Concepte de bază în biologia

moleculară
definitie, istoric, organisme model,
descoperirea rolului genetic al acizilor
nucleici
Biologia moleculară este ramura biologiei care se ocupă cu studierea structurii si
functiei genelor în cadrul celulei, la nivel molecular.

Obiectul de studiu al biologiei moleculare include:

• Interactiunile dintre variatele sisteme celulare, dintre diferitele tipuri de ADN,

ARN si biosinteza proteinelor;

• Rolul acizilor nucleici în cadrul păstrării și transmiterii caracterelor ereditare;

• Procesele de replicare, transcriere și traducere ale materialului genetic.

Tehnicile moleculare cu larga aplicabilitate, in practic toate domeniile biologiei,sunt

printre altele:
• Construirea bancilor de gene si selectia genelor de interes din acestea;
• Marcarea moleculelor (proteine si acizi nucleici) si urmarirea structurii si
functiilor lor;
• Amplificarea fragmentelor de ADN (tehnica PCR);
• Tehnologia markerilor moleculari (polimorfismul fragmentelor de restrictie-
tehnica RFLP; polimorfismul unor fragmente de ADN amplificate randomic-
RAPD etc.).
Istoric
Izolează nucleina din nuclei
Descoperă transformarea genetică la bacterii şi numeşte agentul
responsabil drept „principiu transformant”
Propun ipoteza „o genă – o enzimă”
Demonstrează că principiul transformat al lui Griffith este reprezentat de ADN
Propun modelul dublu-helical de structură al ADN
Elucidarea modelului dublu-helical de structură al
ADN prin difractie in raze X
Replicarea semi-conservativa a ADN
Descifrarea codului genetic
Proiectul genomului uman - descifrarea completă a
secvenţei de nucleotide din genomul uman
 Descoperirea rolului genetic al acizilor
nucleici
Materialul responsabil de transmiterea ereditară a caracterelor trebuie
să îndeplinească trei caracteristici de bază:

• să conţină într-o formă stabilă informaţia necesară pentru

determinarea structurii celulare a organismului, pentru realizarea
funcţiilor, a dezvoltării şi reproducerii;

• să se replice cu mare acurateţe astfel încât celulele fiice rezultate

în urma diviziunii să conţină aceeaşi informaţie ca şi celula mamă;

• să fie capabil să sufere schimbări (mutaţii) deoarece, fără

modificări la nivelul informaţiei genetice, organismele nu ar fi
capabile să supravieţuiască în condiţiile variate de mediu.
 IDENTIFICAREA MATERIALULUI GENETIC

• Descoperirea acizilor nucleici datează din anul 1868 când biochimistul

elveţian Friedrik Miescher a izolat din nucleii leucocitelor, o substanţă cu
caracter acid, ce continea P si N, pe care a denumit-o nucleină (ADN).

• Mai tarziu, in 1914, Robert Feulgen a observat că aceasta substanţă poate

fi pusa in evidentă prin colorare cu fucsină bazică.
• In 1920, P.A. Levene, in urma unui studiu chimic a descoperit că in
compozitia ADN intră patru baze azotate: adenină (A), guanină (G),
citozină (C), timină (T), un zahar (2-deoxiriboza) si o grupare fosfat.
• Cele patru baze azotate sunt de două tipuri: purinice (A si G) si
pirimidinice (C si T).
Pentru stabilirea faptului ca ADN este substanta ereditara responsabilă
pentru caracteristicile ce sunt transmise de la o generaţie la alta, au
fost necesare 2 trepte experimentale mai semnificative.

1. Experientele medicului englez Frederick Griffith, efectuate în 1928 cu

bacteria Streptococcus pneumoniae, agent infectios ce determina
pneumonia.

Aceasta bacterie se prezinta sub forma a 2 tipuri (tulpini) diferite:

 Unul virulent notat cu “S” deoarece pe medii cu agar formeaza colonii
netede (smooth), celula sa fiind inconjurata de o capsula formata din
polizaharide astfel ca, pot aparea diferite tipuri de pneumococi notate SI,
SII si SIII;

 Tipul nevirulent- nu prezinta capsula, formand colonii rugoase si a fost

notat cu R (rough=aspru, rugos).

In mod spontan, prin mutatie, tipul virulent S poate deveni cu o frecventa

mica tipul avirulent R (SI- RI; SII – RII; SIII - RIII)

Urmarind sa obtina noi tipuri de vaccinuri, Griffith a realizat diferite variante

experimentale in care a injectat cultura de pneumococi in plamanii
soarecilor.
Diplococcus pneumoniae (sin. Streptococcus pneumoniae)- bacterie Gram pozitiva
Infectarea şoarecilor cu pneumococi s-a realizat în diferite variante:

• cu tulpini avirulente de tip RII- soarecii supravietuiesc

• cu tulpini virulente de tip SIII – soarecii mor
• cu suspensie bacteriană de tip SIII inactivată prin fierbere –soarecii supravietuiesc
• cu un amestec de bacterii de tip RII cu suspensie bacteriană de tip SIII inactivată prin
fierbere- soarecii mor.
In ultima variantă experimentală rezultatul a fost: moartea şoarecilor inoculaţi
şi detectarea bacteriilor virulente de tip S alături de cele de tip R , desi
fiecare in parte nu determina moartea animalelor.

Acest fapt a condus la concluzia că

• anumite proprietăţi ale bacteriilor de tip S, omorâte prin tratament
termic, au fost transferate bacteriilor avirulente de tip R, acestea
devenind capabile de a produce polizaharide capsulare.

Griffith descoperea astfel un fenomen biologic nou – acela de

TRANSFORMARE BACTERIANA – pe care nu l-a putut explica cauzal.

El a realizat doar ca intr-un fel sau altul in prezenta resturilor de

pneumococilor virulenti de tip SIII, omorati prin fierbere, pneumococii
vii nevirulenti RII se transforma in pneumococi de tip SIII.

Iniţial, componenta bacteriană responsabilă de transformare a fost

denumită “principiu transformant”
2. Experimentele decisive in elucidarea naturii agentului
transformant au fost cele realizate efectuate în 1944 de grupul
de cercetători condus de Avery (Oswald Avery, Collin MacLeod
şi Maclyn McCarty), s-a demonstrat, fără echivoc, natura
acestuia: acidul deoxiribonucleic (ADN).

• In 1944, Avery si colab. au reluat experimentul lui Griffith, dar au

eliminat din el soarecii, pentru a evidentia faptul că acestia nu au
avut nici un rol in transformarea bacteriilor.

In acest caz, cercetătorii au utilizat un lizat celular de la

pneumococi virulenţi de tip SIII pe care l-au tratat cu diferite
tipuri de enzime care au degradat:
• fie proteinele, fie ARN, fie ADN
Lizatul SIII, tratat cu câte un tip de
enzimă, a fost amestecat cu
pneumococi avirulenţi de tip RII
iar amestecul a fost plasat pe un
mediu de cultură corespunzător.

In urma cultivării diferitelor variante

experimentale au fost obţinuţi
pneumococi virulenţi de tip SIII,
excepţie făcând situaţia în care
lizatul a fost tratat cu enzimele ce
degradează în mod specific ADN.

Concluzia acestor experimente a fost

aceea că ADN este purtătorul
informaţiei genetice.

SIII + RII SIII + RII RII

• Experimentul Hershey-Chase (1952).
O a altă dovadă care demonstrează că ADN este materialul genetic purtator de
informatie este oferita de experimentul efectuat de Alfred Hershey și Martha
Chase cu bacteriofagul T2 care infectează bacteria Escherichia coli.

Rezultatele lor au confirmat faptul că ADN si

nu proteina este materialul genetic al fagilor.

Toate sistemele biologice conţin două tipuri

de acizi nucleici :
• acidul deoxiribonucleic (ADN) şi
• acidul ribonucleic (ARN),

stabilindu-se rolul lor în procesele ereditare şi în variabilitate.

Spre deosebire de organismele celulare, virusurile conţin doar un singur tip de

acid nucleic:
• fie ADN (deoxiribovirusuri)
• fie ARN (ribovirusuri),
iar viroizii numai ARN.
 Organisme model utilizate în studiile de genetica
moleculară
Caenorhabditis elegans
 durată de viaţă scurtă (2-3 săptămâni) cu un timp de
generaţie de aprox.4 zile

 organizare simplă (959 celule somatice dintre care

302 sunt neuroni grupaţi în 118 tipuri)

În anul 2003 a fost comunicată secvenţa completă de

nucleotide a genomului său

 Are un număr total de 131 celule suferă un proces de

apoptoză („moarte celulară programată”) în cursul
dezvoltării C.elegans ceea ce permite identificarea
genelor de controlează acest proces precum şi
evidenţierea consecinţelor mutaţiilor acestor gene,
datele obţinute putând fi apoi comparate cu cele
obţinute la animalele superioare.
Drosophila melanogaster
 Organism eucariot de dimensiune mica
(3,5-4 mm) care este folosit ca sistem
biologic model încă din 1910 (Morgan şi
colab.)

 Numar mare de musculite care se

formeaza intr-o perioada scurta de timp: 10- În prezent este utilizata în diferite

14 zile (timpul în care apare o noua arii de cercetare stiintifica, precum

generatie) 1. analiza unor probleme legate
 Număr mic de cromosomi (8 cromosomi) de procesul de crestere si
 Secveţa de nucleotide a genomului său a dezvoltare;
fost determinată în anul 2000;
2. diferentiere celulara;
 Oferă numeroase avantaje pentru
3. reglajul ciclului celular si
evidentierea si studierea modului în care
4. în studierea diferitelor boli
are loc transmiterea caracterelor
genetice.
ereditare de-a lungul generatiilor.
Mus musculus

• Este un mamifer
• Se creşte uşor în laborator, se reproduce rapid
obţinându-se mai mulţi descendenţi de la acelaşi cuplu
ceea ce permite studiul apariţiei şi transmiterii anumitor
însuşiri
• Prezintă un grad înalt de omologie cu organismul uman,
multe dintre genele murine având omologie structurală şi
funcţională cu gene umane
• În anul 2002 a fost comunicată secvenţa completă de
nucleotide a genomului său
• În prezent există numeroase organisme mutante, obţinute
prin tehnici clasice de ameliorare (de ex.
Immunodeficient nude mice, fără păr şi timus ceea ce
înseamnă cu el nu produce limfocite T şi nu manifestă
răspuns celular imun – sunt utili pentru cercetări în
imunologie şi transplant;
• Severe combined immunodeficient (SCID) la care
sistemul imunitar lipseşte aproape complet) sau prin
tehnici de inginerie genetică: şoareci de dimensiuni foarte
mari ca urmare a integrării în genomul lor a genei pentru
hormonul de creştere de la şobolan;
• Oncomice la care a fost activată o oncogenă ceea ce
determină o incidenţă crescută a apariţiei cancerului;
• Doogie mice care prezintă o îmbunătăţirea a memoriei
şi a capacităţii de învăţare;
• knockout mice la care o genă specifică a fost inactivată
– animalele sunt utilizate în studiile legate de stabilirea
funcţiilor unei gene sau a produsului codificat de aceasta
sau pentru simularea unei boli umane).
Peştele zebră (zebrafish, Danio rerio)

 este un peşte de acvariu folosit ca model

experimental pentru genomică comparată
(studiul unor gene - identificarea lor şi stabilirea
rolului lor atât în organismul de origine cât şi la
alte organisme neînrudite, inclusiv om).

Avantajele modelului experimental

– timpul scurt de generaţie (3-4 luni);
– ouăle fertilizate sunt transparente, iar
dezvoltarea embrionară se face rapid,
primordiile organelor apărând în primele
36 ore după fertilizare;
– dungarea apare după 48-72 ore de la
fertilizare şi depinde de temperatura
mediului ambiant
– multe dintre genele pe care le are
prezintă ortologie cu gene umane
– Secvențierea completă a genomului a
fost comunicată în 2009
O noua varianta de pește zebră, denumit
Casper, este transparent, ceea ce
permite observarea anumitor tipuri de
celule, așa cum sunt celulele stem din
care se vor forma celulele sanguine, sau
celulele tumorale metastazante.

Deoarece multe dintre genele de la peștele

zebră sunt foarte asemănătoare celor de
la om, varianta Casper va permite
obținerea de noi date legate de funcțiile
anumitor gene.

Recent, au început să fie comercializate o serie

de pești transgenici, sub denumirea de
GloFish, care exprimă diverse variante
ale genei gfp (green fluorescent protein),
astfel că ei vor prezenta:
 fie o fluorescență verde (conțin gena gfp
normală),
 fie fluorescență roșie (exprimă o variantă a
acesteia care determină sinteza unei
proteine cu fluorescență roșie)
 fie fluorescență galbenă (produc o
proteină cu fluorescență galbenă).
Animale transgenice ce contin proteina pentru fluorescenta verde (sau rosie)
Arabidopsis thaliana

 Genom de dimensiuni mici (27.000

gene), secvențiat în anul 2000;

 Dimensiuni mici și un ciclu de viață

scurt;

 Prezinta mutante care permit studierea

funcțiilor unor gene;

 Stadiile de dezvoltare ca și structura

diverselor organe pot fi studiate la
nivel microscopic;

 Poate fi ușor transformată genetic cu

diverse gene, inclusiv gene marker, care
permit studii legate de localizarea și
funcțiile unor componente celulare.
 Saccharomyces cerevisiae

• Organizare unicelulară eucariotă

• Creştere şi multiplicare rapidă, propagare clonală, posibilitate de marcare
selectivă şi analiză

• folosite în descifrarea structurii şi sintezei acizilor nucleici, a reglajului

genetic, a mecanismelor mutaţiilor, reparării şi recombinării, precum şi în
înţelegerea unor aspecte multiple referitoare la originea, evoluţia, compoziţia
chimică, ultrastructura şi rolul fiziologic al unor organite celulare la
eucariote;

• Cercetări asupra: controlului ciclului celular și a diviziunii celulare; secreția

proteinelor și biogeneza membranelor; funcțiile citosheletului; diferențierea
celulară; fenomenele de îmbătrânire etc
• Importanţa majoră a drojdiilor, în special a
speciei Saccharomyces cerevisiae,
constă în utilizarea lor industrială, în
industria fermentativă tradiţională (bere,
vin, panificaţie).

• In ultimii ani, specii ale genurilor Candida,

Hansenula, Saccharomycea, Pichia sunt
utilizate cu succes în industria de sinteză
proteică, pentru producerea de proteine
furajere, cu perspective de utilizare şi în
hrana omului.
 Escherichia coli

• Bacterie care se găseşte în mod normal

printre microorganismele ce populează
suprafaţa intestinului uman

• Permite obținerea de informații legate

de: structura și funcțiile genelor, de
reglajul genetic, de interacțiunile acizi
nucleici-proteine, ciclul celular,
semnalizarea celulară, transferul de
gene;

• Constituie sistem model pentru

stabilirea interacțiunilor dintre diferiți
compuși chimici (de ex. antibiotice) și
componentele celulare etc.
 Principalele diferențe intre celulele procariote și eucariote
Procariote Eucariote
Tipul de organisme bacterii fungi, plante, animale

Dimensiuni ~ 1-10 µm ~ 10-100 µm

Tip de nucleu nucleoid; nucleu cu dublă membrană

ADN circular molecule liniare (cromozomi) cu proteine

numite histone
ARN și sinteza
Proteinelor cuplată cu citoplasma sinteza de ARN în nucleu
sinteza de proteine în citoplasmă
Structura
citoplasmatică simplă complexă cu membrane
intracitoplasmatice și citoschelet
Mișcarea celulelor flagelară flagelară și ciliară

Metabolism anaerob de obicei aerob

Mitocondrii aerob de la una până la numeroase
Cloroplaste - la alge și la plante

Organizare de obicei celule izolate, celule izolate, colonii, organisme

dar pot forma și colonii evoluate cu celule specializate

Diviziunea celulelor diviziune simplă Mitoză (pentru celulele somatice)

Meioză (la formare a gameților)