J. Microbiol. Biotechnol. ( 2008), 18 ( 11), 1836-1840 doi: 10.

4014 /
jmb.0800.120
Publicado por primera vez en Internet el 4 de junio de 2008

Estabilidad y actividad antibacteriana de las bacteriocinas producidas por bacilo turingiensico y bacilo
turingiensico ssp. Kurstaki

Jung, Woo-Jin 1, Fazli Mabood 2, Alfred Souleimanov 2, Xiaomin Zhou 2, Samir Jaoua 3, Fakher Kamoun 3,
y Donald L. Smith 2 *
1 División de Biociencia y Biotecnología Aplicadas, Centro de Investigación Agrícola Amigable con el Medio Ambiente (EFARC), Instituto de Ciencia y Tecnología Agrícola,

Universidad Nacional de Chonnam, Gwangju 500-757, Corea

2 Departamento de Ciencias Vegetales, Universidad McGill, Campus Macdonald, 21,111 Lakeshore Road, St Anne-de-Bellevue, Quebec H9X 3V9, Canadá

3 Laboratorio de Bioplaguicidas, Centro de Biotecnología, PO Box K 3038, Sfax, Túnez

Recibido: 10 de febrero de 2008 / Aceptado: 2 de abril de 2008

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos que son producidos por bacterias y
tóxicos para las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con la cepa
productora. Anteriormente se informó que
bacilo turingiensico cepa NEB17 y bacilo turingiensico
subsp. Kurstaki BUPM4 produce las bacteriocinas thuricin 17 (3,162 Da) y bacthuricin
F4 (3,160.05 Da), respectivamente. Aquí, demostramos que estas bacteriocinas
tienen similitudes funcionales y muestran un espectro similar de actividades
antimicrobianas contra cepas indicadoras. También estudiamos los efectos de los
métodos de esterilización sobre la recuperación y las actividades biológicas de estas
bacteriocinas. Fueron completamente degradados por esterilización en autoclave y
los dos fueron afectados de manera similar por las membranas de filtro probadas. El
fluoruro de polivinilideno (PVDF), la poliestersulfona (PES) y el acetato de celulosa
(CA) son adecuados para la esterilización por filtración de estas bacteriocinas. Las
dos bacteriocinas se mantuvieron estables en una variedad de condiciones de
almacenamiento. Estos datos facilitarán su utilización en la conservación de
alimentos o aplicaciones agrícolas.
Palabras clave: Antimicrobiano, bacteriocina, Bacilo turingiensico,
thuricin 17, bacthuricin F4
entre las PGPR que ocurren dentro de las células vegetales [PGPR intracelular
(iPGPR)] y las que residen en los diversos nichos fuera de las células vegetales
pero asociadas con las raíces de las plantas [PGPR extracelular (ePGPR)].
La producción de antibióticos es uno de los mecanismos que emplea PGPR para
promover el crecimiento de las plantas; por tanto, pueden desempeñar un papel
importante en el control biológico de patógenos vegetales [4, 7, 14]. Las
bacteriocinas son una clase de toxinas proteicas antimicrobianas que pueden matar
o inhibir el crecimiento de especies bacterianas relacionadas, pero no la cepa
bacteriana productora [9-11, 14]. Las bacteriocinas son estructural y funcionalmente
diversas [11, 14]. Se cree que, en condiciones naturales, las bacterias producen una
gama diversa de bacteriocinas con el fin de aumentar su adaptabilidad y
competitividad en sus nichos ecológicos específicos [13].
Las bacteriocinas se utilizan ahora como conservantes novedosos en una
amplia variedad de alimentos como lácteos, pescado y productos cárnicos, ya
que pueden matar una serie de bacterias patógenas y que deterioran los
alimentos [5, 14]. Por ejemplo, la nisina se introdujo como conservante de
alimentos comercial en el Reino Unido hace unos 40 años. Se ha utilizado como
conservante en productos de queso fundido en el Reino Unido y en varios otros
países [6].

Las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) promueven el
crecimiento y el desarrollo de las plantas vía Mecanismos directos e indirectos. Incluyen
bacterias en el suelo que generalmente se encuentran cerca de las raíces de las
plantas (la rizosfera), en la superficie de la raíz (el rizoplano) y entre las células
epidérmicas y corticales de las raíces y dentro de las células especializadas de los
nódulos de las raíces (endófitos); algunas bacterias promotoras del crecimiento de las
plantas también se encuentran en el área que rodea las semillas (la espermosfera) [15].
Gray y Smith [8] hacen una distinción
* Autor correspondiente
Teléfono: 1-514-398-7851; Fax: 1-514-398-7897; Correo electrónico:
donald.smith@mcgill.ca
Recientemente, se ha demostrado que bacilo turingiensico
NEB17 (BtNEB17), originalmente aislado de los nódulos de la raíz de la soja
en Quebec, Canadá [3], produce una bacteriocina de masa molecular 3.162
Da, conocida como thuricina 17 [9]. El análisis proteómico muestra que,
aunque existen diferencias de secuencia, la thuricina 17 comparte la misma
secuencia N-terminal, DWTXWSXL, con otra bacteriocina, la bacturicina F4
[10]. La bacturicina F4 (MW 3.160,05 Da) es producida por B. thuringiensis ssp.
Kurstaki cepa BUPM4 (BtBUPM4), originalmente aislada de la basura del
suelo en Túnez [12]. Estos hallazgos son de particular interés porque las
bacteriocinas de dos diferentes Bacilo cepas muestran al menos algo
estructural

homología, que es poco común. Dado que estas dos bacteriocinas muestran
similitudes estructurales, es razonable suponer que estas dos bacteriocinas
también pueden tener funciones antimicrobianas similares. Por lo tanto, parte
del presente estudio fue diseñado para estudiar si estas dos bacteriocinas,
thuricin 17 y bacthuricin F4, muestran espectros similares de actividades
antimicrobianas.
Las bacteriocinas generalmente se aíslan de cultivos en condiciones de
laboratorio. Durante el largo proceso de extracción, aislamiento y purificación, están
potencialmente sujetos a contaminación por otras bacterias y microorganismos
relacionados. Al igual que otros compuestos utilizados en estudios de investigación,
se almacenan antes de su uso en aplicaciones de investigación. Sin embargo, estas
bacteriocinas deben estar libres de otras bacterias contaminantes cuando se utilicen
para actividades de investigación. Existe una falta de información sobre su
estabilidad y actividad después de los procedimientos de esterilización. En la
segunda parte de este trabajo, también examinamos el efecto de las técnicas de
esterilización y almacenamiento sobre la estabilidad y actividad de thuricin 17 y
bacthuricin F4.
Las cepas productoras de bacteriocina utilizadas en este estudio fueron bacilo de celulosa (CA).
turingiensico subsp. Kurstaki cepa BUPM4 (BtBUPM4) que produce
bacturicina F4 (BF4) [12], y bacilo turingiensico cepa NEB17 (BtNEB17) que
produce thuricin 17 (T17) [9]. Las cepas indicadoras se seleccionaron por su
sensibilidad a las dos bacteriocinas. A menos que se indique lo contrario, los
cultivos de todas las cepas se cultivaron en medio B de King como se
describe en Atlas [2].
Las colonias BtNEB17 y BtBUPM4 se tomaron de placas de Petri y se
cultivaron en tubos de ensayo que contenían 10 ml del medio de King B [2]
descrito anteriormente. Los cultivos bacterianos se incubaron a 28 ± 2 o C en
un agitador orbital (modelo 5430, agitador orbital de sobremesa; Forma
Scientific Inc., Mariolta, OH, EE. UU.) Durante 48 h, girando a 150 rpm. A
partir de este cultivo inicial, se añadieron 5 ml a matraces de 4 l que
contenían 2 l de caldo (Medio B de King) en condiciones estériles y los
matraces se agitaron durante al menos 72 h en las condiciones descritas
anteriormente. Las culturas fueron
se deja crecer hasta un OD 600 nm de al menos 1,4. Thuricin 17 y
bacthuricin F4 fueron aislados por
Fase de partición de cultivos bacterianos con 40% de butanol, agitar durante
15 min como se describió anteriormente [9], y luego dejar reposar durante al
menos 12 ha 4 o C. La capa superior de butanol se retiró y se concentró hasta
sequedad a 50ºC. o C al vacío por evaporación rotatoria (Yamato RE500;
Yamato, San Francisco, CA, EE. UU.). El material restante fue
luego resuspendido en 10 ml de acetonitrilo al 18% (AcN / H 2 0, v / v) y se
almacena en un vial sellado y esterilizado a 4 o C antes de
Análisis por HPLC.
Antes del análisis por HPLC, los extractos se centrifugaron (Sorvall
Biofuge Pico; Mandel Scientific, Guelph, ON, Canadá) a 13.000 × gramo durante
13 min, y el sobrenadante (100 µ l) se sometió a análisis de HPLC como lo
describe Gray et al. [ 9]. Las dos bacteriocinas (thuricin 17 y bacthuricin F4)
fueron
UN NTIBACTERIANO UN CTIVIDAD DE segundo ACTERIOCINAS 1837
almacenado a cuatro temperaturas (ambiente: 22 ± 2 o C; refrigerador: 4 ± 1 o C;
congelador: -20 ± 1 o C y -80 ± 1 o C) estudiar el efecto de las temperaturas de
almacenamiento sobre su estabilidad y actividad. Tres lotes de bacteriocinas
extraídas de diferentes cultivos bacterianos de las dos cepas productoras
(BtNEB17 y BtBUPM4) actuaron como réplicas. Las bacteriocinas se ajustaron
a una concentración de 48 µ g / ml usando agua destilada estéril y
recromatografiada usando HPLC. Para cada conjunto de condiciones de
almacenamiento, se pipetearon muestras de 2 ml de cada lote de bacteriocinas
en tubos de vidrio pyrex estériles, se sellaron con parafilm y se colocaron en las
condiciones de almacenamiento descritas anteriormente. Después de 48 h de
almacenamiento a cada temperatura, las muestras de cada tubo se
cromatografiaron (HPLC) como se describió anteriormente. Cien µ Se cargaron 1
muestras de cada tubo en el HPLC y se midió la concentración de thuricin 17 y
bacthuricin F4 como se describe anteriormente. Se utilizaron dos métodos de
esterilización: autoclave y esterilización por filtro. La esterilización por filtración
se investigó con cuatro tipos de membranas de filtración. Se evaluaron varias
membranas para examinar el efecto del material de la membrana en la
recuperación de bacteriocinas y cuantificar las pérdidas durante el proceso. Los
cuatro tipos de filtros probados fueron éster de celulosa mixto (MCE, 0.22 µ m),
fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietersulfona (PES) y membrana de acetato
Se cultivaron BtNEB17 y BtBUPM4 en 500 ml de caldo, por triplicado, y se
aislaron bacteriocinas (thuricina 17 y bacturicina F4) mediante HPLC, como se
describió previamente. Las bacteriocinas se liofilizaron y se prepararon
concentraciones equimolares en agua destilada estéril. Antes de la filtración, las
muestras de cada una de las soluciones resultantes se volvieron a cromatografiar
usando HPLC para confirmar sus concentraciones. A continuación, las soluciones
se dividieron en dos partes: una se utilizó para los experimentos de esterilización
del filtro y la otra para el autoclave. A menos que se indique lo contrario, hubo tres
réplicas en cada experimento. Para el experimento de esterilización del filtro, se
pasó una solución de 2 ml de cada bacteriocina, por triplicado, a través de cada
membrana de filtro. La solución resultante se volvió a cromatografiar
inmediatamente usando HPLC y la concentración de bacteriocinas se determinó
midiendo las áreas de los picos de las muestras en comparación con las de
thuricin 17 estándar y bacturicin F4 en las mismas condiciones. Para el autoclave,
las soluciones de 2 ml de cada bacteriocina, por triplicado, se autoclavaron a
121ºC. o C durante 15 min a 103 kPa. Las muestras de control no se sometieron a
autoclave. Después de la esterilización en autoclave, las soluciones se enfriaron a
temperatura ambiente y se volvieron a cromatografiar usando HPLC, como se
describió anteriormente, para determinar la concentración de bacteriocina de las
muestras.
Se evaluó la actividad antimicrobiana de los péptidos thuricin 17 y bacthuricin F4 vía ensayo
de difusión en disco de agar [9] contra las cepas bacterianas indicadoras enumeradas en
la Tabla 1. Todas las cepas indicadoras se cultivaron y se sometieron a prueba para
determinar su pureza sembrando en placas de agar antes del ensayo de difusión en agar.
1838 Jung et al.

Tabla 1. Espectro antimicrobiano de bacteriocinas utilizando el ensayo de difusión en disco, donde 1 µ Se esparcieron g de thuricin 17 y bacthuricin F4 sobre discos esterilizados de 6 mm.

Zona de diámetro de inhibición (mm) Thuricina

Son Fuente
17 Bacturicina F4

bacilo turingiensico NEB 17 SLC DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

bacilo turingiensico BUMP 4 CBST DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

Brevibacillus brevis ATCC 8246 BGSC 13,3 ± 1,2 12,7 ± 0,6

Bacillus cereus ATCC 14579 BGSC 11,7 ± 0,6 12,3 ± 0,6
bacilo turingiensico subsp. thuringiensis Bt 1627 BGSC 14,7 ± 1,5 16,0 ± 3,5
bacilo turingiensico subsp. pakistaní HD395 BGSC 0 9,3 ± 1,5 0 9,3 ± 1,2
bacilo turingiensico serovar. asturiensis EA 34594 BGSC 0 9,7 ± 0,6 0 8,7 ± 0,6
Bacillus megaterium QM B1551 BGSC DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE

ND: No detectado; CBST: Centro de Biotecnología, Sfax, Túnez; SLC: Colección de laboratorio del Dr. Smith; BGSC: Departamento de Bioquímica, Bacilo
Centro de existencias genéticas, Universidad de Ohio, Cleveland, OH, EE. UU.

Se cultivaron colonias individuales de cada cepa indicadora en medio de King,
como se describió anteriormente, en tubos que contenían 10 ml de cultivo en
caldo. Los cultivos se diluyeron a un
sobredosis 600 de 0,1-0,2 y 50 µ L de este cultivo se extendió / superpuso sobre
placas de agar. Discos de filtro estériles (6 mm) se
colocado cuidadosamente sobre los platos y 20 µ l (que contiene 1 µ gramo;
stock 50 µ g / ml) de bacteriocinas (thuricin 17 y bacthuricin F4) se esparcieron
sobre estos discos de filtro. Se dejó secar los filtros. A continuación, las
placas de Petri se incubaron durante al menos 48 ha 29ºC. o C, después de lo
cual se observó y midió la zona clara de inhibición (mm). Se realizaron
triplicados para cada muestra.
fue aislado en el norte de América del Norte y el otro en el norte de África,
esto es algo sorprendente.
En todas las condiciones de almacenamiento probadas, la recuperación fue del
100% tanto para thuricin 17 como para bacthuricin F4 (Tabla 2). Nuestros resultados
sugieren que estos compuestos no se degradan durante el almacenamiento a
temperatura ambiente o a baja temperatura y los compuestos se pueden usar
experimentalmente durante períodos de tiempo relativamente cortos (al menos varios
días) sin preocuparse por la disminución de la actividad. Sin embargo, es necesario
realizar un estudio de almacenamiento prolongado con estas bacteriocinas. Estos
resultados también sugieren que el almacenamiento no sería un problema si estas
bacteriocinas se usaran en aplicaciones comerciales.

Las dos bacteriocinas mostraron intensidades similares de efectos

antimicrobianos sobre las cepas indicadoras, como lo revela la zona de Nuestros datos muestran que ambas bacteriocinas se vieron afectadas de
inhibición. Ambas bacteriocinas mostraron la actividad más fuerte contra B. manera similar por las membranas de filtro (Fig. 1). En todos los casos, el filtrado
thuringiensis subsp. thuringiensis, redujo la cantidad de bacteriocina en la solución. Sin embargo, hubo diferencias
mientras Bacillus megaterium QM B1551 no se vio afectado por ninguna entre los tipos de filtros para la recuperación de bacteriocinas. En el caso de thuricin
bacteriocina (Tabla 1). Estos datos sugieren que las dos bacteriocinas y sus cepas 17, la filtración con PVDF (94,3%) y PES (93,5%) mostró la máxima recuperación
productoras evolucionaron a partir de un ancestro común relativamente
recientemente, o adquirieron el sistema de bacteriocina (toxicidad más mecanismo
de resistencia para la cepa productora). vía algún tipo de transferencia de plásmido,
y que esto ocurrió relativamente recientemente. Dado que una cepa

Tabla 2. Efecto del almacenamiento durante 48 h, en un rango de temperaturas, sobre la

recuperación de thuricin 17 (T17) y bacthuricin F4 (BF4).

Temperatura Bacteriocina Recuperación (%)

22 o C T17 100
BF4 100
4o C T17 100
BF4 100
- 20 o C T17 100
BF4 100
- 80 o C T17 100 Figura 1. Recuperación de bacteriocina afectada por cuatro materiales de membrana de filtro.

BF4 100
( ■) Éster de celulosa mixto (MCE, 0,22 µ m), () fluoruro de polivinilideno (PVDF, 0,2 µ m),
Porcentaje de recuperación = (área del pico después del almacenamiento / área del pico antes del ( ▨) poliestersulfona (PES, 0,2 µ m Whatman) y ( □)
almacenamiento) × 100. Cada valor es una media ± SE (n = 3). acetato de celulosa (CA, 0,2 µ metro).
 UN NTIBACTERIANO UN CTIVIDAD DE segundo ACTERIOCINAS 1839

seguido de CA (74,5%). Para la bacturicina F4, la bacteriocina máxima se
recuperó utilizando filtros CA (86,8%) y PVDF (70,7%). El uso de PES resultó en
una recuperación del 53,6% de bacturicina F4. La recuperación más baja ocurrió
cuando las bacteriocinas se purificaron con membrana de filtro MCE (menos del
2% para thuricin 17 y bacthuricin F4). Nuestros resultados sugieren que se puede
utilizar una membrana de filtro adecuada para producir soluciones libres de
contaminantes, al tiempo que se garantiza la máxima recuperación. Usando un
ensayo de difusión en disco de agar contra cepas indicadoras, pudimos demostrar
que la filtración no afectó la actividad biológica de estas bacteriocinas. Estos datos
también sugieren que sería posible la purificación para aplicaciones
comerciales. Las diferencias en la adherencia a los distintos materiales
filtrantes, como las diferencias en los tiempos de retención durante los análisis
de HPLC (13,49 min para T17, y
13,60 min para BF4) y los datos de secuencia publicados similares [10, 12],
indican además que partes de estas dos bacteriocinas son diferentes. Sin
embargo, los datos sobre los espectros de actividad biológica sugieren que la
secuencia responsable de la toxicidad microbiana se ha conservado en gran parte
o totalmente. Para determinar la eficiencia de la filtración, plateamos 100 µ l de
filtrado en agar nutriente y se incubó, a 28 o C durante al menos 72 h,

Figura 2. Efecto de esterilizar en autoclave durante 15 min a 121 o C y 20 psi sobre actividad y recuperación de bacteriocina.
A. Actividad antibacteriana de thuricin 17 y bacthuricin F4 contra cepa indicadora B. thuringiensis subsp. thuringiensis Bt1627. C: control (agua destilada); BA: antes de esterilizar en autoclave; AA: Después de esterilizar
en autoclave. Veinte µ l de thuricin17 o bacthuricin F4 se vertieron en discos de filtro que contenían 1 µ g de la solución de bacteriocina. SEGUNDO. Efecto del autoclave sobre la recuperación de thuricin 17 y bacthuricin
F4. Cada valor es una media ± SE (n = 3). C. Cromatogramas de HPLC de thuricin 17 y bacthuricin F4, antes y después del autoclave.
1840 Jung et al.
para probar el crecimiento de posibles bacterias contaminantes. No observamos
unidades formadoras de colonias bacterianas en las placas de Petri durante estos
ensayos (datos no mostrados).
Cuando las dos bacteriocinas (thuricin 17 y bacthuricin F4) se esterilizaron en
autoclave durante 15 min a 121 o C, estaban completamente degradados (Fig. 2). La
esterilización en autoclave dio como resultado la aparición de nuevos picos de
cromatograma de HPLC tanto para thuricin 17 (tiempo de retención [RT] 13,49 pico
desaparecido y nuevos picos a RT antes y después de 11,65) como para
bacturicina F4 (RT 13,60 pico desaparecido y nuevo pico a 11,63). Suponemos que
los compuestos representados por los nuevos picos son los subproductos de la
degradación de thuricin 17 y bacthuricin F4, producidos durante el autoclave. El
ensayo de difusión en disco de agar mostró que estos nuevos picos no tenían
actividades antibacterianas (Fig. 2). Por lo tanto, nuestros datos indican que la
thuricina 17 y la bacturicina F4 son lábiles al calor a altas temperaturas (121 o C), y el
tratamiento a alta temperatura durante el autoclave puede resultar en cambios
estructurales y funcionales en estos péptidos antibacterianos.
En conclusión, nuestros datos sugieren que BtNEB17 y BtBUPM4 producen
bacteriocinas que muestran similitudes funcionales, ya que tienen espectros
similares de actividades antimicrobianas. Ambas bacteriocinas son estables en un
rango de temperaturas de almacenamiento; sin embargo, se degradan por completo
en autoclave. Muestran respuestas similares a la purificación a través de una
variedad de materiales de filtro de membrana. Nuestros datos sugieren que las
membranas filtrantes de PVDF, PES y CA se pueden utilizar para la esterilización
por filtración de bacteriocinas. Estas membranas de filtro mostraron una mayor
recuperación con actividades de unión aparentes más bajas que la membrana de
filtro MCE. Estos datos proporcionan información sobre el comportamiento general
de las dos bacteriocinas que son importantes tanto para la experimentación futura
como para los esfuerzos de comercialización.
Reconocimiento
Este trabajo fue apoyado por una subvención de NSERC al Dr. Donald L.
Smith.
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