο πίνακα ανευρίσκεται η θεωρητική τιμή του t,
για στάθμη εμπιστοσύνης 95% και 10 βαθμούς ελευθερίας,: ttheor = 2,228
Επειδή texp = 5,66 > ttheor = 2,228, συνεπάγεται ότι υπάρχει σημαντική στατιστικά διαφορά μεταξύ
της τιμής αναφοράς και της υπολογιζόμενης μέσης τιμής. Συνεπώς, η διαφορά δεν είναι τυχαία και υπάρχει
συστηματικό σφάλμα ίσο με [(196-216)/216] x 100 = - 9,2% που είναι μεγαλύτερο από την %RSD =
(5,8/196) x 100 = 3,0%.
Τρίτη Περίπτωση
Μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας σε άγνωστο θετικό δείγμα και υπολογισμός ανάκτησης.
Αναλύεται άγνωστο δείγμα ουσίας Α και προσδιορίζεται η συγκέντρωσή του C0. Στο δείγμα γίνεται
προσθήκη γνωστής μικρής ποσότητας ουσίας Α (ώστε να μην επέλθει μεταβολή του όγκου) και
επαναπροσδιορίζεται η συγκέντρωση C1 του ενισχυμένου δείγματος.
Η ανάκτηση (Recovery, R) ως μέτρο της ακρίβειας δίνεται από τη σχέση:
C 1  C0
%R   100 (Εξίσωση 7.13. Αυστηρός τύπος)
ΔC
ή
C1
%R  x100 (Εξίσωση 7.14. Ελαστικός τύπος)
C0  ΔC
1ο Παράδειγμα
Άγνωστο δείγμα ουσίας Α αναλύθηκε με την μέθοδο προς αξιολόγηση και βρέθηκε η συγκέντρωση της
ουσίας Α ίση με C0 = 106 mg/dL. Στη συνέχεια, στο δείγμα έγινε προσθήκη γνωστής ποσότητας ουσίας Α,
ΔC = 100 mg/dL (θεωρώντας ότι δεν έχει μεταβληθεί σημαντικά ο όγκος του δείγματος). Κατά τον
επαναπροσδιορισμό της ουσίας Α, βρέθηκε συγκέντρωση ίση με C1 = 195 mg/dL. Να υπολογισθεί η %
ανάκτηση της ουσίας Α.
Με χρήση της σχέσης:
C1  C0
%R   100 (Εξίσωση 7.15)
C
195 - 106
Βρίσκουμε: %R   100  89,0%
100
Ενώ, με χρήση της σχέσης:
C1
%R  x100 (Εξίσωση 7.16)
C0  ΔC
195
Βρίσκουμε: %R  x100  94,7%
106  100
295
2ο Παράδειγμα
Κατά την αξιολόγηση μίας μεθόδου που χρησιμοποιείται σε εργαστήριο κλινικής βιοχημείας, αναλύθηκε
ορός αίματος ασθενούς και προσδιορίστηκε η συγκέντρωση της γλυκόζης, ίση με Cο = 150 mg/dL. Στη
συνέχεια, ο ορός αίματος αραιώθηκε σε αναλογία 1:1 με ορό ελέγχου, ο οποίος είχε τιμή αναφοράς για τη
γλυκόζη ίση με 250 mg/dL. Το διάλυμα που προέκυψε αναλύθηκε και έδωσε τιμή συγκέντρωσης γλυκόζης
ίση με 207 mg/dL. Να υπολογισθεί η ανάκτηση της μεθόδου:
Με βάση τη δεύτερη σχέση για τον προσδιορισμό του ποσοστού ανάκτησης έχουμε:
207
%R  x100  103,5%
(150/2)  (250/2)
Σημείωση: Παρατηρείστε ότι στον τύπο υπολογισμού του ποσοστού ανάκτησης έχουμε χρησιμοποιήσει τις νέες
συγκεντρώσεις της γλυκόζης στο αραιωμένο διάλυμα.
Τέταρτη Περίπτωση. Με προσδιορισμό μεγάλου αριθμού (N) αγνώστων δειγμάτων με την υπό αξιολόγηση
μέθοδο και με μια μέθοδο αναφοράς και αξιολόγηση των διαφορών με κατά ζεύγη με τη δοκιμασία t.
Χρησιμοποιείται ο τύπος:
d N
t exp  (Εξίσωση 7.17)
Sd
Όπου 𝑑̅ η μέση τιμή των διαφορών (με χρήση προσήμου +/-) και Sd η τυπική απόκλιση των διαφορών.
Για την αξιολόγηση μιας αναλυτικής μεθόδου αναλύθηκαν 20 άγνωστα δείγματα: α) με την υπό αξιολόγηση
μέθοδο και β) με μια μέθοδο αναφοράς. Τα αποτελέσματα των δύο μεθόδων παρουσιάζονται στον παρακάτω
πίνακα. Να αξιολογήσετε την ακρίβεια της μεθόδου.
Αξιολογούμενη Μέθοδος Μέθοδος Αναφοράς ̅

Α/Α 𝒅
(mg/L) (mg/L)
1 316 320 -4
2 426 460 -34
3 528 520 8
4 156 160 -4
5 368 378 -10
6 780 790 -10
7 990 1032 -42
8 256 248 8
9 678 687 -9
10 758 789 -31
11 1200 1189 11
12 907 926 -19
13 456 478 -22
14 357 367 -10
15 268 276 -8
16 789 770 19
17 215 225 -10
18 467 445 22
19 678 680 -2
20 895 903 -8
Μέση διαφορά (𝑑̅ ): - 7,25
296
Τυπική απόκλιση (Sd) 10,8
 7 ,25 20
t exp   3,00
10,8
Η τιμή tther (για f = 20-1 και 95%) είναι ίση με 2,10 < texp και επομένως, υπάρχει σημαντική
στατιστικά διαφορά μεταξύ των δύο μεθόδων και η ελεγχόμενη μέθοδος δεν είναι ακριβής.
11.2.3 Ορθότητα (Trueness) και Συστηματικό σφάλμα (Systematic error)
Η ορθότητα είναι ένας νέος όρος που εισήχθη για τα συστηματικά σφάλματα. Η ορθότητα είναι η ταύτιση
(εγγύτητα συμφωνίας) μεταξύ της μέσης εργαστηριακής αριθμητικής τιμής και της πραγματικής τιμής του
ίδιου δείκτη (ή της αποδεκτής τιμής αναφοράς). Δεν έχει αριθμητική έκφραση και εξαρτάται από τα
συστηματικά σφάλματα.
Από τα συστηματικά σφάλματα, ιδιαίτερη σημασία για τη διασφάλιση της ορθότητας των
αποτελεσμάτων, έχει η βαθμονόμηση, η οποία θα πρέπει να εξασφαλίζει τη μετρήσιμη (μετρολογική)
ιχνηλασιμότητα του τελικού αποτελέσματος, με επαναλαμβανόμενη μη διακοπτόμενη αλυσίδα αναλύσεων
και συγκρισιμότητα με πρότυπα υλικά βαθμονόμησης υψηλής ποιότητας.
Η μέτρηση ικανού αριθμού δειγμάτων με γνωστή συγκέντρωση ή ποσότητα του προσδιοριζόμενου
συστατικού δίνει τη δυνατότητα να προσδιορίσουμε το είδος του συστηματικού σφάλματος. Η διαδικασία
πραγματοποιείται με θεώρηση του διαγράμματος συσχέτισης (correlation plot) πραγματικών – μετρούμενων
τιμών χημικών μονάδων (συγκέντρωσης ή μάζας). Τα συστηματικά σφάλματα ταξινομούνται σε τέσσερεις
βασικές κατηγορίες, ανάλογα με τη μορφή της καμπύλης του διαγράμματος συσχέτισης.
Μπορεί να παρατηρηθούν τεσσάρων ειδών συστηματικά σφάλματα:

 Σταθερό σφάλμα (constant error). H καμπύλη συσχέτισης είναι παράλληλη προς την ιδανική και δεν
διέρχεται από την αρχή των αξόνων. Οδηγεί σε μονοκατευθυνόμενο (θετικό ή αρνητικό) αναλυτικό
σφάλμα (Σχήμα 11.4Α).
 Αναλογικό σφάλμα (proportional error). H καμπύλη συσχέτισης διέρχεται από την αρχή των αξόνων.
Οδηγεί σε μονοκατευθυνόμενο (θετικό ή αρνητικό) αναλυτικό σφάλμα, με αυξανόμενο μέγεθος, όσο αυ-
ξάνει η περιεκτικότητα του δείγματος στο προσδιοριζόμενο συστατικό, ενώ το σχετικό σφάλμα παραμένει
σταθερό (Σχήμα 11.4Β).
 Συνδυασμός σταθερού - αναλογικού σφάλματος (combined error). Οδηγεί σε σφάλματα μονοκατευθυ-
νόμενα ή μία μόνο χαρακτηριστική αλλαγή προσήμου του σφάλματος (Σχήμα 11.4Γ).
 Περίπλοκο/μεικτό σφάλμα. Αποτελεί μερική περίπτωση του προηγούμενου τύπου και αποδίδεται από
μη ευθύγραμμες καμπύλες συσχέτισης. Συνήθως οφείλεται στη χημεία της μέτρησης (π.χ. μικρές σταθε-
ρές ισορροπίας, βραδεία αποκατάσταση ισορροπίας) και σε οργανολογικά προβλήματα. Τα σφάλματα
μπορεί να είναι μονοκατευθυνόμενα ή να ομαδοποιούνται σε περιορισμένο αριθμό ομάδων με το ίδιο
πρόσημο (Σχήμα 11.4Δ).
297
Σχήμα 11.4 Σταθερό σφάλμα (Α), αναλογικό σφάλμα (Β), συνδυασμός σταθερού – αναλογικού σφάλματος (Γ) και
περίπλοκο – μεικτό σφάλμα (Δ).
11.2.4 Πιστότητα
Η πιστότητα αντιπροσωπεύει τη ταύτιση μεταξύ ανεξάρτητων αποτελεσμάτων δοκιμασιών,

επαναλαμβανόμενων προσδιορισμών ενός δείγματος κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (βλ. Ενότητα 9.2).
Διακρίνεται σε δύο κατηγορίες:
 την επαναληπτικότητα (repeatability), που αναφέρεται σε πειράματα εντός της σειράς (within run) ή εντός
της ημέρας (within day) και
 την αναπαραγωγιμότητα (reproducibility) σε μεταβαλλόμενες συνθήκες, που αναφέρεται σε πειράματα
μεταξύ ημερών (between days). Η αναπαραγωγιμότητα μπορεί να είναι ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγι-
μότητα (intralaboratory), ή διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα (interlaboratory).
11.2.5 Η Αβεβαιότητα της ανάλυσης
Η αβεβαιότητα της ανάλυσης (Uncertainty of measurment) αποτελεί δείκτη, ο οποίος χαρακτηρίζει το

διάστημα των τιμών, στο οποίο βρίσκεται η «πραγματική» τιμή της αναλυόμενης ποσότητας, ή καθορίζει τα
όρια, στα οποία ένα αποτέλεσμα εξετάζεται ως ακριβές, δηλαδή αναπαραγώγιμο και ορθό. Συμπεριλαμβάνει
όλες τις πηγές τυχαίων και συστηματικών λαθών της αναλυτικής διαδικασίας, οι οποίες είναι δυνατό να
μετρηθούν. Κάποιες από τις πηγές σφαλμάτων μπορούν να αξιολογηθούν με στατιστική κατανομή σε σειρά
και να χαρακτηριστεί με πειραματική SD ή με άλλες πηγές πληροφόρησης για τα συστηματικά σφάλματα.
Σημαντικό είναι να διαχωρίζεται το σφάλμα από την αβεβαιότητα, καθώς το σφάλμα προσδιορίζεται
ως διαφορά μεταξύ μετρήσιμης και πραγματικής τιμής, ενώ η αβεβαιότητα σχετίζεται με το αποτέλεσμα της
μέτρησης και χαρακτηρίζει τη διασπορά των τιμών, που μπορούν λογικά να αποδοθούν στο μετρούμενο.
Η αβεβαιότητα μπορεί να διακριθεί σε τυπική, σχετική τυπική, συνδυασμένη τυπική και διευρυμένη
αβεβαιότητα (Σχήμα 11.5).
298
Σχήμα 11.5 Η αβεβαιότητα τα συστατικά της.
11.2.5.1 Υπολογισμός Αβεβαιότητας τύπου Α
Η αβεβαιότητα τύπου Α εκτιμάται από την τυπική απόκλιση 10 τουλάχιστον μετρήσεων, υπό συνθήκες
ενδοεργαστηριακής αναπαραγωγιμότητας, σε όλα τα επίπεδα συγκέντρωσης που εξετάσθηκαν κατά την
επαλήθευση και από την τυπική απόκλιση 6 μετρήσεων κάθε παραμέτρου από τα πειράματα ανάκτησης
[Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων
κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 15189].
11.2.5.2 Υπολογισμός Αβεβαιότητας τύπου Β
Η αβεβαιότητα τύπου Β δεν στηρίζεται σε αυστηρά στατιστικά δεδομένα, αλλά σε παράπλευρη

πληροφόρηση. Εκτιμάται συνήθως από πηγές αβεβαιότητας για χρησιμοποιούμενους βαθμονομητές του
αυτόματου αναλυτή. Εφόσον πραγματοποιείται ανασύσταση του βαθμονομητή, μπορεί να εκτιμηθεί και η
συνεισφορά από την αβεβαιότητα του χρησιμοποιούμενου ογκομετρικού εξοπλισμού. Εν γένει, όλες οι πηγές
αβεβαιότητας καταγράφονται και δίνονται οδηγίες για τον περιορισμό της συνεισφοράς τους στο τελικό
αποτέλεσμα (διακριβωμένες αυτόματες πιπέττες και θερμόμετρα ψυγείων, σωστή δειγματοληψία, μεταφορά
και προ-αναλυτική ετοιμασία του δείγματος, κ.α.) [Εθνικό Σύστημα Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια
Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO 15189].
11.2.5.3 Υπολογισμός Συνδυασμένης Αβεβαιότητας
Υπολογίζεται από το νόμο διάδοσης των αβεβαιοτήτων. Για την εκτίμηση καταλληλότητας εφαρμογής της
μεθόδου από το εργαστήριο, η συνδυασμένη αβεβαιότητα συγκρίνεται με τις τιμές που δίνονται από τον
κατασκευαστή της συσκευής ή και από τις τιμές που δίνονται από τη βιβλιογραφία. [Εθνικό Σύστημα
Διαπίστευσης Α.Ε.: Κατευθυντήρια Οδηγία για τη Διαπίστευση Κλινικών Εργαστηρίων κατά ΕΛΟΤ ΕΝ ISO
15189].
11.2.6 Ιχνηλασιμότητα
Ιχνηλασιμότητα (Traceability) είναι η ικανότητα παρακολούθησης (track) και ανίχνευσης της προέλευσης
(trace) ενός προϊόντος κατά την διάρκεια της παραγωγής και διακίνησής του (βλ. Κεφάλαιο 10). Η
ιχνηλασιμότητα μας δίδει τη δυνατότητα να έχουμε άμεσα διαθέσιμες πληροφορίες που σχετίζονται με το
προϊόν. Έτσι, στην περίπτωση που κάτι στο προϊόν δεν είναι αποδεκτό, δίδεται στην εταιρεία η δυνατότητα
να εντοπίσει την πηγή του προβλήματος, να το διορθώσει, ενώ παράλληλα μπορεί να ανιχνεύσει και τα
299
υπόλοιπα προϊόντα της ίδιας παρτίδας, που ενδεχομένως πρέπει να αποσυρθούν. Παράλληλα, δίδει τη
δυνατότητα καλύτερης κοστολόγησης του προϊόντος, μια και μετρώνται με ακρίβεια όλες οι παράμετροι που
σχετίζονται με το προϊόν (ISO 17511).
11.2.7 Ολικό Εργαστηριακό Σφάλμα (Total Laboratory Error)
Τόσο η ακρίβεια όσο και η επαναληπτικότητα μπορεί να εκτιμηθούν μέσα από ένα σύνολο μετρήσεων
(αποτελεσμάτων). Η εκτίμηση της ακρίβειας μπορεί να εκτμηθεί σωστά εφόσον η επαναληπτικότητα
παραμένει σταθερή και το αντίθετο. Διαφορετικά, μεταβολές στην ακρίβεια θα συμβάλουν σε έλλειψη
επαναληπτικότητας, ενώ μεταβολές στην επαναληπτικότητα θα οδηγήσουν σε ανακρίβεια. Ο συνδυασμός
των δύο αποτελεί την αναλυτική διακύμανση ή μεταβλητότητα (analytical variation) που εκφράζει το ολικό
εργαστηριακό σφάλμα (total laboratory error ή TLE ή TE), (Σχήμα 11.6).
Το ολικό σφάλμα για διάστημα εμπιστοσύνης 95% ισούται με:
Ολικό εργαστηριακό σφάλμα (ΤΕ) = συστηματικό σφάλμα (bias – μ) + τυχαίο σφάλμα (± 2sd) (Εξίσωση 7.18)
ΤΕ = bias + 1,68 SD, για διάστημα εμπιστοσύνης 95% (Εξίσωση 7.19)
Ανεξάρτητα του διαστήματος εμπιστοσύνης το ολικό εργαστηριακό σφάλμα ισούται με:
Ολικό εργαστηριακό σφάλμα (ΤΕ) = Bias ± z SD (Εξίσωση 7.20)
Όπου z ο συντελεστής που εξαρτάται από το διάστημα εμπιστοσύνης.
Σχήμα 11.6 Το ολικό εργαστηριακό σφάλμα (συστηματικό σφάλμα [bias – μ] + τυχαίο σφάλμας [± 2SD]).
11.3 O Εσωτερικός έλεγχος ποιότητας της πιστότητας (τυχαία σφάλματα)
Ένα πρόγραμμα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου πρέπει να πραγματοποιείται για όλες τις εργαστηριακές
διεργασίες. Οι λειτουργίες, οι οποίες πρέπει να εκτελεί περιλαμβάνουν τον έλεγχο:
300
 για τυχαία σφάλματα, δηλαδή της πιστότητας,
 για συστηματικά σφάλματα, δηλαδή της ορθότητας,
 της επίδρασης του matrix (βασικών ουσιών) στην πιστότητα, την ορθότητα και την εξειδίκευση,
 των τάσεων (trends).
11.3.1 Υλικά ελέγχου
Η εφαρμογή ενός προγράμματος εσωτερικού ελέγχου ποιότητας απαιτεί τη χρησιμοποίηση υλικών που
ονομάζονται υλικά ελέγχου. Τα υλικά ελέγχου πρέπει να διαθέτουν προκαταβολικά τις παρακάτω
απαιτήσεις:
 πρέπει να μοιάζουν όσο γίνεται περισσότερο προς τα δείγματα των ασθενών, σε ό, τι αφορά στη χημική
σύσταση και τα φυσικά χαρακτηριστικά,
 πρέπει η συγκέντρωση των συστατικών τους να είναι σταθερή,
 η συγκέντρωση των συστατικών να βρίσκεται στην περιοχή αναφοράς ή στα όρια σημαντικότητας της
κλινικής παθολογίας.
Τα εμπορικά υλικά ελέγχου μπορούν να παρασκευαστούν στη βάση των παρακάτω βασικών ουσιών
(matrix):
 βιολογική βασική ουσία: χρησιμοποιούνται επιμέρους κλάσματα ανθρώπινου ορού, διαλυμένα σε φυσιο-
λογικό ορό,
 ημισυστηματική βασική ουσία: απομονώνονται ένζυμα σε καθαρό διάλυμα αλβουμίνης, ή καθαρά υπο-
στρώματα διαλυμένα σε συστατικά ορού, ή συνδυασμός κλασμάτων ορού, καθαρά υποστρώματα, διαλυ-
μένα σε φυσιολογικό ορό.
Από άποψη προέλευσης τα υλικά ελέγχου μπορεί να είναι ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης (από βοοειδή, ή
χοίρους, ή από ορό αλόγου). Για το μεγαλύτερο μέρος των κλινικοχημικών εργαστηριακών αναλύσεων
χρησιμοποιούνται υλικά ελέγχου ανθρώπινης προέλευσης, λόγω της μεγαλύτερης συγγένειάς τους με τη
βασική ουσία των δειγμάτων των ασθενών. Τα υλικά ελέγχου που χρησιμοποιούνται είναι:
 πρότυποι οροί ή υλικά βαθμονόμησης (standards ή calibrators),
 οροί ελέγχου (Quality Controls ή QC).
11.3.2 Χάρτες ή Διαγράμματα Ελέγχου
Μεγάλη εφαρμογή βρίσκουν στα κλινικοχημικά εργαστήρια η χρήση των χαρτών ελέγχου, οι οποίοι
αντιπροσωπεύουν τη διαγραμματική απεικόνιση (Σχήμα 11.7) των αποτελεσμάτων ελέγχου (Shewhart, 1931.
Σε κάθε εργαστήριο για κάθε εργαστηριακό ποσοτικό δείκτη κατασκευάζεται χάρτης ελέγχου (control chart).
Λόγω των τυχαίων σφαλμάτων, ένα σωστό αποτέλεσμα δεν είναι μία και μόνο τιμή, αλλά ένα
αποδεκτό εύρος τιμών. Για το λόγο αυτό χρειάζεται να γίνεται σύγκριση του αποτελέσματος της ανάλυσης
με αυτό που αναμένεται σύμφωνα με τη συμπεριφορά του δείγματος κατά το παρελθόν. Τη δυνατότητα αυτή
την παρέχουν τα διαγράμματα ή χάρτες ελέγχου.
301
Σχήμα 11.7 Γενική διαγραμματική απεικόνιση ενός χάρτη ελέγχου.
11.3.3 Κατασκευή Χαρτών Ελέγχου Levey – Jennings
Η κατασκευή του χάρτη ελέγχου Levey – Jennings (Levey & Jennings, 1951) βασίζεται στην υπόθεση ότι οι
τιμές υπόκεινται σε μια τυχαία διακύμανση, η οποία ακολουθεί την κατανομή κατά Gauss, δηλαδή
αναμένεται ότι το 68,2% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ±1 SD, τo 95,5% των τιμών θα βρεθεί
εντός του διαστήματος ± 2 SD και το 99,7% εντός του ±3 SD.
Στο Σχήμα 11.8 δίνεται ένας κλασικός χάρτης ελέγχου Shewart (Levey – Jennings), που λειτουργεί
μόνο με δύο είδη ορίων: ± 2 SD από τη μέση τιμή, τα οποία ονομάζονται προειδοποιητικά, και ±3SD από
τη μέση τιμή, τα οποία ονομάζονται ελέγχου. Στον οριζόντιο άξονα καταγράφονται οι ημέρες του μήνα και
στον κάθετο άξονα οι συγκεντρώσεις της ουσίας σε κατάλληλες μονάδες. Όταν το αναλυτικό σύστημα είναι
υπό έλεγχο, τα καθημερινά αποτελέσματα ελέγχου κατανέμονται ομοιόμορφα των δύο πλευρών της ευθείας
της μέσης τιμής.
Σχήμα 11.8 Διάγραμμα Levey – Jennings.
302
11.3.4 Κριτήρια Westgard
Από το 1981 στα κλινικά εργαστήρια χρησιμοποιούνται ευρέως τα κριτήρια του J. O. Westgard (ή κανόνες
ελέγχου), με βάση τα οποία αυξάνεται η ευαισθησία του κλασικού χάρτη ελέγχου για την ανίχνευση τυχαίων
και συστηματικών σφαλμάτων, χωρίς να αυξάνονται οι περιπτώσεις ψευδούς απόρριψης.
Χρησιμοποιείται ο κλασικός χάρτης ελέγχου, ο οποίος αξιολογείται με δύο είδη κριτηρίων του
Westgard (Westgard Multirules) (Westgard et al., 1981):
 προειδοποιητικά κριτήρια (warning rules),
 κριτήρια για απόρριψη (rejection rules).
Ουσιαστικά, τα κριτήρια αυτά καθορίζουν κατά πόσο η ανάλυση βρίσκεται «υπό έλεγχο» (αποδεκτή)
ή εκτός ελέγχου (μη αποδεκτή). Σήμερα χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο η διαδικασία πολλαπλών
κανόνων (multirule) του Westgard. Στη καθημερινή πρακτική είναι δυνατή η εφαρμογή τους, τόσο κατά τη
χρήση ενός ορού ελέγχου, όσο και δύο ή και περισσότερων.
Στο Σχήμα 11.9 απεικονίζεται η διαδοχικότητα των κριτηρίων Westgard, βάσει της οποίας η
αξιολόγηση ξεκινά από το 12SD κριτήριο, ενώ μετά από αυτό το κριτήριο, εφαρμόζονται διαδοχικά οι
υπόλοιποι κανόνες και λαμβάνονται ανάλογα αποφάσεις για απόρριψη της αναλυτικής σειράς και για
απομάκρυνση των πηγών σφαλμάτων.
Σχήμα 11.9 Διάγραμμα για τη διαδικασία λήψης αποφάσεων με βάση τα κριτήρια (κανόνες).
11.3.5 Κριτήρια χρήσης ενός Υλικού Ελέγχου
Κριτήριο 12SD
Εάν ένα αποτέλεσμα ελέγχου βρίσκεται εκτός των ορίων 𝑥̅ ± 2SD (Σχήμα 11.10) θεωρείται ως
προειδοποιητικό κριτήριο. Απαραίτητο είναι να ελεγχθούν τα υπόλοιπα δείγματα ελέγχου στις προηγούμενες
αναλυτικές σειρές, καθώς χρησιμοποιούνται τα υπόλοιπα κριτήρια ελέγχου: 13SD, 22SD, 10𝑥̅ .
303
Σχήμα 11.10 Κανόνας 12SD : αποτέλεσμα ελέγχου εκτός των ορίων 𝑥̅ ± 2SD.
Εάν μία τιμή ελέγχου βρίσκεται εκτός των ορίων ± 3SD (Σχήμα 11.11), η αναλυτική σειρά απορρίπτεται,
επειδή και αυτή είναι εκτός ελέγχου. Εφαρμόζεται μόνο σε μία αναλυτική σειρά. Αυτό το κριτήριο είναι
ευαίσθητο για τυχαίο σφάλμα, αλλά μπορεί επίσης να δείξει και την ανάδειξη συστηματικού σφάλματος με
ιδιαίτερα μεγάλο μέγεθος.
Σχήμα 11.11 Κανόνας 13SD : αποτέλεσμα ελέγχου εκτός των ορίων 𝑥̅ ± 3 SD.
Εάν δύο διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου βρίσκεται εκτός των ίδιων ορίων ± 2SD (Σχήμα 11.12), η
αναλυτική σειρά απορρίπτεται. Με αυτό το κριτήριο ανιχνεύεται τυχαίο σφάλμα.
Μέση Τιμή
Σχήμα 11.12 Κανόνας 22SD : δύο διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου εκτός των ορίων 𝑥̅ ± 2SD. Επάνω με ένα δείγμα
ελέγχου και κάτω με δύο.
304
Τα τελευταία τέσσερα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου ενός και αυτού υλικού ελέγχου βρίσκονται εκτός
των ορίων ± 1SD (Σχήμα 11.13). Το κριτήριο είναι ευαίσθητο για συστηματικά σφάλματα. Με αυτό το
κριτήριο η αναλυτική σειρά δεν απορρίπτεται. Το κριτήριο προειδοποιεί για την δημιουργία συστηματικού
σφάλματος, για το οποίο είναι απαραίτητο να ελεγχθεί η βαθμονόμηση του οργάνου και η αναλυτική
μέθοδος. Αυτό συνεπάγεται ότι πρέπει να γίνει και στο κριτήριο 13SD.
Σχήμα 11.13 Κανόνας 41SD : τέσσερα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου εκτός των ορίων 𝑥̅ - 1SD. Επάνω με ένα δείγμα
ελέγχου και κάτω με δύο.
Κριτήριο 10𝒙
̅
Δέκα διαδοχικές τιμές ελέγχου από τη μια και αυτή πλευρά της μέσης αριθμητικής (Σχήμα 11.14), χωρίς
άλλες απαιτήσεις για το μέγεθος της απόκλισης. Το κριτήριο είναι ευαίσθητο για συστηματικό σφάλμα. Με
βάση αυτό το κριτήριο η αναλυτική διαδικασία μπορεί να απορριφθεί. Απαιτείται άμεσος έλεγχος της
βαθμονόμησης, καθώς και της υποστήριξης του οργάνου. Εφαρμόζονται ποικίλες παραλλαγές ορίων
ελέγχου: 7, 8, 9 ή 12 τιμές μιας και αυτής πλευράς της μέσης αριθμητικής, τα οποία διαθέτουν διαφορετική
ευαισθησία για τα συστηματικά σφάλματα.
305
Σχήμα 11.14 Κανόνας 10𝑥̅ : δέκα διαδοχικά αποτελέσματα ελέγχου βρίσκονται από τη μία πλευρά της 𝑥̅ .
11.3.6 Ο Εσωτερικός Ποιοτικός Έλεγχος της Ορθότητας (ακρίβειας) (Συσσωρευτικό Αθροιστικό

Διάγραμμα (Cusum chart, CUSUM)
Η χρήση της μεθόδου των συσσωρευτικών σφαλμάτων – CUSUM, (CUMmulative Sum) δίνει τη δυνατότητα
γρήγορης ανίχνευσης συστηματικών λαθών (ακόμη και μικρών), σε αντίθεση με το διάγραμμα Levey-
Jennings που ανιχνεύει τυχαία και συστηματικά σφάλματα (Westgard et al., 1977).
Οι καθημερινές διαφορές του υλικού ελέγχου από τη μέση τιμή της προηγούμενης περιόδου
αθροίζονται, καθώς διατηρείται το αλγεβρικό πρόσημο. Με άλλα λόγια, το συσσωρευτικό άθροισμα είναι η
τρέχουσα ολική τιμή που προκύπτει από το αλγεβρικό άθροισμα των τιμών, που λαμβάνονται από τη
διαφορά των καθημερινών τιμών προσδιορισμού του υλικού ελέγχου από τη μέση τιμή του. Προτείνεται το
όριο ελέγχου +2,7SD. Πάνω από αυτή τιμή θεωρείται ότι υπάρχει συστηματικό σφάλμα με βαθμό
σημαντικότητας υπολογίσιμο στατιστικά (Σχήμα 11.15).
Σχήμα 11.15 Διάγραμμα CUSUM.
306
Στο Πίνακα 11.1 δίνονται οι υπολογισμοί, απαραίτητοι για τη μέθοδο αυτή.
Ημέρα Ληφθείσα τιμή (xi) xi -𝑥̅ CUSUM
1 326 -14
2 349 9 -5
3 355 15 10
4 340 0 10
5 333 -7 3
6 340 0 3
7 353 13 16
8 335 -5 11
9 345 5 16
10 355 15 31
11 349 9 40
12 347 7 47
13 345 5 52
14 333 -7 45
15 327 -13 32
Πίνακας 11.1 CUSUM – έλεγχος των αποτελεσμάτων προσδιορισμού του ουρικού οξέος (ενδεικτικά αποτελέσματα
προηγούμενης περιόδου 𝑥̅ = 340 μmol/L, SD = 15,7 μmol/L).
Σχολιασμός:
Την 12η ημέρα τίθεται σε ενέργεια το CUSUM: το σωρευτικό άθροισμα των διαφορών (47,00 μmol/L) είναι
πάνω από το 2,7 SD (42,39 μmol/L) – είναι εμφανής η ύπαρξη συστηματικού σφάλματος, όταν στο ίδιο
χρονικό διάστημα η ληφθείσα τιμή - 347 μmol/L, εκτιμώμενη με το κλασικό χάρτη ελέγχου είναι «υπό
έλεγχο», γιατί βρίσκεται στο διάστημα 309 – 371 μmol/L (𝑥̅ + 2SD).
Στο Σχήμα 11.16, η απόκλιση από το στόχο απεικονίζεται γραφικά με τέτοιο τρόπο, ώστε κάθε
σημείο που σημειώνεται να αντιστοιχεί στο σύνολο όλων των αποκλίσεων από την τιμή στόχο. Στον
οριζόντιο άξονα καταγράφονται οι ημέρες, ενώ στον κάθετο το αθροιστικό ποσό της απόκλισης, π.χ. αν τα
καθημερινά αποτελέσματα ενός ορού ελέγχου για μια ουσία είναι x1, x2, x3 και 𝑥̅ η τιμή στόχος θα είναι C1 =
x1 – 𝑥̅ , C2 = C1 + (x2 –𝑥̅ ), C3 = C2 + (x3 – 𝑥̅ ).
307
Σχήμα 11.16 Διάγραμμα αθροιστικών συνόλων (CUSUM chart) με βάση τις τιμές του Πίνακα 11.1.
Με το διάγραμμα CUSUM (CUSUM chart) μεγιστοποιούνται οι τάσεις που δημιουργούνται από

τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από ανάλυση σε ανάλυση και γίνονται πολύ πιο εμφανείς οι αποκλίσεις
από τη τιμή στόχο. Με το διάγραμμα CUSUM ανιχνεύεται είτε μια εκτροπή, είτε μια μετατόπιση.
11.4 O Eξωτερικός Έλεγχος Ποιότητας
11.4.1 Ορισμός του Εξωτερικού ελέγχου Ποιότητας

O εξωτερικός ή διεργαστηριακός έλεγχος ποιότητας αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο παρακολούθησης
της επίδοσης του εργαστηρίου και ελέγχου της εγκυρότητας του συνολικού ποιοτικού συστήματος.
Εφαρμόζεται από ένα κεντρικό φορέα κρατικό ή ιδιωτικό επιτρέποντας την αντικειμενική εκτίμηση
της απόδοσης όλων των εργαστηρίων που συμμετέχουν στο πρόγραμμα με αποστολή των ίδιων δειγμάτων
έλεγχου στα ενδιαφερόμενα εργαστήρια, τα οποία προσδιορίζουν προκαθορισμένες εξετάσεις ή παραμέτρους
και αποστέλλουν τα αποτελέσματα πίσω στον φορέα.
11.4.2 Βασικοί στόχοι του Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας

Οι βασικοί στόχοι του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας είναι:
 ο έλεγχος της ακρίβειας των αποτελεσμάτων,
 η αναβάθμιση της εργασίας και της ποιότητας τον εργαστηρίων,
 η εξασφάλιση επαναληπτικότητας των αποτελεσμάτων,
 ο εκσυγχρονισμός και η ευθυγράμμιση με τα υπόλοιπα εργαστήρια και τα παγκόσμια πρότυπα.
Ο εξωτερικός έλεγχος ποιότητας είναι προαιρετικός, εφαρμόζεται ως προς ένα εξωτερικό πρότυπο
από έναν εξωτερικό φορέα και βασίζεται στα αποτελέσματα της ανάλυσης του ίδιου δείγματος σε τακτά
χρονικά διαστήματα από έναν μεγάλο αριθμό εργαστηρίων. Η σύγκριση και η σύγκλιση των επιδόσεων
μεταξύ των εργαστηρίων αποτελεί έναν από τους δύσκολους στόχους του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας.
Κατά κανόνα, ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος αφορά κυρίως την επαναληπτικότητα (τυχαία
σφάλματα), ενώ ο εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος σχετίζεται με την ακρίβεια (συστηματικά σφάλματα).
308
Ο εντοπισμός και η λήψη διορθωτικών μέτρων για την αποφυγή ή την εξάλειψη λαθών αποτελεί
καθημερινή απασχόληση του επιστημονικού προσωπικού των εργαστηρίων. Προς αυτή τη κατεύθυνση
συμβάλλουν συγκεκριμένα διεθνή πρότυπα (π.χ. ISO/IEC 15189: 2012).
11.4.3 Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA (Εξωτερικού Ελέγχου Ποιότητας Δια-

γνωστικών και Βιοαναλυτικών Εργαστηρίων
Στο ΤΕΙ Θεσσαλίας, με φορέα υλοποίησης το Ερευνητικό Εργαστήριο Ελέγχου Ποιότητας Υπηρεσιών
Υγείας, σχεδιάζονται, οργανώνονται και υλοποιούνται διεργαστηριακά προγράμματα για ιατρικά και
βιοαναλυτικά εργαστήρια, με την επωνυμία «Προγράμματα ELQA».
Τα Προγράμματα ELQA πραγματοποιούνται στο σύνολό τους διαδικτυακά, μέσω του
πληροφοριακού συστήματος τους, στην ηλεκτρονική διεύθυνση: http://elqa.teilar.gr. Τα προσφερόμενα
διεργαστηριακά προγράμματα είναι:
Α. Για τα ιατρικά εργαστήρια:

 Πρόγραμμα Κλινικής Βιοχημείας
 Πρόγραμμα Ανοσολογίας
 Πρόγραμμα Αιματολογίας
 Πρόγραμμα HbA1c
 Πρόγραμμα Πήξης
 Πρόγραμμα Καρδιακών Δεικτών
Β. Για τα βιοαναλυτικά εργαστήρια:

 Πρόγραμμα Φυσικοχημικών Παραμέτρων Ύδατος
 Πρόγραμμα Μικροβιολογικών Παραμέτρων Ύδατος
 Πρόγραμμα για Λύματα
Τα Διεργαστηριακά Σχήματα Ελέγχου Ικανότητας ELQA ικανοποιούν πλήρως τις απαιτήσεις του
ΕΛΟΤ ΕΝ ISO/IEC 17043:2011, παρέχοντας στα ενδιαφερόμενα εργαστήρια τις πληροφορίες που
αναφέρονται στο έγγραφο του ΕΣΥΔ ΠΔΙ/02/02/16-01-2014.
11.4.4 Αξιολόγηση των επιδόσεων των εργαστηρίων σε προγράμματα εξωτερικού ελέγ-

χου ποιότητας
Στα Διεργαστηριακά Προγράμματα ELQA, το ίδιο δείγμα ελέγχου διανέμεται στα συμμετέχοντα
εργαστήρια, τα οποία το αναλύουν ταυτόχρονα μέσα σε προκαθορισμένα χρονικά όρια. Στη συνέχεια, τα
εργαστήρια καταχωρούν τα αποτελέσματά τους στο/στα προγράμματα που συμμετέχουν. Τα αποτελέσματα
από τα συμμετέχοντα εργαστήρια υποβάλλονται ηλεκτρονικά σε κατάλληλες φόρμες μέσω του
πληροφοριακού συστήματος του προγράμματος.
Τα Προγράμματα ELQA - Διεργαστηριακά Σχήματα Ελέγχου Ικανότητας για Διαγνωστικά &
Βιοαναλυτικά Εργαστήρια αναλύουν τα αποτελέσματα των συμμετεχόντων εργαστηρίων σύμφωνα με τα
διεθνή πρότυπα (βλέπε ISO/IEC 13528:2005). Τα αποτελέσματα αναλύονται συνήθως μαζί (λαμβάνοντας
υπόψη τη διακύμανση της κάθε χρησιμοποιούμενης μεθόδου ανάλυσης), ώστε να υπολογιστεί η τιμή –
στόχος για κάθε ελεγχόμενη εξέταση – παράμετρο. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται από τα συμμετέχοντα
εργαστήρια αναλύονται από το εκάστοτε διεργαστηριακό πρόγραμμα το συντομότερο δυνατό, έτσι ώστε η
τελική έκθεση αξιολόγησης να μπορεί να κοινοποιηθεί στα συμμετέχοντα εργαστήρια, το αργότερο, μέσα σε
4 εβδομάδες από την ημερομηνία λήξης της προθεσμίας υποβολής των αποτελεσμάτων.
Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων πραγματοποιείται με τον υπολογισμό των SDI ή των z-scores, για
τα Διαγνωστικά και τα Βιοαναλυτικά Εργαστήρια, αντίστοιχα, τα οποία χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό
τυχόν ακραίων τιμών. Για την περαιτέρω βοήθεια της ερμηνείας των αποτελεσμάτων δίνονται συνοπτικά
στατιστικά στοιχεία και διαγράμματα.
309
Μετά την ολοκλήρωση του εκάστοτε διεργαστηριακού προγράμματος, συντάσσεται μία Έκθεση
Αξιολόγησης, που αξιολογεί τις επιδόσεις του κάθε εργαστηρίου, ανά ελεγχόμενη εξέταση – παράμετρο. Η
Έκθεση Επίδοσης συνήθως περιλαμβάνει τις ακόλουθες πληροφορίες:
 Εισαγωγή – γενικά στοιχεία
 Κύρια χαρακτηριστικά του προγράμματος
 Συγκεντρωτικό πίνακα με τις επιδόσεις του εργαστηρίου ανά ελεγχόμενη εξέταση - παράμετρο
 Αναλυτική στατιστική ανάλυση ανά εξέταση - παράμετρο, η οποία περιλαμβάνει περιγραφικά στατιστι-
κά στοιχεία και διαγράμματα
 Τα ακραία αποτελέσματα (ακραία αποτελέσματα είναι αυτά που κρίνονται ασυμβίβαστα σύμφωνα με
τις εκάστοτε τιμές – στόχους)
 Σχόλια και παρατηρήσεις των τεχνικών συμβούλων (σχετικά με τις πιθανές αιτίες εμφάνισης ακραίων
αποτελεσμάτων, επίδραση των μεθόδων ανάλυσης των δειγμάτων ελέγχου στην συνολική απόδοση,
κ.α.)
Δείγματα των εκθέσεων επίδοσης για διαγνωστικά και για βιοαναλυτικά Εργαστήρια υπάρχουν στην
ηλεκτρονική διεύθυνση: http://elqa.teilar.gr (αριστερό κάθετο menu > επιλογή «Εκθέσεις Επίδοσης
Εργαστηρίων».
Συνοπτικά, αξιολογείται η επίδοση των εργαστηρίων με υπολογισμό κατάλληλων παραμέτρων, όπως
των SDI ή των z-score, σύμφωνα με την εξίσωση:
z-score = (Xi – Median) / normIQR (Εξίσωση 7.15)
όπου:
Xi το αποτέλεσμα του εργαστηρίου,
Median η διάμεση τιμή και
normIQR το τυποποιημένο ενδοτεταρτημοριακό εύρος.
Τα αποτελέσματα των οποίων οι απόλυτες τιμές z-score που είναι μεγαλύτερες του 3 θεωρούνται μη
ικανοποιητικά. Αποτελέσματα με απόλυτες τιμές z-score μεταξύ 2 και 3 πρέπει να ελεγχθούν.
Στα Προγράμματα ELQA, η επίδοση των εργαστηρίων με βάση τις απόλυτες τιμές των z-score
κρίνεται ως ακολούθως:
 αν z-score ≤ 0,25 τότε η επίδοση είναι εξαιρετική,

 αν 0,25 < z-score ≤ 0,68 τότε η επίδοση είναι καλή,
 αν 0,68 < z-score ≤ 2,0 τότε η επίδοση είναι ικανοποιητική,
 αν 2,0 < z-score ≤ 3,0 τότε η επίδοση είναι ελεγχόμενη,
 αν z-score > 3,0 τότε η επίδοση είναι μη ικανοποιητική.
Για τις παραμέτρους με αποτελέσματα με απόλυτη τιμή z-score > 3 συνιστάται στα εργαστήρια να
πάρουν διορθωτικά μέτρα για τον προσδιορισμό τους, με βάση το σύστημα ποιότητάς τους.
11.4.5 Διαγράμματα
Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων – επιδόσεων των εργαστηρίων, εκτός από τα z-scores και τα συνοπτικά
στατιστικά στοιχεία, πραγματοποιείται και με τη βοήθεια διαγραμμάτων. Τα δύο διαγράμματα που
χρησιμοποιούνται πιο συχνά είναι το διάγραμμα τύπου Levey-Jennings των z-scores του εργαστηρίου και
όλων των εργαστηρίων, το ιστόγραμμα των z-scores σε διάταξη, το διάγραμμα Youden, κ.α.
Τα διαγράμματα αυτά βοηθούν τον συντονιστή και τους τεχνικούς συμβούλους του προγράμματος
στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων και είναι πολύ χρήσιμα για τα συμμετέχοντα εργαστήρια, τα οποία
μπορούν πολύ εύκολα να δουν αν έχουν ακραίες τιμές στα αποτελέσματά τους και αν διαφέρουν τα
αποτελέσματά τους από τα αποτελέσματα των άλλων εργαστηρίων.
Α. Το ιστόγραμμα Κατανομής Συχνοτήτων
310
Το ιστόγραμμα κατανομής συχνοτήτων (Σχήμα 11.17) αποτελεί την απεικόνιση των τιμών όλων των
εργαστηρίων και δημιουργείται από ένα κάθετο άξονα στον οποίο περιέχεται ο αριθμός των συμμετεχόντων
εργαστηρίων και ένα οριζόντιο άξονα στον οποίο περιέχονται ομάδες συγγενών τιμών και τα όρια ελέγχου
(μέση τιμή ± 2SD). Το ύψος κάθε στήλης αντιπροσωπεύει τη συχνότητα με την οποία εμφανίζονται οι τιμές
κάθε ομάδας. Η τιμή που αντιστοιχεί στη κορυφή είναι η μέση τιμή όλων των εργαστηρίων, αυτή αντιστοιχεί
με τη τιμή στόχο και εκφράζει τη μέγιστη ακρίβεια.
Σχήμα 11.17 Ιστόγραμμα κατανομής συχνοτήτων.
Στη περίπτωση που τα δεδομένα για τα εργαστήρια ομαδοποιούνται με βάση την αναλυτική
μεθοδολογία και το είδος του αναλυτή, μπορεί στο ίδιο ιστόγραμμα να αναπαρασταθούν δύο ή περισσότερες
διαφορετικές κατανομές με διαφορετική μέση τιμή και εύρος τιμών.
Β. Ραβδόγραμμα Z-score σε διάταξη
Στο διάγραμμα αυτό παρουσιάζεται το z-score κάθε εργαστηρίου με μπάρες κατά σειρά μεγέθους (Σχήμα
11.18). Από αυτό, κάθε εργαστήριο μπορεί εύκολα να συγκρίνει τις επιδόσεις του σε σχέση με τα άλλα
εργαστήρια.
311
Σχήμα 11.18 Ραβδόγραμμα Z-score.
Το διάγραμμα αυτό έχει όρια – γραμμές (επάνω και κάτω) στις τιμές ±3, έτσι ώστε οι ακραίες τιμές
να είναι αναγνωρίσιμες με σαφήνεια (τα εργαστήρια των οποίων η μπάρα επεκτείνεται πέρα από τις cut-off
γραμμές). Τα πλεονεκτήματα αυτών των διαγραμμάτων είναι ότι μέσω αυτών για κάθε εργαστήριο
προσδιορίζονται με σαφήνεια οι ακραίες τιμές του.
Γ. Διάγραμμα Youden
Στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούνται δύο δείγματα ελέγχου διαφορετικών συγκεντρώσεων υπολογίζονται
δύο τιμές SDI, μία για κάθε δείγμα ελέγχου (Youden, 1959). Η απεικόνιση των δύο τιμών SDI δίνεται με το
διάγραμμα Youden. Αυτό χρησιμοποιεί τη γραφική αναπαράσταση των δύο διαφορετικών δειγμάτων
ελέγχου για να απεικονίσει την ακρίβεια και την επαναληπτικότητα.
Το διάγραμμα Υouden είναι ένα τετράγωνο διάγραμμα του οποίου οι τέσσερις πλευρές περιέχουν
ανά δύο τα όρια τιμών -4 SDΙ έως +4 SDΙ για κάθε ένα από τα δύο δείγματα ελέγχου (Σχήμα 11.19). Η τιμή
κάθε εργαστηρίου συμβολίζεται με μία κουκίδα (σημείo). Οι κουκίδες στο κέντρο αντιστοιχούν στα
εργαστήρια με την μεγαλύτερη δυνατή ακρίβεια. Οι κουκίδες που βρίσκονται συγκεντρωμένες σε κάθε μία
από τις δύο διαγώνιους του τετραγώνου αντιστοιχούν σε εργαστήρια με την καλύτερη μεταξύ τους
αναπαραγωγιμότητα.
Σχήμα 11.19 Διάγραμμα Υouden.
Ως οδηγός για την ερμηνεία των διαγραμμάτων Youden:

 σημεία (τελείες) που βρίσκονται κοντά στην διαγώνιο (45ο) και μέσα στο τετράγωνο με όρια ±2SD δεί-
χνουν αποδεκτά αποτελέσματα,
 σημεία (τελείες) που βρίσκονται κοντά στην διαγώνιο (45ο), αλλά έξω από το τετράγωνο με όρια ±2SD
δείχνουν συστηματικό σφάλμα,
 σημεία που βρίσκονται μακριά από τη διαγώνιο (45ο) δείχνουν τυχαίο σφάλμα.
312
313
 Σχήμα 11.9 https://www.westgard.com (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
Aναφορές
1. ΓΑΛΑΝΗΣ, Π. (2009) Πολυμεταβλητή ανάλυση επιδημιολογικών δεδομένων. Αρχεία Ελληνικής Ιατρι-
κής, 26(3), p. 407-22.
2. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2007) Τα διαγράμματα ελέγχου στο εξωτερικό έλεγχο ποιότητας. Ιατρική επιθεώ-
ρηση ΙΚΑ, 11(7), p. 35-41.
3. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ, Π. (2007) Εφαρμογή της μεθόδου Delta Check σε διάφορους τύπους αναλυτών. Δελ-
τίο Ελληνικής Μικροβιολογικής Εταιρείας, 52(4), p. 206-16.
4. ΠΑΠΑΪΩΑΝΝΟΥ, Α. & ΠΛΑΓΕΡΑΣ, Π. (2012) Εξειδικευμένα Θέματα Κλινικής Χημείας. Αθήνα: Εκδό-
σεις Π.Χ. Πασχαλίδης.
5. YOUDEN, W. (1959) Graphical diagnosis of interlaboratory test results. Industrial Quality Control, 1,
239-50.
6. KLAUS, D. & LLOYD, C. (1998) Guidelines for calibration in analytical chemistry. Pure & Appl Chem,
70(4), p. 893-1014.
7. KANAGASABAPATHY, Α. & KUMARI, S. (2000) Guidelines on Standard Operating Procedures for
Clinical Chemistry. New Delhi: WHO.
8. KARKALOUSOS, P. & EVANGELOPOULOS, A. (2011) Quality control in clinical laboratories. In:
Applications and Experiences of Quality Control. Zagreb: Intech Books.
9. KARKALOUSOS, P. (2007) The schemes of External quality control in laboratory medicine in Balkans.
Journal of Medical Biochemistry, 26(3), p. 245-47.
10. SHEWHART, W. (1931) Economic control of quality of manufactured product. New York: Van Nos-
trand-Reinhold.
11. SYNDERMAN, W. (1992) The history of proficiency testing/quality control. Clin Chem, 38(7), p. 1205-
9.
12. WESTGARD, J., GROTH, T., ARONSON, T. DE VERDIER, C. (1977) A multirule Shewhart chart for
quality control in clinical chemistry. Clin Chem, 23(10), p. 1881-7.
13. WESTGARD, J., GROTH, T., HAINLINE, A. (1981) A multirule Shewhart chart for quality control in
clinical chemistry. Clin Chem, 27(3), p. 493-501.
14. https://www.westgard.com (τελευταία προσπέλαση 1/4/2015).
314
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 12o
Η ΑΤΟΜΙΚΗ ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ
ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο αυτό θα περιγραφούν οι βασικές ιδιότητες των ιχνοστοιχείων και θα εκτεθεί η αναγκαιότητα
του ποσοτικού προσδιορισμού τους σε βιολογικά υγρά. Πιο συγκεκριμένα θα παρουσιαστεί η ατομική
απορρόφηση ως μέθοδος αναφοράς με τις σημαντικότερες τεχνικές: την φλόγα ακετυλενίου - αέρα και τον
φούρνο γραφίτη. Ειδικότερα θα περιγραφούν η θεωρητική αρχή της μεθόδου, τα μέρη και ο τρόπος
λειτουργίας και των δύο τύπων των φασματοφωτομέτρων ατομικής απορρόφησης. Θα αναπτυχθεί η
προαναλυτική και η αναλυτική διαδικασία και θα δοθούν στοιχεία για την ευαισθησία και την ακρίβεια των
μεθόδων αυτών. Ακόμη, θα αναλυθεί ο τρόπος υπολογισμού των αποτελεσμάτων με παραδείγματα και θα
δοθούν στοιχεία για τις τιμές αναφοράς. Τέλος, θα παρουσιαστούν οι απαραίτητες προδιαγραφές ασφαλούς
εγκατάστασης αερίων για τη λειτουργία των φασματοφωτομέτρων ατομικής απορρόφησης.
Σε ότι αφορά το παρόν βιβλίο θα απαιτηθούν γνώσεις που αφορούν το Κεφάλαιο 1 (φωτομετρία) και το
Κεφάλαιο 11 (έλεγχος ποιότητας). Χρήσιμες θα είναι και οι βασικές γνώσεις ανόργανης χημείας.
12.1.1 Τα Χημικά Στοιχεία του ανθρώπινου οργανισμού
Μέχρι σήμερα έχουν απομονωθεί 81 στοιχεία στους ζωντανούς οργανισμούς από τα 92 συνολικά που
φυσιολογικά συναντώνται στην επιφάνεια της γης. Από αυτά τα πέντε θεωρούνται βασικά δομικά υλικά.
Αυτά είναι το άζωτο (Ν), το υδρογόνο (Η), ο άνθρακας (C), το οξυγόνο (O) και το θείο (S). Όλα αυτά μαζί
με άλλα έξι όπως το κάλιο (K), το νάτριο (Na), το χλώριο (Cl), το ασβέστιο (Ca), το μαγνήσιο (Mg) και τον
φώσφορο (P) αποτελούν το 99% της σύνθεσης των ζωντανών οργανισμών, κρατώντας σημαντικό ρόλο στην
κυτταρική λειτουργία. Η συγκέντρωση τους στα βιολογικά υγρά προσδιορίζεται σε μονάδες g/L
επιτρέποντας έτσι τον ακριβή προσδιορισμό τους. Πολλά όμως από τα υπόλοιπα στοιχεία όπως το σελήνιο
(Se), ο ψευδάργυρος (Zn), το κοβάλτιο (Co), το μαγγάνιο (Mn) και το χρώμιο (Cr) υπάρχουν στον
ανθρώπινο οργανισμό σε πολύ μικρές ποσότητες οι οποίες προσδιορίζονται σε μονάδες μg/L, ng/L κ.α.
Επειδή στο παρελθόν δεν υπήρχε κατάλληλη μέθοδος για τον προσδιορισμό τόσο χαμηλών συγκεντρώσεων
θεωρούσαμε ότι «συναντώνται σε ίχνη», οπότε και επικράτησε ο όρος ιχνοστοιχεία (Iyengar, 1997).
12.1.2 H προέλευση των Ιχνοστοιχείων
Η αρχική προέλευση των ιχνοστοιχείων ανάγεται στην παρουσία τους στα πετρώματα του φλοιού της γης,
απ’ όπου περνούν στη διατροφική αλυσίδα του ανθρώπου. Η δράση των ηφαιστείων, η διαβρωτική
ικανότητα του νερού και, κυρίως η επίδραση του ανθρώπου στη φύση, έχουν προκαλέσει ανακατανομή των
ιχνοστοιχείων, έτσι ώστε όλα να συναντώνται σχεδόν παντού. Σε αυτό συνετέλεσε και η ανάπτυξη της
χημικής βιομηχανίας, η ρύπανση του περιβάλλοντος, η χρήση λιπασμάτων, το διεθνές εμπόριο τροφίμων, και
οι αλλαγές στις διατροφικές συνήθειες των λαών. Τα μέταλλα, σε αντίθεση με τις περισσότερες τοξικές
οργανικές ενώσεις, δεν αποικοδομούνται, αλλά συσσωρεύονται στο έδαφος, τα νερά και τους βιολογικούς
ιστούς. Σήμερα τα ιχνοστοιχεία μετρώνται τακτικά σε άτομα, που εκτίθενται σε αυτά μέσω της εργασίας
τους (π.χ. εργάτες βιομηχανίας, μεταλλουργίας) και γι’αυτό οι μέθοδοι ανάλυσης που θα περιγραφούν σε
αυτό το κεφάλαιο αφορούν κυρίως βιολογικά δείγματα επαγγελματικά εκτεθειμένων ατόμων. Μετρώνται
όμως και σε παιδιατρικά δείγματα (π.χ. για την διάγνωση μεταβολικών νοσημάτων π.χ. νόσο Wilson) αλλά
315
και σε ενήλικες για δερματολογικές (Cr, Ni), νεφρολογικές παθήσεις (π.χ. Al) κ.α. (WHO, 2003· Tietz,
1995).
12.1.3 Ο ρόλος των Ιχνοστοιχείων
Ο ανθρώπινος οργανισμός χρειάζεται καθημερινά ιχνοστοιχεία για την πέψη, την αναπνοή, τον μεταβολισμό,
την αποτοξίνωση, την αποκατάσταση βλαβών και μεταλλάξεων όπως τα: Fe, Cu, Co, Zn, Se κ.α. Τα
ιχνοστοιχεία που έχουν αναγνωρισμένο βιολογικό ρόλο, είναι απαραίτητα για τη φυσιολογική λειτουργία του
οργανισμού, και η έλλειψη τους προκαλεί νόσο και ορίζονται με τον Aγγλικό όρο «essential», δηλαδή
«απαραίτητα» (Iyengar, 1997). Για τα ιχνοστοιχεία αυτά υπάρχουν στον ανθρώπινο οργανισμό διάφοροι
μεταβολικοί δρόμοι για την συντήρηση των απαραίτητων αποθεμάτων (Πίνακας 12.1).
Κατηγορία ιχνοστοιχείων Παραδείγματα και δράση στον οργανισμό

Μεταλλοένζυμα Σταθεροποιούν τη στερεοχημική δομή της αποπρωτεϊνης των ενζύμων.
Ενεργοποιητές ενζύμων Διευκολύνουν την αναγνώριση του κατάλληλου υποστρώματος, την ένωση
υποστρώματος – ενεργού κέντρου, και τη χημική μετατροπή. Η έλλειψή τους οδηγεί
στην απώλεια της ενζυμικής δράσης.
Άλλες φυσιολογικές Π.χ. Fe στην αιμοσφαιρίνη, Ι2 στο θυρεοειδή και Co στη βιταμίνη B12.
λειτουργίες
Φάρμακα Π.χ. λίθιο (Li), χρυσός (Au) και πλατίνα (Pt).
Βαρέα μέταλλα Π.χ. μόλυβδος (Pb), υδράργυρος (Hg), κάδμιο (Cd), αλουμίνιο (Al) και αρσενικό (As).
Πίνακας 12.1 Δράσεις των ιχνοστοιχείων στον ανθρώπινο οργανισμό
12.2 Η δράση των τοξικών Ιχνοστοιχείων

Τα τοξικά μέταλλα (Πίνακες 12.1, 12.2) δεν μπορούν να εκπληρώσουν τον ίδιο ρόλο, όπως τα διατροφικά
μεταλλικά στοιχεία. Ως εκ τούτου, η παρουσία τους αποδιοργανώνει την ενζυμική δραστηριότητα (Agency
for toxic substances, 2008). Τα βαρέα μέταλλα διαταράσσουν το μεταβολισμό με δύο κύριους τρόπους:
 συσσωρεύονται και διαταράσσουν τη λειτουργία ζωτικών οργάνων, όπως τη καρδιά, τον εγκέφαλο, τα
νεφρά, τα οστά και το ήπαρ, κ.λπ.,
 εκτοπίζουν ζωτικής σημασίας ιχνοστοιχεία από ενεργές θέσεις.
Η περίσσεια των τοξικών μετάλλων συγκεντρώνεται αθροιστικά σε διάφορους ιστούς, αν και
υπάρχει επιλεκτική προτίμηση σε ορισμένα όργανα (Πίνακας 12.2).
Όργανο Μέταλλο
Εγκέφαλος Μόλυβδος, υδράργυρος, μαγγάνιο, αλουμίνιο
Θυρεοειδής Κοβάλτιο, ιώδιο, σελήνιο
Καρδιά Ασβέστιο, μαγνήσιο, νικέλιο
Αναπνευστικές Οδοί Αρσενικό, κάδμιο, νικέλιο, χρώμιο
Ήπαρ Σελήνιο, νικέλιο, χρώμιο, αρσενικό
Νεφροί Υδράργυρος, κάδμιο, αρσενικό
Λίπος Κάδμιο
Οστά Κάδμιο, μόλυβδος, υδράργυρος
Πίνακας 12.2 Περιοχές παρουσίας τοξικών μετάλλων στον ανθρώπινο οργανισμό.
Στο σύγχρονο αστικό και βιομηχανικό περιβάλλον συναντάται σημαντική διασπορά τοξικών
ιχνοστοιχείων. Το σύνολο της έκθεσης αυτής ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ ανθρώπου και
περιβάλλοντος καθώς και η βιολογική τους διακύμανση καθορίζουν τα όρια της συνήθους συγκέντρωσης
των ιχνοστοιχείων στο γενικό πληθυσμό (Πίνακας 12.3). Θα πρέπει να τονιστεί ότι επειδή τα τοξικά μέταλλα
δεν έχουν βιολογικό ρόλο και η έλλειψη τους δεν προκαλεί νόσο, τα όρια των συγκεντρώσεων τους στα
316
βιολογικά υγρά στον γενικό πληθυσμό δεν μπορούν να χαρακτηρίζονται ως «φυσιολογικές τιμές».
Σωστότερος είναι ο όρος «όρια αναφοράς» που υπολογίζονται στατιστικά σε υγιή, μη επαγγελματικά
εκτεθειμένα άτομα (ACGIH, 1996).
Όρια αναφοράς
Μέταλλο Άνδρες Γυναίκες
Pb
Ολικό αίμα 106 μg/L 60 μg/L
Cd - Ολικό αίμα
Μη καπνιστές 0,8 μg/L 0,9 μg/L
Καπνιστές 1.6 μg/L 1,4 μg/L
Cr
Ολικό αίμα (Cr III+VI) 0,7 - 28 μg/L 0,7 - 28 μg/L
Ορός αίματος (Cr III) 0,05 - 0,5 μg/L 0,05 -0,5 μg/L
Ούρα 24 h 0,1 - 2 μg/L 0,1 - 2 μg/L
Ni
Ορός αίματος 0,1 - 1 μg/L 0,1 - 1 μg/L
Ούρα 0,1 - 1 μg/L 0,1 - 1 μg/L
As
Ούρα 50 - 500 μg/L 50 - 500 μg/L
Χρόνια δηλητηρίαση 50 - 5.000 μg/L 50 - 5.000 μg/L
Οξεία δηλητηρίαση 1.000-20.000 μg/L 1.000 -20.000 μg/L
Hg
Ολικό αίμα 6 - 60 μg/L 6 - 60 μg/L
Ούρα 24 h < 20 μg/L < 20 μg/L
Πίνακας 12.3 Όρια αναφοράς σημαντικών τοξικών ιχνοστοιχείων σε βιολογικά υγρά.
Στην επαγγελματική έκθεση ως δείκτης ασφαλούς έκθεσης χρησιμοποιείται η «οριακή τιμή

έκθεσης» και για την εκτίμηση της νόσου συνυπολογίζονται και άλλοι βιοχημικοί δείκτες.
12.3 Μέθοδοι προσδιορισμού Ιχνοστοιχείων

Ορισμένα μέταλλα, όπως ο σίδηρος και ο χαλκός σχηματίζουν έγχρωμα σύμπλοκα και έτσι είναι εφικτός ο
χρωματομετρικός προσδιορισμός τους (Κεφάλαιο 1). Τα περισσότερα ιχνοστοιχεία όμως δεν έχουν αυτή τη
δυνατότητα και επιπλέον βρίσκονται στα βιολογικά υγρά σε συγκεντρώσεις περίπου 6 φορές χαμηλότερες
από αυτές των άλλων δεικτών της κλινικής χημείας (π.χ. γλυκόζη, ουρία, ηλεκτρολύτες). Η ανάγκη
προσδιορισμού συνεχώς χαμηλότερων τιμών συγκεντρώσεων των ιχνοστοιχείων απαιτεί αναλυτικές
μεθόδους υψηλής ευαισθησίας με χαμηλά όρια ανίχνευσης (Georgiou et al., 1994).
Μια από τις πιο αξιόπιστες μεθόδους που χρησιμοποιούνται σήµερα είναι η φασματοσκοπία
ατοµικής απορρόφησης (Atomic Absorption Spectroscopy). Στα πλεονεκτήματα της, περιλαμβάνονται η
ταχύτητα, η καλή επαναληψιμότητα και η δυνατότητα αυτοματοποίησης. Μειονέκτημα της είναι η αδυναµία
ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών ιχνοστοιχείων ταυτόχρονα. Το πρόβλημα αυτό προσπάθησε να
επιλύσει μια άλλη τεχνική η φασματομετρία μάζας με επαγωγικά συζευγμένο πλάσμα (ICP-MS) στην
οποία όμως, τα όρια ανίχνευσης δεν είναι τόσο χαμηλά, ώστε να μπορεί να εφαρμοστεί σε βιολογικά
δείγματα.
12.4 Δειγματοληψία
Για τον προσδιορισμό των ιχνοστοιχείων απαιτείται συνήθως αίμα ή ούρα. Για το μόλυβδο, το κάδμιο, το
αρσενικό και τον υδράργυρο, τα οποία βρίσκονται μέσα στα ερυθρά αιμοσφαίρια, απαιτείται η λήψη ολικού
αίματος με αντιπηκτικό EDTA (σωληνάριο γενικής αίματος), ενώ για τα υπόλοιπα ιχνοστοιχεία απαιτείται
ορός αίματος.
Ο χρόνος της δειγματοληψίας και η λήψη τροφής δεν επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης.
Συνήθως για να έχουμε ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό μιας ουσίας στα ούρα χρειάζεται να προηγηθεί
συλλογή ούρων 24 ώρου. Αντίθετα, στις αναλύσεις ιχνοστοιχείων στα ούρα αυτό δεν είναι απαραίτητο, διότι
317
ο ρυθμός αποβολής τους είναι σταθερός. Έτσι, αρκεί ένα μέρος των ούρων από τα πρώτα πρωινά ούρα, τα
οποία συλλέγονται σε καθαρό ουροσυλλέκτη. Εναλλακτικά μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε οποιοδήποτε
τυχαίο δείγμα ούρων. Όμως σε αυτή την περίπτωση χρησιμοποιούμε την τιμή της κρεατινίνης του τυχαίου
δείγματος ως δείκτη πυκνότητας των ούρων, και το αποτέλεσμα εκφράζεται ανά γραμμάριο κρεατινίνης. Π.χ.
έστω ότι η τιμή νικελίου στα ούρα είναι 1,8 μg/L και η τιμή κρεατινίνης 0,9 g/L. Διαιρούμε 1,8/9 = 0,2,
απλοποιούμε τις μονάδες του κλάσματος και το αποτέλεσμα εκφράζεται σε μg Νικελίου/γραμμάριο
κρεατινίνης.
Η συντήρηση και η μεταφορά των δειγμάτων γίνεται με πωματισμένα σωληνάρια, σε ψύξη 2 - 8οC.
Τα δείγματα είναι σταθερά για 5 - 7 μέρες, ενώ η φύλαξή τους για μεγαλύτερο διάστημα απαιτεί κατάψυξη (-
18οC).
Ο σημαντικότερος παράγοντας λάθους κατά τη δειγματοληψία είναι η πιθανή επιμόλυνση των
δειγμάτων, ιδιαίτερα αν η λήψη γίνεται μέσα στο χώρο εργασίας. Για το λόγο αυτό δίνεται ιδιαίτερη προσοχή
στον καλό καθαρισμό του δέρματος πριν την φλεβοκέντηση, και στη χρήση κλειστού συστήματος
αιμοληψίας με πωματισμένα ειδικά σωληνάρια.
Τα περισσότερα μέταλλα είναι δυνατόν να προσδιοριστούν και σε πιο σπάνια δείγματα όπως μαλλιά,
νύχια, οστά και παρασκευάσματα βιοψιών. Οι αναλύσεις τριχών και νυχιών αποκαλύπτουν την συνολική
έκθεση στην πάροδο του χρόνου ή προηγούμενες εκθέσεις, αλλά δεν δείχνουν τις πρόσφατες εκθέσεις. Οι
συγκεντρώσεις των ιχνοστοιχείων στο αίμα και στα ούρα αντικατοπτρίζουν τόσο χρόνιες εκθέσεις αλλά και
εκείνες που προέκυψαν τις τελευταίες μέρες.
Τα δείγματα προσδιορισμού ιχνοστοιχείων απαιτούν ιδιαίτερη κατεργασία (βλ. παρακάτω) και
προσοχή στη συλλογή τους. Μερικά δείγματα συλλέγονται δύσκολα, ενώ πολλές φορές υπάρχει ο κίνδυνος
επιμόλυνσης. Η επιμόλυνση καθιστά πολλά δείγματα ακατάλληλα για τη διάγνωση των επαγγελματικών
παθήσεων (Georgiou et al., 1991· Tietz, 1995).
12.4.1 Επεξεργασία Δειγμάτων
Σε πολλές περιπτώσεις απαιτείται η αραίωση των δειγμάτων, έτσι ώστε να μειωθούν πιθανές παρεμβολές
κατά την ανάλυση. Π.χ. για τον προσδιορισμό κάποιων μετάλλων (όπως χρώμιο, νικέλιο) στον ορό του
αίματος, απαιτείται αραίωση του δείγματος με απεσταγμένο νερό, ενώ για τον προσδιορισμό άλλων
μετάλλων που βρίσκονται μέσα στα ερυθρά αιμοσφαίρια (π.χ. μόλυβδος, κάδμιο), απαιτείται η αραίωση του
με χηλικούς παράγοντες (Triton X-100). Οι χημικοί παράγοντες καταστρέφουν τις μεμβράνες των
αιμοσφαιρίων και απελευθερώνουν τα βαρέα μέταλλα από αυτά. Για την αύξηση της αναλυτικής
ευαισθησίας εφαρμόζεται επίσης η χημική μετατροπή του υποστρώματος χρησιμοποιώντας ειδικό διάλυμα
(modificator), διαφορετικό για κάθε δείγμα και μέταλλο. Ιδιαίτερη κατεργασία των δειγμάτων προς
σχηματισμό υδριδίων απαιτείται για τον προσδιορισμό του υδραργύρου και του αρσενικού (Πίνακας 12.4).
Μέταλλο Δείγμα/ Αραίωση Υλικό Αραίωσης & Modificator Τύπος Ατοµοποιητή

Μόλυβδος & Κάδμιο Ολικό αίμα 1/20 Triton X-100 & Φούρνος γραφίτη
NH4H2PO4
Αρσενικό & Υδράργυρος Ολικό αίμα 1/3 Triton X-100 & Φούρνος γραφίτη
Ni(NO3)2 6H2O
Γεννήτρια Υδριδίων
Χαλκός & Ψευδάργυρος Ορός αίματος 1/10 Υπερκαθαρό νερό Φλόγα
Ούρα 1/1 & K3PO4, NH4NO3 Φλόγα
Χρώμιο & Νικέλιο Ορός αίματος 1/10 Υπερκαθαρό νερό Φούρνος γραφίτη
Αλουμίνιο Ορός αίματος Mg(NO3)26H2Ο & Ca(NO3)24H2Ο Φούρνος γραφίτη
Πίνακας 12.4 Προαναλυτική κατεργασία δειγμάτων για τον προσδιορισμό ιχνοστοιχείων σε βιολογικά υγρά με τεχνικές
ατομικής απορρόφησης.
Αν στις ήδη πολύ μικρές, συγκεντρώσεις των ιχνοστοιχείων στα βιολογικά δείγματα, προστεθούν
και οι μικροποσότητες ιχνοστοιχείων από τα χρησιμοποιούμενα υλικά της ανάλυσης (π.χ. σωληνάρια ρύγχη
πιπετών, νερό και αραιωτικά διαλύματα), η ακρίβεια των αναλύσεων και η ορθότητα των αποτελεσμάτων θα
μεταβληθεί δραματικά. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται επιμόλυνση. Μόνο τα εργαστήρια που διαθέτουν
318
υψηλή καθαρότητα (Class 100, κατά τα διεθνή πρότυπα) μπορούν να εξασφαλίσουν τον έλεγχο της
επιμόλυνσης σε ικανοποιητικό βαθμό. Για τον λόγο αυτό συνιστάται η τοποθέτηση συστημάτων καθαρισμού
του ατμοσφαιρικού αέρα του εργαστηρίου, η χρήση χημικώς καθαρών αντιδραστηρίων (HPLC grade),
υπερκαθαρού νερού (< 18 μΩ) και το σχολαστικό πλύσιμο όλων των χρησιμοποιούμενων εργαστηριακών
σκευών (Georgiou, 1992).
12.5 H αρχή λειτουργίας Φασματοσκοπίας Ατοµικής Απορρόφησης

Τα άτομα κάθε μετάλλου έχουν ένα κεντρικό πυρήνα και ένα αριθμό ηλεκτρονίων γύρω από αυτόν
κατανεμημένα σε στοιβάδες. Η πιo σταθερή κατάσταση των ατόμων είναι αυτή για την οποία απαιτείται η
μικρότερη δυνατή ενέργεια και ονομάζεται βασική κατάσταση. Αν σε κάποιο άτομο προσπέσει εξωτερική
ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος (το οποίο θα είναι διαφορετικό για το κάθε μέταλλο), τότε τα
ηλεκτρόνια της εξωτερικής του στοιβάδας θα μετακινηθούν σε ανώτερες ενεργειακά στοιβάδες
απορροφώντας την προσπίπτουσα ενέργεια. Η ποσότητα ενέργειας που απαιτείται για την μετάβαση αυτή,
είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του μετάλλου (Pecsok et al., 1980).
Η νέα αυτή κατάσταση των ατόμων ονομάζεται διεγερμένη κατάσταση και είναι εξαιρετικά
ασταθής. Τα άτομα τείνουν να αποβάλλουν την ενέργεια που απορρόφησαν για να επανέλθουν στη βασική
τους κατάσταση (Σχήμα 12.1).
Σχήμα 12.1 Οι ενεργειακές μεταβολές των ατόμων. Όπου ΔΕ η ενέργεια που απορροφάται, Ε 1 η ενέργεια των
ηλεκτρονίων στη βασική κατάσταση, Ε2 η ενέργεια των ηλεκτρονίων στην διεγερμένη κατάσταση, h η σταθερά Max
Planck, ν η συχνότητα του φωτός, e- το ηλεκτρόνιο.
Επειδή τα ιχνοστοιχεία στα βιολογικά υγρά βρίσκονται ενωμένα με πρωτεΐνες, προκειμένου να τα

απελευθερώσουμε καταφεύγουμε στην καύση της οργανικής ύλης (πυρόλυση). Κατόπιν με τη βοήθεια
επιπλέον θερμικής ενέργειας τα μόρια του μετάλλου μετατρέπονται σε άτομα (ατομοποίηση), τα οποία
απορροφούν την προσπίπτουσα ειδική ακτινοβολία και ανεβαίνουν σε ανώτερη ενεργειακή στοιβάδα. Ο
προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ιχνοστοιχείων γίνεται με την μέτρηση της ακτινοβολίας που
απορροφήθηκε, σύμφωνα με το νόμο Lambert-Beer (βλ. Ενότητα 1.1, Εξίσωση 1.1) με μικρή τροποποίηση:
Α = -log10(I0/I) = k  L  C (Εξίσωση 12.1)
όπου:
Io η ένταση της αρχικής ακτινοβολίας (μετράται στην έξοδο της ειδικής λάμπας),
I η ένταση της τελικής ακτινοβολίας (μετράται στον φωτοπολλαπλασιαστή),
K ο συντελεστής απορρόφησης,
L το μήκος της πορείας διέλευσης της ακτίνας του φωτός από τον ατοµοποιητή,
C η συγκέντρωση του υπό ανάλυση μετάλλου.
12.6 Τα βασικά τμήματα των συστημάτων Ατομοποίησης

Η φασματοσκοπία ατοµικής απορρόφησης είναι ακόµα και σήμερα η περισσότερο ευρέως
χρησιμοποιούμενη τεχνική για τον προσδιορισµό των ιχνοστοιχείων και αποτελεί τη μέθοδο αναφοράς. Τα
319
όρια ανίχνευσης στην AAS εξαρτώνται από τον τύπο του χρησιμοποιούμενου ατοµοποιητή και το χηµικό
υπόβαθρο του δείγματος.
Υπάρχουν δύο βασικές μεθοδολογίες που χρησιμοποιούνται στην ατομική απορρόφηση, οι οποίες
βασίζονται στην διαφορετική τεχνική ατομοποίησης, ο φούρνος γραφίτη και η φλόγα. Οι δύο μέθοδοι
μπορούν να καλύψουν ένα μεγάλο εύρος μέτρησης, ξεκινώντας από συγκεντρώσεις μικρότερες του 1 ng/L
για το φούρνο γραφίτη μέχρι δεκάδων mg/L για τη φλόγα.
12.6.1 Οι πηγές Ακτινοβολίας για την Ατομική Απορρόφηση

Η απαραίτητη ειδική ακτινοβολία µπορεί να παραχθεί είτε από λυχνίες κοίλης καθόδου (Hollow Cathod
Lamp ή HCl), είτε από λυχνίες εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια (Electrodeless Lamp ή EDL).
Στις λυχνίες κοίλης καθόδου τα θετικά φορτισμένα ιόντα του αδρανούς αερίου, που βρίσκεται στο
εσωτερικό της λάμπας, βομβαρδίζουν το ηλεκτρόδιο καθόδου. (Σχήμα 12.2) Τότε αποσπώνται από αυτό
άτομα ίδια με το στοιχείο που πρόκειται να αναλυθεί. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα την εκπομπή
ακτινοβολίας συγκεκριμένης συχνότητας. Η ενέργεια της ακτινοβολίας ισούνται με ΔΕ = hv.
Σχήμα 12.2 Λυχνία κοίλης καθόδου (Pecsok et al., 1980).
Οι λυχνίες εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια αποτελούνται από ένα µικρό σφραγισμένο σωλήνα από
χαλαζία, που περιέχει το προς ανάλυση μέταλλο ή άλας αυτού και αδρανές αέριο αργό (Ar) σε χαμηλή πίεση
μερικών mm Hg. Ο σωλήνας περιβάλλεται από ένα σπείραµα συνδεδεμένο µε γεννήτρια ραδιοσυχνοτήτων
για τον ιονισµό του Ar. Τα ιόντα του αερίου συγκρούονται µε το μέταλλο και αποσπούν τα άτοµά του, που
στη συνέχεια εκπέμπουν ακτινοβολία χαρακτηριστικού µήκους κύµατος. Κάθε αναλυτής έχει 4 – 8 λυχνίες
εκκένωσης χωρίς ηλεκτρόδια (Φωτογραφία 12.1) που έχουν τη δυνατότητα να παράγουν φάσµα
μεγαλύτερης έντασης και ευαισθησίας απ’ ό, τι οι λυχνίες κοίλης καθόδου. Χρησιμοποιούνται κυρίως για τον
προσδιορισµό πτητικών στοιχείων όπως: As, Se, Te, Sn, Pb, Hg, κ.α. Οι λυχνίες επιλέγονται αυτόματα και
υπάρχει η δυνατότητα αυτόματης προθέρμανσης της επόμενης λυχνίας για οικονομία χρόνου και αυξημένη
αναλυτική αξιοπιστία, καθώς και δυνατότητα αυτόματου σβησίματος αυτών στο τέλος της ανάλυσης για
παράταση του χρόνου ζωής τους (Pecsok et al., 1980).
320
Φωτογραφία 12.1 Υποδοχέας 4 θέσεων για λάμπες ατομικής απορρόφησης,
12.6.2 Το σύστηµα Ατοµοποίησης (Καύσης και Εκνέφωσης)

Ο ατομοποιητής είναι στην πραγματικότητα μια πηγή θερμικής ενέργειας, που παράγει ένα νέφος ατόμων το
οποίο περνά μέσα από μία δέσμη φωτός και απορροφά ακτινοβολία. Οι σημαντικότερες τεχνολογίες
ατοµοποίησης είναι ο καυστήρας φλόγας και το ηλεκτροθερµαινόµενο σύστηµα ατοµοποίησης, δηλαδή ο
φούρνος γραφίτη (καθαρός άνθρακας).
12.6.2.1 Σύστηµα Ατοµοποίησης µε Φλόγα
Η «φλόγα» είναι ένας απλός, φθηνός και εύχρηστος ατομοποιητής, που δημιουργεί ένα σταθερό περιβάλλον
για την ατοµική απορρόφηση. Αποτελείται από ένα εκνεφωτή, στον οποίο γίνεται αρχικά η εισρόφηση του
δείγματος και στη συνέχεια η διασπορά του ως ένα νέφος μικρών σταγονιδίων περίπου 10 μm. Το
ψεκαζόμενο αυτό νέφος αναμιγνύεται με ένα καύσιμο (μίγμα ακετυλενίου και αέρα) και εισέρχεται στην
κεφαλή του καυστήρα, όπου ακολουθεί η καύση. Στην κεφαλή του καυστήρα δημιουργείται μία φλόγα στην
οποία τα μικρά σταγονίδια του δείγματος καίγονται και τα άτομα που δημιουργούνται απορροφούν
ακτινοβολία και διεγείρονται. Συνήθως χρησιμοποιείται φλόγα αέρα – ακετυλενίου, με θερμοκρασία 2125 ως
2400οC (Φωτογραφία 12.2).
Συνήθως μέσα στα βιολογικά υγρά υπάρχουν και άλλα μέταλλα, όπως και άλλες ουσίες, οι οποίες
απορροφούν ή διαθλούν την ακτινοβολία που παράγει η λυχνία του συστήματος παρεμβαίνοντας στην
ανάλυση. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιείται και μία δεύτερη λυχνία δευτερίου. Έτσι, κατά τη στιγμή της
ατομοποίησης παρέχεται πάνω από το νέφος του δείγματος μία διπλή δέσμη φωτός, που αποτελείται από την
δέσμη του δείγματος και τη δέσμη αναφοράς (από την λάμπα δευτερίου). Με τον τρόπο αυτό γίνονται δύο
μετρήσεις σε ταυτόχρονο χρόνο, γίνεται δηλαδή ένα είδος διχρωματικής ανάλυσης, όπως και στα
φωτόμετρα με δύο μήκη κύματος (Pecsok et al., 2010).
321
Φωτογραφία 12.2 Σύστημα ατομικής απορρόφησης με καυστήρα φλόγας.
12.6.2.2 Το ηλεκτροθερµαινόµενο σύστηµα Ατοµοποίησης (Εξαχνωτής ή Φούρνος Γραφίτη)
Ο φούρνος γραφίτη είναι ένας μικρός κύλινδρος με μια μικρή οπή στο κέντρο για την είσοδο του δείγματος
(Φωτογραφία 12.3). Ο γραφίτης είναι καθαρός άνθρακας ο οποίος ως αδρανές υλικό δεν επιδρά στις
μετρήσεις. Όμως ο καθαρός άνθρακας παρουσία οξυγόνου καίγεται και καταστρέφεται, οπότε για την
προστασία του γραφίτη όλη η κεφαλή του καυστήρα βρίσκεται μέσα σε ατμόσφαιρα ευγενούς αερίου (Αργό,
Ar) (Σχήμα 12.3) Επειδή στην αρχή κάθε νέας μέτρησης η θερμοκρασία του συστήματος πρέπει να
επανέλθει από πολύ υψηλές θερμοκρασίες (> 2500οC) ξανά στους 40°C, μέσα στον εξαχνωτή υπάρχει
κατάλληλο κλειστό σύστημα ψύξης που στηρίζεται στη κυκλοφορία του νερού. Σε κάποια δε συστήματα
υπάρχει κάμερα στο εσωτερικό του συστήματος για την παρακολούθηση on-line της ανάλυσης.
Φωτογραφία 12.3 Κύλινδροι γραφίτη για ατομική απορρόφηση (Perkin Elmer Catalog).
322
Σχήμα 12.3 Σύστημα ατοµοποίησης με φούρνο γραφίτη (Pecsok et al.,1980).
Κατά την καύση (Φωτογραφία 12.4) αναπτύσσονται θερμοκρασίες 40 – 3000°C (Πίνακας 12.5) με
μέγιστη ταχύτητα ανόδου 2000°C/sec. Ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ενός δείγματος είναι λίγο μεγαλύτερος
από εκείνο της φλόγας. Πλεονέκτημα της μεθόδου όμως είναι ο μικρότερος όγκος δείγματος που απαιτείται
και η μεγαλύτερη αναλυτική ευαισθησία που εξασφαλίζει.
Στάδια Θερμοκρασία Διαδικασίες

Ξήρανση 100 – 150οC Εξάτμιση των υγρών του δείγματος.
Πυρόλυση 400 – 800οC Καύση της οργανικής ύλης και απελευθέρωση του μετάλλου
από τις πρωτεΐνες του αίματος.
Ατομοποίηση 1500 – 2300οC Παραγωγή ατόμων του μετάλλου, διέγερσή τους και
απορρόφησης της προσπίπτουσας ακτινοβολίας.
Καθαρισμός 2500 – 2700οC Καύση των υπολειμμάτων του δείγματος.
Πίνακας 12.5 Τα στάδια της ατομοποίησης.
Φωτογραφία 12.4 Πυράκτωση του γραφίτη κατά την ατομοποίηση. Ο γραφίτης στηρίζεται πάνω σε δύο δακτυλίους μέσα
από τους οποίους διέρχεται ηλεκτρικό ρεύμα (Philips Pye Unicam).
323
Για την προστασία του χρήστη και την ασφαλή λειτουργία του καυστήρα τα φασματοφωτόμετρα
ατομικής απορρόφησης αυτού του τύπου έχουν ειδικά συστήματα προστασίας και ελέγχου διαφόρων
παραμέτρων (Πίνακας 12.6).
Συστήματα ασφαλείας χρήστη

Πίεση αδρανούς αερίου
Θερμοκρασία και Πίεση νερού ψύξης
Θέση κυλίνδρου γραφίτη
Θερμοκρασία μετασχηματιστή
Πίνακας 12.6 Έλεγχοι ασφαλούς χρήσης του συστήματος ατομοποίησης.
Για την ανάλυση χρησιμοποιείται πολύ μικρή ποσότητα αραιωμένου δείγματος (περίπου 20 μL).
Για το λόγο αυτό είναι απαραίτητη η χρήση αυτόματου δειγματολήπτη (Φωτογραφία 12.5) αλλά και πολλών
άλλων αυτοματισμών (Πίνακας 12.7).
Φωτογραφία 12.5 Αυτόματος δειγματολήπτης για ατομική απορρόφηση με φούρνο γραφίτη.
Αυτοματισμοί
Ειδικές θέσεις για πρότυπα, modificator και δείγματα.
Αυτόματη παρασκευή καμπύλης αναφοράς.
Μετρήσεις δειγμάτων με τη μέθοδο της πολλαπλής προσθήκης προτύπου (βλ. Ενότητα 1.13.5).
Αυτόματη προσθήκη modificator (χηλικός μετατροπέας του υποστρώματος).
Επαναληπτικές εισαγωγές του ιδίου δείγματος στον ίδιο κύκλο καύσης για αύξηση της ευαισθησίας της μέτρηση.
Ταχεία ανάλυση στον εξαχνωτή (hot injection) σε προγραμματισμένη ταχύτητα και θερμοκρασία (40 – 200oC).
Πίνακας 12.7 Μερικές από τις δυνατότητες των αυτόματων δειγματοληπτών.
12.6.3 Το Οπτικό Σύστηµα και το Σύστηµα Μέτρησης

Το οπτικό σύστημα όλων των φασματοφωτόμετρων ατομικής απορρόφησης (ανεξάρτητα από την τεχνική
ατοµοποίησης που χρησιμοποιείται) αποτελείται συνήθως από ένα πρίσμα χαλαζία με μικρές διατομές που
επιτρέπουν την απομόνωση της ειδικής ακτινοβολίας που παράγεται από τις λυχνίες του
φασματοφωτομέτρου. Στη συνέχεια το σήμα ενισχύεται από ένα φωτοπολλαπλασιαστή υψηλής απόδοσης
και προσπίπτει σε ένα μονοχρωμάτορα που έχει περιοχή λειτουργίας 185 – 900 nm.
324
Η διόρθωση της μη ειδικής ακτινοβολίας που εκπέμπεται από το υπόστρωμα γίνεται είτε με λυχνία
δευτερίου υψηλής ταχύτητας (δες παρ. μετρήσεων σε φλόγα), είτε με την εφαρμογή ισχυρού μαγνητικού
πεδίου γύρω από τον φούρνο γραφίτη (Φωτογραφία 12.6). Σε αυτή τη τεχνική τη στιγμή της ατομοποίησης
το μαγνητικό πεδίο διαχωρίζει τη δέσμη του φωτός σε σ* και π* τροχιακά (φαινόμενο Zeeman). Η μία
δέσμη διασχίζει το νέφος των ατόµων του δείγματος και απορροφάται και η δεύτερη ορίζεται ως δέσµη
αναφοράς που περνάει έξω από το νέφος. Η δέσµη αναφοράς δρα ως όργανο παρακολούθησης της έντασης
της λυχνίας και του κοινού ηλεκτρικού κυκλώματος. Γι’ αυτό και η τελική απορρόφηση προσδιορίζεται από
τον λόγο των αναγνώσεων των εντάσεων της δέσµης του δείγματος και της δέσµης αναφοράς. Με τον τρόπο
αυτό αντιμετωπίζεται αποτελεσματικά ο ηλεκτρονικός θόρυβος που επηρεάζει τις μετρήσεις.
Φωτογραφία 12.6 Φούρνος γραφίτη με μαγνήτη για την διόρθωση της μη ειδικής ακτινοβολίας.
12.6.4 Υπολογισμοί, Καμπύλη Αναφοράς και Έλεγχος Ποιότητας

Ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων των δειγμάτων των ασθενών προϋποθέτει την δημιουργία καμπύλης
αναφοράς χρησιμοποιώντας διαφόρων συγκεντρώσεων βαθμονομητές. Η βαθμονόμηση βασίζεται στην
παραλλαγή του νόμου του Lambert-Beer που αναφέρθηκε (Εξίσωση 12.1). Επιλέγονται ως βαθμονομητές
πιστοποιημένα υλικά αναφοράς (CRM) (βλ. Κεφάλαιο 10) των οποίων η σύσταση προσομοιάζει στο
υπόστρωμα των αντίστοιχων βιολογικών δειγμάτων (αίμα ή ούρα). Για τις Ευρωπαϊκές χώρες τέτοια υλικά
αναφοράς παρασκευάζονται και ταυτοποιούνται από το Ευρωπαϊκό Γραφείο Αναφοράς (BCR ή
Community Bureau of Reference). Παραμένει όμως δύσκολη η ανεύρεση τέτοιων προτύπων για κάποια
μέταλλα. Εναλλακτικά, μπορούν να χρησιμοποιηθούν η μέθοδος της «προσθήκης γνωστής ποσότητας» (βλ.
Ενότητα 1.13.2) και η μέθοδος παρεμβολής (βλ. Ενότητα 1.13.6).
Η καμπύλη αναφοράς είναι γραμμική και ο υπολογισμοί της βασίζονται στην μέθοδο ελαχίστων
τετραγώνων (βλ. Ενότητα 1.17). Η εξίσωση αναφοράς (Εξίσωση 1.19) αποθηκεύεται επί μακρόν στη μνήμη
του συστήματος ατομοποίησης, οπότε στις ενδιάμεσες μετρήσεις απαιτείται μόνο επαναβαθμονόμηση με
διορθωτικό πρότυπο.
Τα συστήματα ατομοποίησης διαθέτουν πλήρες και αυστηρό πρωτόκολλο επιβεβαίωσης της
ποιότητας των μετρήσεων (με τουλάχιστον 10 τρόπους ελέγχου, όπως ανάλυση τυφλού και υποστρώματος,
έλεγχο επαναληπτικότητας (RSD %), υπολογισμό συντελεστή διόρθωσης βαθμονόμησης, υπολογισμό ορίων
ανίχνευσης κ.λπ. Όταν οι τιμές των δειγμάτων ελέγχου είναι εκτός ορίων, ο χειριστής ενημερώνεται με
κατάλληλη επισήμανση (flag). Οι διορθωτικές ενέργειες περιλαμβάνουν επανάληψη (Retry), τερματισμό της
ανάλυσης (stop), επαναβαθμονόμηση (recalibration) ή ακόμα και αλλαγές στην μέθοδο (alternative method)
(Georgiou, 1996).
325
Η ανάλυση του Μολύβδου σε ολικό αίμα
Για την μέτρηση του μολύβδου (Pb) σε ολικό αίμα χρησιμοποιείται φασματοφωτόμετρο ατομικής
απορρόφησης με φούρνο γραφίτη και διόρθωση της μη ειδικής ακτινοβολίας με μαγνητικό πεδίο (Zeeman).
Χρησιμοποιείται η ειδική λάμπα για το μόλυβδο στα 10 W. Η μέτρηση γίνεται στα 283,3 nm και η
καταγραφή της κορυφής του σήματος στα 3 sec. To πρόγραμμα καύσης περιλαμβάνει πέντε διαδοχικά
στάδια (Πίνακας 12.8).
Βήματα Ξήρανση Πυρόλυση Ατομοποίηση Καθαρισμός

Θερμοκρασία οC 140 530 2300 2650
Χρόνος Αύξησης Θερμοκρασίας (sec) 25 20 1 1
Χρόνος διατήρησης Θερμοκρασίας (sec) 20 50 4 3
Ταχύτητα Αερίου Αργόν mL/min 300 300 50 300
Πίνακας 12.8 Πρόγραμμα καύσης δειγμάτων στον ατοµοποιητή για τη μέτρηση μολύβδου σε ολικό αίμα.
12.7.1 Υλικά και αντιδραστήρια
 Διάλυμα 1% του χηλικού παράγοντα Triton X-100 για την αραίωση προτύπων και δειγμάτων.
 Πρότυπο διάλυμα βαθμονόμησης με συγκέντρωση μολύβδου 1000 ppm (1 g/L).
 Διαλύματα βαθμονόμησης για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς με συγκεντρώσεις μολύβδου:
100, 200, 400, 600 μg/L. Παρασκευάζονται με αραίωση του αρχικού διαλύματος μολύβδου σε διάλυμα
1% Triton X-100.
 Πρότυπα διαλύματα ελέγχου (controls) του Ευρωπαϊκού Γραφείου Προτύπων (Control Reference Mate-
rials) με συγκεντρώσεις:
o CRM194=126 μg/L
o CRM195 = 416 μg/L
o CRM196 = 772 μg/L
 Γραφίτες με πυρολιτική επικάλυψη
12.7.2 Τα βήματα εφαρμογής

Σε 7 δοκιμαστικά σωληνάρια εισάγουμε 200 μ/L ολικού αίματος και 1,8 mL από κάθε διάλυμα
βαθμονόμησης αντίστοιχα, με συγκέντρωση 0, 100, 200, 400, 600 μg/L μολύβδου. Το περιεχόμενο των
σωληναρίων ανακινείται καλά και από κάθε σωληνάριο μεταφέρουμε με τη βοήθεια του αυτόματου
δειγματολήπτη στο φούρνο γραφίτη 20 μ/L δείγματος. Αναπτύσσεται το πρόγραμμα καύσης και μετράται η
απορρόφηση (Πίνακας 12.9)
Πρότυπο διάλυμα μολύβδου Απορρόφηση Τελική Τιμή

Τυφλό: 0 μg/L 0,020 0
Διάλυμα 1: 100 μg/L 0,110 0,09
Διάλυμα 2: 200 μg/L 0,200 0,18
Διάλυμα 3: 400 μg/L 0,450 0,43
Διάλυμα 4: 600 μg/L 0,650 0,63
Πίνακας 12.9 Τιμές απορρόφησης προτύπων διαλυμάτων. Η στήλη «τελική τιμή» είναι οι τιμές απορρόφησης μείον την
απορρόφηση του τυφλού.
Από τις τιμές τις απορρόφησης αφαιρούμε την τιμή του τυφλού και με τις νέες τιμές αυτές
κατασκευάζεται καμπύλη αναφοράς (Σχήμα 12.4).
326
Σχήμα 12.4 Καμπύλη βαθμονόμησης σε σύστημα ατομοποιητή για τον προσδιορισμό μολύβδου.
Ακολούθως κάθε άγνωστο δείγμα αίματος καθώς και τα δείγματα ελέγχου (controls) αραιώνονται
1/20 με διάλυμα Triton X-100 1% (0,20 mL δείγματος + 1,8 mL διάλυμα). Ανακινούνται καλά και από κάθε
δείγμα μεταφέρονται 20 μ/L στο φούρνο γραφίτη για την μέτρηση. Τα αποτελέσματα υπολογίζονται με τη
βοήθεια της καμπύλης αναφοράς (Σχήμα 12.6) και της εξίσωσης παλινδρόμησης:
[Pb] = 928,05 A + 13,139 (Εξίσωση 12.2)
Από τις τιμές απορρόφησης των δειγμάτων ελέγχου υπολογίζονται οι αντίστοιχες συγκεντρώσεις
τους (Πίνακας 12.10) (Εξίσωση 12.2). Οι τιμές ελέγχονται, αν είναι εντός των ορίων ελέγχου και αν είναι,
τότε το επόμενο στάδιο είναι ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων των αγνώστων δειγμάτων.
Πρότυπο ελέγχου Απορρόφηση Συγκέντρωση μg/L

CRM194 0,780 737
CRM195 0,219 216
CRM196 0,535 510
Πίνακας 12.10 Τιμές συγκέντρωσης και απορρόφησης των controls.
12.8 Η αξιολόγηση των αποτελεσμάτων

Στη συνολική διαδικασία ανάλυσης δειγμάτων αίματος με ατομική απορρόφηση το σημαντικότερο ρόλο
διαδραματίζουν δύο παράγοντες: ο έλεγχος της επιμόλυνσης των δειγμάτων (Ενότητα 12.4) και το
πρόγραμμα καύσης. Για τον έλεγχο της επιμόλυνσης επιδιώκεται η, όσο το δυνατόν, απλούστερη κατεργασία
των δειγμάτων. Σε ό, τι αφορά το πρόγραμμα καύσης, θα πρέπει εξασφαλίζει την πλήρη καύση της
οργανικής ύλης κατά την πυρόλυση και ταυτόχρονα να αποφεύγεται η απώλεια των ατόμων του μετάλλου
κατά την στιγμή της ατμοποίησης. Η επιτυχία του σχεδιασμού εξαρτάται σημαντικά από το είδος του
μετάλλου. Ο μόλυβδος με θερμοκρασία ατοµοποίησης στους 2.300οC παρέχει την δυνατότητα της πλήρους
πυρόλυσης χωρίς άλλες απώλειες. Το κάδμιο όμως, με θερμοκρασία ατοµοποίησης στους 1.400οC, έχει
περιορισμένη δυνατότητα ανάπτυξης ενός μακρού σε χρόνο βήματος πυρόλυσης. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα
την μη πλήρη καύση του οργανικού υποστρώματος του αίματος και την συσσώρευση υπολειμμάτων μέσα
στο φούρνο γραφίτη, που παρεμποδίζουν τις μετρήσεις. Η ανάλωση περισσότερων γραφιτών αυξάνει το
κόστος της ανάλυσης. Η συνολική αναλυτική διακύμανση προέρχεται από την κατεργασία των δειγμάτων
327
και την πιθανή επιμόλυνσή τους κατά την διάρκεια της ανάλυσης και πρέπει, σύμφωνα με τα διεθνή
πρότυπα, να είναι μικρότερη του 10% (Georgiou et al., 1992).
Για την εκτίμηση των αποτελεσμάτων πρέπει να λαμβάνεται υπ’ όψη η αναλυτική και η βιολογική
διακύμανση των τιμών. Σημαντικό εργαλείο για τον έλεγχο της αναλυτικής διαδικασίας είναι η
προτυποποίηση των αναλύσεων κατά ISO.
12.9 Ασφάλεια Εργαστηρίου

Όπως αναφέρθηκε, τα συστήματα ατομοποίησης απαιτούν την χρήση αερίων καυσίμων. Η συνολική
εγκατάσταση του συστήματος, θα πρέπει να εξασφαλίζει σταθερή ροή αερίου και γρήγορη αλλαγές των
θερμοκρασιών συνθηκών ειδικά, όταν πρόκειται να γίνουν ταυτόχρονες αναλύσεις διαφόρων στοιχείων. Για
το λόγο αυτό τα συστήματα αυτά έχουν ηλεκτρομαγνητικές βαλβίδες ρύθμισης της ροής του κατάλληλου
αερίου, του οποίου η παροχή ρυθμίζεται είτε από τον υπολογιστή του συστήματος, είτε με χειριστήρια
εξωτερικά του θαλάμου καύσης. Τα εξαιρετικά εύφλεκτα αυτά αέρια απαιτούν αυστηρές προδιαγραφές
ασφαλείας κατά τη χρήση και την αποθήκευση τους (Πίνακας 12.11).
Οδηγίες για την ασφαλή αποθήκευση των Προδιαγραφές κανονισμών ασφαλείας για τα συστήματα
φιαλών αερίων ατομοποίησης
Αποθηκεύονται σε δωμάτιο με ειδική Ελέγχεται ο καυστήρας ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο μίγμα
πυράντοχη πόρτα καύσης.
Τοποθετούνται όρθιες και ασφαλισμένες σε Ελέγχεται η ορθή θέση του καυστήρα.
τοίχο.
Διαθέτουν μονόμετρα ασφαλείας. Ελέγχεται η υδατοπαγίδα στη ροή του αερίου.
Διατίθενται ανιχνευτές αερίων στις φιάλες Ελέγχεται το πώμα εκτόνωσης.
και στη γραμμή μεταφοράς.
Υπάρχει απαγωγός διαφυγόντων αερίων. Ελέγχεται το σκέπασμα του διαμερίσματος της φλόγας.
Υπάρχει αυτόματο σύστημα πυρόσβεσης. Ελέγχεται η πίεση οξειδωτικού με ύπαρξη εφεδρικού δοχείου
οξειδωτικού.
Ελέγχεται το σύστημα ασφαλείας για τη θέση του εκνεφωτή.
Ελέγχεται το κάλυμμα προστασίας από την ακτινοβολία της λάμπας
δευτερίου.
Πίνακας 12.11 Απαιτήσεις ασφαλείας των συστημάτων ατομοποίησης.
328
Βίντεο που δημιουργήθηκε αυτό το Κεφάλαιο
H μέτρηση μολύβδου σε ολικό αίμα βιομηχανικών εργατών με ατομική απορρόφηση,

https://youtu.be/dypMs_LvLfA.
 http://www.kentchemistry.com/links/AtomicStructure/flash/Atoms_Nav.swf (τελευταία προσπέλαση

1/3/2015).
 http://employees.oneonta.edu/viningwj/sims/atomic_absorption_and_emission_s.html (τελευταία προσπέ-
λαση 1/3/2015).
 https://www.youtube.com/watch?v=-fCX8OFBO-A (τελευταία προσπέλαση 1/3/2015).
 Φωτογραφία 12.1 http://lama.ird.sn/appareillages/fiches/spectro-aas.htm (τελευταία προσπέλαση

1/1/2015).
 Φωτογραφία 12.3
http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Graphite%20Furnace%20Model%20HGA%20600
 (τελευταία προσπέλαση 1/1/2015).
 Φωτογραφία 12.5
 http://www.medicalexpo.com/prod/analytik-jena/atomic-absorption-spectrometers-graphite-furnace-
flame-tandem-3550-547517.html (τελευταία προσπέλαση 1/1/2015).
329
Aναφορές
1. ΓΕΩΡΓΙΟΥ, Ζ., ΤΣΑΤΣΕΦ, Κ., ΧΑΡΤΣΙΑΣ, Β., ΝΤΟΤΣΕΦ, Δ. (1991) Τιμές καδμίου και μολύβδου σε
μη επαγγελματικά εκτιθέμενους ενήλικες. Ιατρική της Εργασίας, 1, p. 34-8.
2. AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND DISEASE REGISTRY, CASE STUDIES IN ENVIRON-
MENTAL MEDICINE (2008) Chromium Toxicity. New York: WB Saunders company.
3. AGENCY FOR TOXIC SUBSTANCES AND DISEASE REGISTRY (ATSDR) (2003) Elemental mer-
cury and inorganic mercury compounds: Human health aspects. Geneva: WHO.
4. ACGIH (ΑΜΕΡΙΚΑΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΙΑ ΚΥΒΕΡΝΗΤΙΚΩΝ ΥΓΙΕΙΝΟΛΟΓΩΝ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΑΣ) (1996)
Οριακές τιμές (TLVs) χημικών ουσιών και φυσικών παραγόντων και Δείκτες Βιολογικής Έκθεσης (BEIs).
5. GEORGIOU, Z., ZIMALIS, Ε., DANEV, S. (1992) Whole blood concentrations of Cadmium in non oc-
cupationally exposed citizens of Athens. Metal Ions in Biology and Medicine vol.2 Editors J. Ana-
stassopoulou, Ph Collery, J. Etienne. J. Libbey Eurotext Paris. p. 414-19.
6. GEORGIOU, Ζ, & ALOUMANIS, P. (1999) Lead and Cadmium in general and working environment.
2nd International Symposium on trace elements in humans – New perspectives Proceedings Book. Edi-
tors. S. Ermidou/Pollet –S. Pollet Athens, 1, p. 79-89.
7. GEORGIOU, Z., THATCHED, Κ., DANEV, S., ΖIMALIS, E. (1994) Comparison of several methods for
determination of Cadmium in whole blood with electrothermal atomic absorption spectrometry. Balkan
Journal of Clinical Laboratory, 1, p. 30-4.
8. HEALTH COUNCIL OF THE NETHERLAND (2012) Onderwerp: aanbieding advies Arsenic and inor-
ganic arsenic compounds.
9. PECSOK, R., SHIELDS, L., CAIRNS, T., MC WILLIAM, I. (1980) Σύγχρονες μέθοδοι στη χημική ανά-
λυση. Αθήνα: Εκδόσεις Γ.Α. Πνευματικός.
10. TIETZ, N. (1995) Clinical guide to laboratory tests. 3rd Ed. New York: WB Saunders company.
11. VENKATESH, G., IYENGAR, K., SUBRAMANIAN, K., JOOST, R., WOITTIEZ, W. (1997) Elemental
Analysis of Biological Samples: Principles and Practices. New York: CRC Press.
330
Η ΥΠΕΡΥΘΡΗ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ ΚΑΙ ΟΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ
ΣΤΗΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ
Σύνοψη
Στο κεφάλαιο, αυτό επιχειρείται μια εισαγωγή στη φασματοσκοπία υπερύθρου και σε εφαρμογή της στη
κλινική χημεία και γενικότερα στη διαγνωστική. Η φασματοσκοπία υπερύθρου χρησιμοποιείται στο κλινικό
εργαστήριο για την ποιοτική ανάλυση, κυρίως, ουρολίθων, με σκοπό την άμεση ή έμμεση διάγνωση
νοσολογικών καταστάσεων. Περιγράφεται η αρχή λειτουργίας της μεθόδου, αλλά δίνεται έμφαση στη
ευρέως χρησιμοποιούμενη φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμούς Fourier (FTIR). Περιγράφεται
η οργανολογία, η διαδικασία λήψης φάσματος, καθώς και η αξιολόγησή του για την ποιοτική ανάλυση του
ουρολίθου.
Απαιτούνται βασικές γνώσεις χημείας, φυσικής οπτικής καθώς και αυτές του Κεφαλαίου 1.
13.1.1 H νεφρολιθίαση
Η ουρολιθίαση είναι η παθολογική κατάσταση κατά την οποία ένας ή περισσότεροι λίθοι σχηματίζονται σε
κάποιο σημείο των νεφρών, των ουρητήρων, της ουροδόχου κύστης και της ουρήθρας, δηλαδή σε κάποιο
σημείο του ουροποιητικού συστήματος (Σχήμα 13.1) και εκδηλώνεται με κωλικό, δυσουρικά ενοχλήματα
και μακροσκοπική ή μικροσκοπική αιματουρία. Αντίστοιχα, νεφρολιθίαση είναι ο σχηματισμός λίθων στα
νεφρά, δηλαδή στην ανώτερη αποχετευτική μοίρα του ουροποιητικού συστήματος.
Η ουρολιθίαση προσβάλλει το 1 με 5% του πληθυσμού στις βιομηχανικές χώρες, συνήθως άτομα
ηλικίας 20 - 40 ετών, με τους άνδρες να προσβάλλονται συχνότερα από τις γυναίκες σε αναλογία 3:1, λόγω
της μεγαλύτερης ουρήθρας.
Τα αίτια εμφάνισης της ουρολιθίασης μπορεί να είναι ποικίλα, όπως η υπερουριχαιμία (αυξημένο
ουρικό οξύ), η ουρική αρθρίτιδα, γενετική προδιάθεση, διαβήτης, λευχαιμία, παράσιτα της κύστης,
βακτήρια, ανατομικά προβλήματα, εγκωλπώματα, υπερπαραθυροειδισμός, ακινησία και χρήση καθετήρα,
υπερασβεστιουρία, υπερβιταμίνωση D, πολλαπλό μυέλωμα, το σύνδρομο Cushing, τα καρκινώματα (με ή
χωρίς οστικές μεταστάσεις), σπογγοειδής νεφρός, ιδιοπαθής σωληναριακή οξέωση, δηλητηριάσεις με
οξαλικό οξύ (διάφορα βιομηχανικά προϊόντα με αιθυλική γλυκόζη και με μεθοξυφουράνιο), πρωτοπαθής
υπεροξαλουρία (κληρονομικό νόσημα που εμφανίζεται σε παιδιά και συνδέεται με αυξημένη απορρόφηση
οξαλικών), νεφρική ανεπάρκεια, παθήσεις του εντέρου, εκτεταμένες εντερεκτομές, έλλειψη χολικών
αλάτων, κυστινουρία, φάρμακα που λαμβάνονται στην κορτικοθεραπεία, ένδεια βιταμίνης B6, κ.ά.
Ο τρόπος ζωής, το pH των ούρων, η μειωμένη πρόσληψη υγρών, η αυξημένη άσκηση, που
συνοδεύεται με αφυδάτωση και φυσικά η διατροφή, είναι επίσης παράγοντες που ευνοούν το σχηματισμό
λίθων στα ούρα.
Στη λιθιασική νόσο υπάρχει και εποχιακή κατανομή, αφού έχει διαπιστωθεί αυξημένη συχνότητα
εμφάνισης της νόσου στους μήνες Ιούλιο, Αύγουστο και Σεπτέμβριο, στους οποίους η αυξημένη εφίδρωση
προκαλεί αποβολή υπέρπυκνων ούρων, με αυξημένες συγκεντρώσεις λιθογόνων αλάτων.
331
Σχήμα 13.1 Περιοχές όπου μπορούν να εντοπιστούν λίθοι στο ουροποιητικό σύστημα
Εκτεταμένες αναφορές υπάρχουν στη βιβλιογραφία σχετικά με τον ρόλο του πόσιμου νερού στην
ουρολιθίαση και αφορούν την ποσότητα του προσλαμβανόμενου νερού, καθώς και την περιεκτικότητά του
σε ιχνοστοιχεία. Υπάρχουν αντικρουόμενες απόψεις σχετικά με το αν η σκληρότητα του νερού, η
περιεκτικότητά του δηλαδή σε ορισμένα δυσδιάλυτα άλατα, σχετίζεται με αυξημένη συχνότητα της νόσου. Η
αυξημένη πρόσληψη νερού και η αυξημένη παραγωγή ούρων, ελαττώνει τη συχνότητα της νόσου, στα άτομα
με προδιαθεσικούς παράγοντες, εξαιτίας της ελάττωσης της συγκέντρωσης και του χρόνου παραμονής στα
ούρα των αλάτων που σχηματίζουν τους λίθους.
Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η πιθανότητα σχηματισμού νέου λίθου ένα χρόνο μετά το αρχικό
επεισόδιο νεφρολιθίασης φθάνει το 10%, ενώ μέσα σε 5-7 χρόνια το ποσοστό υποτροπής ανέρχεται στο 50%,
καθώς και ότι στο 25% των ασθενών με λιθίαση αναφέρεται ύπαρξη λιθίασης και σε άλλα μέλη της
οικογένειας, κάτι που πιθανόν να οφείλεται στις ίδιες διατροφικές συνήθειες και συνθήκες διαβίωσης (Fleish
et al.,1976). Τέλος, πρέπει να τονιστεί ότι οι χολόλιθοι (λίθοι στη χολή) και οι ουρόλιθοι δε συσχετίζονται.
Διαμορφώνονται σε διαφορετικές περιοχές του σώματος και η ύπαρξη χολόλιθου δε σημαίνει απαραίτητα ότι
θα αναπτυχθούν και ουρόλιθοι.
13.1.2 Η σύσταση των ουρολίθων
Οι ουρόλιθοι είναι πολυκρυσταλλικά συσσωματώματα και αποτελούνται από ποικίλες ποσότητες

κρυσταλλοειδούς και οργανικού υλικού (Drach et al.,1992).
Το 75% περίπου των λίθων περιλαμβάνει κυρίως άλατα του ασβεστίου. Από αυτούς οι μισοί
περίπου είναι λίθοι οξαλικού ασβεστίου. Το υπόλοιπο μισό των ασβεστούχων λίθων αποτελούνται από
οξαλικό ασβέστιο μαζί με άλατα του φωσφορικού ασβεστίου.
Γενικά, οι περισσότεροι από τους νεφρικούς λίθους αποτελούνται από μία ή περισσότερες από τις
ακόλουθες ενώσεις:
 75% οξαλικό ασβέστιο (CaC2O4),

 15% εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο (Struvite, NH4MgPO4·6H2O),
 1 - 5% μυκοπρωτεΐνη (γλυκοπρωτεΐνη, αποτελούμενη κυρίως από μυκοπολυσακχαρίτες),
 ουρικό οξύ (2,6,8,τριοξυ-πουρίνη, C5H4N4O3),
 κυστίνη (2R,2'R)-3,3'-διθειο-δις(2-αμινο-προπανοϊκό οξύ, C6H12N2O4S2).
Στον Πίνακα 13.1, δίνονται οι σημαντικότερες χημικές ενώσεις, που απαντώνται σε ουρόλιθους, τα
φυσικά χαρακτηριστικά των λίθων, το pH των ούρων καθώς και οι αιτίες σχηματισμού του λίθων.
Χημική ένωση pH ούρων Φυσικά χαρακτηριστικά Αιτιολογία

Υφή: σκληροί και λείοι. Ουρική αρθρίτιδα (Gout) /
Σχήμα: Ωοειδές Αύξηση ουρικού οξέος
Χρώμα: καφέ, καφεκίτρινο, στο αίμα / αύξηση ουρικού
Ουρικό οξύ ή
όξινο κιτρινέρυθρο, ερυθρωπό. οξέος στα ούρα/ δίαιτα
ουρικό άλας
Πυρήνας και περιφερική υψηλή σε πουρίνες.
διάταξη αλάτων κατά
στοιβάδες
Πυκνά ούρα / Υπερασβε-
στουρία / δηλητηρίαση με
Υφή: Σκληροί με ανώμαλη
βιταμίνη D /
επιφάνεια.
Υπερθυρεοειδισμός /
Σχήμα: ανάλογο με τη θέση
σαρκοείδωση / αλκαλικό
Οξαλικό ασβέστιο Ποικίλλει εύρεσής τους.
σύνδρομο / Οστεοπόρωση
Χρώμα: βαθύ καφέ προς
/ Νεφρική σωληναριακή
μαύρο ή σκούρο βαθύ
οξέωση / Ιδιοπαθής
πράσινο.
υπερασβεστουρία /
Υπεροξαλουρία
Νεφρική σωληνώδης
οξέωση / Πρόσληψη
Φωσφορικό Υφή: Μαλακοί και λείοι.
αλκαλικών τροφών /
ασβέστιο και Σχήμα: ανάλογο με τη θέση
Αλκαλικό Λοίμωξη από
φωσφορικό εύρεσης και
μικροοργανισμούς που
μαγνήσιο Χρώμα: λευκό
διασπούν την ουρία
(παραγωγή μικτών λίθων)
Σχήμα: ομαλοί και
στρογγυλοί Κυστινουρία
Κυστίνη Όξινο
Χρώμα: ασπροκίτρινοι, πρωτογενής
διαφανείς ή και κηρώδεις.
Σχήμα: μοιάζουν με τους
Ξανθίνη λίθους του ουρικού οξέος.
Χρώμα: καφεκίτρινοι.
Σχήμα: μοιάζουν με τους
Ανθρακικό φωσφορικούς λίθους αλλά
Αλκαλικό
ασβέστιο είναι πιο σκληροί.
Χρώμα: άσπρο προς μπεζ
Πίνακας 13.1 Περιέχει τις σημαντικότερες χημικές ενώσεις, που απαντώνται σε ουρόλιθους, το pH των ούρων, τα φυσικά
χαρακτηριστικά των λίθων, καθώς και οι αιτίες σχηματισμού του λίθων.
Οι περισσότεροι λίθοι, σε ποσοστό 60 - 70%, είναι μικτοί, δηλαδή αποτελούνται από περισσότερες
από μία ουσίες. Από τις ουσίες αυτές, η κυστίνη προέρχεται από κληρονομική νόσο.
Ο σχηματισμός του λίθου οφείλεται στην εναπόθεση κρυσταλλοειδών ουσιών γύρω από έναν
κεντρικό πυρήνα, που αποτελείται από μια οργανική ουσία. Η οργανική ουσία είναι κυρίως πρωτεΐνη και
καλείται matrix. Άλλες ουσίες που συγκροτούν το matrix είναι τα φωσφολιπίδια, οι υδατάνθρακες και το
νερό. Αυτή η πρωτεϊνική ουσία προέρχεται από τα σωληνάρια του νεφρού, ενώ η καθίζηση των
κρυσταλλοειδών σωμάτων εξαρτάται από τη συγκέντρωσή τους αλλά και το pH.
Στον Πίνακα 13.2, δίνονται οι κυριότερες κρυσταλλοειδείς ουσίες που απαντώνται σε ουρόλιθους.
333
Ουσία Ορυκτολογικό όνομα Χημικός τύπος
Οξαλικά
Μονοϋδρικό οξαλικό ασβέστιο Βεβελίτης CaC2O4 .H2O
Διϋδρικό οξαλικό ασβέστιο Βεντελίτης CaC2O4 .2H2O
Φωσφορικά
Υδροξυαπατίτης Υδροξυαπατίτης Ca10(PO4)6(OH)2
Καρβονοαπατίτης Καρβονοαπατίτης Ca10(PO4,CO3,OH)6(OH)2
Διϋδρικό υδρογονούχο φωσφορικό ασβέστιο Βρουσίτης CaHPO4.2 H2O
Φωσφορικό τριασβέστιο Whitlockite Ca3(PO4)2
Φωσφορικό οκτασβέστιο -- CaH(PO4)2 .2.5H2O
Εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο Στρουβίτης MgNH4PO4 . 6H2O
Τριϋδρικό φωσφορικό υδρογονούχο μαγνήσιο Newberyite MgHPO4.3H2O
Ουρικό οξύ
Άνυδρο ουρικό οξύ -- CHNO
5 4 4 3
Διϋδρικό ουρικό οξύ -- C5H4N4O3 . 2H2O
Ουρικά
Εναμμώνιο ουρικό οξύ -- C5H3N4O3NH4
Μονοϋδρικό νατριούχο άλας του ουρικού οξέος -- C5H3N4O3Na .H2O
Πίνακας 13.2 Κρυσταλλοειδείς ουσίες που απαντώνται σε ουρόλιθους.
13.1.3 Μακροσκοπική εξέταση των ουρολίθων
Οι προς ανάλυση λίθοι τοποθετούνται σε ένα καθαρό ποτήρι και πλένονται προσεκτικά με κρύο νερό
βρύσης, για την απομάκρυνση του αίματος και της βλέννας.
Αρχικά, εξετάζονται τα φυσικά χαρακτηριστικά δηλαδή το χρώμα, το σχήμα και το μέγεθός τους.
Οι ουρόλιθοι προσλαμβάνουν διάφορα σχήματα ανάλογα με τη χημική τους σύσταση. Διαφέρουν μεταξύ
τους στη δομή, στο σχήμα και το χρώμα. (Φωτογραφία 13.1). Με τη βοήθεια μεγεθυντικού φακού, μπορεί να
εκτιμηθεί αδρά η σύσταση του λίθου, δηλαδή αν αποτελείται από μία ή περισσότερες ουσίες.
Φωτογραφία 13.1 Διάφοροι τύποι ουρολίθων.
334
13.1.4 Ποιοτική ανάλυση των Ουρολίθων
Η εύρεση της χημικής σύστασης των ουρολίθων είναι βασικής σημασίας, προκειμένου να προγραμματιστεί η
κατάλληλη φαρμακευτική ή διαιτητική θεραπεία. Για την ποιοτική ανάλυση των ουρολίθων μπορούν να
χρησιμοποιηθούν χημικές ή φυσικές μέθοδοι. Στις φυσικές μεθόδους ανήκει η υπέρυθρη φασματοσκοπία, η
οποία ανιχνεύει κυρίως ποιοτικά τη σύσταση των ουρολίθων. Πρόκειται για μέθοδο, εξαιρετικά γρήγορη και
αξιόπιστη.
13.2 Υπέρυθρη φασματοσκοπία

Η υπέρυθρη φασματοσκοπία (Infrared Spectroscopy) είναι μια από τις πλέον συνηθισμένες και ευρέως
χρησιμοποιούμενες μεθόδους ενόργανης ανάλυσης (Skoog et al., 2014· Βαλαβανίδης, 2006).
Χρησιμοποιείται τόσο για τη διερεύνηση της δομής μιας χημικής ένωσης, όσο και για τον έλεγχο της
καθαρότητάς της.
13.2.1 Υπέρυθρη ακτινοβολία
Η υπέρυθρη ακτινοβολία καλύπτει την περιοχή μηκών κύματος του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος από 0,78
έως 1000 μm (Σχήμα 13.2). Σε αντίθεση με τη φασματοσκοπία υπεριώδους και ορατού, στη φασματοσκοπία
υπερύθρου αντί του μήκους κύματος της ακτινοβολίας, λ, χρησιμοποιείται ο κυματαριθμός, ν, για τον οποίο
ισχύει:
 cm 1  
1 (Εξίσωση 13.1)
 cm 
Η φασματική περιοχή της υπέρυθρης ακτινοβολίας μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις υποπεριοχές: την
εγγύς υπέρυθρη (NIR, 0,75 – 3 μm), τη μέση υπέρυθρη (MWIR, 3 – 30 μm) και την άπω υπέρυθρη περιοχή
(FIR, 30 - 1000 μm). Στον Πίνακα 13.3 δίνονται οι παραπάνω περιοχές, με το αντίστοιχο εύρος μηκών
κύματος σε μm και κυματαριθμών σε cm-1.
εριοχή Μήκος κύματος / μm Κυματαριθμός / cm-1

Εγγύς Υπέρυθρη 0,75 - 3 13300 - 3330
Μέση Υπέρυθρη 3 - 30 4000 - 330
Άπω Υπέρυθρη 30 - 1000 330 - 10
Πίνακας 13.3 Περιοχές υπέρυθρης ακτινοβολίας, η αντίστοιχη περιοχή μηκών κύματος και η αντίστοιχη περιοχή
κυματαριθμών.
335
Σχήμα 13.2 Περιοχές φάσματος ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας.
336
13.2.2 Αρχή Φασματοσκοπίας Υπέρυθρου
Στο Σχήμα 13.3, παρουσιάζονται διαφορετικά ενεργειακά επίπεδα του ίδιου μορίου. Οι τρεις ομάδες
οριζόντιων γραμμών, αντιστοιχούν σε τρεις διαφορετικές, ενεργειακά, ηλεκτρονιακές διαμορφώσεις
(configurations). Η χαμηλότερης ενέργειας, πιο σταθερή ηλεκτρονιακή διαμόρφωση είναι αυτή της
θεμελιώδους κατάστασης (ground state electron configuration). Τα άτομα των μορίων, ακόμα και όταν
βρίσκονται στη θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση, δε μένουν ακίνητα, αλλά εκτελούν δονητικές και
περιστροφικές κινήσεις.
Όταν ακτινοβολία, με μήκη κύματος στην υπεριώδη και ορατή περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού
φάσματος, αλληλεπιδράσει με ένα δείγμα, ηλεκτρόνια των ατόμων του δείγματος διεγείρονται σε
υψηλότερα, ενεργειακά, τροχιακά (τέτοιες διεγέρσεις φαίνονται στη μεσαία και δεξιά ομάδα κάθετων
γραμμών, για την ορατή και υπεριώδη ακτινοβολία, αντίστοιχα). Ακτινοβολία με μήκη κύματος στην
υπέρυθρη περιοχή, έχει χαμηλότερη ενέργεια από αυτή στην ορατή ή υπεριώδη περιοχή και για αυτό το
λόγο, μπορεί να διεγείρει μόνο τις δονήσεις των μορίων, στην ίδια ηλεκτρονιακή διαμόρφωση (στάθμη).
Τέτοιες διεγέρσεις φαίνονται στην αριστερή ομάδα κάθετων γραμμών.
Όταν η υπέρυθρη ακτινοβολία αλληλεπιδράσει με το δείγμα που μελετάται, τα μόρια διεγείρονται,
αυξάνοντας έτσι την ενέργεια δόνησης και περιστροφής τους. Για να μπορούν τα μόρια του δείγματος να
απορροφήσουν στο υπέρυθρο φάσμα, θα πρέπει η συχνότητα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας να συμπίπτει
με τη συχνότητα δόνησης των ατόμων του δεσμού. Οι συχνότητες, με τις οποίες δονούνται τα άτομα στο
μόριο, εξαρτώνται από τις μάζες των ατόμων (τα πιο βαριά μόρια δονούνται σε χαμηλότερες συχνότητες),
τον τύπο του δεσμού (πολλοί και ισχυροί δεσμοί δονούνται σε υψηλότερες συχνότητες) και το σχήμα του
μορίου.
Σχήμα 13.3 Ενεργειακά επίπεδα ηλεκτρονίων του μορίου και απορρόφηση ακτινοβολίας.
Οι δονήσεις που λαμβάνουν χώρα σε ένα μόριο διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: τις δονήσεις τάσης
(stretching modes), όταν τα άτομα πλησιάζουν και απομακρύνονται μεταξύ τους κατά μήκος του δεσμού και
τις δονήσεις κάμψης (bending modes), όταν τα άτομα των δεσμών κινούνται με τέτοιο τρόπο, ώστε να
αλλάζει η γωνία των δεσμών. Εκτός από τις δονήσεις τάσης και κάμψης, υπάρχουν και άλλα είδη
παραμόρφωσης της δομής των μορίων όπως, όταν αυτό σείεται (wagging mode), κλυδωνίζεται (rocking
mode), στρεβλώνεται (twisting mode) ή έχει ψαλιδωτή κίνηση (scissoring mode) (Animation 13.1).
337
Animation 13.1 Τύποι δονήσεων μορίων. Oι δεσμοί του άνθρακα με τα άτομα υδρογόνου, της ίδιας ένωσης, εμφανίζονται
σε διαφορετικές θέσεις στον χώρο.
Ο αριθμός των τρόπων δόνησης ενός μορίου είναι 3Ν-5 για γραμμικά μόρια και 3Ν-6 για μη
γραμμικά μόρια, όπου Ν ο αριθμός των ατόμων του μορίου. Π.χ το μόριο του CO2, που είναι τριατομικό,
γραμμικό μόριο έχει 4 τρόπους δόνησης: μία (1) συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού C-O, δύο (2)
δονήσεις κάμψης των δεσμών O-C-O και μία (1) μη συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού C-O (Animation
13.2).
Εντούτοις, στο φάσμα υπερύθρου του CO2 (Σχήμα 13.4) εμφανίζονται δύο κορυφές διαπερατότητας,
σε 2338 cm-1 και 581 cm-1. Η μεν πρώτη αποδίδεται στη μη συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού C-O, η δε
δεύτερη στις δονήσεις κάμψης, οι οποίες απορροφούν στην ίδια συχνότητα.
Σχήμα 13.4 Φάσμα διαπερατότητας του CO2.
Animation 13.2 Τύποι δονήσεων του μορίου CO2.
338
Αυτό συμβαίνει γιατί, όταν η δόνηση ενός δεσμού είναι συμμετρική, δεν παρατηρείται απορρόφηση
υπέρυθρης ακτινοβολίας. Για να υπάρξει απορρόφηση στην υπέρυθρη περιοχή, θα πρέπει να υπάρχει
μεταβολή της διπολικής ροπής κατά τη διάρκεια της δόνησης. Σε αντίθετη περίπτωση, η δόνηση είναι
ανενεργή στην υπέρυθρη περιοχή. Όσο μεγαλύτερη είναι η μεταβολή της διπολικής ροπής, τόσο ισχυρότερη
είναι η απορρόφηση.
Το μόριο του H2O που είναι τριατομικό, μη γραμμικό μόριο έχει 3 τρόπους δόνησης: μία (1)
συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού Η-O, μία (1) δόνηση κάμψης των δεσμών Η-Ο-Η και μία (1) μη
συμμετρική δόνηση τάσης του δεσμού Η-O (Σχήμα 13.5, Animation 13.3).
Σχήμα 13.5 Τύποι δονήσεων και κορυφές διαπερατότητας του μορίου H 2O.
Animation 13.3 Τύποι δονήσεων του μορίου H2O.
339
13.2.3 Φασµατοσκοπία υπέρυθρου µε µετασχηµατισµό Fourier
Στη συνήθη φασµατοσκοπία υπέρυθρου (dispersive IR spectroscopy), η πολυχρωµατική

ακτινοβολία της πηγής αναλύεται µε χρήση µονοχρωµάτωρα (πρίσµα ή φράγµα) και
ανιχνεύεται κατά συχνότητες ν+∆ν, όπου το ∆ν καθορίζεται από το εύρος των σχισµών του
φωτοµέτρου. Για τη μέση υπέρυθρη περιοχή, ως πηγή της πολυχρωματικής ακτινοβολίας
χρησιμοποιείται συνήθως καρβίδιο του πυριτίου (silicon carbide ή SiC) θερμαινόμενο στους
1200 Κ (Smith et al.,1968).
Αντίθετα, στη φασµατοσκοπία υπέρυθρου µε µετασχηµατισµό Fourier (FTΙR), το
συµβολόµετρο Michelson, γνωστό ήδη από τα τέλη του 19ου αιώνα (Michelson et al., 1887),
αποτελεί την καρδιά της τεχνικής. Το συµβολόµετρο Michelson είναι μια διάταξη οπτικών, που
απαρτίζεται από δύο κάτοπτρα κάθετα µεταξύ τους, εκ των οποίων το ένα είναι κινητό, και ένα
διαιρέτη δέσµης (beam splitter) που παρεµβάλλεται µεταξύ τους σε γωνία 45 ο. Το
συμβολόμετρο Michelson χωρίζει μια δέσμη ακτινοβολίας σε δύο δέσμες και τις
επανασυνθέτει, αφού πρώτα ακολουθήσουν ξεχωριστές διαδρομές που διαφέρουν στο μήκος.
Οι μεταβολές της έντασης της επαλληλίας των δύο δεσμών ακτινοβολίας ως συνάρτηση της
διαφοράς των οπτικών διαδρομών καταγράφονται από έναν ανιχνευτή (Hariharan, 2007).
Τα πλεονεκτήματα που προσφέρει η φασµατοσκοπία υπέρυθρου µε µετασχηµατισµό
Fourier σε σχέση με τη συνήθη φασµατοσκοπία υπέρυθρου, είναι η βελτιωμένη και σταθερή
διακριτική ικανότητα (λόγος σήμα/θόρυβο) για δεδομένο χρόνο σάρωσης ή η μείωση του
χρόνου σάρωσης για την ίδια διακριτική ικανότητα, λόγω ταυτόχρονης συλλογής πληροφοριών
από μεγάλο εύρος μηκών κύματος (White, 1990).
Στο Σχήμα 13.6 δίνεται σχηματικό διάγραμμα συμβολομέτρου Michelson, το οποίο
χρησιμοποιείται για να δημιουργηθεί ένα συμβολογράφημα (Σχήμα 13.7). H μαθηματική
επεξεργασία του συμβολογραφήματος (μετασχηματισμός Fourier) δίνει το φάσμα
απορρόφησης υπερύθρου.
Η μεγάλη ευαισθησία που χαρακτηρίζει τη φασματοσκοπία FTIR, μετατρέπεται σε
μειονέκτημα στην περίπτωση μη ακριβούς ρύθμισης των οπτικών του οργάνου και κυρίως του
συμβολομέτρου Michelson. Μειονέκτημα επίσης, αποτελεί η παρουσία Η2Ο και το CO2 στο
χώρο του φωτομέτρου, τα οποία εμφανίζουν έντονες απορροφήσεις στο φάσμα υπερύθρου.
Μία συνήθης πρακτική αντιμετώπισης του προβλήματος είναι η διοχέτευση αερίου αζώτου στο
θάλαμο του φωτομέτρου.
Λήψη φάσματος υπερύθρου, μπορεί να γίνει σε: αέρια φάση, υγρή φάση μεταξύ δύο
πλακών NaCl, σε διάλυμα, σε στερεή κατάσταση υπό μορφή αιωρήματος σε παραφινέλαιο, σε
στερεή κατάσταση υπό μορφή δισκίου σε KBr.
340
Σχήμα 13.6 Σχηματικό διάγραμμα συμβολομέτρου Michelson.
Σχήμα 13.7 Τυπικό συμβολογράφημα.
Τα φάσματα υπερύθρου είναι γραφικές παραστάσεις της διαπερατότητας, %Τ, (κυρίως) αλλά και της
απορρόφησης, Α, έναντι του κυματαριθμού, ν (cm-1). Ένα φάσμα υπέρυθρου μπορεί να χωριστεί στις
παρακάτω περιοχές, με βάση τα άτομα ή τις ομάδες των οποίων οι δονήσεις προκαλούν απορρόφηση στο IR
(Σχήμα 13.8).
341
 Περιοχή δονήσεων τάσης υδρογόνου (4.000 – 2.500 cm-1). Η απορρόφηση στις περιοχές αυτές προκαλεί-
ται από δονήσεις τάσεων δεσμών C-H, O-H, N-H και S-H. Η συχνότητα απορρόφησης εξαρτάται από το
άτομο που με το οποίο συνδέεται το Η.
 Περιοχή δονήσεων τάσης τριπλού δεσμού (2.500 – 2.000 cm-1). Στην περιοχή αυτή απορροφούν οι τρι-
πλοί δεσμοί μεταξύ ατόμων άνθρακα και οι τριπλοί δεσμοί μεταξύ ατόμων άνθρακα και αζώτου. Στην ί-
δια περιοχή απορροφούν και οι δεσμοί –C=C=C- και N=C=O.
 Περιοχή δονήσεων τάσης διπλού δεσμού (2.000 – 1.600 cm-1). Υπεύθυνες για την απορρόφηση στην πε-
ριοχή αυτή, είναι οι δονήσεις των δεσμών C=C, C=O και C=N.
 Περιοχή δονήσεων τάσης και κάμψης απλού δεσμού (1.500 – 700 cm-1). Στην περιοχή αυτή εμφανίζονται
πολλές απορροφήσεις, π.χ. δονήσεις κάμψεων των δεσμών C-H και οι δονήσεις τάσεων και κάμψεων α-
πλών δεσμών που συνδέουν ομάδες, όπως του μεθυλενίου (-CH2-), μεθυλίου (-CH3) και αμινομάδες (-
ΝΗ2). Η περιοχή αυτή ονομάζεται περιοχή δακτυλικού αποτυπώματος (fingerprint region), επειδή το φά-
σμα στην περιοχή αυτή χαρακτηρίζει το μόριο ως σύνολο.
Σχήμα 13.8 Τυπικό φάσμα απορρόφησης ουρόλιθου. Η μπλε γραμμή είναι το φάσμα απορρόφησης του ουρόλιθου,
άγνωστης σύστασης, και η μαύρη γραμμή το φάσμα απορρόφησης του KBr.
342
13.3.1 Προετοιμασία δισκίου δείγματος
1. Ο ουρόλιθος πλένεται, στεγνώνεται και διατηρείται σε ξηραντήρα μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

2. Εάν ο λίθος είναι μεγάλος αποσπάται μικρή ποσότητα αυτού, θρυμματίζεται και κονιορτοποιείται σε κα-
τάλληλο ιγδίο.
3. Ζυγίζεται, σε αναλυτικό ζυγό, ποσότητα ~1 mg του κονιορτοποιημένου λίθου και μεταφέρεται σε ιγδίο
αχάτη.
4. Σε αναλυτικό ζυγό ζυγίζεται επίσης, ποσότητα ~200 mg στερεού KBr και μεταφέρεται στο ίδιο ιγδίο με
το δείγμα.
 Η περιεκτικότητα του δισκίου στο προς ανάλυση δείγμα, θα πρέπει να είναι 1 – 2 mg/dL.
 Το KBr έχει το πλεονέκτημα έναντι του NaCl να μην απορροφά καθόλου στο IR και ως εκ τούτου
τα λαμβανόμενα αποτελέσματα είναι πολύ καλύτερα.
5. Ακολουθεί ανάμιξη, λειοτρίβηση και ομογενοποίηση των δύο υλικών.
6. Το ομογενοποιημένο μίγμα τοποθετείται προσεκτικά σε ειδική θέση της συσκευής συμπίεσης.
7. Η συσκευή συναρμολογείται και τοποθετείται σε υδραυλικό πιεστήριο.
8. Στη βαλβίδα εξόδου της συσκευής συνδέεται αεραντλία, για μερικά λεπτά, ώστε να απομακρυνθεί ο ε-
γκλωβισμένος, στη συσκευή, αέρας.
9. Με την αεραντλία να λειτουργεί συνεχώς, εφαρμόζεται πίεση ~ 5 tοns για χρονικό διάστημα από 3 - 5
min.
10. Με το τέλος του χρόνου συμπίεσης, διακόπτεται η λειτουργία της αντλίας, εκτονώνεται η πίεση και η
συσκευή συμπίεσης απομακρύνεται από το πιεστήριο και αποσυναρμολογείται. Στον πυθμένα του εμβό-
λου συμπίεσης της συσκευής, έχει δημιουργηθεί ένα λεπτό, διαφανές δισκίο.
11. Το δισκίο αφαιρείται, προσαρμόζεται σε ειδική υποδοχή και τοποθετείται στην πορεία της δέσμης στο
φασματοφωτόμετρο υπερύθρου.
13.3.2 Λήψη φάσματος
12. Η λήψη φάσματος γίνεται με φασματοφωτόμετρο FT-IR Shimadzu 8300 (Φωτογραφία 13.2).
Φωτογραφία 13.2 Φασματοφωτόμετρο FT-IR Shimadzu 8300.
13. Το φασματοφωτόμετρο τίθεται σε λειτουργία, το σύστημα ελέγχεται από το λογισμικό Hyper-IR και
συνδέεται με αυτό αυτόματα. Με την ολοκλήρωση της σύνδεσης εμφανίζεται το παράθυρο της Φωτο-
γραφίας 13.3.
343
Φωτογραφία 13.3 FTIR 8000 Window.
14. Επιλέγεται η μετρούμενη συνάρτηση: %Τ, η ανάλυση (resolution): 4, η περιοχή σάρωσης σε κυματαριθ-
μούς (range, high: 4000, low: 400), ο αριθμός των σαρώσεων (scans): 64, apodization: Happ-Genzel
function.
15. Αρχικά, λαμβάνεται φάσμα με κενό το θάλαμο τοποθέτησης του δείγματος, με σκοπό την ελαχιστοποίη-
ση του θορύβου.
16. Μόλις ολοκληρωθεί η διαδικασία του background, τοποθετείται στην εγκοπή του δειγματοφορέα ένα
ειδικό φιλμ πολυστυρενίου (Φωτογραφία 13.4) και λαμβάνεται το φάσμα του. Σκοπός της ενέργειας αυ-
τής, είναι ο έλεγχος της καλής λειτουργίας του αναλυτή. Μετά τη λήψη του φάσματος του πολυστυρενί-
ου, τη σύγκριση του με το πρότυπο FTIR φάσμα και την αξιολόγησή του (να μην παρατηρείται απουσία
ή μετατόπιση κορυφών), ο αναλυτής είναι έτοιμος να δεχτεί δείγμα.
Φωτογραφία 13.4 Έλεγχος της καλής λειτουργίας του αναλυτή με λήψη φάσματος πολυστυρενίου.
17. Μετά την εξασφάλιση της καλής λειτουργίας του αναλυτή, τοποθετείται στην εγκοπή του δειγματοφο-
ρέα δισκίο του δείγματος και λαμβάνεται το φάσμα διαπερατότητας ή απορρόφησης.
18. Το φάσμα του δείγματος εμφανίζεται στην οθόνη από την πρώτη κιόλας σάρωση και ενδεχομένως μετα-
βάλλεται (όχι αισθητά) κατά τη διάρκεια των σαρώσεων. Στη Φωτογραφία 13.5 δίνεται ένα τυπικό φά-
σμα ουρολίθου, που έχει ληφθεί με το φασματοφωτόμετρο FT-IR Shimadzu 8300.
344
Φωτογραφία 13.5 Τυπικό φάσμα ουρολίθου στην οθόνη υπέρυθρου φασματογράφου (Shimadzu 8300).
19. Η αποθήκευση του φάσματος σε αρχείο .irs. Το φάσμα μπορεί να αποθηκευθεί και σε αρχείο ASCII.txt,
προκειμένου να γίνει περαιτέρω επεξεργασία σε προγράμματα όπως το Microsoft Excel ή το Microcal
Origin.
20. Τα βήματα 6-10 επαναλαμβάνονται για όλα τα δείγματα.
13.3.3 Αξιολόγηση φασμάτων FTIR
Τα περισσότερα φασματοφωτόμετρα FTIR έχουν, στο λογισμικό τους, ενσωματωμένες βιβλιοθήκες, με τις
οποίες μπορεί να γίνει σύγκριση και ταυτοποίηση. Σε περίπτωση όπου δεν υπάρχει τέτοια δυνατότητα, ο
χρήστης θα πρέπει να αναζητήσει φάσματα γνωστών ενώσεων σε ηλεκτρονικές βιβλιοθήκες στο διαδίκτυο.
Μερικές από αυτές τις βιβλιοθήκες δίνονται παρακάτω:
 http://www.fdmspectra.com
 http://www.ansyco.de/CMS/frontend/index.php?idcatside=124&letter=A
 http://www.molinstincts.com/home/index/demo_order/main.html
 http://www.knowitall.com/academic/default.asp http://www.ir-spectra.com/2012/indexes/index_d.htm
 http://www.ftirsearch.com
 http://sdbs.db.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi
 http://speclab.cr.usgs.gov/spectral.lib06/
345
Σχήμα 13.9 To φάσμα απορρόφησης του ουρικού οξέος.
Σχήμα 13.10 To φάσμα απορρόφησης του κιτρικού οξαλικού νατρίου.
Σχήμα 13.11 To φάσμα απορρόφησης του μονοϋδρικού οξαλικού ασβεστίου.
346
H ανάλυση ουρόλιθου σε υπέρυθρο φασματογράφο, καθώς και όλα τα στάδια προετοιμασίας του δείγματος,
https://youtu.be/VujI8foF8tk. ht

 Σχήμα 13.1
https://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Kidney_stones#/media/File:Blausen_0595_KidneyStones.p
ng (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
 Σχήμα 13.2
https://commons.wikimedia.org/wiki/Category:Electromagnetic_spectrum_illustrations#/media/File:Electr
omagnetic-Spectrum.png (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015).
 Σχήμα 13.4 http://chemistry.elmhurst.edu/vchembook/images/irCO2.JPEG (τελευταία προσπέλαση
10/9/2015)
 Σχήμα 13.5 http://chemistry.elmhurst.edu/vchembook/images/irwater.JPEG (τελευταία προσπέλαση
10/9/2015)
 Σχήμα 13.6
https://en.wikipedia.org/wiki/Fourier_transform_infrared_spectroscopy#/media/File:FTIR_Interferometer.
png (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015)
 Σχήμα 13.7 https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FTIR-interferogram.svg (τελευταία προσπέλαση
8/9/2015).
 Σχήμα 13.9
http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Spec=C69932&Index=0&Type=IR&Large=on&SVG=on (τελευ-
 Σχήμα 13.10 http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Spec=B6006721&Index=0&Type=IR&Large=on
 Σχήμα 13.11 http://webbook.nist.gov/cgi/cbook.cgi?Spec=B6007233&Index=0&Type=IR&Large=on
347
Σχετικό οπτικό υλικό στο διαδίκτυο
 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα: https://www.youtube.com/watch?v=hXe7EVv1y0Q (τελευταία προσπέλαση

10/9/2015)
 Τύποι δονήσεων μορίων: https://www.youtube.com/watch?v=ZWwLCnuYRys (τελευταία προσπέλαση
5/7/2015)
 Δονήσεις μορίου Η2Ο: https://www.youtube.com/watch?v=1uE2lvVkKW0 (τελευταία προσπέλαση
5/7/2015)
 Δονήσεις μορίου CO2: https://www.youtube.com/watch?v=W5gimZlFY6I (τελευταία προσπέλαση
5/7/2015)
 Φασματοσκοπία υπερύθρου (διάλεξη):https://www.youtube.com/watch?v=u2IBdtINsrQ (τελευταία προ-
σπέλαση 3/6/2015)
 Συμβολόμετρο Michelson: https://www.youtube.com/watch?v=zaxYZxQS0yc
 https://www.youtube.com/watch?v=j-u3IEgcTiQ
 http://www.optics-vision.gr/files/items/2/26/tsiapa_eirini_2008.pdf (τελευταία προσπέλαση 10/9/2015).
 Animation δονήσεων μορίων:
o http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Vibrational_Spectroscopy/Vibrational_
Modes (τελευταία προσπέλαση 5/7/2015)
o https://www.youtube.com/watch?v=W5gimZlFY6I (τελευταία προσπέλαση 5/7/2015)
o https://www.youtube.com/watch?v=1uE2lvVkKW0 (τελευταία προσπέλαση 5/7/2015)
Αναφορές
1. ΒΑΛΑΒΑΝΙΔΗΣ, Α. (2006). Φασματοσκοπία οργανικών ενώσεων, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Τμήμα Χη-

μείας.
2. DRACH, W. (1992). pp. 2091-2101) Urinary Lithiasis: Etiology, Diagnosis, and Medical Management.
In: Campell’s Urology, 6th edition, New York: W.B. Saunders Company.
3. FLEISH, H., ROBERSTON, G. (1976, pp. 5-23). The kinetics of crystal growth and renal stone formation
In: Urolithiasis Research. New York: Plenum Press.
4. HARIHARAN, P. (2007) Basics of Interferometry. New York: Elsevier.
5. MICHELSON, A., MORLEY, E. (1887). On the Relative Motion of the Earth and the Luminiferous
Ether. American Journal of Science, 34(203), p. 333–45.
6. SKOOG, A., HOLLER, J., CROUCH, R. (2014). Αρχές Ενόργανης Ανάλυσης (μετάφραση 6ης έκδοσης).
Αθήνα: Εκδόσεις Κωσταράκη.
7. SMITH, D, MORGAN, L., LOEWENSTEIN, V. (1968). Comparison of the Radiance of Far-Infrared
Sources. J Opt Soc Am, 58, p. 433–4.
8. WHITE, R. (1990) Chromatography/Fourier transform infrared spectroscopy and its applications. New
York: Marcel Dekker.
348
ΥΓΙΕΙΝΗ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ
ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ . ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗ ΥΓΕΙΟΝΟΜΙΚΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ
Σύνοψη
Το κεφάλαιο αυτό χωρίζεται σε δύο μέρη. Στο πρώτο, περιγράφονται αδρά οι επαγγελματικοί κίνδυνοι που
απειλούν τη ζωή και την υγεία των εργαζομένων σε διαγνωστικά εργαστήρια, καθώς και παρουσιάζονται οι
βασικές αρχές της ορθής εργαστηριακής πρακτικής. Ακόμη παρουσιάζονται τα είδη κινδύνων, τα μέτρα
πρόληψης και η αναγκαία ιατρική παρακολούθηση.
Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται οι βασικές αρχές ορθής διαχείρισης υγειονομικών αποβλήτων.
Παρουσιάζονται τα είδη των αποβλήτων που παράγονται σε υγειονομικές μονάδες και οι τρόποι
αποθήκευσης μεταφοράς και τελικής διάθεσης. Στο τέλος, δίνεται και ένα παράδειγμα Σχεδίου Έκτακτης
Ανάγκης για την αντιμετώπιση ατυχημάτων, τόσο κατά τη διαχείριση των αποβλήτων, όσο και σε
περιπτώσεις τραυματισμού του προσωπικού.
Οι κίνδυνοι και τα μέτρα πρόληψης που παρουσιάζονται εδώ αφορούν όλα τα προηγούμενα κεφάλαια,
δηλαδή όλες τις προηγούμενες εργαστηριακές μεθοδολογίες. Κατά συνέπεια οι αναγνώστες θα πρέπει να
έχουν υπόψη τα Κεφάλαια 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12 και 13.
14.1 Υγιεινή και Ασφάλεια Εργασίας στο Κλινικό Εργαστήριο

14.1.1 Εισαγωγή
Η υγεία και ασφάλεια των εργαζομένων στα κλινικά εργαστήρια απειλείται καθημερινά από άμεσους και
εμφανείς κινδύνους, οι οποίοι μπορεί να προέρχονται τόσο από το χώρο εργασίας όσο και από τα
χρησιμοποιούμενα υλικά. Οι κίνδυνοι αυτοί μπορούν να δημιουργήσουν σοβαρά προβλήματα υγείας
(επαγγελματικές νόσους) ή να απειλήσουν ακόμη και τη ζωή των εργαζομένων με τη μορφή εργατικών
ατυχημάτων. Είναι προφανές ότι σε όλα τα εργαστήρια οι εργαζόμενοι έρχονται σε επαφή με επικίνδυνα ή
τοξικά υλικά, με πτητικά υγρά που μπορούν να είναι εύφλεκτα ή δηλητηριώδη, με μολυσματικά ή ακόμη και
ραδιενεργά υλικά. Η εκτεταμένη χρήση των υλικών αυτών, μπορεί να θέσει σε κίνδυνο τη ζωή και την υγεία
των εργαζομένων. Πηγές κινδύνων στο εργαστήριο επίσης, δύνανται να είναι οι ίδιες οι δραστηριότητες που
περιλαμβάνονται στην καθημερινή άσκηση των καθηκόντων. Υπάρχουν αρκετά περιστατικά εγκαυμάτων
από τη χρήση καυστικών ή εύφλεκτων υλικών, τρυπήματα κατά την ώρα της αιμοληψίας, ή τραυματισμοί
από σπασμένο σωληνάριο με μολυσμένο αίμα, όπως και κατάποση μολυσματικών και τοξικών υγρών από τη
χρήση πιπέττας.
Στη πρόκληση ατυχημάτων συνεισφέρουν και οι εξής παράγοντες: ο μη λειτουργικός σχεδιασμός
και η κακή κατάσταση των χώρων εργασίας, των αποθηκευτικών χώρων και των χώρων υγιεινής και
ανάπαυσης προσωπικού του Εργαστηρίου, η προβληματική ορισμένες φορές κατάσταση των συστημάτων
θέρμανσης, κλιματισμού και αερισμού του Εργαστηρίου, ο ακατάλληλος φωτισμός και η ελλιπής ηχομόνωση
του Εργαστηρίου, η απουσία πυρανίχνευσης, πυροπροστασίας, αυτόματης πυρόσβεσης και κατάλληλης
αποθήκευσης εύφλεκτων υγρών. Επιπλέον, επειδή στα εργαστήρια ισχύει το κυκλικό ωράριο, δημιουργούνται
προβλήματα στην προσωπική και κοινωνική ζωή των εργαζομένων τα οποία επηρεάζουν την απόδοση και
αυξάνουν το εργασιακό stress.
Η πρόληψη τέτοιων σημαντικά επικίνδυνων καταστάσεων περιλαμβάνει τα εξής βήματα:
1. Πρωτογενής πρόληψη: Εντοπισμός, καταγραφή και μελέτη όλων των βλαπτικών παραγόντων που βρί-
σκονται στον εργασιακό χώρο, προτάσεις και μέτρα για τη μείωση, εάν όχι την εξάλειψη τους.
2. Δευτερογενής πρόληψη: Κλινικός και εργαστηριακός έλεγχος των εργαζομένων για την έγκαιρη διάγνω-
ση των επαγγελματικών και μη ασθενειών. Σκοπός είναι η αναστροφή ή η επιβράδυνση της διαδικασίας
μιας βλάβης
349
3. Τριτογενής πρόληψη: Προσπάθεια περιορισμού των συνεπειών μιας ασθένειας ή και αναπηρίας με την
αποτελεσματική θεραπεία που επιδρά στη εξέλιξη της νόσου, μειώνοντας τις ενδεχόμενες επιπλοκές και
συνεπώς τη θνησιμότητα.
14.1.2 Κύριες πηγές κινδύνου στα εργαστήρια

14.1.2.1 Κίνδυνος από αιχμηρά αντικείμενα
Όλοι οι εργαζόμενοι στον κλάδο των τεχνολόγων και παρασκευαστών βιοϊατρικών εργαστηρίων που
απασχολούνται στα διαγνωστικά εργαστήρια, είναι εκτεθειμένοι σε βιολογικά υγρά (αίμα, ούρα, κόπρανα,
υγρά από κύστεις διαφόρων οργάνων, πτύελα, υλικά τραυμάτων κ.α.). Κατά την αιμοληψία οι εργαζόμενοι
είναι εκτεθειμένοι και στον κίνδυνο τραυματισμών από τις βελόνες και άλλα αιχμηρά αντικείμενα που
χρησιμοποιούνται. Ο κίνδυνος είναι ιδιαίτερα σοβαρός και λόγω της δυνητικά μολυσματικής φύσης των
βιολογικών υγρών. Ταυτόχρονα, υπάρχει και ο κίνδυνος από μικροτραυματισμούς για την υγεία των
επαγγελματιών που χειρίζονται τα απορρίμματα. Για τους λόγους αυτούς τα αιχμηρά αντικείμενα
απορρίπτονται σε ειδικά κίτρινα κουτιά τα οποία έχουν ειδικό υποδοχέα για την αφαίρεση της βελόνας από τη
σύριγγα και κάλυμμα ασφαλείας (Τούκας, 2007). Για την ασφάλεια τους συνολικά οι εργαζόμενοι πρέπει να
τηρούν τους εξής κανόνες:
 απορρίπτουν άμεσα και με ασφάλεια μόνο τα αιχμηρά αντικείμενα μέσα στο κίτρινο κουτί,
 δεν γεμίζουν τα κίτρινα κουτιά πάνω από τα 2/3,
 δεν προσπαθούν ποτέ να επανατοποθετήσουν το κάλυμμα στη χρησιμοποιημένη βελόνη ούτε να βγάλουν
τη βελόνα από τη σύριγγα με τα χέρια,
 δεν τοποθετούν ποτέ τις χρησιμοποιημένες βελόνες στην τσέπη,
 δεν προσπαθούν να πιάσουν αιχμηρά αντικείμενα που πέφτουν.
Φωτογραφία 14.1.1 Τα συμπαγή κίτρινα κουτιά που χρησιμοποιούνται για την απόρριψη αιχμηρών αντικειμένων.
Τέλος, ειδική αναφορά πρέπει να γίνει στον κίνδυνο που προέρχεται από τη χρήση γαντιών. Τα
γάντια αντιπροσωπεύουν σήμερα τον σημαντικότερο παράγοντα κινδύνου αλλεργικών εκδηλώσεων στο
νοσοκομειακό περιβάλλον, επειδή χρησιμοποιούνται ευρέως και έχουν ισχυρή αλλεργιογόνο δράση, η οποία
μπορεί να εμφανίζεται με:
1. τοπικές εκδηλώσεις ως δερματίτιδα εξ επαφής
2. συστηματικές εκδηλώσεις που περιλαμβάνουν:
 το δέρμα και τους βλεννογόνους (γενικευμένη κνίδωση, οίδημα, και οίδημα λάρυγγα με σοβαρή ανα-
πνευστική δυσχέρεια),
350
 το αναπνευστικό σύστημα (άσθμα και ρινίτιδα),
 τα μάτια (επιπεφυκίτιδα),
 αλλεργικές αντιδράσεις μέχρι την εικόνα αναφυλακτικού shock.
14.1.2.2 Βιολογικός κίνδυνος

Ο κίνδυνος έκθεσης των εργαζομένων στα διαγνωστικά εργαστήρια και την αιμοδοσία, εστιάζεται κυρίως
στη μόλυνση: των χεριών, των βλεννογόνων των οφθαλμών, της μύτης και του στόματος, από μολυσμένο
αίμα και άλλα σωματικά υγρά. Οι διαδρομές της λοίμωξης μπορεί να είναι:
 μετά από ένεση/κατάποση των υλικών (ποτού και φαγητού σε μη ελεγχόμενες περιοχές νοσοκομείου),
 από εισπνοή των αερομεταφερόμενων χημικών ουσιών και παθογόνων παραγόντων μέσω των βλεννογό-
νων,
 από δερματική απορρόφηση ή μέσω τομών στο δέρμα (μεταξύ άλλων με υδατοδιαλυτές τοξικές χημικές
ουσίες, που μπορούν να απορροφηθούν σε όλο το σώμα (Τούκας, 2007).
Αν και η καταγεγραμμένη συχνότητα έκθεσης είναι γενικά χαμηλή, οι συνέπειες είναι εξαιρετικά
σοβαρές και για τον λόγο αυτό, η εκπαίδευση στην ασφάλεια είναι ζωτικής σημασίας. Οι οδηγίες ασφαλείας
περιλαμβάνουν, τα ακόλουθα βασικά σημεία:
 Αποφυγή τρυπημάτων, κοψιμάτων, εκδορών και προφύλαξη κάθε υπάρχουσας πληγής.

 Μέτρα βασικής Υγιεινής για την αποφυγή μόλυνσης των εργαζομένων και του ρουχισμού τους.
 Έλεγχο και περιορισμό της μόλυνσης επιφανειών και διαδικασίες καθαρισμού τους.
 Ασφαλή απομάκρυνση των μολυσμένων αποβλήτων και απορριμμάτων.
Οι οδηγίες αυτές διαρθρώνονται σε διάφορα επίπεδα, που περιλαμβάνουν:
 Βασικές οδηγίες βιοασφάλειας για όλες τις συνήθεις διαδικασίες ενός διαγνωστικού εργαστηρίου.
 Πρόσθετα μέτρα για ορολογικά, ιολογικά και ερευνητικά εργαστήρια.
 Γραπτές οδηγίες για τις διαδικασίες συλλογής, διαχείρισης, μεταφοράς, συσκευασίας και αποστολής δυνητικά
μολυσμένων βιολογικών δειγμάτων.
Επιπλέον, οι εργαζόμενοι σε μικροβιολογικά εργαστήρια έρχονται σε άμεση επαφή με τις

καλλιέργειες ιών και βακτηρίων, ενώ οι απασχολούμενοι σε ηπατολογικά εργαστήρια και αιμοδοσίες,
έρχονται σε επαφή με αντιγόνα ιών προς ανίχνευση, κατ' αποκλειστικότητα της Ηπατίτιδας και του ιού HIV.
14.1.2.3 Χημικός κίνδυνος

Λόγω της φύσης των εργαστηριακών πράξεων και αναλύσεων που εκτελούνται, είναι απαραίτητη η χρήση
χημικών ουσιών και διαλυμάτων, όπως οξέα, διαβρωτικά χημικά, καρκινογόνες χρωστικές ουσίες, πτητικά
χημικά υγρά, ραδιενεργά υλικά και ειδικά προϊόντα χημικής βιομηχανίας τα οποία, είναι άμεσα
απορροφήσιμα από το δέρμα και αποτελούν πηγή κινδύνου. Ως παράδειγμα αναφέρονται οι καρβοξυλόλες οι
οποίες χρησιμοποιούνται σε ευρεία κλίμακα κατά τη διάρκεια των χιλιάδων καθημερινών χρώσεων και
πραγματοποιούνται σε παθολογοανατομικά - κυτταρολογικά εργαστήρια. Ιδιαίτερα η ξυλόλη, διαβρώνει τα
πλαστικά γάντια και έρχεται σε απευθείας επαφή με το δέρμα. Αλλά και όλες οι γνωστές χρωστικές όπως:
Hematoxylin, Orange G, Eosin, Giemsa, που χρησιμοποιούνται σε μικροβιολογικά εργαστήρια, θεωρούνται
ερεθιστικές για το δέρμα. Οι εργαζόμενοι σε τοξικολογικά εργαστήρια ανιχνεύουν σε μολυσματικά βιολογικά
υγρά (αίμα-ούρα) ναρκωτικές και τοξικές ουσίες, όπως ινδική κάνναβη, LSD, κοκαΐνη, ηρωίνη, Αμφεταμίνες
βενζοδιαζεπίνες, βαρβιτουρικά και άλλα τοξικά φάρμακα και ουσίες. Λόγω της φύσεως των εξετάσεων
έρχονται σε επαφή με ασθενείς που ανήκουν στις ομάδες υψηλού κινδύνου. Χρησιμοποιούν δε καθαρές
πρωτογενείς ουσίες ναρκωτικών με έντονο τοξικό και πτητικό χαρακτήρα.
351
Οι εργαζόμενοι σε βιοχημικά εργαστήρια έρχονται σε επαφή με πολλά και ποικίλα αντιδραστήρια
όπως (π.χ. ο σίδηρος (Fe) προκαλεί δερματικές αντιδράσεις, ερεθίζει τα μάτια, ή αντιδραστήριο που περιέχει
οξικό οξύ και κατατάσσεται βάση των οδηγιών της Ευρωπαϊκής Ένωσης ως ερεθιστικό [ΧΙ], επικίνδυνο).
Σύμφωνα με τη ελληνική νομοθεσία, κάθε χημικό αντιδραστήριο υποχρεωτικά φέρει την κατάλληλη
σήμανση στην ετικέτα του και συνοδεύεται από Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας στο οποίο αναφέρονται οι
πιθανοί κίνδυνοι για την υγεία. Η συντριπτική πλειοψηφία των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται στα
εργαστήρια, χαρακτηρίζονται από τις ίδιες τις χημικές βιομηχανίες, ως άκρως επικίνδυνα, ή και καρκινογόνα,
ενώ μπορούν να προκαλέσουν βαριά εγκαύματα, κληρονομήσιμες γενετικές ανωμαλίες. Είναι σημαντικό οι
εργαζόμενοι να μπορούν να αναγνωρίζουν τα σήματα που αναγράφονται στις ετικέτες των χημικών που
χρησιμοποιούν. Τα σημαντικότερα από αυτά εικονίζονται στον Πίνακα 14.1.1
Τ Τοξικό C Διαβρωτικό Ν Επικίνδυνο για το Ε Εκρηκτικό

περιβάλλον
Χn Επιβλαβές Χi Ερεθιστικό F Εύφλεκτο O Οξειδωτικό
Πίνακας 14.1.1 Σήματα που χρησιμοποιούνται για τη σήμανση επικίνδυνων υλικών.
Η χρήση των υλικών αυτών θα πρέπει να γίνεται με ατομικές αναπνευστικές μάσκες σε χώρο με
βιομηχανικό εξαερισμό φίλτρων, φορώντας ειδικά ανθεκτικά στα χημικά γάντια και στολές. Πρόκειται για
υλικά που από τη σύσταση τους χαρακτηρίζονται δηλητήρια και πρέπει να χρησιμοποιούνται με ειδικό
εξοπλισμό, αφού προκαλούν σοβαρές και μόνιμες βλάβες στο αναπνευστικό, στο ήπαρ, στα νεφρά,
εγκεφαλική νέκρωση κυττάρων, καρκινογενέσεις, κ.α. (Δρακόπουλος, 2007).
14.1.2.3.1 Εκτίμηση του Χημικού Κινδύνου
Σημαντικό βήμα στην προστασία της υγείας των εργαζομένων είναι η πλήρης ενημέρωση των ενδεχόμενων
κινδύνων. Για το σκοπό αυτό, είναι απαραίτητη η σύνταξη ενός καταλόγου ουσιών που χρησιμοποιούνται ή
που δημιουργούνται κατά τη συνήθη δραστηριότητα εντός του εργαστηρίου. Κατόπιν συλλέγονται
πληροφορίες για τις ουσίες αυτές, κυρίως από τα Δελτία Δεδομένων Ασφαλείας (Δ.Δ.Α.), που συνοδεύουν
κάθε χημική ουσία. Τα Δελτία αυτά εκδίδονται σύμφωνα με την οδηγία 91/155/ΕΟΚ (Υπουργική Απόφαση
378/94), όπου προβλέπεται η υποχρέωση παροχής δωρεάν πληροφοριών από τον παραγωγό, τον εισαγωγέα ή
το διανομέα προς το χρήστη. Στις πληροφορίες που δίνονται περιγράφονται λεπτομερώς οι πιθανοί κίνδυνοι
352
για τους χρήστες, τα ανώτατα επιτρεπτά όρια συγκέντρωσης της ουσίας στον αέρα και ο προστατευτικός
εξοπλισμός που πρέπει να χρησιμοποιείται.
Το επόμενο σημαντικό βήμα είναι να γίνει εκτίμηση του ποσού της έκθεσης στις χημικές ουσίες.
Για το σκοπό αυτό συνεκτιμούνται τα είδη των χημικών που χρησιμοποιούνται, η έκταση ή η συχνότητα της
έκθεσης των εργαζομένων, και προσδιορίζονται τα ανώτερα όρια έκθεσης (TLVs). Συνεκτιμάται η
συνδυαστική δράση ουσιών και οι σχετικοί κίνδυνοι, και γίνεται ιεράρχηση της σοβαρότητας των κινδύνων.
Κατόπιν συντάσσεται κατάλογος για τον κάθε χώρο εργασίας με τις προτεραιότητες για τη λήψη μέτρων
προστασίας της υγείας των εργαζομένων (Καναβάκης, 2007).
14.1.2.3.2 Μέτρα Προστασίας για την πρόληψη του Χημικού Κινδύνου (πρωτογενής πρόληψη)
 Πρώτη επιλογή για την αντιμετώπιση ενός κινδύνου για την υγεία και την ασφάλεια είναι η εξάλειψη της
ίδιας της πηγής του προβλήματος (η αποφυγή δημιουργίας σκόνης, καπνών, αερίων ή ατμών υιοθετώντας
μιαν άλλη παραγωγική διαδικασία, η αφαίρεση ή η αντικατάσταση μίας τοξικής ουσίας από μία λιγότερο
τοξική).
 Εάν η εξάλειψη δεν είναι εφικτή, απαιτούνται τεχνικά μέτρα ελέγχου της απελευθέρωσης των ουσιών
χρησιμοποιώντας τα κατάλληλα συστήματα γενικού ή τοπικού εξαερισμού ή κλειστά κυκλώματα παραγω-
γής.
 Εάν ακόμα και αυτή η επιλογή δεν επιφέρει δραστική μείωση των εκπομπών και παραμένουν σημαντικοί
κίνδυνοι έκθεσης για τους εργαζομένους, είμαστε υποχρεωμένοι να καταφύγουμε στα κατάλληλα μέσα
ατομικής προστασίας, δηλαδή σε προστατευτικές αναπνευστικές συσκευές-μάσκες, γάντια, γυαλιά, φόρ-
μες εργασίας, υποδήματα, κ.α.
Για την ασφαλή χρήση των χημικών όλα τα παρασκευαζόμενα αντιδραστήρια πρέπει να
σηματοδοτούνται, ενώ το προσωπικό του εργαστηρίου ακολουθεί τους εξής κανόνες:
 Φορά εργαστηριακή μπλούζα, προστατευτικά γυαλιά και γάντια κατά τη χρήση επικίνδυνων ουσιών και
προστατευτική μάσκα αναπνευστικού, όταν χρησιμοποιεί τοξικά αέρια.
 Χρησιμοποιεί απαγωγό και σιφώνια με μπαλονάκι (πουάρ), όταν εργάζεται με τοξικές ουσίες. Απαγορεύε-
ται η χρήση σιφωνίων με το στόμα.
 Δεν δοκιμάζει και δεν μυρίζει τα χημικά αντιδραστήρια.
14.1.2.4 Κώδικας Καλής Εργαστηριακής Πρακτικής

Ο «κώδικας καλής εργαστηριακής πρακτικής» αποτελεί το θεμέλιο για την ασφάλεια του Εργαστηρίου. Σε
αυτόν περιγράφονται οδηγίες ασφαλούς εργασίας μέσα στο εργαστήριο. Αποτελεί ένα σημαντικό
συμπλήρωμα των πρακτικών και των διαδικασιών που πρέπει να ακολουθούνται απαρέγκλιτα και αφορούν
στα εξής:
Α. Πρόσβαση
Η πρόσβαση στο Εργαστήριο επιτρέπεται μόνο στο εξουσιοδοτημένο προσωπικό, ενώ απαιτείται ευκρινής
σήμανση. Οι πόρτες του Εργαστηρίου παραμένουν κλειστές και δεν επιτρέπεται καμία πρόσβαση στα παιδιά
και στα κατοικίδια ζώα. Απαγορεύεται η φύλαξη και η κατανάλωση τροφών και ποτών και το κάπνισμα εντός
του Εργαστηρίου. Σημαντικό είναι επίσης, να υπάρχει σήμανση κάθε θέσης εργασίας, ανάλογα με τον
ενδεχόμενο κίνδυνο και ιδιαίτερη σήμανση των χώρων, όπου μπορεί να υπάρχουν επικίνδυνοι παθογόνοι
μικροοργανισμοί (Καναβάκης, 2007).
Β. Προσωπικός Προστατευτικός εξοπλισμός
Για την καθημερινή απασχόληση στα διαγνωστικά εργαστήρια, απαιτείται πάντα προστατευτικός ρουχισμός
για όποιον ευρίσκεται στο Εργαστήριο, συνήθως εργαστηριακή μπλούζα, την οποία απαγορεύεται να
χρησιμοποιούμε εκτός εργαστηρίου, όσο και να φυλάσσουμε σε ντουλάπια κοινού ρουχισμού, μαζί με τα
υπόλοιπα ρούχα. Ταυτόχρονα, απαγορεύεται η χρήση υποδημάτων που αφήνουν ακάλυπτα τα δάχτυλα των
ποδιών.
353
Απαιτούνται γάντια τα οποία πρέπει να απομακρύνονται με άσηπτη διαδικασία. Συνιστάται καλό
πλύσιμο των χεριών μετά από το πέρας κάθε εργασίας και πριν την αναχώρηση από το εργαστήριο.
Προστατευτικά γυαλιά και μάσκες προσώπου χρησιμοποιούνται, όταν το απαιτεί κάποια εργασία.
Γ. Διαδικασίες
Η οργάνωση της εργασίας μέσα σε ένα διαγνωστικό εργαστήριο πρέπει να είναι οργανωμένη με τέτοιο τρόπο,
ώστε να αποφεύγονται κατά το δυνατόν διαδικασίες που οδηγούν στη δημιουργία aerosols και στη διασπορά
σταγονιδίων. Πρέπει να αναφέρονται και να καταγράφονται οι ρυπάνσεις επιφανειών, τα ατυχήματα και οι
εκθέσεις σε μολυσματικά υλικά. Πρέπει να υπάρχει και να τηρείται γραπτή πολιτική απορρύπανσης η οποία
θα προβλέπει τις διαδικασίες και τον τρόπο εξουδετέρωσης. Τα τυχόν μολυσμένα υγρά πρέπει να
εξουδετερώνονται με φυσικές ή χημικές μεθόδους, πριν διατεθούν στην αποχέτευση και ενδεχομένως να
απαιτείται επεξεργασία αποβλήτων, ανάλογα με τα υλικά και την οδό αποβολής. Επίσης, πρέπει να
προβλεφθούν διαδικασίες, ώστε έγγραφα και έντυπα που εξέρχονται από το Εργαστήριο να προφυλάσσονται
από τυχόν ρύπανση και μόλυνση.
Δ. Εξοπλισμός και εργαστηριακή επίπλωση
Ο εξοπλισμός και η εργαστηριακή επίπλωση πρέπει να είναι σχεδιασμένοι κατάλληλα, ώστε να αποτρέπουν ή
να περιορίζουν την επαφή ανάμεσα στο χειριστή και το μολυσματικό υλικό. Αλλά και να διευκολύνει τη
συντήρηση, τον καθαρισμό και την απολύμανση. Στα ανοιγόμενα παράθυρα θα πρέπει να υπάρχουν δικτυωτά
πετάσματα για την προστασία από έντομα και αρθρόποδα.
Τα υλικά κατασκευής των εργαστηριακών επιφανειών πρέπει να είναι αδιάβροχα, ανοξείδωτα και ο
σχεδιασμός τους δεν πρέπει παρουσιάζει αιχμηρές ακμές και ανεξέλεγκτα κινούμενα μέρη.
Ε. Περιοχές εργασίας
Το εργαστήριο πρέπει να διατηρείται λιτό, καθαρό και ελεύθερο αχρήστων υλικών. Οι επιφάνειες εργασίας
πρέπει να καθαρίζονται μετά από κάθε τυχόν ρύπανση και στο τέλος της εργάσιμης ημέρας.
Όλα τα μολυσμένα υλικά και δείγματα πρέπει να συλλέγονται και να απομακρύνονται ασφαλώς,
στα προβλεπόμενα δοχεία και με τα απαραίτητα μέτρα ασφαλείας, καθημερινώς για αποτέφρωση. Η
συσκευασία και μεταφορά τους πρέπει να συμμορφώνεται με τα διεθνώς προβλεπόμενα.
14.1.2.5 Η χρήση της Φυγοκέντρου

Η χρήση της φυγοκέντρου αποτελεί ξεχωριστό παράγοντα κινδύνου στα διαγνωστικά εργαστήρια. Κατ’
αρχάς απαιτείται τήρηση των οδηγιών του κατασκευαστή για ικανοποιητική μηχανική επίδοση της
Φυγοκέντρου. Πλέον αυτού, πρέπει η τοποθέτηση της φυγοκέντρου να είναι σε μέρος που να εξασφαλίζει
οπτική επαφή με το εσωτερικό της. Το εσωτερικό της φυγοκέντρου (ρότορας και κάνιστρα) πρέπει να
επιθεωρείται για τυχόν ρύπανση, ρωγμές και οξείδωση και τα εξαρτήματα πρέπει να καθαρίζονται με
Αλκοόλη 70% (ποτέ με χλώριο!) και μετά από κάθε χρήση ακολουθεί στέγνωμα των κανίστρων ανάποδα.
Ακόμη γίνεται επιθεώρηση των θηκών των (πλαστικών) σωληναρίων για τυχόν βλάβες, ανισόμετρη
φόρτωση, υπερφόρτωση, ασφαλή πωματισμό, στάθμη υγρού σωληναρίων κ.λπ. και χρήση σφραγισμένων
κανίστρων ασφαλείας για επικίνδυνους μικροοργανισμούς.
14.1.2.6 Ιατρική παρακολούθηση

Η δευτερογενής και η τριτογενής πρόληψη των επαγγελματικών παθήσεων, εκτός από την τήρηση όλων των
κανόνων ασφαλείας, περιλαμβάνει και την παρακολούθηση των εργαζομένων από ειδικό γιατρό εργασίας και
τακτικό έλεγχο της υγείας με τις κατάλληλες εξετάσεις (Δρακόπουλος, 2007).
Ο έλεγχος της υγείας των εργαζομένων σε εργαστήρια περιλαμβάνει:
 τη λήψη ιατρικού και επαγγελματικού ιστορικού,
 τη διενέργεια κλινικών και εργαστηριακών εξετάσεων
 και τη δημιουργία ιατρικού φακέλου για κάθε εργαζόμενο.
354
Επιπλέον, πρέπει να γίνεται περιοδικός ειδικός έλεγχος των συστημάτων ή οργάνων στόχων με τον
ενδεδειγμένο κλινικό και εργαστηριακό έλεγχο, όπως φαίνεται στον Πίνακα 14.1.2.
Ιατρική Εργαστηριακές Μικροβιολογικές Λειτουργικές

Κατηγορία προσωπικού εξέταση εξετάσεις εξετάσεις εξετάσεις
Εργαζόμενοι στα ιατρεία, σε

σχετικές υπηρεσίες και Τετραετής Τετραετή Μετά από ατύχημα
γιατροί
Εργαζόμενοι σε βάρδιες Διετής Διετής Μετά από ατύχημα Διετής
Εργαζόμενοι στην
προετοιμασία των Ετήσια Ετήσια Μετά από ατύχημα Διετής
κυτταροστατικών
Εργαζόμενοι στα εργαστήρια Ετήσια Ετήσια Μετά από ατύχημα Διετής
Εργαζόμενοι εκτεθειμένοι
στον κίνδυνο ιοντίζουσας Ετήσια Ετήσια Μετά από ατύχημα Διετής
ακτινοβολίας
Διοικητικοί εργαζόμενοι
Τριετής -
εκτεθειμένοι στις οθόνες Διετής - πενταετής
πενταετής
οπτικής απεικόνισης
Πίνακας 14.1.2 Συχνότητα ιατρικών εξετάσεων των εργαζομένων σε εργαστήρια.
14.2 Διαχείριση Υγειονομικών Αποβλήτων - Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων

(ΑΥΜ)
14.2.1 Εισαγωγή
Η διαχείριση των αποβλήτων, που προέρχονται από υγειονομικές μονάδες, αποτελεί για τα ελληνικά αλλά και
τα διεθνή δεδομένα, αντικείμενο ιδιαίτερου υγειονομικού ενδιαφέροντος, επειδή η ελλιπής τήρηση των
κανόνων υγιεινής είναι δυνατόν να δημιουργήσει κινδύνους για το περιβάλλον και τη δημόσια υγεία. Η
ορθολογική διαχείριση των Αποβλήτων από Υγειονομικές Μονάδες (ΑΥΜ) αποτελεί αναγκαιότητα και
ταυτόχρονα προτεραιότητα και στην Ελλάδα, προκειμένου, αφ’ ενός μεν να εξασφαλίζεται και να
προστατεύεται το περιβάλλον και η δημόσια υγεία και αφ’ ετέρου να εφαρμόζεται η περιβαλλοντική πολιτική
της Ευρωπαϊκής Ένωσης (ΕΕ) στον τομέα αυτό, η οποία δίνει έμφαση στην πρόληψη και ελαχιστοποίηση της
παραγωγής και επικινδυνότητας των αποβλήτων.
Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει σημειωθεί στη διαχείριση των αποβλήτων των υγειονομικών
μονάδων τα τελευταία χρόνια, εξακολουθούν να υπάρχουν προβλήματα, η λύση των οποίων βρίσκεται
κυρίως στον έλεγχο και στη βελτίωση των μέτρων και των συνθηκών διαχείρισης των αποβλήτων και
λιγότερο στην κατασκευή νέων υποδομών.
Τα Υγειονομικά απόβλητα ή Ιατρικά απόβλητα ή Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων (όπως
αναφέρονται στον πρόσφατο νόμο), είναι υλικά που παράγονται ως αποτέλεσμα διαγνωστικών διαδικασιών,
θεραπευτικών χειρισμών, ανοσοποίησης ανθρώπων ή ζώων, ή από ερευνητικές δραστηριότητες σε αυτούς
τους τομείς. Τα υγειονομικά απόβλητα θεωρούνται εστία μολύνσεων και ως εκ τούτου θεωρείται ότι θα
πρέπει να αντιμετωπίζονται ως επικίνδυνα απόβλητα. Στην πραγματικότητα, μόνο ένα μικρό ποσοστό των
υγειονομικών αποβλήτων είναι μολυσματικά. Λανθασμένα θεωρείται, λοιπόν, πως, ότι χρήσιμο υλικό μπαίνει
στο νοσοκομείο, τελικά καταλήγει να βγαίνει ως απόβλητο. Η σωστή διαχείριση των υγειονομικών
αποβλήτων στοχεύει στην ελαχιστοποίηση της παραγόμενης ποσότητας των αποβλήτων διαμέσου της
πρόληψης παραγωγής, στην επαναχρησιμοποίηση και ανακύκλωση της μεγαλύτερης δυνατής ποσότητας και
355
στη διάθεση των τελικών υπολειμμάτων με τρόπο περιβαλλοντικά αποδεκτό. Με τον τρόπο αυτό
κατορθώνουμε τόσο την προστασία του περιβάλλοντος, όσο και τη μείωση του κόστους διαχείρισης.
Προϋπόθεση της ορθολογικής διαχείρισης των αποβλήτων υγειονομικών μονάδων (ΑΥΜ) αποτελεί
ο διαχωρισμός τους σε ομάδες, ώστε να διευκολύνεται η συλλογή, μεταφορά και διάθεσή τους με τον
κατάλληλο τρόπο, έτσι ώστε να λαμβάνονται όλα τα απαραίτητα μέτρα καθ’ όλη τη διαδρομή της διαχείρισης
των αποβλήτων των ΥΜ. Απαραίτητο, λοιπόν, είναι ένα σύγχρονο σχέδιο δράσης για την επεξεργασία των
διαφόρων αποβλήτων με οικολογικά υπεύθυνο τρόπο. Αυτό συμβάλλει στη μείωση του κόστους διαχείρισης,
στην προστασία του περιβάλλοντος, αλλά και στη μείωση του κινδύνου τόσο των ενδονοσοκομειακών
λοιμώξεων των ασθενών, όσο και του κινδύνου μετάδοσης μολύνσεων στο προσωπικό του Νοσοκομείου.
14.2.2 Είδη Αποβλήτων Υγειονομικών Μονάδων
Γενικά υπάρχει η προκατάληψη από τους αποδέκτες των ιατρικών αποβλήτων ότι τα ιατρικά απόβλητα πάντα
είναι μολυσματικά, ανεξάρτητα από την πηγή προέλευσης τους. Η προκατάληψη αυτή έχει ως αποτέλεσμα,
από τη μία την αυξημένη ποσότητα των μολυσματικών αποβλήτων προς αποστείρωση και από την άλλη τις
μειωμένες ποσότητες αποβλήτων αστικού χαρακτήρα. Η απάλειψη αυτής της προκατάληψης μπορεί να γίνει,
όπως αναφέρθηκε πριν, μέσω της εφαρμογής συστημάτων περιβαλλοντικής διαχείρισης και υγείας-
ασφάλειας, και μέσω της τακτικής εκπαίδευσης του προσωπικού. Περίπου το 90% των υγειονομικών
αποβλήτων που προέρχονται από τα νοσοκομεία είναι παρόμοιας φύσης με τα οικιακά απόβλητα και
απορρίπτονται, όπως όλα τα κοινά απορρίμματα (Φωτογραφίες 14.2.1, 14.2.2).
Φωτογραφία 14.2.1 Κάδος απόρριψης Αστικών Στερεών Αποβλήτων ΑΣΑ.
Φωτογραφία 14.2.2 Σήμανση κάδου ΑΣΑ.
356
Τα υπόλοιπα απόβλητα είναι μολυσματικά απόβλητα, (σύριγγες, αίμα, υλικά εργαστηρίου, μέρη του
σώματος και οργάνων). Για αυτά προβλέπονται από τη νομοθεσία ειδική επεξεργασία, ειδικά μέτρα φύλαξης,
μεταφοράς και ειδικοί τρόποι τελικής απόρριψης (Φωτογραφίες 14.2.3, 14.2.4).
Φωτογραφία 14.2.3 Κάδος απόρριψης Επικίνδυνων Αποβλήτων Υγειονομικών Μονάδων (ΕΑΥΜ).
Φωτογραφία 14.2.4 Σήμανση κάδου ΕΑΥΜ.
Συνολικά τα Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων ταξινομούνται στις εξής κατηγορίες:

Α. Αστικά Στερεά Απόβλητα (ΑΣΑ): Απόβλητα που προσομοιάζουν με οικιακά από την παρασκευή
φαγητών στις κουζίνες και από τις δραστηριότητες εστίασης, γυαλί, χαρτί, πλαστικό, μέταλλα, υλικά
συσκευασίας, άλλα μη επικίνδυνα υλικά.
Β. Επικίνδυνα Απόβλητα Υγειονομικών Μονάδων (ΕΑΥΜ)
Β1. Επικίνδυνα Απόβλητα Αμιγώς Μολυσματικά (ΕΑΑΜ): Κόπρανα και ούρα σπέρμα, κολπικές
εκκρίσεις, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, αρθρικό υγρό, πλευριτικό υγρό, περιτοναϊκό υγρό, περικάρδιο υγρό ή
αμνιακό υγρό.
Β2. Μεικτά Επικίνδυνα Απόβλητα (ΜΕΑ): Ανατομικά απόβλητα, από παθολογοανατομικά εργαστήρια,
πειραματόζωα, απόβλητα, από τμήματα όπου γίνονται χημειοθεραπείες, χρησιμοποιημένες συσκευασίες
ορών με κυτταροστατικά φάρμακα από ασθενείς στους οποίους εφαρμόζεται χημειοθεραπεία.
357
Β3. Άλλα Επικίνδυνα Απόβλητα (ΑΕΑ): Απόβλητα από την Υγειονομική Περίθαλψη Ανθρώπων ή
Ζώων ή/και από σχετικές έρευνες, όπως χημικές ουσίες που αποτελούνται από ή περιέχουν επικίνδυνες
ουσίες, αμαγάλματα οδοντιατρικής, απόβλητα που περιέχουν υδράργυρο, άλλα βαρέα μέταλλα,
επικίνδυνες οργανικές ενώσεις.
Γ. Ειδικά Ρεύματα Αποβλήτων: Ραδιενεργά, μπαταρίες, απόβλητα ηλεκτρικού και ηλεκτρονικού
εξοπλισμού, συσκευασίες με αέρια υπό πίεση κ.α. Απόβλητα έλαια, φίλτρα, έλαια εκροής από αντλίες κενού,
μονωτικά υλικά που περιέχουν αμίαντο, υλικά κατασκευών και κατεδαφίσεων.
Τα κριτήρια επιλογής της κατάλληλης μεθόδου επεξεργασίας υγειονομικών αποβλήτων εξαρτώνται
από το είδος και την ποσότητα των αποβλήτων, την αποτελεσματικότητα της μεθόδου που θα χρησιμοποιηθεί
και φυσικά το κόστος.
Η σωστή διαχείριση των ιατρικών αποβλήτων προϋποθέτει:
 το διαχωρισμό στη πηγή,
 τη συλλογή και τη συσκευασία,
 αποθήκευση, μεταφορά, επεξεργασία, ανακύκλωση, εντός του νοσηλευτικού ιδρύματος μέχρι την τελική
διάθεση,
 ανακύκλωση, θερμική επεξεργασία, ή υγειονομική ταφή.
Το σημαντικότερο βήμα της διαχείρισης των ΑΥΜ είναι ο διαχωρισμός τους σε ομάδες στο σημείο
παραγωγής τους δηλαδή στην πηγή. Η συλλογή των ΑΥΜ γίνεται σε ειδικά δοχεία ή σάκους (Φωτογραφίες
14.2.5 & 14.2.6). Οι υποδοχείς πρέπει να φέρουν ειδική σήμανση, ώστε με τρόπο σαφή και εύληπτο, να
γίνεται αντιληπτό από τους υπεύθυνους της διαχείρισης των αποβλήτων και να διευκολύνεται η συλλογή και
μεταφορά τους (Care Waste, 2014).
Φωτογραφία 14.2.5 Πλαστικός σάκος μολυσματικών απορριμμάτων με το αναγνωριστικό σήμα.
358
Φωτογραφία 14.2.6 Σήμανση: το σήμα του βιολογικού κινδύνου, ετικέτα με την ημερομηνία και την προέλευση των
αποβλήτων.
Λαμβάνοντας υπόψη την επεξεργασία που θα ακολουθήσει, γίνεται η τοποθέτηση των αποβλήτων
σε υποδοχείς αντίστοιχου χρώματος, (Πίνακας 14.2.1), ανάλογα με τη μέθοδο τελικής διάθεσης, καθώς και τα
ιδιαίτερα ποιοτικά χαρακτηριστικά τους.
Κατηγορία αποβλήτων ανάλογα

Τύπος περιέκτη Χρώμα και σήμανση περιέκτη
με το είδος επεξεργασίας τους
Αστικά Στερεά Απόβλητα Χρώμα: Μαύρο

Πλαστικές σακούλες
ΑΣΑ Χωρίς σήμανση
Πλαστικές, ανθεκτικές, Χρώμα: Κίτρινο
Προς αποστείρωση,
στεγανές σακούλες Σήμανση: «ΕΑΑΜ», το σήμα του βιολογικού κινδύνου,
Επικίνδυνα Απόβλητα
κατάλληλες για ετικέτα με την ημερομηνία και την προέλευση των
Αμιγώς Μολυσματικά ΕΑΑΜ
αποστείρωση αποβλήτων
Προς αποτέφρωση
Πλαστικές, ανθεκτικές, Χρώμα: Κόκκινο
Επικίνδυνα Απόβλητα
στεγανές σακούλες Σήμανση: «ΕΑΑΜ &ΜΕΑ », το σήμα του βιολογικού
Αμιγώς Μολυσματικά
κατάλληλες για κινδύνου, ετικέτα με την ημερομηνία και την προέλευση
ΕΑΑΜ & Μεικτά Επικίνδυνα
αποτέφρωση των αποβλήτων
Απόβλητα ΜΕΑ
Πίνακας 14.2.1 Συσκευασία αποβλήτων ανάλογα με τη μέθοδο τελικής διάθεσης.
Επιπλέον, τα επικίνδυνα απόβλητα απαιτούν μια διαδικασία τεκμηρίωσης (π.χ. απόδειξη διάθεσης και
σημείωση έκδοσης/αποδεικτικό έγγραφο συλλογής και τιμολόγιο).
Αιχμηρά αντικείμενα
Για τα αιχμηρά απορρίμματα προβλέπεται άκαμπτη και ανθεκτική συσκευασία μιας χρήσεως, η οποία πρέπει
να είναι κλειστή με οπή στο επάνω μέρος, ανθεκτική σε διαρροές στις πλευρές και στο κατώτατο σημείο,
χρωματισμένη κόκκινη ή κίτρινη, και φέρουσα την ένδειξη του βιοκινδύνου. Οι συσκευασίες τοποθετούνται
έτσι, ώστε να είναι προσιτές κατά τη χρήση και να παραμένουν κατακόρυφα, αφού δεν επιτρέπεται να
υπερχειλίσουν (Φωτογραφία 14.2.7).
359
Φωτογραφία 14.2.7 Δοχείο κατάλληλο για απόρριψη αιχμηρών απορριμμάτων.
14.2.3 Μεταφορά και προσωρινή αποθήκευση
Η μεταφορά των ΑΥΜ εντός της Υγειονομικής Μονάδας πρέπει να γίνεται με ειδικά μέσα και να τηρούνται
οι κανόνες υγιεινής και ασφάλειας, που προβλέπονται στον Εσωτερικό Κανονισμό Διαχείρισης ΑΥΜ της
υγειονομικής μονάδας. Η προσωρινή αποθήκευση των μολυσματικών αποβλήτων γίνεται σε ειδικούς χώρους
εντός της υγειονομικής μονάδας (Φωτογραφίες 14.2.8, 14.2.9).
Φωτογραφία 14.2.8 Μεταφορά των ΑΥΜ εντός της υγειονομικής μονάδας.
360
Φωτογραφία 14.2.9 Κάδοι μεταφοράς και προσωρινής φύλαξης των ΑΥΜ εντός της υγειονομικής Μονάδας.
Το νομοθετικό πλαίσιο προβλέπει συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα για την αποθήκευση των
αποβλήτων στις υγειονομικές μονάδες, αλλά και συγκεκριμένες προδιαγραφές των χώρων αποθήκευσης.
Επιτρέπεται φύλαξη σε ψυκτικό θάλαμο, για το πολύ 5 ημέρες σε θερμοκρασία ≤ 5ᵒC. Αν δεν υπάρχει
ψυκτικός θάλαμος, ο χρόνος αποθήκευσης δε θα πρέπει να υπερβαίνει τις 48 ώρες το χειμώνα και τις 24 ώρες
το καλοκαίρι. Στην περίπτωση αυτή, θα πρέπει κατά τη συνεργασία τους με τους διαχειριστές των
αποβλήτων, οι υγειονομικές μονάδες να ζητούν συχνότερες αποκομιδές, κάτι το οποίο βέβαια, ενδεχομένως
να αυξήσει το κόστος διαχείρισης (Care Waste, 2014).
14.2.4 Αποκομιδή
Η μεταφορά – αποκομιδή των υγειονομικών αποβλήτων εκτός υγειονομικής μονάδας, γίνεται με ειδικά
οχήματα τα οποία πρέπει να είναι κλειστά, στεγανά, με δυνατότητα ψύξης < 80ᵒC, χωρίς μηχανισμό
συμπίεσης (Φωτογραφία 14.2.10).
Φωτογραφία 14.2.10 Ειδικό όχημα αποκομιδής ΑΥΜ.
Τα απόβλητα συνοδεύονται από έγγραφο έντυπο με στοιχεία αναγνώρισης, αντίγραφα του οποίου
τηρούνται από τις αρμόδιες υπηρεσίες.
361
14.2.5 Επεξεργασία - διάθεση
Η επεξεργασία των νοσοκομειακών αποβλήτων απαιτεί ιδιαίτερη προσοχή και εφαρμογή ειδικών τεχνικών
διαχείρισης, ώστε να αποφευχθεί η πιθανότητα μόλυνσης και ατυχημάτων. Οι ποιο γνωστές τεχνολογίες που
χρησιμοποιούνται είναι η αποτέφρωση και η αποστείρωση, με τελική απόρριψη ως κοινά απορρίμματα.
Α. Αποτέφρωση
Είναι η διαδικασία ξηράς οξείδωσης των αποβλήτων σε υψηλές θερμοκρασίες, μεγαλύτερες των 900 οC, η
οποία μειώνει το οργανικό κλάσμα των αποβλήτων. Τα τελευταία χρόνια ωστόσο, βασικός προβληματισμός
για τη χρήσης της αποτέφρωσης, αποτελεί η ατμοσφαιρική ρύπανση που προκαλείται από τα απαέρια της
καύσης, τα οποία περιέχουν: HCl, βαρέα μέταλλα, διοξίνες/φουράνια, αιωρούμενα σωματίδια, μονοξείδιο του
άνθρακα, διοξείδιο του θείου, οξείδια του αζώτου, καθώς επίσης η παραγωγή τέφρας και ιπτάμενης τέφρας.
Β. Αποστείρωση
Αποστείρωση είναι η θερμική επεξεργασία των ΕΥΜ, ώστε σε αυτά να καταστραφεί κάθε είδος
μικροοργανισμού και οι σπόροι τους και τελικώς τα απόβλητα να εξομοιωθούν σε ό, τι αφορά στο
μικροβιακό τους φορτίο με τα οικιακά απορρίμματα (Φωτογραφία 14.2.11).
Η διαδικασία της αποστείρωσης με ατμό, ξεκινά με την εισαγωγή των μολυσματικών αποβλήτων σε
ερμητικά κλειστό δοχείο, όπου με τη βοήθεια πανίσχυρων περιστροφών ή τύμπανων, ανακατεύονται και
τεμαχίζονται, ώστε τελικά να συνθλιβούν. Ατμός εισέρχεται μέσα στο δοχείο (ή σε περιβάλλοντα χώρο,
ανάλογα της μεθόδου) για την αύξηση της θερμοκρασίας του δοχείου και τη μετατροπή των υγρών σε ατμό.
Μετά από διάστημα 20 λεπτών, τα απορρίμματα στο εσωτερικό του δοχείου αλλά και τα αντίστοιχα υγρά,
έχουν πλήρως εξυγιανθεί. Ακολουθεί το άνοιγμα της βαλβίδας εξόδου, αποσυμπίεση του δοχείου και τα
πλέον αποστειρωμένα υγρά οδηγούνται στην αποχέτευση, ενώ ταυτόχρονα συνεχίζεται η παροχή ατμού
μέχρις εξατμίσεως όλων των υγρών και της στεγανοποίησης του κάδου. Η διαδικασία τερματίζεται με το
άνοιγμα του δοχείου, ενώ, μέσω ειδικών εξαρτημάτων, τα απορρίμματα οδηγούνται στην έξοδο του δοχείου
και διατίθενται με τα λοιπά αστικά. Με τη μέθοδο της αποστείρωσης επιτυγχάνεται μείωση του όγκου των
αποβλήτων κατά 70-80% του αρχικού (Care Waste, 2014).
Ως προς την περιβαλλοντική συνέπεια της μεθόδου, οι μετρήσεις των αερίων εκπομπών δείχνουν
ότι, έπειτα από έναν πλήρη κύκλο αποστείρωσης στις συνηθισμένες θερμοκρασίες λειτουργίας, δεν υπάρχει
κανένας περιβαλλοντικός ή επιδημιολογικός κίνδυνος.
362
Φωτογραφία 14.2.11 Τα βασικά στάδια της αποστείρωσης.
Η επιλογή μεταξύ των δύο εναλλακτικών λύσεων είναι συνάρτηση διαφόρων παραγόντων αλλά και
του συνολικού κόστους που απαιτείται. Συνήθως, η αποστείρωση είναι πολύ πιο οικονομική λύση, αλλά
δυστυχώς, δεν είναι επαρκής για κάποιες κατηγορίες αποβλήτων, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 14.2.2.
363
Τεχνολογίες Είδος Αποβλήτων Χαρακτηριστικά της Μεθόδου
Μεικτά Επικίνδυνα Απόβλητα
Σημαντική μείωση του όγκου των αποβλήτων
(ΜΕΑ)
Σχεδόν πλήρης καταστροφή παθογόνων μικροοργανισμών
Αποτέφρωση Επικίνδυνα Απόβλητα Αμιγώς
Επεξεργασία μεγάλου εύρους ΕΑ
Μολυσματικά (ΕΑΑΜ)
Δυνατότητα ανάκτησης ενέργειας
Ορισμένες κατηγορίες Άλλων
Παράγονται αέριες εκπομπές
Επικίνδυνων Αποβλήτων (ΑΕΑ)
Απαιτείται η ξήρανση των επεξεργασμένων αποβλήτων, πριν
τη διάθεση
Αποστείρωση Μέθοδος κατάλληλη μόνο για τα
Τα επεξεργασμένα απόβλητα είναι δυνατό να διατεθούν σε
Αμιγώς Μολυσματικά (ΕΑΑΜ)
ΧΥΤΑ
Παράγονται υγρά απόβλητα και αέριες εκπομπές
Πίνακας 14.2.2 Χαρακτηριστικά των κύριων μεθόδων επεξεργασίας επικίνδυνων υγειονομικών αποβλήτων.
Είναι σαφές ότι ο σωστός διαχωρισμός στη πηγή μας δίνει τη δυνατότητα να χρησιμοποιήσουμε
διάφορους τρόπους διαχείρισης των αποβλήτων και μπορεί να μειώσει σημαντικά τον όγκο των αποβλήτων
που θα καταλήξουν στην αποτέφρωση συμβάλλοντας δυναμικά στην προστασία του περιβάλλοντος αλλά και
στη μείωση του συνολικού κόστους διαχείρισης. Για το λόγο αυτό, βασικό στοιχείο σχεδιασμού της
διαχείρισης αποτελεί η κατάρτιση εσωτερικού κανονισμού διαχείρισης ΑΥΜ. (Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων,
2015
Για την επίτευξη των ανωτέρω στόχων η ορθολογική διαχείριση όλων των κατηγοριών αποβλήτων
των ΥΜ προϋποθέτει την τήρηση και εφαρμογή των ισχυουσών νομοθετικών διατάξεων. Οι ποιο σημαντικές
από αυτές είναι:
1. Ο Νόμος 4042/2012 (ΦΕΚ 24 Α): «Ποινική προστασία του περιβάλλοντος − Πλαίσιο παραγωγής και δια-
χείρισης αποβλήτων κ.λπ.» έγινε η εναρμόνιση με την Αναθεωρημένη Οδηγία για τα απόβλητα
2008/98/ΕΚ.
2. Η ΚΥΑ οικ.146163/2012 (ΦΕΚ 1537 Β): «Μέτρα και Όροι για τη Διαχείριση Αποβλήτων Υγειονομικών
Μονάδων» αντικαθιστά την ΚΥΑ H.Π. 37591/2031/2003(ΦΕΚ 1419 Β) και αποσκοπεί στη βελτίωση του
θεσμικού πλαισίου διαχείρισης των ΑΥΜ και στην πλήρη συμβατότητα με την Οδηγία 2008/98 ΕΚ και το
Ν.4042/2012.
3. Η οικ.33312/4110/3.7.12 Απόφαση περί «Ειδικού Εθνικού Σχεδίου Διαχείρισης Επικίνδυνων Αποβλήτων
Υγειονομικών Μονάδων (ΕΣΔΕΑΥΜ), στοχεύει στην ανάπτυξη και εφαρμογή μιας ευέλικτης, οικονομικά
βιώσιμης και αποτελεσματικής πολιτικής στον τομέα της διαχείρισης των ΑΥΜ, προσαρμοσμένης στις
ανάγκες και τις ιδιαιτερότητες της χώρας. Αντικείμενο του ΕΣΔΕΑΥΜ αποτελεί κυρίως η διαχείριση των
επικινδύνων αποβλήτων που παράγονται από ΥΜ (ΕΑΥΜ) και ο χωρικός προσδιορισμός των κατάλλη-
λων εγκαταστάσεων για τη διαχείρισή τους.
14.2.6 Σχέδιο έκτακτης ανάγκης
Το Σχέδιο Έκτακτης Ανάγκης ενεργοποιείται, όταν συμβεί διασκορπισμός στερεών, υγρών

μολυσματικών ή άλλων επικίνδυνων ουσιών ή/και τραυματισμός. Για την αντιμετώπιση εκτάκτων αναγκών
αρμόδιος είναι ο Υπεύθυνος Διαχείρισης Ιατρικών Αποβλήτων, ο οποίος έχει το συντονισμό του συνόλου των
ενεργειών, ενημερώνει το Διευθυντή του Ιατρικού Εργαστηρίου, και συνεργάζεται με το συνεργείο
απολύμανσης. Για την αντιμετώπιση τέτοιων περιστατικών πρέπει να είναι διαθέσιμο και να ακολουθείται
εκτός από το σχέδιο έκτακτης ανάγκης και ο Εσωτερικός Κανονισμός λειτουργίας του εργαστηρίου. Επίσης
πρέπει να είναι διαθέσιμος ο απαραίτητος εξοπλισμός ώστε να μπορούν να εφαρμοστούν γρήγορα και με
ασφάλεια τα αναγκαία μέτρα (προστατευτικός ρουχισμός, μέσα συλλογής κ.λπ.).
Για τη σωστή αντιμετώπιση τέτοιων περιστατικών πρέπει να:

 καθαρίζονται και απολυμαίνονται (αν χρειάζεται) οι περιοχές που μολύνθηκαν,
 περιορίζεται όσο το δυνατό η έκθεση των εργαζομένων κατά τη διαδικασία καθαρισμού,
364
 περιορίζονται στο ελάχιστο δυνατό οι επιπτώσεις στους ασθενείς, στο προσωπικό της Υγειονομικής Μο-
νάδας, και στο περιβάλλον,
 εκπαιδεύεται διαρκώς το προσωπικό στην αντιμετώπιση έκτακτης ανάγκης.
Α. Διασκορπισμός επικίνδυνων ουσιών
Τα στοιχειώδη βήματα αντιμετώπισης περιστατικού με διασκορπισμένα επικίνδυνα υλικά είναι τα εξής:

1. Απομονώνουμε την προσβεβλημένη περιοχή.
2. Παρέχουμε πρώτες βοήθειες και ιατρική περίθαλψη αν υπάρχουν τραυματισμένα άτομα.
3. Προσδιορίζουμε τη φύση και τα χαρακτηριστικά των διασκορπισμένων ουσιών.
4. Ειδοποιούμε τον Υπεύθυνο Διαχείρισης Ιατρικών Αποβλήτων, ο οποίος θα συντονίσει τις απαιτούμενες
εργασίες.
5. Απομακρύνουμε όλα τα άτομα τα οποία δεν εμπλέκονται στις εργασίες καθαρισμού.
6. Παρέχουμε τα απαραίτητα μέσα ατομικής προστασίας στα άτομα που πραγματοποιούν τις εργασίες καθα-
ρισμού.
7. Εξουδετερώνουμε ή απολυμαίνουμε το διασκορπισμένο επικίνδυνο υλικό, εάν αυτό ενδείκνυται. Σε περί-
πτωση βιολογικών υλικών, η απολύμανση των επιφανειών μπορεί να γίνει με διάλυμα 5% υποχλωριώδους
νατρίου (αδιάλυτη οικιακή χλωρίνη) ή με διάλυμα 1000 ppm διχλωροϊσοκυανουρικού νατρίου (NaDCC) ή
με άλλα κοινά απολυμαντικά χώρου, σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Νοσοκομειακών Λοιμώξεων.
8. Περισυλλέγουμε όλα τα διασκορπισμένα υλικά. Τα αιχμηρά αντικείμενα δεν πρέπει να περισυλλέγονται
με τα χέρια. Πρέπει να χρησιμοποιείται ειδικός εξοπλισμός π.χ. λαβίδες, φτυάρια κ.α.
9. Καθαρίζουμε και απολυμαίνουμε την περιοχή, σκουπίζοντάς τη με απορροφητικά υλικά. Τα κατάλληλα
υλικά που χρησιμοποιούνται περιγράφονται στον Πίνακα 14.2.3. Πρέπει να χρησιμοποιείται μόνο η μία
πλευρά του απορροφητικού υλικού, ώστε να μην εξαπλωθεί η μόλυνση. Η απολύμανση πρέπει να γίνεται
από το λιγότερο προς το περισσότερο μολυσμένο τμήμα, με τακτικές αλλαγές των απορροφητικών υλι-
κών. Σε περίπτωση χυμένων υγρών, πρέπει να χρησιμοποιούνται στεγνά πανιά, ενώ σε περίπτωση δια-
σκορπισμένων στερεών υλικών, πανιά εμβαπτισμένα σε υδατικό διάλυμα (όξινο, βασικό ή ουδέτερο ανά-
λογα με την περίπτωση).
10. Τα επικίνδυνα υλικά και τα υλικά μιας χρήσεως, που χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό, πρέπει να
τοποθετούνται σε κατάλληλους υποδοχείς απορριμμάτων για την ειδική διαχείρισή τους.
11. Ξεπλένουμε με νερό την περιοχή και την περνάμε με στεγνά απορροφητικά πανιά.
12. Απολυμαίνουμε όσα εργαλεία χρησιμοποιήθηκαν για τον καθαρισμό.
13. Αφαιρούμε τον προστατευτικό ρουχισμό και τον απολυμαίνουμε.
Ενέργεια Απαραίτητα εργαλεία ή υλικά

Χειρισμός της διασκορπισμένης ουσίας Προστατευτικός εξοπλισμός
Περιορισμός της διασκορπισμένης ουσίας Απορροφητικά υλικά (π.χ. πετσέτες, πανιά, χαρτί κ.α.)
Για υγρά: απορροφητικό χαρτί, πριονίδια, προσροφητικός πηλός
Συλλογή της διασκορπισμένης ουσίας Για στερεά: λαβίδες, σκούπες, γάζες, φτυάρι
Υδράργυρος: σφουγγάρι υδραργύρου, αντλία κενού
Πλαστικές σακούλες (κόκκινη, κίτρινη η μαύρη, ανάλογα με την
Συσκευασία των αποβλήτων
περίσταση), περιέκτες αιχμηρών κ.α.
Για μολυσματικά υλικά: απολυμαντικά
Απολύμανση της περιοχής
Για επικίνδυνες τοξικές ουσίες: κατάλληλος διαλύτης ή νερό
Πίνακας 14.2.3 Απαραίτητα εργαλεία ή υλικά για τον χειρισμό διασκορπισμένης ουσίας.
Β. Τραυματισμός και έκθεση σε επικίνδυνη ουσία
Τα στοιχειώδη βήματα αντιμετώπισης τραυματισμού και έκθεσης σε επικίνδυνη ουσία είναι τα εξής:
1. Άμεση παροχή πρώτων βοηθειών, όπως καθαρισμός των πληγών και του δέρματος, και ξέπλυμα των μα-
τιών με καθαρό νερό. Αν τα μάτια έχουν προσβληθεί από κάποια διαβρωτική, χημική ουσία ολόκληρο το
πρόσωπο ξεπλένεται με άφθονο, καθαρό νερό στο νιπτήρα, με τα μάτια να ανοιγοκλείνουν διαρκώς επί
10-30 λεπτά της ώρας. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί σε τυχόν ανοικτές πληγές στο σώμα.
365
2. Σε περίπτωση τραυματισμού από αιχμηρό αντικείμενο, πρέπει να βοηθηθεί η αιμορραγία της πληγής και
η περιοχή κατόπιν πρέπει να καθαριστεί με καθαρό τρεχούμενο νερό.
3. Εξέταση του αντικειμένου που προκάλεσε το ατύχημα για ενδεχόμενη πρόκληση μόλυνσης.
4. Επιπρόσθετη ιατρική φροντίδα και παρακολούθηση από τον ιατρό εργασίας ή από το Τμήμα Επειγόντων
Περιστατικών.
5. Εξετάσεις αίματος ή άλλου είδους αν θεωρούνται απαραίτητες.
6. Άμεση αναφορά του συμβάντος στον Υπεύθυνο Νοσοκομειακών Λοιμώξεων
7. Καταγραφή του συμβάντος.
8. Διερεύνηση του συμβάντος και λήψη μέτρων για την αποφυγή παρόμοιων περιστατικών στο μέλλον.
Γ. Αναφορά ατυχημάτων και περιστατικών
Η αναφορά ατυχήματος γίνεται εγγράφως προς τον Υπεύθυνο Διαχείρισης Ιατρικών Αποβλήτων. Με τη
συμπλήρωση του έντυπου που περιγράφεται στον Πίνακα 14.2.4 ο υπεύθυνος Διαχείρισης Ιατρικών
Αποβλήτων διερευνάει τα αίτια του ατυχήματος, κρατάει αρχεία με τις έρευνες και τα μέτρα που λήφθηκαν
και λαμβάνει τα απαραίτητα μέτρα για να αποφευχθεί η επανάληψη παρόμοιου συμβάντος.
ΑΝΑΦΟΡΑ ΑΤΥΧΗΜΑΤΟΣ
ΠΡΟΣ ΤΟΝ ΥΠΕΥΘΥΝΟ ΔΙΑΧΕΙΡΙΣΗΣ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ
Φύση του συμβάντος Περιγραφή του περιστατικού
Τόπος συμβάντος Ακριβής αναφορά του σημείου
Χρόνος συμβάντος Ακριβής αναφορά του χρόνου
Άμεσα εμπλεκόμενο προσωπικό Ονόματα και εκπαίδευση προσωπικού
Αναλυτική περιγραφή των δράσεων και των
Ενέργειες για την αντιμετώπιση του συμβάντος
ιατρικών πράξεων που απαιτήθηκαν
Πίνακας 14.2.4 Παράδειγμα δελτίου αναφοράς ατυχήματος.
Γενικά, για να υπάρχει ένα αποτελεσματικό σύστημα διαχείρισης αποβλήτων, πρέπει να πληρούνται
κάποιες βασικές παράμετροι. Το προσωπικό πρέπει να συμμετέχει ενεργά στον διαχωρισμό των αποβλήτων
στη πηγή, αλλά και να γνωρίζει την ενδεδειγμένη διαδικασία για την τεκμηριωμένη αναφορά ατυχήματος ή
περιστατικού, που σχετίζεται με διασκορπισμό, διαρροή, λανθασμένο διαχωρισμό, αιχμηρά αντικείμενα κ.α.
Για την ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου συστήματος ορθής διαχείρισης υγειονομικών αποβλήτων,
χρειάζεται σωστός σχεδιασμός, αλλά και η ισχυρή θέληση της διοίκησης, που θα συμβάλλει στην έναρξη και
προώθηση των σχετικών δραστηριοτήτων. Ο σημαντικότερος όμως παράγοντας, είναι οι καλά ενημερωμένοι
και δραστήριοι εργαζόμενοι. Χωρίς τη συμμετοχή όλων των εμπλεκόμενων, κάθε σχέδιο ορθής διαχείρισης
είναι καταδικασμένο να αποτύχει.
366
Σχετικό οπτικό υλικό και ενημερωτικό υλικό από το διαδίκτυο
 http://www.carewaste.eu/images/Sumplhrwmatika_ylika/Best%20practises%20in%20healtcarewaste%20
management_gr.pdf (τελευταία προσπέλαση 25/2/2015).
 United States Environmental Protection Agency (1995):
http://www.epa.gov/ttn/chief/ap42/ch02/final/c02s03.pdf (τελευταία προσπέλαση 25/2/2015).
 United States Environmental Protection Agency: http://www.epa.gov/OCEPATERMS/
(http://europa.eu.int/comm/enterprise/chemicals/legislation/sds_en.htm (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
 NIOSH (National Institute of Occupational Safety and Health): Registry of Toxic Effects of Chemical
Substances: http://www.cdc.gov/niosh/homepage.html (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
 IARC (International Agency for Research on Cancer, Lyon, France), Carcinogenic substances
(http://ww.iarc.fr) (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
 EPA. Chemical Hazard Information Profile (CHIP): http://www.epa.gov (τελευταία προσπέλαση
1/9/2015).
 http://www.certh.gr/9DF52273.el.aspx (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
 http://www.mylabonline.com (τελευταία προσπέλαση 1/9/2015).
Χρήσιμα ακρωνύμια από οδηγούς διαχείρισης ιατρικών αποβλήτων
 ΑΙΑ: Άλλα Ιατρικά Απόβλητα

 ΕΕΑΕ: Ελληνική Επιτροπή Ατομικής Ενέργειας
 ΕΙΑ: Επικίνδυνα Ιατρικά Απόβλητα
 ΕΙΑ-ΜΤΧ: Επικίνδυνα Ιατρικά Απόβλητα Μολυσματικού και Τοξικού Χαρακτήρα
 ΕΙΑ-ΜΧ: Επικίνδυνα Ιατρικά Απόβλητα Μολυσματικού Χαρακτήρα
 ΕΙΑ-ΤΧ: Επικίνδυνα Ιατρικά Απόβλητα Τοξικού Χαρακτήρα
 ΕΝΛ: Επιτροπή Νοσοκομειακών Λοιμώξεων
 ΙΑ: Ιατρικά Απόβλητα
 ΙΑ-ΑΧ: Ιατρικά Απόβλητα Αστικού Χαρακτήρα. απόβλητα που προσομοιάζουν με οικιακά π.χ. γυαλί,
χαρτί, χαρτόνι, πλαστικό, μέταλλα, υλικά συσκευασίας, και άλλα μη επικίνδυνα υλικά.
 ΚΥΑ: Κοινή Υπουργική Απόφαση
 ΥΔΙΑ: Υπεύθυνος Διαχείρισης Ιατρικών Αποβλήτων
 ΧΥΤΑ: Χώρος Υγειονομικής Ταφής Απορριμμάτων
 ΧΥΤΕΑ: Χώρος Υγειονομικής Ταφής Επικίνδυνων Απορριμμάτων
Νομοθεσία
1. Επιτροπή Διαχείρισης Ιατρικών Αποβλήτων, ΓΝΘ «Αγ. Παύλος». Εσωτερικός Κανονισμός Διαχείρισης
Ιατρικών Αποβλήτων Επικίνδυνων και Μη. 2004.
2. Ν. 2203/1994 ΦΕΚ 58/Α/15-04-1994. Κύρωση της Σύμβασης της Βασιλείας για τον έλεγχο των διασυ-
νοριακών κινήσεων επικίνδυνων αποβλήτων και της επεξεργασίας τους.
3. ΚΥΑ 5673 /400/97 Οδηγία 91/271 για την επεξεργασία των αστικών λυμάτων
4. ΚΥΑ 114218/1997 (ΦΕΚ 1016 B) «Κατάρτιση πλαισίου Προδιαγραφών και γενικών προγραμμάτων
διαχείρισης στερεών αποβλήτων»
5. ΟΔΗΓΙΑ 98/15/ΕΚ για τροποποίηση της οδηγίας 91/271/ΕΟΚ όσον αφορά ορισμένες απαιτήσεις οι
οποίες καθορίζονται στο Παράρτημα Ι αυτής.
6. Κοινή Υπουργική Απόφαση υπ' αριθ. 1014(ΦΟΡ) 94, ΦΕΚ 216/Β/6-3-2001 "Έγκριση Κανονισμών
Ακτινοπροστασίας".
7. Ν. 2939/2001 (ΦΕΚ 179/Α/06.08.2001) «Συσκευασίες και εναλλακτική διαχείριση των συσκευασιών
άλλων προϊόντων – Ίδρυση Εθνικού Οργανισμού Εναλλακτικής Διαχείρισης Συσκευασιών και άλλων
Προϊόντων (ΕΟΕΔΣΑΠ) και άλλες διατάξεις», όπως τροποποιήθηκε με το Ν. 3854/10 (ΦΕΚ
94/Α/23.06.2010) «Τροποποίηση της νομοθεσίας για την εναλλακτική διαχείριση των συσκευασιών και
367
άλλων προϊόντων και τον Εθνικό Οργανισμό Εναλλακτικής Διαχείρισης Συσκευασιών και Άλλων Προ-
ϊόντων (Ε.Ο.Ε.Δ.Σ.Α.Π.) και άλλες διατάξεις» και το Ν.4042/2012.
8. ΚΥΑ 29407/3508/2002 (ΦΕΚ 1572 B) «Μέτρα και όροι για την υγειονομική ταφή των αποβλήτων»,
προς ενσωμάτωση της Οδηγίας 1999/31/ΕΚ
9. ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 1774/2002 ΤΟΥ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΥ ΚΟΙΝΟΒΟΥΛΙΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΜ-
ΒΟΥΛΙΟΥ της 3 Οκτωβρίου 2002 για τον καθορισμό υγειονομικών κανόνων σχετικά με τα ζωικά υπο-
προϊόντα που δεν προορίζονται για κατανάλωση από τον άνθρωπο.
10. ΚΥΑ με αρ. 50910/2727/2003 «Μέτρα και Όροι για τη Διαχείριση Στερεών Αποβλήτων. Εθνικός και
Περιφερειακός Σχεδιασμός Διαχείρισης», όπως έχει τροποποιηθεί με το Ν. 4042/2012
11. ΟΔΗΓΙΑ 2004/12/ΕΚ ΤΟΥ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΥ ΚΟΙΝΟΒΟΥΛΙΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΜΒΟΥΛΙΟΥ της 11ης
Φεβρουαρίου 2004 που τροποποιεί την οδηγία 94/62/ΕΚ για τις συσκευασίες και τα απορρίμματα συ-
σκευασίας.
12. ΚΥΑ 22912/1117/2005 (ΦΕΚ 759 B) «Μέτρα και όροι για την πρόληψη και τον περιορισμό της ρύπαν-
σης του περιβάλλοντος από την αποτέφρωση των αποβλήτων», προς ενσωμάτωση της Οδηγίας
2000/76/ΕΚ,
13. ΚΥΑ 13588/725/2006 «Μέτρα, όροι και περιορισμοί για τη διαχείριση επικινδύνων αποβλήτων σε συμ-
μόρφωση με τις διατάξεις της οδηγίας 91/689/ΕΟΚ «για τα επικίνδυνα απόβλητα» του Συμβουλίου της
12ης Δεκεμβρίου 1991», όπως έχει τροποποιηθεί με το Ν. 4042/2012 και
14. Κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1907/2006 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του Συμβουλίου, της 18ης Δε-
κεμβρίου 2006, για την καταχώριση, την αξιολόγηση, την αδειοδότηση και τους περιορισμούς των χημι-
κών προϊόντων (REACH) και για την ίδρυση του Ευρωπαϊκού Οργανισμού Χημικών Προϊόντων.
15. Κανονισμός (ΕΚ) 1013/2006 Για τις μεταφορές αποβλήτων, όπως έχει τροποποιηθεί, συμπληρωθεί και
ισχύει.
16. ΚΥΑ 24944/1159 ΦΕΚ 791/Β/30-06-2006 κοινή υπουργική απόφαση «‘Έγκριση Γενικών Τεχνικών
Προδιαγραφών για τη διαχείριση επικινδύνων αποβλήτων»
17. ΚΥΑ 8668/2007 (ΦΕΚ 287/Β), με την οποία εγκρίνεται ο Εθνικός Σχεδιασμός διαχείρισης επικίνδυνων
αποβλήτων.
Νοεμβρίου 2008
19. για τα απόβλητα και την κατάργηση ορισμένων οδηγιών
Νοεμβρίου 2008.
21. ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΚ) αριθ. 1272/2008 ΤΟΥ ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΥ ΚΟΙΝΟΒΟΥΛΙΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΣΥΜ-
ΒΟΥΛΙΟΥ της 16ης Δεκεμβρίου 2008 για την ταξινόμηση, την επισήμανση και τη συσκευασία των ου-
σιών και των μειγμάτων, την τροποποίηση και την κατάργηση των οδηγιών 67/548/EΟΚ και
1999/45/EΚ και την τροποποίηση του κανονισμού (EΚ) αριθ. 1907/2006Ν.
22. Ν. 4014/2011 ΦΕΚ 209/Α/ 21-09-2011 Περιβαλλοντική αδειοδότηση έργων και δραστηριοτήτων, ρύθ-
μιση αυθαιρέτων σε συνάρτηση με δημιουργία περιβαλλοντικού ισοζυγίου και άλλες διατάξεις αρμοδιό-
τητας Υπουργείου Περιβάλλοντος.
23. ΥΑ 1958 13-01-2012 «Κατάταξη δημόσιων και ιδιωτικών έργων και δραστηριοτήτων σε κατηγορίες και
υποκατηγορίες σύμφωνα με το Άρθρο 1 παράγραφος 4 του Ν. 4014/2011 (Φ.Ε.Κ. Α΄209/2011)»
24. Αριθμ. 20741 (1) Τροποποίηση της 1958/13−1−2012 ΦΕΚ 1565/2012 απόφασης του Υπουργού Περι-
βάλλοντος, Ενέργειας και Κλιματικής Αλλαγής «Κατάταξη δημόσιων και ιδιωτικών έργων και δραστη-
ριοτήτων σε κατηγορίες και υποκατηγορίες σύμφωνα με το άρθρο 1 παράγραφος 4 του Ν.
4014/21.09.2011 (Α΄ 209)» (Β΄ 21).
25. Ν.4042/2012 (ΦΕΚ 24/Α/13-2-2012) «Ποινική Προστασία του περιβάλλοντος – Εναρμόνιση με την Ο-
δηγία 2008/99/ΕΚ – Πλαίσιο παραγωγής και διαχείρισης αποβλήτων – Εναρμόνιση με την Οδηγία
2008/98/ΕΚ – Ρύθμιση θεμάτων Υπουργείου Περιβάλλοντος Ενέργειας και Κλιματικής Αλλαγής» που
ενσωματώνει στο εθνικό δίκαιο την οδηγία-πλαίσιο 2008/98/ΕΕ για τα απόβλητα.
26. Υ.Α.οικ.146163/2012 ΦΕΚ 1537Β/08-05-2012. Μέτρα και όροι για τη διαχείριση αποβλήτων υγειονο-
μικών μονάδων που εκδόθηκε κατ’ εξουσιοδότηση του άρθρου 38, παρ. 7 του ν. 4042/2012.
27. Υπουργική απόφαση οικ.33312/4110 03-07-2012 Ειδικό Εθνικό Σχέδιο Διαχείρισης Επικίνδυνων Απο-
βλήτων Υγειονομικών Μονάδων: http://www.ypeka.gr
28. Υ.Α. 52167/4683/2012 ΦΕΚ 37Β. Προσαρμογή της ελληνικής νομοθεσίας προς τις διατάξεις της οδηγί-
ας 61/2010/ΕΕ της Επιτροπής της 2ης Σεπτεμβρίου 2010 για την πρώτη προσαρμογή στην επιστημονική
368
και τεχνική πρόοδο των παραρτημάτων της οδηγίας 2008/68/ΕΚ του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του
Συμβουλίου, σχετικά με τις εσωτερικές μεταφορές επικίνδυνων εμπορευμάτων
29. ΕΓΚΥΚΛΙΟΣ ΟΙΚ. 29960/3800 15-06-2012 Ενδεικτικές κατηγορίες Αποβλήτων Υγειονομικών Μονά-
δων (ΑΥΜ) -Ενδεικτικές κατάλληλες εργασίες διαχείρισης ΑΥΜ – Διευκρινίσεις επί ορισμένων απαι-
τήσεων της ΚΥΑ οικ.146163/2012.
30. ΥΠΟΥΡΓΙΚΗ ΑΠΟΦΑΣΗ ΟΙΚ. 33312/4110 03-07-2012 Ειδικό Εθνικό Σχέδιο Διαχείρισης Επικίνδυ-
νων Αποβλήτων Υγειονομικών Μονάδων (ΕΣΔΕΑΥΜ)
31. ΕΥΡΩΠΑΪΚΟΣ ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΠΟΒΛΗΤΩΝ (ΕΚΑ), σύμφωνα με το Παράρτημα της Απόφασης
2002/532/ΕΚ, όπως έχει τροποποιηθεί με τις Αποφάσεις 2001/118/ΕΚ, 2001/119/ΕΚ και 2001/573/ΕΚ
της Επιτροπής Ε.Κ.
32. ISO 14001:2004. Environmental management systems--Requirements with guidance for use.
http://www.iso.org
33. EMAS, EUROPEAN ECO-MANAGEMENT AND AUDIT SCHEME:
http://ec.europa.eu/environment/emas index_en.htm.
34. REACH. Registration, evaluation and authorization of chemicals. http://www.prc.cnrs-
gif.fr/reach/el/home.html.
Αναφορές
1. ΔΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ, Β. (2007) Ο Βιολογικός κίνδυνος στο νοσοκομειακό περιβάλλον Έκδοση του Κέντρου
Υγείας και Υγιεινής της Εργασίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Υγιεινής και Ασφάλειας της Εργασίας Α-
θήνα: ΕΛΙΝΥΑΕ.
2. ΔΡΑΚΟΠΟΥΛΟΣ, Β. & ΔΡΙΒΑΣ, Σ. (2007) Υγεία και ασφάλεια στους χώρους εργασίας των νοσοκομείων.
Aθήνα: ΕΛΙΝΥΑΕ.
3. ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ: Νομοθεσία για τα εργαστηριακά απόβλητα
http://users.uoi.gr/deapi/index.files/Page1192.htm, προσπελάθηκε στις 1/9/2015.
4. ΤΟΥΚΑΣ, Δ., ΛΟΓΟΘΕΤΙΔΗΣ, Μ. (2007) Υγιεινή και ασφάλεια των εργαζομένων σε διαγνωστικά-
ερευνητικά μικροβιολογικά εργαστήρια (Μέρος Α΄): βασικές αρχές προστασίας των εργαζομένων από το
βιολογικό κίνδυνο - κίνδυνοι προερχόμενοι από αιχμηρά αντικείμενα. Υγιεινή και ασφάλεια της εργασίας,
32, p. 25-7.
5. ΚΑΝΑΒΑΚΗΣ, Ε. & ΚΕΚΟΥ-ΛΙΟΛΙΤΣΑ Κ. (2007) Πρακτικός οδηγός κανόνων ασφαλείας και υγιεινής
σε βιο-ιατρικό εργαστηριακό χώρο. Αθήνα: Ιατρικές εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδη.
6. CARE WASTE (2011-2014) Oδηγός για τη διαχείριση των γενικών και υγειονομικών αποβλήτων
http://www.care-waste.eu/images/Book_images_gr/ebook_final_gr.pdf Συγγραφείς: Anastasia Xydeas-
Kikemenis (NSPH, GR), Giorgos Dounias (NSPH, GR), Maya Kitanova (Biognosis, GR) Σύνταξη & Σχε-
διασμός: Maya Kitanova, Zoi Georgiou Συντονισμός: Zoi Georgiou.
7. PRÜSS, A., et al. (1999) Safe Management of wastes from health-care activities. Geneva: World Health
Organization, 1999.
8. PRÓSS, A., TOWNEND, WK. (1998) Management of wastes from health-care activities. Geneva: World
Health Organization.
9. RUSHBROOK, P., et al. (2000) Starting health care waste management in medical institutions. A practi-
cal approach. Health Care Waste Management Practical Information Series, No 1, Copenhagen: World
Health Organization, Regional Office for Europe.
10. ZGHONDI, R. (2002) Basic steps in the preparation of health care waste management plans for health
care establishments Regional Office for the Eastern Mediterranean, World Health Organization.
369
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ/ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΗΣ
Κεφάλαιο 1ο
1.1 Οι όροι «Βαθμονόμηση» και «Διακρίβωση», αντιστοιχούν στον αγγλικό όρο «Calibration» (μία
σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
1.2 Οι βαθμονομητές είναι διαλύματα που προσομοιάζουν με τα προς ανάλυση δείγματα. Στην κλινική
χημεία, είναι διαλύματα αποκλειστικά με βάση το ανθρώπινο αίμα (μία σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
1.3 Η μέθοδος προσθήκης γνωστής ποσότητας απαιτεί γραμμική σχέση της καμπύλης βαθμονόμησης
και υποχρεωτική διέλευσή της από αρχή αξόνων (a = 0) (μία σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
1.4 Ο έλεγχος καμπύλης βαθμονόμησης ή αναφοράς περιλαμβάνει: (μία σωστή απάντηση).

Α. Εάν είναι γραμμική ή όχι και εάν όχι ποιάς μορφής είναι.
Β. Ποια είναι η καλύτερη ευθεία που πρέπει να χαραχθεί;
Γ. Ποια είναι η γραμμική περιοχή (περιοχή εργασίας);
Δ. Ποιο είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης των παραμέτρων της τομής και της κλίσεως της ευθείας;
Ε. Ποιο είναι το σφάλμα και τα όρια εμπιστοσύνης στην προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου που
λαμβάνεται από την καμπύλη βαθμονόμησης;
ΣΤ. Όλα τα παραπάνω
1.5 Το όριο ανίχνευσης ή αναλυτική ευαισθησία (Analytical Sensitivity) μιας μεθόδου είναι μια
συγκέντρωση μιας παραμέτρου, που μπορεί να ανιχνευθεί «αξιόπιστα» από τη μέθοδο αυτή (μία σωστή
απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
2.1 Εάν κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό τελικού σημείου ενός κλινικού αναλύτη χρησιμοποιηθεί
κυψελίδα κατά τη φωτομέτρηση του αγνώστου με μήκος οπτικής διαδρομής το υποδιπλάσιο σε σχέση
με την κυψελίδα του προτύπου, η προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου … (μία σωστή
απάντηση).
Α. Θα είναι ψευδώς αυξημένη
Β. Θα είναι ψευδώς μειωμένη
Γ. Δεν θα επηρεαστεί
2.2 Εάν κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό τελικού σημείου ενός κλινικού αναλύτη δεν
χρησιμοποιηθούν οι προτεινόμενοι στο πρωτόκολλο όγκοι, αλλά διπλάσιος όγκος ταυτόχρονα για το
αντιδραστήριο εργασίας και τον ορό και πρότυπο, η προσδιοριζόμενη συγκέντρωση του αγνώστου (μία
σωστή απάντηση):
Α. θα είναι ψευδώς αυξημένη
Β. θα είναι ψευδώς μειωμένη
Γ. δε θα επηρεαστεί
370
2.3 Εάν κατά το φωτομετρικό προσδιορισμό τελικού σημείου ενός κλινικού αναλύτη η απορρόφηση του
τυφλού είναι υψηλότερη μίας ανώτατης τιμής οριζόμενης από το πρωτόκολλο τότε (πολλαπλές σωστές
απαντήσεις):
Α. Αυτό πιθανόν να αποτελεί ένδειξη αλλοίωσης του αντιδραστηρίου εργασίας
Β. Αυτό πιθανόν να αποτελεί ένδειξη επιμόλυνσης του τυφλού με κλινικό δείγμα
Γ. Απαιτείται επανάληψη του τυφλού, αλλά όχι του δείγματος
Δ. Απαιτείται επανάληψη του τυφλού, αλλά και του δείγματος
2.4 Εάν μετά την επανάληψη του τυφλού, σύμφωνα με το παραπάνω εξακολουθήσει η απορρόφηση του
τυφλού είναι να υψηλότερη μίας ανώτατης τιμής οριζόμενης από το πρωτόκολλο τότε (πολλαπλές
σωστές απαντήσεις):
Α. Απορρίπτεται το αντιδραστήριο εργασίας
Β. Απαιτείται επανάληψη του τυφλού, αλλά όχι του δείγματος, χρησιμοποιώντας νέο αντιδραστήριο εργασίας
Γ. Απαιτείται επανάληψη του τυφλού, αλλά και του δείγματος, χρησιμοποιώντας νέο αντιδραστήριο εργασίας
2.5 Στο παρακάτω σχήμα δίνεται το φάσμα απορρόφησης της χολερυθρίνης (πράσινη καμπύλη),
αιμολυμένου ορού (κίτρινη καμπύλη) και λιπαιμικού ορού (γκρι καμπύλη). Εξηγήστε εάν ο
προσδιορισμός της χολερυθρίνης είναι δυνατός σε λιπαιμικό ή αιμολυτικό κλινικό δείγμα και
αναφέρετε τρόπους αντιμετώπισης πιθανόν παρεμβολών (ανοιχτή απάντηση).
3.1 Θεωρήστε ότι κατά τον προσδιορισμό κάποιου ενζύμου με κλινικό ενδιαφέρον το εργαστήριο σας δε
διαθέτει κυψελίδα με μήκος διαδρομής ακτινοβολίας διαμέσου του διαλύματος σύμφωνα με τη
σύσταση του πρωτοκόλλου, αλλά διπλάσιο αυτής. Για να υπολογίσετε τη συγκέντρωση του ενζύμου θα
πρέπει να πολλαπλασιάσετε την υπολογιζόμενη μέση ΔΑ/Δt με (μία σωστή απάντηση):
Α. τον συντελεστή μετατροπής που αναφέρεται στο πρωτόκολλο
Β. συντελεστή μετατροπής διπλάσιο αυτού που αναφέρεται στο πρωτόκολλο
Γ. συντελεστή μετατροπής υποδιπλάσιο αυτού που αναφέρεται στο πρωτόκολλο
3.2 Θεωρήστε ότι κατά τον προσδιορισμό κάποιου ενζύμου με κλινικό ενδιαφέρον το εργαστήριο σας δε
διαθέτει τον κατάλληλο εξοπλισμό ώστε να ληφθούν οι αναφερόμενοι από το πρωτόκολλο όγκοι
αντιδραστηρίου εργασίας και ορού. Λαμβάνονται τελικά οι διπλάσιοι όγκοι αντιδραστηρίου εργασίας
και ορού, σε σχέση με τους προτεινόμενους, οπότε (μία σωστή απάντηση):
371
A. H υπολογιζόμενη μέση ΔΑ/Δt δεν μεταβάλλεται
Β. H υπολογιζόμενη μέση ΔΑ/Δt είναι ψευδώς αυξημένη
Γ. Ο συντελεστής μετατροπής γίνεται διπλάσιος αυτού που αναφέρεται στο πρωτόκολλο
Δ. Η ενζυμική συγκέντρωση που υπολογίζεται σύμφωνα με τις οδηγίες του πρωτοκόλλου δεν μεταβάλλεται.
Ε. Απαντήσεις Α και Δ
ΣΤ. Απαντήσεις Α και Γ
3.3 Θεωρήστε ότι κατά τον προσδιορισμό κάποιου ενζύμου με κλινικό ενδιαφέρον η δραστικότητα του
ενζύμου είναι εκτός των ορίων γραμμικότητας της μεθόδου. Θα πρέπει να … (μία σωστή απάντηση).
Α. Αραιώσετε το δείγμα με φυσιολογικό ορό π.χ. σε αναλογία 1:10,να επαναλάβετε τον προσδιορισμό στο
αραιωμένο δείγμα και να πολλαπλασιάσετε την υπολογιζόμενη συγκέντρωση επί 10
Β. Αραιώσετε το δείγμα με φυσιολογικό ορό π.χ. σε αναλογία 1:10, οπότε και η μέση ΔΑ/Δt θα
υποδεκαπλασιαστεί
Γ. Αραιώσετε το δείγμα με φυσιολογικό ορό π.χ. σε αναλογία 1:10, οπότε και η μέση ΔΑ/Δt θα
υποδεκαπλασιαστεί και να πολλαπλασιάσετε την υπολογιζόμενη συγκέντρωση επί 10
3.4 Τα σκεύη που χρησιμοποιούνται κατά τον προσδιορισμό κάποιου κλινικού ενζύμουμε κινητική
μέθοδο βασιζόμενη στη οξείδωση του συνενζύμου NAD(P)H θα πρέπει να είναι πάρα πολύ καθαρά διότι
(μία σωστή απάντηση):
A. Το NAD(P)H είναι εξαιρετικά ευαίσθητο σε οξειδωτικούς παράγοντες, παρουσία των οποίων το
αποτέλεσμα του προσδιορισμού θα είναι ψευδώς αυξημένο
Β. Το NAD(P)H είναι εξαιρετικά ευαίσθητο σε οξειδωτικούς παράγοντες, παρουσία των οποίων το
αποτέλεσμα του προσδιορισμού θα είναι ψευδώς μειωμένο
Γ. Οποιαδήποτε επιμόλυνση που απορροφά στα 340 nm θα προκαλεί ψευδώς αυξημένο αποτέλεσμα
προσδιορισμού
Δ. Οποιαδήποτε επιμόλυνση που απορροφά στα 340 nm θα προκαλεί ψευδώς μειωμένο αποτέλεσμα
προσδιορισμού
3.5 Σας δίνεται ότι η χολερυθρίνη απορροφάει στο UV/Vis στα 360 - 515 nm. Θεωρήστε ότι ο
προσδιορισμός κάποιου μη ενζυμικού βιοχημικού αναλύτη βασίζεται στην παραγωγή χρωμοφόρου που
απορροφά στα 390 - 500 nm. Εάν ο αναλύτης θα πρέπει να αναλυθεί σε δείγματα ορού ικτερικών
ασθενών η προτιμώμενη αναλυτική μεθοδολογία είναι η κινητική μέθοδος διότι (μία σωστή απάντηση):
Α. Σε μία μέθοδο τελικού σημείου θα απαιτούνταν η χρήση τυφλού διαφορετικού για κάθε ασθενή
Β. Μία μέθοδος τελικού σημείου που θα έτρεχε χωρίς το κατάλληλο τυφλό θα έδινε είτε ψευδώς αυξημένο
είτε ψευδώς μειωμένο αποτέλεσμα συγκέντρωσης του αναλύτη στα δείγματα
Γ. Η υπολογιζόμενη συγκέντρωση με την κινητική μέθοδο δεν επηρεάζεται από την παρουσία χολερυθρίνης.
Δ. Απαντήσεις Α, Β, Γ
4.1 Το φυσιολογικό pH του αρτηριακού αίματος είναι: (πολλαπλές σωστές απαντήσεις).
Α. Ελαφρώς βασικό
Β. Ελαφρώς όξινο
Γ. Ισχυρά βασικό
Δ. Ισχυρά όξινο
Ε. Κυμαίνεται μεταξύ 7.35 και 7.45
4.2 Ποιο τελικό προϊόν του κυτταρικού μεταβολισμού επηρεάζει το pH του αίματος (μία σωστή
απάντηση);
Α. To Ο2
Β. Το CO2
Γ. Τα ιόντα Η+
372
Δ. Το H2O
4.3 Εάν υπάρχει περίσσεια βάσης στον οργανισμό τα επίπεδα των διττανθρακικών θα είναι (μία
Α. Υψηλότερα των φυσιολογικών
Β. Χαμηλότερα των φυσιολογικών
Γ. Αμετάβλητα
4.4 Εάν υπάρχει απώλεια βάσης στον οργανισμό τα επίπεδα των διττανθρακικών θα είναι (μία σωστή
απάντηση).
Α. Υψηλότερα των φυσιολογικών
Β. Χαμηλότερα των φυσιολογικών
Γ. Αμετάβλητα
4.5 Τι μετράει ο κορεσμός οξυγόνου (μία σωστή απάντηση):

Α. Το ποσό του οξυγόνου που είναι διαλυμένο στο αίμα
Β. Το συνολικό ποσό της αιμοσφαιρίνης στο αίμα
Γ. Το ποσοστό της συνδεδεμένης με οξυγόνο αιμοσφαιρίνης, ως προς το συνολικό ποσό της
αιμοσφαιρίνης
4.6 Το ποσό του διαλυμένου οξυγόνου στο αίμα (πολλαπλές σωστές απαντήσεις):
A. Μετράται με προσδιορισμό της PO2
B. Μετράται με προσδιορισμό3 της [HCO3-]
Γ. Αποτελεί ένδειξη της οξεοβασικής ισορροπίας του ασθενούς
Δ. Αποτελεί ένδειξη της ικανότητας των πνευμόνων να οξυγονώνουν το αίμα
4.7 Η διάγνωση διαταραχών της οξεοβασικής ισορροπίας βασίζεται (πολλαπλές σωστές απαντήσεις):
Α. Στον προσδιορισμό της PO2
B. Στον προσδιορισμό της PCO2
Γ. Στον προσδιορισμό του pH
4.8. Μετατρέποντας την τιμή της PCO2 = 5,0 kPa σε mm Hg λαμβάνουμε τιμή (μία σωστή απάντηση):
A. 37,5 mm Hg, η οποία είναι εντός του διαστήματος αναφοράς
B. 37,5 mm Hg, η οποία είναι εκτός του διαστήματος αναφοράς
Γ. 0,67 mm Hg, η οποία είναι εντός του διαστήματος αναφοράς
Δ. 0,67 mm Hg, η οποία είναι εκτός του διαστήματος αναφοράς
4.9 Μετατρέποντας την τιμή της PCO2 = 48 mm Hg σε kPa λαμβάνουμε τιμή (μία σωστή απάντηση):
A. 6,4 kPa, η οποία είναι εντός του διαστήματος αναφοράς
B. 6,4 kPa, η οποία είναι εκτός του διαστήματος αναφοράς
Γ. 3,3 kPa, η οποία είναι εντός του διαστήματος αναφοράς
Δ. 3,3 kPa, η οποία είναι εκτός του διαστήματος αναφοράς
4.10 Με βάση τη σχέση Henderson-Hasselbalch ποια είναι η αναμενόμενη νεφρική αντιρροπιστική

απάντηση σε αναπνευστική οξέωση και ποια σε αναπνευστική αλκάλωση (μία σωστή απάντηση):
Α. Αύξηση των διττανθρακικών και μείωση των διττανθρακικών αντίστοιχα
Β. Μείωση των διττανθρακικών και μείωση της PCO2 αντίστοιχα
Γ. Αύξηση των διττανθρακικών και μείωση της PCO2 αντίστοιχα
Δ. Αύξηση των διττανθρακικών και μείωση της PO2 αντίστοιχα
E. Μείωση των διττανθρακικών και αύξηση των διττανθρακικών αντίστοιχα
4.11 Mε βάση τη σχέση Henderson-Hasselbalch ποια η αναμενόμενη αναπνευστική αντιρροπιστική

απάντηση σε μεταβολική οξέωση και ποια σε μεταβολική αλκάλωση (μία σωστή απάντηση):
Α. Αύξηση των διττανθρακικών και μείωση των διττανθρακικών αντίστοιχα
373
Β. Μείωση των διττανθρακικών και μείωση της PCO2 αντίστοιχα
Γ. Αύξηση της PCO2 και μείωση της PCO2 αντίστοιχα
Δ. Αύξηση της PCO2 και μείωση της PO2 αντίστοιχα
E. Μείωση της PCO2 και αύξηση της PCO2 αντίστοιχα
4.12 Το πιο σημαντικό ρυθμιστικό σύστημα του οργανισμού είναι (μία σωστή απάντηση):
Α. Το ρυθμιστικό σύστημα των πρωτεϊνών
Β. Το ρυθμιστικό σύστημα των διττανθρακικών
Γ. Το ρυθμιστικό σύστημα των φωσφορικών
4.13 Η οξέωση … (πολλαπλές σωστές απαντήσεις):

Α. Ατιρροπείται πάντοτε πλήρως από τα φυσιολογικά ρυθμιστικά διαλύματα
B. Αντιρροπείται με νεφρική απέκκριση H+.
Γ. Μπορεί να προκληθεί από αναπνευστικές διαταραχές.
Δ. Παρατηρείται όταν το αρτηριακό pH υπερβαίνει την τιμή 7.45.
4.14 Εάν το pH του αρτηριακού αίματος ασθενούς είναι 7.3, το PaCO2 είναι 50 mm Hg και τα
επίπεδα των διττανθρακικών είναι υψηλότερα των φυσιολογικών, τότε πρόκειται για … (μία σωστή
απάντηση).
Α. μερικώς αντιρροπούμενη αναπνευστική οξέωση
Β. μερικώς αντιρροπούμενη μεταβολική οξέωση
Γ. οξεία αναπνευστική οξέωση
Δ. αντιρροπούμενη αναπνευστική οξέωση
Ε. πλήρως αντιρροπούμενη μεταβολική οξέωση
4.15. Εάν το pH του αρτηριακού αίματος ασθενούς είναι 7,30,3 η PCO2 = 7,2 kPa και [HCO3-] = 25
mmole/L τότε πρόκειται για … (μία σωστή απάντηση).
Α. μερικώς αντιρροπούμενη αναπνευστική οξέωση
Β. μερικώς αντιρροπούμενη μεταβολική οξέωση
Γ. οξεία αναπνευστική οξέωση
Δ. αντιρροπούμενη αναπνευστική οξέωση
Ε. πλήρως αντιρροπούμενη μεταβολική οξέωση
5.1 Η εύρεση του κλάσματος ηλεκτροφόρησης της αιμοσφαιρίνης S σε μεγάλα ποσοστά αποτελεί
διαγνωστικό δείκτη για (μία σωστή απάντηση):
Α. Μεσογειακή αναιμία
Β. Δρεπανοκυτταρική αναιμία
Γ. Μεγαλοβλαστική αναιμία
Δ. Κανένα από τα παραπάνω
5.2 Το ισοένζυμο CK-MB απαντά (μία σωστή απάντηση):

Α. Κυρίως στον εγκέφαλο
Β. Κυρίως στην καρδιά
Γ. Κυρίως στους σκελετικούς μυς
Δ. Κυρίως στον εγκέφαλο και στους σκελετικούς μυς
5.3 Η αυξημένη ALP σε συνδυασμό με τρανσαμινάσες και γ-GT βοηθά στην διαφορική διάγνωση (μία
Α. Χολοστατικών καταστάσεων
Β. Εμφράγματος μυοκαρδίου
Γ. Ηπατοχολικής νόσου
Δ. Τίποτα από τα παραπάνω
374
5.4 Η ευαισθησία της τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης αυξάνει, είτε με την αύξηση της εσωτερικής
διαμέτρου του τριχοειδούς σωλήνα αποκλειστικά στη θέση της ανίχνευσης, είτε με την χρήση
μεμβράνης στην αρχή του σωλήνα με σκοπό την έκλουση συστατικών που παρεμποδίζουν την ανάλυση
(μία σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
5.5 Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου λειτουργούν ως μοριακός ηθμός και επιταχύνουν ή επιβραδύνουν τη

μετανάστευση των πρωτεϊνών ανεξάρτητα από το λόγο φορτίο προς μάζα (μία σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
5.6 Οι πηκτές πολυακρυλαμιδίου χρησιμοποιούνται για κατακόρυφες ηλεκτροφορήσεις εξασφαλίζοντας

μεγαλύτερη διαχωριστική ικανότητα από αυτές με αγαρόζη και μπορούν να πραγματοποιηθούν είτε σε
συνθήκες μετουσίωσης, είτε χωρίς (μία σωστή απάντηση).
Α. Σωστό
Β. Λάθος
6.1 Ποιο από τα παρακάτω ένζυμα δεν χρησιμοποιείται σε ανοσοενζυμικές μεθόδους; (μία σωστή
απάντηση).
A. β-γαλακτοσιδάση
Β. Αλκαλική φωσφατάση
Γ. Όξινη φωσφατάση
Δ. Υπεροξειδάση
6.2 Σε ποια κατηγορία ανοσοχημικών μεθόδων υπάρχει περίσσεια αντισωμάτων συνδεδεμένων με την
στερεή φάση (μία σωστή απάντηση);
Α. Στις ετερογενείς μεθόδους μη ανταγωνιστικές μεθόδους.
Β. Στις ομογενείς μη ανταγωνιστικές μεθόδους.
Γ. Στις ετερογενείς ανταγωνιστικές μεθόδους.
Δ. Στις ομογενείς μη ανταγωνιστικές μεθόδους.
6.3 Όταν το εκπεμπόμενο σήμα της ανοσοχημικής μεθόδου αυξάνεται ενώ η συγκέντρωση της ουσίας
μειώνεται αυτό σημαίνει ότι (μία σωστή απάντηση);
Α. Η αντίδραση είναι ανταγωνιστική.
Β. Η αντίδραση είναι μη ανταγωνιστική.
Γ. Η αντίδραση είναι ομογενής.
Δ. Η αντίδραση είναι ετερογενής.
6.4 Στις ισοτοπικές μεθόδους χρησιμοποιείται ως ιχνηθέτης (μία σωστή απάντηση):

Α.124Ι
Β.131Ι
Γ. Ρουθήνιο
Δ. β-γαλακτοσιδάση
6.5 Το φαινόμενο αγκίστρου εμφανίζεται στις ανοσοχημικές μεθόδους όταν (μία σωστή απάντηση):
Α. Υπάρχει περίσσεια αντισωμάτων του αντιδραστηρίων.
Β. Υπάρχει πολύ μεγάλη συγκέντρωση αντιγόνων από το δείγμα του ασθενούς.
Γ. Υπάρχουν παρεμβολές στην ανάλυση.
Δ. Τα αποτελέσματα είναι ανώτερα από το όριο γραμμικότητας.
375
6.6 Η λογαριθμοποίηση του λόγου Α1/Αο χρησιμοποιείται (μία σωστή απάντηση):
A. Στις μεθόδους point to point (σημείο προς σημείο).
B. Στις μεθόδους regression (παλινδρόμησης).
Γ. Στις μεθόδους spline (εξομάλυνσης).
Δ. Σε όλες τις προηγούμενες μεθόδους.
6.7 Τα ετερόφιλα αντισώματα είναι (μία σωστή απάντηση):

A.Αντισώματα που ενώνονται με αντιγόνα του ανθρώπου.
Β.Αντισώματα που βρίσκονται σε περίσσεια και παρεμβαίνουν στις αναλύσεις.
Γ.Αντισώματα που προκαλούν ασθένειες.
Δ. Αντισώματα που συνδέονται με αντισώματα των αντιδραστηρίων.
7.1 Ποιές από τις αναφερόμενες πηγές φωτός εκπέμπουν στη περιοχή του UV (πολλαπλές σωστές απα-
ντήσεις):
Α. Λυχνίες Wο
Β. Λυχνίες Xe
Γ. Λυχνίες HAL
Δ. Λυχνίες D2
Ε. Όλες
7.2 Οι μονοχρωμάτορες στους σύγχρονου αυτόματους βοχημικούς αναλυτές περιλαμβάνουν (πολλαπλές

σωστές απαντήσεις):
Α. Φίλτρα Απορρόφησης
Β. Φίλτρα Συμβολής
Γ. Μηχανικά Στροφεία
Δ. Φράγματα Περίθλασης
Ε. Όλα τα παραπάνω
7.3 Ποιός τύπος από τους παρακάτω φωτοανιχνευτές είναι ο πλέον σύγχρονος και ευαίσθητος (μία σω-
στή απάντηση);
Α. Φωτολυχνίες
Β. Φωτοκύτταρα
Γ. Φωτοδίοδοι
Δ. Φωτοπολλαπλασιαστές
Ε. Συστοιχίες φωτοδιόδων
7.4 Ποιοί από τους παρακάτω ανιχνευτές είναι Νανομηχανικοί Βιοαισθητήρες (πολλαπλές σωστές απα-
ντήσεις);
A. Συμβολόμετρο Young
B. Μικροϊσορροπίας Χαλαζία
Γ. Συντονιζόμενο Κάτοπτρο
Δ. Συντονιζόμενοι Μικροδοκοί
Ε. Δακτυλιοειδές Αντηχείο
7.5 Ποιοί από τους παρακάτω ανιχνευτές είναι Οπτικοί Βιοαισθητήρες (μία σωστή απάντηση);
Α. Συντονισμού Πλασμονίων Επιφανείας
Β. Μίκρο-Συμβολόμετρο Mach-Zehnder
Γ. Συντονιζόμενο Κάτοπτρο
Δ. Φωτονικοί κρύσταλλοι
Ε. Όλοι
ΣΤ. Κανένας
376
8.1 Με βάση το χρωματογράφημα του Σχήματος 8.16 και με δεδομένο ότι ο απεικονιζόμενος
διαχωρισμός έγινε με χρωματογραφία RP-HPLC, να αποφανθείτε σχετικά με τη σειρά πολικότητας των
διαχωριζόμενων ουσιών (παρακεταμόλη, καφεϊνη, βενζοϊκό οξύ και ασπιρίνη) (μία σωστή απάντηση):
Α. Παρακεταμόλη > καφεϊνη > βενζοϊκό οξύ > ασπιρίνη
Β. Ασπιρίνη > βενζοϊκό οξύ > καφεϊνη > παρακεταμόλη
8.2 Από τα A-Z παρακάτω, κυκλώστε όσα χαρακτηριστικά μίας χημικής ένωσης μίας επιτρέπουν να
προβλέψετε τη σχετική σειρά έκλουσής μίας κατά την ανάλυσή μίας με HPLC αντίστροφης φάσης
(πολλαπλές σωστές απαντήσεις):
A. Συντελεστής κατανομής
B. Πολικότητα
Γ. Συντακτικός τύπος
Δ. Μοριακό βάρος
Ε. Ηλεκτρικό φορτίο
ΣΤ. Πτητικότητα
Ζ. Μέγεθος
8.3 Για ποιο λόγο είναι ανεπιθύμητη η παρουσία πρωτεϊνών κατά την ανάλυση ορού με κινητή φάση
που περιλαμβάνει οργανικό διαλύτη (μία σωστή απάντηση);
Α. Διότι οι πρωτεΐνες θα μετουσιωθούν παρουσία του οργανικού διαλύτη, με πιθανότητα να φράξουν το
σύστημα εισαγωγής του δείγματος και να οδηγήσουν σε μη ποσοτικά αποτελέσματα
Β. Διότι οι πρωτεΐνες θα μετουσιωθούν παρουσία του οργανικού διαλύτη, φράζοντας μίας πόρους του
πληρωτικού υλικού μίας στήλης και αυξάνοντας την πίεση μίας κινητής φάσης σε απαγορευτικά επίπεδα για
τη βιωσιμότητα μίας στήλης
Γ. Διότι οι πρωτεΐνες θα μετουσιωθούν παρουσία του οργανικού διαλύτη, με πιθανότητα να φράξουν το
σύστημα εισαγωγής του δείγματος και να οδηγήσουν σε μικρή επαναληψιμότητα
Δ. Διότι οι πρωτεΐνες, λόγω του μεγάλου μοριακού μίας βάρους, θα εμποδίσουν τον διαχωρισμό των μικρού
μοριακού βάρους αναλυτών.
E. Απαντήσεις A, B, Γ
ΣΤ. Απαντήσεις Α, Β, Γ, Δ
8.4 Σημειώστε από ποια από τα παρακάτω χαρακτηριστικά μίας χρωματογραφικής ανάλυσης
εξαρτάται ο χρόνος κατακράτησης μίας ουσίας (μία σωστή απάντηση);
Α. Την πίεση της αντλίας
Β. Τη φύση της στατικής φάσης
Γ. Την ακριβή σύσταση της κινητής φάσης
Δ. Τη θερμοκρασία της στήλης
Ε. Απαντήσεις A, B, Γ, Δ
8.5 Με ποιους από τους παρακάτω τρόπους θα μπορούσατε να αυξήσετε τον αριθμό των θεωρητικών
πλακών (N) μίας στήλης (πολλαπλές σωστές απαντήσεις);
Α. Μειώνοντας το μέγεθος των σωματιδίων του πληρωτικού υλικού
Β. Αυξάνοντας το μέγεθος των σωματιδίων του πληρωτικού υλικού
Γ. Βελτιώνοντας τον τρόπο πλήρωσης («πακετάρισμα») της στήλης με το πληρωτικό υλικό
8.6 Με ποιους από τους παρακάτω τρόπους θα μπορούσατε να μειώσετε το χρόνο ανάσχεσης μίας
ουσίας μικρής πολικότητας που αναλύεται με RP-HPLC (μία σωστή απάντηση):
A. Μειώνοντας την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης
Β. Αυξάνοντας την ταχύτητα ροής της κινητής φάσης
Γ. Αυξάνοντας την πολικότητα της κινητής φάσης
Δ. Μειώνοντας τον άπολο χαραχτήρα της στατικής φάσης
Ε. Απαντήσεις Β, Δ
377
ΣΤ. Απαντήσεις Α, Γ
8.7 Επιλέξατε τους τρεις πιο κοινούς ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην υγροχρωματογραφία
HPLC (μία σωστή απάντηση):
Α. Ηλεκτροχημικός
B. UV/Vis
Γ. Αγωγιμομετρικός
Δ. ΜS
Ε. Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων
ΣΤ. Απαντήσεις Α, Β, Γ
Ζ. Απαντήσεις Β, Δ, Ε
8.8 O χρόνος ανάσχεσης μίας ουσίας που αλληλεπιδρά με την στατική φάση στην RP-HPLC είναι (μία
A. Πάντοτε μεγαλύτερος από τον νεκρό χρόνο.
B. Πάντοτε μικρότερος από τον νεκρό χρόνο.
Γ. Μεγαλύτερος ή ίσος με το νεκρό χρόνο.
Δ. Μικρότερος ή ίσος με το νεκρό χρόνο.
Ε. Ίσος με το νεκρό χρόνο όταν η ουσία είναι ιδιαίτερα πολική και δεν αλληλεπιδρά καθόλου με τη στατική
φάση.
ΣΤ. Ίσος με το νεκρό χρόνο όταν η ουσία είναι ιδιαίτερα άπολη και δεν αλληλεπιδρά καθόλου με τη στατική
φάση.
Ζ. Απαντήσεις Γ, Ε
8.9 Εάν ο χρόνος ανάσχεσης μίας ουσίας ταυτίζεται με το νεκρό χρόνο υπάρχει αλληλεπίδραση αυτής με
τη στατική φάση (μία σωστή απάντηση);
Α. Υπάρχει ισχυρή αλληλεπίδρασή της με τη στατική φάση.
Β. Υπάρχει ασθενής αλληλεπίδρασή της με τη στατική φάση.
Γ. Δεν υπάρχει καμία αλληλεπίδρασή της με τη στατική φάση.
8.10 Αυξηµένη τιµή του παράγοντα κατακράτησης k’ δεικνύει (μία σωστή απάντηση):
Α. Ισχυρότερη κατακράτηση της ουσίας από τη στατική φάση
Β. Ασθενέστερη κατακράτηση της ουσίας από τη στατική φάση
Γ. Μεγαλύτερο χρόνο παραµονής της ουσίας στη στατική φάση
Δ. Μικρότερο χρόνο παραµονής της ουσίας στη στατική φάση
Ε. Απαντήσεις A, Γ
ΣΤ. Απαντήσεις Α, Β
8.11 Οι ουσίες που εκλούονται βραδύτερα (δηλ. κατακρατούνται περισσότερο) στην HPLC κανονικής
φάσης και αντίστροφης φάσης είναι αντίστοιχα (μία σωστή απάντηση):
A. Πολικές και άπολες.
B. Άπολες και πολικές.
Γ. Είναι πολικές και στις δύο περιπτώσεις.
Δ. Κανένα από τα παραπάνω.
8.12 Κατά το χρωματογραφικό διαχωρισμό μίγματος ουσιών με RP-HPLC, περισσότερο διευρυμένες

είναι (πολλαπλές σωστές απαντήσεις):
A. Οι κορυφές που εκλούονται νωρίτερα
B. Οι κορυφές που εκλούονται αργότερα
Γ. Οι κορυφές που αντιστοιχούν στις περισσότερο πολικές ουσίες
Δ. Οι κορυφές που αντιστοιχούν στις περισσότερο άπολες ουσίες
8.13 Εάν ένα δείγμα που αναλύεται με TLC αποτελείται από περισσότερα συστατικά, τότε εμφανίζονται
περισσότερες κηλίδες με (μία σωστή απάντηση):
A. Tην πιο πολική να προπορεύεται σε σχέση με την λιγότερο πολική
378
B. Tην λιγότερο πολική να προπορεύεται σε σχέση με την περισσότερο πολική
8.14 Σημειώσατε εάν ο συντελεστής κατακράτησης εξαρτάται από (μία σωστή απάντηση):
Α. Την κατανομή του αναλύτη μεταξύ της κινητής και στατικής φάσης
Β. Το ρυθμό μετατόπισης του αναλύτη μέσα στη στήλη
Γ. Την πολικότητα της κινητής φάσης
Δ. Απαντήσεις A, B, Γ
8.15 Εάν τα παρακάτω χρωματογραφήματα λήφθηκαν κατά την ανάλυση του ίδιου μίγματος ουσιών 1,
2, 3 με HPLC κανονικής φάσης στη μία περίπτωση και αντίστροφης φάσης στην άλλη περίπτωση και
με δεδομένο ότι η σειρά πολικότητας των τριών ουσιών του μίγματος μεταβάλλεται ως εξής: 1>2>3, να
κυκλώσετε τις σωστές απαντήσεις (μία σωστή απάντηση):
Α. Στο Β η ανάλυση έγινε με HPLC κανονικής φάσης

Β. Στο C η ανάλυση έγινε με HPLC αντίστροφης φάσης
Γ. Στο Β η ανάλυση έγινε με HPLC αντίστροφης φάσης
Δ. Στο C η ανάλυση έγινε με HPLC κανονικής φάσης
9.1 ΙVDs μπορεί να είναι όλα τα παρακάτω εκτός (μία σωστή απάντηση):
Α. Ένας Βιοχημικός αναλυτής
Β. Ένα control για βιοχημικές εξετάσεις
Γ. Ένας βαθμονομητής αυξητικής ορμόνης
Δ. Ένα αντιδραστήριο για μέτρηση τεστοστερόνης
Ε. Ένα ELISA kit για μέτρηση κυττοκίνης (για ερευνητικούς σκοπούς)
9.2 Ποιο από τα παρακάτω δεν είναι υποχρέωση κατασκευαστή ενός IVD αντιδραστηρίου (μία σωστή
απάντηση):
Α. να διαθέτει σύστημα ποιότητας
Β. να προειδοποιεί για κινδύνους από τη χρήση του
Γ. να δώσει θεραπευτικές οδηγίες στον ασθενή
Δ. να αναφέρει τα αναλυτικά χαρακτηριστικά
Ε. να διαθέτει οδηγίες χρήσης
379
9.3 Ποιο από τα παρακάτω δεν είναι χαρακτηριστικό επίδοσης ενός αντιδραστηρίου (μία σωστή
απάντηση);
Α. H πιστότητα
Β. H ορθότητα
Γ. Tο όριο ανίχνευσης
Δ. H ταχύτητα εκτέλεσης
Ε. H γραμμικότητα
9.4 Ποιο από τα παρακάτω δεν σχετίζεται με τον υπολογισμός της πιστότητας μιας μέτρησης (μία
Α. H τυπική απόκλιση
Β. H μεροληψία
Γ. H αναπαραγωγιμότητα
Δ. Tο CV
E. Tο RSD
9.5 Το ολικό σφάλμα μιας μεθόδου σχετίζεται με (μία σωστή απάντηση):

Α. Tη πιστότητα και τη μεροληψία
Β. Tη πιστότητα και το όριο ανίχνευσης
Γ. Tις τιμές αναφοράς
Δ. Tη γραμμικότητα
Ε. το όριο ποσοτικοποίησης
10.1 Η ιχνηλασιμότητα μιας μεθόδου διασφαλίζεται καλλίτερα με (μία σωστή απάντηση):
Α. Tην καλή πιστότητα
Β. Ένα χαμηλό όριο ανίχνευσης
Γ. Τις τιμές αναφοράς
Δ. Τη γραμμικότητα
Ε. Ένα πρότυπο υλικό αναφοράς
10.2 Ένα πρότυπο σύστημα αναφοράς για τη μέτρηση της κρεατινίνης μπορεί να περιλαμβάνει όλα τα
κατωτέρω εκτός από (μία σωστή απάντηση):
Α. Πιστοποιημένο υλικό αναφοράς
Β. Πρότυπη μέθοδο μέτρησης
Γ. Μονάδα μέτρησης ιχνηλάσιμη στο SI
Δ. Κατάλληλο διαλύτη
Ε. Εργαστήριο αναφοράς
10.3 Η διαπίστευση ενός εργαστηρίου σε ένα πεδίο παραμέτρων αφορά κυρίως (μία σωστή απάντηση):
Α. τη φήμη του εργαστηρίου
Β. την τεχνική επάρκεια
Γ. την ύπαρξη διαφόρων πιστοποιητικών
Δ. την ύπαρξη εξωτερικού ελέγχου ποιότητας
Ε. ότι ξέρει ο καθένας στο εργαστήριο τι και πότε συμπληρώνει ένα έγγραφο
10.4 Σε ποιο τομέα διαφέρει η πιστοποίηση από τη διαπίστευση για ένα εργαστήριο
Α. Στη διαβεβαίωση της τεχνικής του επάρκειας
Β. Στην ύπαρξη εγχειριδίου ποιότητας
Γ. Ότι γνωρίζει ο καθένας στο εργαστήριο τι και πότε συμπληρώνει ένα έγγραφο
Δ. Στην καλή υποδομή και τους άνετους χώρους
Ε. Ότι υπάρχει κουτί παραπόνων
380
10.5 Η αβεβαιότητα μιας μέτρησης εκτιμάται με την βοήθεια όλων των κατωτέρω εκτός (μία σωστή
απάντηση):
Α. Την αναπαραγωγιμότητα της μεθόδου
Β. Την αβεβαιότητα που δίνει το πιστοποιητικό του βαθμονομητή
Γ. Τη βεβαιότητα ενός άλλου εργαστηρίου
Δ. Τη μεροληψία σε σχέση με ένα πιστοποιημένο υλικό αναφοράς
Ε. Τους νόμους διάδοσης σφαλμάτων
11.1 Ορισμένοι προαναλυτικοί παράγοντες στον έλεγχο ποιότητας αποτελούν: η δειγματοληψία, η
αραίωση του δείγματος, η φυγοκέντρηση και οι αντιπηκτικές ουσίες.
Α. Σωστό
Β. Λάθος
11.2 Ο όρος ορθότητα αφορά:

Α. Τα τυχαία λάθη
Β. Τα συστηματικά λάθη
11.3 Η αβεβαιότητα της ανάλυσης συμπεριλαμβάνει όλες τις πηγές τυχαίων και συστηματικών λαθών
της αναλυτικής διαδικασίας, οι οποίες είναι δυνατό να μετρηθούν.
Α. Σωστό
Β. Λάθος
11.4 Η κατασκευή του χάρτη ελέγχου Levey – Jennings βασίζεται στην υπόθεση ότι οι τιμές υπόκεινται
σε μια τυχαία διακύμανση, η οποία ακολουθεί την κατανομή κατά Gauss, δηλαδή αναμένεται ότι (μία
Α. Το 65,2% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ±1SD, το 92,5% των τιμών θα βρεθεί εντός του
διαστήματος ±2SD και το 99,7% εντός του ±3SD.
Β. Το 68,2% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ±1SD, το 95,5% των τιμών θα βρεθεί εντός του
Γ. Το 68,2% των τιμών θα βρεθεί εντός του διαστήματος ±1SD, το 92,5% των τιμών θα βρεθεί εντός του
11.5 Δύο βασικοί στόχοι του εξωτερικού ελέγχου ποιότητας είναι: ο έλεγχος της ακρίβειας των
αποτελεσμάτων και η εξασφάλιση επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων.
Α. Σωστό
Β. Λάθος
12.1 Τι είναι η πυρόλυση (μία σωστή απάντηση);
A. Μέθοδος αποστείρωσης
Β. Η καύση χημικών ενώσεων
Γ. Η διάσπαση πρωτεϊνών
Δ. Η καύση οργανικής ύλης
12.2 Με ποια από τις παρακάτω μεθόδους δεν μπορούν να προσδιοριστούν μέταλλα (μία σωστή
απάντηση);
Α. Φλογοφωτομετρία
Β. Ατομική απορρόφηση
Γ. Θολωσιμετρία
Δ. Έγχρωμα σύμπλοκα
381
12.3 H εξίσωση αναφοράς στην ατομοποίηση με φούρνο γραφίτη είναι (μία σωστή απάντηση):
A. Γραμμική
Β. Σιγμοειδής
Γ. Λογαριθμική
Δ. Μπορεί να είναι όλα τα προηγούμενα
12.4 Τα απαραίτητα ιχνοστοιχεία χρησιμοποιούνται από τον ανθρώπινο οργανισμό για (μία σωστή
απάντηση):
Α. Θεραπεία καρδιακών παθήσεων
Β. Ενεργοποιητές ενζύμων
Γ. Αύξηση του μεταβολισμού
Δ. Παραγωγή κολλαγόνου
12.5 Τα βαρέα μέταλλα εκφράζουν την τοξική τους δράση επειδή (μία σωστή απάντηση):
Α. Συσσωρεύονται στα ζωτικά όργανα
Β. Βοηθούν στη σωστή λειτουργία του οργανισμού
Γ. Χρησιμοποιούνται ως μεταλλοένζυμα
Δ. Συμμετέχουν στη παραγωγή ενζύμων
12.6 Στη φασματοφωτομετρία ατομικής απορρόφησης με φλόγα (μία σωστή απάντηση):

A. Η ατομοποίηση γίνεται σε αέριο δείγμα
B. Χρησιμοποιείται σύστημα παραγωγής υδρατμών
Γ. Η ατομοποίηση γίνεται με καυστήρα ακετυλενίου- αέρα
Δ, Χρησιμοποιείται καθαρό υδρογόνο
12.7 Στη φασματοφωτομετρία με φούρνο γραφίτη (μία σωστή απάντηση):

Α. Χρησιμοποιείται μεγάλη ποσότητα δείγματος
Β. Η καύση του δείγματος γίνεται μέσα στο φούρνο γραφίτη
Γ. Χρησιμοποιείται φλόγα μείγματος αερίων
Δ. Χρησιμοποιείται καθαρό οξυγόνο
13.1 Οι όροι «ουρολιθίαση» και «νεφρολιθίαση», περιγράφουν την ίδια κατάσταση (μία σωστή
απάντηση):
Α. Σωστό
Β. Λάθος
13.2 Ποια από τις παρακάτω ενώσεις, που απαντώνται σε ουρολίθους, είναι κληρονομικής προέλευσης
(μία σωστή απάντηση);
Α. Οξαλικό ασβέστιο
Β. Ανθρακικό ασβέστιο
Γ. Κυστίνη
Δ. Ξανθίνη
13.3 Η υπέρυθρη ακτινοβολία καλύπτει την περιοχή μηκών κύματος του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος
από (μία σωστή απάντηση):
Α. 0,4-0,7 μm
Β. 0,7-1000 μm
Γ. 0,01-0,4 μm
13.4 Ποια φασματική περιοχή ονομάζεται περιοχή δακτυλικού αποτυπώματος (fingerprint region) (μία
σωστή απάντηση);
382
Α. 4.000 – 2.500 cm-1
Β. 2.500 – 2.000 cm-1
Γ. 2.000 – 1.600 cm-1
Δ. 1.500 – 700 cm-1
13.5 Ποια διαδικασία εξασφαλίζει την καλή λειτουργία του αναλυτή του φασματοφωτομέτρου
FTIR(μία σωστή απάντηση);
Α. Η λήψη και αξιολόγηση φάσματος ειδικού φιλμ πολυστυρενίου.
Β. Η διοχέτευση αερίου αζώτου στο θάλαμο του φωτομέτρου.
Γ. Η λήψη και αξιολόγηση φάσματος με κενό το θάλαμο τοποθέτησης του δείγματος.
Δ. Η απουσία υγρασίας τόσο στο δείγμα όσο και στο KBr.
14.1 Κατά την αιμοληψία οι εργαζόμενοι είναι εκτεθειμένοι (μία σωστή απάντηση):
Α. Στον κίνδυνο τραυματισμών από τις βελόνες που χρησιμοποιούνται
Β. Σε υψηλό θόρυβο
Γ. Στην επαφή με μολυσματικά βιολογικά υγρά
Δ. Σε επικίνδυνα τοξικά υγρά
14.2 Ο Κώδικας Καλής Εργαστηριακής Πρακτικής περιγράφει (μία σωστή απάντηση):

Α. Τις εξετάσεις που εκτελούνται στο εργαστήριο
Β. Τις διαδικασίες που πρέπει να εφαρμόζονται σε διαγνωστικά εργαστήρια για την ασφάλεια του
προσωπικού
Γ. Τις εξετάσεις που πρέπει να κάνουν περιοδικά οι εργαζόμενοι
Δ. Την ασφαλή μεταφορά δειγμάτων
14.3 Η σωστή διαχείριση των ιατρικών αποβλήτων προϋποθέτει (Σημειώστε το σημαντικότερο) (μία
Α. Το διαχωρισμό στη πηγή
Β. Τη συλλογή & συσκευασία,
Γ. Αποθήκευση, μεταφορά, επεξεργασία, ανακύκλωση, εντός του νοσηλευτικού ιδρύματος μέχρι την τελική
διάθεση
Δ. Ανακύκλωση, θερμική επεξεργασία, ή υγειονομική ταφή
14.4 Η τοποθέτηση των αποβλήτων σε υποδοχείς (σάκους) αντίστοιχου χρώματος γίνεται ανάλογα με
Α. Το χρόνο συλλογής των αποβλήτων
Β. Το είδος των αποβλήτων
Γ. Τη μέθοδο τελικής διάθεσης
Δ. Την επάρκεια των προμηθειών του εργαστηρίου
14.5 Η αποστείρωση είναι μέθοδος επεξεργασίας για (μία σωστή απάντηση):

Α. Μεικτά Επικίνδυνα Απόβλητα (ΜΕΑ)
Β. Επικίνδυνα Απόβλητα Αμιγώς Μολυσματικά (ΕΑΑΜ)
Γ. Ορισμένες κατηγορίες Άλλων Επικίνδυνων Αποβλήτων (ΑΕΑ
Δ. Ραδιενεργά απόβλητα
383
ΑΠΑΝΤΗΣΕΙΣ ΕΡΩΤΗΣΕΩΝ
1.1 Β
1.2 Β
1.3 Α
1.4 ΣΤ
1.5 Β
2.1. Β
2.2. Γ
2.3. Α, Β, Δ
2.4. Α, Γ
2.5. Αδύνατος ο προσδιορισμός χωρίς προκατεργασία: Υπερφυγοκέντρηση για απαλλαγή από θολερότητα
οφειλόμενη σε λιπίδια. Διχρωματική ανάλυση σε 450 nm/550 nm για ελαχιστοποίηση παρεμβολής
αιμοσφαιρίνης.
3.1. Γ
3.2. Ε
3.3. Α
3.4. Α
3.5. Δ
4.1. A, E
4.2. B, Γ
4.3. Α
4.4. Β
4.5. Γ
4.6. Α, Δ
4.7. Β, Γ
4.8. Α
4.9. Β
4.10. Α
4.11. Ε
4.12. Β
4.13. Β, Γ
4.14. Α. Αρχικά, με βάση την τιμή του pH εξετάζουμε εάν πρόκειται για αλκαλαιμία ή οξυαιμία. Εφόσον
pH < 7.35 πρόκειται 3
για οξυαιμία. Στη συνέχεια εξετάζουμε την 3
PCO2. Η τιμή 50 mm Hg είναι
μεγαλύτερη της ανώτερης φυσιολογικής. Αυξημένη PCO2, σύμφωνα με την αντίδραση 4.1. θα είχε ως
αποτέλεσμα τη μετατόπιση της ισορροπίας προς τα δεξιά και συνεπώς τη μείωση του pH. Οπότε η
μετρούμενη μείωση του pH έχει πιθανότατα ως πρωτογενές αίτιο την αύξηση της PCO2 (πρόκειται
δηλαδή για αναπνευστική οξέωση). Εξετάζουμε στη συνέχεια τον μεταβολικό παράγοντα. Επίπεδα
διττανθρακικών υψηλότερα των φυσιολογικών, σύμφωνα με την αντίδραση 4.1. θα είχαν ως αποτέλεσμα
μετατόπιση της ισορροπίας προς τα αριστερά και συνεπώς αύξηση του pH. Οπότε η μείωση του pH
δεν μπορεί να έχει ως πρωτογενές αίτιο την αύξηση της [HCO3-] (δεν πρόκειται δηλαδή για μεταβολική
οξέωση). Απομένει να εξετάσουμε εάν ο μεταβολικός παράγοντας δρα αντιρροπιστικά. Σύμφωνα με τη
Σχέση 4.2. η νεφρική αντιρροπιστική απάντηση στην αύξηση της PCO2 θα ήταν η αύξηση της [HCO3-
]. Συνεπώς πρόκειται για αναπνευστική οξέωση με μερική νεφρική αντιρρόπηση.
4.15 Γ. Αρχικά, με βάση την μετρούμενη τιμή pH εξετάζουμε
3 εάν πρόκειται για αλκαλαιμία ή οξυαιμία.
Εφόσον pH < 7.35 πρόκειται για οξυαιμία. Στη συνέχεια εξετάζουμε την PCO2. Η τιμή 7,7 kPa
3
ισοδυναμεί με 7,7 x 7,5 mm Hg δηλ. 57.8 mmHg είναι κατά πολύ μεγαλύτερη της ανώτερης
φυσιολογικής. Αυξημένη PCO2, σύμφωνα με την αντίδραση 4.1 θα είχε ως αποτέλεσμα τη μετατόπιση
της ισορροπίας προς τα δεξιά και συνεπώς τη μείωση του pH. Οπότε η μετρούμενη μείωση του pH έχει
πιθανότατα ως πρωτογενές αίτιο την αύξηση της PCO2 (πρόκειται δηλαδή για αναπνευστική οξέωση).
Εξετάζουμε στη συνέχεια τον μεταβολικό παράγοντα. Συγκέντρωση [HCO3-] = 25 mmole/L είναι εντός
των τιμών αναφοράς. Αυτό σημαίνει ότι ο μεταβολικός παράγοντας δεν δρα αντιρροπιστικά. Σύμφωνα με
τη Εξίσωση 4.2 η νεφρική αντιρροπιστική απάντηση στην αύξηση της PCO2 θα ήταν η αύξηση της
384
[HCO3-]. Συνεπώς πρόκειται για οξεία αναπνευστική οξέωση. Αναφέρθηκε ότι η νεφρική
αντιστάθμιση είναι μια διαδικασία που συμβαίνει βραδέως και τα αποτελέσματά της δεν μπορούν να
είναι αμέσως εμφανή.
5.1. Β
5.3. Β
5.5. Α
5.4. Α
5.5. Β
5.6. Α
6.1. Γ
6.2. Γ
6.3. Α
6.4. Α
6.5. Β
6.6. Β
6.7. Δ
7.1. Β, Δ
7.2. Β, Γ, Δ
7.3. Ε
7.4 Β, Δ
7.5. Ε
8.1. Β
8.2. A, B, Γ
8.3. Ε
8.4. Ε
8.5. Α, Γ
8.6. Ε
8.7. Ζ
8.8. Ζ
8.9. Γ
8.10.Ε
8.11. Α
8.12 Β, Δ
8.13. Β
8.14. Δ
8.15. Β
9.1 Ε
9.2 Γ
9.3 Δ
9.4. Β
9.5 Α
10.1 Ε
10.2 Δ
10.3 Β
10.4 Α
10.5 Γ
11.1 Α
11.2 Β
11.3 Α
11.4 Β
11.5 Α
12.1 Δ
12.2 Γ
12.3 Α
12.4 B
385
12.5 A
12.6 Γ
12.7 Δ
13.1 Β
13.2 Γ
13.3 Β
13.4 Δ
13.5 Α
14.1 Α, Γ
14.2 Β
14.3 Α
14.4 Γ
14.5 Β
386
ΛΕΞΙΛΟΓΙΑ
Αγγλοελληνικό λεξιλόγιο
2,2' azino-di(3-ethyl-benzοthiazoline sulfonic
acid-6) ABTS 2,2-άζινο δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό οξύ
2-methyl-4-isothiazolin-3-one ΜΙΤ 2-μεθυλ-2H-ισοθειαζολ-3-όνη
3-(p-hdroxyphenyl) propionic acid HPPA 3-(π-υδροξυφαινυλο) προπιονικό οξύ
3,3',5,5'-tetramethyl-benzindine TMB 3,3’,5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη
4-methylumbelliferyl phosphate MUP 4-μεθυλο φωσφορική ουμπελιφερόνη
4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside MUG 4-μεθυλουμπελιφαιρολ-β-D γαλακτοπυρανοζίδιο
5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxane BND 5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο
Absorbance Α Απορρόφηση
Absorbance of radiation ABS Απορρόφηση ακτινοβολίας
Accuracy Ακρίβεια
Acid-Base Balance Οξεοβασική ισορροπία
Acidemia Οξυαιμία
Activation Energy ΔG‡ Ενέργεια ενεργοποίησης
Activator Ενεργοποιητής
Active Site Ενεργό κέντρο
Acute Disorder Οξεία διαταραχή
Adjusted Retention Time tR' Ανηγµένος χρόνος κατακράτησης
Adsorption Chromatography Xρωµατογραφία προσρόφησης
Affinity chromatography Χρωματογραφία χημικής συγγένειας
Agarose Αγαρόζη
Aliquot Ισομερίδια
Alkalemia Αλκαλαιμία
Alkaline Phospatase ALP Αλκαλική φωσφατάση
Alumina Οξείδιο αργιλίου
Amylase AMS Αμυλάση
Analytical errors Αναλυτικά σφάλματα
Analytical fuctionality Αναλυτική ευαισθησία
Analytical Protocol Πρωτόκολλο ανάλυσης
Anion Gap AG Χάσμα ανιόντων
Antibody Ab Αντίσωμα
Antidiuretic Hormone ή Vasopressin ADH Αντιδιουρητική ορμόνη ή βασοπρεσίνη
Antigen Ag Αντιγόνο
Arterial Blood Gas Analysis ή ABG Analysis Ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος
Arterial Partial Pressure Pa Μερική πίεση στο αρτηριακό αίμα
Aspartate Τransaminase ή Glutamate- AST ή
Oxaloacetate Transaminase GOT Ασπαρτική αμινοτρανσφεράση
Atomic Absorption Spectroscopy Φαρματοσκοπία ατομικής απορρόφησης
Atrial Natriuretic Peptide ANP Κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο
Autoclavin Αυτόκαυστο αποστείρωσης
Avidin Αβιδίνη
Base Deficit Έλλειμμα βάσης
Base Excess BE Περίσσεια βάσης
Batch Παρτίδα αναλύσεων
Beam splitter Διαιρέτης δέσµης
Bending vibration Δόνηση κάμψης
b-Galactosidase β-GAL β-γαλακτοσιδάση
387
Bichromatic Analysis Διχρωματική ανάλυση
Biohazard Βιοκίνδυνος
Biological indicator ή biomarker Βιολογικός δείκτης ή βιοδείκτης
Biotin Βιοτίνη
Blank Τυφλό ή λευκό διάλυμα
Blood Gas Analyser AAA Αυτόματος αναλυτής αερίων
Buffer Ρυθμιστικό διάλυμα
Burner Καυστήρας
Burried channel Εγκιβωτισμένος δίαυλος
Calcium carbonate Ανθρακικό ασβέστιο
Calcium oxalate Οξαλικό ασβέστιο
Calcium phosphate Φωσφορικό ασβέστιο
Calculated Osmolarity Υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα
Calibration Βαθμονόμηση
Calibration curve Καμπύλη βαθμονόμησης
Calibrator Cal Bαθμονομητής
Capacity factor Παράγοντας χωρητικότητας
Capillary column Τριχοειδής στήλη
Capillary Electrophoresis Τριχοειδική ηλεκτροφόρηση
Carbohydrates Υδατάνθρακες
Carbon dioxide CO2 Διοξείδιο του άνθρακα
Carbon Dioxide Partial Pressure PCO2 Μερική πίεση διοξειδίου του άνθρακα
Catalyst Καταλύτης
Certified reference material CRM Πρότυπα υλικά αναφοράς
Charge-coupled devices CCD Ανιχνευτής (διάταξη) συζευγμένου φορτίου
Chemiluminescence CHIA Χημειοφωταύγεια
Chemiluminescence ImmunoAssays CIA Ανοσοχημειοφωταύγεια
Chopper Κατατμητής
Chromatograph Χρωματογράφημα
Chromatography Χρωματογραφία
Chromatography Column Χρωματογραφική στήλη
Chromοgen Χρωμογόνος ένωση (χρωμογόνο)
Clorophenolic red-β-D-galactopyranoside CPRG Ερυθρό χλωροφαινόλης-β-D-γαλακτοπυρανοσίδης
Closeness Κοινή συναίνεση, συμφωνία
Code of Good Laboratory Practice Κώδικας Καλής Εργαστηριακής Πρακτικής
Coefficient of Variation CV Συντελεστής μεταβλητότητας
Coeficient of variation CV Συντελεστής διακύμανσης
Coenzyme Συνένζυμο
Cofactor Συμπαράγοντας
Column chromatography Χρωματογραφία στήλης
Combined error Μεικτό (σταθερό και αναλογικό) συστηματικό σφάλμα
Community Bureau of Reference BCR Γραφείο Προτύπων της Ευρωπαϊκής Ένωσης
Compensated Disorder Αντιρροπούμενη διαταραχή
Compensatory Μechanisms Μηχανισμοί αντιρρόπησης
Competitive method Ανταγωνιστική μέθοδος
Conductivity Detector Αγωγιμομετρικός ανιχνευτής
Conjugate CON Συνδέτης
Control chart Διάγραμμα ελέγχου
Control sample CS Δείγμα ελέγχου
Correct value Αληθή τιμή
Correlation plot Διάγραμμα συσχέτισης
Corrosive Διαβρωτικό
Costant error Σταθερό συστηματικό σφάλμα
Counts per min Cpm Κρούσεις ανά λεπτό
388
Coupled Αssay Συζευγμένη μέθοδος
Critical Pair of Analytes Kρίσιμο ζεύγος (Aναλυτών)
Cusum chart Συσσωρευτικό αθροιστικό διάγραμμα
Cuvette Κυψελίδα
Cyanine Dye CD Χρώση κυανίνης
Cystine Κυστίνη
Dead time Νεκρός χρόνος
Degaser Απαερωτής
Detectability Aνιχνευσιμότητα
Detection Limit DL Όριο ανίχνευσης
Detector Ανιχνευτής
Deutsche Vereinte Gesellschaft für Klinische Γερμανική Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηριακής
Chemie und Laboratoriums Μedizin DGKL Ιατρικής
Diabetes Διαβήτης
Differental Diagnosis Διαφορική διάγνωση
Dilution Check Έλεγχος αραίωσης
Diode Array Detector DAD Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων
Dipole moment Διπολική ροπή
Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluorescent DELFIA Ανοσοφθορισμομετρική ενισχυμένη διάσταση λανθανι-
Immunoassay δών
Drain Voltage control Έλεγχος διαφυγής δυναμικού
Dynamic Range Δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων
Electrochemical Detector Ηλεκτροχημικός ανιχνευτής
ECL ή
ElectroChemiLuminescese eCLIA Ηλεκτροχημειοφωταύγεια
Electrode Ηλεκτρόδιο
Electrolyte Ηλεκτρολύτης
Electrolyte Panel Analysis Aνάλυση επιπέδων ηλεκτρολυτών
Electromagnetic spectrum Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα
Electroneutrality Ηλεκτροουδετερότητα
Electronic configurations Ηλεκτρονιακές διαμορφώσεις
Electrophoresis Ηλεκτροφόρηση
End Point Method Μέθοδος τελικού σημείου
Energy level Ενεργειακό επίπεδο
Enzume linked Immuno – SPOT ELISPOT Ανοσοενζυμική μέθοδος κηλίδας
EnzumeImmunoAssay EIA Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός
Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός προσδεδεμένων αντισω-
Enzume-Linked immunoSorbent Assay ELISA μάτων
Enzyme Ένζυμο
Enzyme Activity Ενζυμική ενεργότητα ή δραστικότητα
Enzyme Concentration C Ενζυμική συγκέντρωση
Enzyme Multiplied Immunoassay Technique EMIT Aνοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος
Enzyme Units U Μονάδες ενζυμικής δραστικότητας
Enzyme-Substrate Complex ES Σύμπλοκο ενζύμου‐υποστρώματος
Epitope Επίτοπος
Explosive Εκρηκτικό
Exposure limits Όρια έκθεσης
Extracellular Fluid Volume EFV Εξωκυττάριος όγκος
Far-infrared FIR Άπω υπέρυθρη περιοχή
Filter ή monochromator Φίλτρο ή μονοχρωμάτορας
Fingerprint region Περιοχή δακτυλικού αποτυπώματος
Fingertip Pulse Oximeter Παλμικό οξύμετρο δακτύλου
Flag Επισήμανση
Flame Emission Spectroscopy FES Φλογοφασματοσκοπία εκπομπής
389
Flame Spectrometry Φλογοφωτομετρία
Flow Rate Ταχύτητα ροής
Fluorecense Polarization ImmunoAssay FPIA Ανάλυση πολωμένου φθορισμού
Fluorescence Detectors Φθορισμομετρικοί ανιχνευτές
Fluorescin isothiocyanate FITC Ισοθειοκυανική φλουορεσκείνη
Fluoresence Energy Tranfer Immunoassay FETI Μέθοδος μεταφοράς φθορισμομετρικής ενέργειας
Fourier Transformed Infrared Spectroscopy FTIR Φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμούς Fourier

Fraction Collector Κλασματοσυλλέκτης
Ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως ή ωσμώμετρο
Freezing Point Depression Osmometer κρυοπηξίας
Furnace Εξαχνωτής γραφίτη
gallstone, bilestone Χολόλιθος
Gas Chromatography GC Αέρια χρωματογραφία
Genetic predisposition Γενετική προδιάθεση
Glucose 6P-dehydrogenase G6P-DH 6-φωσφορική αφυδρογονάση της γλυκόζης
Glucose Oxidase GOD Οξειδάση της γλυκόζης
Glutaraldehyde Γλουταραλδεύδη
Glycosylated H(a)emoglobin Γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη
Gradient elution Βαθμιδωτή έκλουση
Grafite Tube Γραφίτης
Gross error Χονδροειδές λάθος
Ground state electron configuration Ηλεκτρονιακή διαμόρφωση θεμελιώδους κατάστασης
Ηb ή
H(a)emoglobin HgB Aιμογλοβίνη ή αιμοσφαιρίνη
Harmful Επιβλαβές
Hazardous Waste Επικίνδυνα απόβλητα
Heterophilic antibodies Ετερόφιλα αντισώματα
Hexokinase HK Εξοκινάση
Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή υγρή χρωματο-
High Pressure liquid Chromatography HPLC γραφία υψηλής απόδοσης
Hold-up Time t0 Νεκρός χρόνος
Hook effect Φαινόμενο αγκίστρου
Horshradish Peroxidase HRP Υπεροξειδάση της αγριοραπανίδος
Hospital Ιnformation Systems HIS Νοσοκομειακά συστήματα πληροφοριών
Human anti-mouse antibodies HAMA Αντισώματα έναντι των ποντικιών
Hydrogen Peroxide Η2Ο2 Υπεροξείδιο του υδρογόνου
Hyperkalemia Υπερκαλαιμία
Hypernatremia Υπερνατριαιμία
Hypertonic Solution Υπέρτονο διάλυμα
Hyperventilation ή Hypercapnia Υπεραερισμός ή υπερκαπνία
Hypokalemia Υποκαλαιμία
Hyponatremia Υπονατριαιμία
Hypotonic Solution Υπότονο διάλυμα
Hypoventilation ή Hypocapnia Υποαερισμός ή υποκαπνία
Immunoassay Ανοσομέθοδος
ImmunoChemiluminescentMetric Assay ICMA Ανοσοχημειοφωταυγειομετρική μέθοδος
Immunocomplex Ανοσοσύμπλεγμα
Immunoglobulin Ig Ανοσοσφαιρίνη
ImmunoRadioMetric Assay IRMA Ανοσοραδιομετρική μέθοδος
In vitro diagnostics IVD Ιατροδιαγνωστικά προιόντα
Inaccuracy Έλλειψη ακρίβειας
Incineration Αποτέφρωση
Infectious waste Μολυσματικά απόβλητα
390
Infrared (Detector) IR (Ανιχνευτής) υπερύθρου
Initial Reaction Rate v0 Αρχική ταχύτητα αντίδρασης
Initial Substrate Concentration S0 Αρχική συγκέντρωση υποστρώματος
Initiation Phase Φάση έναρξης
Injection System/ Injector Valve Σύστημα εισαγωγής δείγματος
Instantaneous Rate of Reaction Στιγμιαία ταχύτητα αντίδρασης
Inter-assay Precision ή Reproducibility Αναπαραγωγιμότητα
Interferogramm Συμβολογράφημα
Interlaboratory reproducibility Διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα
International Federation of Clinical Chemistry IFCC Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας
International Unit IU Διεθνής μονάδα
Intra-assay Precision ή Repeatability Επαναληπτικότητα
Intralaboratory reproducibility Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα
Ion Ιόν
Ion exchange chromatography Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής
Ion Selective Electrode ISE Ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια
Ion-capture immunoassay ICIA Τεχνολογία δέσμευσης ιόντων
Irritant Ερεθιστικό
Isocratic Elution Ισοκρατική έκλουση
Isotonic Solution Ισότονο διάλυμα
Kinetic Method Κινητική μέθοδος
Lab-on-a-Chip LOC Μικρογραφημένη εργαστηριακή διάταξη
Laboratory Ιnformation Systems LIS Εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών
Lactate Dehydrogenase LDH Γαλακτική αφυδρογονάση ή γαλακτική δεϋδρογενάση
LASER Diode (LDs LD LASER διόδων
Lateral overflow drain Απορροή διαμύκους υπερχύλισης
Least Squares Method Mέθοδος ελαχίστων τετραγώνων
Light Beam Path Length d Μήκος διαδρομής ακτινοβολίας
Limit of detection LOD Όριο ανίχνευσης
Limit of Linearity LOL Όριο γραμμικότητας
Limit of quantification LOQ Όριο ποσοτικοποίησης
Linear molecule Γραμμικό μόριο
Linear Range Γραμμική περιοχή
Linear Regression Γραμμική συσχέτιση
Linear Regression Equation Γραμμική εξίσωση συσχέτισης
Linearity Ln Γραμμικότητα
Linearity Range Εύρος γραμμικότητας
Liquid Chromatography LC Υγρή χρωματογραφία
Luminescent oxygen channeling Immunoassay LOCI Ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου
Luminometer Φωταυγειόμετρο ή λουμινόμετρο
Magnesium ammonium phosphate Εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο
Magnesium phosphate Φωσφορικό μαγνήσιο
Malate Dehydrogenase MDH Μηλική αφυδρογονάση
Maltose Binding Protein MBP Πρωτεϊνη συνδέουσα την μαλτόζη
Mass Spectroscopy (Detector) MS Φασματογράφος μάζας
Matrix Μήτρα
Matrix Modificator Μετατροπέας υποστρώματος
Maximum Velocity vmax Μέγιστη ταχύτητα
Measured Osmolarity Μετρούμενη ωσμωτικότητα
Measuring range MR Εύρος μέτρησης
Medical Surveillance Ιατρική παρακολούθηση
Medical Waste Ιατρικά απόβλητα
Metabolic Acidosis Μεταβολική οξέωση
Metabolic Alkalosis Μεταβολική αλκάλωση
391
Method Validation Eπικύρωση μεθόδου
Michaelis Constant KM Σταθερά Michaelis
Michelson interferometer Συµβολόµετρο Michelson
Microarrays Μικροδιατάξεις, μικροσυστοιχίες
Microchip Oλοκληρωμένo ηλεκτρονικό κύκλωμα
Micro-E/M Systems Acoustic Resonator Ακουστικό αντηχείο μικρο-Η/Μ Συστημάτων
Microplate enzyme immunoassay MEIA Aνοσοενζυμική μέθοδος με πλάκα μικροτιτλοδότησης
Microplate reader Φωτόμετρα πλακών μικροτιτλοδότησης
Mid-wavelength infrared MWIR Μέση υπέρυθρη περιοχή
Λάθος (ανθρώπινο σφάλμα που επηρρεάζει τα αποτελέ-
Mistake σματα)
Mixed Αcid-Βase Disorders Μεικτές οξεoβασικές διαταραχές
Mobile phase Κινητή φάση
Molar Extinction Coefficient ε Μοριακός συντελεστής απόσβεσης (ή απορρόφησης)
Monochromator Μονοχρωµάτωρας
Mucoprotein Μυκοπρωτεΐνη
Municipal waste Αστικά Απόβλητα
Near-infrared NIR Εγγύς υπέρυθρη περιοχή
Nebulizer Εκνεφωτής
Nicotinamide Adenine Dinucleotide NAD+ Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate NADP+ Φωσφορικό δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate Φωσφορικό Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης, α-
Reduced Form NADPH νηγμένη Μορφή
Nicotinamide Adenine Dinucleotide Reduced
Form NADH Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης, ανηγμένη μορφή
Nitro-phenol phosphate NPP Φωσφορική p-νιτροφαινόλη
Nomogram Νομόγραμμα
Non linear molecule Μη γραμμικό μόριο
Non-competitive method Μη ανταγωνιστική μέθοδος
ΝP-
Normal Phase HPLC HPLC HPLC κανονικής Φάσης
Normal values Φυσιολογικές τιμές
Nuclear Magnetic Resonance (Detector) NMR (Ανιχνευτής) πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού
Occupational Exposure Επαγγελματική έκθεση
Occupational Hazard Επαγγελματικός κίνδυνος
Occupational Health and Safety Υγιεινή και ασφάλεια Εργασίας
o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside oNPG o-νιτροφαινυλ-β-D-γαλακτοπυρανοσίδης
o-phenylenediamine OPD Ορθo-φαινυλενοδιαμίνη
osmol ή
Osmol Osm Ωσμώλιο
Osmolal Gap Ωσμωτικό χάσμα
Osmolality Ωσμωτικότητα
Osmolarity Ωσμωμοριακότητα
Osmosis Ώσμωση
Osmotic Pressure Ωσμωτική πίεση
Osmotic Sensor Ωσμωϋποδοχέας
Oxygen Partial Pressure PO2 Μερική πίεση οξυγόνου
Oxygen Saturation SaO2 Κορεσμός οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα
PaArticle Counting ImmmunoAssay PACIA Μικροσωματιδιακή ανοσοενζυμική ανάλυση
Paper chromatography Χρωματογραφία χάρτου
Μαγνητικά σφαιρίδια όπου συγκολλούνται αντισώματα σε
Paramagnetic particles PMP ανοσοχημικούς προσδιορισμούς
Partition Chromatography Χρωµατογραφία κατανοµής
Partition coefficient Συντελεστής κατανομής
Peak Width W Εύρος κορυφής
392
Pearson Correlation Coefficient R(2) ή r(2) Συντελεστής συσχέτισης (του Pearson)
Peroxidase POD Υπεροξειδάση
Personal Protective Equipment Προσωπικός προστατευτικός εξοπλισμός
Phospholipids Φωσφολιπίδια
Photodetector Φωτοανιχνευτής
Photometer Φωτόμετρο
Photometric Detection Φωτομετρικός προσδιορισμός
p-hydroxyphenylacetic acid HPAA π-υδροξυφαινυλοξεικό οξύ
Pixel reset gate Πύλη επαναφοράς εικονοστοιχείου
Planar chromatography Επίπεδη χρωματογραφία
Plate Height Η Ύψος θεωρητικής πλάκας
Plate Number Ν Aριθμός θεωρητικών πλακών
p-nitrophenyl-phosphate p-NP π-νιτροφαινυλο-φωσφατάση
"Σημείο προς σημείο", καμπύλη βαθμονόμησης που περνά
Point to point από όλα τα σημεία.
Παρακλίνιος, εξετάσεις που γίνονται από μη εργαστηρια-
Point-of-Care POC κό προσωπικό
Polarity Πολικότητα
Polychromatic Analysis Πολυχρωματική ανάλυση
Polycrystallic clusters Πολυκρυσταλλικά συσσωματώματα
Polystyrene PS Πολυστυρένιο
Portable Blood Gas Analyser Φορητός αναλυτής αερίων αίματος
Post-analytical errors Μετα-αναλυτικά σφάλματα
Potassium bromide KBr Βρωμιούχο κάλιο
Potential barrier Φράγμα δυναμικού
Pre-analytical errors Προαναλυτικά σφάλματα
Precision Πιστότητα
Preparatory chromatography Προπαρασκευστική χρωματογραφία
Pressure Sensor Oγκοϋποδοχέας ή τασεοϋποδοχέας
Product P Προϊόν
Propotional error Αναλογικό συστηματικό σφάλμα
Pulmonary Control Αναπνευστική ρύθμιση
Pumb Αντλία
Quality Assessment Αποτίμηση της ποιότητας
Quality Control QC Έλεγχος ποιότητας
Quality Improvement Βελτίωση της ποιότητας
Quality laboratory processes Εργαστηριακές διαδικασίες
Quality planning Σχεδιασμός ποιότητας
Quality standards Πρότυπα ποιότητας
Quantum Dots QDs Κβαντικές τελείες ή κηλίδες
Quantum yield Λόγος απόδοσης
Quartz Crystal Microbalance QCM Χαλαζίας μικροϊσορροπίας
Radio AllergoSorbent Test RAST Ραδιο-αλλεργιοαπορροφητική διαδικασία
Radio ImmunoSorbent Test RΙST Ραδιο-απορροφητική διαδικασία
Radio-Frequency Identification RFID Ταυτοποίηση μέσω ραδιοσυχνότητας
RadioImmunoAssay RIA Pαδιοανοσολογική μέθοδος
Random error Τυχαίο σφάλμα
Σταθερά ταχύτητας αντίδρασης ή Eιδική Tαχύτητα
Rate Constant k Aντίδρασης
Rate Law Nόμος ταχύτητας αντίδρασης
Reaction Order Τάξη αντίδρασης
Reaction Velocity v Ταχύτητα χημικής αντίδρασης
Reagent R Αντιδραστήριο
Reagent Strips Εμβαπτιζόμενες ταινίες
393
Recorder Καταγραφέας
Reference values Τιμές αναφοράς
Refractive Index Δείκτης διάθλασης
Refractive Index Detector Ανιχνευτής δείκτη διάθλασης
Refractometry Διαθλασιμετρία
Rejection rules Κριτήρια για απόρριψη
Relative Density ή Specific Gravity Σχετική πυκνότητα ή ειδικό βάρος
Relative light Units RLU Σχετικές μονάδες φωτός
Relative Standard Deviation RSD Σχετική τυπική απόκλιση
Renal Reabsorption Nεφρική επαναρρόφηση
Renal Rejection Nεφρική απέκκριση
Renin-Angiotensin-Aldosterone system Σύστημα ρενίνης – αγγειοτενσίνης – αλδοστερόνης
Repeatability r Επαναληψιμότητα
Reproducibility R Αναπαραγωγιμότητα
Resolution Rs Διαχωριστική ικανότητα
Resonant Micro-cantilevers RMC Συντονιζόμενοι μικροδοκοί
Respiratory Acidosis Αναπνευστική οξέωση
Respiratory Alkalosis Αναπνευστική αλκάλωση
Συντελεστής κατακράτησης ή παράγοντας κατακράτησης
Retention Factor ή Capacity Factor k' ή παράγοντας χωρητικότητας
Retention Time tR Xρόνος κατακράτησης ή χρόνος ανάσχεσης
RP-
Reversed Phase HPLC HPLC HPLC αντίστροφης φάσης
Rheumatoid factors RF Ρευματοειδείς παράγοντες
Rotation energy Ενέργεια περιστροφής
Sample Aspirator Σύστημα εισόδου δείγματος με αναρρόφηση
Sample Injection Έγχυση ή ένεση δείγματος
Sample Loop Βρόγχος εισαγωγής δείγματος
Sample Preparation Module SPM Τμήμα προετοιμασίας του δείγματος
Sandwith Μη συναγωνιστική ανοσοχημική μέθοδος
Scan Σάρωση
Selectivity Eκλεκτικότητα
Sensitivity Ευαισθησία
Ο πρώτος σειριακός Αυτόματος Βιοχημικός αναλυτής
Sequential Multiple Analyzer Computer SMAC πολλαπλών δοκιμασιών
Serum proteins Electrophoresis SPE Ηλεκτροφόρηση πρωτεινών ορού
Signal Σήμα
Silica Διοξείδιο του πυριτίου
Silica Gel Πηκτή διοξειδίου του πυριτίου
Simvastatin Σιμβαστατίνη
Single External Standard Method Μέθοδος ενός εξωτερικού προτύπου
Single Photon Avalanche Diodes SPAD Δίοδος χιονοστιβάδας μεμονωμένου φωτονίου
Size exclusion chromatography Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού
Société Française de Biologie Clinique SFBC Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας
Solid support Στερεό υπόστρωμα
Solvent Διαλύτης
Specific Activity Ειδική δραστικότητα
Specificity Eιδικότητα
Spectral Βιο-barcoding SBBC Φασματικού βιο-γραμμωτού κώδικα
Καμπύλη αναφοράς που περνά από τα ιδανικότερα σημεία
Spline μεταξύ των τιμών των προτύπων
Standard Std Πρότυπο δείγμα
Standard Curve Καμπύλη αναφοράς
Standard Deviation SD Τυπική απόκλιση
394
Static phase Στατική φάση
Stationary Phase Στατική φάση
Steady-state Phase Φάση σταθεροποιημένης κατάστασης
Stop dilution Διάλυμα τερματισμού
Streptavidin Στρεπταβιδίνη
Stretching vibration Δόνηση τάσης
Substrate SUB Υπόστρωμα
SL-FIA Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί με επισημασμένο
Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay υπόστρωμα
Supercooling Yπέρψυξη
Surface Plasmon Resonance SPR Επιφανειακός συντονισμός πλασμονίων
Επιφανειακά βελτιωμένη μέσω LASER απορρόφηση ιό-
Surface-Enhanced LASER Desorption Ioniza- SELDI- ντων μέθοδος φασματομετρίας μάζας βασισμένη στο χρό-
tion Time-of-Flight Mass Spectrometry TOF-MS νο πτήσης των πεπτιδίων
Suspended Micro-channel Resonator SMR Αναρτημένο αντηχείο μικροδιαύλων
Systematic error Συστηματικό σφάλμα
Χρωματογραφία συζευγμένη με διαδοχική τεχνική ανί-
Tandem Chromatography χνευσης
Thin Layer Chromatography TLC Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας
Time-resolved fluorescence immunoassay TR-FIA Mέθοδος χρονικά διαχωριζομένου φθορισμού
Tonicity Τονικότητα
Total error Ολικό σφάλμα
Trace elements Ιχνοστοιχεία
Traceability Ιχνηλασιμότητα
Tracer Ιχνηθέτης
Trichloroacid TCA Τριχλωροξεικό οξύ
True value Αληθή τιμή
Trueness Ορθότητα
Turnover Number kcat Αριθμός Μετατροπής ή αριθμός ανακύκλισης
Uncertainty Αβεβαιότητα
Urine Ούρα
Urolith Ουρόλιθος
UV/Vis Detector Ανιχνευτής ορατού-υπεριώδους
Uv-vis spectroscopy Φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού
UV-VIS-NIR Υπεριώδες - Ορατό - Εγγύς Υπέρυθρο
Vacuum Pump Αντλία κενού
Variance Διακύμανση
Vibration energy Ενέργεια δόνησης
Warning rules Προειδοποιητικά κριτήρια
Wash dilution Διάλυμα πλύσης
Waste collector Δεξαμενή αποβλήτων
Waste segregation Διαχωρισμός αποβλήτων
Wavelength λ Μήκος κύματος του φωτός
Wavenumber Κυματαριθμός
Westard multirules Κριτήρια ελέγχου Westgard
Whispering Gallery Mode WGM Φαινόμενο της Στοάς που ψιθυρίζει
Working Range Χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων
Working Reagent WR Αντιδραστήριο εργασίας
Xanthine Ξανθίνη
Zeroing Μηδενισμός οργάνου
395
Ελληνοαγγλικό λεξιλόγιο
2,2-άζινο δις-(3-αιθυλβενζοθειαζολίνη-6-σουλφονικό 2,2' azino-di(3-ethyl-benzοthiazoline sul-

οξύ ABTS fonic acid-6)
"Σημείο προς σημείο", καμπύλη βαθμονόμησης που
περνά από όλα τα σημεία. Point to point
(Ανιχνευτής) πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού NMR Nuclear Magnetic Resonance (Detector)
(Ανιχνευτής) υπερύθρου IR Infrared (Detector)
2-μεθυλ-2H-ισοθειαζολ-3-όνη ΜΙΤ 2-methyl-4-isothiazolin-3-one
3-(π-υδροξυφαινυλο) προπιονικό οξύ HPPA 3-(p-hdroxyphenyl) propionic acid
3,3’,5,5’-τετραμεθυλοβενζιδίνη TMB 3,3',5,5'-tetramethyl-benzindine
4-μεθυλο φωσφορική ουμπελιφερόνη MUP 4-methylumbelliferyl phosphate
4-methylumbelliferyl-β-D-
4-μεθυλουμπελιφαιρολ-β-D γαλακτοπυρανοζίδιο MUG galactopyranoside
5-βρωμο-5-νιτρο-1,3-διοξάνιο BND 5-Bromo-5-nitro-1,3-dioxane
6-φωσφορική αφυδρογονάση της γλυκόζης G6P-DH Glucose 6P-dehydrogenase
Aιμογλοβίνη ή αιμοσφαιρίνη Ηb ή HgB H(a)emoglobin
Aνάλυση επιπέδων ηλεκτρολυτών Electrolyte Panel Analysis
Aνιχνευσιμότητα Detectability
Aνοσοενζυμική ενισχυμένη μέθοδος EMIT Enzyme Multiplied Immunoassay Technique
Aνοσοενζυμική μέθοδος με πλάκα μικροτιτλοδότησης MEIA Microplate enzyme immunoassay
Aριθμός θεωρητικών πλακών Ν Plate Number
Bαθμονομητής Cal Calibrator
Eιδικότητα Specificity
Eκλεκτικότητα Selectivity
Eπικύρωση μεθόδου Method Validation
HPLC αντίστροφης φάσης RP-HPLC Reversed Phase HPLC
HPLC κανονικής Φάσης ΝP-HPLC Normal Phase HPLC
Kρίσιμο ζεύγος (Aναλυτών) Critical Pair of Analytes
LASER διόδων LD LASER Diode (LDs
Mέθοδος ελαχίστων τετραγώνων Least Squares Method
Mέθοδος χρονικά διαχωριζομένου φθορισμού TR-FIA Time-resolved fluorescence immunoassay
Nεφρική απέκκριση Renal Rejection
Nεφρική επαναρρόφηση Renal Reabsorption
Nόμος ταχύτητας αντίδρασης Rate Law
Oγκοϋποδοχέας ή τασεοϋποδοχέας Pressure Sensor
Oλοκληρωμένo ηλεκτρονικό κύκλωμα Microchip
o-νιτροφαινυλ-β-D-γαλακτοπυρανοσίδης oNPG o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside
Pαδιοανοσολογική μέθοδος RIA RadioImmunoAssay
Xρόνος κατακράτησης ή χρόνος ανάσχεσης tR Retention Time
Xρωµατογραφία προσρόφησης Adsorption Chromatography
Yπέρψυξη Supercooling
Αβεβαιότητα Uncertainty
Αβιδίνη Avidin
Αγαρόζη Agarose
396
Αγωγιμομετρικός ανιχνευτής Conductivity Detector
Αέρια χρωματογραφία GC Gas Chromatography
Ακουστικό αντηχείο μικρο-Η/Μ Συστημάτων Micro-E/M Systems Acoustic Resonator
Ακρίβεια Accuracy
Αληθή τιμή Correct value
Αληθή τιμή True value
Αλκαλαιμία Alkalemia
Αλκαλική φωσφατάση ALP Alkaline Phospatase
Αμυλάση AMS Amylase
Αναλογικό συστηματικό σφάλμα Propotional error
Arterial Blood Gas Analysis ή ABG Analy-
Ανάλυση αερίων αρτηριακού αίματος sis
Ανάλυση πολωμένου φθορισμού FPIA Fluorecense Polarization ImmunoAssay
Αναλυτικά σφάλματα Analytical errors
Αναλυτική ευαισθησία Analytical fuctionality
Αναπαραγωγιμότητα Inter-assay Precision ή Reproducibility
Αναπαραγωγιμότητα R Reproducibility
Αναπνευστική αλκάλωση Respiratory Alkalosis
Αναπνευστική οξέωση Respiratory Acidosis
Αναπνευστική ρύθμιση Pulmonary Control
Αναρτημένο αντηχείο μικροδιαύλων SMR Suspended Micro-channel Resonator
Ανηγµένος χρόνος κατακράτησης tR' Adjusted Retention Time
Ανθρακικό ασβέστιο Calcium carbonate
Ανιχνευτής Detector
Ανιχνευτής (διάταξη) συζευγμένου φορτίου CCD Charge-coupled devices
Ανιχνευτής δείκτη διάθλασης Refractive Index Detector
Ανιχνευτής ορατού-υπεριώδους UV/Vis Detector
Ανιχνευτής συστοιχίας φωτοδιόδων DAD Diode Array Detector
Ανοσοενζυμική μέθοδος κηλίδας ELISPOT Enzume linked Immuno – SPOT
Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός EIA EnzumeImmunoAssay
Ανοσοενζυμικός προσδιορισμός προσδεδεμένων αντι-
σωμάτων ELISA Enzume-Linked immunoSorbent Assay
Ανοσομέθοδος Immunoassay
Ανοσοραδιομετρική μέθοδος IRMA ImmunoRadioMetric Assay
Ανοσοσύμπλεγμα Immunocomplex
Ανοσοσφαιρίνη Ig Immunoglobulin
Ανοσοφθορισμομετρική ενισχυμένη διάσταση λανθα- DELFIA Dissociation-Enhanced Lanthanide Fluores-
νιδών cent Immunoassay
Ανοσοφθορισμομετρικοί προσδιορισμοί με επισημα- SL-FIA
σμένο υπόστρωμα Substrate-Labeled Fluorescent Immunoassay
Ανοσοχημειοφωταύγεια CIA Chemiluminescence ImmunoAssays
Ανοσοχημειοφωταύγεια καναλιού οξυγόνου LOCI Luminescent oxygen channeling
Immunoassay
Ανοσοχημειοφωταυγειομετρική μέθοδος ICMA ImmunoChemiluminescentMetric Assay
Ανταγωνιστική μέθοδος Competitive method
Αντιγόνο Ag Antigen
Αντιδιουρητική ορμόνη ή βασοπρεσίνη ADH Antidiuretic Hormone ή Vasopressin
Αντιδραστήριο R Reagent
397
Αντιδραστήριο εργασίας WR Working Reagent
Αντιρροπούμενη διαταραχή Compensated Disorder
Αντίσωμα Ab Antibody
Αντισώματα έναντι των ποντικιών HAMA Human anti-mouse antibodies
Αντλία Pumb
Αντλία κενού Vacuum Pump
Απαερωτής Degaser
Απορροή διαμύκους υπερχύλισης Lateral overflow drain
Απορρόφηση Α Absorbance
Απορρόφηση ακτινοβολίας ABS Absorbance of radiation
Αποτέφρωση Incineration
Αποτίμηση της ποιότητας Quality Assessment
Άπω υπέρυθρη περιοχή FIR Far-infrared
Αριθμός Μετατροπής ή αριθμός ανακύκλισης kcat Turnover Number
Αρχική συγκέντρωση υποστρώματος S0 Initial Substrate Concentration
Αρχική ταχύτητα αντίδρασης v0 Initial Reaction Rate
AST ή Aspartate Τransaminase ή Glutamate-
Ασπαρτική αμινοτρανσφεράση GOT Oxaloacetate Transaminase
Αστικά Απόβλητα Municipal waste
Αυτόκαυστο αποστείρωσης Autoclavin
Αυτόματος αναλυτής αερίων AAA Blood Gas Analyser
Βαθμιδωτή έκλουση Gradient elution
Βαθμονόμηση Calibration
β-γαλακτοσιδάση β-GAL b-Galactosidase
Βελτίωση της ποιότητας Quality Improvement
Βιοκίνδυνος Biohazard
Βιολογικός δείκτης ή βιοδείκτης Biological indicator ή biomarker
Βιοτίνη Biotin
Βρόγχος εισαγωγής δείγματος Sample Loop
Βρωμιούχο κάλιο KBr Potassium bromide
Γαλακτική αφυδρογονάση ή γαλακτική δεϋδρογενάση LDH Lactate Dehydrogenase
Γαλλική Ένωση Κλινικής Βιολογίας SFBC Société Française de Biologie Clinique
Γενετική προδιάθεση Genetic predisposition
Deutsche Vereinte Gesellschaft für
Γερμανική Ένωση Κλινικής Χημείας και Εργαστηρια- Klinische Chemie und Laboratoriums
κής Ιατρικής DGKL Μedizin
Γλουταραλδεύδη Glutaraldehyde
Γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη Glycosylated H(a)emoglobin
Γραμμική εξίσωση συσχέτισης Linear Regression Equation
Γραμμική περιοχή Linear Range
Γραμμική συσχέτιση Linear Regression
Γραμμικό μόριο Linear molecule
Γραμμικότητα Ln Linearity
Γραφείο Προτύπων της Ευρωπαϊκής Ένωσης BCR Community Bureau of Reference
Γραφίτης Grafite Tube
Δείγμα ελέγχου CS Control sample
Δείκτης διάθλασης Refractive Index
398
Δεξαμενή αποβλήτων Waste collector
Διαβήτης Diabetes
Διαβρωτικό Corrosive
Διάγραμμα ελέγχου Control chart
Διάγραμμα συσχέτισης Correlation plot
Διαθλασιμετρία Refractometry
Διαιρέτης δέσµης Beam splitter
Διακύμανση Variance
Διάλυμα πλύσης Wash dilution
Διάλυμα τερματισμού Stop dilution
Διαλύτης Solvent
Διαφορική διάγνωση Differental Diagnosis
Διαχωρισμός αποβλήτων Waste segregation
Διαχωριστική ικανότητα Rs Resolution
International Federation of Clinical Chemis-
Διεθνής Ένωση Κλινικής Χημείας IFCC try
Διεθνής μονάδα IU International Unit
Διεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα Interlaboratory reproducibility
Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης NAD+ Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης, ανηγμένη Nicotinamide Adenine Dinucleotide Re-
μορφή NADH duced Form
Δίοδος χιονοστιβάδας μεμονωμένου φωτονίου SPAD Single Photon Avalanche Diodes
Διοξείδιο του άνθρακα CO2 Carbon dioxide
Διοξείδιο του πυριτίου Silica
Διπολική ροπή Dipole moment
Διχρωματική ανάλυση Bichromatic Analysis
Δόνηση κάμψης Bending vibration
Δόνηση τάσης Stretching vibration
Δυναμική περιοχή συγκεντρώσεων Dynamic Range
Εγγύς υπέρυθρη περιοχή NIR Near-infrared
Εγκιβωτισμένος δίαυλος Burried channel
Έγχυση ή ένεση δείγματος Sample Injection
Ειδική δραστικότητα Specific Activity
Εκνεφωτής Nebulizer
Εκρηκτικό Explosive
Έλεγχος αραίωσης Dilution Check
Έλεγχος διαφυγής δυναμικού Drain Voltage control
Έλεγχος ποιότητας QC Quality Control
Έλλειμμα βάσης Base Deficit
Έλλειψη ακρίβειας Inaccuracy
Εμβαπτιζόμενες ταινίες Reagent Strips
Εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο Magnesium ammonium phosphate
Ενδοεργαστηριακή αναπαραγωγιμότητα Intralaboratory reproducibility
Ενέργεια δόνησης Vibration energy
‡
Ενέργεια ενεργοποίησης ΔG Activation Energy
Ενέργεια περιστροφής Rotation energy
Ενεργειακό επίπεδο Energy level
399
Ενεργό κέντρο Active Site
Ενεργοποιητής Activator
Ενζυμική ενεργότητα ή δραστικότητα Enzyme Activity
Ενζυμική συγκέντρωση C Enzyme Concentration
Ένζυμο Enzyme
Εξαχνωτής γραφίτη Furnace
Εξοκινάση HK Hexokinase
Εξωκυττάριος όγκος EFV Extracellular Fluid Volume
Επαγγελματική έκθεση Occupational Exposure
Επαγγελματικός κίνδυνος Occupational Hazard
Επαναληπτικότητα Intra-assay Precision ή Repeatability
Επαναληψιμότητα r Repeatability
Επιβλαβές Harmful
Επικίνδυνα απόβλητα Hazardous Waste
Επίπεδη χρωματογραφία Planar chromatography
Επισήμανση Flag
Επίτοπος Epitope
Επιφανειακά βελτιωμένη μέσω LASER απορρόφηση
ιόντων μέθοδος φασματομετρίας μάζας βασισμένη στο SELDI- Surface-Enhanced LASER Desorption Ioni-
χρόνο πτήσης των πεπτιδίων TOF-MS zation Time-of-Flight Mass Spectrometry
Επιφανειακός συντονισμός πλασμονίων SPR Surface Plasmon Resonance
Εργαστηριακά συστήματα πληροφοριών LIS Laboratory Ιnformation Systems
Εργαστηριακές διαδικασίες Quality laboratory processes
Ερεθιστικό Irritant
Ερυθρό χλωροφαινόλης-β-D-γαλακτοπυρανοσίδης CPRG Clorophenolic red-β-D-galactopyranoside
Ετερόφιλα αντισώματα Heterophilic antibodies
Ευαισθησία Sensitivity
Εύρος γραμμικότητας Linearity Range
Εύρος κορυφής W Peak Width
Εύρος μέτρησης MR Measuring range
Ηλεκτρόδιο Electrode
Ηλεκτρολύτης Electrolyte
Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα Electromagnetic spectrum
Ηλεκτρονιακές διαμορφώσεις Electronic configurations
Ηλεκτρονιακή διαμόρφωση θεμελιώδους κατάστασης Ground state electron configuration
Ηλεκτροουδετερότητα Electroneutrality
Ηλεκτροφόρηση Electrophoresis
Ηλεκτροφόρηση πρωτεινών ορού SPE Serum proteins Electrophoresis
ECL ή
Ηλεκτροχημειοφωταύγεια eCLIA ElectroChemiLuminescese
Ηλεκτροχημικός ανιχνευτής Electrochemical Detector
Ιατρικά απόβλητα Medical Waste
Ιατρική παρακολούθηση Medical Surveillance
Ιατροδιαγνωστικά προιόντα IVD In vitro diagnostics
Ιόν Ion
Ιοντοεπιλεκτικά ηλεκτρόδια ISE Ion Selective Electrode
Ισοθειοκυανική φλουορεσκείνη FITC Fluorescin isothiocyanate
400
Ισοκρατική έκλουση Isocratic Elution
Ισομερίδια Aliquot
Ισότονο διάλυμα Isotonic Solution
Ιχνηθέτης Tracer
Ιχνηλασιμότητα Traceability
Ιχνοστοιχεία Trace elements
Καμπύλη αναφοράς Standard Curve
Καμπύλη αναφοράς που περνά από τα ιδανικότερα
σημεία μεταξύ των τιμών των προτύπων Spline
Καμπύλη βαθμονόμησης Calibration curve
Καταγραφέας Recorder
Καταλύτης Catalyst
Κατατμητής Chopper
Καυστήρας Burner
Κβαντικές τελείες ή κηλίδες QDs Quantum Dots
Κινητή φάση Mobile phase
Κινητική μέθοδος Kinetic Method
Κλασματοσυλλέκτης Fraction Collector
Κοινή συναίνεση, συμφωνία Closeness
Κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο ANP Atrial Natriuretic Peptide
Κορεσμός οξυγόνου στο αρτηριακό αίμα SaO2 Oxygen Saturation
Κριτήρια για απόρριψη Rejection rules
Κριτήρια ελέγχου Westgard Westard multirules
Κρούσεις ανά λεπτό Cpm Counts per min
Κυματαριθμός Wavenumber
Κυστίνη Cystine
Κυψελίδα Cuvette
Κώδικας Καλής Εργαστηριακής Πρακτικής Code of Good Laboratory Practice
Λάθος (ανθρώπινο σφάλμα που επηρρεάζει τα αποτε-
λέσματα) Mistake
Λόγος απόδοσης Quantum yield
Μαγνητικά σφαιρίδια όπου συγκολλούνται αντισώμα-
τα σε ανοσοχημικούς προσδιορισμούς PMP Paramagnetic particles
Μέγιστη ταχύτητα vmax Maximum Velocity
Μέθοδος ενός εξωτερικού προτύπου Single External Standard Method
Μέθοδος μεταφοράς φθορισμομετρικής ενέργειας FETI Fluoresence Energy Tranfer Immunoassay
Μέθοδος τελικού σημείου End Point Method
Μεικτές οξεoβασικές διαταραχές Mixed Αcid-Βase Disorders
Μεικτό (σταθερό και αναλογικό) συστηματικό σφάλμα Combined error
Μερική πίεση διοξειδίου του άνθρακα PCO2 Carbon Dioxide Partial Pressure
Μερική πίεση οξυγόνου PO2 Oxygen Partial Pressure
Μερική πίεση στο αρτηριακό αίμα Pa Arterial Partial Pressure
Μέση υπέρυθρη περιοχή MWIR Mid-wavelength infrared
Μετα-αναλυτικά σφάλματα Post-analytical errors
Μεταβολική αλκάλωση Metabolic Alkalosis
Μεταβολική οξέωση Metabolic Acidosis
Μετατροπέας υποστρώματος Matrix Modificator
401
Μετρούμενη ωσμωτικότητα Measured Osmolarity
Μη ανταγωνιστική μέθοδος Non-competitive method
Μη γραμμικό μόριο Non linear molecule
Μη συναγωνιστική ανοσοχημική μέθοδος Sandwith
Μηδενισμός οργάνου Zeroing
Μήκος διαδρομής ακτινοβολίας d Light Beam Path Length
Μήκος κύματος του φωτός λ Wavelength
Μηλική αφυδρογονάση MDH Malate Dehydrogenase
Μήτρα Matrix
Μηχανισμοί αντιρρόπησης Compensatory Μechanisms
Μικρογραφημένη εργαστηριακή διάταξη LOC Lab-on-a-Chip
Μικροδιατάξεις, μικροσυστοιχίες Microarrays
Μικροσωματιδιακή ανοσοενζυμική ανάλυση PACIA PaArticle Counting ImmmunoAssay
Μολυσματικά απόβλητα Infectious waste
Μονάδες ενζυμικής δραστικότητας U Enzyme Units
Μονοχρωµάτωρας Monochromator
Μοριακός συντελεστής απόσβεσης (ή απορρόφησης) ε Molar Extinction Coefficient
Μυκοπρωτεΐνη Mucoprotein
Νεκρός χρόνος Dead time
Νεκρός χρόνος t0 Hold-up Time
Νομόγραμμα Nomogram
Νοσοκομειακά συστήματα πληροφοριών HIS Hospital Ιnformation Systems
Ξανθίνη Xanthine
Ο πρώτος σειριακός Αυτόματος Βιοχημικός αναλυτής
πολλαπλών δοκιμασιών SMAC Sequential Multiple Analyzer Computer
Ολικό σφάλμα Total error
Οξαλικό ασβέστιο Calcium oxalate
Οξεία διαταραχή Acute Disorder
Οξειδάση της γλυκόζης GOD Glucose Oxidase
Οξείδιο αργιλίου Alumina
Οξεοβασική ισορροπία Acid-Base Balance
Οξυαιμία Acidemia
Ορθo-φαινυλενοδιαμίνη OPD o-phenylenediamine
Ορθότητα Trueness
Όρια έκθεσης Exposure limits
Όριο ανίχνευσης LOD Limit of detection
Όριο ανίχνευσης DL Detection Limit
Όριο γραμμικότητας LOL Limit of Linearity
Όριο ποσοτικοποίησης LOQ Limit of quantification
Ούρα Urine
Ουρόλιθος Urolith
Παλμικό οξύμετρο δακτύλου Fingertip Pulse Oximeter
Παράγοντας χωρητικότητας Capacity factor
Παρακλίνιος, εξετάσεις που γίνονται από μη εργαστη-
ριακό προσωπικό POC Point-of-Care
Παρτίδα αναλύσεων Batch
Περιοχή δακτυλικού αποτυπώματος Fingerprint region
402
Περίσσεια βάσης BE Base Excess
Πηκτή διοξειδίου του πυριτίου Silica Gel
Πιστότητα Precision
π-νιτροφαινυλο-φωσφατάση p-NP p-nitrophenyl-phosphate
Πολικότητα Polarity
Πολυκρυσταλλικά συσσωματώματα Polycrystallic clusters
Πολυστυρένιο PS Polystyrene
Πολυχρωματική ανάλυση Polychromatic Analysis
Προαναλυτικά σφάλματα Pre-analytical errors
Προειδοποιητικά κριτήρια Warning rules
Προϊόν P Product
Προπαρασκευστική χρωματογραφία Preparatory chromatography
Προσωπικός προστατευτικός εξοπλισμός Personal Protective Equipment
Πρότυπα ποιότητας Quality standards
Πρότυπα υλικά αναφοράς CRM Certified reference material
Πρότυπο δείγμα Std Standard
Πρωτεϊνη συνδέουσα την μαλτόζη MBP Maltose Binding Protein
Πρωτόκολλο ανάλυσης Analytical Protocol
π-υδροξυφαινυλοξεικό οξύ HPAA p-hydroxyphenylacetic acid
Πύλη επαναφοράς εικονοστοιχείου Pixel reset gate
Ραδιο-αλλεργιοαπορροφητική διαδικασία RAST Radio AllergoSorbent Test
Ραδιο-απορροφητική διαδικασία RΙST Radio ImmunoSorbent Test
Ρευματοειδείς παράγοντες RF Rheumatoid factors
Ρυθμιστικό διάλυμα Buffer
Σάρωση Scan
Σήμα Signal
Σιμβαστατίνη Simvastatin
Σταθερά Michaelis KM Michaelis Constant
Σταθερά ταχύτητας αντίδρασης ή Eιδική Tαχύτητα
Aντίδρασης k Rate Constant
Σταθερό συστηματικό σφάλμα Costant error
Στατική φάση Static phase
Στατική φάση Stationary Phase
Στερεό υπόστρωμα Solid support
Στιγμιαία ταχύτητα αντίδρασης Instantaneous Rate of Reaction
Στρεπταβιδίνη Streptavidin
Συµβολόµετρο Michelson Michelson interferometer
Συζευγμένη μέθοδος Coupled Αssay
Συμβολογράφημα Interferogramm
Συμπαράγοντας Cofactor
Σύμπλοκο ενζύμου‐υποστρώματος ES Enzyme-Substrate Complex
Συνδέτης CON Conjugate
Συνένζυμο Coenzyme
Συντελεστής διακύμανσης CV Coeficient of variation
Συντελεστής κατακράτησης ή παράγοντας κατακράτη-
σης ή παράγοντας χωρητικότητας k' Retention Factor ή Capacity Factor
Συντελεστής κατανομής Partition coefficient
403
Συντελεστής μεταβλητότητας CV Coefficient of Variation
(2) (2)
Συντελεστής συσχέτισης (του Pearson) R ήr Pearson Correlation Coefficient
Συντονιζόμενοι μικροδοκοί RMC Resonant Micro-cantilevers
Συσσωρευτικό αθροιστικό διάγραμμα Cusum chart
Σύστημα εισαγωγής δείγματος Injection System/ Injector Valve
Σύστημα εισόδου δείγματος με αναρρόφηση Sample Aspirator
Σύστημα ρενίνης – αγγειοτενσίνης – αλδοστερόνης Renin-Angiotensin-Aldosterone system
Συστηματικό σφάλμα Systematic error
Σχεδιασμός ποιότητας Quality planning
Σχετικές μονάδες φωτός RLU Relative light Units
Σχετική πυκνότητα ή ειδικό βάρος Relative Density ή Specific Gravity
Σχετική τυπική απόκλιση RSD Relative Standard Deviation
Τάξη αντίδρασης Reaction Order
Ταυτοποίηση μέσω ραδιοσυχνότητας RFID Radio-Frequency Identification
Ταχύτητα ροής Flow Rate
Ταχύτητα χημικής αντίδρασης v Reaction Velocity
Τεχνολογία δέσμευσης ιόντων ICIA Ion-capture immunoassay
Τιμές αναφοράς Reference values
Τμήμα προετοιμασίας του δείγματος SPM Sample Preparation Module
Τονικότητα Tonicity
Τριχλωροξεικό οξύ TCA Trichloroacid
Τριχοειδής στήλη Capillary column
Τριχοειδική ηλεκτροφόρηση Capillary Electrophoresis
Τυπική απόκλιση SD Standard Deviation
Τυφλό ή λευκό διάλυμα Blank
Τυχαίο σφάλμα Random error
Υγιεινή και ασφάλεια Εργασίας Occupational Health and Safety
Υγρή χρωματογραφία LC Liquid Chromatography
Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή υγρή χρωματο-
γραφία υψηλής απόδοσης HPLC High Pressure liquid Chromatography
Υδατάνθρακες Carbohydrates
Υπεραερισμός ή υπερκαπνία Hyperventilation ή Hypercapnia
Υπεριώδες - Ορατό - Εγγύς Υπέρυθρο UV-VIS-NIR
Υπερκαλαιμία Hyperkalemia
Υπερνατριαιμία Hypernatremia
Υπεροξειδάση POD Peroxidase
Υπεροξειδάση της αγριοραπανίδος HRP Horshradish Peroxidase
Υπεροξείδιο του υδρογόνου Η2Ο2 Hydrogen Peroxide
Υπέρτονο διάλυμα Hypertonic Solution
Υποαερισμός ή υποκαπνία Hypoventilation ή Hypocapnia
Υποκαλαιμία Hypokalemia
Υπολογιζόμενη ωσμωτικότητα Calculated Osmolarity
Υπονατριαιμία Hyponatremia
Υπόστρωμα SUB Substrate
Υπότονο διάλυμα Hypotonic Solution
Ύψος θεωρητικής πλάκας Η Plate Height
404
Φαινόμενο αγκίστρου Hook effect
Φαινόμενο της Στοάς που ψιθυρίζει WGM Whispering Gallery Mode
Φαρματοσκοπία ατομικής απορρόφησης Atomic Absorption Spectroscopy
Φάση έναρξης Initiation Phase
Φάση σταθεροποιημένης κατάστασης Steady-state Phase
Φασματικού βιο-γραμμωτού κώδικα SBBC Spectral Βιο-barcoding
Φασματογράφος μάζας MS Mass Spectroscopy (Detector)
Φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού Uv-vis spectroscopy
Φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμούς
Fourier FTIR Fourier Transformed Infrared Spectroscopy
Φθορισμομετρικοί ανιχνευτές Fluorescence Detectors
Φίλτρο ή μονοχρωμάτορας Filter ή monochromator
Φλογοφασματοσκοπία εκπομπής FES Flame Emission Spectroscopy
Φλογοφωτομετρία Flame Spectrometry
Φορητός αναλυτής αερίων αίματος Portable Blood Gas Analyser
Φράγμα δυναμικού Potential barrier
Φυσιολογικές τιμές Normal values
Φωσφολιπίδια Phospholipids
Φωσφορική p-νιτροφαινόλη NPP Nitro-phenol phosphate
Φωσφορικό ασβέστιο Calcium phosphate
Nicotinamide Adenine Dinucleotide
Φωσφορικό δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης NADP+ Phosphate
Φωσφορικό Δινουκλεοτίδιο νικοτιναμιδίου-αδενίνης, Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phos-
ανηγμένη Μορφή NADPH phate Reduced Form
Φωσφορικό μαγνήσιο Magnesium phosphate
Φωταυγειόμετρο ή λουμινόμετρο Luminometer
Φωτοανιχνευτής Photodetector
Φωτόμετρα πλακών μικροτιτλοδότησης Microplate reader
Φωτομετρικός προσδιορισμός Photometric Detection
Φωτόμετρο Photometer
Χαλαζίας μικροϊσορροπίας QCM Quartz Crystal Microbalance
Χάσμα ανιόντων AG Anion Gap
Χημειοφωταύγεια CHIA Chemiluminescence
Χολόλιθος gallstone, bilestone
Χονδροειδές λάθος Gross error
Χρήσιμη αναλυτική περιοχή συγκεντρώσεων Working Range
Χρωµατογραφία κατανοµής Partition Chromatography
Χρωματογράφημα Chromatograph
Χρωματογραφία Chromatography
Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής Ion exchange chromatography
Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας TLC Thin Layer Chromatography
Χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού Size exclusion chromatography
Χρωματογραφία στήλης Column chromatography
Χρωματογραφία συζευγμένη με διαδοχική τεχνική
ανίχνευσης Tandem Chromatography
Χρωματογραφία χάρτου Paper chromatography
Χρωματογραφία χημικής συγγένειας Affinity chromatography
Χρωματογραφική στήλη Chromatography Column
405
Χρωμογόνος ένωση (χρωμογόνο) Chromοgen
Χρώση κυανίνης CD Cyanine Dye
osmol ή
Ωσμώλιο Osm Osmol
Ωσμώμετρο ταπείνωσης σημείου πήξεως ή ωσμώμετρο
κρυοπηξίας Freezing Point Depression Osmometer
Ωσμωμοριακότητα Osmolarity
Ώσμωση Osmosis
Ωσμωτική πίεση Osmotic Pressure
Ωσμωτικό χάσμα Osmolal Gap
Ωσμωτικότητα Osmolality
Ωσμωϋποδοχέας Osmotic Sensor
406

Εργαστηριακές Ασκήσεις Κλινικής Χημείας

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Εργαστηριακές Ασκήσεις Κλινικής Χημείας

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Εργαστηριακές ασκήσεις

ΤΣΟΤΣΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΕΛΕΝΗ

ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΑ

Τσότσου Γεωργία Ελένη,

Copyright © ΣΕΑΒ, 2015

ΣΥΝΔΕΣΜΟΣ ΕΛΛΗΝΙΚΩΝ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΩΝ ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΩΝ

 Θεοδώρα Νικολακοπούλου, Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων

Ο επιμελητής της έκδοσης Πέτρος Καρκαλούσος

1.1 Η φύση του φωτός

1.2 Η Ηλεκτρομαγνητική θεωρία του Μaxwell

Μήκος κύματος (nm) Χρώμα

1.3 Ηλεκτρομαγνητικό Φάσμα

Σχήμα 1.1 Ηλεκτρομαγνητικό φάσμα.

Περιοχή φάσματος Μήκος Κύματος

Πίνακας 1.2 Επιμέρους περιοχές του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος.

1.4 Η Θεωρία του Planck (Θεωρία των κβάντα)

1.6 Ο νόμος Lambert – Beer

Η διαπερατότητα (Τ) εκφράζεται σε % (Αν Τ = 0% τότε η Α = ∞ και αν Τ = 100% τότε η Α = 0).

1.6.1 Οι προϋποθέσεις ισχύος του νόμου Lambert-Beer

Σχήμα 1.3 Σχηματική παράσταση φασματοφωτόμετρου UV - Vis.

1.7.1 Τα κριτήρια επιλογής Φωτόμετρου

Έτσι, όταν η χρήση του αφορά:

Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη και άλλοι παράμετροι, όπως:

1.7.2 Η διαδικασία της Φωτομέτρησης

1.7.3 Οι εφαρμογές της Φασματοφωτομετρίας

1.7.3.1 Ο Ποιοτικός προσδιορισμός (ταυτοποίηση, ανίχνευση)

Π.χ. Στα 280 nm πραγματοποιείται ανίχνευση πρωτεϊνών σε απομονωμένο DNA.

1.7.3.2.1 Ο ποσοτικός προσδιορισμός με Πρότυπο Διάλυμα

Με εφαρμογή του νόμου των Lambert-Beer για τα δύο διαλύματα, έχουμε:

Άγνωστο Διάλυμα: Αx = k l Cx (Εξίσωση 1.2)

Με διαίρεση κατά μέλη έχουμε:

Λύνοντας ως προς Cx έχουμε: Cx = (Αx / Aπ) Cπ (Εξίσωση 1.4)

1.7.3.2.2 Ο ποσοτικός προσδιορισμός με κατασκευή Πρότυπης Καμπύλης

Χρησιμοποιούνται πρότυπα διαλύματα της ουσίας που θέλουμε να αναλύσουμε. Με φωτομέτρηση

Σχήμα 1.4 Πρότυπη καμπύλη.

1.8 Φασματοφωτομετρικές μέθοδοι ανάλυσης στην κλινική βιοχημεία

Οι οπτικές μέθοδοι ανάλυσης περιλαμβάνουν κυρίως τις μεθόδους:

1.9 Η Φασματοφωτομετρία UV-Vis

Σχήμα 1.5 Τυπικό φάσμα στο UV – Vis.

Παραδείγματα αναλυτικής συνάρτησης:

Ποτενσιομετρία (Εξίσωση Nernst):

Πολαρογραφία (Εξίσωση ρεύματος διαχύσεως Ilkovic):

Φασματοφωτομετρία (Νόμος Lambert – Beer):

Υγρή και Αέρια Χρωματογραφία:

1.12 Η Βαθμονόμηση των Ενόργανων μεθόδων

1.13 Οι Καμπύλες Βαθμονόμησης

Οι κυριότερες μέθοδοι βαθμονόμησης που χρησιμοποιούνται είναι:

1.13.1 Η καμπύλη Αναφοράς (ή Πρότυπη καμπύλη)

1.13.2 Η μέθοδος Προσθήκης Γνωστής Ποσότητας (standard addition method)

Συνεπώς, χρησιμοποιείται σε εκείνες τις περιπτώσεις που ισχύουν τα παρακάτω:

Σχήμα 1.6 Αναπαράσταση του πειράματος προσδιορισμού συγκέντρωσης.

Σχήμα 1.7 Αναπαράσταση μέτρησης της απορρόφησης σε φωτόμετρο.

Η «γνωστή» αύξηση της συγκέντρωσης ΔCX υπολογίζεται εύκολα και ως εξής:

H ποσότητα της Χ που προσθέσαμε στο ποτήρι Δ1 είναι VS × CS.

Με τις τιμές που έχουμε δώσει σαν παράδειγμα θα είναι:

Cx = [P0 / (P1 – P0)] / ΔC1 (Εξίσωση 1.13)

Cx = [35,0 / (61,0 – 35,0)] / (5,00 μg X/mL) = 6,73 μg/mL

1.13.3 Ο Γραφικός Υπολογισμός

Σχήμα 1.8 Γραφική παράσταση της παραμέτρου P συναρτήσει του ΔCx.

1.13.4 Η μέθοδος των Πολλαπλών Προσθηκών

Εναλλακτικά, μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε τη μέθοδο των ελαχίστων τετραγώνων για τον

Από την οποία, για την τιμή P = 0, προκύπτει ότι:

1.13.5 Η μέθοδος Παρεμβολής

Εναλλακτικά, υπολογιστικά υπολογίζεται ως ακολούθως: