I.

Giới thiệu chung

1. Vitamin A
Thuật ngữ vitamin A được dùng để chỉ tất cả các hợp chất với hoạt tính sinh học của
tất cả các retinol dạng mạch thẳng (R-OH) bao gồm retinal (R-CHO), retinoic acid
(R-OOH) và một dạng chiếm chủ yếu trong thực phẩm là các este retinyl (R-OO). 
Ngoài ra, một dạng tiền chất để tổng hợp vitamin A ở động vật được gọi là
carotenoid, một hợp chất tan trong dầu, có màu vàng hoặc cam, hầu như chỉ được
tìm thấy ở các loại thực vật.
Có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy trong tự nhiên và hầu hết chúng đều
có cấu tạo hóa học là C40H56On, số lượng nguyên tử oxi sẽ thay đổi trong khoảng từ
0 đến 6.

Hình. Cấu trúc hóa học của các retinoid mang hoạt tính vitamin A
và các carotenoid phổ biến nhất trong tự nhiên (West & Darnton-Hill, 2008)
Vitamin A là một chất dinh dưỡng thiết yếu, nắm vai trò quan trọng như một chất
nền trong quá trình sản xuất tại các tế bào khác nhau. Retinol còn là hợp chất cần
thiết trong quá trình sinh tổng hợp rhodopsin và sản xuất retinoic acid (Ross, 2010).
Retinoic acid (là một chất chuyển hóa từ vitamin A) đã được công nhận là một trong
những nhân tố quan trọng trong việc hỗ trờ duy trì sự khỏe mạnh các tế bào và các
mô trong cơ thể. Retinoic acid có khả năng điều chỉnh sự tăng trưởng của tế bào,
làm chậm tốc độ chu kì của tế bào, từ đó điều chỉnh sự phân hóa của tế bào theo một
hướng có chọn lọc và an toàn hơn, tránh gây ra sự đột biến trong tế bào là tác nhân
chính dẫn đến căn bệnh ung thư. Do đó retinoic acid có chức năng như một cơ quan
điều chỉnh các chức năng của tế bào tại tất cả các mô trong cơ thể, hỗ trợ giảm tỉ lệ
mắc bệnh ung thư trên cơ thể người (Ross, 2010).
Vì vậy, vitamin A là một chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với con người.
Vitamin A cần thiết trong việc điều chỉnh nhiều quá trình sinh học trong cơ thể gồm
các quá trình hình thành, tăng trưởng, phát triển thị lực, sinh sản và miễn dịch của
con người. Việc thiếu hụt vitamin A trong cơ thể lâu dài có thể gây ra các vấn đề về
mắt như gây viêm mắt, mù lòa hay gây ra các ca tử vong sớm ở trẻ em do tiêu chảy,
sởi, sốt rét hoặc nhiễm trùng ở trẻ (West & Darnton-Hill, 2008).
2. Vitamin D
Vitamin D là một vitamin cần thiết cho sự phát triển của các động vật bậc cao và
đặc biệt là con người. Vitamin D là một trong những thành phần điều hòa sinh
học quan trọng nhất trong quá trình chuyển hóa calcium trong cơ thể người
(Norman, 2012).

Vitamin D được tổng hợp trên da người khi tiếp xúc và được tác động dưới tia
cực tím trong ánh nắng mặt trời hoặc có thể được hấp thu qua thực phẩm, đặc
biệt là mỡ cá.

Quá trình chuyển hóa vitamin D trong cơ thể: vitamin D sau khi được dung nạp
vào cơ thể người sẽ được hydroxyl hóa ở gan thành 25-hydroxyvitamin D
(25(OH)D) và sau đó tại thận sẽ được chuyển hóa thành 1,25-dihydroxyvitamin
D (1,25(OH)2D), một chất có hoạt tính chuyển hóa có thể thâm nhập vào tế bào,
sau đó liên kết với cơ quan thụ cảm vitamin D và sau đó là gen tương ứng trong
tế bào chẳng hạn như gen quy định protein liên kết với calcium. Sau khi phiên
mã và dịch mã, các protein liên kết với calcium được hình thành. Protein liên kết
canxi còn là một chất trung gian cho quá trình hấp thu calcium trong ruột (Lips,
2006).

Vai trò của vitamin đối với sự phát triển của cơ thể con người đặc biệt là trẻ sơ
sinh và trẻ nhỏ là rất quan trọng. Việc thiếu hụt vitamin D trong dinh dưỡng về
lâu dài có thể gây ra các biến chứng không tốt như gây ra bệnh còi xương hoặc
nhuyễn xương, các chất cấu tạo nên bộ xương không được khoáng hóa, khiến
cho xương giòn, loãng xương và còn có thể gây tiêu xương dẫn đến xương dễ
gãy, ảnh hưởng xấu đến chất lượng cuộc sống, sức khỏe (Lips, 2006).

II.Xác định hàm lượng vitamin A-D trong thực phẩm

(Theo QCVN)
 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ HAI LẦN
LC-MS/MS
1. Nguyên tắc
Mẫu bột sữa gầy sẽ được xà phòng hóa bằng ethanol với KOH 50% và chất
chống oxi hóa pyrogallic acid để chuyển các chất béo về dạng acid béo và chuyển
retinol este về retinol, sau đó sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng để chiết mẫu,
mẫu sau khi chiết được làm bay hơi dung môi chiết. Cuối cùng mẫu được hòa tan lại
và phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS.
2. Hóa chất và thuốc thử

 Ethanol (C2H5OH,Merck, độ tinh khiết 99.6%)

 Methanol (CH3OH,Merck, độ tinh khiết 99.9%)
 Acetonitrile (CH3CN,Merck, độ tinh khiết 99.9%)
 Hexane (CH3(CH2)4CH3,Merck, độ tinh khiết 99.0%)
 Potassium hydroxide (KOH, Merck, độ tinh khiết 85.0%)
 Pyrogallic acid (C6H3(OH)3, Merck)
 Nước cất
 Nước khử ion (DIW)
 Dung dịch ethanol chứa 2% acid pyrogallic
 Dung dịch KOH 50% (w/v)
 Dung dịch rửa tạp KOH 0.15M
 Dung môi chiết mẫu (n-hexane chứa 12.5 mg/L BHT
 Dung môi hòa tan mẫu ACN:H2O = 7:3 
 Pha động A: nước 20%MeOH 0.1%HCOOH
 Pha động B: MeOH 0.1%HCOOH
 Chuẩn vitamin D2 (ergocalciferol)
 Chuẩn vitamin D3 (cholecalciferol)
 Nội chuẩn vitamin D2 – [2H3] (1mg/mL = 40000 IU/mL), được phối trộn sẵn
từ nhà sản xuất
 Nội chuẩn vitamin D3 – [2H3] (1mg/mL = 40000 IU/mL), được phối trộn sẵn
từ nhà sản xuất
 Dung dịch nội chuẩn gốc (~1600 IU/mL)
 Hỗn hợp nội chuẩn trung gian (~20 IU/mL)
  Chuẩn vitamin A (all-trans retinyl palmitate) 2000 mg/L
3. Thiết bị và dụng cụ
a. Thiết bị

 Thiết bị sắc ký lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần (LC-MS/MS) gồm:

- Hệ bơm dung môi

- Hệ thống tiêm mẫu tự động
- Cột sắc ký
- Lò gia nhiệt cột sắc ký
- Hệ thống phân tích khối phổ

 Cân phân tích , độ chính xác 0.0001 g

 Máy xay mẫu
 Bể điều nhiệt (bếp cách thủy)
 Bể siêu âm
 Thiết bị cô quay chân không
 Máy lắc vortex
b. Dụng cụ

- Màng lọc PTFE 0.45 µm

- Phễu chiết 250 mL, 500 mL
- Pipet thủy tinh các loại
- Micropipet các loại
- Bình định mức 100 mL
- Bình cầu 250 mL
- Một số dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.

4. Chuẩn bị mẫu
a. Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu khi nhận sẽ được xử lý ngay hoặc bảo quản mẫu trong tủ lạnh không quá
5 C cho đến khi xử lý.
o

b. Chuẩn bị chuẩn vitamin D và vitamin A

 Chuẩn vitamin D
Dung dịch chuẩn gốc 1000 mg/L: cân chính xác 10.00 mg từng chất chuẩn
vitamin D2, vitamin D3 vào hai bình định mức 10ml. Hòa tan chất chuẩn và định
 mức đến vạch bằng n-hexane. Chuẩn được bảo quản ở (-18±40) oC, tránh ánh sáng
và có thể sử dụng được trong hai tháng.

Hỗn hợp chuẩn trung gian 1 (20 mg/L): rút 0.2 mL từng chuẩn gốc vitamin D2
và vitamin D3 vào ống thủy tinh, thôi khô và hòa tan lại chính xác bằng 10ml ACN.
Chuẩn được bảo quản ở (-18±40)oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng được trong
hai tháng.

Hỗn hợp chuẩn trung gian 2 (2 mg/L): rút 1 mL dung dịch chuẩn trung gian 1 đã
được bảo quản cho vào bình định mức 10 mL, định mức đến vạch bằng ACN.
Chuẩn được bảo quản ở (-18±40)oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng được trong
hai tháng.

Dung dịch chuẩn làm việc 5.0, 20.0, 50.0 và 200.0 (mg/L) được pha theo bảng
2.4, chuẩn được bảo quản ở (-18±40)oC, tránh ánh sáng và có thể sử dụng được
trong hai tháng.

Bảng 2.4 Bảng chuẩn bị dung dịch chuẩn theo từng nồng độ (vitamin D)

Chuẩn Chuẩn Chuẩn

  Chuẩn 4
1 2 3

Nồng độ chuẩn làm việc

5.0 20.0 50.0 200.0
(D2=D3) (mg/L)

Vrút dung dịch chuẩn 2.0

0.025 0.10 0.25 1.00
mg/L (mL)

Thể tích định mức bằng

10 10 10 10
ACN (mL)

 Chuẩn vitamin A

Dung dịch chuẩn gốc 2000 mg/L

Dung dịch chuẩn làm việc 0.5, 2.0, 5.0, 10.0, 40.0 (mg/L) được pha theo bảng
2.5, các dung dịch chuẩn được rút theo đơn vị (mL), chuẩn được bảo quản ở nhiệt
độ phòng và sử dụng trong ngày.

Bảng 2.5 bảng chuẩn bị dung dịch chuẩn theo từng nồng độ (vitamin A)

Chuẩn Chuẩn Chuẩn 3 Chuẩn Chuẩn

 1 2 4 5

Nồng độ chuẩn 0.5 2.0 5.0 10.0 40.0

làm việc (mg/L)

Vrút dung dịch - - - - 0.5

chuẩn 2000 mg/L

Vrút dung dịch - - - 0.25 -

chuẩn 2000 mg/L

Vrút dung dịch - - 1.25 - -

chuẩn 5 (40.0 mg/L)

Vrút dung dịch - 0.5 - - -

chuẩn 5 (40.0 mg/L)

Vrút dung dịch 0.5 - - - -

chuẩn 4 (10.0 mg/L)

Thể tích định mức 10.0 10.0 10.0 50.0 25.0

bằng ACN (mL)

5. Quy trình thực hiện

 Hình 1. Sơ đồ quy trình xác định hàm lượng vitamin A và vitamin D

 Xà phòng hóa mẫu

Cân 5±0.0001 g mẫu bột sữa đã xử lý vào bình cầu 250ml. Sau đó thêm vào
bình chứa mẫu 40 mL ethanol có chứa 2%  pyrogallic acid và 20 mL KOH 50%.
Bình cầu chứa hỗn hợp sau đó được đun trên bếp cách thủy trong 15 phút ở 90oC.

Trong quá trình xà phòng hóa, pyrogallic acid có tác dụng chống oxi hóa nhằm
bảo vệ hàm lượng vitamin A và vitamin D trong mẫu không bị oxi hóa vởi oxi trong
không khí gây sai lệch kết quả. Bên cạnh đó KOH 50% đóng vai trò tạo môi trường
kiềm cho quá trình thủy phân chất béo trong mẫu.

 Chiết mẫu
Hỗn hợp chứa dịch mẫu sau khi được xà phòng hóa sẽ được chuyển toàn bộ vào
một phễu chiết 250 mL.

Ở lần chiết thứ nhất ta thêm 50 mL n-hexane (chứa 12.5 mg/L BHT), sau đó lắc
đều liên tục trong một phút. Hỗn hợp dung dịch sau đó sẽ tách thành hai lớp gồm
một lớp chứa n-hexane ở phía trên và lớp nước ở phía dưới.

Tiếp tục chuyển lớp nước ở phía dưới vào bình cầu dùng để xà phòng hóa mẫu,
lớp chứa n-hexane sẽ được chuyển vào một bình cầu khác.

Lớp nước thu lại vào bình cầu ở lần chiêt thứ nhất sẽ tiếp tục được chuyển lại
vào phễu chiết đã sử dụng để chiết ở lần chiết thứ nhất, tiếp tục thêm 50 mL n-
hexane (chứa 12.5 mg/L BHT), sau đó lắc đều trong một phút và tách lớp nước vào
bình cầu xà phòng hóa mẫu, lớp chứa n-hexane sẽ được gộp chung vào bình cầu
chứa n-hexane của lần chiết thứ nhất.

Mẫu sẽ được chiết 3 lần, các quy trình giống như lần chiết thứ nhất nhằm đảm
bảo chiết hoàn toàn chất phân tích trong mẫu.

 Cô quay và lọc
Lớp chứa n-hexane ở ba lần chiết sẽ được thu lại và gộp chung vào một bình
cầu. Hỗn hợp thu được sẽ mang đi cô quay đến khô.

Sau khi cô quay đến khô, thêm 10 mL ACN-H 2O (theo tỉ lệ 7:3) để hoa tan chất
khô trong bình cầu. Mang hỗn hợp thu được lọc qua màng lọc 0.45 mm và thu lại
dịch. Dịch thu được sẽ được dùng để phân tích.

Trong quá trình cô quay, việc cô quay đến khô và hòa tan lượng chất khô trong
bình bằng 10 mL ACN-H2O sau đó lọc qua màng lọc mang những ý nghĩa quan
trọng hỗ trợ cho quá trình xác định hàm lượng vitamin tiếp theo trên hệ thống sắc ký
lỏng ghép đầu dò khối phổ hai lần:
 - Làm giàu chất phân tích trong mẫu.
- Pha loãng bằng ACN-H2O giúp hỗn hợp dịch phân tích tương thích với hệ
thống, đồng thời dung môi ACN giúp cải thiện hiệu suất ion hoá mẫu ở đầu dò khối
phổ.
- Ngoài ra, việc cô quay đến khô và hoà tan lại với dung môi giúp loại bỏ một
số tạp chất không tan trong mẫu sau quá trình chiết mẫu.
-Phân tích hàm lượng vitamin A và vitamin D trong mẫu trên hệ thống
LC-MS/MS
 

Điều kiện sắc ký

- Cột sắc ký là cột pha đảo C18 có kích thước 2.1 ´ 100 mm (đường kính ´
chiều dài), hạt silicagel có đường kính là 1.7 m
- Thể tích mẫu tiêm: 20.0 m Thứ tứ tiêm mẫu lần lượt là các chất chuẩn xây
dựng đường chuẩn, mẫu blank, mẫu phân tích, chuẩn kiểm tra.
- Nhiệt độ buồng cột: 30oC
- Pha động gồm:
- Pha động A: H2O 20% MeOH chứa 0.1% HCOOH
- Pha động B: MeOH chứa 0.1% HCOOH
- Chương trình pha động theo bảng 2.6

Thời gian % Pha động % Pha động Tốc độ dòng

(phút) A B (mL/phút)

0 45 55 0.25

1 45 55 0.25

9 0 100 0.4

15 0 100 0.4

15.1 45 55 0.4

17.1 45 55 0.4
 17.2 45 55 0.25

20 45 55 0.25

Bảng chương trình pha động cho quá trình sắc ký

Điều kiện khối phổ:

 Dạng ion hóa: ion hóa tia điện

 Điện áp: 2500 V
 Điện áp côn: 35 V
 Nhiệt độ nguồn : 140oC
 Nhiệt độ khử solvat hóa: 400oC
 Dòng khí khử solvat hóa: 800 L/h
 Dòng khí cone: 50 L/h
 Dòng khí va chạm: 4.0´10-3 mbar (khí Argon)
6. Tính kết quả:

Từ đường tuyến tính y = ax + b giữ diện tích peak và nồng độ các dung dịch
chuẩn từng dạng vitamin D và vittamin A, nội suy được nồng độ từng dạng vitamin
D và vitamin A trong dung dịch mẫu.

Tính được hàm lượng vitamin D và vitamin A trong mẫu thử theo công thức:

X = (CxV)/W

Trong đó:

C: Nồng độ của từng dạng vitamin D và vitamin A từ đường chuẩn (mg/L)

V: thể tích hòa tan mẫu (mL)

W: Lượng mẫu thử (mL)

X: hàm lượng từng dạng vitamin D và vitamin A trong mẫu (mg/L hoặc mg/kg)