Міністерство освіти і науки України

Дніпропетровський національний університет

ім. Олеся Гончара

Г.О. Ушакова, І.Є. Соколова

ОСНОВИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ

Навчальний посібник

Дніпропетровськ
РВВ ДНУ
2016
BBK 28.070
УДК 576.32/36
У 93
Рецензенти: д-р біол. наук, проф. О.В. Севериновська
д-р біол. наук, проф. О.3. Бразалук

У 93 Ушакова, Г.О. Основи молекулярної біології | Текст): навч. посіб. /

Г.О. Ушакова, І.Є. Соколова. - Д.: РВВ ДНУ, 2016. - 200 с.

Наведено основні положення стосовно організації та функцій

нуклеїнових кислот, їх складників, особливостей геномів прокаріотів і
еукаріотів, головних механізмів збереження 1 реалізації генетичної
інформації та механізмів мінливості живих організмів, розкрито принципи й
практичні підходи сучасних методів у молекулярній біології. Опрацювання
наданого матеріалу дозволить сформувати теоретичне підгрунтя та уміння у
студентів ставити перед собою завдання для здійснення наукового пошуку в
галузі молекулярної біології, а також організації, постановки і застосування
найпоширеніших методів молекулярної біології.
Для студентів факультету біології, екології та медицини ДНУ.
Матеріалами навчального посібника можуть послуговуватися студенти
природничих і медичних факультетів ВНЗ України.

ISBN
ISBN 978-617-7373-39-0
978-617-7373-39-0

о Ушакова Г.О., Соколова І.Є., 2016

 3MICT
BOTY llasessmneemnnneeeiene ee eeu 5
Частина І. НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ ЯК НОСІЇ ГЕНЕТИЧНОЇ
ІНФОРМАЦІЇ... нан 7
Розділ І. Структурно-функціональна організація нуклеїнових кислот.............аанннння 7
1,1. Структурні особливості азотистих основ. заінавно ивнананивананоя 7
1.2. Будова та функції нуклеозидів і нуклеотидів ...........ананачнннчнннннннннннннннн 10
1.3. Особливості структури рибонуклеїнових кислот. ......... нання 14
1.4. Структура та функції дезоксирибонуклеїнової кислоти..........
шана 18
1.4.1. Первинна й. вторинна структура -ггхзчннкки нано кавквиннаннеона
анна инь 18
1.4.2. Форми дезоксирибонуклеїнової кислоти ........... нання 20
1.4.3. Надмолекулярна організація ДНК. Взаємодія з білками............ 24
1.4.4. Фізико-хімічні властивості дезоксирибонуклеїнової
КИСЛОТИ... 29
POSTE, NEDO молекулярної ХНологій паааазнанонаанчкан анна ання ананвновлннан ат» 32
2.1. Центрифугування в градієнті густини. газазіненнвннгнаннананннназеньниеизни 32
22, Влектрофоретичні методи wccornmonnmman cai ND 33
2.3. Методи секвенування ДНК............... нн 38
Частина П. ОРГАНІЗАЦІЯ І ФУНКЦІОНУВАННЯ ГЕНОМІВ...............аначнннннн 43
Розділ 3. Загальна характеристика геномів .......... нання 43
Розділ. Геноми прокаріотів пааннапеватаччнанн пиаменнанатинини і анна лан рана 48
4.1; Структуранукавоїду зазнав піна варив ана овваннсь рн 48
4.2. Особливості організації та функціонування геномів прокаріотів ........ 50
4.3. Будова генів прокаріотів. Структура оперонів ........... мання 52
Розділ 5. Геноми еукаріотів. ......... мана 58
2, Генетичний апарат-вукаріотів: зазазтатничанипинапанниньннуканенчна нам винних 60
5.2. Надмірність геномів еукаріотів. Типи нуклеотидних
ПОСЛІДОВНОСТВИ se ssccsscccesseresrancesasecssaciuaccssuanconcouiapesaseeceusceseanaeaaisenerimememcneness 62
5.3. Структура генів еукарі?тів......... «анна 64
5.4. Особливості еукаріотичних генів........... манна 68
5.5. Екзон-інтронна будова генів еукаріотів. Сплайсинг.......... мання 69
5.6. Порівняльна характеристика геномів прокаріотів та еукаріотів .......... 72
Частина Ш. МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ЗБЕРЕЖЕННЯ І РЕАЛІЗАЦІЇ
ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ .......... нання 76
Розділ 6. Реплікація ДНК та її роль у збереженні генетичної інформації .............. 76
6.1. Загальна характеристика процесу реплікації .............
анна 76
6.2. Ферменти та білки, що беруть участь у реплікації. .......... манна 79
6.3. Стадії реплікації: ініціація, елонгація, термінація..........
манна 86
6.4. Особливості реплікації в еукаріотів.......... манна 90
6.5. Типи реплікації. .........шнннннннннннннннннннннннннннннннннннн 91
6.6. Проблема реплікації кінців лінійних молекул ДНК. Теломераза......... 93
Розділ 7. Транскрипція як механізм реалізації генетичної інформації
(перший етап'єкспрест Тенін) ззазааранананна канва ННЯ 97
7.1. Види РНК-полімераз.......... анна 98
 4

72. Фактори регуляції транскрипції, зеззнананнаани авіа нан нанн рани 101
ТЗ; Влади ЗрАНоКришнИ зонам нононунаання ов рано 104
7.4. Дозрівання різних видів рибонуклеїнових кислот в еукаріотів.......... 109
7.5. Процесинг рибонуклеїнових кислот у прокаріотів ........... мання 111
6. Продукти транокритнії. захо наново нн начал нання нан нааанкх 112
11, Інгіопоричтранскрицції азнозанинананквкавннааананавн варена ання 113
Розділ 8. Трансляція як процес синтезу білка (другий етап експресії генів)........ 113
8.1. Механізм трансляції у прокаріотів.........мшначнннннннннннннннннннннннннннн 118
8.2. Механізм трансляції еукаріотів ......... манна 122
83. Посттрансляційна.модифікація білків.. захааенананнанннканана нн нааннасанаанємноє 124
8.4. Фолдинг і системи захисту синтезованих поліпептидних ланцюгів.. 128
Розділ 9; Механізми регуляції експресії тТеніВзеазнананан нання назанади аваднам ооо 130
9.1. Загальна характеристика механізмів регуляції метаболізму........ чн. 130
9.2. Регуляція експресії генів на рівні транскрипції. .......... манна 132
9.2.1. Позитивний і негативний контроль. Індукція та репресія........ 132
92.2. Катаболітна репресія газазаезазгананаанавнивнананнаани ананаси 136
9.2.3. Регуляція експресії генів шляхом атенуації........... нання 138
9.3. Механізми регуляції трансляції.......... манна нн 141
9.4. Особливості регуляції експресії генів в еукаріотів ........... нання 143
Частина ТУ. МЕХАНІЗМИ ГЕНЕТИЧНОЇ МІНЛИВОСТІ ........... «ач 147
Розділ. 10..Мутації та. модифікації. еаачачаанна пивна напувалкивай 147
Розділ 11. Рекомбінаційна мінливість, зазнавав
аназнчв наннизнта везе ВН 151
Розділ 12. Мобільні генетичні елементи та їх роль у мінливості організмів........ 158
12.1. Плазміди............... нання 158
12.1.1. Загальна характеристика плазмід..........маначннннннннннннннннннннн 158
а, ВНС ВОСТВН ЛАВКИЩО о зорова УРИВКИ ВАЛ АЛ РИ ВАЛОВИЙ 160
12.1.3. Е-фактори та їх варіанти оахаханазаньновни
ан нання 165
12:54. ВАПЛАЗМІДИ зго 169
12.1.5. Плазміди бактеріоциногенності ............«анннннннннн нини 171
12.1.6. Плазміди токсиноутворення............ мчч 173
12.2. Гранспозони зазазнноночю чна анна знана тина нан палааннааь ванна ана заанрих 174
12.2.1. Мобільні генетичні елементи прокаріотів .............нанннннннннннняя 175
12.2.2. Мобільні генетичні елементи еукаріотів.......... «ання 179
12.2.3. Механізми транспозиції ........... манна 180
12.2.4. Складні мобільні генетичні елементи. ......... манна 183
Розділ 13. Репарація. Механізми забезпечення стабільності генома.......... нання 185
13.1. Система модифікації та рестрикції (МВ-система) у прокаріотів...... 186
132. Реплікаційна системарепарації озаазана нанаанна в назонан вним серо 190
13.2.1. Механізми репарації для виправлення помилок реплікації ... 190
13.2.2. Пряма репарація........... нання 191
Іа Вкоцизійнаренараціяї зпохесанатна нн онанхноєнакеанавльнчнннаказнеааананома 192
13.2.4. Їндукована 305-репарація ггганаенченевачннаванннннни нання 195
13.3. Постреплікативна (рекомбінаційна) репарація............ «нання 197
СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ... «манна 198
 5
BCTYII

Жива природа - неоднорідна цілісна система, якій властива ієрархічна

організація (ієрархія - від грец. «Біего8» - священний, «агпе» - влада -
розташування частин або елементів цілого від нижчого до вищого). Згідно з цією
ієрархією в різних біологічних науках застосовують класифікацію рівнів
дослідження. Так, основні біологічні явища відбуваються на молекулярно-
генетичному, клітинному, органо-тканинному, організмовому, популяційно-
видовому, біогеоценотичному рівнях організації живої природи. Механізми
еволюції притаманні усім біологічним явищам - від макромолекулярних до
біосферних. Усі перераховані рівні відображають загальну структуру
еволюційного процесу, закономірним результатом якого є людина. Загальна
біологія вивчає організми щодо їх індивідуального й історичного розвитку.
В основі будови і розвитку майже всіх організмів лежить біологічна
структурна одиниця - клітина. Єдність структури організмів - одна з
найважливіших загальнобіологічних закономірностей, що вказує на спільність
походження органічного світу. Особливий інтерес становить розмноження
клітини, що забезпечує матеріальну спадкоємність. Але кожен організм тісно
пов'язаний із навколишнім середовищем, між ними відбувається безперервний
обмін речовинами й енергією. Організми регулюють цей обмін, зберігаючи свою
цілісність 1 здатність до саморегуляції. Отже, питання про механізми
саморегуляції організмів - одне з основних поряд із спадкоємністю у загальній
біології.
Завданням молекулярної біології є дослідження основних проявів життя
на рівні молекул, що складають клітину: обмін речовин, спадковість, збереження
та реалізація генетичної інформації, пристосування організмів, подразливість
тощо. Молекулярна біологія розкриває широкі перспективи в галузі керування
людиною життєвими процесами. Генетика, що досягла значних успіхів у ХХ ст.,
вивчає мінливість і спадковість організмів і широко застосовує методи
молекулярної біології, слугує основою для селекції. Сучасна молекулярна біологія
дозволяє цілеспрямовано змінювати спадкову природу організму й надавати йому
спадкових властивостей, яких він не мав (за допомогою генної інженерії). Перед
молекулярною біологією відкриваються широкі можливості щодо зміни на
користь людини спадкової природи різних організмів і мікроорганізмів, рослин,
тварин, використовуваних у медицині й народному господарстві.
В останні десятиріччя в біології відбулися революційні зміни, у результаті
яких вона вийшла на передній план природознавства, почала активно сприяти, а
деколи | і задавати | напрямок науково-технічному прогресу. Біологія
перетворюється на науку з добре розвиненою системою понять, що дозволяють
робити широкі теоретичні узагальнення і передбачення. З того часу, як у біології
стали застосовувати методи фізики, хімії, математики сформувалася нова
молекулярна біологія, що бурхливо розвивається. Безперервно виконуючи
пізнавальну функцію, молекулярна біологія через генетичну інженерію стрімко
 6

інтегрується в матеріальне виробництво. Водночас молекулярна біологія вийшла

за межі загальної біології й стала міждисциплінарною наукою.
Молекулярна біологія за останні десятиріччя стала визначальним науково-
фундаментальним підгрунтям сучасної біології. Сьогодні на ii основі
сформувалися та бурхливо розвиваються такі нові напрями, як геноміка, генні та
клітинні технології, протеоміка, квантова біологія, біоінформатика, генна
медицина тощо. Зокрема, діагностика, профілактика та спрямоване лікування на
рівні індивідуального генома відкривають широкі можливості лікування
спадкових і соматичних захворювань. Важливе місце посідають дослідження,
пов'язані з активною перебудовою генома тварин і рослин (одержання стійких до
захворювань порід тварин і сортів рослин, а також трансгенних живих
«біореакторів» гостродефіцитних біологічно активних речовин).
У Національній академії наук України проблемами молекулярної біології
опікується низка установ: інститути біохімії ім. О.В. Палладіна; фізіології ім.
О.О. Богомольця; експериментальної патології, онкології і радіобіології im.
Р.Є. Кавецького; мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного; проблем
кріобіології ії кріомедицини; біології клітини; клітинної біології та генетичної
інженерії; фізіології рослин і генетики; біоорганічної хімії та нафтохімії.
Найбільший обсяг досліджень в Україні в галузі молекулярної біології,
молекулярної генетики, геноміки та генних технологій здійснюють в Інституті
молекулярної біології ії генетики НАН України. Окремі питання з цих проблем
вирішують в установах Академії медичних наук, Української академії аграрних
наук та вищих навчальних закладах України.
Із початку ХХІ ст. почалася епоха інтегральних досліджень геномів, що
сприяли формуванню таких розділів молекулярної генетики, як геноміка,
протеоміка, біоінформатика. Геноміка сьогодні займається аналізом структури 1
функцій геномів як інтегрального функціонального масиву генів, їх регуляторних
елементів і інших послідовностей, необхідних для функціонування генома. З
розвитком геноміки надзвичайно важливу роль стали відігравати комп'ютерні
методи зберігання й аналізу інформації, обсяг якої швидко зростає в процесі
розвитку молекулярної біології. Створені бази даних дозволяють здійснювати
оперативний порівняльний аналіз нових даних.
Стрімке накопичення інформації в галузі фундаментальних досліджень
молекулярної біології сприяє вирішенню практичних проблем біотехнології,
медицини, сільського господарства, а також вирішенню безлічі інших життєво
важливих проблем, серед яких, імовірно, найважливіші -- екологічні.
У даному навчальному посібнику відображено лише частину питань, що
охоплює молекулярна біологія сьогодні. Головною метою укладання цього
видання є формування у студентів біолого-медичного напрямку знань і навичок
за базовими розділами сучасної молекулярної біології.
 7

Частина І. НУКЛЕЇНОВІ КИСЛОТИ ЯК НОСІЇ

ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ

Розділ І. СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНА ОРГАНІЗАЦІЯ

НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

1.1. Структурні особливості азотистих основ

Усі живі клітини здатні продукувати азотисті основи, гетероциклічні

сполуки, збагачені Нітрогеном. Вони - структурний матеріал для біосинтезу
багатьох важливих речовин - нуклеотидів, нуклеїнових кислот, коферментів.
Виділяють два класи азотистих основ - пурини та піримідини
Пуринові основи (латин. ригиз - чистий) - природні похідні пурину, який є
конденсована гетероциклічна з система, що складається 3 {BOX циклів:
піримідинового (Сб) та імідазольного (С3).
Найважливішими пуринами, що входять до складу нуклеїнових кислот, є
аденін (6-амінопурин) 1 гуанін (2-аміно-б-оксопурин) (рис. 1.1).

Пурин Аденін

Рис. 1.1. Структура пуринових основ

Особливістю структури азотистих основ є те, що всі зв'язки в кільці

частково подвійні, крім того, ці основи планарні - усі атоми кільця в них лежать
практично в одній площині. За такої структури можливі тільки незначні
коливання довжини зв'язків кільця та валентних кутів, проте в даних основах
відсутні обертальні рухи, що робить їх конформаційно жорсткими конструкціями.
Вагоме значення для структури основи мають атоми Нітрогену та Оксигену -
акцептор водню 1 ХН»-групи - донори водню.
Пуринові основи можуть мати дві таутомерні форми: лактимну (енольну) 1
лактамну (кетонну) (рис. 1.2).
о OH

HN” SN ї ни Sy ї
H H
Лактамна (кетонна) Лактимна (енольна)

Рис. 1.2. Таутомерні форми пуринів

 ана М Іміно , Залежно | від | окисно-
Ми, N~ “AN відновної рівноваги в
а Sry середовищі, що частіше
«бо N
М г безпосередньо залежить від: рН,
Se
Шо и
ої б
відбувається
чани
амінно-імінний |і
- й a і кето-енольний перехід. За
а фізіологічних значень РН (7,4)
для гуаніну переважає лактамна
форма. На рис. 1.3 стрілочками
позначено трансфер атома
Водню під час амінно-імінного
та кето-енольного переходу.

ae Н-донор
"а Н-акцептор

Рис. 1.3. Таутомерні форми піримідинів (а) та пуринів (6)

Пуринові основи входять до складу нуклеозидів, нуклеотидів, обох типів

нуклеїнових кислот, коферментів, макроергічних сполук (АТФ, ГТФ) та інших
біологічно активних речовин (БАР). До пуринових основ можна віднести також
продукти пуринового обміну: інозин, гіпоксантин, ксантин, сечову кислоту та
пуринові алкалоїди і їх ПОХІДНІ.
У харчовій промисловості та медицині широко використовують метильні
похідні ксантину: кофеїн, теобромін і теофілін (рис. 1.4)

CH O сн
re й CHs

om x NT ON о
wot N
CH, нь
1,3,7-Триметилксантин 3,7-Диметилксантин
(кофеїн) (теобромін)

Рис. 1.4. Метильні похідні ксантину

Природне джерело пуринових алкалоїдів - зерна кави, какао й листя чаю.

Також пуринові алкалоїди можна синтезувати за допомогою хімічного синтезу
Траубе або одержувати напівсинтетично.
 9

Серед фармпрепаратів на сьогодні широко використовують як самі

пуринові алкалоїди: кофеїн, теобромін i теофілін, так 1 їх комплексні
водорозчинні солі: кофеїн-бензоат натрію, темісол 1 еуфілін.
За хімічними властивостями пуринові алкалоїди - дуже слабкі основи.
Головні властивості обумовлені Нітрогеном імідазольного циклу (в 9-му
положенні). У природі кофеїн зустрічається в різних концентраціях разом із
іншими ксантиновими алкалоїдами теофіліном і теоброміном, які є нейро- та
кардіостимуляторами. Найбільшу його концентрацію мають листя і боби кавового
дерева, чаю, мате, ягоди гуарани, а також плоди какао (у невеликій кількості).
Кофеїн може по-різному впливати на людський організм, залежно від
походження, що можна пояснити в першу чергу різною концентрацією інших
стимуляторів нервової системи та швидкістю їх абсорбції. У рослинах кофеїн
відіграє роль природного пестициду, який паралізує та вбиває комах-паразитів.
У природі є і деякі рідкісні, так звані мінорні пурини, наприклад 2-метил-
аденін і 1-метилгуанін. Окремі аналоги пуринів - 6-тіопурин і 6-тіогуанін - мають
протипухлинні та імунодепресивні властивості.
Інший клас азотистих основ - піримідинові основи (піримідини) --
природні органічні сполуки, похідні гетероциклу піримідину. Три головні
піримідинові основи - цитозин, урацил і тимін -- ключові представники даного
класу у складі нуклеотидів, нуклеїнових кислот, коферментів, макроергічних
сполук (ЦТФ, УТФ, ТТФ) та інших БАР (рис. 1.5).
NH, у у

0
N N з N N
H H H

Примідин Цитозин (Ц) Урацил (У) Тимін (Т)

(2-оксо-4-аміно- (2.4-діоксо- (2,4-діоксо-5-
піримідин) піримідин) метилпіримідин)

Рис. 1.5. Піримідинові основи

Оксипохідні піримідину, як і пурину, залежно від рН середовища, можуть

бути у двох таутомерних формах - лактимній і лактамній, причому остання більш
стійка і саме в ній дані основи входять до складу нуклеотидів (рис. 1.6).
У складі нуклеотидів нуклеїнових кислот усі оксипохідні пурину та
піримідину мають лактамну форму, що обумовлює утворення міжмолекулярних
водневих зв'язків між шпуринами й піримідинами окремих ланцюгів у
дволанцюговій структурі молекул ДНК та в одноланцюгових РНК. Піримідинові
основи, як і пурини, можуть бути екзогенного (потрапляють в організм із їжею), а
також ендогенного походження (їх синтез здійснюється у клітинах організму
людини). Цитозин й урацил входять до складу РНК, а тимін 1 цитозин - ДНК.
 10

OH о

Ж
Її Зоо)
a Ж
HO N о М
H
Лактим Лактам

Рис. 1.6. Лактимна або лактамна форма урацилу

Крім трьох головних піримідинових основ відомі також рідкісні або мінорні
піримідини, наприклад 5-метилцитозин, 5-гідроксиметилцитозин,
5-гідроксиметил-урацил та деякі інші, наявні в невеликій кількості в нуклеїнових
кислотах (частіше - у транспортних РНК). Деякі синтетичні похідні піримідину
використовують як лікарські препарати. За природою вони подібні до природних
метаболітів (У, Т, Ц), проте не повністю їм ідентичні (антиметаболіти).
Наприклад, 5-фторурацил використовують як протипухлинний препарат.

1.2. Будова та функції нуклеозидів і нуклеотидів

Азотисті основи пуринового чи піримідинового ряду можуть утворювати

двокомпонентні органічні сполуки разом із пентозами - ШР-рибозою або
2-дезокси-Д-рибозою, які називають нуклеозидами. Азотиста основа і пентоза
поєднані В-М-глікозидним зв'язком, який утворюється | між М-атомом
піримідинової азотистої основи або Мо-атомом пуринової азотистої основи і С-І"
атомом пентози (|-рибози або 2-дезокси-О-рибози) (рис. 1.7).
7 y живих клітинах нуклеозиди
; NH, утворюються в результаті ферментативного
2 N « відщеплення | фосфатного | залишку від
о @w нуклеотидів під дією ферментів нуклеотидаз.
5 8 Залежно від природи шпентози нуклеозиди
5
НН HO— cH, 0 розрізняють рибонуклеозиди (містять рибозу і
Хо ай : Ke го входять до складу РНК) і
H ..
1 Я но дезоксирибонуклеозиди (до їх складу входить
М дезоксирибоза; ДНК).
OH

Аденозин Дезоксицитидин

Рис. 1.7. Структура нуклеозидів

Назва нуклеозиду походить від назви відповідної азотистої основи із

закінченням -ідин (-идин) у піримідинових і -озин - у пуринових нуклеозидах:
цитозин -- цитидин, тимін - тимідин, урацил - уридин, аденін - аденозин, гуанін -
гуанозин. До назви нуклеозидів, які містять дезоксирибозу, додають літеру «д»,
наприклад, д-цитидин (дезоксицитидин), д-аденозин (дезоксиаденозин) тощо.
 1]

Нуклеозиди (та відповідні нуклеотиди) можуть вільно обертатися навколо

М-глікозидного зв'язку і таким чином утворювати анти- або синконформації
(рис. 1.8). Вільні пуринові нуклеозиди (та нуклеотиди), наявні в розчині, можуть
набувати як син-, так і антиконформації. У складі нуклеїнових кислот (особливо у
двоспіральних молекулах ДНК 1 РНК) просторове взаєморозташування азотистих
основ 1 пентоз відповідає антиконформації, що є необхідна умова для утворення
водневих зв'язків між комплементарними нуклеотидами.

СУ ОЗ
el - ey
OH OH

Синконформація Антиконформація

Рис. 1.8. Син- та антиконформація аденозину

о о о Он Крім головних, у нуклеїнових

HN кислотах наявні також і мінорні
оч он oy ae on нуклеозиди, найбільшу кількість яких
містить транспортна РНК (рис. 1.9).
H
OH OH
Дигідроуридин Псевдоуридин

Рис. 1.9. Мінорні нуклеозиди

Найпоширенішими мінорними нуклеозидами, які входять до всіх

транспортних РНК, є псевдоуридин (позначають символом м) і дигідроуридин. У
псевдоуридині відсутній М-глікозидний зв'язок, а рибоза приєднана до урацилу в
5-му положенні, тобто не нітроген-вуглецевим, а вуглець-вуглецевим зв'язком.
Цей нуклеозид входить до складу псевдоуридилової петлі транспортної РНК.
Дигідроуридин є у складі дигідроуридинової петлі тРНК.
Біологічні функції мінорних нуклеотидів до кінця не з'ясовані. Деякі вільні
рибонуклеозиди та їх похідні, що не входять до складу нуклеїнових кислот,
виконують функції коферментів, кофакторів, алостеричних ефекторів різних
ферментних систем.
Модифіковані зд нуклеозиди з пуринового | й піримідинового ряду є
антиметаболітами і їх використовують у медичній практиці. Наприклад,
противірусний препарат ацикловір - 9-(2-гідрокси) етоксиметилгуанін - аналог
пуринового нуклеозиду дезоксигуанозину, нормального компонента ДНК.
 12

Схожість їх структур дозволяє ацикловіру взаємодіяти з вірусними ферментами,

що обумовлює гальмування реплікації ДНК вірусу герпесу. В офтальмологічній
практиці використовують індоксуридин ((офтан-П20)-5-йод-2"-дезоксиуридин) як
противірусний препарат, що вибірково діє на реплікацію деяких вірусів.
Препаратом нуклеозидної природи є тегафур, який має протипухлинну дію і який
використовують для лікування злоякісних пухлин шлунка, товстої, сигмоподібної
та прямої кишок, молочної залози. У випадку гострих лейкозів і кризи хронічних
мієлолейкозів використовують цитарабін — нуклеозид, що належить до
антагоністів піримідину. Для комплексної терапії ішемічної хвороби серця,
міокардіодистрофії, поліпшення обмінних процесів у міокарді використовують
інозин, який за структурою похідний нуклеозидів пуринового ряду.
За участі ферментів кіназ відбувається фосфорилювання нуклеозидів із
утворенням нуклеотидів (нуклеозидмоно-, ди- і трифосфатів) (рис. 1.10).
NH» Нуклеотиди є структурні
компоненти (мономерні ланки)
м ‘ молекул нуклеїнових кислот ДНК і
г. | Y о о с РНК. За хімічною будовою вони
N 7 3
N . | al ,| трикомпонентні сполуки, що
0 O—P—O—Y-—O—P=—OH складаються | 3 | азотистої основи
й 1, i, 4 пуринового чи піримідинового ряду,
боно он залишків | пентоз (рибози | або
дезоксирибози) та фосфату.
А АМФ ui

мо i
Ж АТФ А

Рис. 1.10. Структура нуклеотиду

Крім наведених вище основних п'яти азотистих основ (двох пуринових і

трьох піримідинових), до складу деяких нуклеїнових кислот входять у відносно
незначних кількостях додаткові (мінорні) азотисті основи та відповідні їм мінорні
нуклеотиди, які мають додаткові радикали.
За каталітичної дії циклаз нуклеозидтрифосфати перетворюються на
циклічні нуклеотиди за рахунок відщеплення пірофосфату та замикання циклу
між 3’- 1 5"-вуглецевими атомами залишків 0-Д-рибофуранози. Серед
найважливіших циклічних нуклеотидів виділяють циклічну-3",5-АМФ (3",5-
ЦАМФ) і циклічну-3',5"--гуанозинмонофосфорну кислоту (3"5"-цЦГМФ) -
регулятори клітинного метаболізму (рис. 1.11). Шляхи біосинтезу ЦАМФ і цгГМФ
відрізняються та реалізуються через різні регуляторні системи, однак механізми їх
впливу на клітинну 0 активність подібні | Й передбачають вибіркове
фосфорилювання функціонально важливих клітинних білків. Циклічні
нуклеотиди відіграють в організмі роль вторинних посередників у випадку
передавання гормонального імпульсу (сигналу). Їх регуляторна функція
 13

здійснюється в результаті активації відповідних ЦГМФ- та цАМФ-залежних

протеїнкіназ, які забезпечують каталітичну активність різних білків-ферментів.
NH.
: 0
N N

CI N N
"TT
— tii, “

o=P 5
\, So -

Циклічний 3/5"-АМФ Циклічний 3/,5'-ГМФ

Рис. 1.11. Структура циклічних нуклеотидів

Наприклад, у процесі дії адреналіну й глюкагону - гормонів, які

підвищують рівень ЦАМФ у клітинах, - активовані протеїнкінази фосфорилюють
глікогенфосфорилазу, тобто переводять її із неактивної форми в активну та
забезпечують розпад глікогену в печінці й скелетних м'язах (підвищують рівень
глюкози в крові). У той же час за результатом фосфорилювання відбувається
інактивація ферменту глікогенсинтетази, що приводить до гальмування синтезу
глікогену.
Структурні мономери, нуклеотиди - функціональні фрагменти багатьох
коферментів. Їх синтетичні аналоги широко використовують у наукових
дослідженнях і клінічній медицині. Так, у медичній практиці використовують такі
препарати нуклеотидної природи, як АТФ і фосфаден (АМФ).
На відміну від азотистих основ, нуклеотиди, що мають ще й пентози та
фосфатні залишки, добре взаємодіють із водою. Крім того, пентоза не містить
подвійних зв'язків, тому навколо зв'язків у її складі можливе обертання. Оскільки
атоми пентози утворюють кільце, п'ять кутів обертання не можна назвати
незалежними - для однозначного опису конформації п'ятичленного кільця
достатньо двох параметрів. Планарна конформація кільця енергетично невигідна
через стеричні обмеження. У складі нуклеїнових кислот переважають дві
конформації: С2'-ендо (С2'затом виходить у бік С5'-атома з площини, заданої
атомами С4"-О-С 1) характерна для дезоксирибози за фізіологічних умов та С3!-
ендо, притаманна для рибози у складі РНК, оскільки ОН-групи замість гідрогену
при С2"-затомі унеможливлює С2"-ендо конформацію (рис. 1.12).
cs cr N oe ae З

c+ 7 о сг «Мк cr
СУ
Су
С2'-ендо С3'-ендо

Рис. 1.12. Переважні конформації пентоз у складі нуклеотидів

 14
1.3. Особливості структури рибонуклеїнових кислот

Рибонуклеїнові кислоти (РНК) (латин. acidum ribonukleinicum) — we

одноланцюгові (іноді дволанцюгові) органічні біополімери, які входять до складу
всіх живих клітин і складаються з великої кількості мономерів - рибонуклеотидів.
До складу рибонуклеотиду входять: азотиста основа пуринового ряду (аденін або
гуанін) чи піримідинового ряду (цитозин або урацил), вуглевод Ю-рибоза
(пентоза) і залишок фосфорної кислоти.
Первинна структура РНК є специфічна послідовність із чотирьох
рибонуклеотидів, з'єднаних 3",5"-фосфодіефірними зв'язками. Специфіка кожного
з чотирьох рибонуклеотидів залежить від того, яка азотиста основа входить до
його складу. На рис. 1.13 зображено послідовність РНК, у якій чергуються в
хаотичному порядку рибонуклеотиди: С - гуаніловий, |) - уридиловий, А -
аденіловий 1 С - цитидиловий. Азотисті основи нуклеотидів позначають не тільки
латинськими літерами С, Ю, А, С, а й кириличними - Г (гуанін), У (урацил), A
(аденін), Ц (цитозин).б
о-

Рис. 1.13. Первинна структура РНК

У деяких РНК, крім постійних азотистих основ, є ще їх похідні, або

«мінорні», основи, наявність яких зумовлює специфічність функцій РНК. РНК
містяться, головним чином, у цитоплазмі клітин. Ці молекули синтезуються у
клітинах усіх живих організмів, а також є у віроїдах і деяких вірусах. Основна
функція РНК у клітинних організмів - це перенесення генетичної інформації з
молекули ДНК на молекулу білка. Тобто ІРНК (інформаційна або матрична РНК),
зчитана з ДНК у процесі транскрипції - це шаблон (матриця) для трансляції
 15

генетичної інформації в білки. Крім того, молекули транспортної РНК

забезпечують доставку відповідних амінокислот до рибосом, де білок
синтезується. У деяких вірусів (РНК-вмісних) РНК - носій генетичної інформації
(кодує білки оболонки та ферменти вірусів). Віроїди, на відміну від вірусів, не
мають оболонки (капсиду) 1 безпосередньо складаються з кільцевої молекули РНК
і не містять інших молекул. Існує гіпотеза, згідно з якою РНК з'явилися раніше
білків і були першими формами життя.
Молекули РНК, як правило, побудовані з одного полінуклеотидного
ланцюга; дволанцюгову структуру мають лише РНК деяких вірусів.
Для одноланцюгових РНК характерні різноманітні просторові структури, в
яких деякі нуклеотиди одного і того ж ланцюга спарені між собою. Стосовно
вторинної структури всі нуклеотиди в молекулі РНК можна поділити на два класи
- спарені (такі, що утворюють Уотсон-Кріківський зв'язок із будь-яким іншим
нуклеотидом) і вільні (неспарені). Формально вторинна структура РНК - це
опис усіх спарених і вільних основ у молекулярному ланцюзі. Петлею називають
замкнуту послідовність однониткових ділянок РНК, кінці яких з'єднані Уотсон-
Кріківськими вторинними зв'язками. Однониткові ділянки, які входять до складу
петлі, називають її гілками або ланками. Довжина петлі - це кількість вільних
нуклеотидів, що входять до її складу. Виділяють декілька типів петель:
шпилькові, бічні, внутрішні та багатоланцюгові (рис. 1.14).
5!
3
-

У З" У 3!
Шпилькова Бічна 5 у
Внутрішня = 3
Багатоланцюгова

Пухирпі Петлі

Шпилька

Рис. 1.14. Клементи вторинної структури РНК і типи петель

Деякі високоструктуровані РНК беруть участь у синтезі білка клітини,

наприклад, транспортні РНК слугують для впізнавання кодонів і доставки
відповідних амінокислот до місця синтезу білка, а рибосомальні РНК - це
структурна і каталітична основа рибосом. Окремі ділянки молекули РНК
 16

утворюють спіралізовані петлі - шпильки - за рахунок водневих зв'язків між

комплементарними азотистими основами А-У та Г-Ц. Спіралізовані ділянки
характерні для всіх типів РНК. РНК клітини відрізняються нуклеотидним
складом, розмірами, локалізацією у клітині та функціями.
Виділяють три головні типи РНК: інформаційні, або матричні (іРНК, або
МРНК), рибосомальні (рРНК) і транспортні (ТРНК). В еукаріотів є ще клас малих
ядерних РНК (мяРНК), які впливають на процесинг РНК, та ядерні попередники
МРНК -- гетерогенні ядерні РНК (гяРНК). Синтез усіх видів РНК клітини
відбувається на ДНК під час транскрипції. Реакції синтезу каталізує фермент
ДНК-залежна-РНК-полімераза. Синтезована молекула РНК комплементарна
фрагменту ДНК-матриці, оскільки порядок включення нуклеотидів у ланцюг РНК
визначає послідовність нуклеотидів у матриці ДНК. Молекули РНК синтезуються
у вигляді попередників, які в результаті процесингу перетворюються на зрілі
молекули РНК.
Матричні РНК (мРНК) становлять близько 2-5 Зб загальної кількості
клітинної РНК. Вони виконують функцію переносників генетичної інформації від
гена (ділянки ДНК) до білоксинтезувальної системи клітини. МРНК - це матриці,
які визначають амінокислотну послідовність
молекули білка (рис. 1.15). Усі мРНК
незалежно від їх первинної структури мають
однакову будову 5"- і 3"зкінців. Так, на 5"-кінці
міститься модифікований нуклеотид
7-метилгуанозин-5'-трифосфат, так званий
«кеп» (англ. сар - капелюх). На 3/"-кінці
більшості мРНК розташована послідовність із
100-200 залишків аденілової кислоти - полі(А)
- поліаденільований «хвіст».

Рис. 1.15. Формування мРНК

Вважають, що модифікація 5"- і 3'-кінців стабілізує молекули мРНК,

запобігаючи дії нуклеаз, а також важлива для специфічного впізнавання та
зв'язування в системі трансляції. Вторинна структура мРНК характеризується
наявністю численних шпильок.
Переважна більшість РНК не кодують білок. Класичні, добре вивчені типи
некодуючих РНК - це транспортні РНК (тРНК) і рРНК, які беруть участь у
процесі трансляції. Виділяють також класи РНК, відповідальні за регуляцію генів,
процесинг МРНК, інші функції, а також представлені похідними інтронів.
 17

Рибосомні РНК (рРНК) - клітинні РНК, які

входять до складу рибосом прокаріотичних та
еукаріотичних клітин. рРНК становлять до 80 Уб
усієї РНК клітини. Вони разом із специфічними
білками утворюють основу структури рибосом i
виконують функцію каркасів для зв'язування в
певному порядку рибосомних білків і, можливо,
специфічні функції під час біосинтезу білка
(рис. 1.16). За | коефіцієнтом седиментації
рибосомні РНК еукаріотів ділять на 55-рРНК,
5,8 S-pPHK і 28 5-рРНК великої субодиниці
рибосоми 1 185-рРНК малої субодиниці.
Рис. 1.16. Модель
рибосомної РНК

Транспортні РНК (тРНК) становлять близько 15 Уо усієї РНК клітини.

Вони виконують функцію переносників амінокислот у ході трансляції, а саме
транспортують І амінокислоти до місця синтезу білка на рибосоми, відіграють
роль адаптера між МРНК i амінокислотою, розташовують амінокислоти B
певному порядку в поліпептидному ланцюгу під час його біосинтезу. У будь-якій
клітині є декілька десятків різних видів тРНК, кожна з яких переносить тільки
одну амінокислоту. Усі тРНК побудовані однаково і мають вторинну структуру у
вигляді листка конюшини завдяки наявності декількох внутрішньоланцюгових
комплементарних ділянок (рис. 1.17).

ІРНК Акцепторний
кінець

Д-плече Т-плече

Додаткове
плече

Плече антикодону

Рис. 1.17. Схема будови та просторова структура тРНК

Транспортні РНК - це малі полінуклеотидні молекули, що складаються

приблизно з 80 нуклеотидів і мають консервативну третинну структуру. Кожна
тРНК містить ділянку для приєднання амінокислоти і антикодон для пізнавання та
 18

приєднання до кодону мРНК. Антикодон TPHK утворює водневі зв'язки з

кодоном (триплетом) мРНК. Це обумовлює таке положення тРНК, за якого легко
утворюється пептидний зв'язок між останньою амінокислотою вже утвореного
пептиду і амінокислотою, приєднаною до тРНК.
Функції РНК у клітинах не обмежуються їх участю тільки в трансляції. Так,
малі ядерні (мяРНК) беруть участь у сплайсингу еукаріотичних матричних РНК
та інших процесах. Молекули РНК входять до складу деяких ферментів
(наприклад, теломерази).
Нещодавно в еукаріотів відкрито новий тип малих ядерних РНК, що
отримали назву малих інтерферуючих РНК (міРНК a6o siRNA). Lle
дволанцюгові молекули РНК довжиною 21-28 п.н. комплементарні певним
ділянкам генів на ДНК і здатні специфічно блокувати їх експресію. Це дуже
важливо для захисту ДНК від ретровірусів, ретропозонів, ретротраспозонів та
інших чужорідних генетичних елементів. Явище блокування генів за допомогою
міРНК отримало назву РНК-інтерференції. За відкриття цього механізму
американські вчені Е. Файр і К. Меллоу у 2006 р. отримали Нобелівську премію.
Крім того, молекули некодуючих РНК здатні каталізувати такі хімічні реакції, як
розрізання та лігування молекул РНК. Дані каталітичні молекули РНК називають
рибозимами.

1.4. Структура та функції дезоксирибонуклеїнової кислоти

1.4.1. Первинна й вторинна структури

Дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНЮ (латин. acidum

дезохігібопикіеїпісит) - складний біополімер, що має вигляд подвійної спіралі.
Біологічні функції ДНК, які вони виконують у всіх живих організмах:
- збереження генетичної (спадкової) інформації;
- передавання генетичної інформації нащадкам.
Уперше провідну роль ДНК у збереженні та реалізації генетичної
інформації було доведено в результаті вивчення трансформації пневмококів
Утгеріососсизх рпеитопіае (Ф. Гріффіт, 1928; О. Евері, К. Мак-Леод і М. Мак-Карті,
1944) і механізму передавання генетичного матеріалу бактеріофага Т2 (А. Херші,
М. Чейз, 1952).
Принцип побудови первинної структури одинарного ланцюга ДНК із
нуклеотидів такий самий, як і у РНК (див. підрозділ 1.3): дві хімічні групи - ОН-
група при 3'-атомі пентози одного нуклеотиду й фосфатна група при 5"-атомі
іншого - необхідні для утворення фосфодіефірного зв'язку між нуклеотидами.
Послідовності нуклеотидів прийнято записувати в напрямку 5-53", у
напрямку синтезу нуклеїнових кислот. Отже, нуклеїнові кислоти - полярні
структури.
Основні відмінності між структурами ДНК і РНК:
1). у складі нуклеотидів ДНК міститься пентоза 2'-дезоксирибоза замість
рибози у складі нуклеотидів РНК;
2) нуклеотиди ДНК і РНК відрізняються за складом піримідинових основ:
 19

у ДНК наявний тимін (5-метилурацил), у РНК - урацил (замість тиміну);

3) ДНК - дволанцюгова спіраль, РНК - одинарний ланцюг;
4) первинна структура ДНК і РНК різняться наявністю деяких мінорних
нуклеотидів;
5) певні класи ДНК і РНК мають специфічні послідовності нуклеотидів,
що визначають їх біологічні функції.
Результати дослідження нуклеотидного складу молекул ДНК різних
біологічних об'єктів довели, що, незалежно Bi джерела походження
(бактеріальні, рослинні, тваринні організми), усі ДНК мають певні особливості
побудови вторинної структури цієї молекули. І перш за все це кількісні
взаємовідношення між вмістом пуринових і піримідинових нуклеотидів. Згідно з
правилами Чаргаффа у складі ДНК:
- сума пуринових основ дорівнює сумі піримідинових основ, тобто
АЧГ-ТУЦ,
або (АЧГУ/(Т-Ц) - 1;
- кількість 6-аміногруп дорівнює кількості 6-кетогруп (за хімічною
номенклатурою Фішера);
- вміст аденіну дорівнює вмісту тиміну, а вміст гуаніну - вмісту цитозину
(правило еквівалентності, комплементарності):
A=T, Г-Ц.
Зазначені кількісні взаємовідношення між нуклеотидами, а також
результати вивчення будови молекул ДНК методом рентгеноструктурного
аналізу, отримані Р. Франклінз ії М. Уілкінсом, дозволили американському
біохіміку Д. Уотсону Й англійському фізику Ф. Кріку, які працювали в
Кембриджському університеті, запропонувати у 1953 р. просторову модель
структури молекули ДНК (рис. 1.18).

Маленький ae :
жолобок
вєоонднзмогаг
4 f

Цукрофосфатний
/ остов
-

Пари азотистих
основ ——~ фосфати 2

а 6

Рис. 1.18. В-форма молекули ДНК за Уотсоном і Кріком (а)

та схема подвійного ланцюга ДНК (б)
 20

За моделлю Уотсона-Кріка з молекула | ДНК складається з BOX

антипаралельних полінуклеотидних ланцюгів (5'-»3" та 3'--57). Вони з'єднані
між собою водневими зв'язками, утвореними між протилежно розташованими
комплементарними нуклеотидами, за рахунок нековалентного притягання атома
Водню атомами Оксигену або Нітрогену в структурі азотистих основ: хімічні
групи азотистих основ - донори (МН»- 1 МН-групи) 1 акцептори (атоми О 1 М)
водневого зв'язку.
Два антипаралельні полінуклеотидні ланцюги утворюють стабілізовану
водневими зв'язками правообертальну спіраль, в якій обидва полінуклеотидні
ланцюги закручені навколо центральної осі, при цьому цукрофосфатні остови
розташовані зовні, пари основ - щільно упаковані всередині цієї структури.
Уотсоном і Кріком були розраховані структурні характеристики подвійної
спіралі ДНК: діаметр спіралі - 2 нм; відстань між азотистими основами вздовж
осі спіралі 0,34 нм; повтор обертання спіралі з
інтервалом у 3,4 нм, тобто через 10 нуклеотидних
пар. Крім водневих зв'язків, стабільність молекули
ДНК підтримується також за рахунок гідрофобних
взаємодій між р-електронними хмарами
гетероциклів азотистих основ, розміщених один під
одним уздовж осі спіралі, - так званої стекінг-
взаємодії (рис. 1.19).

Рис. 1.19. Схема стекінг-взаємодії

між парами нуклеотидів

Ефективність стекінг-взаємодій залежить від типу контактних пар основ, а

також від їх взаємної орієнтації і порядку розташування в ланцюгах ДНК.

1.4.2. Форми дезоксирибонуклеїнової кислоти

У живій клітині подвійні спіралі, що становлять вторинну структуру ДНК,

не мають вигляду розгорнутої молекули, а додатково утворюють певні третинні
структури - суперспіралі.
За фізіологічних умов подвійна спіраль досить стабільна структура.
Уотсоном i Kpikom була описана саме найпоширеніша в живих організмах ДНК
(В-форма). Але подвійним спіралям нуклеїнових кислот притаманний
структурний поліморфізм, що залежить від послідовності пар основ, типу
пентозного цукру та зовнішніх умов.
За різних експериментальних умов виявлено різноманітні форми подвійних
спіралей: праві спіралі А-, В-, С-, Д-, Е-ДНК і ліва спіраль /-форми (рис. 1.20).
Праві спіралі утворюють два сімейства: А-сімейство (конформація цукрових
залишків С3'-ендо) і В-сімейство (конформація цукрових залишків С2"-ендо), що
містить також С-, Р-, Е-ДНК.
 21

А-форму ДНК фіксують у волокнах за наявності іонів Ма за відносної

вологості, нижчій 75 Ус: це єдина представниця А-сімейства ДНК. Одне
обертання цієї спіралі становить 11 пар нуклеотидів, відстань між нуклеотидами
вздовж осі спіралі - 2,56 А.
B-JHR 7-ДНК

34 пт

Copyright © 2004 Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings

Рис. 1.20. Різні форми ДНК

Пари основ в А-ДНК, так само, як і у В-ДНК, майже плоскі, але в даній
формі вони нахилені на 20" щодо перпендикуляра до осі спіралі й зміщені
відносно осі на 4,7 А, так що вісь потрапляє в головний жолобок. Це обумовлює
появу порожнини в центрі структури; крім того, головний жолобок стає глибоким,
а мінорний - дрібним. Пентоза в А-ДНК має С3'-ендо-конформацію, а не С2/-
ендо-конформацію як у випадку всіх інших модифікацій ДНК.
В-ДНК і схожі С-, D-, Е-форми належать до В-сімейства подвійних
спіралей. Спіраль ДНК закручена праворуч. У цього сімейства пентозні кільця
мають конформацію С2"-ендо (або близьку їй С3'-екзо), відстань між сусідніми
фосфатами збільшена до 7 А. В В-ДНК на обертання спіралі припадає близько 10
пар основ і відстань між нуклеотидами вздовж осі спіралі становить 3,4 А. Вісь
спіралі проходить через пари, тому жолобки менш виражені, ніж в А-ДНК. Їх
глибина приблизно однакова, але ширина різна: мінорний жолобок вузький, а
головний жолобок - широкий і відкритий.
С-ДНК формується в результаті впливу іонів літію (або високої
концентрації солі) та низької відносної вологості (44-66 90). У подвійній спіралі
С-ДНК крок становить 30,9 А, а кількість пар основ на одне обертання - 9,33.
Дезоксирибоза має конформацію С3/-екзо (або еквівалентну їй С2/-ендо), як у
 22

В-ДНК. У С-форму можуть переходити не тільки природні ДНК, але і синтетичні

полінуклеотиди з певною послідовністю.
О-ДНК не характерна для природних нуклеїнових кислот, за винятком
повторюваних АТ-збагачених ділянок у ДНК ії ДНК фага Т2 (Т-ДНК), що має
високу здатність до модифікацій. Як і в інших подвійних спіралях В-сімейства,
пентозні кільця мають С3'-екзо-конформацію. Порівняно з В-ДНК ця спіраль
закручена сильніше: на обертання припадає всього 85 пар основ, при цьому висота
витка дорівнює 24,3 А. Оскільки вісь спіралі проходить через мінорний жолобок,
головний жолобок стає дрібнішим, ніж у В- 1 С-ДНК, а мінорний - дуже глибоким
і вузьким.
ДНК фага Т2 - єдина з відомих природних ДНК, що перебуває в Р-формі. У
даній ДНК замість цитозину міститься 5-гідроксиметилцитозин, крім того, вона
глюкозильована більше ніж на 70 90.
7-форма ДНК - це лівоспіральна конформація ДНК. Її було відкрито в
1979 р. у процесі дослідження структури гексануклеотиду 4 (ЦГ)з». Якщо
полінуклеотид полі(4Г-4Ц) помістити у водний розчин із високою концентрацією
МесСі, NaCl a6o0 спирту, то утвориться ліва подвійна спіраль 7-ДНК.
Повторюваною одиницею спіралі є не пара нуклеотидів, а двійка сусідніх пар. У
кожній із комплементарних ниток /-ДНК відбувається чергування син- та
антиконформацій нуклеотидних ланок, а в кожній парі нуклеотидів один
нуклеотид завжди перебуває в син-конформації відносно М-глікозидного зв'язку,
інший - в антиконформації. На одне обертання /-спіралі припадає 12 пар
нуклеотидів. Залежно від умов середовища формуються /-, 71», /11- та 7/-ДНК, які
становлять /-сімейство.
У лівих подвійних спіралей є тільки мінорний жолобок, через який
проходить вісь спіралі: цей жолобок глибокий і вузький і з двох боків обмежений
фосфатними групами. Область головного жолобка заповнена атомами C5
цитидину 1 7, С8 гуаніну.
7АДНК - напіврозмотана спіраль у вигляді зигзагу, що, імовірно, має певне
біологічне значення (рис. 1.21).

о
Гуанін
H
итозин
ice ey aHTH
» ум М се
зе г© м
yo EN
cr net
cHH jf о

ie Вісь спіралі
се

Рис. 1.21. Особливості структури 7-форми ДНК

 23

Вона виявлена в хромосомах дрозофіли 1, можливо, бере участь у регуляції

суперспіралізації ДНК. Утворення 7-ДНК можна стимулювати не тільки
додаванням у розчин солі, але й негативною суперспіралізацією в кільцевій ДНК.
Було доведено, що в результаті дії негативної суперспіралізації ділянки З
послідовностями 4(ЦГ)п можуть переходити в /-форму за звичайних
фізіологічних іонних умов.
Нижче наведено приклади деяких форм ДНК, що утворюються за умов
повтору особливих комбінацій полінуклеотидів (таблиця).
Таблиця
Форми дезоксирибонуклеїнової кислоти
Форма Конформація Особлива послідовність
Розп'ята Інвертовані повтори
чи? TCGGTACCGA
AGCCATGGCT
- bn

Триплекс (R * Y)n
= дзеркальні повтори

AAGAGG
| GGAGAA
TTTCTCC | CCTCTT

Ковзна Направлені повтори

шпилька TCGGTTCGGT
AGCCAAGCCA

Тетраплекс Оліго (С) ланцюжки

AG3(T2AG3)3

Закручена вліво (YR * YR)n

B-Z-JJHK a CGCGTGCGTGTG

Отже, поліморфізм ДНК залежить:

- від структури та конформації нуклеотидів;
- конформації пентози;
- повторюваних ділянок полінуклеотидів;
- іонної сили;
- рН середовища;
- ступеня гідратації (вологості).
 24
1.4.3. Надмолекулярна організація ДНК. Взаємодія з білками

ДНК у живих системах постійно взаємодіє з великою кількістю білків. На

поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та екзоциклічні групи азотистих
основ у жолобках. Саме ці групи й контактують з амінокислотними боковими
залишками та пептидними групами на поверхні білка. Усі білки, які взаємодіють
із ДНК, можна поділити на дві категорії:
1) зв'язуються з ДНК будь-якої послідовності;
2) здійснюють специфічне впізнання певної послідовності пар основ.
Білки, які здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють із будь-якою
іншою послідовністю ДНК неспецифічно. Кілька прикладів структури білково-
нуклеїнових комплексів наведено нижче (рис. 1.22).

Рис. 1.22. Білково-нуклеїнові комплекси:

а - димер гістонів Н3-НА; б - лейциновий зіпер;
в - катаболічний активаторний білок; г - білок із цинковими «пальцями»

Димер гістонів Н3-Н4А взаємодіє з фосфатами ДНК за рахунок

неспецифічних електростатичних (іонних) зв'язків, забезпечуючи щільну
упаковку ДНК. Інші білки, зображені на рис. 1.22, виконують функцію
регуляторів генної активності, специфічно впізнаючи певні ділянки послідовності.
Головною умовою реалізації контактів між ДНК і білком є взаємне
прилаштування структури у результаті відповідних конформаційних перетворень:
шляхом певних структурних перебудов (незначних або досить суттєвих)
подвійної спіралі ДНК.
Основу хромосоми еукаріот становить лінійна макромолекула ДНК значної
довжини. У розтягнутому вигляді довжина хромосоми людини може сягати 5 см.
Крім неї, до складу хромосоми входять п'ять спеціалізованих білків - НІ, НОСА,
Н2В, Н3 і НА (так звані гістони) (рис. 1.23) і деякі негістонові білки.
Послідовність амінокислот у молекулах гістонів високо-консервативна 1
практично не відрізняється в найрізноманітніших групах організмів.
Гістони - низькомолекулярні, сильно основні білки (збагачені лізином та
аргініном), які зв'язуються безпосередньо з ДНК за рахунок позитивних зарядів
амінокислотних залишків та негативно заряджених фосфатних груп ДНК, що
обумовлює щільну упаковку ДНК у ядрі. Завдяки такій упаковці 46 молекул ДНК
диплоїдного генома людини загальною довжиною близько 2 м, що загалом
нараховує 6:10" пар нуклеотидів (п.н.), можуть вміщуватися в клітинному ядрі
діаметром усього 10 мкм.
 25

пос

_- H3
— H2B
: H2A
-— H4

Рис. 1.23. Клектрофореграма гістонів

Амінокислотна послідовність гістонів, тобто їх первинна структура,

несуттєво змінилася в процесі еволюції. У цьому можна пересвідчитися, якщо
порівняти амінокислотну послідовність гістонів ссавців, рослин і дріжджів. Так,
НА людини і пшениці відрізняються лише декількома амінокислотами. До того ж
розмір молекули білка і її полярність відносно постійні.
А. Клугом побудована модель нуклеосоми, відповідно до якої ДНК
(146 п.н.) у В-формі (правозакручена спіраль із кроком 10 п.н.) намотана на
гістоновий октамер, у центральній частині якого розташовані гістони Н3 і Н4А, ана
периферії - Н2А 1 Н2Ь. Діаметр такого нуклеосомного диска становить 11 нм, а
його товщина - 5,5 нм (рис. 1.24).

Рис. 1.24. Електронна мікрофотографія хроматину (а)

і моделі мінімальної та повної нуклеосоми (б)

Структуру, що складається з гістонового октамеру й намотаної на нього

ДНК, називають нуклеосомною коровою частинкою. Корові частинки відділені
одна від одної сегментами лінкерної ДНК. Загальна довжина ділянки ДНК,
включеної до нуклеосом тварин, становить приблизно 200 п.н.
Поліпептидні ланцюги гістонів містять структурні домени декількох типів.
Центральний глобулярний домен і гнучкі виступні М- і С-кінцеві ділянки,
збагачені основними амінокислотами, отримали назву плечей. С-кінцеві домени
поліпептидних ланцюгів, що беруть участь у гістон-гістонових взаємодіях
 26

усередині корової частинки, мають здебільшого вигляд альфа-спіралі з

протяжною центральною спіральною ділянкою, уздовж якої з двох боків
розміщені коротші спіралі. Усі визначені місця оборотних посттрансляційних
модифікацій гістонів, що відбуваються протягом клітинного циклу або в ході
диференціювання клітин, локалізовані в гнучких основних доменах ix
поліпептидних ланцюгів. При цьому М-кінцеві плечі гістонів Н3 1 Н4А -
найконсервативніші ділянки молекул, а гістони в цілому - одні з найбільш
еволюційно консервативних білків. За результатами генетичних досліджень
дріжджів 5. сегеуізіає було встановлено, що невеликі делеції 1 точкові мутації в М-
кінцевих частинах генів гістонів супроводжуються суттєвими і різноманітними
змінами фенотипу дріжджових клітин, що свідчить про важливість цілісності
молекул гістонів для забезпечення правильного функціонування еукаріотичних
генів. У розчині гістони Н3 і НА можуть існувати у вигляді стабільних тетрамерів
ХН3)2(Н4), а гістони Н2А ії Н2В - стабільних димерів. Поступове підвищення
іонної сили в розчинах, до складу яких входить нативний хроматин, спочатку
обумовлює звільнення димерів Н2А-Н2В, а згодом тетрамерів 2Н3-2НА. Розмір
поліпептидних ланцюгів гістонів - у межах » 220 (НІ) 1 102 (Н4) амінокислотних
залишків. Гістон НІ містить багато залишків лізину, для гістонів Н2А і Н2В
характерний помірний вміст лізину, поліпептидні ланцюги гістонів Н3 1 НА
збагачені аргінином. Гістони Н3 і НА належать до найконсервативніших білків.
Така еволюційна консервативність передбачає, що для функції даних гістонів
важливі майже всі їх амінокислоти.
Гістони, утворюючи нуклеосому, взаємодіють із ДНК за рахунок:
1) позитивно зарядженної спіралі Н2В, Н3, НА і негативно заряджених
фосфатних груп молекули ДНК;
2) водневих зв'язків між остовом ДНК і амідними групами;
3) неполярних зв'язків між гістонами та дезоксирибозою ДНК;
4) водневих зв'язків між бічними ланцюгами основних амінокислот гістонів
й Оксигеном фосфатних груп ДНК;
5) неспецифічної взаємодії М-кінцевих «хвостів» Н3 1 Н2В гістонів із малим
жолобком молекули ДНК.
Гістони можуть зазнавати модифікацій шляхом:
- ацетилювання;
- фосфорилювання ;
- метилювання;
- убіквітинування (приєднання до синтезованого білка невеликого 3a
розміром білка убіквітину за допомогою убіквітин-лігази);
- сумоїлування (приєднання убіквітин-подібних білків).
Гістони в октамері мають рухливий М-кінцевий фрагмент («хвіст») із 20
амінокислот, який виступає з нуклеосом і важливий для підтримки структури
хроматину та контролю за генною експресією. Так, формування (конденсація)
хромосом пов'язане з фосфорилюванням гістонів, а посилення транскрипції - із
ацетилюванням у них залишків лізину. Деталі механізму регуляції до кінця не
з'ясовані.
 27

Перший рівень компактизації ДНК. В їінтерфазі хроматин не

конденсований, але його нитки - це комплекс ДНК і білків. Макромолекула ДНК
обвиває октамер (структура, що складається з восьми білкових глобул)
гістонових білків Н2А, Н2В, H3 1 НА (по два білки кожного типу), утворюючи
певні структури, так звані нуклеосоми. У цілому вся конструкція дещо нагадує
намисто. Послідовність із таких нуклеосом, з'єднаних білком НІ, називають
нуклеофіламентом (писіеойіатепі) або нуклеосомною ниткою, що має діаметр
приблизно 10 нм. Гістон НІ на відміну від інших гістонів не входить до складу
нуклеосоми, а зв'язується з ДНК у ділянці її входження до нуклеосоми.
Нуклеосому разом із НІ називають хроматосомою. Нуклеосомний рівень
компактизації хроматину відіграє регуляторну та структурну роль, збільшуючи
щільність упаковки ДНК в 6-7 разів.
Другий рівень компактизації складається із 30 нм фібрили (рис. 1.25).

(ХХХУХХХХУХХИ 2108
т - нуклеосоми - 200 п.н. на поверхні октамеру гістонів
Ш нм (H2A, H2B, Н3 і НА);

- фібрили - 30 нм, за рахунок асоціації октамерів

З0нм | нуклеосом із гістонами НІ. В одному нуклеомері
6-10 нуклеосом. Ступінь компактизації - 40;

300 - петлі - по 10-60 тис. п.н. у вигляді розетки з

2 - .
a нм фіксованою щільною центральною зоною (нуклеомер).
Хромомери містять 20-40 нуклеомерів;

700 нм

Центромера
я аю Р 400нм " Домени - хромомери утворюють хромонеми
і

Рис. 1.25. Рівні компактизації ДНК

У мітотичних хромосомах 1 в інтерфазних ядрах наявні фібрили хроматину

діаметром 25-30 нм. Виділяють соленоїдний тип упаковки нуклеосом: нитка
щільно упакованих нуклеосом діаметром 10 нм утворює витки із кроком спіралі
приблизно 10 нм. На один виток даної суперспіралі припадає 6-7 нуклеосом. У
результаті такої упаковки формується фібрила спірального типу з центральною
порожниною. Хроматин у складі ядер має 25-нм фібрилу, яка складається Зі
зближених глобул того ж розміру, - нуклеомерів. Ці нуклеомери ще називають
«супернамистом». Основна фібрила хроматину діаметром 25 нм - лінійне
 28

чергування нуклеомерів уздовж компактизованої молекули ДНК. У складі

нуклеомера утворюються два обертання нуклеосомної фібрили, по 4 нуклеосоми в
кожному. Нуклеомерний рівень упаковки хроматину забезпечує 40-кратне
ущільнення ДНК. Упаковка цієї фібрили може мати різну щільність. Щільно
упакований хроматин називають конденсованим або гетерохроматином, його
добре видно під мікроскопом. ДНК, наявна в гетерохроматині, недоступна для
транскрипції, як правило, цей стан характерний для незначущих або «мовчазних»
ділянок, непотрібних на даній стадії розвитку клітини. В інтерфазі клітинного
циклу гетерохроматин зазвичай розташовується по периферії ядра (пристінковий
гетерохроматин). Повна конденсація хромосом відбувається перед поділом
клітини. Нещільно упакований хроматин називають еу- або інтерхроматином.
Цей вид хроматину не такий щільний і зазвичай має активну транскрипцію.
Щільність упаковки хроматину суттєво залежить від модифікацій гістонів.
У ранній інтерфазі (фаза СІ) основу кожної з майбутніх хромосом
становить одна молекула ДНК. У фазі синтезу (5) молекули ДНК зазнають
реплікації і подвоюються. У пізній інтерфазі (фаза С2) основа кожної з хромосом
складається з двох ідентичних молекул ДНК, утворених у результаті реплікації і
з'єднаних між собою в ділянці центромерної послідовності. Перед початком
поділу клітинного ядра хромосома, яка має вигляд ланцюга нуклеосом, починає
спіралізуватися (упаковуватися), утворюючи за допомогою білка НІ товщу
хроматинову нитку (хроматид) діаметром 30 нм. У результаті подальшої
спіралізації діаметр хроматиди досягає до моменту метафази 700 нм.
Для 30 нм фібрил існують мінімум 4 моделі, у кожній із яких нуклеосоми
упаковані такими способами:
І. Соленоїдна модель. Ланцюг згортається в ліву спіраль із шістьма
нуклеосомами на обертання. НІ локалізований вздовж довгої осі 30 нм структури
(всередині).
2. Модель суперспіралі. Схожа на соленоїдну, але НІ, можливо,
локалізований на периферії або між нуклеосомами по всій довжині спіралі.
3. Крос-лінкерна модель. 10 нм філаменти згорнені в зигзагоподібну
структуру вздовж осі у вигляді подвійної суперспіралі. Нуклеосоми розташовані
на периферії структури, упоперек поздовжньої осі - лінкерні ділянки.
4. Стрічкова модель. 10 нм структура у вигляді стрічки, закрученої у
суперспіраль.
Третій рівень структурної організації - петельні домени ДНК. На вищих
рівнях організації хроматину специфічні білки зв'язуються з особливими
ділянками ДНК, яка в місцях зв'язування утворює великі петлі, або домени. У
деяких ділянках наявні згустки конденсованого хроматину, розеткоподібні
утворення, що складаються з багатьох петель 30 нм-фібрил, з'єднаних у щільному
центрі. Середній розмір розеток сягає 100-150 нм. Розетки фібрил хроматину -
хромомери. Кожен хромомер складається з декількох нуклеосомних петель,
з'єднаних в одному центрі. Хромомери поєднані один з одним ділянками
нуклеосомного хроматину. Taka петельно-доменна структура хроматину
 29

забезпечує структурну компактизацію хроматину та організовує функціональні

одиниці хромосом.
Четвертий рівень - утворення хромонеми. Хромонеми формуються за
рахунок лінійного зближення хромомерів. У результаті подальшого скручування
утворюється хромосома. Завдяки товщині хромосоми (діаметр 1400 нм) на стадії
метафази можна побачити її у світловий мікроскоп. Конденсована хромосома має
вигляд букви Х (часто з нерівними плечима), оскільки дві хроматиди, утворені
шляхом реплікації, як 1 раніше з'єднані центромерою.
Дослідники вважають, що в ядрі еукаріотів є так звані функціональні
домени хроматину, а ДНК одного домену містить приблизно 30 тис. пар основ,
тобто кожна ділянка хромосоми має власну «територію». Учені передбачають
специфічне зв'язування хромосом із ділянками ядерної мембрани, проте питання
просторового розподілу хроматину в ядрі поки недостатньо вивчене.
Отже, можна стверджувати, що хромосоми - це нуклеопротеїдний
конгломерат складений певним чином із ДНК, щільно упакованої за допомогою
специфічних білків.

1.4.4. Фізико-хімічні властивості дезоксирибонуклеїнової кислоти

Молекулярна маса ДНК суттєво варіює в різних біологічних об'єктах:

вірусах, прокаріотичних та еукаріотичних клітинах. Точно визначити
молекулярну масу різних зразків ДНК неможливо через гідродинамічну
ламкість гігантських молекул ДНК, особливо у вищих організмів. За різних умов
виділення та очищення їх в інтактному стані ДНК може розпадатися на коротші
фрагменти. Утім застосування сучасних фізико-хімічних методів дослідження та
електронної мікроскопії дозволило встановити, що молекулярна маса ДНК (у
випадку розрахунку на один полінуклеотидний ланцюг) становить у середньому
від 109 до 101 одиниць атомної маси, або дальтонів (чи 103-108 кДа). Найменшу
молекулярну масу й довжину молекули мають ДНК найпростіших живих
організмів - вірусів, зокрема вірусів бактерій (бактеріофагів) - у середньому
107-107 кДа.
У клітинах без'ядерних прокаріотів наявна одна молекула ДНК, яка
розташована в спеціальній зоні цитоплазми - нуклеоїді.
У прокаріотичних клітинах мікроорганізмів кількість ДНК та її молекулярна
організація значно вищі, ніж у вірусів. Зокрема, ДНК кишкової палички 2. соїї -
ковалентне замкнене дволанцюгове кільце з молекулярною масою 1,9-10? кДа.
Відповідно зі зростанням складності біологічної організації (від вірусів до
прокаріотів і еукаріотів) зростає й кількість нуклеотидних пар у дволанцюгових
молекулах ДНК.
Молекулярна маса ДНК хромосом людини дорівнює приблизно |1,6:10" Да,
що відповідає 2,4:10" пар азотистих основ. Фізична довжина розгорнутих молекул
ДНК із клітин еукаріотів сягає декількох сантиметрів.
Ураховуючи, що гени кодують послідовність білків, можна визначити
потрібну для цього кількість нуклеотидів. Наприклад, для білка приблизно 40 кДа
 30

за середньої маси амінокислот 110 Да матимемо 40,000 / 110 - 364 амінокислоти.

Кожна амінокислота кодується триплетом (3 пари нуклеотидів ДНК). Отже,
364:3-1092 пари нуклеотидів необхідно для збереження коду цього білка. Такий
простий розрахунок не можна застосовувати для всієї довжини еукаріотичної
ДНК, оскільки вона має екзон-інтронну структуру. Розглянемо питання
генетичної ємності ДНК. Логічно припустити, що складніший організм містить
більше генів, відповідно більше ДНК (наприклад, хромосома FE. coli містить
4,6:109 п.н., що відповідає -4200 білків; фаг 1 (інфікує Е. соїї) - 4,85:10" п.н. -
-44 протеїнів). За результатами досліджень ДНК різних організмів установлено
так званий парадокс С. Показник С (концентрація) - це кількість ДНК на
гаплоїдний набір у клітині. Для порівняння клітин миші або людини 13
дріжджовими клітинами його застосування коректне. Але клітини жаби містять
ДНК у 7 разів більше, ніж клітини людини. Складнішому організму не завжди
потрібно більш генів, ніж простому. Це так званий парадокс С. Найвірогідніше
пояснення парадокса таке: послідовності ДНК, що не кодують гени (інтрони),
наявні в геномі еукаріотів, коли простіший організм не має проміжків між генами
(екзонами).
За хімічними властивостями всі полінуклеотиди (ї ДНК зокрема) - сильні
багатоосновні кислоти з низьким значенням рК. Кислотність ДНК обумовлена
вторинними фосфатними групами, що за фізіологічних значень рН повністю
іонізовані. Завдяки кислотним властивостям і наявності на своїй поверхні
негативних зарядів молекули ДНК за фізіологічних значень рН активно реагують і
утворюють комплекси з катіонами: основними білками (гістонами, протамінами);
катіонами металів (Са", Ма", Ре" ); поліамінами (спермідином, сперміном).
Висока молекулярна маса і значна довжина молекул ДНК зумовлюють
високу в'язкість навіть дуже розбавлених їх розчинів. В'язкість молекул ДНК у
розчині залежить від їх конформації 1 суттєво змінюється за умов денатурації та
ренатурації:
| п Р (п відн-1)/С,
де / - відносна в'язкість; С - концентрація (г/100 мл).

Нуклеїнові кислоти мають високу густину (р), яка становить для

природної ДНК 1,69-1,73, що обумовлено високим вмістом фосфору. На густину
розчину нуклеїнових кислот впливає кількість ГЦ пар

р25- 1,658 - 0,1 |ГЦІ,

де р25 - густина за 25"С; (ГЦ| - молярна концентрація ГЦ пар.

Оскільки ДНК має значну молекулярну масу, відповідно її легко можна

відділити від низькомолекулярних сполук за допомогою ультрацентрифугування.
Азотисті основи (та відповідні нуклеотиди), що входять до складу
нуклеїнових кислот ДНК і РНК, забезпечують спектрофотометричні
властивості останніх. Нуклеїнові кислоти можуть поглинати ультрафіолетове
світло із максимумом 260 нм.
 31

Коефіцієнт седиментації відображає співвідношення швидкості осаду ДНК

у разі центрифугування залежно від молекулярної маси:
0,445 IgM = 1,819 + Ig(S-2,7),
де М - маса нуклеїнової кислоти;
5 - одиниця Сведберга (коефіцієнт седиментації).
Утворення полінуклеотидів | супроводжується | певним | зниженням
УФ-поглинання порівняно із сукупністю вільних нуклеотидів. Поглинання за
260 нм нативної молекули ДНК у середньому на 40 У» нижче відповідного
поглинання суми азотистих основ, що входять до складу полінуклеотиду (так
званий гіпохромний ефект).
Оскільки подвійна спіраль ДНК утримується за рахунок нековалентних
слабких взаємодій (водневих зв'язків і стекінг-взаємодій), у результаті впливу
температури, рН, іонізації тощо може відбуватися порушення нативної
двоспіральної конформації молекул ДНК та їх впорядкованого просторового
розташування з утворенням невпорядкованих додноланцюгових клубків -
денатурація ДНК. Молекулярною основою денатурації молекул ДНК є
руйнування водневих зв'язків між комплементарними азотистими основами А-Т і
Г-Ц. Денатурація ДНК супроводжується гіперхромним ефектом і зменшенням
в'язкості її розчинів.
Ренатурація - це протилежний денатурації процес відновлення нативної
вторинної конформації ДНК, що відбувається за певних фізіологічних умов.
Ренатурація ДНК супроводжується гіпохромним ефектом і збільшенням в'язкості
її розчинів.
Важливим чинником, що впливає на процеси денатурації-ренатурації ДНК,
є температура. У результаті нагрівання нековалентні зв'язки, що утримують ДНК,
стають слабкими та порушуються (денатурація або плавлення ДНКУ.
Температуру, за якої 50 Ус ДНК стає денатурованою, називають
температурою плавлення, Тт (рис. 1.26). На температуру плавлення ДНК
впливає вміст ГЦ пар нуклеотидів (чим більше ГЦ, тим вище Тт ), а також рН,
іонна сила, радіація.

10 I 1 І 4 І
"65 70 75 80 85 90 95
т СС)
Рис. 1.26. Температура плавлення ДНК
 32

Згідно з правилом комплементарності для ДНК характерна гібридизація -

процес взаємодії ланцюгів двох різних полінуклеотидів із комплементарною або
частково комплементарною послідовністю ДНК чи РНК (рис. 1.27).

ов
Подвійна ДНК

Гібридизація

С
Гібрид

Рис. 1.27. Схема гібридизації ДНК

Використовуючи здатність нуклеїнових кислот до гібридизації, розроблено

сучасні методи візуалізації дослідних фрагментів ДНК 1 РНК - Саузерн-блотинг 1
Нозерн-блотинг відповідно й метод іп 5йи-гібридизації, які широко застосовують
для визначення кількості копій гена в досліджуваній тканині або виявлення
вагомих структурних змін у генах (делеції, перегрупування тощо).
Метод ДНК-ДНК гібридизації заснований на тому факті, що стабільність
ДНК-ДНК дуплексів за певної температури залежить від кількості нуклеотидів,
які утворюють комплементарні пари. Очевидно, що кількість комплементарних
нуклеотидів у дуплексі, де обидва ланцюги походять з однієї і тієї ж молекули
ДНК (тобто в гомодуплексах), дорівнює 100 У5. Якщо ж обидва ланцюги мають
різне походження (гетеродуплекс), то, залежно від кількості мутацій, кількість
комплементарних пар буде менша 100 95. Відповідно гетеродуплекси повинні
розпадатися за більш низької температури, ніж гомодуплекси. Причому чим
нижча температура плавлення, тим більше відмінностей у двох послідовностях.

Розділ 2. МЕТОДИ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ

2.1. Центрифугування в градієнті густини
Макромолекули або органели, що несуттєво розрізняються за розміром або
густиною, можна розділити центрифугуванням у градієнті густини. Для цього
застосовують такі методи.
Зональне центрифугування. Аналізовану пробу (наприклад, білки або
ДНК) нашаровують поверх буферного розчину. У процесі центрифугування
 33

частинки проходять через розчин, оскільки їх густина вища густини розчину.

Швидкість руху залежить від маси й форми частинок. Перш ніж частинки
досягнуть дна центрифугальної пробірки, центрифугування припиняють. Дно
пробірки проколюють і збирають фракції, що містять різні частинки. Стабільності
градієнта густини в процесі центрифугування досягають за рахунок розчинів
вуглеводів або колоїдного силікагелю, концентрація яких зростає від поверхні до
дна пробірки. Градієнт густини перешкоджає утворенню конвекційних потоків,
що знижують якість поділу.
Ізопікнічне центрифугування. Пробу (наприклад, ДНК, РНК або віруси)
рівномірно розподіляють у повному об'ємі розчину (зазвичай С5СІ,). У випадку
застосування ізопікнічного центрифугування поділ триває значно довше, ніж за
зонального. Градієнт густини створюється за рахунок седиментації і дифузії.
Згодом кожна частинка потрапляє до ділянки, що відповідає її власній плавучій
густині. У момент встановлення рівноваги центрифугування припиняють.
Отримані фракції аналізують, використовуючи відповідну вимірювальну техніку.
Ультрацентрифугування. Даний метод заснований на різній швидкості
седиментації білкових молекул у розчинах із різним градієнтом густини
(сахарозний буфер чи хлорид цезію) (рис. 2.1).

4 =Hecte о
Повільне
Центрифугування +. "ocamKeHHA
| 000
| з
Стабілізувальний
і пана ориніюувння
розчин сахарози и

Рис. 2.1. Етапи ультрацентрифугування

Застосування методів центрифугування дозволяє виділити ту чи іншу
фракцію ДНК, РНК або білка, очистити їх від домішок, а також визначити
молекулярну масу речовини за умов проведення додаткового центрифугування
подібних речовин із відомою молекулярною масою.

2.2. Клектрофоретичні методи

Електрофорез на даний час - основний метод дослідження білків і
нуклеїнових кислот. У сучасній науковій літературі часто зустрічаються статті, у
яких розглянуто застосування електрофорезу. Метод дозволяє розділяти
макромолекули, що розрізняються за такими найважливішими параметрами, як
розміри (або молекулярна маса), просторова конфігурація, вторинна структура й
електричний заряд, причому ці параметри можуть бути як окремо, так і в
сукупності. Фізичний принцип методу полягає в тому, що макромолекули мають
 34
деякий сумарний електричний заряд, величина і
знак якого залежать від рН середовища. Якщо
через цей розчин, уміщений у канал 13
ізоляційного матеріалу, наприклад скляну трубку,
почати пропускати електричний струм, то вздовж
каналу встановиться певний градієнт напруги,
тобто сформується електричне поле. Його
напруженість вимірюють різницею потенціалів
до кінців робочого каналу (або його ділянки),
віднесеної до його довжини (В/см). Під дією
електричного поля макромолекули відповідності
Рис. 2.2. Схема приладу до свого сумарного заряду мігрують у напрямку
для найпростішого катода або анода, причому ix тертя 06
електрофорезу в гелі навколишнє середовище обмежує швидкість
міграції. Залежно від величини заряду і розмірів
молекули набувають різних швидкостей, і в
цьому полягає сутність електрофорезу. Поступово у вихідному препараті, який
складався з різних молекул, формуються зони однакових молекул, що мігрують з
однією і тією ж швидкістю. І з часом ці зони розподіляються за довжиною каналу.
На рис. 2.2, крім робочого каналу (трубки), зображено деякі необхідні
компоненти системи. По-перше, це два електроди у вигляді спіралей, виготовлені
з платинового дроту, а, по-друге, електродні резервуари. Робочий канал
заштриховано. Такі прилади використовували на перших етапах застосування
методу (електрофорез у вільній рідині). У рідині не можна уникнути конвекції,
яка деформує 1 змішує поділені зони. Тому в сучасних приладах робочий канал
заповнюють гелем (рис. 2.2, штриховка). Досить чиста і добре змочувана
(гідрофільна) просторова сітка гелю перешкоджає витіканню рідини і конвекції.
Водночас використовувані гелі містять дуже багато рідини (80-99,5 90), у якій
(тобто в робочому буфері) 1 мігрують макромолекули.
Електрофорез у поліакриламідному гелі й агарозі. На сьогодні
електрофорез | застосовують | майже | виключно в агарозному або
поліакриламідному гелі (ПААГ). Варіюючи концентрацію полімеру, можна
отримувати гелі з дуже широким діапазоном розмірів пор. Крім того, можна
змінювати електричні заряди макромолекул шляхом варіації рН буфера, а їх
конфігурацію - уведенням у буфер денатурувальних агентів або детергентів. Усе
це надає електрофорезу виняткову гнучкість. Проте електрофорез має і свої
недоліки. Спільні макромолекули все ж таки наявні в розчині, тому можлива їх
дифузія, що спричиняє розмивання зон. Проходження через рідину електричного
струму неминуче пов'язане із виділенням тепла. Утім великі молекули білків і
нуклеїнових кислот дифундують He надто з швидко. Однак проблема
тепловідведення, а, головне, його рівномірності по всьому гелю дуже важлива ще
й тому, що швидкість міграції макромолекул в електричному полі залежить від
температури. Нерівномірність нагрівання (гелю | неминуче 0 призведе до
спотворення зон і погіршення їх поділу.
 35

У ході електрофорезу зони розчинених макромолекул залишаються

невидимими. Для спостереження за процесом у вихідний препарат додають
барвник, молекули якого несуть електричний заряд із тим же знаком, що і
фракціоновані макромолекули, але не взаємодіють із ними. Барвник теж
пересувається в електричному полі, але вже у вигляді забарвленої зони. Його
підбирають таким чином, щоб швидкість міграції найрухливіших макромолекул
була дещо нижчою, ніж у молекул барвника. Коли пофарбована зона доходить до
кінця трубки, електрофорез припиняють.
Розділені зони біополімерів, для запобігання їх дифузії, негайно фіксують.
Для цього гель витягають зі скляної форми і вимочують у суміші кислоти зі
спиртом так, щоб білки або нуклеїнові кислоти випали в осад у тому самому
місці, де закінчилася їх міграція в ході електрофорезу. Після фіксації (або
одночасно з нею) проводять забарвлення зон вимочуванням гелю в розчині
барвника, що міцно зв'язується з білком або нуклеїновою кислотою. Надлишок
барвника видаляють. На фотознімку забарвленого циліндричного ПААГ
(рис. 2.3, а) добре видно чіткі вузькі смуги розділених компонентів вихідної
суміші білків.

а б

Рис. 2.3. Електрофорез у гелі:

а - трубки з ПААГ після закінчення електрофорезу, горизонтальні смужки - забарвлені

Ж
зони протеїнів; б - пластина агарозного гелю після розділення фрагментів ДНК, реєстрація
люмінесцентним барвником (бромистим етидієм)

Замість циліндричних часто використовують гелі у вигляді тонких пластин,

заполімеризованих між двома плоскими скельцями. Такі пластини мають суттєву
перевагу: на них можна одночасно фракціонувати кілька препаратів. Зазвичай їх
вносять з одного боку гелю на однакових відстанях один від одного. Кожен
препарат рухається в електричному полі незалежно від своїх «сусідів»,
утворюючи певний набір зон. На фотознімку даної пластини (рис. 2.3, б) добре
видно серію паралельних «треків», заштрихованих поперечними смугами зон, у
яких розміщені (у нашому випадку) олігонуклеотиди різної довжини.
Замість забарвлення або одночасно з ним часто застосовують методи
виявлення розділених зон за їх радіоактивністю. До них відносять прийоми
 36

реєстрації смуг на фотоплівці за допомогою авторадіографії або флюорографії та

різні способи розрахунку радіоактивності в гелі із використанням рідинних
сцинтиляційних лічильників.
До переваг пластин можна віднести не тільки економію часу і місця в ході
обробки великої кількості препаратів. Оскільки гель заливають у форму для
полімеризації рідким, то його концентрація, склад буфера 1 вміст інгредієнтів
чітко однакові по всьому гелю. Отже, густина струму і напруга електричного поля
також однакові. Це забезпечує ідентичні умови фракціонування різних препаратів
і дає можливість достовірного зіставлення їх складу шляхом порівняння смуг у
паралельних треках. Якщо додати до цього значно вигідніші умови
тепловідведення від тонкої пластинки гелю порівняно з циліндром, то стане
зрозумілою виняткова популярність цієї системи електрофорезу в останні роки.
Сучасні методи електрофорезу передбачають не тільки фракціонування в
ПААГ й агарози. Як «носії» рідкої фази широко використовують також плівки з
ацетату целюлози, фільтрувальний папір, тонкі шари силікагелю, целюлози,
сефадексу Ta iH. | У - деяких випадках, наприклад, Wid розділення
низькомолекулярних речовин, ці системи мають свої переваги, проте для
фракціонування білків, нуклеїнових кислот і їх фрагментів у даний час
використовують майже виключно гель-електрофорез.
Для визначення концентрації ДНК і РНК у розчині широко застосовують
два методи. Найбільш простий і точний метод спектрофотометрії, проте він має
порівняно малу чутливість. Якщо загальний зміст нуклеїнових кислот невеликий,
то концентрацію ДНК і РНК можна визначити за інтенсивністю їх флуоресценції
в УФ-світлі після забарвлення бромистим етидієм.
Щоб дослідити якісний склад ДНК і РНК, застосовують електрофоретичний
метод. Для оцінки концентрації препаратів ДНК або РНК на гель наносять різну
кількість маркерних нуклеїнових кислот. Концентрацію досліджуваної ДНК або
РНК у зразку оцінюють, порівнюючи інтенсивність флуоресценції зразка та
стандартних маркерів із відомою концентрацією. При цьому важливо, щоб проби
ДНК і РНК порівнювали з відповідними маркерами, оскільки за однакової
кількості ДНК і РНК інтенсивність їх флуоресценції в УФ-світлі різна.
Блотинг і метод плям. Крім електрофорезу застосовують блотинг і метод
плям: концентрацію нуклеїнових кислот у розчині можна визначити, забарвивши
розчин бромистим етидієм, вимірявши інтенсивність флуоресценції в УФ-світлі Й
порівнявши її з флуоресценцією маркерів відомої концентрації. Як і у випадку
застосування електрофоретичного методу, маркери мають бути нуклеїновими
кислотами відповідного типу (тобто ДНК або РНК).
Блотингом (буквально - промокання) називають перенесення фрагментів
макромолекул (ДНК, РНК або білка), розділених за допомогою електрофорезу в
гелі, на тверду підкладку - мембрану.
Саузерн-блотинг. Даний метод був розроблений Е. Саузерном у 1975 р. У
вітчизняній літературі його прийнято називати «південний блотинг». Блотинг у
перекладі з англійської мови означає «промокальний папір», саузерн -
 37

«південний», у даному випадку це гра слів: прізвище вченого перекладено як

географічний напрям.
У дослідженнях генома людини часто застосовують метод блотингу,
розроблений Саузерном, відповідно до якого олігонуклеотидний зонд,
розміщений у розчині, гібридизується з ДНК, адсорбованою на мембрані. ДНК
(зазвичай виділену з лейкоцитів або клітин плоду) генома розщеплюють на
короткі фрагменти, розділяють їх в агарозному гелі, переносять на мембрану,
після чого ідентифікують специфічні ділянки за допомогою гібридизації з
олігонуклеотидними зондами. За допомогою цього методу виявляють унікальні
фрагменти ДНК, розмір якої становить приблизно одну мільйонну частину
генома. Важливість застосування методу в медицині обумовлена можливістю
досліджувати певний фрагмент ДНК генома в будь-якої людини. Метод
застосовують для виявлення значних перебудов у ДНК і деяких точкових мутацій
(більшість точкових мутацій цим методом виявити не можна).
Денатурацію ДНК здійснюють за допомогою лугу. Після закінчення
електрофорезу гель поміщають у лужний розчин, в якому дволанцюгові
фрагменти ДНК втрачають зв'язки і стають одноланцюговими.
Перенесення ДНК із гелю на фільтр із нітроцелюлози або нейлоновий
проводять у буферному розчині. Безпосередньо на поверхню гелю кладуть фільтр
і невеликий стос фільтрувального паперу. У результаті капілярного ефекту
створюють струм буфера, перпендикулярний гелю. ДНК, що вимивається із гелю,
затримує фільтр і вона практично повністю осідає на його поверхні. Після
перенесення одноланцюгові нитки фіксують на фільтрі. Розташування фрагментів
на фільтрі точно відповідає їх розташуванню в гелі. Для того щоб візуально
виявити потрібні фрагменти (фіксовану на фільтрі ДНК не видно), проводять
гібридизацію зі специфічним щодо нуклеотидної послідовності мічених
радіонуклідів або флюоресцентної мітки олігонуклеотидним синтетичним зондом
(складається із 16-30 пар основ) або клонованим фрагментом ДНК. Нуклеотидна
послідовність зонда має бути повністю або частково комплементарна ділянці ДНК
досліджуваного генома.
У процесі інкубації фільтра з розчином, що містить мічений зонд,
відбувається гібридизація комплементарних ланцюгів ДНК зонда 1 фрагмента на
фільтрі. Неспецифічні зв'язані молекули зонда відмивають за допомогою
спеціальної процедури. Радіоактивно мічені ділянки виявляють шляхом
експонування фільтра з рентгенівською плівкою (ауторадіографія). Після
проявлення на плівці можна бачити смуги міченої зондом ДНК. Нерадіоактивні
мітки візуалізують за допомогою флюоресценції або опосередковано за
допомогою антитіл.
Аналіз ДНК проводять за такою схемою: досліджувану ДНК гідролізують
рестриктазами, фракціонують електрофорезом, переносять розділені фрагменти
на фільтр нітроцелюлози і проводять реакцію гібридизації з міченими
олігонуклеотидами (рис. 2.4).
Молекули ДНК розділяють в агарозному гелі електрофорезом. ДНК у гелі
денатурують лугом. Далі луг нейтралізують, а пластину гелю покривають листом
 38

нітроцелюлози. Зверху | на нітроцелюлозу поміщають декілька шарів

фільтрувального паперу, забезпечуючи проходження повільного струму
буферного розчину через гель у напрямі, перпендикулярному напряму
електрофорезу.

і А -
днк я" i" Ендонуклеаза
7 г

© Електрофорез |
є? ( й Розщеплення
є с) цен «а ——e
~~

С >
fog Агарозний |== ar,
гель

Нітроцелюлозний ip Перенесення|
фільтр мчч
Рентгенівська плівка

Гібридизація

Радіоавтограф

Рис. 2.4. Блотинг ДНК за Саузерном

ДНК дифундує із гелю і зв'язується з нітроцелюлозним фільтром. Після

прогрівання фільтра за 80"С у вакуумі ДНК необоротно зв'язується з
нітроцелюлозою. Смуги іммобілізованої ДНК точно відображають їх
розташування в гелі.
Вестерн-блотинг (білковий імуноблот, англ. УМ/езіегп Біої) - аналітичний
метод, який застосовують для визначення специфічних білків у пробі. На
першому етапі дослідження застосовують електрофорез білків ї у
поліакриламідному гелі для поділу денатурованих поліпептидів за довжиною (як
правило, за наявності додицилсульфата-натрію) або за тривимірною структурою
білка (у нативному стані). Далі білки переносять на нітроцелюлозну мембрану,
потім проводять детекцію 13 використанням антитіл, специфічних до
досліджуваного білка.

2.3. Методи секвенування ДНК

Методи секвенування біополімерів (білків і нуклеїнових кислот - ДНК і

РНК) - це визначення їх первинної амінокислотної або нуклеотидної
послідовності (від англ. 5едиепсе - послідовність). У разі секвенування білків
застосовують методи Едмана, Сенгера та інші; для секвенації нуклеїнових кислот
- методи Максама-Гілберта або Сенгера.
 39

Метод Максама і Гілберта, запропонований у 1977 р., базується на

хімічній модифікації нуклеотидів у складі ДНК за допомогою гідразину та
диметилсульфату. Модифікація нуклеотидів призводить до обриву ланцюга ДНК.
Застосування певної концентрації хімічних реагентів та терміну інкубації
дозволяє обривати ланцюг за місцем локалізації пуринових або піримідинових
нуклеотидів (А, Г або Т, Ц). Для реєстрації продуктів реакції на 5"-кінець
полінуклеотиду вводять радіоактивну мітку. Розщеплені продукти реакції мають
різну довжину Й відповідно різний загальний заряд, що визначають за допомогою
електрофорезу. Ауторадіографія гелю після електрофорезу дозволяє визначити
послідовність досліджуваних нуклеотидів, які реєструються на гелі у вигляді
смуг. За допомогою методу Максама-Гілберта можна визначати всю
послідовність ДНК, починаючи з першого нуклеотиду. Проте він має недоліки
щодо трактування результатів експерименту, оскільки можливе перехресне
реагування пуринів (А та Г), модифікованих диметилсульфатом, і піримідинів (Т
і Ц) - гідразином. Також метод Максама-Гілберта не дозволяє секвенувати
фрагменти ДНК, більші за 200-300 п.н., та не піддається автоматизації.
Метод Сенгера. Перший метод прямого ферментативного секвенування
ДНК, запропонований Ф. Сенгером і Д. Коулсоном. Метод базується на принципі
полімеразного копіювання одноланцюгового фрагмента ДНК. Для застосування
методу необхідні нуклеотидтрифосфати всіх типів (АТФ, ГТФ, ТТФ, ЦТФ), ДНК
полімераза та праймери (синтетичні олігонуклеотиди або природні фрагменти
ДНК, одержувані в результаті гідролізу ендонуклеазами). Специфічна термінація
синтезу копії ДНК забезпечується додаванням у реакційну суміш крім чотирьох
типів НТФ (один із яких радіоактивно мічений за альфа положенням фосфату) ще
й одного з 21,3'-"дидезоксинуклеозидтрифосфату (Ч4АТФ, 44ТТФ, 4АЦТФ або
ЧАГТФ), який здатний включатися в зростаючий ланцюг ДНК, але не забезпечує
подальше копіювання за відсутності 3'-ОН групи. Для визначення первинної
структури досліджуваного фрагмента ДНК необхідно провести чотири реакції
копіювання: за одним типом термінатора в кожній з реакцій. Після цього отримані
чіатР
продукти реакцій досліджують методом електрофорезу
dd TTR dd OTe dd Ter

з визначенням нуклеотидної послідовності. На сьогодні

м»

- метод Сенгера застосовують в автоматичному режимі.

AQ

Сучасні секвенатори різняться за типом електрофорезу

RE

(капілярні або гелеві), а також за типом і кількістю

Ae

= барвників. Капілярні секвенатори випускають тільки у

eel

варіанті, що використовує детекцію за допомогою

A

J чотирьох різних флуоресцентних фарбників.

S' TAACTAGGTCA 3'

Рис. 2.4. Електрофореграма

На теперішній час одним із найбільш точних і сучасних методів аналізу є

метод використання ДНК-чипів. Технології синтезу ДНК-чипів засновані на
розміщенні на чипі попередньо синтезованих одноланцюгових ДНК i
 40

олігонуклеотидів. Перші чипи містили олігонуклеотиди, оскільки сама суть

створення чипів передбачала використання олігонуклеотидів. Переваги чипів
ізолігонуклеотидами: можливість проведення мутаційного аналізу, досліджень
оліморфізму, детальне вивчення експресії високогомологічних генів.
Головним недоліком даного методу є необхідність попереднього синтезу
великої кількості олігонуклеотидів. Це обмежує ємність таких чипів (до 1 000
олігонуклеотидів). Але навіть цю кількість можна одержати тільки 13
використанням найсучаснішого обладнання для синтезу олігонуклеотидів. Для
синтезу великої кількості олігонуклеотидів можуть бути використані тільки
багатоканальні синтезатори. Комерційно доступним приладом даного класу є
96-канальний синтезатор виробництва «Intelligent Buio-Instruments» вартістю
110 000 дол., здатний синтезувати 10 нМ кожного з 96 олігонуклеотидів на день.
Ще потужніший 192-канальний синтезатор «Мег Маде», виготовлений «Texas
Пляігитепів». Вартість синтезу на ньому становить 0,1 дол. за основу. Але навіть
використання такого обладнання потребує приблизно 10 днів для синтезу І 000
олігонуклеотидів. У той же час олігонуклеотидний чип такої ємності явно
недостатній для мутаційного аналізу довгих фрагментів ДНК.
Дані чипи використовують під час аналізу експресії кількох сотень генів,
для визначення поліморфних варіантів генів, детекції кількох відомих мутацій.
Усі ці галузі використання можуть мати клінічне значення, наприклад, детекція
експресії деяких клінічно значущих онкомаркерів, детекція деяких спадкових
захворювань, антибіотикорезистентності, онкозахворювань, пов'язаних із
певними нуклеотидними замінами в суворо визначених сайтах генів.
Іншим поширеним типом чипів є так звані к-ДНК-чипи. Це чипи, на
поверхню яких нанесено одноланцюгові молекули ДНК. Зазвичай ДНК
одержують із продуктів полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Процес синтезу
даних чипів складний і тривалий і складається з таких етапів.
Основною умовою створення чипів є придбання необхідних клонів, що
містять послідовності ДНК, які відповідають сегментам експресивних генів.
Великі наукові центри і біотехнологічні компанії займаються зберіганням
геномних бібліотек 1 їх синтезом. Вартість таких клонів зазвичай висока, а якість
часто низька.
Отримані клони ампліфікують за методом ПЛР. Праймери для цього
зазвичай надають разом із клонами або використовують загальні для всіх клонів.
У будь-якому випадку ампліфікацію проводять у 96 або 384-лункових планшетах.
Продукт ПЛР потребує очищення від праймерів, білків та інших компонентів
реакційної суміші. Одночасна маніпуляція із настільки великою кількістю
субстратів передбачає використання спеціальних термоциклерів, здатних
проводити одночасно ампліфікацію в декількох планшетах. Вартість даних
апаратів - 20-30 тис. дол. Для обробки цих планшетів (додавання реагентів,
промивання, переміщення) потрібне спеціальне роботизоване обладнання
вартістю приблизно 30 тис. дол. Фрагменти ампліфікації на поверхні чипа
розміщують за допомогою спеціальних роботів -- принтерів, або «агтауег5».
 41

Головними особливостями принтерів є кількість каналів, що становить від 4

до 384, і кількість одночасно синтезованих чипів, яка варіює від 24 до 96.
Мінімальний час синтезу чипів - 3-4 год. Вартість таких принтерів - від 45 до
200 тис. дол. Можна стверджувати, що синтез даного типу чипів - складний,
тривалий і трудомісткий процес.
Усі відмінності в технологіях розміщення попередньо синтезованих
олігонуклеотидів або ДНК на поверхні чипа полягають у методах іммобілізації
олігонуклеотидів на поверхні чипа. Як поверхню можна використовувати
полімеризований поліакриламіднй гель. Як лінкер, що з'єднує олігонуклеотиди з
поверхневими групами гелю, використовують похідні гідразиду. Для ефективної
іммобілізації потрібна модифікація пуринових основ олігонуклеотидів.
Перевагою розглядуваного способу є тривимірний характер іммобілізації
олігонуклеотидів за всім об'ємом гелю, що дозволяє іммобілізувати більшу
кількість олігонуклеотидів порівняно з іммобілізацією на поверхні. Міцна
ковалентна іммобілізація дає можливість багаторазового (до 20 разів)
використання чипа. Це значно знижує вартість досліджень, що особливо важливо
для клінічної практики. У той же час необхідність модифікації основ у
олігонуклеотидній послідовності суттєво знижує специфічність гібридизації, що
робить такі чипи непридатними для мутаційного аналізу і досліджень
поліморфізму ДНК.
Проаналізуємо підхід, за якого пробу наносять безпосередньо з розчину
шляхом прикладання електричного струму до певної ділянки чипа. При цьому
нанесення проби пов'язане з її іммобілізацією. Перевагою даного методу є
непотрібність механічного нанесення проб. Чип послідовно промивають
розчинами, що містять різні проби. Під час кожного такого промивання
електричний струм підводять тільки до однієї ділянки чипа, на якому 1 фіксують
дану пробу. Для іммобілізації проби на поверхні чипа-електрода можна
застосовувати метод електрополімеризації піролів, при цьому ДНК проби хімічно
з'єднують із пірол-мономером. Цим розчином промивають чип. На поверхні
електрода, до якого прикладено напругу, відбувається полімеризація пірол-
мономерів. Таким чином, пробу «прив'язують» до поверхні електрода. Далі
напругу прикладають до іншого електрода, і чип промивають розчином, що
містить іншу пробу. Застосування даного методу дозволяє синтезувати чипи з
кількістю олігонуклеотидів до 1000. Обмеження методу пов'язані з можливістю
одночасної іммобілізації тільки однієї проби.
Аналогічний підхід, але з використанням простішої системи, за якої пробу
мітять біотином, а електрод покривають шаром агарози, що містить стрептавідин,
застосовують у чипах фірми «ХМапогеп».
Найпоширенішою є іммобілізація ДНК, розміщених на поверхні чипа за
допомогою робота-принтера. При цьому іммобілізація відбувається на склі,
покритому функціонально активними групами. Функціональні групи представлені
нуклеофілами (такими як аміногрупа). ДНК-проба містить карбоксильну або
фосфорильну групу на 5"-кінці, уведену за допомогою відповідних модифікованих
праймерів. Як електрофіли застосовують карбоксильні чи альдегідні групи: при
 42

цьому ДНК містить аміногрупу на 5"-кінці, також уведену за допомогою

модифікованого праймера.
Для іммобілізації можливе використання реакції утворення дисульфідного
зв'язку. При цьому поверхневі групи на чипі й 5"-кінець ДНК міститимуть тіолові
групи.
Головною перевагою к-ДНК-чипів порівняно з олігонуклеотидними є
можливість синтезу іммобілізованої на них ДНК методом ПЛР із використанням
праймерів однієї і тієї ж послідовності для будь-якої кількості клонів. У результаті
кількість одержуваної ДНК буде практично необмежена. Сучасні термоциклери
здатні виробляти ампліфікацію одночасно в декількох планшетах на 96 або 384
лунки. Принтери з великою кількістю каналів можуть швидко наносити
ампліфіковані ДНК на поверхню одночасно декількох чипів. Усе це дає
можливість створювати чипи з кількістю осередків до 40 000 і щільністю 10 000
Ha | cm’, при цьому розмір лунки - не менше 50 мкм. Дані характеристики - межа
можливості аналізованої технології, оскільки нанесення крапель розчину, що
містить ДНК розміром, меншим 50 мкм, механічним способом неможливе.
Використання довгих (до 1 000 п.н) молекул ДНК має істотні недоліки. Це
пов'язано з обов'язковою наявністю вторинної структури ланцюгів ДНК даної
довжини, зумовленої присутністю компліментарних послідовностей. Taki
взаємодії з утворенням вторинної структури можливі як усередині однієї
молекули проби (внутрішньомолекулярні), так 1 між сусідніми молекулами
(міжмолекулярні).
Дані взаємодії суттєво ускладнюють гібридизацію з досліджуваної ДНК.
Значна довжина ДНК у зразку також різко знижує специфічність гібридизації з
ДНК, яка містить істотні відмінності у з нуклеотидній послідовності
(негомологічна гібридизація). Усе це робить розглядувані чипи цілком
непридатними для мутаційного аналізу і визначення різних поліморфних
маркерів, включаючи диференціацію між високогомологічними ізоформами генів.
Отже, єдиною сферою використання таких чипів є порівняльне визначення генної
експресії. Цього зазвичай досить для проведення досліджень у галузі
функціональної геноміки, коли для визначення функції гена порівнюють його
експресію в різних умовах і за різного стану, що викликають значні зміни. к-ДНК-
чипи на теперішній час найпоширеніший тип чипів для даних досліджень. Але
відносно невелика кількість проб, розміщених на одному чипі, і низька
специфічність гібридизації робить використання чипів неможливим для
грунтовного вивчення експресії всіх генів у складних геномах, таких як геном
людини. Застосування цього методу також суттєво обмежує складністю
процедури їх синтезу, що потребує надзвичайно великих трудовитрат і коштів,
головним чином на придбання, сортування, оцінку, обробку та ампліфікацію
клонотек. Виробниками-лідерами даних чипів є компанії «Пасуїе» і «Зупіепі», що
мають власні клонотеки 1 надають послуги із синтезу чипів необхідного генного
складу на замовлення.
 43

Частина П. ОРГАНІЗАЦІЯ І ФУНКЦІОНУВАННЯ ГЕНОМІВ

Розділ 3. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕНОМІВ
Поняття «геном» і «генотип» багато вчених вважають тотожними, але в ході
детального аналізу між ними можна виявити певні відмінності.
Генотип -- це сукупність генів організму, які визначають певні фенотипічні
ознаки організму: морфологічні особливості, наявність специфічних білків тощо.
Геном - це сукупність нуклеотидних послідовностей в усіх молекулах ДНК
клітини в гаплоїдному наборі. Причому загальний геном клітини складається не
тільки з послідовностей ДНК хромосом, але Й із послідовностей мобільних
генетичних елементів, таких як плазміди, транспозони 1 віруси.
Поняття «геном» ширше, ніж «генотип», оскільки воно включає не тільки
кодуючі ділянки ДНК - гени, але й некодуючі послідовності - так звану
сателітну або егоїстичну ДНК. Такі некодуючі послідовності зустрічаються у
ДНК всіх організмів, але в прокаріотів їх мало (10-20 У), а в еукаріотів вони
становлять переважну більшість послідовностей ДНК і сягають 50-95 Зб від
загального об'єму генома. У людини за деякими даними тільки 3 Уб ДНК зайняті
генами, що кодують білки, рРНК 1 тРНК. Переважна більшість послідовностей
геному людини - це егоїстична некодуюча ДНК.
Функції великої кількості некодуючих послідовностей ДНК ще не з'ясовані,
але є припущення, що значна їх кількість може бути пов'язана з інтеграцією в
геном вірусної та бактеріальної ДНК, дуплікацією певних фрагментів хромосоми,
зворотною транскрипцією і -| вбудовуванням y зд хромосому | ДНК-копій
інформаційної РНК й іншими генетичними процесами.
Розміри геномів визначають за такими показниками:
- молекулярна маса ДНК у дальтонах (Да), І Да - маса протона водню;
- довжина молекули (мкм);
- кількість нуклеотидів чи пар нуклеотидів (и.н.) - відповідно для
гаплоїдних 1 диплоїдних організмів;
-кілобази (кб): за | кб обирають ДНК довжиною 1000 пар нуклеотидів.
Знаючи молекулярну масу І нуклеотиду (-500 Да), масу всієї молекули
ДНК і середню довжину гена (у прокаріотів та вірусів - приблизно 1000
нуклеотидів, у еукаріотів - 5000 і більше), можна орієнтовно підрахувати
кількість генів у геномі. Нижче наведено кількість генів у деяких організмів:
- вірус гепатиту В - 4 гени;
- вірус імунодефіциту людини - 9 генів;
- фаг фХ 174 - 9 генів;
- бактеріофаг ТА E. coli — 200 renis;
- Е-фактор (плазміда фертильності) Е. соїї - 90 генів;
- хламідії - 400 - 600 генів;
- рикетсії - 800 -- 1000 генів;
- Є. сої - понад 4000 генів;
- людина - 75 тис. генів (можливо, 100 -- 150 тис.).
 44
Розроблені в останні десятиріччя молекулярно-генетичні методи вивчення
геномів, а також секвенування ДНК дозволяють достатньо точно визначати
кількість генів у тих чи інших організмів. Слід зауважити, що визначити кількість
генів в еукаріотів значно складніше, оскільки для їх генома характерна
надлишковість, а гени містять, крім кодуючих ділянок (екзонів), ще й некодуючі
послідовності - інтрони. Крім того, у межах певної геномної ділянки можуть
існувати 2 - 3 генні рамки зчитування.
Ген - це послідовність нуклеотидів, що кодує амінокислотну послідовність
відповідного білка. Ген забезпечує реалізацію певної функції в організмі.
Інформація закодована в гені за допомогою триплетного коду, в якому кожен
триплет (трійка нуклеотидів) кодує певну амінокислоту. Тобто послідовність
триплетів у гені визначає відповідну послідовність амінокислотних залишків у
молекулі білка. Зазначимо, що не всі гени кодують білки. Деякі гени кодують
молекули рибосомальних і транспортних РНК (рРНК і тРНК), дуже важливі для
утворення рибосом 1 здійснення на них трансляції. Синтез інших біополімерів -
полісахаридів і ліпідів - відбувається завдяки ферментам вуглеводного та
ліпідного метаболізму, також закодованим у генах.
Узагалі всі фізіологічні, біохімічні й біологічні процеси в живих організмах
перебувають під генним контролем. Цілі групи, що складаються із десятків і
навіть сотень генів, контролюють процеси реплікації, репарації, розподілу клітин
(у тому числі, мітоз 1 мейоз), індивідуальний розвиток.
Мутації в генах можуть призводити до змін у синтезі білкових продуктів,
порушення біохімічних і фізіологічних процесів, проте деякі мутації можуть,
навпаки, посилювати експресію тих чи інших генів, наприклад, за рахунок
підвищення спорідненості регуляторного білка до оператора гена.
За сучасними уявленнями ген - універсальна структурна одиниця живої
матерії, яка завдяки закодованій у ній інформації забезпечує єдність і
різноманітність існуючих форм життя, контролює клітинний обмін (метаболізм),
спадковість, еволюцію. Як було зазначено, сукупність генів формує генотип.
У процесі еволюції органічного світу відбувалися удосконалення геномів,
вибракування незначущих генів, мутаційні та рекомбінаційні перебудови ДНК,
формування 1 ускладнення регуляторних систем контролю експресії генів тощо.
Учені вважають, що еволюція генетичного апарату живих істот відбувалася так:
кодон -з ген -» оперон -» геном вірусів і плазмід -» геном прокаріотів --
геном еукаріотів
Геном вірусів не такий досконалий, як у про- 1 еукаріотів, і зазвичай
містить нуклеїнові кислоти одного типу - одно- чи дволанцюгову ДНК або одно-
чи дволанцюгову РНК.
Геном прокаріотів значно складніший, ніж геном вірусів. Геном
прокаріотів гаплоїдний (п). До його складу входить не тільки хромосомна ДНК,
представлена однією кільцевою молекулою, але Й послідовності нуклеотидів
мобільних генетичних елементів (МГЕ) - плазмід, фагів, транспозонів.
Геном еукаріотів ще більш еволюційно розвинутий. В еукаріотів
розрізняють ядерний геном, мітохондріальний геном 1 геном пластид. Крім того,
 45

додаткову генетичну інформацію в еукаріотів несуть різноманітні транспозони,

дефектні віруси та інші генетичні елементи. Соматичні клітини еукаріотів містять
диплоїдний геном (2л), статеві клітини - гаплоїдний (п).
Геноми всіх клітинних організмів (про- і еукаріотів) мають такі характерні
властивості:
1) здатність до самореплікації, оскільки ферменти, що здійснюють
подвоєння ДНК, кодує сама ДНК;
2) здатність до самопоновлення (мінливості) за рахунок мутацій,
рекомбінацій, транспозицій та інших генетичних змін;
3) здатність до самовираження - експресії генів шляхом транскрипції та
трансляції;
4) здатність до самовиправлення за допомогою механізмів репарації, ревізії
та супресії;
5) контроль за індивідуальним розвитком клітин і організмів.
Усі перелічені функції геномів пов'язані з роботою генів - структурних
одиниць генетичної інформації.
Наприкінці ХХ ст. був започаткований міжнародний науковий проект
«Геном людини». Мета створення даного проекту було картування всіх генів на
хромосомах і визначення функцій генів. Кінцевим завданням генетики вчені
вважали генетичне моделювання людини і передусім застосування генетичних
методів у лікуванні спадкових хвороб, раку, СНІДу.
Відкриття рестриктаз, лігаз, зворотної траскриптази не тільки мало важливе
значення для розвитку генної інженерії та отримання біологічно активних
продуктів, але й відіграло значну роль у вивченні геномів живих організмів і
людини в тому числі. Так, шляхом клонування генів людини в клітинах бактерій
було створено «бібліотеки», які включали багато тисяч фрагментів ДНК, що дає
змогу вибрати будь-яку ділянку хромосоми для більш детального дослідження.
Грунтовне вивчення генома людини і розробка складних молекулярно-
генетичних методів клонування генів у бактеріальних клітинах і вірусах
підштовхнуло вчених до вивчення геномів мікроорганізмів. На сьогодні
розшифровано геноми понад 400 бактерій, геноми багатьох корисних для людей
рослин. У результаті вивчення геномів тварин встановлено еволюційні зв'язки
між певними систематичними групами живих істот.
Одним із перших, хто висунув ідею проекту «Геном людини» у 1986 р., був
італійський учений, лауреат Нобелівської премії Ренато Дулбекко, який
наголосив, що вивчення генома людини - це єдиний спосіб перемогти рак.
Наприкінці 90-х рр. ХХ ст. почалося серйозне протистояння у поглядах і методах
між двома групами вчених, які працювали над проектом «Геном людини». Одну
групу очолив відомий учений, президент компанії «Сеіега рбепотіс5» Крейг
Вентер (міліонер, ветеран війни у В'єтнамі), який застосовував штурмові методи
«шотган-секвенування» генома людини з одночасним комерційним
патентуванням виявлених генів. Групі К. Вентера протистояли академічні кола
Кембриджа під керівництвом Джона Салтона, які фінансувала організація
«У/еісоте Тги58ї». Вони надавали перевагу методам системного вивчення генів і
 46

протестували проти комерціалізації проекту. Кембриджська група планувала

повністю визначити геном людини протягом 15 років і потребувала фінансових
інвестицій на 3 млрд дол. Група Вентера оголосила, що виконає це завдання за 1,5
року і попросила всього 300 млн дол. на проведення досліджень. До 2000 р. геном
людини був повністю розшифрований групою Крейга Вентера.
У 2002 р. Вентер був звільнений із посади президента акціонерами компанії
«Сеїега сепотіс5», які вважали патентування генів невигідним, після чого вчений
став засновником всесвітньо відомого Інституту генетичних досліджень (ТІСВ -
The Institute for Genomic Research). Із 2002 р. Інститут Вентера займається
створенням штучних живих організмів. Спочатку був штучно синтезований геном
вірусу ФХ-174, який після введення у клітини бактерій почав функціонувати як
природний і став активно розмножуватися.
Наступним завданням групи Вентера стало створення штучної бактерії з
метою одержати мікроорганізм, який був би активним біодеградантом нафти та
інших токсичних продуктів у навколишньому середовищі. Дослідження почали зі
створення ДНК мікоплазми, яка має найменший серед бактерій геном. Після
грунтовних досліджень 29 березня 2010 р. було штучно створено мікроорганізм на
основі генома Mycoplasma mycoides. Спочатку за допомогою синтезатора генів
синтезували невеликі фрагменти хромосоми, а потім у клітинах дріжджів провели
їх зшивання лігазою, після чого замінили кільцеву хромосому мікоплазми на
штучну, в яку попередньо вбудували гени, що надали колоніям блакитного
кольору. Після вирощування трансформованих клітин на живильному середовищі
вчені виявили перші блакитні колонії штучно створених бактерій.
Геном людини - це літопис виду, розпочатий 4 млрд років тому, що
продовжується і до сьогодні. Деякі гени зближують нас із черв'яками, рибами та
іншими низькоорганізованими тваринами. Вважають, що кількість генів у геномі
людини становить приблизно 60000 -- 80000. На кінець ХХ ст. біологічні функції
було описано для 5000 генів, але кожного року їх кількість збільшується
приблизно на сотню. У геномі людини понад 3 млрд нуклеотидів, що у 800 разів
більше, ніж слів у Біблії. Якщо всі нуклеотиди генома людини записати як текст,
то вийде стос книжок висотою 45 м. Гени на хромосомах, на відміну від тексту у
книзі, зчитуються при транскрипції у двох напрямках, але ніколи - в обох одразу.
Геном постійно змінюється і людство накопичує приблизно 100 мутацій на кожне
покоління. Це небагато в розрахунку на мільярди нуклеотидів, проте навіть одна
мутація може виявитися фатальною. Метт Рідлі у своїй книзі «Геном» висловлює
таку думку: «Ми з вами - щасливе покоління, якому вперше вдалося розкрити
книгу людського генома».
У результаті грунтовного вивчення даної проблеми в останні десятиліття
було виявлено такі особливості функціонування геномів живих істот:
- в еукаріотів не всі гени знаходяться в ДНК ядерних хромосом, частина їх
розташована в ДНК мітохондрій і пластид;
- не у всіх організмів гени «записані» в молекулі ДНК, деякі віруси
зберігають генетичну інформацію генів у молекулах РНК;
- не всі гени кодують білки, продуктами генів можуть бути рРНК і тРНК;
 47

- не всіма біохімічними реакціями керують білки, у деяких реакціях

каталізаторами і регуляторами є молекули РНК або самої ДНК;
- один ген може кодувати декілька білків, які утворюються шляхом
альтернативного сплайсингу молекули ІРНК, в інших випадках декілька генів
можуть брати участь у кодуванні різних доменів одного білка;
- у генетичному коді не всі 64 кодони визначають певні амінокислоти,
стоп-кодони - некодуючі, а відіграють важливу роль у термінації трансляції;
- не вся ДНК - кодуюча, значна її частина (особливо в еукаріотів) - це
випадкові послідовності або численні повтори, які зазвичай не транскрибуються в
ІРНК. Таку ДНК називають сателітною;
- у клітинних організмів ДНК відповідає за спадковість, реплікацію,
розмноження, ознаки статі - тобто все, що називають генотипом, а білки
контролюють такі життєві процеси, як метаболізм, дихання, поведінка.
Завдяки вивченню геномів було отримано багато нових даних відносно
участі РНК у різних клітинних процесах. Давно відомо, що РНК - це та хімічна
субстанція, яка є посередником між ДНК і білками та відіграє важливу роль у
переведенні інформації ДНК у послідовність амінокислот у молекулі білка в
процесі трансляції. Проте все менше залишається сумнівів, що саме РНК була
попередницею ДНК і білка. Існують декілька свідчень того, що РНК у процесі
еволюції була першою біополімерною молекулою, що з'явилася раніше ДНК і
білків і могла зберігати і відновлювати генетичну інформацію:
-компоненти молекули ДНК можна легко отримати шляхом модифікації
нуклеотидів РНК;
- деякі ферменти для активації потребують участі невеликих молекул РНК;
- РНК без участі ферментів здатна копіювати себе за наявності нуклеотидів,
а також може каталізувати подовження власного ланцюга;
-усі найважливіші та реліктові процеси клітини відбуваються за участю
РНК: інформація, записана в ДНК, зчитується на молекулу ІРНК; РНК входить до
складу рибосом, які транслюють генетичний код у білок, при цьому молекули
тРНК підхоплюють у цитоплазмі амінокислоти й доставляють їх до місця синтезу
білкової молекули; у прокаріотів 4,55 РНК бере участь у формуванні структури
нуклеоїду;
-в еукаріотів невеликі молекули РНК фіксують петлі інтронів для їх
вирізання під час сплайсингу; крім того, сама ІРНК здатна до аутосплайсингу,
тобто до самонарізання з видаленням інтронів і подальшим зшиванням кінців
екзонів.
Можливо, якщо синтезувати довільним чином молекули РНК безпосередньо
в пробірці - іп уїго, можна отримати сполуку, що буде відповідати за своїми
хімічними властивостями першоджерелу життя. Молекули РНК, отримані в
результаті таких експериментів, завжди були схожі за своїм вмістом на текст гена
рибосомальної 55 РНК, що знаходиться поблизу центромери хромосоми |.
У 1989 р. за відкриття властивостей РНК Томас Сеч 1 Сідні Альтман були
нагороджені Нобелівською премією.
 48

Розділ 4. ГЕНОМИ ПРОКАРІОТІВ

Прокаріоти серед клітинних організмів займають особливе місце, оскільки
не мають типового ядра, оточеного ядерною мембраною. Їх клітини не розділені
на компартменти, тобто в них немає органел, крім рибосом для забезпечення
біосинтезу білка. До - прокаріотичних організмів належать бактерії Ta
ціанобактерії. Їх геном складається з нуклеотидних послідовностей, що входять
до складу кільцевої хромосоми, а також додаткових елементів генома - плазмід,
транспозонів, интегронів, фагів, профагів, залишків фагової та плазмідної ДНК.
4.1. Структура нуклеоїду
Бактеріальну хромосому називають нуклеоїдом, тобто прототипом ядра,
оскільки вона не оточена ядерною мембраною, компактно укладена та занурена
безпосередньо в цитозоль. Бактеріальна хромосома має гаплоїдний набір,
представлена дволанцюговою ДНК, замкненою в кільце. Першим об'єктом серед
прокаріотів, у якого був вивчений генетичний апарат, стала кишкова паличка -
Escherichia сої. Було з'ясовано, що її хромосома має кільцеву форму і містить
приблизно 5 109 п.н., аїї молекулярна маса становить 2,5-3,0 :- 10° Да.
Існування кільцевої форми хромосоми в прокаріотів довів ще в 1960-1963
рр. Дж. Кернс, який отримав радіоавтограф міченої "Н-тимідином хромосоми Є.
coli із контурною довжиною 1,3 мм, що у 500 раз перевищує довжину самої
клітини. Кернес вирощував ХЕ. сої у спеціальній камері в живильному середовищі
з додаванням міченого "Н-тимідину. За активного розмноження клітин відбувався
синтез ДНК, у яку вбудовувались молекули міченого тимідину. У фазі активного
росту культури клітини бактерій руйнували шляхом діалізу проти лаурилсульфату
натрію або додаванням лізоциму і етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТО).
Видаляли білки, але не допускали механічного перемішування, оскільки всі
інгредієнти надходили в камеру через напівпроникну мембрану шляхом дифузії.
Після очищення ДНК від баластних речовин камеру висушували, а мембрану
поміщали на пластинку для авторадіографії, на якій у ділянках локалізації міченої
"Н-ДНК з'являлися засвічені темні плями. Аналіз радіоавтографів дозволив
виявити видовжені розтягнуті молекули ДНК, серед яких були замкнені у кільце
подвійні спіральні хромосоми. Розмір хромосомної ДНК досягав у довжину
приблизно 1,3 мм, що збігався із розмірами ДНК, виявленими хімічними
методами.
Бактеріальна хромосома не просто плаває в цитозолі, а в деяких ділянках
прикріпляється до цитоплазматичної мембрани. Виявляють 20-40 сайтів
прикріплення. У релаксованому стані хромосома Є. соії може досягати 1,6 мм у
той час, як довжина самої клітини зазвичай не перевищує 2 - 3 мкм. Для того щоб
хромосома розмістилася в клітині, в ній відбувається декілька актів конденсації, а
саме спочатку вона зазнає позитивної суперспіралізації шляхом додаткового
накручування за годинниковою стрілкою (закручена вправо ДНК). У результаті
початкова В-форма спіралі ДНК стає більш компактною, кількість нуклеотидів на
виток спіралі значно збільшується. Це обумовлює значну напругу в молекулі ДНК
і для запобігання розривів остову молекули вона починає накручуватись у
 49

протилежний бік - проти годинникової стрілки (закручена вліво ДНК). Таку

суперспіралізацію називають негативною і вона сприяє утворенню суперпетель.
Завдяки цьому хромосома компактизується у 1600 раз і діаметр нуклеоїду
становить усього І мкм.
Якщо б гігантська молекула ДНК була укладена довільним чином, то її
упорядкована реплікація (подвоєння в процесі синтезу) і сегрегація (розходження
в дочірні клітини) були б неможливі. Очевидно, високий рівень організації
нуклеоїду забезпечується за рахунок утворення комплексу ДНК із РНК і білками.
Кількість ДНК сягає в ньому 80 95. За допомогою електронної мікроскопії у
виділених нуклеоїдах виявляють від 12 до 140 петель ДНК (довжиною до
40000 п.н.), які в центрі нуклеоїду фіксуються особливими молекулами 4,55 РНК,
за рахунок чого утворюється серцевинна структура. У центрі нуклеоїду також
розташовані гістоноподібні білки НО-а 1 НО-В, що становлять 50 Уб усіх білків
нуклеоїду. І хоча на відміну від еукаріотів бактеріальна хромосома не має
нуклеосом, що складаються з гістонів, білки НО-а і НО-В беруть участь у
намотуванні й фіксації приблизно 1/6 усієї молекули ДНК (рис. 4.1).

Довжина петлі
40000 п.н.

Внутрішні петлі, Х
закріплені серцевин-
ними факторами

; Петля формується
Нуклеоїд усередині ey
eisai шляхом намотування
антеренть дволанцюгової ДНК
набілки НС-аї НС-В

Рис. 4.1. Схема просторового укладення ДНК у нуклеоїді бактерії

Це робить нуклеоїд більш компактною і стабільною структурою. Очевидно,
що саме білки відіграють головну роль у компактизації бактеріальної хромосоми.
ДНК - сильно заряджена молекула. Її негативний заряд обумовлений
іонізованими гідроксильними групами фосфатних залишків, що входять до складу
цукрофосфатного остова молекули. У прокаріотів нейтралізація негативного
заряду ДНК відбувається за допомогою поліамінів (сперміну, спермідину,
путресцину та кадаверину), а також іонів магнію, натрію і цинку. На відміну від
бактерій в еукаріотів значний негативний заряд ДНК урівноважують катіони
основних білків гістонів, що входять до складу нуклеосом.
 50

Моделі укладення бактеріального нуклеоїду. Відповідно до отриманих

радіоавтографів ДНК учені запропонували декілька моделей укладки нуклеоїдів,
Згідно з моделлю, висунутою У/огсе! i Burgi у 1972 р., суперспіралізовані петлі
хромосоми зосереджені на периферії клітини біля цитоплазматичної мембрани, а
в центральній частині нуклеоїду вони частково релаксовані та фіксовані,
очевидно, за допомогою гістоноподібних білків і РНК (рис. 4.1).
Протилежна модель укладення нуклеоїду була запропонована Кіерре в
1979 р. Згідно знею неактивні суперспіралізовані ділянки хромосоми укладені в
центральній зоні нуклеоїду, а деспіралізовані (транскрипційно активні) - уздовж
цитоплазматичної мембрани. Причому на них відбувається транскрипія, яку
виявляють за наявністю інформаційних РНК (продуктів транскрипції) і зв'язаних
із ними комплексів рибосом (полісом), розташованих на самій мембрані.
Можливо, обидві альтернативні моделі укладення бактеріальної хромосоми
мають місце за різних фізіологічних станах мікробної клітини. Хромосома дуже
рухлива і в ній за допомогою ферментів по черзі розкручуються ті чи інші ділянки
ДНК залежно від того, які гени повинні «зчитуватись» на даний момент. Так, на
стадії клітинного циклу, коли відбувається підготовка до реплікації та поділу
клітини і потрібні ферменти головних клітинних функцій, релаксовані
транскрипційно активні ділянки ДНК виявляються в центральній серцевинній
зоні нуклеоїду (модель УМ/огсеї 1 Вигеї). І навпаки, коли клітина зростає і їй
необхідні екзоферменти для позаклітинного перетравлення поживних речовин,
релаксованими стають периферійні ділянки ДНК, на яких відбувається
транскрипція і практично відразу починається трансляція з утворенням білків-
екзоферментів (модель КіІерре). У даному випадку локалізація апарату біосинтезу
біля мембрани сприяє швидкій екскреції позаклітинних ферментів у зовнішнє
середовище, а це необхідно для позаклітинного перетравлення складних
субстратів - білків, полісахаридів, ліпідів, нуклеїнових кислот й інших складних
біополімерів.
4.2. Особливості організації та функціонування геномів прокаріотів
Множинність генома. Для прокаріотів характерна множинність генома, а
саме в межах одної клітини можуть існувати 4, 8 (у Васійиз зибійїя) і навіть 40
ідентичних копій (в АгсоїоРасіег уіпеіапаїї) хромосоми. Це можна пояснити
незбалансованістю процесів реплікації та поділу клітини, коли акти реплікації
відбуваються один за одним, а поділ клітини затримується. Однак для
одноклітинних прокаріотичних організмів наявність дублюючих генів може бути
додатковою перевагою для адаптації до складних умов існування.
Кількість хромосом у прокаріотів. В останні роки у результаті вивчення
геномів понад 400 мікроорганізмів дещо змінилися уявлення про кількість
хромосом у прокаріотичних клітинах. Якщо до 80-х рр. ХХ ст. вважали, що в
бактеріальних клітинах наявна тільки одна гаплоїдна хромосома, то на даний час
у деяких бактерій виявлено 2 - 3 кільцеві хромосоми з різними наборами генів, а
іноді, крім кільцевих, зустрічаються ще й лінійні хромосоми з теломерами,
типовими для еукаріотичних хромосом. У таблиці наведено дані, що
 51

демонструють певні відмінності кількісного складу хромосом у прокаріотів.

Таблиця
Відмінності у кількісному складі хромосом у різних представників прокаріотів

Кількість і форма хромосом Представник Розмір хромосом, п. н.

І кільцева хромосома Escherichia coli K 12 5.0° 10°

Pseudomonas aeruginosa 59108
Brandyrhizobium japonicum 87+ 10°
Rhodobacter capsulatus 3.7° 10°
2 кільцеві хромосоми Rhodobacter sphaeroides I—3.1°10°

Il—0,9* 10°
Vibrio cholerae І-29: 109

П- 1,1 710?
3 кільцеві хромосоми Pseudomonas cepacia I—3.4° 10°

II — 2,5 *10°
Ш -- 0,9 10?
Ї кільцева і І лінійна Agrobacterium tumefaciens I-22° 10°
хромосоми , ,
П-3,0310
І лінійна хромосома Borrelia burgdorferi 0.95 * 10°

Проте зауважимо, що, як правило, тільки одна з кільцевих хромосом містить

повний набір генів головних клітинних функцій, а інші хромосоми несуть
додаткові гени, що сприяють адаптації бактерій до умов навколишнього
середовища. Вважають, що ці додаткові хромосоми утворилися шляхом
коінтеграції великих плазмід, тому їх ще називають мегаплазмідами. Не
виключена також можливість утворення додаткових хромосом у результаті
коінтеграції інших мобільних генетичних елементів.
Особливості реплікації та поділу клітин. Мітозу і мейозу у прокаріотів
немає. Розмноження відбувається шляхом простого бінарного поділу, якому
передує подвоєння молекули ДНК - реплікація, що здійснюється за рахунок
синтезу додаткових дочірніх ланцюгів на розведених матричних материнських
ланцюгах. У більшості прокаріотів реплікація двоспрямована, за винятком деяких
плазмід. Хромосома функціонує як один реплікон, оскільки реплікація завжди
починається з одної ділянки - огієіп-центру (центру ініціації реплікації) і вся ДНК
подвоюється за один акт реплікації. Майже одразу після реплікації відбувається
метилювання деяких нуклеотидів (А, Г, Ц) і особливо в сайтах рестрикції. Це
важливо для запобігання гідролізу власної ДНК рестриктазами. Система
ферментів, що забезпечує процес метилювання власної та рестрикції чужорідної
неметильованої ДНК, отримала назву системи рестрикції-модифікації. Головна
її функція - знешкодження всіх чужорідних ДНК, що проникли у клітину, і перш
за все - вірусних нуклеїнових кислот.
 52

Ощадність генома прокаріотів проявляється в тому, що їх ДНК в

основному представлена кодуючими ділянками (генами) 1 містить мало
некодуючих послідовностей (15-20 90). Для порівняння - в еукаріотів некодуючі
послідовності становлять 50-90 90 генома. Більша частина хромосоми прокаріотів
містить структурні та регуляторні гени. Структурні гени кодують синтез РНК,
клітинних білків і ферментів, що беруть участь у процесах метаболізму, росту та
поділу клітини. Регуляторні гени кодують синтез регуляторних білків, що
керують процесами метаболізму шляхом «увімкнення» або «вимкнення» генів.
Некодуючі послідовності у прокаріотів представлені мультикопійними
повторами. Наприклад, послідовність REP у геномі бактерій може
повторюватись до 580 раз. Послідовність ГЦТГГТГГ повторюється багаторазово й
утворює фрагменти протяжністю 5000 пар нуклеотидів. Вона розпізнається
рекомбіназою гес-ВСР, що бере участь у процесах рекомбінації та репарації.
Серед некодуючих послідовностей у лінійних хромосомах прокаріотів виявляють
послідовності, подібні теломерам еукаріотів.
Локалізація генів на бактеріальній хромосомі. Що стосується
розташування генів на кільцевій хромосомі, то можна спостерігати таку
закономірність: гени головних функцій (реплікації, росту, поділу) локалізовані
ближче до origin-uenmpy, із якого починається реплікація, а гени вторинних
функцій розташовані дистальніше, тобто ближче до Іегтіпи5-центру - місця
закінчення реплікації. Це має певний сенс, а саме, якщо реплікація за якихось
причин завершується передчасно, гени головних функцій вже встигають
подвоїтись.

4.3. Будова генів прокаріотів. Структура оперонів

У мікроорганізмів реалізується правило колінеарності генетичного коду,
тобто існує однозначна відповідність між послідовністю ДНК у даному гені та
кодованою послідовністю амінокислот у поліпептиді (в еукаріотів це правило не
працює). Гени прокаріотів відрізняються відсутністю екзон-інтронної структури.
На відміну від еукаріотів, прокаріотичні гени цілісні, представлені єдиною
нуклеотидною послідовністю і не розчленовані на кодуючі ділянки (екзони) та
некодуючі (інтрони). Тому в прокаріотів відсутній сплайсинг - процес видалення
некодуючих інтронів у молекулі інформаційної РНК. Винятком із цього правила є
гени прокаріотів, що кодують рРНК 1 тРНК (рис. 4.2).
Одиниця транскрипції

235 рРНК
тРНК

Спейсери

Рис. 4.2. Кластер генів, що кодують транспортні та рибосомальні РНК

На рис. 4.2 зображено кластер (групу) генів, що кодують тРНК і рРНК. Як
бачимо, у даному кластері є загальна регуляторна область (оператор). У разі
 53

зв'язування оператора з регуляторним білком відразу починається транскрипція

всіх розташованих у кластері генів і формується єдина ІРНК. При дозріванні
(процесингу) ІРНК окремі її фрагменти, що кодують 165 рРНК, тРНК, 235 рРНК,
55 рРНК, формують петлі, а спейсери, які розділяють їх, видаляються за
допомогою РНК-ази. Таким чином утворюються окремі молекули рибосомальних
і транспортних РНК. Цей процес дещо нагадує сплайсинг, характерний для
еукаріотів, а спейсери можна вважати своєрідними інтронами.
Гени у прокаріотів поодинокі (близько 70 Уб) або зібрані в оперони. Оперон
- це група генів під загальними промотором і термінатором, які кодують
ферменти послідовних метаболічних реакцій. Оперонні угруповання генів досить
часто зустрічаються в мікроорганізмів, причому в оперони можуть бути зібрані
гени ферментів катаболізму вуглеводів (катаболічні оперони), гени синтезу
амінокислот (анаболічні оперони).
Найбільш детально вивчено лактозний оперон кишкової палички, у якому
злагоджено функціонують 3 гени катаболізму лактози. Добре вивчено анаболічні
оперони бактерій - триптофановий оперон кишкової палички, що складається з 5
структурних генів, 1 гістидиновий оперон сальмонел, який містить | І генів.
Під час транскрипції з оперона зчитується поліцистронна іРНК (цистрон -
синонім гена), що містить генетичну інформацію про всі структурні гени оперона,
а з поодиноких генів транскрибуються моноцистронні іРНК.
В еукаріотів, на відміну від прокаріотів, гени зазвичай поодинокі,
транскрибуються з утворенням моноцистронних ІРНК, і тільки гени тРНК і рРНК
зібрані в кластери, що нагадують оперони бактерій.
У прокаріотів крім оперонів виділяють цілі генні родини, представлені
декількома кластерами генів (оперонами). До них можна віднести ттп-оперони,
що включають гени рРНК. Так, у геномі Е. сої (кишкової палички) виявлено
генну родину із 7 кластерів, у кожному з яких тандемно розташовані гени 238,
165, 55 рРНК, а іноді й тРНК (див. рис. 2.1). У ВасіПиз subtilis i Mycobacterium
шБексиїозіз зафіксовано наявність подібних генних родин, які включають
відповідно 10 і 2 гтп-оперони. Гени транспортних РНК також дублюються. У
геномі Е. со/ї функціонує 36 генів, які кодують 46 видів тРНК. Генна родина
АТФ-зв'язувальних транспортерів містить 77 генів. Дублювання вказаних генів,
очевидно, дуже важливе для запобігання негативного впливу мутацій і
рекомбінацій на процес біосинтезу білка та метаболізм у цілому.
У молекулі ДНК у межах гена чи оперона розрізняють змістовий 1
матричний ланцюги. Змістовий ланцюг (кодогенний) має послідовність
нуклеотидів, що визначають набір амінокислот у відповідному білку.
Матричний ланцюг (некодогенний) - комплементарний змістовому ланцюгу --
слугує матрицею для синтезу інформаційної матричної РНК (ІРНК або тРНК).
Молекула ІРНК, що транскрибується на матричному ланцюгу ДНК, за набором
нуклеотидів повністю збігається з послідовністю змістового ланцюга за
невеликим винятком - у молекулу ІРНК замість тимідилових залишків
включаються уридилові.
 54
Нуклеотидні послідовності гена можна умовно поділити на декілька
різних за функціями ділянок - регуляторні та структурні (кодуючі). Структурна
частина гена, що власне і кодує відповідний білок, оточена регуляторними
елементами. До регуляторних елементів генів належать промоторна ma
термінаторна зони (рис. 4.3). Промоторна зона дуже важлива для ініціації
транскрипції та подальшої трансляції, термінаторна зона необхідна для
припинення цих процесів. Таким чином, завдяки функціонуванню регуляторних
зон відбувається увімкнення та вимкнення генів, тобто регуляція експресії генів і
реалізація генетичної інформації. Формування оперонів у прокаріотів, імовірно,
пов'язане з | малими розмірами та ощадністю генома. Те, що в оперонах усі
структурні гени перебувають під контролем загальних промотора та термінатора,
дозволяє клітині заощаджувати внутрішньоклітинний простір і не витрачати
енергію на синтез зайвих послідовностей. Зауважимо, що і в поодиноких генах
бактерій, i B оперонах регуляторні елементи представлені подібними
нуклеотидними послідовностями. Як показали дослідження декількох сотень
бактеріальних генів та оперонів, промоторна й термінаторна зони складаються з
декількох ділянок, що виконують різні функції. Причому в різних
мікроорганізмів зафіксовано високий ступінь гомології певних нуклеотидних
послідовностей промотора й термінатора.
Розглянемо детальніше структуру регуляторних елементів генів прокаріотів
на прикладі добре вивченого лактозного оперона кишкової палички (рис. 4.3).
Промоторна зона Кодуюча частина оперона Термінаторна зона
Структурні гени

І 2 3
Промо Центр зв'я- Ген бета- Ген Ген транс- ГЦ-паліндром,
- тор зування з галактози- пермеази ацетилази TA-30Ha
рибосомою, дази

Рамка транскрипції
EUs ОДНО
Рис. 4.3. Будова лактозного оперона E. coli
Для позначення місць локалізації тих чи інших послідовностей у рамках
гена (або оперона) застосовують таку систему: стартову точку транскрипції
позначають як 41. Усі нуклеотиди, що йдуть за нею праворуч (по ходу
транскрипції), позначають +2, +3, +4 і т.д. І навпаки, нуклеотиди, розміщені в
ДНК зліва від стартової точки (проти ходу транскрипції), позначають знаком
«-», асаме - 1, -2, -3 тощо.
Як бачимо на рис. 4.3, промоторна зона лактозного оперона складається з
промотора й оператора, ділянки яких частково можуть перекриватися, центру
зв'язування з рибосомою та ініціювального (стартового) кодону. Розглянемо ці
регуляторні елементи та їх розташування в межах оперона.
Промотор (Р) - це регуляторна ділянка гена (або оперона), до якої
приєднується РІНК-полімераза (головний фермент транскрипції) перед початком
 55

синтезу ІРНК. У нуклеотидній послідовності промотора є дві консервативні

ділянки (так звані консенсусні зони): ТТГАЦА і ТАТААТ. Їх нуклеотидний набір
був установлений завдяки усередненню якісного складу нуклеотидів багатьох
бактеріальних промоторів. Причому такий самий склад нуклеотидів практично не
зустрічається в жодного мікроорганізму. Проте штучно синтезовані промотори, а
саме їх консенсусні ділянки ТТГАЦА 1 ТАТААТ, вбудовані у вектори разом із
певними генами, забезпечували значно більшу ефективність транскрипції, ніж
природні промотори.
ТТГАЦА - блок Гілберта. Умовний центр цієї послідовності
розташований на ДНК у положенні -35, зліва відносно стартової точки
транскрипції. Це зона впізнавання РНК-полімеразою місця приєднання до ДНК
перед початком транскрипції.
ТАТААТ - блок ШПрибнова. Умовний центр даної послідовності
розташований на ДНК ближче до стартової точки транскрипції - у положенні -10.
Ця ділянка призначена для збирання РНК-полімерази.
Штучно синтезовані блоки Гілберта та Прибнова використовують у генній
інженерії під час конструювання векторів і вбудовування в них генів. Тому вони
можуть бути маркерами розпізнавання трансгенних організмів.
Оператор (О) - це регуляторна ділянка гена (чи оперона), розташована
відразу за промотором по ходу транскрипції та призначена для приєднання білка-
регулятора. Дуже часто нуклеотидні послідовності промотора та оператора
частково перекриваються. Саме тому заблокований білком-регулятором оператор
не дає можливості РНК-полімеразі приєднатися до промотора.
Білок-регулятор (В), зв'язуючись із ДНК в області оператора, може
блокувати або активувати процес транскрипції, а саме впливає на збирання
РНК-полімерази та її рух по матричному ланцюгу ДНК. Ген, що кодує синтез
білка-регулятора, може знаходитися біля гена (оперона) або на великій відстані
від нього. Іноді ген білка-регулятора розташований усередині самого оперона
серед структурних генів і навіть кодує синтез певного ферменту. Це явище
спостерігається при аутогенному контролі транскрипції. Більше того, один білок-
регулятор може регулювати роботу декількох генів або оперонів. Таку систему
генів називають регулоном.
Центр зв'язування з рибосомою (СВ) призначений для кодування лідерної
послідовності на 5/-кінці РНК. СВ-ділянка ДНК, на відміну від зон промотора та
оператора, вже кодуюча і може містити декілька десятків нуклеотидів.
Транскрипція починається саме з цієї зони, як правило, - з аденіну в
послідовності ЦАТ. До складу СВ-ділянки входить консервативна нуклеотидна
послідовність, що зустрічається у промоторних зонах багатьох бактерій, -
ЗУАГГАГГ З -- послідовність Шайна - Дальгарно.
Під час транскрипції РНК-полімераза синтезує на матриці СК-ділянки
лідерну послідовність ІРНК, що бере участь у наступному етапі експресії генів -
трансляції, зокрема в її ініціації. Розглянемо детальніше цей процес. У складі 165
РНК рибосоми (у меншій субчастинці) є послідовність 3 УЦЦУЦЦ 5,
комплементарна послідовності Шайна - Дальгарно - 5" АГГАГГ 3". Завдяки цьому
 56

iPHK ta 16S PHK рибосоми з'єднуються комплементарними ділянками. Це

важливо для ініціації трансляції, а саме для фіксації ІРНК у меншій субчастинці
рибосоми. Можливо, що лідерну послідовність ІРНК після закінчення ініціації в
рибосомі відрізають спеціальні ферменти і в подальшому вона участі в трансляції
не бере. У разі ж синтезу позаклітинних ферментів лідерна послідовність ІРНК
транслюється в лідерну послідовність білка, яка бере участь в екскреції білків-
ферментів поза межами клітини.
Ініціювальний кодон (ІС) - АТГ міститься на ДНК за СВ-ділянкою та
кодує на ІРНК триплет ДУГ. Саме з цього кодону відкривається «рамка»
трансляції, тобто розпочинається синтез поліпептиду. АУГ у складі молекули
ІРНК на рибосомах кодує першу амінокислоту білка - формілметіонін (в
еукаріотів - метіонін). У деяких мікроорганізмів замість АУГ ініціювальним
кодоном може бути ГУГ, що кодує амінокислоту валін.
Зона структурних генів розташована відразу за ініціювальним кодоном і
містить нуклеотидні послідовності генів, що кодують певні ферменти. У
поодиноких генах між промоторною і термінаторною зонами розміщена
послідовність ДНК, що кодує лише один поліпептид, в оперонах містяться групи
послідовностей, які відповідають за синтез декількох білків. Для того щоб білкові
продукти цих генів у процесі трансляції на рибосомах могли розділитися на
окремі білкові молекули ферментів, між структурними генами можуть бути
додаткові послідовності Шайна - Дальгарно.
У лактозному опероні кишкової палички зібрані у групу 3 структурні гени,
що кодують ферменти послідовних реакцій катаболізму лактози. Перший ген Іас/
кодує фермент В-галактозидазу, що розщеплює дисахарид лактозу на два
мономери - глюкозу та галактозу. Другий ген лактозного оперона ІасУ під час
транскрипції визначає послідовність В-галактозидпермеази - транспортного
ферменту, що здійснює перенесення галактози в середину клітини. Третій ген
lacA кодує фермент трансацетилазу, що залучає галактозу в подальший
метаболізм, а саме цей фермент переносить ацетильну групу від ацетил-СодА до
В-галактозидів.
Термінаторна зона гена (або оперона) розташована відразу за зоною
структурних генів 1 відіграє важливу роль у завершенні процесів транскрипції та
трансляції. Вона містить декілька регуляторних елементів, що розрізняються за
своїми функціями: термінуючий кодон (ТС) і термінатор, який складається з
двох основних блоків - Р) (ГЦ-паліндрома) і ділянки - ТА-зони, що здебільшого
представлена парами тимідилових 1 аденілових залишків.
Термінуючий кодон (ТС) - своєрідний сигнал для закінчення трансляції на
рибосомах. На змістовому ланцюгу ДНК він зазвичай представлений такими
триплетами, як ТАА, ТАГ, ТГА, на ЇРНК - УАДА, УАГ, УГА. Їх ще називають
стоп-кодонами або нонсенс-кодонами, оскільки вони не кодують жодної
амінокислоти. Тому процес трансляції на рибосомах на термінуючому кодоні
припиняється і синтез поліпептиду закінчується.
ГЦ-паліндром (РР) - наступна за термінуючим кодоном зона термінатора,
яка відіграє основну роль у гальмуванні процесу транскрипції. ГЦ-паліндром -- це
 57

ділянка ДНК, яка складається переважно з ГЦ- ї ЦГ-пар і утворює своєрідну

вторинну структуру у вигляді хреста. У паліндромі наявна умовна вісь симетрії,
відносно якої у транс-положеннях розміщені інвертовані послідовності, тобто
повернуті на 1807. Тому в паліндромах може формуватися комплементарність як
за горизонталлю (між двома ланцюгами), так і за вертикаллю (між сусідніми
ділянками одного ланцюга). Завдяки цьому на одноланцюгових ДНК і РНК
з'являються шпильки, а на дволанцюгових ДНК - хрестоподібні структури. На
верхівках шпильок кожного ланцюга нуклеотиди можуть не коплементуватися
між собою, тому мають вигляд роздутих кульок.
Саме ГЦ-паліндром у складі термінатора обумовлює уповільнення руху
РНК-полімерази і гальмує транскрипцію. Це пов'язано з тим, що для забезпечення
транскрипції даної ділянки РНК-полімераза повинна спочатку розрівняти
шпильку на матричному ланцюгу ДНК, на що витрачається додаткова енергія. У
результаті різко зменшується швидкість синтезу ІРНК і послаблюється зв'язок
РНК-полімерази з матричним ланцюгом.
ТА-зона термінатора розташована за ГЦ-паліндромом. У цій ділянці ДНК
багаторазово повторюються ТА-пари нуклеотидів, а точніше, у змістовому
ланцюгу ДНК повторюються тимідилові, а в матричному - аденілові нуклеотидні
залишки. На матричному ланцюгу ТА-зони ДНК під час завершення транскрипції
РНК-полімераза синтезує кінцевий фрагмент ІРНК - так званий «уридиловий
хвіст», що складається з уридилових залишків. Між аденіловими залишками
матричної ДНК і комплементарними уридиловими залишками щойно
синтезованої ІРНК формується тільки по два водневі зв'язки, на відміну від
ГЦ-пар, з'єднаних трьома водневими зв'язками. Тому в ТА-зоні термінатора
ІРНК легко звільняється від ДНК-матриці.
У бактерій зустрічаються два основні типи термінаторів - р-залежні (ро-
залежні) і р-незалежні, які ще називають ВПо-залежними їі ВРро-незалежними.
Вони відрізняються, по-перше, участю в процесі термінації специфічного р-білка,
а по-друге, структурою відповідних термінаторів. Зазвичай у р-незалежних
термінаторах ТА-зона достатньо протяжна. У р-залежних термінаторах основну
функцію в термінації (закінченні) транскрипції виконує р-білок. Цей білок «сідає»
на 5-кінець ІРНК, рухається вздовж неї, наздоганяє РНК-полімеразу та після
подолання перепони у вигляді ГЦ-паліндрома збиває РНК-полімеразу з
матричного ланцюга ДНК. Тому ТА-зона в р-залежних термінаторах може бути
відсутня або слабко виражена.
Експресія генів у прокаріотів реалізується шляхом транскрипції та
трансляції, як і в усіх живих істот. Проте через відсутність у прокаріотів типового
ядра ці процеси, на відміну від еукаріотів, спряжені й відбуваються практично
одночасно. На одному з ланцюгів ДНК бактеріальної хромосоми (матричному) у
межах певного гена відбувається синтез нуклеотидної послідовності
інформаційної РНК - транскрипція. Як тільки 5/'-кінець ІРНК починає відділятися
від матриці ДНК, то потрапляє до полісоми - комплексу, що складається
приблизно із 10 рибосом, розташованих на цитоплазматичній мембрані, де відразу
розпочинається трансляція - синтез поліпептидного ланцюга на матриці ІРНК.
 58

Білковий продукт з'являється в клітині вже через 2,5-3 хв після початку

транскрипції. Така висока швидкість експресії генів забезпечує одноклітинним
прокаріотам надзвичайно ефективну адаптацію до умов навколишнього
середовища.
Регуляція експресії генів здійснюється під час транскрипції та трансляції.
На рівні транскрипції регуляція увімкнення генів відбувається за допомогою
таких механізмів, як негативний і позитивний контроль, індукція та репресія,
аутогенний контроль, катаболітна репресія. У деяких бактерій під час
трансляції на рибосомах запускається механізм регуляції, заснований на
утворенні альтернативних шпильок на іРНК - атенуація.
Передавання генетичної інформації у прокаріотів відбувається як
вертикально (від материнської клітини до дочірньої), так і горизонтально (між
клітинами | одного | виду, різних видів, родів, родин) за допомогою
рекомбінативних процесів - кон'югації, трансформації, трансдукції, сексдукції,
трансфекції, транспозиції. ШГоризонтально можуть передаватися мобільні
генетичні елементи - плазміди, транспозони, віруси та мобілізовані ними
фрагменти хромосомної ДНК. Для прокаріотів, крім хромосомного, характерний
ще плазмідний геном. У клітині може бути від декількох одиниць до декількох
сотень плазмід.
Плазміди - це дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, які мають додаткові
гени: гени стійкості до токсинів, антибіотиків, сульфаніламідів, важких металів,
нафтопродуктів, нафталіну, камфори, а також гени синтезу токсинів,
антибіотиків, гемолізинів та інших факторів патогенності. Гени факторів
патогенності зазвичай зібрані в особливі кластери (групи), які називають
островами патогенності. За допомогою плазмід, фагів 1 транспозонів острови
патогенності та інші геномні острови (Сепоте ізіапаб) можуть переноситись між
клітинами горизонтально не тільки в межах виду, але й між представниками
різних родів і родин.
У 70-х рр. минулого століття в бактерій виявили транспозони -- мобільні
генетичні елементи (так звані «стрибаючі» гени), здатні переміщуватись з одного
сайта генома в інший, наприклад, із однієї ділянки хромосоми в іншу, із
хромосоми в плазміду, фагову ДНК і навпаки. Детальніше мобільні генетичні
елементи будуть розглянуті пізніше.
На завершення слід зауважити, що, незважаючи на одноклітинність,
прокаріоти мають доволі складну будову клітини та генетичного апарату.
Розділ 5. ГЕНОМИ ЕУКАРІОТІВ
Геноми еукаріотів мають складнішу будову, ніж прокаріоти. До складу
генома еукаріотичного організму входять нуклеотидні послідовності хромосом,
ДНК мітохондрій (1-10 Уб від загального об'єму генома), пластид (у рослин), ДНК
плазмід (у дріжджів - до 20 90 генома), ДНК латентних і дефектних вірусів.
Геноми еукаріотичних організмів різних систематичних груп суттєво
відрізняються між собою як за загальною кількістю нуклеотидів, так і за кількістю
 59

пар хромосом. Нижче подано геноми різних еукаріотичних організмів, визначені

за кількістю пар нуклеотидів (табл. 5.1).
Таблиця 5.1
Розміри геномів еукаріотичних організмів за кількістю пар нуклеотидів
Група організмів Кількість п. н. Група організмів Кількість п. н.
Гриби 47-10" Риби костисті 14-10"
Рослини голонасінні 1,6. 10! Амфібії 2,7-3,6: 101"
Рослини покритонасінні 22-10" Рептилії 1,5 10"
Лілейні 1,810" Птахи 12:10"
Комахи 23-10" Ссавці 26-10"
Молюски 1,6: 10° Людина 3,75 10°
Від об'єму генома і відповідно кількості генів залежить ступінь складності
певного організму, рівень і характер проявів життєдіяльності. Але є і винятки.
Особливо це стосується такого показника, як кількість пар хромосом у клітинах.
Так, у деяких найпростіших організмів (наприклад, радіолярій), клітини яких
мають досить примітивну організацію, кількість пар хромосом значно більша,
ніж у комах, риб, ссавців і рослин (табл. 5.2). Заслуговує на увагу той факт, що
навіть у представників однієї родини рослин - сливи і черешні - кількість пар
хромосом значно відрізняється (відповідно 24 і 3). Очевидно, складність генома
залежить не тільки від Кількості хромосом, а ще 1 від їх генної ємності.

Таблиця 5.2
Кількість пар хромосом (п) у геномах різних організмів
Рослинний організм Кількість пар Тваринний організм Кількість пар
хромосом, п хромосом, п
Нейроспора 7 Радіолярія 300
Хламідомонада 16 Малярійний плазмодій 1
Кукурудза 10 Кімнатна муха 6
Жито 7 Дрозофіла 4
Пшениця 21 Окунь 14
Горох y Миша 20
Картопля 24 Щур 21
Черешня 8 Шимпанзе 24
Слива 24 Людина 23
Особливу увагу вчених привертає геном людини. Він містить 60-80 тис.
генів, що визначають наш зовнішній вигляд і внутрішню будову. Весь геном
розміщений у 23 парах хромосом. Хромосоми нумерують у порядку зменшення їх
розміру від найбільшої (1-ї) до найменшої (22-ї) пари. Проте з цього ряду
«випадають» статеві хромосоми: у жінок дві великі Х-хромосоми, а в чоловіків -
одна Х- 1 одна маленька У-хромосома. За своїм розміром Х-хромосома
знаходиться між 7-ю та 8-ю хромосомами, а У-хромосома - найменша в геномі.
У геномі людини нараховують 3,75 : 10" пар нуклеотидів. Геноми інших
ссавців дещо розрізняються, але мають схожі значення молекулярної маси
хромосом, що сягають сотень мільярдів Да (дальтон). Відповідно до розміру
генома в людини мало б бути понад 150 тис. генів, однак у 2003 р. американські
 60

вчені, які брали участь у проекті «Геном людини», заявили про ідентифікацію
приблизно 30 тис. генів. В останні роки припускають наявність у людини 75 тис.
генів. Очевидно, решта геномної ДНК - «генетичне сміття».
5.1. Генетичний апарат еукаріотів
Генетичний апарат еукаріотів представлений, перш за все, хромосомами,
розташованими в ядрі, а також позахромосомними елементами генома - ДНК
мітохондрій і пластид, вірусів та інших мобільних генетичних елементів.
Ядро у клітинах еукаріотів чітко сформоване, оточене ядерною
мембраною. Хромосом, як правило, більше 2, вони розташовані парами,
складаються з гомологічних хроматид. Кожна з хроматид представлена
дволанцюговою молекулою ДНК. Тобто набір хромосом диплоїдний. Хромосома
за хімічною природою є нуклеопротеїд, який на 50 Зо складається з ДНК і на 50 У
— 13 білків. ДНК в основному знаходиться в ядрі й лише 1-10 90 її міститься у
мітохондріях і хлоропластах (у рослин). У дріжджів до 20 У генома може
становити мітохондріальна ДНК. Білки у складі хромосом представлені
основними гістоновими білками, що входять до складу нуклеосом, і кислими
білками, які заповнюють внутрішню порожнину нуклеосом. Негістонові кислі
білки взаємодіють із кгістоновими білками, шляхом ацетилювання та
фосфорилювання гістонів розпушують нуклеосоми 1 відіграють важливу роль в їх
дисоціації перед початком транскрипції та реплікації.
У релаксованому стані хромосоми еукаріотів можуть досягати в довжину
декількох сантиметрів (у людини до 5 см), а на стадії метафази мітозу вони
скорочуються до 5 мкм. У процесі життєдіяльності організму в клітинному циклі
відбувається чергування стадій конденсації та деконденсації хромосом. В
інтерфазі хромосомна ДНК має вигляд видовжених сплутаних ниток --
хроматину. Це дуже важливо, оскільки саме в інтерфазі відбуваються
транскрипція та реплікація (подвоєння ДНК). Для ефективного проходження цих
процесів хромосомна ДНК має бути частково релаксована. Коли клітина вступає у
стадію поділу, для нормального розходження хромосом (сегрегації) під час мітозу
хромосомна ДНК має бути суперспіралізованою, тобто конденсованою. Тому на
початку мітозу (уже на стадії профази) хроматин починає компактизуватися за
допомогою позитивної та негативної суперспіралізації і шляхом накручування на
спеціальні білкові частинки нуклеосоми. Нуклеосомна будова хромосом -
характерна особливість хромосом еукаріотів.
Нуклеосома являє собою октомер із 3 субодиниць основних білків-гістонів і
містить по 2 молекули гістонів Н2А, Н2В, Н3 1 НА. Діаметр нуклеосоми - 1Ї нм,
висота - 5,7 нм. На нуклеосоми намотується хромосомна ДНК довжиною 146 п.н.
По краях від нуклеосом є вільні ділянки ДНК довжиною у 20- 90 пар нуклеотидів
- лінкери. Гістон НІ не входить до складу нуклеосоми, а бере участь у фіксації
лінкерів, утримуючи ДНК на нуклеосомі. Він має своєрідну будову, а саме від
його основної глобулярної частини відходять видовжені М- і С-кінці. Завдяки
глобулярній частині молекули гістон НІ приєднується до поверхні нуклеосоми, а
 61

видовжені кінці з одного боку прикріплюються до лінкерної ДНК, а з іншого - до

лінкера біля гістонового ядра сусідньої нуклеосоми.
Нуклеосомна будова хромосом характерна тільки для лінійних хромосом
еукаріотів. У результаті суперспіралізації та накручування на нуклеосоми
хромосомні нитки укорочуються і перетворюються на метафазні хромосоми (на
стадії метафази мітозу). Завдяки цьому їх довжина зменшується в 10000 раз, а
діаметр збільшується приблизно в 700 раз. Це сприяє нормальній сегрегації
хромосом в анафазі мітозу. За допомогою рентгеноструктурного аналізу було
виявлено особливості компактизації ДНК. Розглянемо детальніше стадії
конденсації еукаріотичних хромосом (рис. 5.1).
2 HM 11 uM 300 нм
= Петельні домени
=

5 Соленоїд
змо 1400 нм
6 é te. С
ин
В Конденсована
а хромосома
д

Метафазна
хромосома
е

Рис. 5.1. Стадії компактизації еукаріотичних хромосом

1-ша стадія (рис. 5.1, а) - дволанцюгова спіраль ДНК із діаметром 2 нм,
зазвичай має правозакручену В-форму. У такій молекулі один виток спіралі
містить приблизно 10,5 пар нуклеотидів. Дана структурна форма ДНК найбільш
«зручна» для «розплітання» молекули перед початком транскрипції та реплікації.
2-га стадія (рис. 5.1, б) - нуклеосомна нитка (діаметр - 11 нм). Вона
формується шляхом намотування ДНК на нуклеосомні частинки, утворюючи на
них 1,75 витку, що містять 146 пар нуклеотидів. Нуклеосомна нитка ДНК нагадує
намисто, в якому сама нитка (суперспіралізована молекула ДНК) намотана на
«намистини» (нуклеосоми).
Нижче зображено процес утворення нуклеосомної нитки за участю білків-
гістонів і з'єднання гістоном НІ лінкерних ділянок ДНК (рис. 5.2).
 62

Нитка ДНК

Нуклеосома містить
5 молекул гістонів:
по дві молекули Н2а,
H2s, H3, H4

Гістон НІ

Нитка ДНК ее

Рис. 5.2. Компактизація еукаріотичної хромосоми на стадії

утворення нуклеосомної нитки
3-тя стадія (рис. 5.1, 6) - хроматинова фібрила з діаметром 30 нм. Для
утворення такої структури нуклеосоми зближуються одна з одною завдяки
стягуванню гістоном НІ. У результаті формується зигзагоподібна «стрічка», у якій
нуклеосоми дуже зближені між собою. Вона, у свою чергу, скручується в
соленоїд -- спіраль із порожниною всередині.
4-та стадія (рис. 5.1, г) - структура, що являє собою серію петельних
доменів (діаметр 300 нм). Формується шляхом утворення петель із нитки
соленоїда. Кожен петельний домен додатково спіралізується з утворенням
окремого нуклеомера. Очевидно, нуклеомер є самостійна функціональна одиниця
і містить послідовності ДНК, які кодують одну або декілька РНК. Декілька
нуклеомерів компактизуються, формуючи розетку - хромомер - характерну
структуру для метафазної хромосоми.
5-та стадія (рис. 5.1, д) - конденсована хромосома (діаметр 700 нм).
Імовірно, утворюється шляхом формування соленоїда другого порядку з
суперспіралізованої хроматинової нитки з вираженими хромомерами. У такий
спосіб відбувається формування хроматиди.
6-та стадія (рис. 5.1, е) - метафазні хромосоми. Дві суперспіралізовані
хроматиди, зчеплені в області центромер, утворюють типові еукаріотичні
хромосоми, які на стадії метафази мітозу мають вигляд «лампових щіток». Їх
діаметр дорівнює 1400-2000 нм.

5.2. Надмірність геномів еукаріотів. Типи нуклеотидних послідовностей

У більшості еукаріотичних організмів майже всіх відомих систематичних
груп, від одноклітинних дріжджів до ссавців, виявлено надмірність геномів.
Тільки незначна частина ДНК у хромосомах кодуюча |і представлена
структурними й регуляторними генами, які часто розділені довгими незначущими
послідовностями - спейсерами. Решта генома (50-95 %) складається 3
«егоїстичної» (або сателітної) ДНК, що, імовірно, потрапила в геном еукаріотів
шляхом інтеграції фрагментів вірусної ДНК та інших мобільних генетичних
 63

елементів. Не виключена можливість дуплікацій певних фрагментів ДНК у

результаті транспозицій, помилок під час реплікації, репарації.
Значна | частина | генома | людини представлена | некодуючими
послідовностями, які можуть складати, за деякими даними, майже до 97 б, тобто
характерна надлишковість генома.
У геномах еукаріотів виділяють різні типи послідовностей ДНК, що
відрізняються частотою повтору:
1) багаторазово повторювані послідовності - понад 10? повторів на
геном. Як правило, це блоки з 5 - 8 нуклеотидів, що тандемно повторюються й
утворюють фрагменти довжиною 150-500 пар нуклеотидів, наприклад,
(ААТАТУзолос. Тобто така комбінація з п'яти нуклеотидів повторюється 30-100
раз 1 утворює послідовність ДНК (150-500 п.н.), яка в геномі може зустрічатися
понад 100000 раз. Функції таких повторів остаточно не встановлено, але існує
припущення, що вони можуть відігравати певну роль у регуляції роботи генів.
Найчастіше за все їх виявляють у ділянках центромер, теломер, інтронів,
транспозонів. До таких повторів ДНК відносять послідовності Ай, ВІ, В2, І.І.
Серед багаторазово повторюваних послідовностей дуже часто зустрічаються
сайти рестрикції у складі паліндромів (див. розділ «Репарації»). Сайти рестрикції
можуть бути тими «гарячими точками» на ДНК, куди вбудовуються плазміди,
транспозони, вірусні ДНК, трансгени;
2) помірно повторювані послідовності - від 10 до 10? повторів на геном.
До них відносять послідовності, що кодують гістони, рибосомальні білки, рРНК і
тРНК, І5-елементи (вставні послідовності). На довгому плечі 1-ї хромосоми
людини поруч із центромерами є численні повтори з 120 нуклеотидів (відділені
один від одного випадковими нуклеотидними послідовностями), які кодують
55 РНК, шо входить до складу рибосоми;
3) мультигенні родини - це групи близьких за структурою та функціями
генів, що, очевидно, утворилися в результаті дуплікацій і мутацій певного
вихідного гена. Наприклад, В-ланцюг гемоглобіну кодують 7 генів, 2 із яких
дефектні (псевдогени), а інші 5 вмикаються послідовно на різних етапах
онтогенезу: у ранньому ембріогенезі, у плодному періоді, у дитячому, юнацькому
та зрілому віці. У даній мультигенній родині гени розташовані на відстані 10 кб
(кілобаз), тобто 10000 пар нуклеотидів. Генна родина із 3 генів кодує білок
курячого яйця - овальбумін. Антигени головного комплексу гістосумісності в
мишей кодують 25-35 генів, що являють собою родину генів, розділених
некодуючою ДНК у 5-15 кб. Інші мультигенні родини, у яких гени представлені
сотнями копій, характерні для рРНК, тРНК і білків-гістонів;
4) унікальні гени - специфічні гени, що кодують синтез певних
структурних 1 ферментних білків.
Деякі дослідники розподіляють унікальні гени на дві групи:
- унікальні гени зі спеціалізованими функціями (тканиноспецифічні
гени), які експресуються тільки в певних диференційованих клітинах 3
утворенням мажорного продукту - білка в одній або декількох копіях;
 64

-унікальні гени (повторювані декілька раз), які виконують загальні функції,

активні в більшості клітин і експресуються слабше, ніж тканиноспецифічні гени.
Залежно від структури та функцій нуклеотидні послідовності можуть бути
декількох типів: 1) структурні гени; 2) регуляторні гени; 3) регуляторні послідовності
ДНК, що регулюють активність генів; 4) сателітна ДНК; 5) спейсерна ДНК; 6) групи
(кластери) генів; 7) повторювані гени; 8) кластер-гени.
Структурні гени несуть інформацію про структуру певних білків. На цих
ділянках ДНК транскрибується ІРНК, яка в разі потрапляння на рибосоми
транслюється у відповідну поліпептидну послідовність.
Регуляторні гени кодують синтез білків-регуляторів, здатних зв'язуватись із
оператором структурного гена й регулювати його активність. Таким чином,
регуляторні гени контролюють і регулюють процес біосинтезу білка.
Регуляторні послідовності ДНК - некодуючі ділянки ДНК, що не мають
структури гена, але, зв'язуючись із промотором певного структурного гена через
білки-посередники, регулюють його активність. До таких послідовностей відносять
енхансери 1 сайленсери, які відповідно посилюють або пригнічують транскрипцію
генів, а також інсулятори, що регулюють дію енхансерів і сайленсерів.
Сателітна ДНК (некодуючі послідовності) містить велику кількість
повторюваних груп нуклеотидів, що не транскрибуються. Наприклад, послідовність
ААТАТ може повторюватись 30-100 раз. Серед величезних фрагментів сателітної
ДНК інколи зустрічаються поодинокі регуляторні гени.
Групи (кластери) генів - це групи різних структурних генів у певній ділянці
хромосоми, об'єднані загальними функціями. Наприклад, кластери п'ятьох різних
гістонів повторюються 10-20 раз.
Спейсерні ділянки -- великі некодуючі фрагменти ДНК, що відокремлюють
кластери генів один від одного. Їх роль до кінця не з'ясовано.
Повторювані гени - послідовності, у яких один і той же ген багаторазово
повторюється (декілька сотень раз), причому гени невідокремлені один від одного.
Прикладом повторюваних генів є своєрідні генні тандеми, що кодують рРНК 1 тРНК.
Кластер-гени - опероноподібні структури, що кодують довгі поліпептиди
із декількома каталітичними активностями. Кожен фрагмент кластер-гена,
очевидно, кодує окремий домен білка з певною ферментативною активністю.
5.3. Структура генів еукаріотів
Гени еукаріотів, як правило, поодинокі й не зібрані в оперони, як у
прокаріотів, хоча зустрічаються опероноподібні структури - кластер-гени.
Установлення структури генів еукаріотів - одне із головних відкриттів кінця
ХХ ст. Доведено, що структурний ген, який кодує білок, має дуже складну будову.
Одним із найбільш вивчених генів еукаріотів є ген В-ланцюга гемоглобіну. Проте в
генів різних організмів і навіть у різних генів одного організму було виявлено певні
відмінності щодо будови регуляторних ділянок, тому далі надамо узагальнену
 65

схему будови еукаріотичного гена, де відображено ті структурні елементи, що є

універсальні та найчастіше зустрічаються.
Для забезпечення функціонування генів їх кодуюча структурна частина з
обох боків оточена регуляторними елементами подібно до прокаріотів. До них
відносять промоторну й термінаторну зони. Регуляторні елементи генів дуже
важливі для реалізації їх експресії, оскільки саме завдяки їм гени «вмикаються»
тільки тоді, коли є необхідність у відповідних білкових продуктах. На початку
гена розташована промоторна зона, що забезпечує початок транскрипції та
трансляції, а на кінці гена - термінаторна зона, яка відповідає за їх закінчення.
У промоторній зоні гена можна виділити такі консервативні послідовності:
ГЦ-мотив, ЦААТ, ТАТА, АГГАГ, ініціювальний кодон АТГ (на РНК
відповідно АУГ). Далі розташована структурна частина гена, що складається з
кодуючих ділянок екзонів та некодуючих інтронів. За структурною частиною
гена розміщена зона термінатора, представлена термінуючим кодоном (ТТА, ТАГ
або ТГА) і власне термінатором. Нижче на схемі зображено основні ділянки гена
еукаріотів (рис. 5.3).

Промоторна зона Кодуюча зона Термінаторна зона

Структурна частина гена
ГЦ- |ЦААТ ТАТА |АГГАГ | ATT Ex- | In- Ex- | In- Ex- | TAA, Термі-
мо- зон | трон | зон | трон |зон | ТАГ, натор
_THB TTA
Па- Центр Центр | Центр Ініцію- Унікальна Термі- Специ-
лін- розпізна | зв'язу- | зв'язу- валь- послідовність нуклеотидів, | нуючий | фічна
дром | -вання вання з | вання з | ний що кодує певний білок кодон послідов-
для РНК- рибосо- | кодон ність
РНК-по- | поліме | мою
лімерази | -разою
Рис. 5.3. Структура еукаріотичного гена

Далі надано характеристику будови та функцій основних регуляторних

ділянок генів еукаріотів (рис. 5.3).
ГЦ-мотив - один із найпоширеніших регуляторних елементів генів
еукаріотів. Представлений паліндромом ГГЦІТГ / ЦЦЦГЦЦ, зустрічається в
промоторних ділянках генів загальних клітинних функцій, тобто в тих генах, які
експресуються у всіх клітинах організму й відіграють важливу роль в їх
життєзабезпеченні. Припускають, що ЛГДЦ-мотив у промоторній зоні може
повторюватися декілька раз і утворювати зону у 200-300 пар нуклеотидів. У
деяких генах декілька повторів ГЦ-мотиву можуть функціонально замінювати
відсутні | ТАТА-бокс 1 (ЦУЦААТ-бокс, наприклад, у гені гіпоксантин-
фосфорибозилтрансферази. Приєднання до ГДЦ-мотиву білка-регулятора SP/
збільшує швидкість транскрипції в 10-25 раз. Тому не виключено, що ця ділянка
може виконувати функцію оператора транскрипції.
ЦААТ (або ЦЦААТ) -- ділянка 0 промотора дм для розпізнавання
РНК-полімеразою промоторної зони гена перед початком транскрипції. Ця
послідовність розташована в промоторній зоні гена в положеннях -80—(-50)
відносно сайта ініціації транскрипції. Імовірно, вона виконує функцію, подібну до
 66

тої, що встановлена для блоку Гілберта (ТТГАЦА) у прокаріотів. В еукаріотичних

організмах ЦААТ наявна у тканиноспецифічних генах, а саме тих, що
експресуються тільки в певних тканинах і органах на різних стадіях онтогенезу,
наприклад, у генах глобінів (тиреоглобуліну, альфа-актину скелетних м'язів
та ін). Промоторна ділянка між ЦААТ-боксом і сайтом ініціації транскрипції
містить значну кількість інвертованих повторів, що потенційно можуть
утворювати стійкі шпилькоподібні структури, які, очевидно, відіграють важливу
роль в ініціації транскрипції. Точкові мутації в ЦААТ-боксі зазвичай пригнічують
активність промотора, але іноді, навпаки, стимулюють транскрипцію.
Блок Голдберга - Хогнеса - ТАТА (або довші послідовності ТАТАААА,
ТАТААТА) - подібний до блоку Прибнова (ТАТААТ) у прокаріотів, слугує для
приєднання РНК-полімерази до ДНК у промоторній зоні. Умовний центр блоку
Голдберга - Хогнеса міститься в гені в положенні -30 відносно стартової точки
початку транскрипції. Установлено, що РНК-полімераза приєднується до цієї
послідовності так, що її активний центр опиняється над першим нуклеотидом, який
зчитується. Комбінація нуклеотидів у даній зоні промотора специфічна 1 в разі
порушення рамки зчитування утворює «стоп»-кодони, що призводить до
припинення транскрипції.
КЕП-послідовність ТТГЦТТАЦ розташована наприкінці промотора і містить
сайт ініціації транскрипції ТАЦ, на якому починає утворюватись 5'-початкова
ділянка РНК, тобто розпочинається транскрипція.
Центр зв'язування з рибосомою -- послідовність (50 п.н.) промоторної зони
гена, розташована між сайтом ініціації транскрипції ТАДЦ і сайтом ініціації
трансляції АТГ, яка транскрибується слідом за сайтом ініціації. На ній
відбувається синтез лідерної послідовності ІРНК, що відіграє важливу роль на
етапі ініціації трансляції. У цій послідовності є консервативна ділянка, подібна до
послідовності Шайна - Дальгарно у прокаріотів (АГГАГГ), але редукована -
АГГАГ (див. функції послідовності Шайна - Дальгарно АГГАГГ у прокаріотів,
розділ «Геноми прокаріотів»).
Ініціювальний (стартовий) кодон представлений триплетом АТГ (АУГ --
на РНК). Він транскрибується у складі інформаційної РНК, під час трансляції на
рибосомах з нього розпочинається синтез поліпептиду. Кодон 4УГ кодує першу
амінокислоту пептиду метіонін. З метіоніну починається синтез більшості білків.
Іноді ініціювальним кодоном стає ГУГ, який кодує амінокислоту валін.
Структурна частина гена - це послідовність ДНК, що безпосередньо
кодує сам білок. В еукаріотів, на відміну від прокаріотів, вона складається із
кодуючих ділянок екзонів і некодуючих інтронів (вставних ділянок ДНК). У
процесі транскрипції структурна частина гена зчитується повністю з утворенням
недозрілої про-іРНК. Остання в процесі переміщення з ядра у цитоплазму зазнає
сплайсингу (тип процесингу), коли відбувається видалення некодуючих інтронів 1
зшивання екзонів. Детальніше процес сплайсингу описано далі.
Термінуючий кодон - триплет, який транскрибується на ІРНК і забезпечує
закінчення трансляції на рибосомах. На змістовому ланцюгу ДНК він може бути
представлений нонсенс-кодонами - триплетами ТАА, ТАГ, ТГА, на РНК їм
 67

відповідають УА4А, УАГ 1 УГА. Жодному з цих триплетів не відповідає жодна з

амінокислот, тому на них у рибосомі припиняється синтез поліпептида.
Термінаторна зона - регуляторна ділянка гена, на якій завершується
процес транскрипції. Поки що не виявлено універсальних послідовностей, які б
виконували цю функцію в різних генах. Можливо, у кожному гені вона
представлена специфічною нуклеотидною послідовністю. Так, у гені, що кодує
В-ланцюг гемоглобіну, після термінуючого кодону трансляції TAA
розташований трейлер 1 сайт поліаденілювання ААТААА, необхідний для приєднання
до ІРНК «хвоста» полі-А, який складається приблизно з 200-300 аденілових
залишків. Ця ділянка ДНК необхідна для припинення транскрипції. Послідовність
термінатора транскрипції починається відразу за полі-А ділянкою і складається
приблизно із 1000 нуклеотидів. Дана послідовність разом із полі-А зупиняє процес
транскрипції.
Регуляція експресії генів еукаріотів. Більшість учених, які вивчали
геноми еукаріотів, наголошують на дуже високому рівні складності систем
регуляції функцій і метаболізму в цілому. Крім перелічених вище регуляторних
елементів генів (компоненти промоторної та термінаторної зон), важливу роль у
регуляції експресії генів відіграють гормони, регуляторні білки, які можуть
включатися в регуляцію каскадно, і регуляторні ділянки ДНК. Так, у геномах
еукаріотів знайдено специфічні регуляторні послідовності, що можуть відігравати
роль енхансерів - підсилювачів транскрипції, а також послідовності, що
виконують функції сайленсерів - глушників транскрипції. Вони можуть
знаходитись як у межах, так і на значній відстані від гена, вмикання якого
регулюють. Їх зближення із певним геном, очевидно, відбувається за рахунок
зміни просторової структури ДНК і утворення петель. Цікаво, що одні й ті самі
послідовності в одній клітині | можуть бути енхансерами, а в іншій -
сайленсерами. У свою чергу регуляторами дії енхансерів і сайленсерів слугують
специфічні фактори - інсулятори, які теж регулюють експресію генів.
В еукаріотів виявлено також регуляторні білки (як 1 в прокаріотів), що
можуть зв'язуватись із промоторною зоною гена й забезпечувати або активацію,
або пригнічення транскрипції. Так, уже згадуваний регуляторний білок ЗРІ,
зв'язуючись із ГЦ-мотивом, може посилювати транскрипцію в 10-20 раз.
Останнім часом учені інтенсивно вивчають малі ядерні РНК (мяРНК).
Установлено, що серед них є специфічна група дволанцюгових коротких РНК (21
-28 п.н.), які беруть участь у регуляції роботи певних генів шляхом блокування їх
експресії. Такі регуляторні молекули отримали назву малих інтерферуючих РНК
(міРНК або 51ВМА). Детальніше механізми регуляції експресії генів еукаріотів
розглянуто у розділі 9.
 68

5.4. Особливості еукаріотичних генів

В останні роки у зв'язку з проведенням інтенсивних досліджень геномів
різних організмів було встановлено, що гени еукаріотів мають такі особливості:
- поодинокі і, на відміну від прокаріотів, не зібрані в оперони;
- іноді олігомерні, а саме представлені кластер-генами (опероноподібними
структурами);
- переривчасті, тобто розділені на інтрони та екзони;
- перекриваються: в межах однієї генної ділянки ДНК може функціонувати
декілька рамок зчитування.
Гени в ДНК розташовані у хромосомах у лінійному порядку. Кожен ген має
своє місце розташування (локус). Теломерні й центромерні ділянки хромосом не
містять генів. Гени вмикаються не синхронно, а під впливом регуляторних
факторів, коли виникає потреба у синтезі відповідних білків. Клітини функціонують
завдяки скоординованій дії генів. Так, у геномі людини у виконанні певних функцій
бере участь різна кількість генів: синтез РНК і білків - 22 Ус, обмін (метаболізм) -
17 %, клітинний поділ - 12 Уо, клітинні сигнали - 12 90, клітинні структури - 8 90,
захист клітини - 12 Ус. Проте одночасно активними можуть бути тільки 5-10 У
генів.
Результати генетичного аналізу в еукаріотів, зокрема їх найпростіших
представників - дріжджів і нейроспори, засвідчили, що гени, які контролюють
різні етапи одного шляху метаболізму, як правило, хаотично розкидані по геному
і зазвичай не утворюють скупчень подібно оперонам бактерій. Однак виявлено
декілька винятків: компактна ділянка ДНК у грибів роду нейроспора контролює 3
реакції в біосинтезі гістидину. Схожі результати одержано в процесі вивчення
генетичного контролю біосинтезу ароматичних амінокислот (триптофану,
тирозину, фенілаланіну), а також жирних кислот. У дослідників склалося
враження, що вони мають справу з опероноподібною структурою, яка кодує
мультиензимний комплекс. За допомогою мутаційного аналізу було встановлено,
що у грибів усі 5 етапів біосинтезу ароматичних амінокислот контролює І ген,
єдиним продуктом якого є довгий поліпептидний ланцюг із молекулярною масою
150 000 Да. Саме він і проявляє всі 5 ферментативних активностей. Це не оперон,
а кластер-ген (сПимег-репе). Дані генні конструкції досить часто зустрічаються в
еукаріотів. Як приклади можна навести такі кластер-гени:
- із 4 - кластер-ген, призначений для біосинтезу гістидину у дріжджів-
сахаромщетів, кодує єдиний поліпептид із з трьома ферментативними
активностями;
—arom 1 - кластер-ген, що забезпечує біосинтез ароматичних амінокислот у
нейроспори, кодує один поліпептид із п'ятьма ферментативними активностями;
—fas 1 - перший кластер-ген для біосинтезу жирних кислот у дріжджів-
сахароміцетів, кодує поліпептид із трьома ферментативними активностями;
-/а5 2 - другий кластер-ген для біосинтезу жирних кислот у дріжджів-
сахароміцетів, кодує єдиний поліпептид 13 п'ятьма ферментативними
активностями.
 69

Існування кластер-генів - приклад молекулярної олігомерізації. Очевидно,

зчитування з Кластер-гена інформації відразу про декілька ферментів
метаболічного шляху для клітини «економічно» вигідніше, як і в оперонах
прокаріотів. На відміну від оперона бактерій, із кластер-генів шляхом
транскрипції та подальшої трансляції на рибосомах синтезується одна довга
молекула поліпептиду, у якій окремі домени після просторової укладки
починають виконувати функції певних ферментів. У прокаріотів кожен ген
оперона зазвичай транслюються в самостійний білковий продукт.
Більшість генів еукаріотів поодинокі, тобто в ході еволюції еукаріотів
відбувалася автономізація генів. Це сприяло формуванню роздільної та більш
тонкої регуляції функцій окремих генів. Нагадаємо, що в прокаріотів, навпаки, як
правило, регулюються відразу всі гени оперона, за винятком такого механізму, як
аутогенний контроль, коли ген-регулятор розташований серед структурних генів
самого оперона й дозволяє регулювати оперон окремими блоками.
Наприкінці 70-х рр. ХХ ст. німецькі вчені Я. Нюссляйн-Фолхард 1 Е. Вішаус у
процесі вивчення мутацій у дрозофіл установили наявність кластера із 8 стратегічних
генів, що контролюють розвиток основних частин тіла комахи: голови, грудей і черевця.
Особливо цікавий той факт, що на хромосомі ці гени розташовані в такому самому
порядку, що і сегменти тіла дрозофіли, і послідовно контролюють формування рота,
лицевої і задньої частин голови, шийного сегмента, грудей, передньої та задньої частин
черевця, окремих частин на черевці. Дані гени отримали назву гомеозисних або
гомеобоксних (Нох-гени). Що стосується розташування гомеозисних генів, то це майже
єдиний випадок, коли черговість генів має значення і не може бути змінена. Всі
гомеозисні гени, як виявилось, кодують регуляторні білки, функціями яких є керування
іншими генами ембріонального розвитку. Встановлено наявність гомеозисних генів у
жаби, морського їжака та ссавців. Так, у геномі миші й людини виявлено 39 Нох-тенів,
організованих у 4 кластери, а в кінці кожного кластера - по 5 додаткових генів, яких
немає у дрозофіли. Гомеозисні гени навіть у організмів різних систематичних груп
мають певну гомологію, у них виявлено однакову послідовність із 180 нуклеотидів, яка
слугує зоною для зв'язування з регуляторним білком. Відкриття гомеозисних генів
підтверджує походження багатоклітинних організмів від загального предка, свідчить
про консервативність генів ембріогенезу в процесі довготривалої еволюції та є одним із
найяскравіших наукових досягнень ХХ ст.
5.5. Екзон-інтронна будова генів еукаріотів. Сплайсинг
Гени еукаріотів переривчасті, а саме складаються із кодуючих ділянок -
екзонів і некодуючих - інтронів. Таку структуру генів називають інтрон-
екзонною або мозаїчною. Довжина екзонів сягає 1000 пар нуклеотидів, а інтронів
- зазвичай 5000-20000 пар. Структурна частина гена може мати 2-3 екзони (іноді
більше), розділені довгими інтронами. Хоча інтронів у гені, як правило, буває
небагато, їх кількість у різних видів і в різних генах може коливатися від 0 (у
генах гістонів) до 51 (у структурному гені колагену). Екзонів завжди на один
більше, ніж інтронів, але на частку інтронів припадає в 5-7 раз більше
 70

нуклеотидних пар, ніж на частку екзонів, оскільки інтрони значно довші. Від
кількості екзонів та інтронів, а також від їх довжини залежить довжина гена
еукаріотів. У різних організмів вона може суттєво варіювати. Так, у дрозофіли
середня довжина гена становить 2000 п.н. а довжина гена фіброїну шовку в
шовковника - 16000 п.н.
В одноклітинних еукаріотів дріжджів інтрони зустрічаються рідко
порівняно з багатоклітинними організмами. Серед декількох сотень вивчених
генів дріжджів інтрони знайдено тільки в 17 генах, 16 із них мають тільки по
одному інтрону з 5'-кінця й лише І ген МАТА! містить два інтрони.
Інтрони достатньо консервативні. У споріднених видів еукаріотів виявлено
значну гомологію нуклеотидних послідовностей інтронів. У більшості вивчених
генів інтрони являють собою складні геномні повтори типу Аи, ВІ, В2, ІІ. Але в
складі інтронів можуть зустрічатися й унікальні послідовності ДНК.
Екзон-інтронна структура гена свідчить про те, що його функціональні
частини роз'єднані і він не є неподільною одиницею не тільки щодо рекомбінацій і
мутацій, але й стосовно своїх функціональних властивостей.
Існування інтронів у структурній частині гена створює певні труднощі для
реалізації генетичної інформації, оскільки | в ІРНК, що транскрибується,
з'являються «зайві» ділянки, які в подальшому не повинні транслюватися на
рибосомах. Відповідь на питання, як видаляються інтрони, було знайдене
американським вченим із Масачусетського технологічного інституту Філіпом
Шарпом, який відкрив у 1978 р. явище сплайсингу (від англ. /о 5ріасе -- зшивати
без вузлів).
Механизм сплайсингу. Спочатку в ядрі з ділянки хромосоми (гена)
повністю транскрибується послідовність ДНК із формуванням про- -IPHK —
недозрілої, більш довгої молекули РНК. Вона містить як екзони, так і інтрони.
Коли про-іРНК переміщується із ядра в цитоплазму, під час проходження ядерної
мембрани відбувається сплайсинг - дозрівання про-їЇРНК - один із видів
процесингу. В результаті сплайсингу видаляються інтрони, екзони зшиваються
між собою, а довжина гена зменшується в десятки раз. Процес вирізання інтронів
здійснює спеціальний фермент матураза, відкритий французькими вченими.
Важливу роль у сплайсингу відіграють особливі 5РНК (малі РНК
довжиною до 160 нуклеотидів). Вони стягують між собою кінці інтронів, що
полегшує їх вирізання та подальше зшивання екзонів. Причому кінці інтронів, що
видаляються, дуже консервативні - на 5'-кінці завжди розташовані нуклеотиди
ГУ, а на 3'-кінці - АГ. Саме вони з'єднуються з кінцями 5РНК за правилом
комплементарності. У клітині нараховують 10"-10 копій 5РНК. Усі вони
синтезуються в ядрі, функціонують і в ядрі, і в цитоплазмі. Ці специфічні РНК
містять багато залишків урацилу, тому їх ще називають 0/1, 102, 03 тощо.
Сплайсинг здійснюють специфічні білкові частинки, що отримали назву
сплайсосом. Вони являють собою білкові комплекси, до складу яких, крім уже
названих матураз і 5РНК, входять ще білки, які надають про-іРНК конформацію,
зручну для вирізання інтронів. Крім того, сплайсосома містить ферменти, що
здійснюють поліаденілювання 3'-кінця ІРНК.
 71

Завдяки сплайсингу в цитоплазму на рибосоми для трансляції надходить

зріла ІРНК, у якій уже відсутні інтрони.
Слід зауважити, що інтрони не завжди є некодуючими ділянками. Так, у
дріжджів у генах мітохондрій виявлено інтрони, що кодують синтез ферменту
матурази, який бере участь саме у видаленні інтронів. У деяких генах дріжджів
знайдено інтрони, що кодують цитохром В.
5’ PHK-tpancrpnuor (mpo-iPHK)

Ex30n 1 Інтрон Ex30n 2

Пе яв»
2 Білок С ши б
sPHK i sy, Інші білки У

fr Se el

Компоненти ae Me
сплайсосоми об
Відрізаний інтрон

Дозріла іРНК
е 51
Ex20H 1 Ex3o0n 2

Рис. 5.4. Сплайсинг іРНК за участю сплайсосоми

Види сплайсингу. Розрізняють декілька видів сплайсингу: простий,

альтернативний, транссплайсинг, аутосплайсинг.
Простий сплайсинг притаманний процесингу простих генів, у яких
нуклеотидна послідовність усіх екзонів кодує синтез тільки одного білка. В таких
генах екзони на ДНК мають фіксоване положення й видалення інтронів завжди
відбувається в чітко зазначених сайтах.
про-іРНК

x Екзон КУ Екзон БАР У

iPHK

Рис. 5.5. Простий сплайсинг. Перетворення про-іРНК на дозрілу іРНкК

шляхом вирізання інтронів
Альтернативний сплайсинг характерний для генів, у рамках зчитування
яких закодовано відразу декілька білків. Причому одні й ті самі ділянки можуть
бути або екзонами, або інтронами. Так, на одній ділянці ДНК у щурів кодується
нейропептид гіпофіза ССЕР і гормон щитовидної залози кальцитонін. Залежно від
вирізання тих чи інших фрагментів ДНК у процесі сплайсингу можуть
утворюватися різні ІРНК, що кодують певний білок. Зокрема, у клітинах гіпофіза
 72

сплайсинг відбувається з утворенням кальцитоніну, а в клітинах щитовидної

залози сплайсинг забезпечує утворення нейропептиду ССЕР.
Альтернативний сплайсинг також відбувається під час синтезу антитіл
(імуноглобулінів) і антигенів МНС (головного комплексу гістосумісності).
Транесплайсинг здійснюється шляхом ковалентного з'єднання в одну
молекулу ІРНК екзонів різних генів після видалення з них інтронів. Причому
екзони, що об'єднуються в одну молекулу ІРНК, можуть бути розташовані навіть
в генах різних хромосом. Такий тип сплайсингу добре вивчений в одноклітинних
еукаріотів трипаносом на прикладі синтезу білків тубулінів - компонентів
цитоскелета клітин. Альтернативний і | транссплайсинг структурно та
функціонально - урізноманітнюють популяцію клітинних РНК, кодованих
обмеженою кількістю генів.
Аутосплайсинг (самосплайсинг) вперше описав у 1982 р. Томас Чек
(США) у макронуклеусі інфузорій Теїгасйутепа їйегторпуїа. Пізніше наявність
аутосплайсингу було встановлено в бактерій, дрозофіл й інших організмів.
Аутосплайсинг - самонарізання про-ІРНК без участі матураз та інших ферментів,
а лише за наявності іонів магнію. РНК, яка сама видаляє власні інтрони,
називають рибозимом. Аутосплайсинг свідчить про те, що в еволюції живих істот
першою молекулою, здатною зберігати, відновлювати та переносити генетичну
інформацію, була РНК. Вона виконувала і генетичну, і каталітичну функції, які
пізніше стали виконувати відповідно ДНК і білки.
Відносно появи в структурі генів некодуючих інтронів було запропоновано
гіпотезу про те, що на початку еволюції еукаріотів вони інфікувалися вірусами і в
результаті інтеграції вірусної ДНК у геном у хромосомах з'явилася надлишкова
егоїстична ДНК. Вона є не тільки в інтронних послідовностях генів, але й
розкидана по всій довжині хромосом у вигляді некодуючих послідовностей.
Відкриття екзон-інтронної організації генів сприяло обгрунтуванню того, що
поряд із міжгенною існує і внутрішньогенна функціональна взаємодія. Ген (базиген)
складається з окремих ділянок - трансгенних центрів, які мають схожі функції.
Між трансгенами одного гена є такі ж алельні взаємозв'язки, як і між окремими
функціонально різними генами.
5.6. Порівняльна характеристика геномів прокаріотів та еукаріотів
У ході порівняльного аналізу молекулярно-генетичних процесів прокаріотів
і еукаріотів можна виявити загальні риси, обумовлені еволюційним походженням
усіх живих істот від єдиного реліктового предка. Однак ускладнення генетичних
систем еукаріотів відбувалося | за умов формування відокремленого від
цитоплазми ядра, дії факторів горизонтального перенесення генів, розвитку
багатоклітинності та диференціації різних тканин і органів. Тому в прокаріотів та
еукаріотів є певні особливості проходження реплікації, транскрипції, трансляції, а
також регуляції експресії генів. Нижче наведено дані щодо відмінностей геномів
про- та еукаріотів (табл. 5.3).
 73

Таблиця 5.3
Порівняльна характеристика геномів прокаріотів та еукаріотів

Властивості геномів Прокаріоти Еукаріоти

Об'єм генома 109 пар нуклеотидів 3 410? пар нуклеотидів

Генетичний матеріал Одна кільцева гаплоїдна хромо- Декілька | пар | хромосом | із
сома, просторово укладена в диплоїдним набором
нуклеоїд (іноді 2-3 хромосоми
різні за складом генів)

Молекулярна і Хромосома суперспіралізована, Хромосоми мають нуклеосомну

просторова органі- у її компактизації беруть участь будову, в їх компактизації беруть
зація хромосом гістоноподібні білки участь основні білки гістони

Надмірність генома Не виражена, більшість нуклео- Виражена надмірність геномів,

тидних послідовностей кодуючі більшість нуклеотидних послі-
(85-90 90) 1 представлені ностей - некодуючі (50-95 9) і
структурними або регулятор- представлені егоїстичною ДНК,
ними генами із них 30 95 - повтори

Наявність Екзон-інтронну структуру генів Виражена екзон-інтронна будова

екзон-інтронної не виявлено; гени суцільні, не генів, вони не суцільні, мають
структури генів мають екзонів та інтронів; кодуючі ділянки - екзони та
і сплайсингу сплайсинг відсутній (крім некодуючі - інтрони. Останні
вирізання спейсерів під час вирізаються в процесі сплай-
синтезу тРНК і рРНК) сингу

Активність генів В одиницю часу активні 95 90 В одиницю часу активні 5-10 Уб

генів генів

Зв'язок Через відсутність ядерної | Транскрипція і трансляція

між транскрипцією | мембрани транскрипція і| відокремлені просторово; транс-
і трансляцією трансляція відбуваються | крипція відбувається в ядрі, а
практично одночасно; від | трансляція - у цитоплазмі на
початку транскрипції до появи | рибосомах; від початку транс-
поліпептиду (кінець трансляції) | крипції до появи поліпептиду
проходить 2-3 хв проходить 6-24 год

Особливості Кільцева бактеріальна хромо- | У кожній еукаріотичній хромо-

реплікації сома подвоюється за один акт | сомі функціонують 20-100 сайтів
реплікації, тобто являє собою початку реплікації і відповідно
один реплікон. Реплікація десятки і навіть сотні репліконів,
двонаправлена і завжди почи- реплікація в яких відбувається
нається в одному сайті Огі С не синхронно

Гени еукаріотів утворюють не оперони, як у прокаріотів, а функціональні

групи, що забезпечують синтез різноманітних первинних продуктів:
ферментів, модуляторів функцій білків, рецепторів, транскрипційних факторів,
компонентів внутрішньоклітинного і позаклітинного матриксу, трансмембранних
переносників, гормонів, імуноглобулінів та ін. На структурних генах (цистронах)
 74
відбувається транскрипція ІРНК, яка кодує послідовність певного білка.
Структура олігомерних білків, що складаються із різних субодиниць, закодована в
декількох генах, які розміщуються поряд або на певній відстані один від одного.
Довжина генів прокаріотів та еукаріотів суттєво розрізняється. У
прокаріотів гени суцільні, не мають нітронів, їх довжина, як правило, сягає в
середньому 1000 п.н. Гени еукаріотів мають екзон-інтронну будову, тому їх
довжина значно більша і до сплайсингу (вирізання інтронів) може становити
2000--50000 п.н.
В еукаріотів, як 1 у вірусів, є гени, що перекриваються: на одному й тому ж
фрагменті ДНК із різних сайтів (на різних ланцюгах) може відбуватися
транскрипція із утворенням різних іРНК, що кодують різні поліпептиди. Проте
одночасно транскрипція на обох ланцюгах розпочинатися не може, що, очевидно,
пов'язано із просторовими проблемами.
Реплікація в еукаріотів множинна, у кожній хромосомі функціонує 20-100
сайтів ініціації реплікації та відповідна кількість репліконів - фрагментів ДНК, де
синтез відбувається безперервно за один акт реплікації. Реплікація в окремих
репліконах може відбуватись не одномоментно, однак поділ клітини не
починається, поки повністю не репліковані всі хромосоми (детальніше реплікація
розглянута в наступному розділі навчального посібника). У прокаріотів одна
кільцева хромосома подвоюється за один акт реплікації. Синтез ДНК
розпочинається в точці ініціації - Огі С і проходить у двох протилежних
напрямках за участю двох реплікативних вилок. Вони просуваються по
матричних ланцюгах назустріч одна одній і завершують синтез дочірніх ланцюгів
у термінус-центрі.

ген 1 ген 2 му Р з aA —~ >

ДНК ю юшки SS ш-о Син ЗВ рекзоПени | інтрони" 2
| 5 В
і За пи З

МРНКО зво є- -
|. Ії
п ,} ВoF
I
a
So tH )* Ї
білок 1 білок 2

- 4

Фь
варіант 1
os
варіант 2
:
Мо ЦИТОПЛАЗМА /
Я
б
Рис. 5.5. Особливості експресії генів у прокаріотів (а) та еукаріотів (6)
 75

Транскрипція і трансляція в еукаріотів просторово розділені ядерною

мембраною, яка оточує ядерний матеріал і відділяє ядро від цитоплазми.
Як бачимо на рис. 5.5, транскрипція в еукаріотів відбувається в ядрі, а
синтезована при цьому іРНК транспортується з ядра в цитоплазму для
проходження наступного етапу експресії гена - трансляції. Трансляція (синтез
білка) відбувається на рибосомах, розташованих на мембранах шорсткого
ендоплазматичного ретикулума. Як уже було наголошено, в ІРНК під час
траспортування крізь ядерну мембрану відбувається сплайсинг, тобто дозрівання
ІРНК. Усі ці процеси потребують певного часу, тому від моменту ініціації
транскрипції в ядрі до появи першого білкового продукту в цитоплазмі минає в
середньому 6-24 год. Для порівняння: у прокаріотів цей термін становить 2-3 хв.
Через відсутність ядерної мембрани процеси транскрипції і трансляції у
прокаріотів спряжені (поєднані) 1 відбуваються в клітині відразу один за одним.
В еукаріотів крім ядерного (хромосомного) існує ще позахромосомний
геном, до якого відносять геноми мітохондрій і пластид. Ці органели
сформувалися в результаті проникнення дрібних прокаріотичних клітин у більші
клітини і пожиттєвого ендосимбіозу між ними, про що свідчать певні відмінності
генетичного коду в ДНК мітохондрій і пластид. Нижче зображено послідовності
промоторних зон у генах хлоропластів рослин (рис. 5.6). Привертає увагу той
факт, що деякі ділянки промоторів, а саме ТТСАСА i TATAAT, повністю
збігаються із послідовностями блоків Гілберта (-35) i Прибнова (-10) у
прокаріотів. Тобто промотори багатьох пластидних генів можна розглядати як
аналоги промоторів бактерій.
Гірчиця = pbs4 TIGGIIGACATGGCTATATAAGTCATGTATACTGTICAAT
Шпинат pbsd TIGGITGACACGGGCATATAAGGCATGIATACTGTTGAAT
4 ррсі ~TGGGITGCGCCATATATATGAAAGAGTATACAATAATGATG
« шир ТСТТОАСАСТОСОТАТАТОТТОТАТАТОТАТАТССТАСЗАТОТ
тпм ТТАТАТТОСТТАТАТАТААТАТТТСАТТТАТААТСААТСТА
Бактеріальні TTGACA TATAAT
промотори Блок Гілберта Блок Прибнова

Рис. 5.6. Промоторні ділянки різних генів хлоропластів рослин

Крім генома мітохондрій і пластид в еукаріотів, як і в прокаріотів, є і
мобільні генетичні елементи -- плазміди (у дріжджів та ін.), транспозони, у тому
числі ретропозони 1 ретротранспозони, латентні й дефектні віруси.
Геном еукаріотів відрізняється високим ступенем надлишковості. Так,
геном людини містить приблизно 3,5 : 10" нуклеотидних пар, яких достатньо для
утворення 1,5 млн генів. Однак експериментально доведено, що в організмі людини
приблизно 35000 -- 40000 генів. Це означає, що в геномі функціонує приблизно 1 Уб
нуклеотидних послідовностей | ДНК, причому значна частина генома
використовується | для здійснення | процесів | ембріонального | розвитку,
диференціювання, росту і надалі не експресується. Для порівняння: у геномі
прокаріотів кодуючими послідовностями є 85-90 Зб генома, тобто геном бактерій
досить «ощадний», що дуже важливо із урахуванням малих розмірів клітин.
 76

Частина ШІ. МОЛЕКУЛЯРНІ МЕХАНІЗМИ ЗБЕРЕЖЕННЯ

І РЕАЛІЗАЦІЇ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ

Крім вивчення структури та функцій нуклеїнових кислот та інших

біополімерів, до завдань молекулярної біології входить дослідження складних
механізмів клітини на молекулярному рівні. До таких механізмів належать:
реплікація - синтез ДНК, який забезпечує збереження, відтворення,
передачу та відновлення генетичної інформації як у самій клітині, так і в ряду
поколінь;
експресія генів - переведення інформації із ДНК на амінокислотну
послідовність білка (спочатку шляхом транскрипції, а далі - за допомогою
трансляції на рибосомах);
е регуляція експресії генів із залученням різних механізмів: позитивного 1
негативного контролю, індукції та репресії, аутогенного контролю, катаболітної
репресії, атенуації, дії регуляторних білків, спеціальних геномних послідовностей,
малих ядерних РНК, гормонів тощо;
е процеси мінливості генів: молекулярні механізми мутацій, рекомбінацій,
транспозицій;
ерепарація - виправлення пошкоджень ДНК, одержаних у результаті
мутацій, рекомбінацій, транспозицій (пряма репарація, ексцизійна, 505-
індукована, постреплікативна та ін.).
У наш час до найважливіших завдань молекулярної біології можна віднести
вивчення геномів людини та інших організмів, дослідження механізмів
виникнення раку, процесів старіння, апоптозу (запрограмованої загибелі клітини),
механізмів розвитку СНІДу при ВІЛ-інфекції, спадкових хвороб, взаємодії вірусу
та клітини-хазяїна та ін.
Розділ 6. РЕПЛІКАЦІЯ ДНК ТА Її РОЛЬ У ЗБЕРЕЖЕННІ
ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ
6.1. Загальна характеристика процесу реплікації
Реплікація - це складний процес копіювання (подвоєння) ДНК шляхом
матричного синтезу за допомогою спеціальних ферментів, який забезпечується
генами самої ДНК. Суть реплікації полягає в утворенні ідентичних копій ДНК для
того, щоб під час поділу клітини надвоє в кожну дочірню клітину потрапляла
повноцінна молекула ДНК. Таким чином, реплікація відіграє важливу роль у
відтворенні генетичної інформації, оскільки передує розділенню клітини, а також
забезпечує збереження інформації, закодованої в генах, у ряду поколінь. Ріст і
реплікація у всіх живих істот (прокаріотів, археобактерій 1 еукаріотів) пов'язані
між собою, поділ клітин відбувається тільки після завершеного подвоєння ДНК.
Реплікація лежить в основі розмноження живих організмів. Навіть існування
вірусів було б неможливим без подвоєння їх нуклеїнових кислот. Від
злагодженості реплікації зрештою залежить можливість і тривалість життя.
 77

Реплікація дуже важлива на всіх стадіях росту та розвитку клітин для

реалізації таких процесів, як репарація, рекомбінація і транспозиція, що тісно
пов'язані з активністю реплікативних ферментів. Інтерес до вивчення реплікації
обумовлений важливістю цього процесу для реалізації наслідків мутацій,
здійснення еволюційних змін, запуску канцерогенезу, а також для розробки
стратегії лікування раку, спадкових хвороб, для розробки методів генної терапії.
Гіпотетичні механізми реплікації. У 1953 р., відразу після створення
моделі ДНК, у колі вчених почали виникати гіпотези щодо процесу подвоєння
ДНК. Найбільшу увагу привернули до себе три запропоновані механізми, які не
базувалися на експериментальних даних, тому були досить гіпотетичними:
консервативний, напівконсервативний і дисперсивний.
Напівконсервативний механізм. Ще у 1953 р. Дж. Уотсон ії Ф. Крік
припустили, що подвоєння ДНК відбувається шляхом розривання водневих
зв'язків між двома комплементарними ланцюгами, при цьому кожен ланцюг стає
матрицею для синтезу нового дочірнього ланцюга. При діленні клітини надвоє в
кожну половинку має потрапити ДНК, що складається з одного старого та одного
нового ланцюга. Такий механізм реплікації назвали напівконсервативним. Проте
не всі вчені були згодні з існуванням такого механізму реплікації. Це
підштовхнуло М. Мезелсона ії Ф. Сталя у 1958 р. провести експерименти для
доведення існування напівконсервативного механізму реплікації (рис. 6.1).

Культури у градієнті Склад фо

Е сої CsCl ДНК зн
Покоління 0 | se й aa
Середовише фе
містить М — || aN]
М-

Покоління ! = + )
Ріст культур Л П| Важка легка |
Ha середови- (сб) 3 THK, 'N4N
mi3 +N О
Й в
. 2 -

дона я Легка
(| THK Важка/легк а {|
Ріст культур THK “NN

на середови" (В |) муну Є + Ry
= wry
Покоління3 | П
Ріст культур , Е і
на середови- Y J :
щіз "М мимо | МАМ
Рис. 6.1. Схема досліду М. Мезелсона і Ф. Сталя
Для цього Є. сої спочатку вирощували у спеціальному живильному
середовищі із важким ізотопом азоту - "М. Радіозотоп азоту включався в азотисті
основи ії далі - у молекули ДНК у процесі їх синтезу з нуклеотидів. Перед
масовим поділом клітин мікробну культуру синхронізували і в середовище
додавали звичайний ізотоп азоту "М, проводили культивування в оптимальних
 78

температурних умовах (37°C). У процесі реплікації "М входив у склад нових

дочірніх молекул ДНК. Після виділення ДНК із клітин та їх розділення шляхом
рівноважного ультрацентрифугування в градієнті С5СІ отримали дві фракції
ДНК, які містили відповідно по 50 96 ізотопів азоту "М і "М. Таким чином, було
доведено, що в результаті поділу клітин генетичний матеріал розподіляється
рівномірно в дочірніх клітинах, тобто у Е.со/ї має місце напівконсервативний
механізм реплікації. У подальшому було виявлено, що він - найпоширеніший у
природі.
Консервативний механізм гіпотетично припускав такий розвиток подій: на
одному з материнських ланцюгів здійснюється синтез дочірнього ланцюга, який,
у свою чергу, слугує матрицею для синтезу ще одного дочірнього ланцюга. За
такого механізму реплікації B процесі ділення клітини в одну половину
потрапляють 2 старі ланцюги ДНК. а в іншу - 2 нові. Цей механізм практично не
зустрічається у прокаріотів та еукаріотів, оскільки невигідний через можливе
накопичення мутацій у 50 Зо клітин популяції. Однак подібний тип реплікації
(сигма-тип) притаманний деяким вірусам з одноланцюговою молекулою ДНК,
наприклад, бактеріофага ФХ 174.
Дисперсивний механізм припускає можливість рекомбінацій. Після такої
реплікації в дочірніх клітинах повинні опинитися ДНК, що складаються з
фрагментів старого та нового, щойно синтезованого матеріалу. В еукаріотів це
відбувається в процесі кросинговеру при мейотичному діленні клітин, але не в
ході реплікації (рис. 6.2).

g2 2888
Рис. 6.2.
засн
Напізконсеувативний (а), консервативний (6) і дисперсивний (в) механізми
реплікації (розподіл материнських і дочірніх ланцюгів ДНК)
Завдяки дослідженням А. Корнберга, Дж. Кернса, Сакабе, Оказакі та інших
вчених було підтверджено існування напівконсервативного механізму реплікації.
Крім того, було встановлено, що реплікація здійснюється як напівбезперервний
процес, а саме один із ланцюгів ДНК (лідируючий) синтезується беззупинно, а
інший ланцюг (відстаючий) реплікується в пульсівному ритмі просторово у
зворотному напрямку. Завдяки цьому на відстаючому ланцюзі спочатку
 79

утворюються окремі фрагменти ДНК (фрагменти Оказакі), які пізніше зшиває

спеціальний фермент лігаза.
Основні принципи реплікації базуються на ключових властивостях
молекули ДНК. Найбільш важливі з них наведено нижче:
е самовідтворення (самореплікація), оскільки в самій ДНК наявні гени, що
кодують ферменти та білки для власного подвоєння;
е комплементарність - основний принцип матричного синтезу;
енапівконсервативність (синтез відбувається на обох ланцюгах ДНК,
роз'єднаних за рахунок розриву водневих зв'язків між азотистими основами);
е уніполярність синтезу ДНК (синтез завжди здійснюється в напрямку 5'-з»3);
еантипаралельність синтезу комплементарних ланцюгів (синтез на двох
ланцюгах відбувається у двох просторово протилежних напрямках);
е переривчастість синтезу (спостерігається на відстаючому ланцюзі);
е потреба в затравках (спочатку синтезуються невеликі фрагменти РНК, які
виконують функції затравок-праймерів для подальшого синтезу ДНК).
Уперше механізм реплікації було вивчено в прокаріотів на прикладі
кишкової палички FE. coli. Пізніше було проведено дослідження процесів
реплікації в еукаріотів і виявлено, що за основними принципами процес
подвоєння ДНК у них мало відрізняється від аналогічного у бактерій.
Нуклеоїд. ДНК у нуклеоїді покрита гістоноподібними білками НО-аф і
Н-М5, які надають нуклеоїду певної структури. Нуклеоїди можна виділити із
клітин шляхом їх лізису за високої концентрації солі. На електронних
мікрофотографіях нуклеоїд має вигляд множинних суперспіралізованих петель
(доменів), що відходять від центру. Область нуклеоїда в цитоплазмі майже на
містить рибосом, ДНК у ньому щільно упакована і недосяжна для дії
гідролізуючих ферментів. Г. Шлегель і співавтори вважають, що транскрипція
можлива в основному на поверхні нуклеоїду. Проте структура нуклеоїду дуже
динамічна, і певні петлі ДНК можуть потрапляти в серцевинну зону нуклеоїду або
на його периферію. У 1963 р. Дж. Кейрнс отримав радіоавтограму міченої Н-
тимідином хромосоми Є. соїї з контурною довжиною 1,3 мм, що у 500 раз більша
довжини самої клітини. Хромосома мала кільцеву форму.
Реплікон - це автономна реплікаційна одиниця, що має точку початку
реплікації, з якою взаємодіє ініціаторний білок. Точка початку реплікації
локалізована в ДНК, що реплікується, у цис-положенні.
6.2. Ферменти та білки, що беруть участь у реплікації
Реплікація подібно до транскрипції та трансляції - процес матричного
синтезу. Він висококоординований, збалансований 1 його обслуговує велика
кількість ферментів і білків (понад 30). Вивчено гени, що кодують ці білкові
продукти. Більша їх частина отримала назву «па А, «па В, апа С, апа Р, апа Е,
дпа С апа І, апа К, апа І, апа М, апа М тощо. Крім цих генів існують ще гени зі
специфічними назвами: Іїе (ген лігази), гер (ген хелікази лідируючого ланцюга),
гіг А, ріг В (гени гірази), гор (гени топоізомераз). Розглянемо функції основних
білків і ферментів, що беруть участь у процесі реплікації.
 80

Білок-ініціатор - продукт гена дпа А, «упізнає» на ДНК сайт початку

реплікації - огі С (огідїп сепгег). Огі С - ділянка на хромосомі з досить великою
протяжністю (декілька сотень нуклеотидів). Вона насичена АТ-парами, завдяки
чому в ній можуть легко розходитись комплементарні ланцюги. У кільцевій
хромосомі FE. co/i за умов двоспрямованої реплікації огі С має протяжність
понад 440 нуклеотидів, за односпрямованої реплікації - до 245 нуклеотидів.
РНК-аза Н - фермент, що забезпечує вибірковість початку реплікації. Якщо
за будь-якої причини реплікація розпочнеться не в огі С, то РНК-аза Н гідролізує
утворений у «неправильному» місці затравочний ланцюг.
Топоізомерази (продукти генів ор, яуг, раг) - ферменти, що забезпечують
просторові (топологічні) перетворення ДНК. Оскільки ДНК у клітині перебуває в
надспіралізованому стані, що утруднює розходження матричних материнських
ланцюгів перед реплікацією, необхідні ферменти, які б здійснювали розплітання
та розплутування ДНК. Таку функцію і виконують топоізомерази майже на усіх
стадіях підготовки та здійснення реплікації, а саме:
еперед початком реплікації (на стадії ініціації) топоізомерази релаксують
молекули ДНК і частково розкручують матричні ланцюги ДНК;
ey процесі реплікації (на стадії елонгації) розплутують петлі, що
утворюються перед реплікативною вилкою;
е після завершення реплікації (на стадії термінації) роз'єднують катенани -
зчеплені кільцеві новоутворені молекули ДНК і полегшують їх розходження до
полюсів клітини.
У кишкової палички ідентифіковані чотири топоізомерази: топоізомераза І
(ген /орд), топоізомераза П (ДНК-гіраза, гени гугА 1 ругВ), топоізомераза ПІ (ген
торВ), топоізомераза IV (гени рагС 1 рагЕ). Топоізомерази розподіляють на два
типи. Ферменти І типу (топоізомерази І 1 ПІ) здійснюють тимчасовий розрив в
одному з ланцюгів ДНК, а ферменти Ш типу (топоізомеразай П і ІМ)
одномоментно розривають обидва ланцюги. Завдяки вивченню мутантів FE. coli
було встановлено, що серед усіх топоізомераз тільки гіраза може здійснювати
негативну суперспіралізацію, тобто скручувати молекулу ДНК з утворенням
супервитків, закручених проти годинникової стрілки. Топоізомераза І, навпаки,
послаблює ці супервитки. Тобто топоізомерази І 1 П за своєю дією - антагоністи.
Крім підтримання надспіральності функцією гірази є також послаблення напруги
скручування перед реплікативною вилкою.
Топоізомерази П (гіраза), ПІ і ГУ беруть участь у роз'єднанні (декатенації)
з'єднаних кінцевих продуктів (катенанів, або конкатемерів) при реплікації
кільцевих хромосом 1 плазмід.
Найважливішими для реплікації ДНК у Е.соїї є топоізомерази І 1 П (гіраза),
причому останній фермент починає діяти раніше.
Топоізомераза П наявна у всіх клітинних організмів (у прокаріотів та
еукаріотів). У Е. coli цей фермент називають гіразою (або ДНК-гіразою). Гіраза
являє собою тетрамер, що складається з двох субодиниць А і двох субодиниць В,
які кодують відповідно гени єугА і гугВ. Активні центри ферменту утворюються
за рахунок формування гетеродимерів, що містять по одній субодиниці двох
 81

різних типів. Для фукціонування топоізомерази П необхідна енергія, яка

видобувається за рахунок гідролізу АТФ.
У кишкової палички гіраза виконує 2 основні функції. Перша функція
гірази - перевірка цілісності ДНК шляхом негативної суперспіралізації, а саме
гіраза здійснює додаткове скручування кільцевої молекули ДНК проти
годинникової стрілки з утворенням петлеподібних елементів - суперпетель.
Якщо в ДНК є хоча б І розрив, то суперскручування не відбувається. Це слугує
сигналом для активації системи репаративних ферментів, що відновлюють
цілісність ДНК. Друга функція гірази протилежна першій: фермент робить у
молекулі ДНК дволанцюговий розрив i, протягуючи частину заплутаної молекули
через нього, розплітає петлі ДНК. Причому такі розриви можуть релаксувати і
позитивні, і негативні суперспіралі ДНК.
Налідиксова кислота й антибіотики групи фторхінолонів (норфлоксацин,
офлоксацин, ципрофлоксацин та ін.) здатні інгібувати гірази прокаріотів. Їх
застосовують як лікарські засоби для терапії бактеріальних інфекцій, оскільки
блокування гірази повністю припиняє реплікацію 1 поділ клітин бактерій.
Топоізомераза І (продукт гена горд) в Е. соїї відіграє важливу роль у
подальшій релаксації кільцевої хромосоми вже після її прикріплення до виступу
цитоплазматичної мембрани. У частково розслаблених негативних суперспіралях
цей фермент здійснює тимчасовий одноланцюговий розрив ДНК і приєднується
до 5-кінця розриву, а 3-кінець починає розкручуватись відносно інтактного
(нерозірваного) ланцюга. У такий спосіб формується реплікативна вилка, на
кінцях якої розпочинається збирання ферментативного апарату реплікації.
Було встановлено, що топоізомерази наявні не тільки в прокаріотів. Подібні
ферменти функціонують також у клітинах еукаріотів.
Хелікази - ферменти, що розривають водневі зв'язки між азотистими
основами комплементарних ланцюгів ДНК. В ЕХ. соїї виявлено хелікази двох
типів, які кодуються різними генами і працюють кожна на своєму ланцюзі (одна -
на лідируючому, інша - на відстаючому). Проте у разі блокування однієї з хеліказ
інша досить ефективно розводить комплементарні ланцюги ДНК.
На лідируючому ланцюзі працює хеліказа-гер (продукт гена гер), яка
використовує 2 молекули АТФ для розривання однієї пари нуклеотидів.
На відстаючому ланцюзі формується більш складна хеліказа В (хеліказа
ФпаСапав), що складається з 6 білкових продуктів гена апаС і 6 білків гена апаВ.
Білки п, п, п, і відіграють допоміжну роль. Білок n mae ATO- -азну
активність, гідролізує АТФ і таким чином забезпечує хеліказу В енергією для
розриву водневих зв'язків між комплементарними ланцюгами ДНК.
Праймаза (продукт гена апаС) - специфічна РНК-полімераза - синтезує на
відстаючому ланцюзі (як на матриці) невеликі фрагменти РНК (із 4-6
нуклеотидів), які виконують функції затравок для синтезу і отримали назву
праймерів. Праймери необхідні для того, щоб головний фермент реплікації
ДНК-полімераза зміг розпочати синтез дочірнього ланцюга ДНК, оскільки без
затравки жодна ДНК-полімераза не може приєднатися до матричного ланцюга
ДНК. Тобто саме з затравок розпочинається синтез ДНК.
 82

Праймосома -- складна функціональна частинка, збирання і функціонування

якої відбувається на відстаючому ланцюзі. Праймосома являє собою комплекс
білків, куди входять хеліказа В, допоміжні білки п, п, п, і, а також праймаза. За
рахунок гідролізу АТФ праймосома рухається вздовж відстаючого ланцюга,
розриваючи водневі зв'язки між комплементарними ланцюгами, і одночасно з
цим праймаза синтезує РІНК-праймери. Функції допоміжніх білків n, n, i
остаточно не з'ясовані за винятком білка п, що проявляє АТФ-азну активність.
558-білки (від англ. 5іпеіе 5ігапа Біпаїпе) - тетрамери, що складаються з
чотирьох однакових поліпептидних субодиниць (М.м. кожної - 19 кДа). Здатні
зв'язуватись із розведеними поодинокими материнськими ланцюгами ДНК.
Рухаючись перед реплікативною вилкою, 55В-білки вирівнюють одноланцюгові
нитки ДНК, усувають усі випадкові елементи на шляху ДНК-полімераз і таким
чином «очищують» матриці. Крім того, 55В-білки блокують ренатурацію ДНК,
запобігаючи з'єднанню ланцюгів.
ДНК-полімерази - головні ферменти реплікації, які безпосередньо
здійснюють синтез дочірніх ланцюгів ДНК, використовуючи як матриці розведені
материнські ланцюги. Усі ДНК-полімерази мають полімеразну (синтетичну)
активність. Bonu синтезують ДНК шляхом послідовного 0 приєднання
дезоксирибонуклеотидів один до одного за рахунок утворення фосфодіефірного
зв'язку між 3-ОН кінцем попереднього та 5 -фосфатним кінцем наступного
нуклеотиду. Таким чином, синтез ДНК відбувається тільки в напрямку 5-3.
Поряд із полімеразною активністю деякі ДНК-полімерази проявляють також
абсолютно протилежну активність - екзонуклеазну, завдяки чому вони видаляють
неправильно вбудовані нуклеотиди або з 5 -, або з З-кінця ланцюга ДНК. У
еукаріотів і прокаріотів ДНК-полімерази дещо розрізняються.
ДНК-полімерази прокаріотів зазвичай представлені ферментами 3-х типів
(1, П 1 ЩІ), що розрізняються структурою і набором ферментативних активностей.
Усі ДНК-полімерази синтезують ДНК завдяки єдиному механізму, а саме:
до 3-кінця зростаючого 4 ланцюга через а-фосфатну групу послідовно
приєднуються нуклеозид-5 фосфати. Необхідну для такого процесу енергію
забезпечує гідроліз макроергічного фосфатного зв'язку, що супроводжується
вивільненням пірофосфату. ДНК-полімераза | при цьому підбирає нуклеотид,
здатний спарюватись із азотистою основою комплементарного нуклеотиду в
матричному ланцюгу. Зростаючий ланцюг подовжується на 3-кінці, тобто синтез
відбувається в напрямку 5 -» 3.
ДНК-полімераза ЇЇ прокаріотів (продукт гена polA) — фермент 13
молекулярною масою 109 кДа. У процесі обмеженого протеолізу фермент може
ділитися на 2 різні фрагменти: більший за розміром (фрагмент Кльонова) і
менший. Як у складі єдиної білкової молекули, так і в дискретному стані обидва
фрагменти повноцінно проявляють характерні для них ферментативні активності.
Фрагмент Кльонова (більший фрагмент ДНК-полімерази І) має дві
ферментативні активності - полімеразну і 3-екзонуклеазну. Завдяки полімеразній
активності фермент синтезує дочірній ланцюг ДНК у напрямку 5-3, а за рахунок
3 -екзонуклеазної активності він може відщеплювати нуклеотиди з 3 -кінця.
 83

Менший фрагмент ДНК-полімерази І на відміну від більшого фрагмента

має тільки 5-екзонуклеазну активність і здатний відщеплювати неправильні
нуклеотиди з 5 -кінця.
ДНК-полімераза І під час реплікації ДНК на стадії елонгації завдяки
екзонуклеазним активностям здійснює видалення РНК-праймерів, а за рахунок
полімеразній активності проводить забудову утворених виломів у дочірньому
ланцюзі ДНК-послідовностями. У клітині кишкової палички виявлені близько 400
молекул цього ферменту. ДНК-полімераза І відіграє важливу роль не тільки в
реплікації, але й в репарації. І фрагмент Кльонова, і ДНК-полімераза І у
повноцінній формі холоферменту широко застосовують у генній інженерії.
ДНК-полімераза ПП прокаріотів (продукт гена роїВ) - фермент 13
молекулярною масою 120 кДа, складається з однієї субодиниці, виявляє Ті ж види
активностей, що і фрагмент Кльонова - полімеразну й 3-екзонуклеазну. У
клітині його приблизно в 4 рази менше, ніж ДНК-полімерази І, - близько 100
молекул. Цей фермент може дублювати функції ДНК-полімерази І і також бере
участь у репарації.
ДНК-полімераза Ш - головний фермент реплікації. Мутанти Е.ооїї, у яких
заблоковано гени ДНК-полімерази ПІ, не здатні до реплікації. Даний фермент має
молекулярну масу 500 кДа і складається із 7 субодиниць: а, В, у, 9, є, 0, т, які
кодуються відповідно окремими генами (апаЕ, апа, апахХ, апа/, апа0, апад,
ФпаХ). Дія цієї полімерази проявляється у формі холорферменту - повного
комплексу всіх субодиниць. Кофакторами ДНК-полімерази ПІ є іони Ме" і 7п".
Для деяких субодиниць ферменту встановлено ферментативні активності:
а-субодиниця проявляє полімеразну, В-субодиниця - АТФ-азну, є-субодиниця --
З -екзонуклеазну активність. В останні роки було детально вивчено структуру
ДНК-полімерази Ш і встановлено, що у вигляді повнорозмірного ензиму
(холоферменту) вона являє собою білковий комплекс із молекулярною масою 9153
кДа і складається із 10 білкових субодиниць: O, By, Y2, 5 i 5, Go; о ба у М.
Указаний білковий комплекс утворює асиметричний димер, одна частина якого
синтезує лідируючий ланцюг, а інша - відстаючий ланцюг. До кожної частини
димеру входять субодиниці серцевинного поліпептиду (а, є, 0) і «ковзаючий
затискач» (Р-субодиниця), необхідні для швидкої полімеризації (синтез
відбувається зі швидкістю 1000 нукл./с). Так званий «зв'язувальний затискач» -
це у-комплекс, що містить субодиниці у, 9, 9, У, М, він виконує функцію скріпки
(або скоби) і необхідний для зв'язування «ковзаючого затискача».
ДНК-полімераза ПІ синтезує ДНК на лідируючому ланцюзі безперервно, на
відстаючому ланцюзі - у пульсуючому ритмі, а саме фермент синтезує окремі
фрагменти ДНК (фрагменти Оказакі), розпочинаючи синтез кожного разу з
РНК-праймера (затравки). Це пов'язано з тим, що ДНК-полімераза не може
розпочати синтез ае поуо, тобто з пустого місця. Ферменту необхідний
затравковий нуклеотид, до якого можна приєднати наступний. Раніше уже було
зазначено, що синтез РНК-затравок на відстаючому ланцюзі здійснює праймаза.
ДНК-полімераза ПІ у прокаріотів працює з високою точністю, зазвичай
допускає не більше однієї помилки на 10" нуклеотидів. Фермент відрізняється
 84
високою процесивністю і здійснює реплікацію з надзвичайною швидкістю -
1000-1600 (за останніми даними до 2000) нуклеотидів на секунду.
Таблиця
Основні ферменти і білки реплікації

Білок Ген Функція

Білок-ініціатор dnaA Ініціація реплікації, зв'язування з оріджином і його
(52 кДа) часткове розплітання
РНК-аза Н таб Забезпечення вибірковості ініціації реплікації,
гідроліз РНК-затравок, синтезованих y
«неправильних» місцях
Топоізомераза П сугА, єугВ | Перевірка цілісності ДНК перед реплікацією
(Гіраза) шляхом негативної суперспіралізації хромосоми.
Містить по 2 субодиниці Розплітання суперпетель завдяки двонитковим
Ата В розривам ДНК. Усунення просторових проблем під
(374 кДа) час реплікації кільцевих ДНК
Топоїізомераза І topA Участь у розплітанні дволанцюгової ДНК завдяки
(100 кДа) однонитковому розриву в кільцевій хромосомі
Хеліказа-Кер гер Розплітання дуплекса ДНК за рахунок руйнування
водневих зв'язків | між | комплементарними
нуклеотидами. Рухається вздовж лідируючого
ланцюга
Хеліказа ДрпаВв DnaC dnaB Руйнування водневих зв'язків між нуклеотидами
(6 білків ДрпаВ - 300 кДа dnaC комплементарних ланцюгів. Рухається вздовж
6 білків ДрпаС - 174 кДа) відстаючого ланцюга
Праймаза dnaG Синтез праймерів - РНК-затравок на відстаючому
(60 кДа) ланцюзі. Входить до складу праймосоми
ДНК-залежна АТФ-аза Входить до складу праймосоми
п Функція невідома
пи АТФ-азна активність
п! Функція невідома
і Функція невідома
55В-білок (76 кДа) 856 Запобігання ренатурації ДНК, витягування та
(тетрапептиди) «очищення» однониткових ДНК
ДНК-полімераза ПІ, Головний фермент реплікації, синтезує
холофермент (918 кДа, дочірній ланцюг на лідируючому 1 фрагменти
включає 10 субодиниць: Оказакі на відстаючому ланцюгах
а dna E Полімеразна активність (серцевинний поліпептид)
В dna N АТФ-азна активність
у dna X У складі + y-KoMiieKcy скріплює «ковзаючий
т dna X затискач»
є dna Q 2 т-білки з'єднують 2 димери в один холофермент
5 hol A 3/-екзонуклеазна дія (серцевинний поліпептид)
б hol В Входить до складу у-комплексу
x hol C Входить до складу у-комплексу
У hol D Входить до складу у-комплексу
9 hol E Входить до складу у-комплексу
Субодиниця серцевинного поліпептиду
 85

Закінчення таблиці

Білок Ген Функція

ДНК-полімераза І polA Видалення праймерів і забудова виломів у
(109 кДа): відстаючому ланцюзі.
більший фрагмент Полімеразна та 3 -екзонуклеазна активності
(фрагмент Кльонова),
менший фрагмент 5 -екзонуклеазна активність
ДНК-полімераза П polB Полімеразна | та | 3-екзонуклеазна | активності
(140 кДа) (можливо фермент дублює функції
ДНК-полімерази І)
ДНК-лігаза Пе Поєднання фрагментів Оказакі фосфодіефірним
(75 кДа) зв'язком
ДНК-полімерази - Виявлено декілька типів ДНК-полімераз, що
еукаріотів: функціонують у різних компартментах клітини
ДНК-полімераза-а, - Реплікація ДНК в ядрі, синтез фрагментів Оказакі
4 субодиниці (500 кДа)
ДНК-полімераза-В, - Репарація ДНК в ядрі, забудова коротких виломів у
І субодиниця (40 кДа) ДНК, що залишилися після гідролізу праймерів.
ДНК-полімераза- у - Реплікація ДНК у мітохондріях, репарація.
2 субодиниці (50 кДа) Подібний фермент є у хлоропластах рослин
ДНК-полімераза- д - Має полімеразну та 3 -екзонуклеазну активності,
2 субодиниці завдяки яким може не тільки синтезувати ДНК, але
(120-150 кДа) й видаляти затравки (праймери)
Вище наведено характеристику основних ферментів і допоміжних білків,
що беруть участь у реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів (таблиця).
ДНК-полімерази еукаріотів різноманітніші як за стуктурою, так і за
функціями, оскільки працюють у різних компартментах клітини. Їх розподіляють
на 5 типів -- (», В», у», 0-, є-полімерази:
1) ДНК-полімераза-а - фермент із молекулярною масою 500 кДа,
складається з 4 субодиниць. Проявляє полімеразну й праймазну активності.
Головний фермент реплікації в еукаріотів, який синтезує ДНК в ядрі, тому його
ще називають ядерною ДНК-полімеразою. Фермент подвоює лінійні фрагменти
хромосом у місцях утворення реплікативних вилок. Дослідники припускають, що
а-полімераза синтезує ДНК тільки на відстаючих ланцюгах, а на лідируючих
працює 0-полімераза;
2) ДНК-полімераза-р - фермент із молекулярною масою 40 кДа, має тільки
полімеразну активність. Забудовує короткі виломи, що залишилися після
гідролізу РНК-праймерів на відстаючому ланцюзі ДНК уже після синтезу
фрагментів Оказакі. Відіграє важливу роль у репараціях ДНК;
3) ДНК-полімераза-) - фермент із молекулярною масою 50 кДа, має декілька
субодиниць, проявляє полімеразну активність, синтезує ДНК у мітохондріях;
4) ДНК-полімераза-д - фермент із молекулярною масою 120 - 150 кДа,
містить 2 субодиниці, має полімеразну та 3 -екзонуклеазну активності, завдяки
чому може не тільки синтезувати ДНК, але й видаляти затравки (праймери);
 86

5) | ДНК-полімераза-є вивчена недостатньо. Можливо вона - ізофермент

однієї з описаних ДНК-полімераз.
Усі ДНК-полімерази синтезують ДНК за єдиним механізмом, а саме до
3-кінця зо зростаючого ланцюга через альфа-фосфатну групу послідовно
приєднуються нуклеозид-5 «фосфати. Необхідну для такого процесу енергію
забезпечує гідроліз макроергічного фосфатного зв'язку, що супроводжується
вивільненням пірофосфату. | ДНК-полімераза з підбирає комплементарний
нуклеотид, здатний спаровуватись із азотистою основою нуклеотиду в
матричному ланцюгу. Зростаючий ланцюг подовжується на 3 -кінці, тобто синтез
відбувається у напрямку 533.
Лігаза (ДНК-лігаза) - фермент, який «зшиває» фрагменти ДНК шляхом
утворення фосфодіефірних зв'язків між 3-гидроксильними та 5-фосфатними
кінцями фрагментів ДНК. У прокаріотів кофактором лігази є НАД, а в еукаріотів 1
фагів - АТФ. Лігазу, поряд із ДНК-полімеразами та рестриктазами, широко
застосовуть у генетичній інженерії.
6.3. Стадії реплікації: ініціація, елонгація, термінація
У більшості організмів, як прокаріотичних, так і еукаріотичних, реплікація
являє собою двоспрямований процес, а саме в оріджин-центрі (Огі С - стартова
точка реплікації) утворюються дві реплікативні вилки, які рухаються у двох
протилежних напрямках. У деяких бактеріальних плазмід 1 вірусів виявлено
односпрямовану реплікацію за типом рулону, що розгортається, або кільця, яке
котиться.
Реплікон - це автономна реплікаційна одиниця, що має точку початку
реплікації, із якою взаємодіє ініціаторний білок. Точка початку реплікації
локалізована в ДНК, що реплікується, у цис-положенні.
Для реплікації, так само, як 1 для процесів транскрипції і трансляції,
характерні три основні стадії: ініціація, елонгація та термінація. Найбільш
детально ці стадії досліджено в Є. сої.
Ініціація - перший підготовчий етап реплікації, коли відбуваються
просторові зміни в ДНК, завдяки чому вона частково релаксується. Це
надзвичайно важливо для забезпечення розплітання молекули й розходження
матричних ланцюгів, а також для збирання на ланцюгах ферментативного апарату
реплікації. Установлено функції певних білків у процесі ініціації реплікації. Їх
називають факторами ініціації реплікації. До них відносять: продукт гена DnaA
(білок-ініщіатор), НО-аВ (гістоноподібні білки), ПХЕ-аВ (Пестайоп host factor), FIS
(Factor for inversion stimulation), H-NS (Histon-like nucleoid structuring protein),
РНК-полімеразу (а», В, В, с). НО-аб, ІМЕ-оВ, БІ8, Н-М5 виконують структурну
(морфопоетичну) функцію у формуванні ініціаторного комплексу на початку
реплікації. Завдяки ним молекула ДНК може згинатись і набувати такої
просторової форми, яка буде зручнішою для початку процесу синтеза.
Ініціація реплікації включає три стадії: 1) розпізнавання місця старту -
точки початку реплікації; 2) синтез РНК-затравки; 3) зв'язування Хелікази з
матрицею.
 87

Ініціація розпочинається з перевірки ДНК на цілісність шляхом додаткового

негативного (проти годинникової стрілки) суперекручування молекули за
допомогою ДНК-гірази (топоізомерази П). Якщо в ДНК є хоча б І розрив,
суперскручування не відбувається. Це є сигналом для проведення репарації ДНК.
Для переведення ДНК у релаксований стан, що дуже важливо для розкручування,
гіраза робить тимчасові дволанцюгові розриви в ДНК і розплутує петлі, що
виникли в результаті негативного суперскручування. Точку старту розпізнає
білок-ініціатор (4па А), він приєднується до багатої на АТ-пари області оріджин-
центру на ДНК і сприяє її прикріпленню до внутрішнього виросту
цитоплазматичної мембрани клітини. Таким чином кільцева хромосома бактерії
фіксується на мембрані біля сайта початку реплікації. Топоізомераза І робить
розрив у лідируючому ланцюзі ДНК поблизу огі С, прикріплюється до 5-кінця
розриву, а 3-кінець починає розкручуватись відносно інтактного (нерозірваного)
ланцюга з утворенням реплікативної вилки, де й відбувається формування
ферментативного апарату реплікації (по-різному на лідируючому та відстаючому
ланцюгах).
На лідируючому ланцюзі як на матриці неспецифічна РНК-полімераза
синтезує невеликий фрагмент РНК (так званий РНК-транскрипт), який відіграє
роль затравки для наступного синтезу ДНК. РНК-полімераза для початку синтезу
затравки на лідируючому ланцюгу розпізнає ділянку, що утворює вторинну
шпилькову структуру. Саме до затравки - РНК-транскрипта ДНК-полімераза ПІ
на стадії елонгації приєднуватиме дезоксирибонуклеотиди. Якщо транскрипт
утворився у «неправильному» місці, РНК-аза Н гідролізує його, забезпечуючи
вибірковість синтезу.
У сайті ініціації реплікації, де починає утворюватись затравка, формується
так звана К-петля (вічко) - триланцюгова ділянка, яка складається із гібрида
ДНК-РНК і відповідної одноланцюгової ДНК. Ця петля дуже важлива для
формування реплікативної вилки. Перед транскриптом на лідируючий ланцюг
ДНК «сідає» хеліказа Кер і 55В-білки. Останні утримують у розведеному стані
ланцюги ДНК, запобігаючи ренатурації, вирівнюють ланцюги, усувають зайві
елементи із матричного ланцюга ДНК. До лідируючого ланцюга приєднюється
молекула ДНК-полімерази ПІ, що здійснюватиме синтез дочірнього ланцюга.
На відстаючому ланцюзі формується складна хеліказа-0паВОпаС шляхом
послідовного приєднання 6 молекул білка фпаС і 6 молекул дпаВ. До них
приєднуються допоміжні білки (п, п, п, і) та праймаза. Таким чином формується
складна частинка - праймосома. Реплікацію хромосом у прокаріотів здійснює
праймосома Дпад-типу, яка крім хелікази ШДпаВ РДпаС і праймази містить ще
білок ДрпаА. Праймосома в комплексі з ДНК-полімеразою ПІ утворює реплісому.
На відстаючий ланцюг також «сідають» 55В-білки. Перед початком елонгації на
кожному ланцюгу виявляють по | молекулі ДНК-полімерази ПІ.
Елонгація - основна стадія реплікації, у процесі якої відбувається
подовження дочірніх ланцюгів ДНК, тобто їх безпосередній синтез за участю
ДНК-полімерази ПІ. На лідируючому та відстаючому ланцюгах елонгація
здійснюється по-різному.
 88

На лідируючому ланцюзі відбувається безперервний синтез ДНК, а саме

ДНК-полімераза ШІ (у формі холоферменту) приєднується до матричного ланцюга
і, о використовуючи РНК-транскрипт як затравку, починає нарощувати
комплементарний дочірній | ланцюг шляхом послідовного приєднання
дезоксирибонуклеотидів. Попередники синтезу ДНК - активовані нуклеозид-3-
фосфати. При їх приєднанні до нарощуваного ланцюга від кожного нуклеозид-3-
фосфату відщеплюються два залишки фосфорної кислоти (пірофосфат), а
вивільнений 5-фосфорнокислий кінець нуклеозидмонофосфату приєднується до
3-гідроксильного кінця попереднього нуклеотиду. Синтез здійснюється в
напрямку 5 -» 3, що відповідає спрямованості просування реплікативної вилки.
Нижче подано схему процесу реплікації ДНК на стадії елонгації (рис. 6.3).

ланцюг

полімераза
Ш

Фр агменти
г У й
Оказакі 23 ES)
чо РНК-транскрипт
5 дні Ху

Рис. 6.3. Реплікація молекули ДНК (стадія елонгації)

Примітка: утворення дочірніх молекул ДНК відбувається в напрямку 5-з93!
комплементарно і антипаралельно ланцюгам материнської молекули.

На відстаючому ланцюзі синтез ДНК на стадії елонгації відбувається у

пульсуючому ритмі фрагментарно, оскільки цей матричний ланцюг спрямований
антипаралельно до протилежного матричного. Спочатку праймаза, що входить до
складу праймосоми, на незначній відстані від кінця відстаючого ланцюга синтезує
невеликий РНК-праймер із 4 - 6 нуклеотидів, а вже до нього ДНК-полімераза ПІ
починає послідовно приєднувати дезоксирибонуклеотиди. У результаті цього
услід за праймером утворюється | фрагмент ДНК довжиною 1000-2000
нуклеотидів - фрагмент Оказакі. Причому синтез відбувається у протилежному
напрямку порівняно із синтезом на лідируючому ланцюгу. Тому далі праймосома
дає «хід назад» і переміщується на більш значну відстань від кінця матричного
ланцюга. У новому сайті відстаючого ланцюга також синтезується праймер, від
якого ДНК-полімераза ПІ знову розпочинає синтез ДНК-фрагмента Оказакі.
 89

Із просуванням реплікативної вилки все далі від кінця ланцюга

утворюються праймери і фрагменти Оказакі. У результаті дочірній ланцюг стає
фрагментарним 1 складається із коротких РНК-праймерів і ділянок ДНК
довжиною у 1000-2000 нуклеотидів (фрагментів Оказакі). У перекладанні всього
ланцюга «на мову ДНК» важливу роль відіграє ДНК-полімераза I, ska 3a
допомогою своєї 3-екзонуклеазної активності гідролізує РНК-праймери, а за
участю полімеразної активності забудовує утворені виломи в синтезованому
ланцюзі дезоксирибонуклеотидами. Усі фрагменти ДНК зшиваються між собою
за допомогою лігази.
Як уже було зазначено, матричні ланцюги ДНК антипаралельні, тому синтез
дочірніх ланцюгів здійснюється у різних просторових напрямках. Однак усі
ферменти, що входять до складу реплікативної вилки, рухаються синхронно в
напрямку розведення матричних ланцюгів. Виявилось, що це можливо завдяки
утворенню на відстаючому матричному ланцюгу петлі (у місці розташування
ферментів), яка ковзає в напрямку пересування реплікативної вилки вздовж ДНК.
Проблема антипаралельності ланцюгів вирішується завдяки повороту
послідовності ДНК у петлі на 1807. Петлю утримує так званий ковзаючий
затискач, здатний переміщуватись уздовж ДНК услід за петлею (рис. 6.4).
Відстаючий ланцюг
ДНК -лігаза

РНК-аза Н (екзонуклеаза)
= - м .
Зростаючий У РНК -полімераза, що синтезує затравки
фрагмент ПРАЦЯ

7 Димер основної ДНК -полімерази

- "Ковзаючий затискач"
Лідируючий
ланцюг ДНК
Рис. 6.4. Формування петлі на відстаючому ланцюгу ДНК
Примітка: утворення петлі на відстаючому ланцюгу забезпечує з можливість / проходження
скоординованого синтезу ДНК на обох матричних ланцюгах в одному просторовому напрямку.

Розглянута вище просторова проблема, що виникає через протилежну

спрямованість синтезу на відстаючому ланцюзі відносно напрямку просування
реплікативної вилки, не єдина. Перед реплікативною вилкою, що рухається
вздовж матричних ланцюгів, відбувається крутіння молекули ДНК зі швидкістю
близько 6 тис. об/хв, у результаті чого в молекулі утворюються сплутані петлі. У
їх розплутуванні важливу роль відіграють топоізомерази.
Термінація - заключна стадія реплікації. Специфічні послідовності в ДНК,
що слугують сигналами для термінації, поки що не відомі. У клітині кишкової
палички реплікація кільцевої хромомоми відбувається як двоспрямований процес.
Синтез ДНК розпочинається в огі С з утворення двох реплікативних вилок, які
рухаються по матричних ланцюгах у двох взаємно протилежних напрямках
 90

до термінус-центру (тегтіпиз С), де процес 1 закінчується. Реплікативні вилки, що

рухаються назустріч, у термінус-центрі ніби «збивають» одна одну з матриці.
Таким мчином відбувається термінація реплікації не тільки бактеріальних
хромосом, але і більшості великих малокопійних плазмід.
У випадку односпрямованої реплікації, характерної для маленьких
мультикопійних плазмід 1 деяких вірусів, процес починається та закінчується в
огі С. Реплікативна вилка просувається по матричних ланцюгах як по кільцю, і в
результаті кожного циклу реплікації утворюється одна нова молекула ДНК.
Процесинг. Відразу після реплікації в дочірніх ланцюгах ДНК у сайтах
рестрикції відбувається процесинг, а саме - метилювання аденіну, гуаніну та
цитозину. Це надзвичайно важливо для мічення власної ДНК і запобігання
розрізання ДНК у цих сайтах власними рестриктазами (ендонуклеазами). Сама по
собі система рестрикції-модифікації потрібна для спрямованого знищення
чужорідної ДНК (наприклад, вірусної), яка може потрапляти до клітини ззовні.
Розходження хромосом перед поділом клітини. Кожна з двох утворених у
процесі реплікації хромосом складається з одного материнського та одного
дочірнього ланцюга, що характерно для напівконсервативного процесу реплікації.
Як уже було зазначено, перед початком реплікації бактеріальна кільцева
хромосома прикріплюється до виросту цитоплазматичної мембрани, але завдяки
дії топоізомерази І у двох місцях по боках від оріджин-центру утворюються
одноланцюгові розриви, які сприяють розходженню матричних ланцюгів і
утворенню реплікативних вилок. Дещо пізніше утворені вільні кінці молекули
ДНК приєднуються до додатково утвореного виросту цитоплазматичної
мембрани. Між первинним виростом ЦІМ і новоутвореним відбувається
локальний синтез мембрани, за рахунок чого після реплікації 2 нові молекули
ДНК розходяться до полюсів клітини. Цей процес проходить із деякими
труднощами, оскільки хромосоми виявляються зчепленими одна з одною і
утворюють так звані катенани (або катемери), які нагадують весільні обручки,
але не з одним, а декількома ділянками зчеплень. У їх роз'єднанні важливу роль
відіграють топоізомерази, і перш за все гіраза. Після розходження хромосом між
двома молекулами ДНК формується міжклітинна перегородка i процес
завершується утворенням двох дочірніх клітин.
6.4. Особливості реплікації в еукаріотів
Особливості реплікації в еукаріотів пов'язані з нуклеосомною будовою
хромосом. ДНК намотується на частинки нуклеосом, що утруднює розходження
ланцюгів ДНК перед реплікацією. Перед реплікативною вилкою, яка рухається
вздовж матричних ланцюгів, нуклеосоми розпадаються. На міжнуклеосомних
ділянках ДНК, які мають довжину приблизно 200 нуклеотидів, розпочинається
реплікація. Саме тому фрагменти Оказакі в еукаріотів значно менші, ніж у
прокаріотів, і містять зазвичай 200-300 нуклеотидів. У зв'язку з нуклеосомною
будовою хромосом в еукаріотів значно менша і швидкість синтезу ДНК (50-100
нуклеотидів у секунду) порівняно з прокаріотами. Після завершення реплікації на
певній ділянці ДНК матричний і дочірній ланцюги спіралізуються. На відстані
 91

200-400 нуклеотидів від реплікативної вилки на них утворюються нові

нуклеосоми шляхом агрегації білків-гістонів.
В еукаріотів реплікація відбувається у двох взаємопротилежних напрямках.
У кожній лінійній хромосомі еукаріотів існує багато стартових точок початку
реплікації і відповідно до цього утворюється багато репліконів. Так, у дріжджів
виявлено до 500, у дрозофіли - близько 3500, а в ссавців до 20-30 тис. репліконів.
Для порівняння слід згадати, що у прокаріотів уся кільцева хромосома являє
собою І реплікон.
Реплікативні

Рис. 6.5. Реплікація ДНК еукаріотичної хромосоми

Примітка: зображено один із багатьох репліконів, реплікативні вилки рухаються у
протилежних напрямках від двох сусідніх стартових точок початку реплікації.

Синтез ДНК лінійних еукаріотичних хромосом починається з утворення в

стартових точках У-подібних реплікативних вилок, які рухаються назустріч одна
одній, поки не буде повністю синтезовано дочірній ланцюг на матричній ДНК.
Після цього вилки «збивають» одна одну, тобто реплікативні ферменти
від'єднуються від матричного ланцюга. Реплікація лінійних хромосом еукаріотів
може починатися з різних стартових точок не синхронно, але поки не буде
реплікована вся хромосомна ДНК, клітина не вступить у стадію мітотичного
поділу.

6.5. Типи реплікації

Реплікація в більшості досліджених на даний момент організмів
відбувається за описаним вище напівконсервативним механізмом. Однак аналіз
механізму реплікації в організмів різних систематичних груп виявив деякі
відмінності, пов'язані із різною формою хромосом, - лінійною або кільцевою,
одно- або дволанцюговою. Розрізняють 3 основні типи реплікації: У-тип (ігрек-
тип), 9-тип (тета-тип), с-тип (сигма-тип). Дані назви було запропоновано для
позначення різних типів реплікації у зв'язку з тим, що при електронно-
мікроскопічному дослідженні ДНК у фазі реплікації нагадувала за формою літери
грецького алфавіту.
О-тип реплікації характерний для кільцевих хромосом бактерій, плазмід,
фага 2 та інших вірусів із ДНК, замкненою у кільце. Такий тип реплікації
 92

супроводжується локальним розходженням ланцюгів ДНК в огі С 1 нагадує

грецьку літеру «ОД», тому й отримав відповідну назву 9-тип.
У-тип реплікації характерний для лінійних хромосом еукаріотів і деяких
вірусів із лінійними молекулами ДНК у геномі, оскільки в них реплікативна вилка
нагадує літеру «У». Слід зауважити, що принципово У-тип реплікації майже не
відрізняється від 9-типу за винятком самої форми хромосоми. У-подібні вилки
зазвичай виявляють на кінцях лінійних хромосом. Усередині хромосом
реплікаційно активні фрагменти ДНК нагадують бульбашки через локальне
розведення двох комплементарних матричних ланцюгів.
С-тип реплікації притаманний вірусам із геномом із одноланцюгової ДНК
і нагадує кільце, що котиться, або рулон, який розгортається. Реплікація
розпочинається з утворення розриву в одному з ланцюгів ДНК, завдяки чому
вивільнений 3/'-кінець стає 3aTpaBKOIO, a
: il: збережений кільцевий ланцюг - матрицею для
"ри зо подальшого синтезу розірваного ланцюга. При
з цьому матрична ДНК нагадує кільце, яке
* крутиться, а навколо HbOrO синтезується
гине 5 дочірній ланцюг. У той час коли 3'-кінець
продовжує подовжуватись, 5'-кінець того
самого ланцюга все далі «ВіДХОДИТЬ» Ввід
матриці, у результаті чого формується «хвіст»
молекули, який усе більше звільнюється.
Рис. 6.6. б-тип реплікації в бактеріофага ФХ174

Уже сформований дочірній ланцюг може містити декілька тандемно

з'єднаних копій генома вірусу, які пізніше «розрізає» спеціальний фермент.
Окремі геномні копії вірусу поміщаються в капсид. Такий тип синтезу ДНК
виявлено в бактеріофага ФХ 174 (рис. 6.6).
б-тип реплікації із деякими особливостями виявляють і в ДНК хлоропластів
рослин, що може свідчити про вірусне походження цих органел.
Реплікація ДНК у мітохондріях відбувається особливим способом із
утворенням Д-петлі (від англ. Діхзріасетепі -- витіснення). Спочатку на окремому
фрагменті першого матричного ланцюга мітохондріальної ДНК (мтДНК) із точки
ініціації 1 починається (за годинниковою стрілкою) синтез лідируючого
дочірнього ланцюга, що витісняє другий матричний ланцюг (рис. 6.7). У
результаті утворюється ЮЩ-петля, яка в процесі реплікації збільшується через
розведення матричних ланцюгів. Д-петля - триланцюгова структура ДНК із
вільним 3'-кінцем, що може бути використаний як затравка і подовжуватись
ДНК-полімеразою.
Синтез дочірнього лідируючого ланцюга відбувається не до кінця, а після
досягнення другої точки ініціації 5 на відтісненому матричному ланцюзі у
зворотному напрямку (проти годинникової стрілки) розпочинається синтез
другого дочірнього ланцюга мтДНК.
 93

6.7. Реплікація мітохондріальної AHK

із утворенням Д-петлі:
І - точка ініціації реплікації лідируючого
ланцюга; 2 - подвоєний фрагмент мтДНК; 3 - р-
петля; 4 - витіснений другий матричний ланцюг; 5 -
точка реплікації відстаючого з ланцюга ДНК
(стрілками показано напрямки реплікації дочірніх
ланцюгів)

Таким чином, у складі Д-петлі одна частина

мітохондріальної ДНК подвоюється відразу,
а інша залишається неподвоєною. Добудова фрагментів відбувається вже після
розходження двох дочірніх молекул мтДНК.
6.6. Проблема реплікації кінців лінійних молекул ДНК. Теломераза
На проблему реплікації кінців лінійних хромосом уперше звернув увагу
Джеймс Уотсон, який ще в 1972 р. відмітив, що ДНК-полімераза, яка здійснює
реплікацію ДНК, не може самостійно почати зчитування з матриці, тобто
розпочати синтез де поуо (наново, із «пустого місця»). Спочатку ДНК-полімеразі
необхідно прикріпитися до затравочного олігонуклеотидного РНК-фрагмента. Як
було зазначено раніше (див. Стадії реплікації), затравками для початку синтезу
дочірніх ланцюгів ДНК стають невеликі ланцюжки РНК, які синтезуються на
матричних ланцюгах ДНК за допомогою РНК-полімераз. Для цих ферментів
затравки не потрібні. Після закінчення реплікації лінійних хромосом еукаріотів на
5 -кінцях дочірніх ланцюгів відбувається гідроліз РНК-транскриптів (затравок), у
результаті чого дочірні ланцюги вкорочуються на декілька десятків нуклеотидів
порівняно із 3-кінцями матричних материнських ланцюгів. Після декількох
наступних актів реплікації виникає проблема значного вкорочення хромосом у
цілому.
Щоб вкорочення ланцюга ДНК хромосоми не було летальним для клітини,
на кінцях хромосом є некодуючі фрагменти ДНК - теломери, які складаються із
тисяч повторів блоку нуклеотидів Т/АССС. Слід зауважити, що нуклеотидний
склад теломер однаковий у більшості організмів (усіх ссавців, грибів, трипаносом,
цвільового гриба ЖМеигозрога), але було виявлено й інші подібні послідовності.
Так, у рослин блок ТТАССС збільшений на один нуклеотид і являє собою
послідовність ТТТАССС. Цікаво, що теломери інфузорії, у яких уперше було
виділено теломеразу, відрізняються складом теломерних блоків, вони мають
інший «текст»: ТТТТСССС або ТТСССС. Цей факт свідчить про те, що, імовірно,
інфузоріїї - представники живих викопних організмів, утворені безпосередньо
від загального предка всіх живих організмів.
Після кожного акту реплікації довжина теломер зменшується. Оскільки
теломери не кодують жодних білкових продуктів, то до певного часу їх
вкорочення ніяк не позначається на метаболічних властивостях клітини. Але
 94
після сотні актів реплікації та розподілів клітини хромосоми стають такими
короткими, що під загрозу знищення потрапляють послідовності важливих генів.
У середньому теломери зменшуються на 31 нуклеотид за рік, але в клітинах
тканин із високою швидкістю ділення вони «згорають» значно швидше. Це і
спричиняє старіння та відмирання клітин у певному віці. У людини у віці 80 років
на кінцях хромосом залишається в середньому 5/8 частини теломери. Проте було
знайдено фермент теломеразу, здатний відновлювати теломери.
Теломеразу вперше відкрили у 1984 р. Керол Грейдер й Елізабет Блекберн.
Цей фермент містить молекулу РНК, яка застосовується як матриця для
копіювання теломерів, а його білкова частина дуже нагадує зворотну
транскриптазу ретровірусів, що здійснює копіювання вірусної РНК із утворенням
ДНК-копії. Деякі вчені розглядають теломеразу як релікт РНК-ї епохи життя на
Землі, тобто як прототип першого організму, основою якого був комплекс
молекули РНК і білка.
У 1998 р. у журналі «Наука» («5Зсіеєпсе») Джері Шей опублікував статтю про
відкриття ферменту теломерази, здатного подовжувати вкорочені ланцюги ДНК,
тобто синтезувати теломери - кінці хромосом, які складаються з повторюваних
блоків ТТАССС (іноді ТТСССС).
В організмі людини гени теломерази блоковані у всіх тканинах, за
винятком стовбурових, ембріональних і репродуктивних клітин (яйцеклітин і
сперматозоїдів), де гени теломерази активно функціонують.
У ракових клітинах гени теломерази включаються повторно і за рахунок
активності теломерази забезпечується їх потенційне безсмертя.
У статевих клітинах фермент забезпечує саму можливість їх нормального
розвитку. Достатньо 50 циклів поділу клітин, щоб запліднена яйцеклітина
перетворилася на організм. Весь цей період у клітинах організму, який
розвивається, теломераза перебуває в активному стані, а потім відбувається
блокування експресії гена, що її кодує.
Дія теломерази у стовбурових клітинах - основа для поновлення клітин
крові, епітелію та регенерації тканин. Деякі клітини організму продовжують
ділитися протягом усього життя, забезпечуючи регенерацію шкіри та органів у
дорослої людини. Такі клітини проходять понад сотню циклів ділення, а потім
відмирають. У соматичних клітинах, не призначених для постійного поновлення,
із кожним актом реплікації та ділення теломери зменшуються приблизно на 50
нуклеотидів, оскільки теломераза в них заблокована. Тому приблизно через 50
ділень клітина гине. Таким чином, термін активного функціонування теломерази
в еукаріотів визначає тривалість життя окремих клітин і організму в цілому.
Фермент теломераза за хімічним складом являє собою нуклеопротеїд, що
складається з білкової глобули і фрагмента РНК (у людини довжиною 450
нуклеотидів). Причому набір нуклеотидів у цій РНК не випадковий, а складається
із повторюваних блоків - комплементарних блокам теломерних ділянок
хромосом.
Механізм дії теломерази. Для подовження вкорочених кінців хромосом
теломераза приєднується з до теломерної ділянки виступаючого 3"-кінця
 95

материнського ланцюга і ще більше подовжує його, використовуючи власну РНК

як матрицю для синтезу. Після цього фермент починає рухатись у протилежному
напрямку і синтезувати відсутній фрагмент вкороченого дочірнього ланцюга,
використовуючи як матрицю щойно подовжений ланцюг, а як затравку - власну
РНК. Таким чином відбувається додаткова репаративна реплікація з добудовою
вкороченого 5/-кінця (рис. 6.8).

Теломераза, що Теломера , 5 Теломерна ДНК

нарощує теломерну і, будується нуклеотил
нуклед ом
днк
- COTAChGAACGGGGTTGG
Ї сбатолето ,C§ECCAACEEEAACCE Eg
GGtTagay
a f 34m) THA
——= і
‘ ста
й РН .
' « Білок ecccaa РМІРриця
im, sh BD) ee PHK A
- Ж КУ)
рю» ‘ В чі
о oh ha] Теломераза- фермент, шо
aD р і ВІ складається з білка та РНК.
І ASEM ne і fey РНК слугує матрицею для
- - синтезу теломер
Без теломерази хромосоми Теломераза відновлює довжину
скорочуються після кож- теломері, тим самим, забезпечує
ного клітинного циклу зберігання генетичної інформації

Рис. 6.8. Механізм дії теломерази

Існує припущення, що теломерази походять від зворотних транскриптаз
ретровірусів. У людини ген теломерази розташований у 14-й хромосомі й отримав
назву ТЕР, (від англ. Кіг5ї геЇотега5е-аззосіатед ргогеіп - перший теломеразний
білок). Однак передбачається, що в синтезі теломерази беруть участь ще Й інші
гени. Так, у результаті дослідження геномів людей у віці понад 100 років у
Франції було виявлено три версії гена на хромосомі 6, які суттєво відрізняються в
довгожителів, причому один варіант гена характерний для чоловіків, а інший -
для жінок. Очевидно, що процес старіння контролюють декілька, а можливо, і
багато генів. Джордж Мартін підрахував, що на процес старіння впливають
близько 7000 генів, що становить приблизно 10 90 від загальної кількості генів у
геномі людини. Гени теломерази отримали назву «генів молодості». Іноді їх
називають «біологічним годинником» організму. У 1997 р. компанія «Сегоп
согрогайоп», заснована Колом Харлі для вивчення теломерази, сповістила світ про
клонування генів теломерази для отримання препаратів цього ферменту.
Відсутність теломерази - основна причина, що призводить до вмирання клітин.
Тому інтерес до теломерази перш за все пов'язаний із пошуком засобу для
боротьби зі старінням.
У клітинах, де гени теломерази постійно перебувають в активному стані,
вкорочені кінці хромосом після кожного акту реплікації відновлюються за участю
самої теломерази. Цікаво, що в мікроорганізмів гени теломерази не виключаються
ніколи, тому вони можуть ділитися нескінченно. Деякі вчені вважають, що кожен
вид організмів має свою програму старіння, реалізація якої залежить від довжини
 96

теломерів на кінцях хромосом 1 тривалості репродуктивного періоду, після якого

починається поступове старіння. Причому старіння в різних тканинах
відбувається нерівномірно. Так, постійний поділ клітин у стінках артерій
призводить до швидкого вкорочення довжини теломерів і старіння клітин. Мабуть
тому проблеми з артеріями починаються раніше і зустрічаються частіше, ніж із
венами. Довжина теломерів на хромосомах людини дозволяє розраховувати на
тривалість життя у межах 75-90 років. Було доведено, що кількість блоків
ТТАССС у теломерах хромосом різних людей може коливатися у межах 7-10 тис,
причому довжина теломерів успадковується. Імовірно, саме цим можна пояснити
факти довголіття членів окремих родин і представників деяких народів. Однак не
все визначають гени. Хворому організму довгі теломери не допоможуть. Вони
будуть швидше скорочуватись, оскільки для регенерації ушкоджених тканин
необхідний інтенсивніший поділ клітин.
Експерименти, проведені дослідниками «Сегоп corporation»,
продемонстрували, що введення генів теломерази в культури клітин, де такі гени
були відсутні, сприяло значному збільшенню строку їх життя за рахунок
нескінченого ділення. За період спостереження строк життя клітин із активною
теломеразою перевищив нормальний показник у 20 раз, причому клітини
залишалися молодими.
Ще до відкриття теломерази | в - багатьох лабораторіях почали
використовувати безсмертні лінії клітин людини і тварин. Найвідоміша у світі -
лінія Неїа, виділена з пухлини чорношкірої жінки Генрієтти Лекс (Henrietta
Lacks), aka вмерла в 1951 р. Її ракові клітини так швидко розмножуються, що
часто навіть забруднюють інші лабораторні зразки 1 пригнічують ріст інших
культур у чашках Петрі. Клітини HeLa використовували для створення вакцин,
вони побували у космосі. Сумарна кількість клітин Неї! а в усіх лабораторіях світу
вже перевищила у 400 раз вагу тіла самої Генрієтти Лекс. Ці клітини бессмертні.
Вони мають на своїх хромосомах теломери, які ніколи не зменшуються. Проте,
коли в них експериментально заблокували теломеразу шляхом додавання РНК,
комплементарної до РНК-фрагмента самої теломерази, клітини Не!а втратили
своє безсмертя. Вони старіли та вмирали приблизно після 25-го поділу. Було
зазначено, що пухлинне переродження більш характерне для тканин, у яких поділ
клітин відбувається частіше, а саме для шкіри, придаткових залоз чоловіків,
легень, хребта, шлунку, лімфоцитів крові.
Вивчення теломерази надзвичайно важливе для вирішення проблем
геронтології, а саме сповільнення старіння і подовження життя людей, а також
дуже значуще для вирішення проблеми раку.
Експериментально було доведено, що термін життя тварин, у клітини яких
було введено ген теломерази, збільшувався на 40 У. Однак без встановлення
факторів, що регулюють синтез і активність теломерази, її використання може
призвести до злоякісного переродження клітин. І навпаки, виявлення інгібіторів
теломерази 1 репресорів її синтезу може надати онкологам дієву зброю для
боротьби з раком.
 97

Розділ 7. ТРАНСКРИПЦІЯ ЯК МЕХАНІЗМ РЕАЛІЗАЦІЇ

ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ
(ПЕРШИЙ ЕТАП ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ)
Реалізацію генетичної інформації, закодованої в послідовностях генів на
ДНК, ще називають експресією генів. Це складний процес вираження інформації
генів у відповідних молекулах білків - як структурних, так і ферментативних, що
забезпечують безліч метаболічних реакцій. Проте не всі гени кодують білки.
Частина генів кодує різноманітні молекули РНК - тРНК, рРНК, мяРНК, міРНК
та ін. Синтез інших біополімерів - вуглеводів, ліпідів, складних біополімерних
сполук, що власне і визначають унікальність кожного виду живих істот, суттєво
відрізняється від біосинтезу нуклеїнових кислот. Їх структура не закодована
безпосередньо в ДНК, але гени кодують ферменти ліпідного та вуглеводного
метаболізму, які саме і забезпечують можливість синтезу специфічних
біополімерів організму із мономерів, що організм отримує в результаті
розщеплення поживних речовин.
Під час синтезу білків експресія генів проходить у два основні етапи, що
отримали назву транскрипції і трансляції. Транскрипція - це перший етап
експресії генів, у процесі якого генетична інформація переписується з молекули
ДНК на молекулу-посередник ІРНК (інформаційну або матричну РНК). На
другому етапі відбувається трансляція, суть якої полягає в переведенні
інформації вже з молекули ІРНК на молекулу білка. Зауважимо, що для експресії
генів, які кодують молекули РНК, достатньо одного етапу - транскрипції для
утворення кінцевих продуктів.
Переклад генетичної інформації з мови нуклеотидів на мову амінокислот
відбувається згідно з генетичним кодом, а саме кожній амінокислоті в молекулі
білка відповідає певний триплет -- трійка нуклеотидів у молекулі ДНК і
відповідній ІРНК. З огляду на кодуючу функцію триплети ще називають
кодонами. Обидва процеси - і транскрипція, і трансляція відбуваються за типом
матричного синтезу, характерного також для реплікації, репарації, транспозиції
та зворотної транскрипції.
Транскрипція -- це біосинтез молекули ІРНК на матричному ланцюгу ДНК
у межах ділянки відповідного гена. Процес транскрипції ще описують як
«зчитування» або «копіювання» генетичної інформації з молекули ДНК на ІРНК.
Матричний синтез ІРНК (синтез із використанням матриці, шаблону ДНК)
здійснює ДНК-залежна РНК-полімераза. Цей фермент «знаходить» на ДНК
стартову ділянку (ділянка початку транскрипції), приєднується до неї, розплітає
подвійний ланцюг ДНК і починає синтез одноланцюгової ІРНК. До матричного
ланцюга ДНК надходять рибонуклеотиди, які під дією РНК-полімерази
починають за принципом комплементарності послідовно приєднуватись до
матриці і зшиватися один з одним з утворенням фосфодіефірних зв'язків. Із
просуванням РНК-полімерази по матричному ланцюгу полінуклеотидний ланцюг
ЇРНК збільшується і його 5'-кінець відділяється від матриці. Готова ІРНК сходить
з ДНК і прямує до місця синтезу білків.
 98

7.41. Види РІНК-полімераз

Отже, як уже було зазначено, транскрипція - це ферментативний процес,

забезпечуваний РНК-полімеразами. Більшість із них і в прокаріотів, і в
еукаріотів є ДНК-залежними і здійснюють пряму транскрипцію, а саме
синтезують копію РНК на матриці ДНК. Проте у ретровірусів, до яких належать
онковіруси і ВІЛ, було виявлено особливий фермент - ревертазу, здатний
переписувати інформацію з молекули вірусної РНК на молекулу ДНК. Така ДНК
копія вірусу може легко інтегруватись у геном клітини хазяїна. У даному випадку
має місце зворотна транскрипція, тому ревертаза отримала ще одну назву -
зворотна транскриптаза (або РНК-залежна ДНК-полімераза). Відповідно до
субодиничного складу РНК-полімерази поділяють на дві групи:
1) ферменти, що складаються тільки з однієї субодиниці, серед
них - РНК-полімерази мітохондрій і бактеріофагів, які транскрибують невелику
кількість генів простих геномів; для їх функціонування не потрібно складних
регуляторних механізмів;
2) складні за будовою РНК-полімерази бактерій і еукаріотів, які є
полісубодиничні білкові комплекси, що транскрибують сотні й тисячі різних
генів. Такі ферменти під час свого функціонування реагують на численні
регуляторні сигнали, що надходять від регуляторних послідовностей нуклеотидів
і білкових факторів.
За останнє десятиріччя був накопичений великий обсяг інформації про
склад і функції РНК-полімераз організмів різних царств і таксонів.
РНК-полімерази прокаріотів. У прокаріотів синтез ІРНК, рРНК і тРНК
здійснює одна 1 та сама РІНК-полімераза. Розглянемо особливості структури
цього ферменту на прикладі бактерії АЕ.сої/ї. Загальна кількість молекул
РНК-полімерази в клітинах Е.соїї може сягати 7000. Залежно від конкретних умов
росту бактеріальних клітин у синтезі РНК може брати участь одночасно від 2000
до 5000 молекул ферменту.
Субодинична структура даного ферменту аналогічна структурі
РНК-полімераз інших видів бактерій. Повний фермент (холофермент) має
молекулярну масу - 480 кДа і складається із 5 субодиниць та с-фактора (рис. 7.1).
a-NTD

Puce. 7.1. Схеми будови РНК-полімерази прокаріотів

Примітка: СТР та МТО (від англ. С-іегтіпа! дотеп М-гегтіпа! дотеп) - С- та М-кінцеві
домени субодиниць.
 99

Холофермент містить дві а-субодиниці (по 36,5 кДа кожна), одну

В-субодиницю (150 кДа), одну В'-субодиницю (155 кДа), одну о-субодиницю
(11 кДа) ії фактор с (35 кДа). Він має витягнуту форму і його максимальні
розміри становлять 15 нм.
Дві а-субодиниці зв'язують інші елементи ферменту й розпізнають
регулюючі чинники. В-Субодиниця має власне полімеразну дію і каталізує синтез
РНК, вона ініціює процес і керує елонгацією. В'-Субодиниця неспецифічно
зв'язується з ДНК, а о«-субодиниця, за даними іп уйго, надає денатурованій
РНК-полімеразі дієздатної форми.
Холофермент можна розділити біохімічними методами на мінімальний
фермент (аафВ'оз) або кор-фермент та с-фактор. Тільки повний фермент може
ініціювати транскрипцію, фактор - виходить із комплексу і власне елонгація
відбувається за участю кор-ферменту. Таким чином, мінімальний фермент тільки
створює фосфодіефірні зв'язки між рибонуклеотидами із використанням ДНК
матриці, але він не може ініціювати сам процес транскрипції.
Основна функція с-фактора полягає в забезпеченні стабільного зв'язування
РНК-полімерази з промотором гена, а не з випадковою ділянкою ДНК.
Мінімальний фермент сам по собі також споріднений із ДНК за рахунок
електростатичної взаємодії між позитивно зарядженими групами білка-ферменту
та негативно зарядженими групами ДНК.
Випадкову ділянку, із якою може зв'язатися мінімальний фермент
РНК-полімерази, називають слабкою ділянкою зв'язування. Сигма-фактор
принципово змінює характер взаємодії РНК-полімерази із ДНК, завдяки чому в
холоферменту різко знижується (у 10 000 раз) спорідненість до слабких ділянок
зв'язування. Отже, с-фактор контролює здатність ферменту зв'язуватися з
випадковими ділянками ДНК, і комплекси ДНК-ферменту, що утворюються при
цьому, стають надзвичайно короткоіснуючими. Період їх напівжиття - менше
І секунди.
У той же час с-фактор надає ферменту здатність упізнавати в молекулі ДНК
специфічні ділянки взаємодій, тобто промотори - регуляторні ділянки генів.
Холофермент дуже міцно зв'язується з промотором - період напівжиття
створеного комплексу триває декілька годин. Насправді є суттєві відмінності у
швидкості та міцності взаємодії холоферменту з різними промоторами, що має
важливе значення для ініціації транскрипції саме з певного промотору.
Взаємодія холоферменту з промотором починається з утворення подвійного
закритого комплексу, який потім переходить у подвійний відкритий комплекс.
Зауважимо, що розходження двох ланцюгів ДНК у межах промотору й ініціація
транскрипції відбуваються легше за наявності негативної суперспіралізації в
молекулі ДНК. Особливості типів взаємодії із ДНК кор-ферменту і холоферменту
вказують на те, що РНК-полімераза знаходить промотори методом «спроб і
помилок». Будь-який непрацюючий на даний момент кор-фермент має вигляд
закритого слабкого комплексу. Холофермент дуже швидко зв'язується з
ділянками слабкої взаємодії і також швидко відокремлюється від них. Таким
 100

чином, просуваючись по молекулі ДНК, холофермент утворює слабкі комплекси з

випадковими ділянками до тих пір, поки не натрапить на промотор.
Після утворення подвійного відкритого комплексу відбувається включення
двох перших нуклеотидів з утворенням фосфодіефірного зв'язку між ними. У
результаті формується потрійний комплекс, що включає мінімальний фермент,
ДНК і РНК, що синтезується. На цій стадії ос-фактор відділяється від
РНК-полімерази. Мінімальний фермент у складі потрійного комплексу
характеризується тісною взаємодією з ДНК, і його висока спорідненість тільки
збільшується в присутності новосинтезованих РНК. Коли ж транскрипція
закінчується, кор-фермент відділяється від ДНК у вигляді вільного білкового
тетрамеру («аВВ"?, який потім повинен знайти інший с-фактор і включитися у
наступний цикл транскрипції.
Отже, с-фактор виконує такі функції:
1) активує впізнавання промоторних послідовностей РНК-полімеразою;
2)забезпечує специфічну ініціацію транскрипції в промоторі, знижуючи в
10 000 раз спорідненість РНК-полімерази із випадковими ділянками;
3) бере участь у розкритті подвійної спіралі ДНК так, щоб один із ланцюгів міг
слугувати матрицею.
Таким чином, функція холоферменту полягає в пошуку промотору й ініціації
транскрипції, а функція кор-ферменту - у здійсненні елонгації.
Є дані про те, що здатність РНК-полімерази до впізнання промотору може
змінюватися в разі зв'язування з різними с-субодиницями. Наприклад, після
інфікування клітин Васій/из 5ибіїйіз певними бактеріофагами або на ранніх стадіях
споруляції експресуються різні с-фактори і в результаті змінюється порядок
транскрипції клітинних і фагових генів. Чи використовують РНК-полімерази
інших прокаріотів різні с-фактори для регуляції промоторної специфічності поки
що невідомо.
РНК-полімерази еукаріотів. У еукаріотів виявлено | РНК-полімерази
трьох основних типів: РНК-полімераза І, РНК-полімераза П, РНК-полімераза Ш.
РНК-полімераза І транскрибує гени класу І, що кодують послідовності
всіх рибосомних РНК (285 рРНК, 185 рРНК і 5,8 5 рРНК), крім 55 рРНК,
оскільки в більшості вищих еукаріотів гени 55 рРНК розташовані поза межами
кластерів генів інших рРНК. У дріжджів ген 55 рРНК перебуває усередині таких
кластерів, але з протилежною орієнтацією нуклеотидів у ДНК. РНК-полімераза І
забезпечує транскрипцію передрибосомних РНК - молекул-попередниць, які в
результаті обмеженого сплайсингу (вирізання інтронів) перетворюються на зрілі
молекули РНК.
РНК-полімераза П транскрибує гени класу П, що кодують білки. Тобто
продуктами РНК-полімерази П гетерогенні ядерні РНК - гяРНК (інформаційні
ядерні РНК). Із трьох РНК-полімераз цей фермент найчутливіший до регуляції.
Однією з особливостей будови найбільшої субодиниці РНК-полімерази П є її
С-кінцевий домен (СТГ), утворений повторами гептамерів. Послідовне
скорочення С-кінцевого домену призводить до загибелі клітини.
 101

РНК-полімераза ПІ транскрибує гени класу ПІ, тобто синтезує транспортні

РНК - тРНК, а також рибосомну 55 рРНК.
На даний час найбільш вивченими щодо біохімії та генетики є
РНК-полімерази | І-ПІ дріжджів Saccharomyces cerevisiae. BusaBneHo, що
РНК-полімераза І 5.сегеуізіає складається з 14, РНК-полімераза П - із 12, а
РНК-полімераза ПІ - 13 17 субодиниць. Серед компонентів усіх цих ядерних
ферментів можна виділити дві найбільші субодиниці, гомологічні субодиницям В"
if бактеріальної РНК-полімерази, два компоненти, споріднені із бактеріальною
субодиницею а, а також білок, аналогічний субодиниці а. Крім цих субодиниць,
еквівалентних субодиницям кор-ферменту бактеріальної РНК-полімерази,
у складі РНК-полімераз І-ПІ є цілий набір білків, що не мають аналогів у
прокаріотів.
7.2. Фактори регуляції транскрипції
РНК-полімераза І. Промотор гена попередника рРНК складається з двох
ділянок: СРЕ (соге рготоїег еістепі) ії ЮСК (апр5ігеат сопіто! еЇетепі). З цими
ділянками зв'язуються білкові комплекси 581.1 (а сотріех ої ТВР (Мт 600075 Да)
and 3 TBP-associated factors or TAFs) i UBF (upstream binding factor) BiqnoBiqHo.
Крім двох основних факторів ініціації транскрипції РНК полімеразу І регулює ще
it 6in0K TTFI (transcription termination factor I), який здійснює також 1 термінацію
транскрипції.
РНК-полімераза І синтезує тільки один транскрипт. Тому їй не потрібна
складна ген-залежна регуляція. Проте транскрипційна активність РНК-полімерази
І залежить від фази клітинного циклу (інгібується під час мітозу) 1
проліферативної активності клітин (у разі посилення поділу клітин потрібно
багато рРНК). Інтенсивність транскрипції варіює залежно від концентрації
факторів, що сприяють ініціації. Активність факторів ініціації SLI i UBF
регулюється залежно від фази клітинного циклу. Білок ТТЕЇ сприяє пересуванню
нуклеосом (елементарних одиниць упаковки хроматину) по ДНК таким чином,
щоб забезпечити ефективнішу транскрипцію РНК-полімеразою Ї.
РНК-полімераза П. Для правильної ініціації | транскрипції
РНК-полімеразою П у зоні взаємодії кор-ферменту та промоторної ділянки
повинні перебувати відповідні ініціаторні чинники, що називають TFII
(transcription Тасіогя П): ТЕПА, ТЕПВ, ТЕПО, ТЕПЕ, ТЕПЕ і ТЕПН. Серед них лише
ТЕПО здатний безпосередньо взаємодіяти із промоторною областю ДНК, інші
фактори утримуються в промоторній області за допомогою білок-білкових
взаємодій один із одним 1 з ТЕПІ.
Специфічне зв'язування ТЕПР із ДНК є початковий етап ініціації
транскрипції. | В основі | цього процесу - специфічна взаємодія
ТАТА-зв'язувального компонента ТЕПО (ТВР - ТАТА біпапе protein) із
відповідною ділянкою ДНК. Зв'язування ТВР із ТАТА-боксом запускає низку
процесів, що приводить до формування передініціаторного комплексу: із ТВР-
ТАТА комплексом зв'язується ініціаторний фактор ТЕПВ, із ТЕПВ -
передформований комплекс РНК-полімерази П з ініціаторним фактором ТЕПЕ.
 102

Вважають, що таким чином реалізується одна з функцій ТЕПВ, яка полягає в

дотриманні правильного положення полімерази щодо промотору. Із ТЕПЕ
зв'язується ініціаторний фактор ТЕПЕ, із ТЕПЕ - фактор ТЕПН. На цьому
формування передініціаторного комплексу завершується.
У передініціаторному комплексі ТЕШН проявляє кіназну активність -
фосфорилювання С-кінцевого домену великої субодиниці РНК-полімерази П.
Одночасно АТФ-залежна хеліказа розплітає подвійну спіраль ДНК у ділянці
старту транскрипції. Формується так званий «відкритий» комплекс. Полімераза
сходить із промотору і починає елонгацію. Після відходу полімерази ТЕПР
залишається пов'язаним із коровим елементом промотору протягом деякого часу i
може взяти участь у новому раунді ініціації. Після термінації транскрипції
спеціальна | фосфатаза | повертає велику субодиницю полімерази в
дефосфорилований стан. Таким чином відновлюється здатність полімерази
ініціювати транскрипцію.

Кодуючий ШПромоторна | Початок | ТЕШУ | РНК-полімераза П

ланцюг частина транскрипції комплекс Транскрипція
зак ee 5 одн ня ом У
Я ТАТА - З5пно |
TFIID 1 ТВР приєднуються Промотор
до ТАТА 1.Промотор РНК-полімерази П
5 з
ТАТА
a Pol|
a SLT М sul \ г
я UFBT UFBT
[en eo У
З x Елемент зовнє Центральний Гени
спрямованої промотор
3. ТАН, ТАПЕ, й Щ
TRIB ‘
як
SED
TFIIF, Polit —
4180 до -170
“Ss
ТЮ НЕ 2. Промотор РНК-полімерази І
5 з бінарний
4. сер) Polll Транскрипція
| (тРНК, 55 рРНК. міРНЮ)
ТНІН фосфорилює Pol I TF HIB,
т - ТЕША ТЕС ТЕШС
ane ранскрипція 5 = у
зо ЕНН ВИНИ у С в
Polli
0000 3. Промотори РНК-полімерази ШІ ;
а РНК полімераза П зовнішньо - та внутрішньоспрямовані

Рис. 7.2. Фактори регуляції транскрипції

На рис. 7.2 зображено ділянки зв'язування факторів регуляції транскрипції,

послідовність їх приєднання до ДНК і функції на різних етапах транскрипції.
РНК-полімераза ШІ. Ген 55 рРНК, який транскрибує РНК-полімераза ПІ,
містить внутрішній промотор, тобто всі області, необхідні й достатні для ініціації
транскрипції, розташовані всередині ділянок транскрибованих ДНК.
 103

ТЕША - специфічний транскрипційні фактор, взаємодіє із так званою

С-послідовністю усередині гена 55 рРНК. Зв'язування цього фактора, у свою
чергу, приводить до приєднання наступного білкового комплексу - ТЕНІС.
ТЕПІС також зв'язує А-послідовність ДНК, проте без ТЕША цієї ДНК-білкової
взаємодії недостатньо для ефективної транскрипції гена 55 рРНК. Після
приєднання фактора ТЕПІС із геном 55 реРНК зв'язується й фактор ТЕПВ. ТЕПІВ
фактор сприяє остаточному приєднанню РНК полімерази ПІ ії початку
транскрипції.
Повний набір генів РНК-полімерази ПІ у геномі людини до кінця не
вивчено. Також значний інтерес викликає саме регуляція РНК-полімерази ПІ. Уже
визначено 513 попередників генів, що кодують тРНК у подібних геномах, не
рахуючи псевдогени тРНК (усього 172), але їх функція в різних типах клітин
абсолютно невідома. Крім того, було виявлено, що високий рівень утворення
РНК-полімерази ШІ і запасів тРНК пов'язаний зі зростанням кількості ракових
клітин.
Очевидно, що для розуміння динаміки 1 регуляції РНК-полімерази ШІ у разі
розвитку різних захворювань, у тому числі раку, необхідне дослідження
РНК-полімерази в нормальному стані.
У результаті вивчення генів РНК-полімераз у дріжджів, безхребетних 1
хребетних виявлено фактори, необхідні для спрямування РНК-полімерази до
потрібних генів, а також визначено три типи генів РНК-полімерази ПІ в організмі
людини на основі: 1) наявності регуляторних елементів; 2) потреби в базових або
допоміжних факторах транскрипції. Тільки 55 рРНК, яка належить до 1-го типу,
однозначно потребує фактора ТЕША. Гени 2-го 1 3-го типів потребують фактор
ТЕПІС, тобто основний фактор транскрипції, який розпізнає А- і В-домени для
РНК-полімерази, але He потребує ТЕША. Фактор / ТЕПІВ включає
ТАТА-зв'язувальний білок (ТВР), необхідний для розпізнавання ТАТА-
послідовності. Для транскрипції генів 2-го і 3-го типів також придатні
альтернативні комплекси ТЕПІВ: ВЕКІ та ВВК2 відповідно. Промотор для РНК-
полімерази ПІ 3-го типу генів нагадує за будовою промотор для РНК-полімерази
П і не потребує ТЕПІС-фактора.
Перед розглядом етапів транскрипції необхідно проаналізувати деякі
особливості транскрипції генів еукаріотів. В основному механізми транскрипції в
еукаріотичних клітинах аналогічні добре дослідженій транскрипції прокаріотів.
Однак є і значні відмінності:
І. Транскрипція в еукаріотів відбувається в ядрі за участю трьох різних
РНК-полімераз. На відміну від прокаріотів, РНК-транскрипти в еукаріотів не
з'єднуються з рибосомами до завершення транскрипції. Трансляція (синтез білка)
на ІРНК відбувається після її виходу з ядра в цитоплазму клітини.
2. Жодна з РНК-полімераз еукаріотів не здатна самостійно зв'язуватися з
промоторами генів. Для приєднання до транскриптонів еукаріотів слугують
специфічні з для г кожної РНК-полімерази білкові з фактори транскрипції
(ТЕ-фактори). РНК-полімерази І, П і ПІ потребують участі факторів транскрипції
ТЕЇ, ТЕП, ТЕП відповідно.
 104

3. Первинний РНК-транскрипт зазнає процесингу або дозрівання: зазвичай

до 5"-кінця додається кеп (капелюх), до 3"-кінця - хвіст (полі-А-фрагмент), а
внутрішня послідовність РНК зазнає сплайсингу. Первинні транскрипти, перед-
МРНК, що є безпосередня копія всіх послідовностей ДНК (інтронів та екзонів),
набагато довші за зрілі МмРНК і локалізовані в ядрі клітини, утворюють групу
гетерогенних ядерних РНК (гяРНК). Їх укорочення відбувається за рахунок
вирізання (сплайсингу) некодуючих послідовностей (інтронів) і зшивання
смислових послідовностей (екзонів).
7.3. Етапи транскрипції
Механізм транскрипції, незважаючи на різницю у структурі РНК-полімераз
різних організмів, у прокаріотів та еукаріотів дуже подібний і відбувається за
єдиним планом. Той ланцюг ДНК, на якому відбувається транскрипція,
називають матричним, а протилежний ланцюг - смисловим, оскільки
послідовність нуклеотидів у ньому буде повністю збігатися з послідовністю
нуклеотидів у молекулі синтезованої ІРНК, за рідкісним винятком у молекулі РНК
замість тимідилових нуклеотидів будуть розміщені уридилові (рис. 7.3).
Смисловий ланцюг ще називають кодогенним, а матричний - антикодогенним.

ДНК 5 - АТСАТТССССТСТА - 3" смисловий ланцюг (кодогенний)

3" - ТАСТААССССАСАТ - 5" матричний ланцюг (антикодогенний)

Транскрипція
iPHK 5'’— AUGAUUGGGGUCUA- 3’

Рис. 7.3. Транскрипція - синтез РНК на матриці ДНК

Синтез РНК завжди відбувається в напрямку від 5" до 3"-кінця молекули, а з

урахуванням антипаралельності синтезу (як і під час реплікації) матричний
ланцюг, яким просувається РНК-полімераза, буде орієнтований у зворотному
напрямку - від З'до 5"-кінця (рис. 7.3).
Процес транскрипції для зручності опису механізмів біосинтезу РНК
умовно можна поділити на три основні етапи: ініціацію, елонгацію та термінацію
(рис. 7.4), хоча іноді виділяють стадію, що передує ініціації, - зв'язування
РНК-полімерази із ДНК. Ініціація - перший етап транскрипції, що включає
зв'язування РНК-полімерази із промотором і початок синтезу РНК, тобто
утворення фосфодіефірного зв'язку між першим аденіловим нуклеотидним
залишком і наступним нуклеотидом синтезованої молекули 1-РНК. Клонгація --
збільшення ланцюга РНК за рахунок послідовного приєднання нуклеотидів один
до одного в тому порядку, у якому розміщені комплементарні нуклеотиди в
матричному ланцюзі ДНК. Швидкість елонгації досягає 50 нуклеотидів за
 105

секунду. Термінація - це етап завершення синтезу ІРНК 1 відділення її від

матриці ДНК. Розглянемо ці етапи детальніше.
Ініціація. Цикл транскрипції починається з приєднання РНК-полімерази до
промотору - певної ділянки ДНК, із якої стартує синтез РНК.
У бактерій РНК-полімераза впізнає певну послідовність нуклеотидних пар у
складі промотору (див. розд. 4, підрозд. 4.3). У цьому впізнаванні бере участь
с-фактор. До нього потім приєднується кор-фермент, що являє собою тетрамер із
чотирьох субодиниць РНК-полімерази.
В еукаріотів завжди потрібне попереднє зв'язування з промотором цілої
сукупності білків — - загальних факторів транскрипції, які послідовно
приєднуються до ТАТА-послідовності промоторної області. Незважаючи на
індивідуальність набору регуляторних елементів у структурних генів еукаріотів,
кожен із них має:
1) промоторну ділянку із 5 нуклеотидів (ТАТА-бокс, або бокс Хогнеса);
2) послідовність ССААТ (СААТ-бокс);
3) ділянку із повторюваних нуклеотидів (СС-бокс).
Опинившись на промоторі, РНК-полімераза створює з ним так званий
закритий промоторний комплекс, у якому ДНК зберігає двоспіральну
структуру. У закритому комплексі РНК-полімераза ще не здатна до синтезу РНК.
Цей комплекс нестабільний |і легко дисоціює в разі підвищення іонної сили.
Закритий комплекс може зворотно перетворюватися на відкритий комплекс, у
якому РНК-полімераза розплітає приблизно один виток подвійної спіралі ДНК у
районі стартової точки (41) - нуклеотиду, із якого починається комплементарне
копіювання матриці. У відкритому комплексі зв'язок РНК-полімерази з
промотором стає значно міцнішим, ніж у закритому. За низьких температур
рівновагу суттєво порушено в бік закритого комплексу, за температур, близьких
до фізіологічних, - у бік відкритого. Перехід між цими крайніми випадками
відбувається у вузькому температурному інтервалі. Відкритий комплекс має
вигляд бульбашки, або вічка (рис. 7.4).
Наступна стадія ініціації потребує наявності субстратів РНК-полімерази,
нуклеозидтрифосфатів і полягає в утворенні перших декількох ланок ланцюга
РНК. Перший нуклеотид входить до складу ланцюга, зберігаючи свою
трифосфатну групу з 5'-кінця, а наступні нуклеотиди приєднуються до 3'-ОН-
групи попереднього з вивільненням пірофосфату. На стадії ініціації РНК-продукт
пов'язаний із матрицею і РНК-полімеразою неміцно і з високою імовірністю може
звільнятися з комплексу. У цьому випадку РНК-полімераза, не покидаючи
промотору, знову ініціює синтез РНК. Такий пробний синтез ді-, три- і довших
олігонуклеотидів, що передчасно обривається, називають абортивною ініціацією
(протилежний процес - продуктивна ініціація). Коли РНК-продукт досягає
критичної довжини (від 3 до 9 нуклеотидів на різних промоторах), абортивна
ініціація повністю припиняється, транскрибований комплекс стабілізується і вже
не розпадається до тих пір, поки синтез молекули РНК не буде доведений до
кінця. Приблизно в цей же момент, який вважають кінцем ініціації і початком
елонгації, від РНК-полімерази відділяється с-субодиниця.
 106

«о
РНК-полімераза
"м
Ініціація: /
впізнавання промотору

5"( І І .-"Юввиио оз
3'С І І — 05
днк Промотор Послідовність, що термінує

Ініціація:
відкритий комплекс

—————] ТЦ a —
—, ee =

Епонгація

днк
РНК

Термінація
С Г I но.
с І І ни |,

ДНК РНК

5 ль
РНК-полімераза
~~
Рис. 7.4. Загальна схема етапів транскрипції

Ефективність ініціації на різних промоторах, їх сила, істотно різняться:

якщо з деяких промоторів ініціюється всього одна-дві молекули РНК за весь
період поділу клітини, то з інших (наприклад, із промоторів генів рибосомних
РНК) ініціація відбувається кожні 1-2 с. Частота, із якою ініціюється
транскрипція в разі збільшення концентрації субстратів, залежить, головним
чином, від рівноважної константи утворення закритих промоторних комплексів і
константи швидкості перетворення закритого комплексу на відкритий. Для
найсильніших промоторів зазвичай характерні високі значення обох констант
(висока спорідненість РНК-полімерази до промотору і швидкий перехід
промоторного комплексу в активний відкритий стан). Слабкі промотори, як
правило, мають низькі значення цих величин. Слабкість промоторів із низькою
 107

спорідненістю до РНК-полімерази особливо помітна за низьких концентрацій

РНК-полімерази і може компенсуватися в разі її високих концентрацій. Промотор
із низькою спорідненістю до РНК-полімерази буває досить сильним, якщо він
може швидко переходити у відкритий стан. Сила більшості промоторів
збільшується зі збільшенням ступеня негативної суперспіралізації ДНК. Це
пояснюється тим, що негативна надспіралізація полегшує розплітання ДНК, а
отже, і перехід у відкритий промоторний комплекс. Існують, однак, промотори,
сила яких не залежить або навіть зменшується зі збільшенням ступеня
суперспіралізації. Ініціація транскрипції - це складний процес, що залежить від
наявності чи відсутності різних білкових факторів, в еукаріотів - ще від
розташування поблизу зони транскрипції енхансерів і сайленсерів --
послідовностей, що можуть посилювати або пригнічувати транскрипцію та ін.
Елонгація. Наступний етап - це поступове подовження ланцюга перед-РНК
(РНК-попередниці) до остаточного розміру.
На стадії елонгації в ДНК розплетено приблизно 15 п.н. Біля 12 нуклеотидів
матричної нитки ДНК утворюють гібридну спіраль зі зростаючим кінцем ланцюга
РНК. Під час руху РНК-полімерази уздовж матриці перед нею відбувається
розплітання, а ззаду - відновлення подвійної спіралі ДНК. Одночасно
звільняється чергова ланка зростаючого ланцюга РНК із комплексу з матрицею і
РНК-полімеразою. Ці переміщення повинні супроводжуватися відносним
обертанням РНК-полімерази і ДНК у процесі розплітання ланцюгів, що може
спричиняти сплутування молекули ДНК перед і за транскрипційною бульбашкою
(або вічком). У вирішенні цієї просторової проблеми, очевидно, беруть участь
топоізомерази.
У процесі подовження молекули РНК РНК-полімераза рухається по ДНК зі
змінною швидкістю. Особливо це можна простежити за низьких концентрацій
субстратів. Транскрипція може також супроводжуватися помилками спарювання,
у результаті яких у синтезованих РНК включаються «неправильні» нуклеотиди. У
середньому на 2:10" включених нуклеотидів припадає одна така помилка. Це
істотно більше, ніж поява помилок реплікації. Можливо, менша точність
пояснюється тим, що помилки тут мають не настільки серйозні наслідки. Вони
легко компенсуються завдяки утворенню на одному гені безлічі перед-РНК. Крім
того, у зв'язку з виродженістю генетичного коду, не кожна заміна нуклеотиду
змінює зміст кодону МРНК. Можна стверджувати, що в 67 У» помилок, що
стосуються третього нуклеотиду в кодоні, призначення останніх залишається
незміним. У деяких ділянках матриці тривалі затримки в просуванні
РНК-полімерази, так звані паузи, спостерігаються навіть за оптимальних
концентрацій субстратів. Завершується синтез РНК у певних ділянках матриці -
термінаторах, де відбувається відділення від ДНК і готової РНК, і мінімальної
РНК-полімерази, яка, об'єднавшись із вільною с-субодиницею, може брати участь
у наступному циклі транскрипції.
Термінацію найбільш вивчено у прокаріотів. На сьогодні описано два типи
термінації в генах бактерій - КРро-залежна та КРро-незалежна. У ВПо-залежній
термінації бере участь спеціальний білок ВПЮо-фактор. Він рухається вздовж
 108

ДНК услід за РНК-полімеразою, наздоганяє її на ГЦ-ділянці гена й активує

розплетення, полегшує розходження ланцюгів РНК і матричної ДНК. Проте
Кро-фактор бере участь у термінації транскрипції не всіх генів.
За ВПпо-незалежної термінації сигналом слугують ГЦ-збагачені ділянки в
кінці генів. Оскільки сила взаємодії пар ГЦ досить велика, денатурація таких
ділянок відбувається важче. Це уповільнює просування РНК-полімерази 1 є для
неї сигналом припинення транскрипції. Ще до закінчення процесу в кінці
новосинтезованих РНК теж встигає з'явитися ГЦ-збагачена ділянка. Завдяки
взаємодії між своїми нуклеотидами утворюється так звана «шпилька», при цьому
взаємодії з нуклеотидами матричного з ланцюга | ДНК замінюються на
«внутрішньошпилькові» взаємодії. Це полегшує від'єднання РНК від ДНК. Нижче
наведено два типи термінації у генах прокаріотів (рис. 7.5).

Вро-незалежна Вбо-залежна

Рис. 7.5. Два типи термінації транскрипції

Термінація, як і ініціація синтезу РНК, регульований процес. Є білки, що

функціонують як антитермінатори. За певних обставин молекули РНК можуть
утворювати альтернативні шпилькові структури на особливих послідовностях
певних ділянок ДНК. Деякі з таких структур можуть спричиняти абортивну
термінацію, а інші - продовжувати транскрипцію.
 109

7.4. Дозрівання різних видів рибонуклеїнових кислот в еукаріотів

Більшість молекул РНК еукаріотів синтезується у вигляді молекул-
попередниць, які підлягають «редагуванню» після транскрипції. Це перш за все
пов'язано з особливістю екзон-інтронної будови генів еукаріотів, не характерної
для прокаріотів. Використовують спеціальний термін - процесинг РНК
(посттранскрипційна модифікація), під яким розуміють сукупність процесів у
клітинах еукаріотів, що приводять до перетворення первинного транскрипта
гярРНК на зрілу РНК. Найбільш вивчений процесинг матричних РНК, які під час
свого синтезу зазнають модифікацій: кепування, поліаденілювання, метилювання
та сплайсинг.
Кепування (від англ. Сар - капелюх) - це біохімічна реакція приєднання до
5'-кінця матричного транскрипта модифікованого нуклеотиду 7-метилгуанозину
(ГІ на рис. 7.6) через незвичайний для РНК 5/,5-трифосфатний місток, а також
метилювання залишків рибози двох перших нуклеотидів. Процес кепування
відбувається під час синтезу молекули перед-мРНК. Кепування насамперед
захищає 5'-кінець первинного транскрипта від руйнівної дії екзонуклеаз.

Мн»

о 3 7-0-P-0-P-0-F-0-
обофої NH2

o 0 0"

й
OHі о, Снз)о

Рис. 7.6. Кепування матричного РНК-транскрипта

На сьогодні експериментально встановлено мультифункціональну роль кепа

в молекулах МРНК і пов'язаних із ним білків: захист 5"-кінця транскрипта від
екзонуклеаз; участь у сплайсингу; участь у шпроцесингу 3" кінця мРНК;
експорт МРНК із ядра; участь в ініціації трансляції.
Поліаденілювання. Фермент полі(А)-полімераза приєднує до 3"'-кінця
транскрипта від 100 до 200 залишків аденілової кислоти. Поліаденілювання
відбувається за наявності сигнальної послідовності 5-ААПЮААДАА-3" на 3'-кінці
транекрипта, за якою слідує 5"-СА-3". Друга послідовність є сайт розрізання.
 110
Х50бО0С 00 ДОобоГ
5 ж транскрипція
кеп
5 у я
m AAAAAAA
поліаденілювання

Рис. 7.7. Приєднання полі-А до 3/-кінця транскрипта

Метилювання - біохімічний процес приєднання метильних груп до бічних

радикалів нуклеотидів матричного транскрипта за допомогою специфічних
трансметилаз. Ступінь метилювання суттєво коливається в різних транскриптів.
Вважають, що метильні групи є своєрідними сигналами для визначення
наступного етапу процесингу РНК-транскрипта - сплайсингу, але біологічні
ефекти метилювання значно ширші.
Сплайсинг. Після поліаденілювання РНК зазнає сплайсингу, у ході якого
видаляються інтрони (ділянки, які не кодують білки), а екзони (ділянки, що
кодують білки) зшиваються і утворюють єдину молекулу мРНК. Сплайсинг
каталізує великий нуклеопротеїдний комплекс - сплайсосома, що складається з
білків і малих ядерних РНК. Перед-мРНК, транскрибовані з деяких генів
(наприклад, із генів імуноглобулінів), можуть зазнати сплайсингу різними
шляхами, при цьому утворюватимуться різні зрілі мРНК, що кодують різні
послідовності амінокислот. Це так званий альтернативний сплайсинг.

Екзон | Інтрон || Екзон Інтрон Екзон

Малі ядерні РНК

Інтрон
7

Місця з! ред екзонів

Q
20 НН *

Рис. 7.8. Схема механізму сплайсингу

У сплайсингу бере участь мала ядерна РНК, яка містить послідовності,

комплементарні інтронам, мяРНК забезпечує утримання липких кінців екзонів і їх
правильне зшивання після зрізання нітронів.
Дозрівання тРНК. Від попередника тРНК відщеплюються додаткові
олігонуклеотиди на 3"-і 5/-кінцях, вирізаються інтрони, добудовується акцепторна
ділянка (ЦЦА), формується петля антикодону, модифікуються нуклеотиди
(утворюються псевдоурідин, дигідроурідин тощо).
Нижче зображено процесинг рибосомних РНК (рис. 7.9).
 111

5" І 185 | 15.85: (1 28S ) 3"

455

|
А esl] 285 І
415

+ (sss І 285 |
205 325

У У
0 185 | | (285 |)
І |
м

——
Puc. 7.9. Процесинг рибосомної РНК
Дозрівання рРНК. Рибосомна РНК синтезується у вигляді великих
попередників. Вони містять у межах великих транскриптів окремі молекули pPPHK
(135, 5,85, 285), розділені інтронами (рис.7.9).
У випадку процесингу таких молекул-попередниць видаляються інтрони,
окремі молекули рРНК різного розміру метилюються, об'єднуються з білками і
саме з них утворюються мала і велика субодиниці рибосом.
7.5. Процесинг рибонуклеїнових кислот у прокаріотів
Процесинг молекул-попередниць РНК у прокаріотів вважають більш
простим порівняно з еукаріотами 1, перш за все, через відсутність у бактеріальних
генах інтронів. У зв'язку з цим у прокаріотів практично не зустрічається
сплайсинг. Проте організація генів рибосомних РНК дуже нагадує кластери
аналогічних генів в еукаріотів.
Процесинг перед-РНК, зчитаних із кгп-оперонів. У хромосомі Є. coli
виявлено сім кгп-оперонів, у яких зібрані практично всі гени рибосомних рРНК
(165, 235, 55), а також гени тРНК. Причому ці оперони відрізняються лише типом
і кількістю генів транспортних РНК. Під час транскрипції такий оперон
зчитується як єдине ціле і утворений транскрипт міститиме »-- 5600 нуклеотидів. У
ньому окремі молекули РНК розділені невеликими спейсерами, які нагадують
інтрони і в разі процесингу видаляютимуться за допомогою ендонуклеаз. Тобто
можна вважати такий тип дозрівання РНК примітивним сплайсингом.
Дозрівання поліцистронних РНК. Відомо, що у прокаріотів - 30 90 генів
зібрані в оперони. Це групи генів під єдиним промотором 1 термінатором, що
відповідають за синтез білків-ферментів певного метаболічного процесу. У
результаті транскрипції оперона утворюється єдина молекула перед-РНК, що
містить копії всіх його генів, - поліцистронна копія (цистрон - ген). Розпад
такої полігенної РНК на окремі ІРНК може відбуватися безпосередньо в рибосомі,
оскільки між РНК-копіями генів у такій перед-РНК наявні «розділові знаки» -
 112

послідовності Шайна-Дальгарно, із яких трансляція нібито розпочинається

заново.
Гени білків рибосом також зібрані в оперони, причому в порядку участі в
збиранні субчастинок. Спільний транскрипт також являє собою поліцистронну
РНК, яка в результаті впливу ендонуклеаз розпадається на окремі ЇРНК для
трансляції певних рибосомних білків.
Поліаденілювання РНК раніше вважали характерною рисою тільки
еукаріотів, проте нещодавно такий вид процесингу було виявлено і в прокаріотів.
Цей тип дозрівання супроводжується нарощуванням поліаденілового «хвоста» на
3"-кінці ІРНК, що, очевидно, захищає РНК від впливу екзонуклеаз.
7.6. Продукти транскрипції
Нагадаємо, що в результаті транскрипції утворюються лише попередники
тих чи інших РНК, мРНК, рРНК і тРНК. Порівняємо структуру зрілих ланцюгів
РНК кожного виду з будовою відповідних перед-РНК.
Перед-мРНК (гетероядерна, гяРНК) - первинні ланцюги РНК, що
містять повну копію ДНК в еукаріотів. Зазвичай вони в кілька разів довші, ніж
зрілі мРНК, і містять транскрипти як екзонів, так і інтронів. Частину кодованих
гярРНК, як і у вихідному гені, переривають інтрони. При цьому інтронні
послідовності часто утворюють «шпильки». Зауважимо, що довжина гяРНК не
тільки набагато більша, ніж у мРНК, але і значно сильніше варіює в різних
молекул - від 2 тис. до 20 тис. нуклеотидів. Інша особливість гяРНК - відсутність
на 5'-кінці «ковпачка» (кепа), а на 3" кінці - поліаденілового фрагмента.
Здебільшого випадків гяРНК еукаріотів несуть інформацію про синтез лише
одного пептидного ланцюга, тобто дають у результаті дозрівання тільки одну
молекулу мРНК.
Перед-рРНК. Кластер трьох генів рРНК теж транскрибується як єдине
ціле. РНК, яка при цьому утворюється, містить послідовності відразу трьох зрілих
рРНК. Ці послідовності розділені спейсерами, але не містять інтронів. Також у
ньому немає модифікованих нуклеотидів, які є в зрілої рРНК.
Перед-тРНК. На відміну від перед-рРНК, усі перед-тРНК (за поодиноким
винятком у бактерій) містять послідовності лише однієї тРНК. При цьому вже на
рівні перед-тРНК утворюється типова структура «листа конюшини». Однак
остання ще відрізняється від остаточної: у ній є низка додаткових послідовностей
(з обох кінців і в середині молекули), відсутні мінорні нуклеотиди, не сформована
типова послідовність акцепторної петлі (ЦЦА), антикодон не займає свого
правильного положення.
Із усього вищесказаного зрозуміло, що безпосередні продукти транскрипції
повинні зазнавати певних (1 істотних) змін для перетворення на функціонально
активні ланцюги РНК.
 113

7.1. Інгібітори транскрипції

Виділяють чимало речовин, які специфічно інгібують транскрипцію, в
основному за рахунок пригнічення активності основних ферментів і білків
транскрипції. Дія інгібіторів дуже специфічна щодо різних РНК-полімераз.
а-Аманітин -- це один із токсинів отруйних грибів (блідої поганки). Він -
циклічний пептид, що включає низку незвичайних амінокислот.
РНК-полімерази І, П ї ПІ відрізняють за чутливістю до альфа-аманітину:
РНК-полімераза І не чутлива до нього, РНК-полімераза ПІ помірно чутлива.
Даний пептид дуже міцно зв'язує РНК-полімеразу П (у еукаріотів) і таким
чином блокує синтез попередників матричних РНК (на стадії елонгації).
Актиноміцин Д - антибіотик, що походить від природного антибіотика із
стрептомщетів. Він містить два ідентичні циклічні пентапептиди, з'єднані 3
гетероциклічною системою. Актиноміцин міцно зв'язується з ГЦ-збагаченими
ділянками ДНК. Це блокує просування РНК-полімерази через неможливість
локального розплітання ланцюгів. Особливо чутливий до даного інгібітору синтез
попередників рРНК, оскільки їх гени особливо збагачені ГЦ-парами.
Рифампіцин і стрептолідигін — | антибіотики, що інгібують
РНК-полімеразу прокаріотів на етапі ініціації за рахунок взаємодії 13
В-субодиницею.
Доведено, що за умов стресу активність РНК-полімерази ПІ еукаріотів може
пригнічувати консервативний протеїн Майї. Справа в тому, що Маг! специфічно
пригнічує ініціацію транскрипції з промоторів РНК-полімерази ПІ, а також
запобігає реїніціації наступного циклу, зв'язуючи РНК-полімеразу ПІ під час
елонгації.

Розділ 8. ТРАНСЛЯЦІЯ ЯК ПРОЦЕС СИНТЕЗУ БІЛКА

(ДРУГИЙ ЕТАП ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ )

Трансляція - це біохімічний процес синтезу білків із амінокислот, який

каталізують складники рибосоми на матриці матричної (інформаційної) РНК
(МРНК або ІРНК). Трансляція, у свою чергу, - частина процесу експресії генів.
Під час трансляції інформація, уміщена в мРНК, розшифровується згідно з
правилами, відомими як генетичний код, і використовується для синтезу
закодованої поліпептидної послідовності. Трансляція завершує переклад
генетичної інформації, зашифрованої в ДНК, на синтезовані протеїни, що
забезпечують фенотипічні ознаки й функціональні властивості живих організмів
за загальною схемою ДНК-зРНК-» Протеїн.
Протеїн-синтезувальна система включає: рибосоми, мРНК, тРНК, АТФ, ГТФ,
фактори ініціації, елонгації та термінації трансляції, ключовий фермент
аміно-ацилсинтетазу.
Трансляція відбувається в цитоплазмі клітини, де розташовані рибосоми
(від «рибонуклеїнова кислота» та 5ота - тільце) - найважливіші немембранні
органоїди живої клітини сферичної або трохи еліпсоїдної форми діаметром
 114

10-20 нм, що складаються з великої та малої субодиниць. Кожна субодиниця

рибосоми - це рибонуклеопротеїдний комплекс, який містить рРНК і специфічні
протеїни. Відношення РНК- білок становить І1:Ї у вищих тварин і 60-65:35-40 у
бактерій. РРНК становить близько 70 Уб усього складу РНК клітини. Рибосоми
еукаріот містять чотири молекули рРНК, із них 185, 5.35 1 285 рРНК синтезує в
полісомі РНК полімераза І у вигляді єдиного попередника (455), який потім зазнає
модифікацій 1 нарізання. 55 рРНК синтезує РНК-полімераза ПІ в іншій частині
генома, вони не потребують додаткових модифікацій. Майже всі рРНК - у вигляді
магнієвої солі, що необхідно для підтримки структури; в разі видалення іонів
магнію рибосома зазнає дисоціації на субодиниці. Константа седиментації
(швидкість осідання в ультрацентрифузі) рибосом еукаріотичних клітин дорівнює
805 (велика 1 мала субодиниці 605 і 405 відповідно), бактеріальних клітин (а
також мітохондрій і пластид) - 705 (велика і мала субодиниці 505 і 305
відповідно). Рибосоми еу- та прокаріот мають багато подібних рис як у структурі,
так і у функціях, але при цьому істотно відрізняються розмірами й відносним
вмістом РНК і протеїнів (табл. 8.1).
Таблиця 8.1
Рибосоми еукаріот і прокаріот
Характерна особливість Рибосоми прокаріот Рибосоми еукаріот
Діаметр 8 нм 23 нм
Молекулярна маса 2,510" 4,2-10°
Співвідношення РНК і білка 3:2 1:1
Склад великої субодиниці 2 молекули pPHK 1 3 молекули рРНК i
34 молекули білків 49 молекул білків
Склад малої субодиниці 1 молекула рРНК і 1 молекула рРНК і
21 молекула білків 33 молекули білків
Швидкість осадження 70 5 80 5
Приблизна кількість у клітині 10° 10°

Рибосома містить сайти зв'язування для молекул РНК: один для МРНК і три
для ТРНК (рис. 8.1).

велика
субодиниця

Рис. 8.1. Будова рибосоми

 115

Перший сайт зв'язування тРНК називають сайтом аміноацил-тРНК або

А-сайтом. У ньому міститься молекула тРНК, «заряджена» наступною
амінокислотою. Другий сайт - пептидил-тРНК-зв'язувальний, або Р-сайт,
містить молекулу тРНК, що зв'язує кінець поліпептидного зростаючого ланцюга.
Третій сайт - це сайт виходу, або Е-сайт. У цей сайт потрапляє порожня тРНК,
яка позбулася зростаючого кінця поліпептиду після його взаємодії із наступною
«зарядженою» амінокислотою в пептидильному сайті. Сайт зв'язування МРНК
розміщений у малій субодиниці. Він утримує рибосому «нанизаною» на мРНК,
яку рибосома транслює.
В еукаріотичних клітинах рибосоми розташовуються на мембранах
ендоплазматичної мережі, хоча можуть бути локалізовані і в неприкріпленій
формі в цитоплазмі. Часто з однією молекулою мРНК асоційовані кілька рибосом,
таку структуру називають полірибосомою (полісомою). Синтез рибосом в
еукаріот відбувається в спеціальній внутрішньоядерній структурі - ядерці.
Для розпізнавання амінокислот у клітині є спеціальні «адаптери», молекули
транспортної РНК (тРНК). Ці молекули у формі листа конюшини мають ділянку
(антикодон), комплементарну кодону мРНК, та іншу ділянку, до якої
приєднується амінокислота, що відповідає цьому кодону. Приєднання
амінокислот до TPHK 3a допомогою екзоенергетичної реакції здійснюють
ферменти аміноацил-тРНК-синтетази, а молекулу, що утворюється в результаті,
називають аміноацил-тРНК. Таким чином, специфічність трансляції визначають
взаємодія між кодоном мРНК і антикодоном тРНК, а також специфічність
аміноацил-тРНК-синтеназ, що приєднують амінокислоти строго до відповідних
тРНК (наприклад, кодону ССО відповідатиме тРНК, що містить антикодон CCA,
а до цієї ТРНК приєднуватиметься тільки амінокислота гліцин) (рис. 8.2).

Амінокислота

TPHK

Антикодон
rer MPHK
GAU UGU GCU__¥
Кодон

Рис. 8.2. Схема «кодон-антикодон» протеїн-синтезувальної системи

Механізми трансляції прокаріотів (бактерій та архей) і еукаріотів істотно

відрізняються, тому багато речовин, які пригнічують прокаріотичну трансляцію,
значно менше впливають на трансляцію еукаріотичних організмів, що дозволяє
 116

використовувати їх у медичній практиці як антибактеріальні засоби, безпечні для

організму ссавців.
Оскільки кожен кодон містить три нуклеотиди, один і той же генетичний
«текст» можна прочитати трьома різними способами (починаючи з першого,
другого 1 третього нуклеотидів), тобто в трьох різних межах зчитування. За
деякими цікавими винятками, значущою є інформація, закодована тільки в одній
рамці зчитування. Через це надзвичайно важливим для синтезу білка рибосомою є
її правильне позиціонування на стартовому АД С-кодоні -- під час ініціації
трансляції.
Процес трансляції можна поділити на чотири фази: активацію, ініціацію,
елонгацію та термінацію.
За ініціації мала субодиниця рибосоми зв'язується з 5"-кінцем МРНК за
допомогою факторів ініціації (ТК), інших білків, що прискорюють процес.
Елонгація починається, коли чергова аміноацил-тРНК використовується для
збільшення поліпептидного ланцюга. Термінація відбувається, коли рибосома
зустрічає стоп-кодон ((АА, САС або ОСА), для якого не існує відповідної тРНК,
при цьому звільняється поліпептидний ланцюг (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Загальна схема трансляції ( шК.ууіКіредіа.ого)

Примітки. Ініціація: 1 - розпізнавання стартового кодону (АОС) супроводжується

зв'язуванням тРНК, аміноацильованої метіоніном (М), і збиранням рибосоми з великої і малої
субодиниць.
Елонгація: 2 - розпізнавання поточного кодону відповідною йому аміноацил-тРНК
(комплементарна взаємодія кодону мРНК і антикодону тРНК збільшена); 3 - приєднання
амінокислоти, принесеної тРНК, до кінця зростаючого поліпептідного ланцюга; 4 - просування
рибосоми вздовж матриці, що супроводжується вивільненням молекули тРНК;
5 - аміноацилювання вивільненої молекули тРНК відповідною аміноацил-тРНК-синтетазою;
6 - приєднання наступної молекули аміноацил-тРНК аналогічно стадії (2); 7 - рух рибосоми
молекулою мРНК до стоп-кодону (у даному випадку ПАС).
Термінація. Розпізнавання рибосомою стоп-кодону супроводжується (8) від'єднанням
новосинтезованого білка і в деяких випадках (9) дисоціацією рибосоми.
 117

Розглянемо детальніше деякі механізми трансляції.

Активація амінокислоти
За активації відповідна амінокислота приєднується до певної транспортної
РНК (тРНК). Хоча цю стадію часто розглядають окремо від трансляції, вона
необхідна для її початку. Зв'язану з амінокислотою тРНК називають
аміноацил-тРНК або «зарядженою» тРНК.
У процесі трансляції рибосоми використовують тільки активовані
амінокислоти. Приєднання аміноацильного залишку до 3'-кінця специфічної
TPHK і утворення аміноацил-тРНК відбувається за допомогою ферменту
аміноацил-тРНКсинтетази (рис. 8.4).

АТФ PP.

І eon Tae ож дю
NH» NH
Аміноацил-тРНК
М * Аміноациладенілат
синтаза

і в-СноСОмО-Амо РНК Моно

СОТ + AMO
| |
Мн, NH2
Аміноацил-тРНК

Рис. 8.4. Формування аміноацил-тРНК

Практично всі неправильно синтезовані комплекси аміноацил-тРНК

розпадаються відразу ж після утворення, тому на даному етапі трансляції
можливе виправлення помилок.
Ініціація трансляції відбувається за спеціальними механізмами. Насамперед
початок трансляції залежить від здатності рибосоми до трансляції матричного
полінуклеотиду (мРНК) і направленого синтезу поліпептидного ланцюга білка.
Синтез поліпептиду потребує участі готової пептидил-тРНК одного з субстратів
реакції транспептидації. Іншими словами, донорний субстрат повинен бути
наявним у рибосомній Р-ділянці, щоб далі збільшуватися за рахунок приєднання
наступного аміноацильного залишку. Проте коли рибосома починає трансляцію,
жодного пептиду та відповідного донорного субстрату у вигляді пептидил-тРНК у
рибосомі ще немає. Для вирішення цієї проблеми і запускаються спеціальні
механізми ініціації: спеціальна ініціаторна аміноацил-тРНК взаємодіє зі
спеціальними білками (факторами ініціації), зв'язується зі спеціальною ділянкою
MPHK на рибосомі. При цьому зв'язування ініціаторних аміноацил-тРНК
відбувається саме в Р-ділянці рибосоми, що дозволяє їй використовувати функції
донорного субстрату під час утворення першого пептидного зв'язку. Таким
чином, ініціаторні аміноацил-тРНК у Р-ділянці рибосоми імітує пептидил-тРНК,
що і дозволяє без особливих труднощів розпочати елонгацію пептиду. У
прокаріотів (бактерій) ініціаторна аміноацил-тРНК схожа на пептидил-тРНК
 118

також і хімічно: її аміногрупа формільована, тобто зв'язана з формільною групою

амідним зв'язком. Отже, введення донорного субстрату в Р-ділянку рибосоми --
одна з основних функцій механізму ініціації трансляції. Ініціація трансляції,
однак, означає не просто початок синтезу поліпептидного ланцюга, тобто
елонгаційного процесу. Ініціація - це і початок зчитування МРНК, яке повинне
завжди починатися зі строго фіксованної точки матричного полінуклеотиду.
Початок зчитування - це не початок полінуклеотидного ланцюга мРНК (тобто не
її 5'-кінець), він завжди перебуває на певній відстані від початку ланцюга. Отже,
для початку синтезу поліпептиду з його першого амінокислотного залишку
необхідний механізм точного впізнавання першого кодону на МРНК.
У живій природі є два способи, два шляхи пошуку стартової точки
трансляції на мРНК. У вищих організмів - еукаріотів - рибосомна частинка, як
правило, спочатку приєднується до 5"-кінця МРНК, а потім рухається вздовж
ланцюга МРНК і сканує її до моменту зустрічі з ініціюючим кодоном. Цей спосіб
отримав назву термінальної ініціації. Для здійснення цього шляху еукаріотичні
клітини мають набір спеціальних МРНК-зв'язувальних білків, які допомагають
рибосомній частинці впізнати 5"-кінець МРНК і далі рухатися вздовж ланцюга
мРНК, у тому числі розщеплювати АТФ і використовувати енергію fi
розщеплення для розплітання вторинної структури мРНК 1 руху. Інший шлях -
так звану внутрішню ініціацію - використовують головним чином одноклітинні
прокаріотичні організми. У цьому випадку рибосомна частинка безпосередньо
асоціює з локальною структурою мРНК, яка містить ініціюючий кодон незалежно
від 5"-кінця МРНК і його віддаленості від початку кодуючої послідовності.
Оскільки у прокаріотів дуже часто один довгий полінуклеотидний ланцюг мРНК
містить декілька кодуючих послідовностей для різних білків (поліцистронна
мРНК), то цей спосіб забезпечує ініціацію трансляції відразу декількох кодуючих
послідовностей усередині однієї мРНК незалежно один від одного. Зазначимо, що
в деяких випадках еукаріоти теж можуть використовувати шлях внутрішньої
ініціації. Так, мРНК, що кодують певні регуляторні білки, необхідні для
ембріонального розвитку, транслюються, імовірно, через внутрішню ініціацію.
Найбільш вивчений приклад внутрішньої ініціації у еукаріот - трансляція мРНК
деяких малих вірусів (так званих пікорнавірусів) у разі інфікування ними клітин
людини або тварин. Такі мРНК мають спеціальні внутрішні структури, які
залучають рибосомні частинки хазяйської клітини і зв'язують їх, після чого
відбувається ініціація трансляції в точці цього зв'язування.

8.1. Механізм трансляції прокаріотів

Ініціація. Рибосоми прокаріотів ініціюють трансляцію на мРНК уже в процеї

транскрипції. Час, необхідний для приєднання рибосом, - декілька секунд, хоча
це залежить від кожної мРНК. Рибосоми транслюють МРНК зі швидкістю
приблизно 12 амінокислот за секунду.
 119

У ініціації трансляції беруть участь: рибосома, аміноацильована 1

формільована тРНК, мРНК і три білкові ініціаторні фактори: IF1, IF2 1 ТЕЗ
(англ. іпібайоп Гасбог8, скорочено ТЕ).
Синтез білка завжди починається з АГ)С-кодону, що також кодує метіонін.
Цей кодон зазвичай називають стартовим або ініціаторним. Ініціація трансляції
передбачає розпізнавання рибосомою цього кодону і залучення ініціаторної
аміноацил-тРНК. Для ініціації трансляції необхідна також наявність певних
нуклеотидних послідовностей біля стартового кодону. Існування послідовності,
що відрізняє стартовий АОС від внутрішніх, абсолютно необхідне, оскільки
інакше ініціація синтезу білка відбувалася б хаотично на всіх А)С-кодонах.
Мала рибосомна субодиниця (305) прокаріотів, якщо вона в цей час не бере
участі в трансляції, перебуває з факторами ініціації ТЕ1, ТЕЗ і, в деяких випадках,
ІЕ2. ІЕЗ, зв'язаний із 305-субодиницею, запобігає асоціації з великою (505)
субодиницею рибосоми, таким чином зберігаючи її вільний стан до зв'язування з
матричною РНК. Цей протеїн також бере участь у поєднанні МРНК і тРНК, а
також ЇЕ2. ТЕ2 взаємодіє із тРНК 1 може розщеплювати ГТФ. ІКІ є, імовірно, не
обов'язковим фактором (у деяких видів він відсутній), що підвищує спорідненість
малої субодиниці із ІК2 1 ТЕЗ (рис. 8.5).

че &
Й

Рис. 8.5. Схема ініціації трансляції у прокаріотів (иК.міКіредіа.ого)

Примітки. Початкова стадія передбачає зв'язування малої рибосомні субодиниці (305) із

мРНК. Це може відбуватися двома способами: спочатку до мРНК приєднується комплекс, що
містить рибосомну субодиницю (/), а потім до нього притягується тРНК у комплексі з IF2 i
ГТФ (2), або 305 субодиниця спочатку зв'язується з тРНК, а вже потім «сідає» на мРНК (3). До
утвореного комплексу приєднується велика (505) рибосомна субодиниця (4), фактори ініціації
від'єднуються від 305 субодиниці, що супроводжується гідролізом ГТФ білком IF2 (5) i
утворена рибосома починає подовжувати ланцюг (6). У правому нижньому кутку зображено
схему ініціаторної ділянки прокаріотичної мРНК. Позначено 5"- і 3"-кінці молекули. КВ5 --
ділянка зв'язування рибосоми; 5Ю) -- послідовність Шайн- Дальгарно; АОС - ініціаторний
кодон.
 120

Комплекс 305 субодиниці з ініціаторними факторами здатний розпізнавати

спеціальні послідовності МРНК, так звані ділянки зв'язування рибосоми
(anrs. ribosome-binding site a6o ВВ5). Ці ділянки містять, по-перше, ініціаторний
кодон АОС і, по-друге, спеціальну послідовність Шайн-Дальгарно, із якою
комплементарно зв'язується рибосомна 165 РНК. Послідовність Шайн- Дальгарно
слугує для того, щоб відрізнити ініціаторний АЮС від внутрішніх кодонів, які
кодують метіонін. Після того як 305-субодиниця зв'язалася з МмРНК, до неї
притягується ініціаторна аміноацил-тРНК 1 ТЕ2, якщо вони ще не були включені в
комплекс. Потім приєднується 505-субодиниця, відбувається гідроліз ГТФ і
дисоціація факторів ініціації. Утворена рибосома починає синтезувати
поліпептидний ланцюг.
Елонгація поліпептидного ланцюга полягає в додаванні нових амінокислот
до карбоксильного С-кінця зростаючого ланцюга. Цей поліпептидний ланцюг
виходить із рибосоми через вихідний тунель у великій субодиниці. Елонгація
починається, коли метильована аміноацил-тРНК зв'язується з ділянкою Р, що
обумовлює конформаційну зміну комплексу, яка відкриває ділянку А для
зв'язування нової аміноацил-тРНК.
Фактори елонгації: БЕ-Ти та ЕЕ-Т58 - білки, які зв'язуються з рибосомою і
необхідні для елонгації трансляції.
У процесі ініціації утворюється 705-рибосома, пов'язана з МРНК, у Р-сайті
якої перебуває Етеї-тРНКІМеї. Для утворення першого пептидного зв'язку
необхідно, щоб аміноацил-тРНК, що відповідає наступному кодону, зайняла
А-центр.
Етапи елонгації трансляції:
1. ЕЕ-Ти-ГТФ з'єднує всі аміноацил-тРНК, крім бтеї-тРНКІМеї, і доставляє
їх до А-центру комплексу; 705-рибосома-мРНКаміноацил-тРНК з'єднує ЕЕ-Ти та
ГТФ. Утворений комплекс (аміноацил-тРНК-ЇЕЕ-Ти-ГТФІ) доставляє аміноацил-
тРНК до А-ділянки. ГТФ гідролізується і комплекс (ЕЕ-Ти-ГТФ) відділяється від
рибосоми. ЕЕ-Т5 відновлює ЕЕ-Ти-ГТФ.
2. Коли обидві ділянки А і Р зайняті, пептидилтрансферазна активність
505-субодиниці каталізує перенесення групи формілметіоніну з її тРНК на
аміногрупу аміноацил-тРНК, розташовану в А-ділянці. У результаті в А-ділянці
опиняється дипептидил-тРНК, ав Р - вільна тРНК.
3. Процес, відомий як утворення пептидного зв'язку, каталізується
рибозимом пептидилтрансферазою. Така активність властива 235 рРНК великої
(505) рибосомної субодиниці. Після утворення пептидного зв'язку ділянка А
міститиме поліпептид, у той час як ділянка Р - незаряджену тРНК (тРНК без
амінокислоти). ТРНК звільняє /| Р-сайт, утворений дипептидил-тРНК
переміщується на неї, а новий кодон повинен бути готовий до того, щоб зайняти
звільнений А-сайт. Усі ці процеси відбуваються за допомогою EF-G y разі
наявності ГТФ-залежної транслокації рибосоми.
4. Новий кодон, який зайняв А-сайт, готовий до з'єднання зі спорідненою
аміноацил-тРНК. Відразу після зв'язування аміноацил-тРНК з А-ділянкою
вивільняється комплекс ЕЕ-Ти-ГТФ і відбувається регенерація функціонально
 121

активного ЕЕ-Ти-ГТФ. При цьому ЕЕ-Ти-ГТФ взаємодіє з білком ЕНЕ-Т8, що

приводить до відділення ГТФ і утворення комплексу ЕЕ-Ти-ЕЕ-Тз8. Далі комплекс
взаємодіє з ГТФ, відбувається регенерація ЕЕ-Ти-ГТФ і відділення ЕЕ-Т5, і обидва
з'єднання стають готовими до наступного циклу.
Для зчитування наступного кодону та подовження поліпептидного ланцюга
ще на одну амінокислоту вся серія реакцій повинна повторитися.
Під час утворення кожного пептидного зв'язку витрачається енергія, що
дорівнює чотирьом енергетичним еквівалентам (якщо за один еквівалент узяти
енергію утворення фосфатного зв'язку): два еквіваленти АТР споживаються в
ході аміноацилювання тРНК і два еквіваленти ГТФ - у кожному циклі елонгації.
Рибосома продовжує транслювати кодони, що залишилися, тому що нові
аміноацил-тРНК зв'язуються з ділянкою А до того моменту, поки рибосома не
зустріне кодон зупинки на мРНК (ОАА, ОСА або САС).
Термінація відбувається, коли один із трьох стоп-кодонів переміщається в
ділянку А. Ці кодони не мають відповідних тРНК. Натомість їх розпізнають
спеціальні білки - фактори звільнення (англ. геіеа5е Гасіог5, КЕ), а саме ВКІ
(який розпізнає стоп-кодони САА і ОАС) або КЕ2 (що розпізнає стоп-кодони
UAA 1 ОСА). Третій фактор звільнення КЕ-3 каталізує звільнення ВЕ-І і ВЕ-2 у
кінці процесу термінації. Ці фактори каталізують гідроліз ефірного зв'язку, що
зв'язує ТРНК із пептидом, та вивільнення недавно синтезованого білка з
рибосоми. Однак, який би зі стоп-кодонів не забезпечував термінацію, Її
ефективність залежить від послідовностей у мРНК, що фланкують ці кодони.
Посттермінаційний комплекс, сформований після термінації, складається з
мРНК зі стоп-кодоном у ділянці А рибосоми і тРНК. Крок переробки рибосоми
відповідає за розбирання посттрансляційного рибосомного комплексу. Після
звільнення білка після термінації фактори переробки рибосоми і фактор елонгації
БНЕ-С звільняють МРНК і тРНК із рибосоми і роз'єднують 705 рибосоми на 305 1
505 субодиниці. ТЕ-3 також бере участь у переробці, запобігаючи повторному
зв'язуванню субодиниць за рахунок зв'язування із 305 субодиницею. Цей процес
«готує» рибосому для повторення циклу трансляції.
Коли відстань від рибосоми до сайта ініціації досягне величини 100-200
нуклеотидів, у цьому сайті може відбутися нова ініціація трансляції. Таким
чином, на одній мРНК можуть перебувати кілька транслюючих рибосом -
полірибосоми або полісоми (рис. 8.6).

Рибосоми
мРНК ж м

Рис. 8.6. Полірибосома

 122

8.2. Механізм трансляції еукаріотів

Кеп-залежна ініціація. За допомогою цього механізму транслюється

переважна більшість еукаріотичних мРНК. Білки, що беруть участь у процесах
ініціації трансляції в еукаріотів, називають еїЇЕ (англ. еиКагуобіс іпішайоп Гасіогя -
еукаріотичні фактори ініціації). Крім факторів ініціації еТЕЇ, elF2 1 eIF3, mo
зв'язуються з малою рибосомною субодиницею (405) 1 за своїми функціями
майже аналогічні відповідним протеїнам прокаріотів, еукаріоти мають ще дві
групи факторів ініціації: родина факторів, що зв'язують мРНК - е!Е4, і родина
факторів, що зв'язуються з великою (605) субодиницею рибосоми, еїЕ5. Наведемо
список основних факторів: еТБАА - РНК хеліказа, фермент, що розплітає
вторинну структуру мРНК для того, щоб рибосома могла по ній рухатися; elF4B —
притягує фактор еЇК4А до молекули мРНК; еІГЕАЕ - зв'язує кеп 7-метилгуанін,
розташований на 5"-кінці молекули мРНК; еЇКАС - потрібний для організації
компонентів, що беруть участь в ініціації трансляції, в єдиний комплекс і містить
ділянки прикріплення еІРАВ, еГЕАЕ до рибосоми; еІЕ5 - потрібний для залучення
великої субодиниці рибосоми.
На першому етапі ініціації трансляції мала субодиниця рибосоми в
комплексі з факторами ініціації е|КАС, eIF4B, eIF4E й ініціаторною тРНК
приєднується до 5"-кінця МРНК за рахунок здатності еЇЕАЕ зв'язувати кеп-
структуру, а еТЕЗ - мРНК. Потім білок еЇЕАВ активує хеліказу е|ЇКАА й починає
розплітати МРНК у напрямку до 3"-кінця, що супроводжується витратами енергії у
вигляді молекул АТФ. За рахунок функціонування цього білка 405 субодиниця
звільняється від факторів еТЕАС і еїКАЕ, і в комплексі з факторами ініціації, що
залишилися, рухається вздовж мРНК до ініціаторного кодону AUG, де
відбувається дисоціація факторів ініціації, що залишилися, і залучення 605-
субодиниці рибосоми за допомогою еІЕ5, після чого починається синтез
поліпептидного ланцюга.
Кеп-незалежна ініціація. Як правило, еукаріотична трансляція потребує
наявності кепа на 5"-кінці МРНК, у той же час деякі вірусні й клітинні МРНК не
мають кеп-залежного механізму за рахунок ініціації трансляції на певних
послідовностях у молекулі РНК.
Найкраще дослідженим (але зовсім не єдиним) прикладом кеп-незалежної
трансляції в еукаріотах є так звана «внутрішня ділянка входження рибосоми»
(anrm. Internal Ribosome Епігу 5їе або ІКЕ5). На відміну від кеп-залежного
механізму, кеп-незалежний механізм також не потребує сканування рибосомою
від 5'-кінця рибосоми до стартового кодону. Рибосома може бути доставлена до
стартової ділянки ІКІ5 за допомогою ІТАКів (ІКЕЗ ітап5-асіїпе, Гасіог5), що
дозволить уникнути сканування від 5"-кінця РНК.
Цей спосіб трансляції відкритий відносно недавно, клітини Його
застосовують за умов, які активують трансляцію певних МРНК (за стресових
умов), коли загальна ефективність трансляції знижена. Активують такий спосіб
трансляції фактори апоптозу, імуноглобуліни, деякі фактори росту. Крім того, цей
спосіб інколи застосовують віруси.
 123

Загальне порівняння протеїнсинтезувальної системи про- та еукаріотів

наведено нижче (табл. 8. 2).
Таблиця 8.2
Порівняльний склад протеїнсинтезувальної системи про- та еукаріотів

Хо Етап Прокаріоти | Еукаріоти

І Активація
амінокислот
2 Ініціація
3 Елонгація
4 Термінація
5 Процесинг
формування третинної | звільнення
структури
20 амінокислот
20 аміноацил-трРНК-синтетаз
Мінімум 20 тРНК
АТФ та Ме"
мРНК МРНК
Ініціаторна аміноацил тРНК Ініціаторна аміноацил тРНК
(Х-формілметіоніл-тРНК) (метіоніл-тРНК)
Ініціювальний | кодон у| Ініціювальний | кодон у
молекулі МРНК (АУГ) молекулі МРНК (АУГ)
305 1 505 рибосомні 405 1 605 рибосомні
субодиниці субодиниці
Фактори ініціації: Фактори ініціації:
IF-1, IF-2, ТЕ-3, ГТФ, Ме?" eIF-1, eIF-2, elF-2A, el F-3,
elF-4A, eI F-4B, eI F-4C,
elF-4D, кеп-упізнавальний
фактор, ГТФ, Mg**
Ініціювальний комплекс Ініціювальний комплекс
(функціональна 705 (функціональна 805
рибосома) рибосома)
Специфічні тРНК за Специфічні тРНК за
кодонами кодонами
Фактори елонгації: Фактори елонгації:
EF-Tu, EF-Ts, EF-G, [T®, | eEF-1la, eEF-1By, eEF-2,
Ме" ГТФ, Ме"
Термінувальні кодони в Термінувальні кодони в
молекулі мРНК: молекулі МРНК:
УАА, УАГ, УГА УАА, УАГ, УГА
Фактори термінації Фактори термінації
(релізинг-фактори): (релізинг-фактори):
RF-1, RF-2, RF-3, AT® eRF, AT®
і| Специфічні ферменти та кофактори, що індукують
амінокислотних залишків і сигнальних
послідовностей, частковий протеоліз і хімічну модифікацію

Елонгація трансляції еукаріотів дуже подібна до елонгації трансляції

прокаріотів. Основні фактори елонгації: еНЕ-І, чиї а 1 Бу субодиниці відповідають
прокаріотичним факторам ЕЕ-ТО ії EF-TS відповідно; еНЕ-2, що відповідає
прокаріотичному фактору НЕ-С.
Термінація. У еукаріотів існує лише один фактор вивільнення, еКЕ, замість
трьох факторів прокаріотів. Проте загалом процес термінації подібний до процесу
термінації прокаріотів.
Замість комплементарного РНК-РНК упізнавання, у якому бере участь
послідовність Шайна-Дальгарно прокаріотичних мРНК, еукаріотичні мРНК
 124

упізнають еукаріотичні рибосоми за кепом 5"-кінця з обов'язковою участю білка,

наприклад, еТЕ-4Е ініціаторного фактора. Учені припускаюь, що цей білок бере
участь у розплавленні вторинних структур 5"областей мРНК, полегшуючи їх
зв'язування з малими субодиницями рибосом. На відміну від прокаріотів,
еукаріотична мРНК утворює комплекси з протеїнами (мРНК, або месенджер-
рибонуклеопротеїди, або інформосоми), що обумовлює ii метаболічну
стабільність. У еукаріотів відсутня постійна інтенсивна деградація й інтенсивний
ресинтез МРНК, що, як правило, моноцистронні й мають специфічно
модифікований (кепований) 5"-кінець. Усе це зумовлює низку особливостей
ініціації трансляції та її регуляції в еукаріотичних організмів. Природно, що
метаболічна стабільність еукаріотичної мРНК робить регуляцію на рівні
трансляції особливо важливою в загальному процесі регуляції біосинтезу білка.

8.3. Посттрансляційна модифікація білків

Посттрансляційна модифікація - хімічна модифікація білка після його

трансляції - це одна з останніх стадій процесу біосинтезу для більшості білків.
Під час трансляції синтезується поліпептидний ланцюг, що складається з 20
головних амінокислот. Посттрансляційна модифікація розширює функціональний
склад білка за допомогою додаткового приєднання таких груп, як ацетильна
(ацетилювання) ado фосфатна (фосфорилювання), |а також цукрів
(глікозилювання) і ліпідів. Посттрансляційна модифікація може також
передбачати зміну хімічної природи амінокислоти (наприклад, трансформацію
залишку аргініну в цитрулін) або утворення дисульфідних зв'язків у структурі
протеїну. Зафіксовано з також метилювання аргінінових | або лізинових
амінокислотних залишків протеїну, наприклад гістонових ядерних протеїнів.
Специфічні пептидази можуть відщеплювати невеликі фрагменти протеїну з
М-термінального кінця або розрізати поліпептидний ланцюг у середині.
Наприклад, молекула інсуліну після трансляції додатково видозмінюється за
допомогою внутрішньомолекулярного дисульфідного зв'язку, після чого певна
ділянка вирізається з середини ланцюга пропептиду, що перетворює проінсулін на
активний інсулін.
Фосфорилювання | - одна з найпоширеніших посттрансляційних
модифікацій і використовується як механізм, що контролює поведінку багатьох
білків (наприклад, активацію або інактивацію ферментів).
На сьогодні описано понад 100 різних посттрансляційних модифікацій
протеїнів. Роль більшості цих модифікацій не з'ясовано; деякі з них випадкові і,
мабуть, не мають функціонального значення, але є й важливі для функціонування
клітини, оскільки їх суворо контролюють специфічні ферменти. Модифікації
відбуваються в ендоплазматичному ретикулумі й апараті Гольджі (рис. 8.7).
 125
On. a

is
+

ae г (CH2)4
Фо ло

h CH,OH "Ра eo снфоон Ацетил-Сод

боса tae ||mucierea | транореа щ | ежевниня

протеїн протеїн метил метил

HP х ADP +р 5 -аденозилгомо- но CoA

CHg цистен Ом CHy
од 0.4. O

Te
о
NHІ
GH (СНоід

Фосфорилювання Метилювання Ацетилювання

Рис. 8.7. Зворотні ковалентні модифікації протеїнів

Багато з перерахованих модифікацій критичні для біологічної активності

пептидів. Зокрема, карбоксіамідування С-кінцевого гліцину активує окситоцин і
вазопресин, а перенесення сульфогруп на залишок тирозину в холецистокінін-3
критичне для Його активності в підшлунковій залозі. М-ацетилювання бета-
ендорфіну блокує його опіоїдну активність, у той час як ацетилювання
меланоцитстимулювального гормону посилює його вплив на синтез меланіну.
Оскільки більшість цих модифікацій тканиноспецифічна, пептиди, що мають
різну біологічну активність, повинні бути доставлені до різних тканин у вигляді
попередників, де вони зазнають специфічного процесингу.
Фосфорилювання. Перші свідчення про те, що фосфорилювання білків -
важливий регулятор ферментативної активності, одержано в той час, коли
регуляторну роль нековалентних взаємодій субстратів, кофакторів 1 кінцевих
продуктів реакцій було вже добре вивчено. Класичний приклад - регуляція
активності фосфорилази 5-АМР (позитивна) і глюкозо-б-фосфотом (негативна).
Обидва вони є алостеричні ефектори-регулятори і не беруть безпосередню участь
в реакції каталізу фосфорилазою. Пізніше було з'ясовано, що додавання однієї
фосфатної групи до фосфорилази Б також переводить фермент із неактивного в
активний стан. Таким чином, додатково до алостеричної регуляції модифікація
фосфорилюванням також змінює активність ферментів.
Хоча ці два механізми діють через однакові конформаційні зміни,
фосфорилювання є основний механізм у разі рецептор-залежної відповіді клітин
на зовнішні впливи, у той час як алостеричні ефектори змінюють активність
ферментів у відповідь на зміну внутрішньоклітинних умов. Зазвичай зміна цих
умов має відбутися в широких межах (концентрація продукту або кофактора
повинна суттєво змінитися). У той час як фосфорилювання забезпечує
перетворення дуже слабкого сигналу (концентрація гормону, пов'язаного з
рецептором) на великий сигнал (наприклад, швидка активація глікогенолізу).
Однак недостатня швидкість процесу є недоліком контролю фосфорилюванням.
 126

Якщо потрібно забезпечити високу швидкість зміни активності ферменту

(звільнення трансмітера або скорочення м'язів), необхідна регуляція швидкою
зміною концентрації Са"! (у м'язах - фосфорилаза-кіназа).
Додаткова роль фосфорилювання при цьому полягає в збільшенні
спорідненості ферменту до Са". Важливість фосфорилювання підтверджує той
факт, що геном дріжджів містить понад 120 різних протеїнкіназ (ПК). Вважають,
що геном людини містить понад 1000 протеїнкіназ; 30 5 цитоплазматичних білків
містять ковалентно зв'язаний фосфат. Фосфорилювання модифікує білки
додаванням негативно заряджених груп до серину, треоніну, рідше - до тирозину.
Ці нейтральні гідроксіамінокислотні залишки типово експонуються на поверхні й
часто між регуляторними субодиницями білка.
М-глікозилювання. М-глікозилювання відбувається 3a 4 аспарагіном,
розташованим через один амінокислотний залишок від триптофану.
О-глікозилювання. У процесі О-глікозилювання відбувається приєднання
одного-двох вуглеводних залишків переважно за серином і триптофаном, але
іноді й за іншими амінокислотним залишкам (наприклад, за гідроперином, як це
має місце в рослинних білках). В одній молекулі поліпептиду може бути безліч
сайтів О-глікозилювання. Молекула дріжджової інвертази, наприклад, містить 150
залишків манози. О-глікозилювання відбувається без участі мембранозв'язаних
посередників. Є дані про те, що процес О-глікозилювання починається дуже
скоро після виходу білка з ендоплазматичного ретикулума, можливо, уже в
проміжному компартменті, і продовжується, імовірно, у кількох відділах апарату
Гольджі.
Частковий протеоліз. Багато білків первинно синтезуються у вигляді
неактивних попередників, із яких потім шляхом обмеженого протеолізу
утворюються окремі функціонально активні білки. Так, більшість протеолітичних
ферментів травного тракту утворюється у вигляді неактивних проферментів
(пепсиногену, трипісиногену, прокарбоксіпептидази і т.д.) і активується після
відщеплення пептидів, які блокують їх активний центр. Білкові гормони також
синтезуються у вигляді неактивних попередників. Шляхом протеолізу з
препроінсуліну утворюється інсулін, проопіомеланокортин (пептидні гормони
гіпофізу) тощо.
Секреторні білки, синтезовані на рибосомах, у процесі проходження через
мембрани ендоплазматичного ретикулума Й апарату Гольджі зазнають
обмеженого протеолізу. Прикладом є відщеплення М-кінцевих формілметіонину і
метіоніну від синтезованого поліпептидного ланцюга.
Метилювання й ацетилювання. Метилювання Й ацетилювання білків
зазвичай відбувається за аміногрупами аргініну, лізину. Метилювання й
ацетилювання гістонових білків - важливий механізм у регуляції процесів
реплікації 1 транскрипції .
Карбоксилювання і гідроксилювання білків. Вітамін-К-залежне
карбоксилювання залишків глутамінової кислоти в кальцій-зв'язувальних білках
системи зсідання крові, а також у кістковій тканині - важливий елемент регуляції
 127

обміну цих білків. Гідроксилювання проліну і лізину за участю аскорбінової

кислоти - важливий етап дозрівання колагенових білків.
Ізопренування і пальмітування білків. Приєднання залишків ізопрену і
пальмітинової кислоти найчастіше відбувається за залишками цистеїну. Так
регулюється активність білків диференціації клітин і їх запрограмованої смерті
(апоптозу).
Йодування. Під час синтезу тиреоїдних гормонів відбувається йодування
залишків тирозину в білках.
Приєднання коферментів. У результаті формування складних ферментів
до їх білкової частини приєднуються простетичні групи і коферменти (так,
приєднання гема сприяє утворенню функціонально активних молекул цитохромів
і гемоглобіну).
Хімічна модифікація. Установлено також хімічну модифікацію -
перетворення гістидину в молекулі фактора ініціації трансляції eEF2 на
незвичайну амінокислоту дифтамід під дією дифтерійного токсину. Суть цієї
реакції полягає в почерговому приєднанні до залишку гістидину в молекулі
фактора еНЕ2 амінокарбоксипропільної і метильної груп 5-аденозилметіоніну.
Епімеризація | І-амінокислотних залишків. Серед ковалентних
посттрансляційних модифікацій пептидів, синтезованих рибосомами, особливе
місце належить епімеризації І амінокислотних залишків із утворенням
О-енантіомерів, наявність яких впливає на біологічну активність пептидів.
Тільки Ідлстереоізомери амінокислот беруть участь у синтезі білка
рибосомами. У природних білках Ю-амінокислоти виявляють не часто, як
правило, у складі антибіотиків | пептидної природи, синтезованих
ферментативними комплексами мікроорганізмів без залучення рибосом. Іншим
джерелом Д-амінокислот у білках може бути спонтанна рацемізація їх
І стереоізомерів у складі поліпептидних ланцюгів у результаті старіння.
У деяких - природних пептидів, що мають біологічну активність,
О-амінокислоти утворюються під час посттрансляційних модифікацій. Це явище
характерне для опіоїдних пептидів, секретованих шкірою деяких амфібій
(дерморфін 1 дерменкефалін). Активність цих пептидів як анальгетиків у 1000
разів перевищує активність морфіну, і для її прояву необхідна обов'язкова
наявність Д-амінокислот у зазначених положеннях молекул.
Дерморфіноподібні молекули з тими ж особливостями структури було
виявлено й у мозку щурів, а в амфібій знайдено серію нових гексапептидів,
делторфінів (Туг--АЇТа- Х-Уаї!-Уаї-СІу, де Х - Азр або Си), які є агоністи дельта-
опіоїдних рецепторів і для активності яких також потрібні |-амінокислоти. До
пептидів тієї ж природи відносять поліциклічні пептидні антибіотики
грампозитивних бактерій, зокрема низин, субтилін і епідермін, а також деякі
нейропептиди вищих безхребетних.
Механізм утворення Ю-амінокислот у складі пептидів до кінця не вивчено,
однак учені припускають наявність ферментативних реакцій, у результаті яких
відбувається послідовна дегідрогенізація 1 гідрогенізація І ізомерів амінокислот.
 128

8.4. Фолдингі системи захисту синтезованих поліпептидних ланцюгів

У процесі трансляції зростаючі поліпептидні ланцюги набувають

високоспецифічної просторової структури, яка повністю формується після
завершення біосинтезу. Процес згортання поліпептидного ланцюга в просторову
структуру отримав назву фолдингу. У результаті фолдингу у водних розчинах у
водорозчинного поліпептиду зменшується вільна енергія, гідрофобні залишки
амінокислот упаковуються переважно всередину молекули, а гідрофільні залишки
розташовуються на поверхні білкової глобули.
Правильне згортання (фолдинг) поліпептидних ланцюгів деяких білків у
клітинах еукаріот забезпечують специфічні білки, які називають шаперонам.
Вони необхідні для ефективного формування третинної структури поліпептидних
ланцюгів інших білків, але не входять до складу кінцевої білкової структури.
Новосинтезовані білки після виходу з рибосом для правильного функціонування
повинні упаковуватися в стабільні тривимірні структури і залишатися такими
протягом усього функціонального життя клітини. Контроль якості структури
білка також здійснюють шаперони.
Гідрофобні області утворюються і на зовнішній поверхні молекул білків,
формуючи порожнини активних центрів і ділянки контактів субодиниць
мультимерних білків один з одним і біологічними мембранами. Збільшення
гідрофобності поверхні білків знижує їх внутрішньоклітинну стабільність,
оскільки безліч протеолітичних ферментів гідролізують із великою швидкістю
пептидні зв'язки, утворені гідрофобними амінокислотами або розташовані біля
них.
Протеолітична деградація зростаючого поліпептидного ланцюга можлива
після його появи на поверхні рибосоми. Установлено, що близько 1/3
синтезованих поліпептидних ланцюгів зазнає протеолітичного розпаду відразу
після завершення їх синтезу рибосомами. Більшість нещодавно синтезованих
білків не розпадається завдяки утворенню комплексу МАС (nascent polypeptide
аз5осіаїсд сотрієх, комплекс, асоційований зі зростаючим поліпептидом).
Виділяють групу білків із молекулярними масами 21-33 кДа, які взаємодіють як із
даним ланцюгом, так і з самою рибосомою, оберігаючи зростаючий поліпептид
від деградації шляхом формування МАС. Коли ж кгідрофобна сигнальна
послідовність синтезованого білка досягає довжини приблизно 70 амінокислотних
залишків і покидає МАС, із нею починає взаємодіяти комплекс білків 5ЕВР (signal
recognition рагіїсіє, сигнальна впізнавальна частка), який не тільки оберігає
гідрофобну частину зростаючого поліпептиду від - ранньої деградації
протеїназами, а й спрямовує її 0 місця призначення - мембран
ендоплазматичного ретикулума.
Зростаючі поліпептидні ланцюги, у яких відсутня сигнальна послідовність,
залишаючи МАС, взаємодіють із системою фолдингу, до складу якої входять
шаперони Неяр70 і Нер40. Білки теплового шоку (Н5р - heat shock protein),
утворюючи комплекс зі зростаючим поліпептидним ланцюгом, запобігають їх
неспецифічній агрегації і деградації під дією внутрішньоклітинних протеїназ,
 129

сприяючи їх правильному формуванню, що відбувається за участю інших

шаперонів. Няєр70 бере участь в АТФ-залежному розгортанні поліпептидних
ланцюгів, роблячи неполярні ділянки поліпептидних ланцюгів доступними щодо
впливу протеолітичних ферментів.
Сигнальні | послідовності | амінокислотних залишків забезпечують
спрямовану доставку нещодавно синтезованих білків до внутрішньоклітинних
органел 1 мікрокомпартментів, впливають на характер холдингу. На сьогодні
досліджено п'ять біохімічних процесів за участю нещодавно синтезованих білків,
контрольованих сигнальними послідовностями амінокислотних залишків:
- транслокація білка через площину мембрани;
- внутрішньоклітинне перенесення білка без перетину площини мембрани;
- хімічні модифікації білка без гідролізу пептидних зв'язків;
- розщеплення деяких пептидних зв'язків у білку;
- конформаційні й інші просторові зміни білків, включаючи фолдинг й
олігомеризацію поліпептидних ланцюгів.
Тривалість існування внутрішньоклітинних білків може відрізнятися на
декілька порядків. Структурні та конституційні білки зазвичай мають тривале
життя, у той час як регуляторні білки, як правило, швидко розпадаються.
Протеолітичний гідроліз регуляторних білків, який може точно регулюватися,
дозволяє еукаріотичній клітині швидко переключатися з однієї функціональної
програми на іншу.
Більшість внутрішньоклітинних білків закінчують існування в результаті
протеолітичного гідролізу, перетворюючись на невеликі пептиди і вільні
амінокислоти, які утилізуються в результаті синтезу нових білків.
Виділяють безліч протеїназ широкої субстратної специфічності, чия
нерозбірливість у субстратах компенсується їх чіткою компартменталізацією.
Вони локалізовані в лізосомах і вакуолях, де гідролізують будь-які білки після їх
потрапляння в ці органели. Така компартменталізація протеолітичних ферментів --
життєво важлива умова існування клітини. Система протеолітичної деградації
внутрішньоклітинних білків за участю протеасом і убіквітину відрізняється від
вищеописаних систем тим, що, маючи широку субстратну специфічність, вона
безпечна для оточуючих білків 1 реагує на регуляторні дії.
У згортанні поліпептидних ланцюгів беруть участь специфічні білки
фолдази та ізомерази.
Найбільш добре вивченими ферментами цієї групи є тіоредоксин і
глутаредоксин, які поряд із глутатіонзалежним перетворенням рибонуклеотидів у
дезоксирибонуклеотиди здатні відновлювати дисульфідні зв'язки в білках,
сприяючи формуванню в них правильної третинної структури. Ті ж функції
виконує і дисульфідізомераза білків, утворюючи дисульфідні зв'язки в білках
після їх перенесення крізь мембрани еукаріотичних клітин. Лімітувальною
стадією у формуванні правильної третинної структури поліпептидних ланцюгів є
цис-транс-ізомеризація залишків проліну. Цей процес у клітинах еукаріот
відбувається за участю пролін-цис-транс-ізомерази.
 130

Розділ 9. МЕХАНІЗМИ РЕГУЛЯЦІЇ ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ

9.1. Загальна характеристика механізмів регуляції метаболізму

Жива клітина - відкрита, динамічна, здатна до саморегуляції система,

метаболізм якої залежить як від внутрішніх потреб, так і від умов навколишнього
середовища. Тому різноманітні гени, що входять до складу генома, експресуються
не одномоментно, а відповідно до стадій клітинного циклу 1 фізіологічних потреб
клітини. Основним об'єктом регуляції в клітині є ферментні білки та гени, які їх
кодують. Система регуляції біосинтезу білків діє на рівні транскрипції і
трансляції. У свою чергу регуляцію транскрипції поділяють на глобальну
регуляцію, що забезпечує зміни окремих фаз життєвого циклу, і регуляцію на
рівні експресії окремих генів чи оперонів залежно від умов існування. Крім того,
й активність ферментів змінюється залежно від умов існування клітини. На цьому
й грунтується сутність регуляції експресії генів і обміну речовин (метаболізму) у
цілому. Регуляція процесів життєдіяльності Й метаболізму організмів
здійснюється на двох основних рівнях - генетичному та біохімічному.
На першому рівні регуляції - генетичному - обмін речовин контролюється
шляхом регуляції експресії генів, а саме посиленням або пригніченням
транскрипції та трансляції. Залежно від особливостей регуляції транскрипції
виділяють конститутивний, індуцибельний і репресибельний синтез ферментів.
Якщо швидкість синтезу ферменту не залежить від наявності субстрату в
середовищі, такий фермент і його синтез називають конститутивним. Більшість
катаболічних ферментів - індуцибельні, оскільки їх синтез індукується тільки за
наявності в середовищі відповідного субстрату. Базальна швидкість синтезу
індуцибельних позаклітинних фементів дуже низька, але в разі появи індуктора
збільшується в тисячі разів. Існують ферменти, які можна назвати частково
конститутивними, оскільки вони постійно синтезуються зі значною швидкістю,
але 3a наявності специфічного індуктора швидкість їх синтезу може
збільшуватись у 2 - 3 рази. Утворення анаболічних ферментів регулюється
шляхом репресії, тому їх синтез називають репресибельним.
Другий рівень регуляції- біохімічний -- реалізується за рахунок регулювання
активності ферментів. Генетичну регуляцію вважають грубим способом
налагодження метаболізму, а біохімічну регуляцію - більш тонким процесом.
Молекулярною основою обох рівнів регуляції здебільшого є алостеричні
ферменти та білки, що мають зазвичай два типи активних центрів. Один із них
слугує для приєднання низькомолекулярних ефекторів, які можуть впливати на
активність іншого центру шляхом змінення просторової структури білкової
молекули.
У разі регуляції ферментативної активності (біохімічний рівень
регуляції) самі регуляторні ферменти того чи іншого метаболічного циклу мають
алостеричну природу. Вони, як правило, складаються з двох або чотирьох
субодиниць і мають два типи активних центрів - каталітичний (для зв'язування
з субстратом) та ефекторний (для зв'язування з ефектором - активатором чи
інгібітором). Якщо фермент зв'язується з активатором, змінюється його
 131

конформація і відповідно просторова структура каталітичного центру. Це

полегшує зв'язування ферменту з субстратом і посилює ферментативну
активність. Якщо ж ефектор виконує функцію інгібітора, то його приєднання до
ефекторного центру ферменту ослаблює або зовсім унеможливлює взаємодію
субстрату з каталітичним центром ферменту й призводить до зниження чи
повного пригнічення ферментативної активності.
Слід зауважити, що в результаті дослідження регуляції ферментативної
активності було виявлено безліч різноманітних біохімічних механізмів. Так,
активність | простих ферментів регулюється концентрацією субстрату,
алостеричних регуляторних ферментів - за рахунок алостеричних ефекторів і
кооперативної взаємодії різних за функціями субодиниць. Активність деяких
ферментів про- та еукаріотів регулюється за рахунок специфічних високо- та
низькомолекулярних інгібіторів. Для протеолітичних ферментів характерний
інший тип регуляції, за якого фермент спочатку синтезується в неактивній формі
- у вигляді довшого поліпептиду, і тільки після гідролітичного відщеплення так
званої сигнальної послідовності (за рахунок обмеженого протеолізу) набуває
активної форми. У регуляції ферментативної активності беруть участь також
білки-шаперони, здатні надавати певної просторової структури ферментним
білкам. Зміна активності деяких ферментів пов'язана 3 ковалентною
модифікацією в результаті дії інших ферментів, що можуть здійснювати реакції
аденілювання, фосфорилювання або ацетилювання тощо. Крім перелічених
складних механізмів у регуляції ферментативної активності певну роль відіграють
умови середовища: температура, рН, іонне оточення, природа розчинника,
колоїдність та ін.
У регуляції експресії генів (генетичний рівень регуляції) також беруть
участь алостеричні білки. Вони виконують функції білків-регуляторів, які
зв'язуються з ДНК у промоторній зоні гена (чи оперона) і можуть або
посилювати, або пригнічувати транскрипцію. Один центр білка-регулятора слугує
для приєднання до ДНК, інший - для зв'язування ефектора. Алостеричні білки-
регулятори -- це посередники між ДНК та ефектором.
Ефекторами, здатними «вмикати» і «вимикати» гени, можуть бути різні
речовини залежно від того, гени якого типу метаболізму регулюються:
- у катаболічних генах (оперонах) функції ефекторів виконують самі
субстрати (наприклад, вуглеводи), які підлягають розщепленню, вони є
індукторами для білка-регулятора, тобто «умикачами» генів;
© 6 анаболічних генах (оперонах) функції ефекторів виконують кінцеві
продукти синтезу (наприклад, амінокислоти, нуклеотиди), вони є корепресорами
або інгібіторами для білка-регулятора 1, зв'язуючись із ним, «вимикають»
транскрибування генів ферментів, необхідних для їх власного синтезу.
В існуванні таких механізмів регуляції генної активності є глибокий
біологічний сенс, а саме: клітина не буде синтезувати катаболічні ферменти, якщо
не надходить відповідний субстрат, і навпаки, якщо в клітині достатньо
необхідних кінцевих продуктів синтезу, то буде доцільно припинити синтез
відповідних анаболічних ферментів.
 132

Механізми регуляції метаболізму на генетичному рівні вперше були вивчені

в клітинах прокаріотів (зокрема, в оперонах кишкової палички E.coli)
французькими вченими Ф. Жакобом 1 Ж. Моно, які у 1961 р. розробили
концепцію оперона в регуляції генів у прокаріотів. Вони виявили, що додавання
лактози до культури Е.соїї індукує утворення відразу трьох ферментів для утилізації
лактози: галактозидази, пермеази і трансацетилази. Їх кодують розташовані поряд три
відповідні гени, які в разі транскрипції зчитуються як єдине ціле. За відкриття в галузі
генетичного контролю синтезу ферментів Ф. Жакоб ії Ж. Моно в 1965 р. були
нагороджені Нобелівською премією в галузі фізіології та медицини.
На теперешній час уже встановлено, що регуляція експресії генів
відбувається різними шляхами і в тому числі на рівні транскрипції (під час
синтезу ІРНК) і на рівні трансляції (у процесі синтезу білка на рибосомах).
На рівні транскрипції в прокаріотів виявлено такі механізми регуляції:
позитивний і негативний контроль транскрипції за участю білків-регуляторів;
індукція і репресія;
аутогений контроль;
катаболітна репресія;
комбіновані механізми регуляції;
регуляція за допомогою рибоперемикачів.
На рівні трансляції вивчено такі механізми:
е атенуація шляхом утворення альтернативних шпильок на іРНК;
е регуляція трансляції під час збирання рибосом;
е регуляція трансляції за участю факторів ініціації, елонгації та термінації.
В еукаріотів також наявні подібні механізми регуляції, але на сьогодні
виявлено вже багато інших механізмів, які будуть розглянуті пізніше.
9.2. Регуляція експресії генів на рівні транскрипції
9.2.1. Позитивний і негативний контроль. Індукція та репресія
Позитивний і негативний контроль регуляції роботи генів (чи оперонів)
реалізуються за допомогою білків-регуляторів (В.) і базуються на їх природі.
У разі позитивного контролю білок-регулятор є активатором i,
зв'язуючись із активаторним сайтом (а або і) у промоторній зоні гена, активує
РНК-полімеразу 1 в результаті посилює транскрипцію.
У разі негативного контролю білок-регулятор (БК) є репресором,
зв'язується із оператором (О) у зоні промотору і, таким чином, перешкоджає
формуванню активної РНК-полімерази або заважає її просуванню по матричному
ланцюгу ДНК. Білки-регулятори кодуються окремими генами, що можуть бути
розташовані поряд із структурним геном, усередині оперона серед структурних
генів, або далеко за межами гена чи оперона. Один білок-регулятор може брати
участь у регуляції різних генів і оперонів, поєднуючи їх в єдину систему регуляції
- регулон або ще складніший модулон, де один регулятор контролює низку інших
специфічних регуляторів.
 133

Індукція і репресія. Механізми індукції та репресії реалізуються завдяки

ефекторам. Генетичні системи чутливо реагують на наявність у клітині та
навколишньому середовищі живильних субстратів, тих чи інших важливих
метаболітів, тому експресія «потрібних» генів починається тільки після появи в
середовищі Й у клітині відповідних ефекторів - субстратів чи кінцевих
продуктів синтезу. Рівень транскрипції залежить від концентрації ефектора.
Білки-регулятори виконують функції посередників між молекулою ДНК і
ефекторами, але саме ефектори запускають той чи інший метаболічний шлях.
Для катаболічних оперонів і генів, які контролюють синтез ферментів
катаболізму вуглеводів, характерний такий тип регуляції, як індукція. Індукція
синтезу ферментів, закодованих у катаболічних оперонах, відбувається завдяки
ефекторам індукторам, роль яких відіграють самі вуглеводні субстрати. Оскільки
індуктори не можуть безпосередньо зв'язуватись із молекулою ДНК, то вони
запускають транскрипцію не самостійно, а тільки через посередник - білок-
регулятор В, здатний приєднуватися до ДНК у зоні оператора. Таким чином, сам
субстрат запускає синтез ферментів, потрібних для його утилізації. Індукторами
для відповідних катаболічних оперонів у бактерій можуть бути глюкоза, лактоза,
мальтоза, арабіноза, гліцерин та ін. Індукторами називають ті ефектори, що
сприяють вмиканню або посиленню транскрипції. Так, лактозний оперон Є. coli,
кодуючий три ферменти катаболізму лактози, вмикається тільки тоді, коли в
середовище потрапляє субстрат-індуктор - сама лактоза.
Для анаболічних оперонів і генів характерний інший механізм регуляції -
репресія. У таких оперонах ефекторами для білків-регуляторів є не субстрати, а
кінцеві продукти синтезу (наприклад, амінокислоти, нуклеотиди). Вони
виконують функції корепресорів і можуть зв'язуватися з білком-регулятором -
апорепресором (неповноцінним репресором), посилювати його здатність до
репресії. Наприклад, у Е. соїї амінокислота триптофан, накопичена клітиною в
результаті синтезу в надлишковій кількості, як корепресор білка-регулятора
(репресора) блокує транскрипцію генів триптофанового оперона і таким чином
припиняє синтез - ферментів для власного синтезу. Тобто ефектором
(корепресором) триптофанового оперона є сам триптофан.
Узагальнюючи сказане вище, ще раз наголосимо:
е індукція характерна для катаболічних оперонів, для них ефекторами-
індукторами є субстрати, що зазнають катаболічного розщеплення;
е репресія характерна для анаболічних оперонів, у них ефекторами є кінцеві
продукти синтезу, які виконують функції корепресорів.
В умовах «іп уїуо» у прокаріотів позитивний і негативний контроль
практично завжди комбінуються з індукцією або репресією, тобто в регуляції
генної активності на рівні транскрипції беруть участь і білки-регулятори (як
посередники між генами і ефекторами), і ефектори. У різних бактерій було
виявлено дещо відмінні механізми регуляції транскрипції, але в результаті
детального аналізу їх можна розподілити на 4 основні типи: 2 індуцибельні
оперони - відповідно з позитивним і негативним контролем і 2 репресибельні
оперони - також із позитивним і негативним контролем. Наведені назви оперонів
 134

свідчать про те, що індуцибельними є катаболічні оперони, керовані індукцією, а

репресибельними - анаболічні оперони, для яких характерна репресія.
Розглянемо ці 4 типи класичних оперонів:
1. Індуцибельний оперон із негативним контролем регулюється шляхом
поєднання негативного контролю транскрипції та індукції субстратом. Такий тип
регуляції виявлено в лактозному опероні (/ас-опероні) Е. сої (рис. 9.1), який
містить три структурні гени, що кодують ферменти послідовних реакцій
катаболізму лактози. Перший ген /ас/ кодує фермент Р-галактозидазу, яка
розщеплює дисахарид лактозу на два мономери - глюкозу та галактозу. Другий
ген лактозного оперона /асУ при транскрипції
Індуцибельний оперон з негативним контролем | визначає послідовність В-галактозидпермеази
(Іас-оперон) - транспортного ферменту, що переносить
a галактозу у клітину. Третій ген оперона - /асА
Pozo кодує фермент трансацетилазу, що залучає
Ра Оперон | галактозу в подальший метаболізм, а саме
, неактивний | цей фермент переносить ацетильну групу від
oe ацетил-СоА | до В-галактозидів. Білок-
eet ign натоннунан нічні регулятор Гасі кодується регуляторним
Ро оо a геном /асі, розташованим безпосередньо
и перед промотором оперона. За механізмом дії
ПИ
Ф МИ Ма цейиа і
білок-регулятор Р- репресор,
3 ;
оскільки,
індуктор Оперон зв'язуючись з оператором (0), він блокує
tact Vi ‘ активний транскрипцію усього оперона. За наявності
penpecop лактози (індуктора - J) OinoK-perynatop Lacl
= з перетворюється на інактивований репресор.
9.1. Регуляція транскрипції в /ас - опероні
Регуляція /ac-onepoHa відбувається з так: якщо в середовищі, де
культивується Є. со/ї, немає субстрату лактози (індуктора), то білок-регулятор
виконує функцію репресора (негативний контроль) і, блокуючи зону оператора,
заважає РНК-полімеразі транскрибувати гени оперона; коли лактоза потрапляє у
середовище, вона як ефектор-індуктор реагує з білком-репресором і змінює його
конформацію, що значно зменшує здатність репресора зв'язуватись із ДНК. У
результаті білок-регулятор (репресор) «відпадає» від оператора. Завдяки цьому
«відкривається шлях» для просування РНК-полімерази в область структурних
генів 1 починається транскрипція, а згодом і трансляція, у результаті чого
утворюються ферменти, необхідні для катаболізму лактози. Таким чином, лактоза
шляхом індукції знімає репресію 1 вмикає власний катаболічний оперон.
2. Індуцибельний оперон із позитивним контролем також являє собою
комбінований тип регуляції з поєднанням позитивного контролю транскрипції та
індукції. Цей тип регуляції був виявлений також в Є. соїї в катаболічних оперонах
- мальтозному, рамнозному й арабінозному. Розглянемо цей механізм на прикладі
арабінозного оперона (рис. 9.2), що складається з трьох генів ага В, ага А, ага П,
кодуючих ферменти для перетворення І -арабінози на Ї-ксилулозо-5-фосфат.
 135

Індуцибельний оперон з позитивним контролем У даному опероні білок-регулятор

-
(ага-оперон) AraC виконує подвійну функцію. 3a
ат B\l a if D ) відсутності арабінози в середовищі білок-
регулятор спочатку виконує функції
Оперон |
репресора. Приєднуючись до оператора,
AraC
не активний він заважає транскрипції. У разі появи в
Неповноцінний
активатор | (П(.,, нанні ренту середовищі субстрату арабінози вона як
індуктор зв'язується із білком-регулятором
fap Bap | AraC і, змінюючи його конформацію,
a перетворює на повноцінний активатор.
(rac) Повноцінний Оперон Цей змінений регуляторний білок
\ активатор активний
переміщується | в | сусідню | область
нФ----Індуктор промотора | - | а (сайт зв'язування
Неповноцінний активатора) 1 AK активатор прискорює
активатор збирання РНК-полімерази B зоні
промотора
- Р.
Рис. 9.2. Регуляція транскрипції в ага - опероні
Таким чином регуляторний білок АгаС стимулює транскрипцію. Тобто в
кінцевому результаті має місце позитивний контроль. Незважаючи на назву -
«Індуцибельний оперон із позитивним контролем», реально в арабінозному
опероні кишкової палички має місце складніший тип регуляції, а саме за
відсутності індуктора оперон «зачинений» білком-регулятором (негативний
контроль), а поява індуктора (арабінози) «відкриває» оперон для зчитування
(позитивний контроль).
3. Репресибельний оперон із негативним контролем регулюється за
рахунок комбінації механізмів негативного контролю і репресії. Даний тип
регуляції транскрипції виявлено у триптофановому опероні Є. Соїї, так званому
Репреснбельний оперон з негативним контролем пр-опероні (рис. 9.3). Він містить 5 генів
(trp-onepox)
(греЕ, пр), tpC, trpB, гра), що
= TSR забезпечують синтез амінокислоти
триптофану із попередника - хоризмової
кислоти (хоризмату). Цей анаболічний
оперон регулюється шляхом репресії.
Регуляція транскрипції пгр-оперона
(Ploy Ep leltgi al здійснюється за таким механізмом. Якщо

=
є Оперон
в клітині кишкової палички недостатньо
триптофану, то РНК-полімераза без
зрання SS He cee
репресор
перешкод зчитує гени оперона та
+® Корепресор
забезпечує продукування ферментів для
Апорепресор
синтезу триптофану.
Рис.9.3. Регуляція транскрипції у /гр-опероні

При цьому білок-регулятор ТгрК наявний, але в неактивній формі апорепресора

(неповноцінного репресора). Як тільки у клітині з'являється надлишок
 136

триптофану, він як корепресор (К) приєднується | до апорепресора ТирК i

перетворює його на активний репресор. У свою чергу приєднання активного
репресора до оператора (0) блокує транскрипцію (негативний контроль), у
результаті чого припиняється синтез ферментів і самого кінцевого продукту -
триптофану.
4. Репресибельний оперон із позитивним контролем функціонує завдяки
поєднанню позитивного контролю і репресії. Такий тип регуляції довгий час був
невідомий, але нещодавно Його наявність було встановлено в опероні синтезу
лейцину - Іен-опероні у кишкової палички. Цей оперон містить чотири гени
(leuA, leuC, leuB, leuD), що кодують
Репресибельний оперон з позитивним контролем
(leu-onepon) ферменти для забезпечення синтезу
с лейцину (рис. 9.4). За даного механізму
регуляції білок-активатор Ігр за умов
Й al St ate нестачі кінцевого продукту (лейцину) у
(пр) активний клітині виконує функцію активатора,
a зв'язується з активаторним сайтом а і
Канн посилює транскрипцію (позитивний
rato tp контроль). У aa vakowntens B
(щр)-Ф----Іннбнор достатній кількості лейцину він сам стає
Р ‘ ‘Coron . інгібітором (1) i, зв'язуючись із білком-
активатором Ігр, перетворює його на
Інгібований активатор
i з б інгібований активатор.
Рис. 9.4. Регуляція транскрипції у /ен-опероні
Утворений інгібований активатор уже не може зв'язуватись із активаторним
сайтом а, тому його активаторна дія далі не може продовжуватись, що призводить
до вимкнення оперона, блокування транскрипції та синтезу ферментів і в
результаті - самого кінцевого продукту - лейцину.
Аутогенний контроль (або аутогенна регуляція) здійснюється в тих
оперонах, де один із структурних генів кодує білок із подвійними фунціями - 1
ферменту, і білка-регулятора. Принцип аутогенної регуляції полягає в тому, що
білок-регулятор керує транскрипцією оперона й таким чином впливає на власний
синтез. Тобто відбувається саморегуляція оперона. Причому такий тип регуляції
характерний оперонам і з позитивним, 1 з негативним контролем. Це достатньо
тонко налаштована система регуляції, що дозволяє завчасно припинити або,
навпаки, активувати транскрипцію відповідно до потреб клітини на даний
момент. Найгрунтовніше вивчено такий механізм на прикладі гістидинового
onepona hut у сальмонел, у якому один із генів кодує синтез ферменту, що
одночасно виконує функцію білка-регулятора, який гальмує транскрипцію.
Ауторегуляція - загальна властивість усіх оперонів рибосомальних білків, у
яких продукт одного з генів регулює і власний синтез, і синтез інших В-білків.
9.2.2. Катаболітна репресія
Катаболітна репресія — приклад складного механізму регуляції
транскрипції. Уперше її було виявлено в описаному вище лактозному опероні
 137

E. соїї в умовах диауксії. Це явище можна спостерігати в тому випадку, коли в

середовищі є в наявності два або декілька вуглеводів (наприклад, глюкоза та
лактоза). Сутність диауксії полягає в тому, що спочатку як більш легко
засвоюваний субстрат утилізується глюкоза за рахунок її залучення в гліколіз.
При цьому лактозний оперон буде заблоковано до тих пір, поки глюкозу не буде
вичерпано. Тобто синтез ферментів, які розщеплюють інший субстрат (лактозу),
ніби «репресується». Насправді, як буде доведено нижче, транскрипція
лактозного оперона He репресується, а тимчасово відкладається через
неможливість його індукування. Сам по собі лактозний оперон є катаболітний і
контролюється не репресією, а індукцією. Тому назва - «катаболітна репресія» -
не зовсім коректна, але закріпилася ще з моменту відкриття. Із утилізацією
глюкози відбувається «дерепресія» лактозного оперона і розпочинається
транскрипція генів катаболізму лактози. Розглянемо принцип реалізації цього
механізму регуляції на молекулярному рівні (рис. 9.5).
а) Оперон
Промотор |

дико
ІРНК
| ві |. [ert
QS
0. | 2Транскрипція
| у | Іс
І РНК- заборонена
Рибосоми 5 5 ae
І JЛактози в се pe-
<> довищі немає
Білок-репресор
(активний)

Оперон
Be i Промотор
дик | к |. | |
мо В Lap) й - іРНК
iPHK ав» ца; РНКополімераза | Ї 1
Рибосоми 86 — 5 5 55

Sige У SH
Білок-репресор вино
ук Білок-репресор :
(лактоза) ; es В середовищі
(інактивований)
є лактоза

Рис. 9.5. Катаболітна репресія в лактозному опероні E. coli

У лактозному опероні Е. соїії існують дві системи регуляції. Перший
регуляторний механізм уже було описано раніше на прикладі індуцибельного
оперона з негативним контролем. Він реалізується в області оператора за рахунок
білка-регулятора, блокувальна дія якого знімається в результаті зв'язування з
індуктором - лактозою. Однак за наявності ще одного легкозасвоюваного цукру
глюкози цього недостатньо для початку транскрибування генів лактозного
оперона. Оперон не може «включитись» до тих пір, поки з сусідньою областю -
промотором не зв'яжеться інший специфічний білок-регулятор САР (сагабойе
асіїуаїог ргогеїп), тобто поки не спрацює друга система регуляції. Зв'язування
 138

CAP із промотором -- необхідна умова для приєднання РНК-полімерази до ДНК.

Однак ефектором САР є циклічний АМФ (цАМФ), який у достатній кількості
з'являється у клітині тільки після вичерпання глюкози. Поки в середовищі є
глюкоза, вона залучається до гліколізу із утворенням АТФ. Як тільки глюкоза
буде вичерпана, кількість АТФ у клітині різко зменшиться, але зросте
концентрація ЦАМФ, який є сигналом голоду й ефектором-індуктором САР. Під
дією ЦАМФ білок САР модифікується і вже як активатор приєднується до
промотору, прискорюючи приєднання та збирання РНК-полімерази. Таким чином
активований САР «вмикає» транскрипцію генів лактозного оперона, завдяки чому
клітини бактерій переходять на живлення лактозою. Отже, у лактозному опероні
під час катаболітної репресії функціонують дві системи регуляції: одна - на
операторі (індукція з негативним контролем), інша - на промоторі (індукція з
позитивним контролем). На операторі контроль здійснюється за допомогою
білка-репресора та індуктора лактози, на промоторі «вмикання» оперона
забезпечується завдяки приєднанню білка-регулятора САР та його ефектора
цАМФ.
Розглянутий механізм ще називають вуглецево-катаболітною репресією,
щоб підкреслити факт координованої регуляції катаболізму вуглеводів. Проте
подібні механізми в прокаріотів було виявлено й при азотному та фосфорному
метаболізмі. Tak, синтез позаклітинних протеїназ у бацил може бути
репресований різними амінокислотами та пептидами. У Васійих licheniformis
синтез протеолітичних ферментів пригнічуть глутамат і аспартат, у В. тегаїегійт
- ізолейцин і треонін. У безперервній культурі 8. //спепі/огтіз секреція протеїназ
відбувається тільки в разі лімітації азотом, що свідчить про репресію синтезу цих
ферментів на багатих середовищах шляхом азотної регуляції. У інших
мікроорганізмів, у тому числі вібріонів 1 Neurospora crassa, CMHTe3 протеїназ
індукується низькими і репресується високими концентраціями амінокислот або
амонію. Синтез практично всіх позаклітинних | ферментів у більшості
мікроорганізмів, у тому числі нуклеаз, карбогідраз і вже згаданих протеїназ,
контролює катаболітна репресія. У такий спосіб мікроорганізми уникають
непотрібного синтезу індуцибельних і конститутивних ферментів для утилізації
малоефективних субстратів.
9.2.3. Регуляція експресії генів шляхом атенуації
Регуляцію експресії генів на рівні трансляції вивчено недостатньо. Можливо
в про- та еукаріотів існують специфічні механізми регуляції синтезу білка, але
безумовно в усіх організмів із клітинною організацію мають бути подібні загальні
механізми регуляції трансляції на рівні збирання рибосом і вмикання процесів
ініціації, елонгації та термінації.
Атенуація. У 1983 р. Чарлз Яновський відкрив дуже цікавий механізм
регуляції в Е. соїії при трансляції поліцистронної ІРНК, зчитаної з анаболічного
триптофанового гр-оперона. Цей механізм отримав назву атенуації. Він
реалізується, очевидно, як на рівні транскрипції, так і трансляції завдяки
утворенню альтернативних шпильок на ДНК і відповідній ІРНК. Слід відмітити,
 139

що шпильки на ІРНК з'являються за рахунок зчитування подібних структур із

молекули ДНК, в якій вони беруть участь у регуляції транскрипції.
———————-
«критична»
старт
р: область стоп
то 4 ЕІ
UUUU
i 2 3, 4

шпилька /--2 у
о шпилька 3--4 (термінаторна)

и
0000
---- шпилька 2--2 (антитермінаторна)
1--2
3--4
За даної конформації
здійснюється термінація

= uUUU М
-ни 3 yuu
За даної конформації транс-
крипція продовжується
в область структурних генів
оперону
2--3
Рис. 9.6. Атенуація транскрипції у триптофановому опероні Е. соїї
за рахунок утворення альтернативних шпильок

Регуляція транскрипції шляхом атенуації може відбуватися за рахунок

завчасної термінації синтезу ІРНК у специфічному сайті (між лідерною ділянкою і
першим структурним геном), де можуть утворюватися шпильки. На лідерному
транскрипті формуються шпилькові структури між комплементарними ділянками
ІРНК, причому можливе утворення трьох шпильок 1-2, 2-3 і 3-4 (рис. 9.6).
Залежно від комплементації різних ділянок РНК будуть утворюватись різні
вторинні структури. Так, формування шпильки 1-2 припускає утворення
шпильки 3-4, що обумовлює завчасну термінацію транскрипції. І навпаки,
формування шпильки 2-3 унеможливлює утворення шпильки 3-4, завдяки чому
транскрипція продовжується в область структурних генів.
Оскільки в прокаріотів транскрипція і трансляція сполучені й відбуваються
практично одночасно, то процес синтезу може регулюватися і на рівні трансляції
на рибосомах. Це, очевидно, відбувається, коли процес транскрипції і трансляції
проходить із великою швидкістю і в клітині починає накопичуватися надлишок
кінцевого продукту триптофану. Механізм атенуації на рівні трансляції детально
розглянуто в підрозділі 9.3.
Механізм атенуації було виявлено не тільки в оперонах біосинтеза
амінокислот (триптофану 1 гістидину), але й при синтезі бета-лактамази в E. coli.
Атенуація притаманна як анаболічним, так і катаболічним оперонам.
Рибоперемикачі. Крім атенуації виявлено ще один механізм регуляції, в
основі якого лежить утворення шпильок та інших вторинних структур на
молекулах ІРНК. Такі регулятори були названі рибоперемикачами (рис. 9.7).
Механізм регуляції транскрипції за допомогою рибоперемикачів було виявлено
при синтезі ІРНК тирозил-тРНК-синтетази у Васійиз 5зифійїз. У даному випадку
 140

спостерігається термінація | транскрипції за надлишку тирозину та ефект

антитермінації у разі його дефіциту.
Антитермінатор

я
а 0
Рис. 9.7. Регуляція експресії генів у прокаріотів за допомогою рибоперемикачів:
а - утворення термінатора; б - утворення антитермінатора
Таким чином, регуляція транскрипції за допомогою рибоперемикачів
відбувається під дією метаболіту. За його наявності утворюється шпилькова
структура, що відіграє роль термінатора, а за відсутності метаболіту термінатор
перетворюється на антитермінатор, у результаті чого здійснюється синтез
повноразмірної РНК (рис. 9.7). Проте існує подібний механізм, що не залежить
від білкових факторів і кінцевого продукту синтезу - антитермінація.
Антитермінація визначається вторинною структурою лідерної ділянки
ІРНК. Вона пов'язана із цис-ефектами та здійснюється в процесі трансляції
лідерного пептиду. Переміщення транслюючої рибосоми обумовлює формування
в ІРНК альтернативних шпильок, які або сприяють, або запобігають термінації
транскрипції на сайті атенуації.
Роль ЮТР у регуляції транскрипції. У кишкової палички принаймні у двох
оперонах, що відповідають за синтез піримідинів (руг8/) та утилізацію галактози
(galETKM), виявлено новий механізм регуляції транскрипції в разі зміни
внутрішньоклітинної концентрації уридинтрифосфатів (ЮТР). За високої
концентрації UTP РНК-полімераза затримується на промоторі Й замість
повноцінного транскрипта (ІРНК) синтезує велику кількість псевдоматричних
продуктів із нуклеотидною послідовністю ррр( А) г( Ю),, де п більше 20, причому
за низької концентрації ЮОТР РНК-полімераза здійснює транскрипцію звичайним
способом без затримки. Тобто, якщо мова йде про ругВ/-оперон, що кодує
ферменти для синтезу попередників піримідинів, і в тому числі уридину, то
очевидна наявність регуляції за типом негативного контролю кінцевим
продуктом. Участь ЮТР у негативній регуляції оперона єа/ЄТКМ може бути
пояснена участю в даному процесі проміжного продукту |ТР-галактози.
Можливо, даний тип регуляції більш поширений, ніж вважають зараз.
У ругВІ-опероні крім ЮТР-контролю затримки РНК-полімерази ще існує
контроль шляхом атенуації, оскільки в лідерній послідовності ІРНК може
утворитися шпилька, яка в разі надлишку ЮТР може завчасно припинити процес
трансляції.
Слід відмітити, що у прокаріотів, на яких проведено більшість досліджень із
вивчення механізмів регуляції, дуже складно відділити механізми регуляції
 141

транскрипції від механізмів регуляції трансляції, оскільки ці два етапи експресії

генів сполучені і відбуваються практично синхронно.
9.3. Механізми регуляції трансляції
Регуляція трансляції в прокаріотів може відбуватися на етапах ініціації,
елонгації 1 термінації. Основним призначенням регуляції трансляції є
регулювання кількості синтезованих білкових продуктів. Ця регуляція являє
собою приклад більш тонкого налаштування метаболізму порівняно з регуляцією
транскрипції, коли регулюванню підлягають цілі групи генів, зібраних в оперони.
На базовому рівні регуляція трансляції здійснюється завдяки дії факторів ініціації,
елонгації та термінації трансляції, які були розглянуті у розділі 8. Проте існують і
більш специфічні регуляторні механізми, про які мова піде далі.
Пригнічення трансляції білками було встановлено - при синтезі
рибосомальних білків (КВ-білків), а також при трансляції поверхневих 1
серцевиних білків у багатьох бактеріофагів (Т4, КІ? та ін.). У бактерій існує
декілька оперонів, що містять гени для кодування всіх В-білків. Для першого з
генів оперона існує регуляторний В-білок, який може специфічно зв'язуватись із
певною послідовністю своєї власної ІРНК. Ця послідовність гомологічна сайту
зв'язування даного К-білка із рРНК. Клітина, що інтенсивно росте й активно
синтезує необхідні білки, потребує великої кількості рибосом, тому В-білки
інтенсивно включаються до їх складу і зв'язуються із рРНК. Коли ж збирання
рибосом закінчується, К-білки накопичуються в клітині і зв'язуються з власними
ІРНК, що обумовлює пригнічення трансляції всіх рибосомальних білків. Тобто
відбувається ауторегуляція одним із них власного синтезу й усіх інших В-білків.
Регуляція за участю антисмислових РНК. Антисмислові РНК - невеликі
молекули РНК, що транскрибуються на окремих генах, як і білки-репресори, і
можуть зв'язуватися із комплементарними послідовностями ІРНК в області ВБ5
(ділянка зв'язування з рибосомою). Таким чином, антисмислові РНК блокують
процес приєднання ІРНК до рибосоми, що унеможливлює трансляцію. Даний
механізм регуляції трансляції виявлено при контролі гена отрК у E. coli.
Регуляцію трансляції шляхом атенуації було досліджено в
триптофановому опероні Е. соїї. Утворена в ітр-опероні поліцистронна ІРНК
містить на 5-кінці лідерну послідовність, яка включає підвищену кількість
триплетів для кодування триптофану, синтез якого забезпечується даним
опероном. Якщо в клітині недостатньо триптофану, то ІРНК своєю лідерною
послідовністю проходить через пептидильний 1 аміноацильний центри рибосоми
«вхолосту», оскільки до місця синтезу не надходять навантажені триптофаном
тРНК. У даному випадку в лідерній послідовності, прокатаній через рибосому, за
рахунок вертикальної комплементації формується шпилька, яка внаслідок зміни
конформації молекули унеможливлює утворення альтернативної шпильки в
області структурних генів. Тому частина ІРНК, що кодує структурні гени, без
перепон транслюється з утворенням ферментів, необхідних для синтезу
триптофану. У протилежному випадку, коли в клітині є надлишок триптофану і до
рибосом надходять навантажені триптофаном тРНК, лідерна послідовність ІРНК
 142

транслюється, проте шпилька утворюється в зоні структурних генів, що

призводить до завчасної термінації трансляції. У результаті цього ферменти
синтезу триптофану не утворюються і синтез самого триптофану припиняється.
Механізм атенуації трансляції при індукції стійкості до антибіотиків
макролідів, лінкозамідів і стрептограмінів (МІ.5) було виявлено у стафілококів,
стрептококів 1 стрептоміцетів. У лідерній послідовності ІРНК гена егт, що кодує
фермент | РНК-метилазу (забезпечує стійкість | до | еритроміцину), між
комплементарними ділянками можуть утворюватись альтернативні шпильки 1-2,
2-3 1 3-4. Трансляція гена відбувається тільки за наявності індукуючого фактора
еритромщину, який сприяє утворенню шпильки 2-3. У результаті синтезується
РНК-метилаза, яка за рахунок диметилювання аденіну в 235 РНК знижує
спорідненість еритроміцину до 505-субодиниці рибосоми, тобто виникає стійкість
до антибіотика. За відсутності в середовищі еритроміцину в ІРНК формується
альтернативна шпилька 3-4, що унеможливлює трансляцію. Внаслідок цього
припиняється синтез РНК-метилази і стійкість до антибіотика не формується.
Контроль елонгації трансляції зі зміщенням рамки зчитування уперше
було виявлено у вірусів еукаріотів (ретровірусів), а пізніше - у кишкової палички
та її фагів. У Е. сої такий механізм регуляції діє на стадії елонгації трансляції
iPHK rena dnaX. Цей ген відразу кодує дві субодиниці основного ферменту
реплікації ДНК-полімерази ПІ - т 1 у. Субодиницю т кодують 643, а субодиницю у
- 431 кодони. Вони мають відповідну кількість амінокислот, послідовність яких
повністю збігається з М-кінця. Тобто трансляція субодиниці у завершується
раніше, але для цього повинен бути сигнал термінації - стоп-кодон. Такий стоп-
кодон УГА може з'явитись, якщо рамка термінації трансляції на межі 431 і 432
кодонів після приєднання 431-ї амінокислоти зміститься назад на - 1. Для цього
рибосома робить крок назад на І нуклеотид і завдяки цьому в її аміноацильному
центрі з'являється стоп-кодон УГА, що є сигналом для термінації трансляції.
Механізм такої регуляції ще остаточно не встановлено, але відомо, що зсув рамки
зчитування стимулює шпилькова структура, яка формується відразу за кодоном
УАГ. Можливо, саме шпилька трохи зміщує рибосому назад. Цікаво, що під час
синтезу довшої субодиниці т зміщення рамки зчитування не відбувається й
елонгація поліпептиду продовжується до кінця рамки на С-кінці.
«Стрибок» рибосоми під час елонгації трансляції. Зсув рамки зчитування
може бути обумовлений «стрибком» рибосоми по ІРНК. Такий механізм регуляції
трансляції виявлений при синтезі білка єрб0 (субодиниця топоізомерази) фага ТА
у клітині Е. сої. У молекулі ІРНК цього білка кодони 46 і 47 розділені зайвим
сегментом із 50 нуклеотидів. Рибосома в процесі трансляції ніби перестрибує
даний сегмент, «приземлюється» на кодоні 47, зміщується назад на -1 1
продовжує трансляцію. Вірогідно, що цей механізм регуляції так само, як і в
попередньому випадку, пов'язаний із формуванням вторинної структури РНК у
зайвому сегменті у вигляді шпильки або петлі.
Посттрансляційний сплайсинг білків. Відомо, що гени еукаріотів
зазнають процесингу після транскрипції. Мова йде про сплайсинг, що
супроводжується | вирізанням некодуючих інтронів і зшиванням кодуючих
 143

екзонів. Проте, як було встановлено, сплайсинг може відбуватися і після

трансляції - уже на синтезованих молекулах білка. За аналогією зі сплайсингом
РНК зайві спейсерні ділянки білка-попередника (кодовані інтронами) отримали
назву інтеїнів, а продукт з'єднання значущих сегментів (кодованих екзонами) -
екстеїну. Сплайсинг кінцевих сегментів інтеїнів із утворенням eKCTeiHy
відбувається автокаталітично. Даний вид сплайсингу інколи зустрічається навіть у
прокаріотів. Так, наявність одного інтеїну встановлено в продуктах гена гесА у
МусоРастегіит їиБетсиїозія 1 М. Іергаєе. Виявлено також білки з двома інтеїнами.
Слід відмітити, що інтеїни виявляють сайт-специфічну ДНК-ендонуклеазну
активність. Вільний інтеїн розпізнає і специфічно розщеплює ДНК у сайті, де має
бути інтрон, відповідний інтеїну. У такий сайт шляхом транспозиції може
переноситись відсутній інтрон. Таким чином ділянка, кодуюча інтеїн, ніби
повертається «додому», тому даний феномен отримав назву хоумінгу (від
англ. йоте - дім). Учені припускають, що, можливо, самі інтеїни являють собою
продукти транспозонів, колись вбудованих у певні специфічні сайти ДНК. Цікаво,
що подібні за амінокислотними послідовностями інтеїни зустрічаються не тільки
в мікобактерій (прокаріотів), а й у дріжджів (еукаріотів). Це може свідчити про
важливу роль МГЕ в еволюції геномів за рахунок горизонтальної передачі
генетичного матеріалу навіть між представниками різних царств живих істот.
Рестрикція використання кодонів. Цей тип регуляції транскрипції
пов'язаний із тим, що в ІРНК певного організму переважно наявний один із
кодонів-синонімів, характерний для всіх генів незалежно від їх функції. Для
успішної трансляції і синтезу поліпептиду із ізоакцепторних тРНК мають бути
обрані тільки ті, антикодони яких подібні до аутентичних синонімічних кодонів в
ІРНК. У протилежному випадку трансляція може припинитися.
Як приклад можна навести регуляцію синтезу антибіотика актинородину у
Streptomyces coelicolor i S. lividans, rexwu якого зібрані у цілий регулон. Цей
регулон контролює білок-активатор. У його гені зустрічається дуже рідкісний
лейциновий кодон УУА. Мутації в гені відповідної транспортної РНК, що
приводять до появи антикодона-синоніма в TPHK, повністю пригнічують
трансляцію білка-активатора й антибіотик актинородин не синтезується.
Рестрикція використання кодонів досить часто зустрічається у фагів, для
яких характерна наявність лише одного з кодонів-синонімів.
Рестрикція використання кодонів обумовлена тим, що нуклеотиди у складі
РНК мають задовольняти умови спаровування для підтримання вторинної 1
третинної структур, важливих для регуляції трансляції та процесингу ІРНК.
9.4. Особливості регуляції експресії генів в еукаріотів
Регуляція експресії генів еукаріотів, очевидно, має складніший характер, ніж
у прокаріотів. Важливу роль у регуляції експресії генів еукаріотів відіграють
регуляторні ділянки промотора й термінатора, що регулюють початок і кінець
транскрипції. В еукаріотів виявлено регуляторні білки (подібно прокаріотам), що
здатні зв'язуватись із промоторною зоною гена й забезпечувати або активацію,
або пригнічення транскрипції. Так, уже згадуваний регуляторньй білок 5РІ,
 144
зв'язуючись із ГЦ-мотивом, може посилювати транскрипцію в 10-20 разів.
Також регулювальну функцію виконує процесинг під час дозрівання
синтезованої іРНК. Так, первинний транскрипт, зчитаний із еукаріотичного гена,
являє собою незрілу про-іРНК довжиною від 2 до 50000 тис. п.н. Вона зазнає
декілька етапів процесингу ще до транспортування з ядра в цитоплазму, де на
рибосомах відбуватиметься трансляція. Процесинг включає: кепування --
добудову до 5-кінця «кеп»-сайта із метильованих нуклеотидів; сплайсинг --
вирізання некодуючих ділянок (інтронів) 1 зшивання кодуючих екзонів;
поліаденілювання 3-кінця ІРНК після заключного етапу сплайсингу, а саме
формування на кінці молекули досить довгого ланцюгу із залишків аденіну. Усі
етапи процесингу регулюються спеціальними білками, які можуть включатися в
регуляцію каскадно. Крім того, регуляція транскрипції і трансляції в еукаріотів
відбувається на рівні збирання рибосом, а також у процесі ініціації, елонгаціїі
термінації трансляції. Через складність цих процесів вважають, що регуляція
експресії генів в еукаріотів відбувається на більшій кількості рівнів, ніж у
прокаріотів.
Певну роль у кооперації різних систем багатоклітинних еукаріотів
відіграють гормони, що безпосередньо можуть зв'язуватись із ДНК і впливати на
експресію тих чи інших генів.
Крім перелічених вище регуляторних механізмів важливе значення для
регуляції експресії генів мають регуляторні ділянки ДНК - специфічні
нуклеотидні послідовності, що відіграють роль енхансерів - підсилювачів
транскрипції, а також послідовності, що виконують функції сайленсерів --
глушників транскрипції. Цікаво, що одні Й ті ж послідовності в одній клітині
можуть бути енхансерами, а в іншій - сайленсерами.
Енхансери - основний засіб регуляції транскрипції у клітинах вищих
еукаріотів, вони збільшують ефективність транскрипції генів у 10-100 разів.
Енхансери можуть діяти на достатньо великій відстані від гена і незалежно від
його орієнтації відносно напрямку транскрипції. Для цього вони мають бути
зближені з промотором гена за рахунок утворення петлі ДНК (рис. 9.8).
Можливість контакту енхансера з промотором залежить від інших регуляторних
елементів, які власне і забезпечують формування петлевих доменів хроматину.
@& ДНК полімераза П

. Медіатор

Коактиватор'фактор
Exxancep AC) М транскрипції
Осі4 — | Гілерчутливий
Промотор сайт

Рис. 9.8. Зближення енхансера та промотора гена Осі4 завдяки

утворенню петлі в ембріональних стовбурових клітинах
 145

Такими регуляторними елементами можуть бути інсулятори. Можливо, вони

можуть слугувати і перемикачами між енхансерами та сайленсерами, завдяки
чому теж регулюється експресія генів.
Інсулятори було відкрито в еукаріотів (дрозофіл) нещодавно, але вони
надзвичайно зацікавили дослідників як нові й дуже важливі регуляторні фактори
експресії генів. Вони являють собою цис-елементи генома, здатні блокувати
взаємодію між енхансерами (підсилювачами) і промоторами генів. Усе більше
даних свідчить про те, що інсулятори не просто блокують енхансери, а
забезпечують правильну для даної клітини просторову організацію ДНК. Таким
чином інсулятори регулюють, які енхансери вмикатимуться, а які - ні. Інсулятор
допомогає енхансеру обрати промотор для активації. Саме цей механізм,
очевидно, і забезпечує вмикання певних генів у спеціалізованих тканинах 1 їх
блокування в інших тканинах, де відповідні білкові продукти непотрібні.
Також інсулятори здатні в тих чи інших ділянках просторово блокувати
утворення гетерохроматину, обмежуючи можливість або частоту активації
певних генів. Тобто саме інсулятор визначає, яка ділянка хроматину буде
«відкритою» для транскрипції, а яка - «закритою».
Дія інсулятора неоднозначна і залежить від комунікації з іншими
інсуляторами. Специфічна взаємодія інсуляторів можлива завдяки зв'язуваню зі
специфічними білками. Так, білок СТСЕ (СССТС-Ріпаїпе /асіог) може специфічно
приєднуватись до нуклеотидної послідовності інсулятора СССТС й імовірно
відіграє головну роль у забезпеченні взаємодії між розташованими поблизу
інсуляторами. З'ясовано, що цей білок, який спочатку був описаний як
інсуляторний, у ядрі виконує декілька функцій: забезпечує взаємодію між
енхансерами і промоторами, перебуває на межах доменів активного і неактивного
хроматину тощо. СТСЕ-білок - не єдиний фактор, що взаємодіє з інсуляторами.
3 У дрозофіл бурбу на інсуляторі виявлено
su|—_

| комплекс специфічних білків, які кодуються

( reHaMH peTpoTpaucno30ny gypsy — Mod (mdg)4,
Ing

Su (HW), СРІ90, СУР. Дані білки

забезпечують взаємодію двох інсуляторів, що
може призводити до нейтралізації
блокувальної дії інсуляторів на енхансер,
формування петлі зі зближенням енхансера і
a промотора гена і посилення транскрипції
== (puc. 9.9).
Рис. 9.9. Роль інсуляторів у регуляції
активності хроматину
Цікаво, що окремо розташовані інсулятори можуть блокувати не тільки дію
енхансерів, але й сайленсерів. Відомо, що ретротранспозони еукаріотів походять
від ретровірусів і є ДНК-копіями вірусних РНК, що утворились завдяки зворотній
транскрипції. Така система регуляції «вигідна» для дуже малих за розмірами
вірусів, у яких можливе тільки послідовне вмикання генів, а в еукаріотів вона
 146

«прижилася» через велику кількість генів, що не можуть транскрибуватися

одночасно.
Кластер В-глобінових генів у мишей регулюється за допомогою специфічної
регуляторної зони ІСЕ довжиною 16 тис. п.н. що складається із енхансера,
інсулятора та інших регуляторних елементів. ІСВ дуже чутлива до дії ДНК-ази I,
що вказує на її розташування в міжнуклеосомній ділянці. Можливо, що саме ці
лінкерні ділянки ДНК, розміщені між шнуклеосомами, і є основними
регуляторними зонами, які «вирішують» - відкривати дану зону хроматину для
транскрибування чи ні.
"р H3.3 H3K27me3
HOAZ @

@ я
ни se: Інсулятор Сайленсер

СВР
H3K4 Енхансер ] . :
тет/2 РНК -пполімераза П
H3.3/
H2A.2 H3K4 _ H3K4
нам H3K4me3 тет/2Н3 3" meti2

ЧО; я ПРЕ ж!
об Фе
Проксимальний Промотор Дистальний Р Пн 3
елемент промотора елемент промотора

Рис. 9.10. Роль інсуляторів у регуляції експресії В-глобінових генів у мишей

На рис. 9.10 зображено частину хромосоми, де розташований один ген
(нижня частина петлі) із промотором (ТАТА) і 3 енхансери, один із яких
(енхансер 2 у верхній частині петлі) перебуває під контролем інсулятора.
Оскільки в петлі енхансери не зближені з промотором, дія інсулятора пригнічує
активність усіх трьох енхансерів.
В останні роки науковці інтенсивно вивчають малі ядерні РНК (мяРНК).
Установлено існування специфічної групи дволанцюгових коротких РНК (21-23
пар нуклеотидів), які беруть участь у регуляції роботи певних генів шляхом
вимикання їх експресії. Такі регуляторні молекули отримали назву малих
інтерферуючих РНК (міРНК або 5іКМА). Американські вчені Е. Файр і
К. Меллоу за відкриття явища РНК-інтерференції у 2006 р. отримали Нобелівську
премію. Відомо, що міРНК захищають ДНК хромосом від ретровірусів,
ретропозонів, ретротранспозонів та іншої чужорідної інформації.
Описані в даному розділі процеси не вичерпують того великого різноманіття
регуляторних механізмів, що реально існують у клітинах прокаріотів та
еукаріотів. Їх вивчення потребує значних зусиль, проте результати подібних
досліджень дуже важливі для розробки систем регуляції генної активності,
лікарських препаратів для подолання багатьох спадкових хвороб, раку, СНІДу, а
також для створення ефективних засобів для боротьби зі старінням.
 147

Частина ІУ. МЕХАНІЗМИ ГЕНЕТИЧНОЇ МІНЛИВОСТІ

Розділ 10. МУТАЦІЇ ТА МОДИФІКАЦІЇ
В основі всіх матричних процесів у клітині - дивовижна стабільність
генетичного матеріалу. Ця властивість, однак, не результат метаболічної
інертності ДНК, вона пов'язана із наявністю особливих систем для підтримки
стабільності її первинної послідовності й більш високого порядку структур, що
безперервно змінюються в процесі нормальної життєдіяльності. Але в природі, в
будь-якій найдосконалішій системі все рівно є недоліки.
Мутагенез - процес появи спадкових змін-мутацій, який може бути штучно
створений, прискорений 1 видозмінений впливом на живі організми мутагенами.
Розрізняють такі види мутагенезу:
- природний (спонтанний), що відбувається в результаті дії зовнішніх
чинників середовища або фізіолого-біохімічних змін у живому організмі;
- штучний (індукований), зумовлений спрямованою дією різних фізичних
або хімічних чинників для одержання мутацій.
Найважливішими характеристиками мутагенезу є частота появи мутацій і їх
специфічність, тобто можливість повторного одержання однакових мутацій у
результаті впливу одного і того самого чинника. Як правило, хімічні й фізичні
мутагенні чинники навіть за високої частоти мають низьку специфічність.
Штучний мутагенез залежить від дози і концентрації чинника (мутагену),
тривалості його впливу, наявності систем репарації пошкоджень у генетичному
матеріалі (ДНК), а також відповідності мутацій конкретним умовам середовища
(адаптивні мутації). Мутагенез здатний проявлятися відразу після впливу чинника
або із затримкою в часі, яка може тривати навіть кілька поколінь.
Мутаційна теорія становить одну з основ сучасної генетики. Вона з'явилася
після перевідкриття Т. Морганом законів Менделя на початку ХХ ст. Вважають,
що вона майже одночасно сформувалася у працях голландця Хуго де Фріза (1903)
і російського вченого-ботаніка С.І. Коржинського (1899). Визнання основного
еволюційного значення за дискретною мінливістю та заперечення ролі
природного відбору в теоріях Коржинського і де Фріза було пов'язано з
невирішеним на той час протиріччям в еволюційному вченні Ч. Дарвіна між
важливою роллю незначних відхилень і їх «поглинанням» під час схрещувань
(«жахіття» Дженкіна).
Основні положення мутаційної теорії Коржинського- де Фріза:
- мутації раптові, як дискретні зміни ознак;
- нові форми стійкі;
- на відміну від спадкових змін, мутації не утворюють безперервних рядів,
не групуються навколо якогось середнього типу; вони є якісні «стрибки» змін;
- мутації виявляються по-різному і можуть бути як корисними, так і
шкідливими;
- імовірність виявлення мутацій залежить від кількості досліджуваних
особин;
- подібні мутації можуть виникати неодноразово.
 148

Класифікація мутагенів
За походженням мутагени класифікують як ендогенні, що утворюються в
процесі життєдіяльності організму, та екзогенні - усі інші фактори, у тому числі
й умови навколишнього середовища.
За природою походження мутагени класифікують як фізичні, хімічні та
біологічні.
Фізичними мутагенами є будь-який фізичний вплив на живі організми
безпосередньо на ДНК або вірусну РНК або опосередковано через системи
реплікації, репарації, рекомбінації.
Перші фізичні мутагени, відкриті вченими, - це різні види випромінювань:
іонізуюче випромінювання, радіоактивний розпад, ультрафіолетове
випромінювання.
Первинний ефект іонізуючих і ультрафіолетових випромінювань полягає в
утворенні одинарних або подвійних розривів у молекулі ДНК. Ультрафіолет
активно поглинають тканини і він спричиняє мутації лише в поверхнево
розташованих клітинах багатоклітинних тварин, однак на одноклітинних він діє
ефективніше. Вперше мутагенний вплив ультрафіолету установив А.Н. Промптов
у 1931 р. Іншими фізичними мутагенами є частинки різної природи, що мають
високу енергію: це альфа- і бета-випромінювання радіоактивних речовин і
нейтронне випромінювання. У разі безпосереднього впливу на ДНК основну роль
відіграють два параметри: величина енергії частинки, що впливає, і здатність
біологічного матеріалу поглинати цю енергію.
Мутації може спричиняти також висока або низька температура. У 1928 р.
Меллер довів, що підвищення температури на 10 градусів за Цельсієм підвищує
частоту мутацій у дрозофіл у 2-3 рази.
Знаючи спосіб впливу цих мутагенів, можна припустити, що вони повинні
впливати на ДНК будь-яких організмів. І дійсно, було виявлено, що, наприклад,
рентгенівські промені викликають мутації в найрізноманітніших тварин, рослин і
мікроорганізмів.
Установлено, що мутації, спричинені з випромінюванням, можуть
стосуватися будь-яких ознак організму, оскільки квант випромінювання або
частинка з високою енергією випадково може пошкодити будь-яку ділянку ДНК.
Кількість | мутацій | збільшуватиметься | зі | збільшенням інтенсивності
випромінювання, тобто зі збільшенням квантів або частинок у клітині в одиницю
часу.
Також було доведено, що фізичні чинники спричиняють ті ж мутації, що й у
випадку спонтанного мутагенезу.
У вищих живих організмів є речовини, що послаблюють вплив
випромінювання - фотопротектори, багато рослин містять алкалоїди та кумарини,
які посилюють процеси, спричинені радіацією, і ці речовини небезпечні для
тварин.
Фізичні мутагени і їх вплив суттєво залежать від попередньої еволюції
організму. До постійно діючих мутагенів організми виробили стійкість. Крім того,
 149

фізичний мутагенез може не реєструватися через швидку загибель мутантних

організмів.
До хімічних мутагенів відносять багато хімічних сполук
найрізноманітнішої будови. Найбільшу мутагенну активність проявляють різні
алкілувальні сполуки, а також нітрозосполуки, деякі антибіотики, які мають
протипухлинну активність.
Серед хімічних мутагенів вирізняють мутагени прямої дії (реакційна
здатність яких достатня для хімічної модифікації ДНК, РНК деяких білків) і
мутагени непрямої дії (промутагени - речовини, які самі по собі інертні, але
перетворюються B організмі на мутагени, в основному в результаті
ферментативного окиснення).
Мішенню дії мутагенів у клітині є ДНК і деякі білки. Певні мутагени
спричиняють мутації, не зв'язуючись ковалентно з ДНК. У цьому випадку
матричний синтез на ДНК відбувається з помилками. У ланцюзі синтезованої
ДНК на один нуклеотид більше або менше звичайної кількості. У даній ДНК і
виникають мутації.
Існують мутагени, що інгібують синтез попередників ДНК. У результаті
відбувається уповільнення або навіть припинення синтезу ДНК. Мутагенні й
канцерогенні властивості хімічних речовин тісно взаємопов'язані. Тому
виявлення можливих мутагенів у навколишньому середовищі, дослідження на
мутагенність продуктів промислового синтезу (барвники, лікарські препарати,
пестициди тощо) - важливе завдання сучасної молекулярної біології та генетики.
Установлено, що мутагенну активність мають кілька тисяч хімічних сполук.
Однак на відміну від іонізуючого та ультрафіолетового випромінювань для
хімічних мутагенів характерна специфічність дії, що залежить від природи
об'єкта і стадії розвитку клітини. У результаті взаємодії хімічних мутагенів із
компонентами спадкових структур (ДНК і білками) останні отримують первинні
ушкодження. У подальшому ці первинні ушкодження призводять до появи
мутацій.
Найпоширеніші хімічні мутагени:
- окисники та відновники;
- алкілувальні агенти й пестициди;
- деякі харчові домішки;
- продукти переробки нафти та органічні розчинники;
- лікарські препарати (особливо гетероциклічної будови).
До біологічних мутагенів відносять ДНК- і РНК-віруси, певні поліпептиди
і білки, наприклад О-стрептолізин і низку ферментів рестриктаз, а також
препарати деяких ДНК і певні плазміди.
Механізми появи мутацій у результаті впливу різних біологічних факторів
не повністю досліджено, проте агенти, що містять нуклеїнові кислоти, можуть
порушувати процеси рекомбінації, що призводить до появи мутацій. Рестриктази
«розрізають» ланцюги ДНК у місці (локусі) певної послідовності нуклеотидів,
специфічному для кожної рестриктази.
Біологічні мутагени:
 150

- специфічні послідовності ДНК-транспозони;

- деякі віруси (вірус кору, грипу та ін.);
- продукти обміну речовин (продукти окиснення ліпідів);
- транспозони - один із класів мобільних елементів генома які,
убудовуючись у геном, можуть спричиняти мутації, у тому числі й такі значні, як
хромосомні перетворення. Вони відіграють важливу роль у розвитку
толерантності до ліків серед мікроорганізмів, рекомбінаціїй та обміну генетичним
матеріалом між різними видами як у природі, так і в ході генно-інженерних
досліджень.
Механізм мутагенезу. Послідовність процесів, що призводить до мутації
(усередині хромосоми), така:
- пошкодження ДНК;
- якщо пошкодження сталося в незначущому фрагменті ДНК (інтроні), то
мутація не відбувається;
- якщо пошкодження сталося в значущому фрагменті (екзоні) і відбулася
коректна репарація ДНК або у виродженому генетичному коді не сталося
порушення, то мутація не відбувається;
- тільки в разі пошкодження ДНК у значущій частині, яке не було коректно
репароване, змінило кодування амінокислоти або яке призвело до випадіння
частини ДНК і поєднання ДНК в єдиний ланцюг, відбувається мутація.
Мутагенез на рівні генома також може бути пов'язаний із інверсіями,
делеціями, транслокаціями, поліплоїдією і анеуплоїдією, подвоєнням, потроєнням
(множинною дуплікацією) деяких хромосом.
Типи пошкодження ДНК. За широкою варіацією мутагенних агентів
можна виділити два основні типи пошкоджень ДНК: порушення структури
азотистих основ і пошкодження ланцюгів ДНК.
Порушення структури азотистих основ
1. Гідролітичне вирізання основ відбувається спонтанно, а також у
результаті дії вищеперерахованих факторів. Пентозофосфатний остов ланцюга
при цьому зберігається. Особливо значна швидкість вирізання пуринових основ, у
середньому за добу в диплоїдній клітині молекули ДНК втрачають 5:10" таких
основ. Якщо б ці помилки не виправляли системи репарації, то за 70 років у
кожній клітині організму, що не ділиться, молекули ДНК залишили б приблизно
тільки 25 Ус своїх пуринових основ. Проте клітини втратили б свою
життєздатність задовго до цього. Не менш драматичними були б наслідки і в
клітинах, що діляться. Якщо б зберігався хоча б один депуринізований нуклеотид,
то після реплікації ДНК один із дочірніх ланцюгів був би позбавлений у даному
місці цілого нуклеотиду. А після другої реплікації з'явилися б молекули ДНК,
позбавлені нуклеотидної пари, а це змінювало б весь зміст генетичної інформації
за пошкодженою ділянкою.
2. Гідролітичне дезамінування основ. У даному випадку втрачається не
ціла основа, а лише її аміногрупа. У ході такого процесу:
- цитозин перетворюється на урацил - основу, яка за нормальних умов
міститься лише в РНК;
 151

- У-метилцитозин перетворюється на тимін - звичну основу ДНК;

- аденін перетворюється на гіпоксантин - основу, яка не міститься за
нормальних умов ні в ДНК, ні в РНК.
Дані переходи змінюють генетичний зміст локусу. Наприклад, урацил і
тимін комплементарні вже не гуаніну (як цитозин і 5-МЦ), а аденіну. Це буде
проявлятися під час синтезу РНК чи ДНК.
3. Утворення димерів тиміну. Ініціює ультрафіолетове опромінення,
відбувається там, де два тиміділові нуклеотиди розташовані поруч у ланцюзі
ДНК. При цьому між їх основами замикаються два ковалентні зв'язки. У
результаті в даному локусі ДНК порушується структура подвійної спіралі та
здатність останньої брати участь у синтезі ДНК 1 РНК.
Пошкодження ланцюгів ДНК
1. Одноланцюгові розриви: між сусідніми нуклеотидами ланцюга ДНК
розривається фосфодіефірний зв'язок (тобто зв'язок між фосфатною групою і
дезоксирибозою). Особливо часто це відбувається в результаті впливу
рентгенівського та радіоактивного опромінення. У випадку накопичення в ДНК
великої кількості розривів порушується структура хромосом - з'являються так
звані хромосомні аберації.
2. Поперечні зшивки - ковалентні зв'язки двох видів:
- ДНК-ДНК, тобто між основами двох ланцюгів ДНК;
- ДНК-білок, тобто між ланцюгом ДНК і будь-яким білком хромосоми.
Дані зшивки блокують у цьому локусі синтез ДНК і РНК, оскільки в обох
процесах необхідне розходження ланцюгів ДНК.
Таким чином, навіть локальні пошкодження структури ДНК можуть
призводити до серйозних наслідків. Цим пояснюється наявність у клітинах різних
систем репарації ДНК, що спеціалізуються на усуненні різноманітних
пошкоджень.
Розділ 11. РЕКОМБІНАЦІЙНА МІНЛИВІСТЬ
Рекомбінацію було розтлумачено як процес кросинговеру Й обміну ділянок
ДНК між гомологічними хромосомами під час мейозу еукаріотичних клітин і
згодом зафіксовано в процесі інтеграції та передачі ДНК у бактеріальних геномах
після кон'югації, трансдукції або трансформації. Біологічне значення цих
процесів стимулювало перші спроби опису молекулярних механізмів, що беруть
участь у рекомбінації, і сприяло відкриттю моделі Холлідея (Ноіаау, 1964).
Отже, рекомбінація - це процес обміну генетичним матеріалом за
допомогою розриву й з'єднання різних молекул ДНК чи РНК. Рекомбінація може
відбуватися також за репарації двониткових розривів у ДНК і для продовження
реплікації в еукаріотів, бактерій і архей. У вірусів можлива рекомбінація між
молекулами РНК їх геномів.
Послідовність нуклеотидів у ланцюгах визначає специфічність ДНК, що
містить генетичну інформацію. Молекули, які мають спільне походження 1
складаються | з однакових нуклеотидних послідовностей, називають
гомологічними.
 152

Процеси рекомбінації можна розділити на три категорії:

І) загальна рекомбінація (гомологічна, законна), яка проходить між
гомологічними послідовностями ДНК;
2) сайт-специфічна рекомбінація, характерна для молекул ДНК, що мають
обмежену структурну схожість (зі строго визначеними нуклеотидними
послідовностями) - транспозиція;
3) незаконна рекомбінація (негомологічна), у якій можуть брати участь
молекули ДНК, які не мають жодної структурної подібності, - транслокація.
Загальна рекомбінація
Гомологічна рекомбінація починається з утворення в одному або обох
дуплексах ділянок поодиноких ланцюгів ДНК, які потім за допомогою
спеціальних білків знаходять комплементарні послідовності в гомологічному
дуплексі й утворюють із ними гетеродуплекс - ключовий проміжний продукт
(інтермедіат) рекомбінації. Кінцевим результатом рекомбінації буде обмін
однаковими частинами гомологічних молекул.
Із загальної рекомбінації як окремий випадок можна виділити ектопічну
рекомбінацію. Вона полягає в обмінах (кросинговерах) між окремими ділянками
гомологічної ДНК, розкиданими по геному. До них відносять різноманітні
рухливі елементи, названі так за здатність переміщатися по геному, гени
транспортних і рибосомних РНК, гістонів і багато інших повторюваних
послідовностей (повторів) ДНК. Така локальна гомологічна рекомбінація цікава
насамперед тим, що вона може обумовлювати хромосомні перебудови, а саме
утворення поворотів внутрішніх ділянок хромосом на 180? (інверсій), втрат
(делецій) 1 подвоєнь (дуплікацій) частин хромосом у результаті ектопічної
рекомбінації. Це тільки частина можливих перебудов хромосом. Інші їх типи
можуть утворюватися залежно від того, яка орієнтація повторів ДНК стосовно
один одного (пряма або зворотна), і від того, де вони розташовані: усередині
однієї хромосоми, у CeCTpHHCbKHX жхроматидах або різних хромосомах.
Незважаючи на те що обміни відбуваються між локальними ділянками гомології,
ектопічну рекомбінацію здійснюють в основному ті ж білки, що і гомологічну.
Рекомбінаційні процеси між гомологічними ДНК характеризується дуже
високою точністю, обумовленою точним спарюванням основ нуклеотидних
послідовностей, що беруть участь у рекомбінації батьківських ланцюгів ДНК.
Загальний механізм гомологічної рекомбінації можна пояснити на прикладі
хрестоподібної сучасної моделі Холлідея (рис. 11.1), де показано процес обміну
одноланцюговими ділянками між батьківськими дволанцюговими молекулами
ДНК, що закінчується утворенням структури хреста. Для того щоб гомологічні
молекули ДНК помінялися своїми частинами, спочатку повинні відбутися
розриви у всіх колах обох дуплексів, а вже потім - обмін ланцюгами і з'єднання
розривів. За Холлідеєм, розриви відбуваються не одночасно, а у два етапи.
Рекомбінація починається з первинних одноланцюгових розривів фосфодіефірних
зв'язків ДНК (їх робить фермент ендонуклеаза). Розриви відбуваються у двох
ланцюгах з однаковою полярністю (рис. 11.1, а). Біля точок первинних розривів
 153

відбувається обмін ланцюгами між дуплексами, який призводить до утворення

хрестоподібної структури, яку назвали напівхіазмою Холлідея (рис. 11.1, б).

А am С

8 ba X
a b с
А В С
д bB
a b є

Рис. 11.1. Модель Холлідея. Механізм загальної рекомбінації

Дана назва пояснюється тим, що в напівхіазмі в обміні беруть участь тільки два
ланцюги ДНК із чотирьох, що відрізняє її від повної хіазми - характерного
продукту завершеного мейотичного кросинговеру. Згодом відбувається дуже
важливий процес - переміщення точки перетину ланцюгів у напівхіазмі вздовж
рекомбінуючих дуплексів (рис. 11.1, в). Це явище відоме як міграція
розгалуження.Воно полягає в такому: від точки перетину ланцюгів йде
розплітання вихідних дуплексів і ланцюги, що вивільняються, тут же ренатурують
із комплементарними ланцюгами із гомологічних дуплексів, що призводить до
утворення та подальшого подовження гетеродуплекса (В/Б на рис. 11.1, в). Саме в
подовженні гетеродуплекса і є біологічний сенс міграції розгалуження. (ЇЇ
здійснюють спеціальні ферменти. Розміри гетеродуплекса за мейотичного
кросинговеру коливаються від кількох сотень до однієї тисячі пар нуклеотидів
(п.н), у разі рекомбінації в соматичних і прокаріотичних клітинах він ще довший.
Отже, гетеродуплекс сформовано. Новоутворена складна розгалужена
структура повинна розділитися на гомологи. Цей процес називають дозволом
напівхіазми. Для завершення процесу необхідні ще два розриви ланцюгів:
вторинні розриви завершать обмін ланцюгами. Напівхіазма має зазнати ще одного
перетворення - ізомеризації. Ізомеризація полягає в зміні структури напівхіазми,
яка відбувається за рахунок звичайного теплового руху молекул.
Структури в 1 в" ідентичні. У структурі в" відбувається один поворот на 1809
будь-якої пари дуплексних сегментів (плечей) (рис. 11.1 - нижня пара).
Новоутворена структура (рис. 11.1, г) може виникати між двома парами
 154

вторинних розривів. У результаті розривів ланцюгів однакової полярності 1-1 або

2-2 утворюються два типи їх рекомбінантних хроматид:
Г) хроматиди першого типу (рис. 11.1, д) містять внутрішній гетеродуплекс
В/Ь, а за конфігурацією флангових маркерів А і С не відрізняються від вихідних
(некросоверні хроматиди);
2) рекомбінантні хроматиди другого типу (рис. 11.1, е) кросоверні, вони
також містять гетеродуплекс, але обмінюються частинами по обидва боки від
нього.
Обидва типи продуктів рекомбінації рівномірні, що відповідає генетичним
даним, на які спирався Холлідей під час створення своєї моделі.
Клітини Є. соїї здатні до обміну генетичною інформацією за допомогою двох
процесів: кон'югації і трансдукції (на відміну від статевого).
У ході кон'югації клітини різних статевих типів контактують, і З клітини
донора в клітину реципієнта передається один із двох ланцюгів кільцевої ДНК
(хромосоми або кон'югативні плазміни, якщо остання не інтегрована в
хромосому). При цьому пари бактеріальних клітин поступово розходяться через
неміцний зв'язок між ними, і перенесення ДНК відразу припиняється. Тому
реципієнтні клітини ніколи не отримують від донора повну одноланцюгову
кільцеву хромосомну ДНК, а тільки її частину, яка відразу добудовується до
лінійного дволанцюгового фрагмента з так званими тупими кінцями (у них немає
виступних одноланцюгових кінців -- «хвостів»). Розміри перенесених фрагментів
варіюють, найчастіше вони досягають декількох сотень тисяч п.н.
У процесі трансдукції із клітин донора в клітину реципієнта за допомогою
бактеріофага (бактеріального вірусу) переноситься дволанцюговий фрагмент
бактеріальної хромосоми, але в десятки рази менший, ніж під час кон'югації.
Таким чином, стосовно фізичних законів генетичний матеріал, переданий
реципієнтам у ході кон'югації і трансдукції, відрізняється тільки розмірами. Далі
донорний фрагмент повинен замінити гомологічну частину хромосоми реципієнта
за | допомогою парних кросинговерів, ї що проходять біля кінців
фрагмента (рис. 11.1, в).
У лабораторії А. Кларка в США було виділено і вивчено набір мутантів E.coli
із порушеннями рекомбінації (у них було пригнічено здатність давати
рекомбінантних нащадків у результаті кон'югації і трансдукції). За допомогою
цих мутантів, названих кес, установлено відповідні гени, а потім виділено й
рекомбінаційні білки, інактивовані в мутантів. Найголовніший білок - ВесА -
продукт гена гесА. Білок має невеликий розмір (усього приблизно 38 КД) і
проявляє різноманітні активності. Він бере участь не тільки в рекомбінації, ай у
репарації ДНК. За умов /п уйго для прояву всіх активностей білка КесА потрібні
кофактори АТФ і одноланцюгова ДНК у будь-якій формі, наприклад дуплексній
ДНК із кінцевими (хвости) або внутрішніми (проломи) одноланцюговими
ділянками. Основне призначення білка КесА - активувати у взаємодію одно
ланцюгові ДНК із гомологічним дуплексом. Залежно від структури ДНК-
субстратів білок може активізувати різні рекомбінаційні реакції.
 155

Сайт-специфічна рекомбінація
Сайт-специфічна рекомбінація відбувається між специфічними
послідовностями ДНК у межах дуже коротких ділянок гомології, зазвичай
15-30 п.н. Вона поширена у прокаріотів і нижчих еукаріотів. Сайт-специфічна
рекомбінація забезпечує інтеграцію (включення) ДНК помірних фагів у
хромосоми бактерій, інверсію (зміну орієнтації) окремих ділянок ДНК у
хромосомах бактерій і бактеріофагів і в так званій двомікронній плазміді
дріжджів, а також інші процеси, які відіграють важливу роль у циклах розвитку
фагів і бактерій. Рідкісний, якщо не єдиний, але надзвичайно важливий приклад
сайт-специфічної рекомбінації в багатоклітинних тварин - перебудови в
послідовностях ДНК, які кодують імуноглобуліни, - білкові молекули, що
розпізнають той чи інший антиген у разі імунної відповіді у хребетних.
Розглянемо деякі з найвідоміших прикладів сайт-специфічної рекомбінації.
Найбільш вивчена вона в помірного бактеріофага лямбда. Після інфекції в клітину
Е. соїї лінійна віріонна дволанцюгова ДНК фага (рис. 11.2, а) замикається в кільце
(рис. 11.2, б) за рахунок наявних на її кінцях комплементарних одноланцюгових
послідовностей. Подальший розвиток фага може відбуватися шляхом інтеграції в
хромосому бактерії між генами 24! 1 bio (рис. 11.2, в). Інтеграція відбувається за
допомогою рекомбінації між особливими аїї (абасптепі)-сайтами: абР у
хромосомі фага і айВ у хромосомі бактерії. Інтегрований фаг називають
профагом.

ate Він фланкований між рекомбінантними

я Nien eee caiitamu attL (mipuii) i attR (mpasuii).
га Вирізання (ексцизія) профага | з
хромосоми відбувається у 0 зворотній
(2) послідовності. Запис реакцій в
gal_» bio узагальненому вигляді зображено
| aa SS на puc. 11.2, г. В інтегративній
я "4 рекомбінації беруть участь сайти акР і
Інтеграція |в Ексцизія
айВ, продукт фагового гена їпі (інтеграли)
gala RA SOB:
Це i Oim0K IHF (Integration Host Factor) E. coli.
— attl Р айв =, fe,
ши
Для ексцизії необхідні сайти абі, i attR, Ti
ж білки і продукт фагового гена Xis.
"4,

" Загальна реакція

Int, IHF Сайти абР і акВ нерівноцінні. Перший
POP’ + BOB’ BOP’ + POB'
Int, IHF, Xis має складну будову, розмір 270 п.н.,
2
складається з центральної частини О 1
Рис. 11.2. Схема сайт-специфічної двох прилеглих до неї частин: РіР".
рекомбінації у фага лямбда:

а - нуклеотидна послідовність аї-сайтів у центральній частині О (вертикальні риски вказують

на сайти розривів, що передують обміну ланцюгами між акР і аїїВ); б - проміжна структура,
яка утворилася після обміну між двома ланцюгами ДНК із однаковою полярністю в ай-сайтах,
фізично вона відповідає напівхіазмі Холлідея; в - продукт завершеної рекомбінації
 156

Усередині сайта айР розміщені ділянки зв'язування з інтегразою 1 білками ІНЕ і

Хіз. Сайт айВ влаштований простіше. Його розмір усього 23 п.н., гомологія з аїР
обмежена центральною частиною з 15 п.н., у якій є два сайти зв'язування з
інтегразою. Інтегрази - топоізомерази типу І, характерні для сайт-специфічної
рекомбінації. У результаті утворення комплексу інтегрази з анР-сайтом і білком
IHF формується складна нуклеопротеїдна структура, яка захоплює сайт аїВ. У цій
структурі послідовності ДНК абйі-сайтів зв'язуються за рахунок взаємодій між
субодиницями інтегрази і потім зазнають узгодженого розщеплення.
Як 1 всі топоізомерази І, інтегрази зазнають розриву в одному ланцюгу
кожного дуплекса, і в місці розриву утворюються 3"Р 1 5"-ОН-кінці ДНК.
Фермент ковалентно зв'язується з 3"'-Р-кінцем, завдяки чому енергія розірваного
фосфодіефірного зв'язку зберігається, 1 для подальшого замикання розриву,
здійснюваного тим же ферментом, не потрібно додаткової енергії. Так
топоізомерази відрізняються від ДНК-лігази, які використовують для зшивання
кінців ланцюгів ДНК енергію, звільнену за рахунок гідролізу сполук типу АТФ.
Тому розрив полінуклеотидного ланцюга, утворений топоізомеразою, називають
«тимчасовим» на відміну від фіксованих одноланцюгових розривів, активованих
ендонуклеазами. При цьому інтегрази можуть здійснювати рекомбінацію між
ай-сайтами шляхом замикання фосфодіефірного зв'язку з 5-ОН-кінцем з іншого
дуплекса, тобто шляхом обмінів 5"ОН-кінцями. Таку рекомбінацію між
дуплексами, що не потребує додаткової енергії, називають консервативною.
Є принципові відмінності сайт-специфічної рекомбінації від гомологічної.
У разі останньої молекули ДНК упізнають одна одну за допомогою прямого
зіставлення їх послідовностей за участю білка КесА. Для цього в ДНК уводять
спеціальні розриви-ушкодження, що вивільняють одноланцюгові ділянки ДНК,
цей процес 1 лежить в основі впізнавання гомологічних послідовностей. Навпаки,
у разі сайт-специфічної рекомбінації головну роль відіграє взаємовпізнавання
білків, пов'язаних із рекомбінаційними сайтами. Ці сайти зовсім короткі, і
гомологія між ними не важлива. Вона важлива для зв'язування зі специфічними
білками і для обміну ланцюгами між сайтами.
Транспозиції
Рекомбінаційні процеси ще одного типу - транспозиції - лежать в основі
переміщень рухомих генетичних елементів. Рухомі елементи - це особливі
послідовності ДНК, здатні, як це випливає з їх назви, до переміщень з однієї
ділянки молекули ДНК (хромосоми або плазміди) до іншої, або в іншу молекулу в
тій же клітині, або навіть у клітини іншого організму. Вони поширені як у
прокаріотів, так 1 у еукаріотів і при цьому досить різноманітні. Рухомі елементи,
як правило, не існують автономно, і для них характерне перебування в складі
хромосом або плазмід. Детальніше рухомі генетичні елементи й механізм
транспозиції розглянуто у розділі 12.2.
Незаконна рекомбінація
Незаконна рекомбінація - це група процесів, у якій рекомбінація
відбувається без гомології між молекулами ДНК і при цьому без участі механізмів
сайт-специфічної рекомбінації або транспозицій. Як приклади можна навести
 157

захоплення ретровірусом деяких клітинних генів за Його ексцизії з хромосоми

хазяйської клітини, а також інтеграцію фрагментів ДНК, які вводять у клітини
хребетних за допомогою мікроін'єкцій. Механізми незаконної рекомбінації мало
вивчені. Спільним для них є з'єднання кінців негомологічних молекул ДНК.
Уперше механізм однієї з реакцій незаконної рекомбінації був описаний
японським дослідником Х. Ікеда та співавторами у 19382 р. У досліді іп уйтго вони
продемонстрували рекомбінацію між повністю негомологічними ДНК плазміди
рРВК322 1 фага лямбда, який каталізує топоізомераза П (ДНК-гіраза) Є. сої. Згідно
з моделлю, запропонованою авторами, дві молекули гірази, кожна з яких
складається з двох пар субодиниць, тимчасово розривають в обох молекулах
обидві ланцюги ДНК, утримуючи їх кінці. Потім вони обмінюються парами
субодиниць разом з утримуваними кінцями різних ДНК-партнерів і зшивають
кінці дуплексів. Пізніше Ікеда дослідив таку рекомбінацію й in vivo
у клітинах Є. соїї. На сьогодні наявні дані про участь топоізомераз обох типів у
незаконній рекомбінації у бактерій 1 еукаріот.
В останнє десятиліття у амфібій 1 ссавців виявлено ферменти, що зв'язують
дволанцюгові кінці ДНК незалежно від їх гомології. Природа цих білків до
останнього часу залишалася невивченою. У 1994-1995 рр. за результатами
дослідження гризунів-мутантів, які мають підвищену порівняно із здоровими
особинами чутливість до іонізуючих випромінювань, здійснено сенсаційний
прорив у даній галузі. Відомо, що іонізуюче випромінювання спричиняє
дволанцюгові розриви ДНК, тобто розриви хромосом, для відновлення яких у
здоровій клітині є спеціальні системи репарації. У мутантів вони порушені. Крім
того, у мутантів пригнічена інтеграція в хромосоми фрагментів ДНК, штучно
введених у клітини, оскільки в ссавців в основі процесів як інтеграції чужорідної
ДНК, так і репарації дволанцюгових розривів лежить з'єднання кінців розірваних
дволанцюгових ДНК без гомології, тобто обидва процеси відбуваються за
механізмом незаконної рекомбінації (на відміну від дріжджів і бактерій, у яких
вони засновані на гомологічній рекомбінації). Несподіваним виявився той факт,
що мутанти нездатні до рекомбінаційних перебудов у послідовностях ДНК, що
кодують імуноглобуліни. Таким чином, було з'ясовано, що в рекомбінації
імуноглобулінових послідовностей ДНК задіяно два різні механізми. Ранні етапи
- утворення дсайт-специфічних дволанцюгових розривів за типом сайт-
специфічної, а пізні - з'єднання решти розривів - за механізмом незаконної
рекомбінації. Виявлено також фермент, відповідальний за таку незаконну
рекомбінацію: зазначені вище радіочутливі мутанти виявилися дефектними за
ДНК-залежною протеїнкіназою. Фермент активується, зв'язуючись із вільними
кінцями ДНК незалежно від їх походження, і з'єднує ці кінці.
Незаконна рекомбінація, подібно до сайт-специфічної рекомбінації та
транспозиції, може призводити до хромосомних перетворень. У живій клітині
розриви хромосом, що є одним із активаторів незаконної рекомбінації, можуть
спонтанно відбуватися в ході реплікації, транскрипції і репарації ДНК.
 158

Розділ 12. МОБІЛЬНІ ГЕНЕТИЧНІ ЕЛЕМЕНТИ ТА ЇХ РОЛЬ

У МІНЛИВОСТІ ОРГАНІЗМІВ
Мобільними (або мігруючими) генетичними елементами (MITE)
називають усі елементи генома, здатні існувати автономно, інтегруватися в інші
геномні структури та самостійно переміщуватись між різними елементами
генома. До МГЕ відносять: плазміди, 15-елементи, транспозони та віруси.
Плазміди - незалежні генетичні елементи, які реплікуються автономно.
Проте епісоми - плазміди, що інтегруються в хромосому, можуть реплікуватися в
складі хромосоми. На відміну від плазмід транспозони реплікуються тільки в
стані інтеграції в хромосому, хоча деякий час після вирізання із ДНК вони можуть
перебувати в клітині автономно, нагадуючи плазміди. Віруси, а точніше їх
нуклеїнові кислоти, здатні реплікуватися тільки всередині клітини хазяїна І
можуть бути як у стані, інтегрованому в хромосому, так і автономно.
МГЕ відіграють колосальну роль у мінливості всіх живих істот, оскільки
можуть спричиняти суттєві рекомбінаційні зміни в ДНК. Переміщення МГЕ
супроводжується делеціями (випадіннями фрагментів ДНК) і інсерціями
(вставками геномних фрагментів), також у разі їх міграції можливі дуплікації
фрагментів ДНК, інші мутації та перебудови хромосом. За сучасними уявленнями
МГЕ - важливі компоненти генома, що забезпечують рекомбінативну мінливість
клітин. А потенційна здатність до генетичної рекомбінації - природжена
властивість всіх репродукуючих клітин.
Відносно походження мобільних генетичних елементів висунуто дві
альтернативні гіпотези -- прогресивної та регресивної еволюції МГЕ. Згідно з
першою гіпотезою в процесі еволюції відбувалося послідовне ускладнення в ряду
І5-елементи - транспозони - плазміди - віруси. Відповідно до гіпотези
регресивної еволюції деякі віруси типу /-фага (мю-фага) у бактерій ado
ретровіруси хребетних поступово втрачали здатність до самостійної реплікації 1
синтезу білків капсиду і перетворювались на плазміди й транспозони.
12.1. Плазміди
12.11. Загальна характеристика плазмід
Плазміди - це кільцеві дволанцюгові молекули ДНК, що можуть існувати в
клітині автономно або інтегруватися в інші елементи генома. Плазміди - не
обов'язкові геномні елементи, проте вони несуть додаткові гени, що забезпечують
клітині певні переваги в опановуванні навколишнього середовища та адаптації до
екстримальних умов існування. Молекулярна маса плазмід сягає І-300 мДа
(мегадальтон), довжина молекули - 2-600 тис. п.н.
Єдина номенклатура плазмід відсутня. Часто в їх назву входить літера «р»
(від англ. ріазтідє), а далі великими літерами - ініціали авторів і число,
наприклад, плазміда рВК 322 авторів Болівара і Родригеса. Іноді після літери «р»
приписують літери для позначення функції плазміди (наприклад, рРЕХ - для
експресії вектора). Деякі плазміди мають історично збережені ранні назви, без
літери «р», наприклад, В 100, ВЗЕ1010, Е-фактор, СоіН! та ін.
 159

На puc. 12.1 зверху зображено

плазміду всередині бактеріальної клітини,
внизу - Її вигляд на фотопластинці,
отриманій за допомогою радіоавтографії.
Добре видно, що плазміда має кільцеву
форму. Зазвичай плазміди значно менші за
розміром порівняно з хромосомою, але в
деяких бактерій зустрічаються
мегаплазміди, розмір яких складає
третину хромосоми. Їх навіть вважають
інм
додатковими хромосомами.
Рис. 12.1. Бактеріальна плазміда

Мегаплазміди відносять до великих плазмід. Вони можуть містити як гени

основних метаболічних функцій, так і додаткові гени, що сприяють адаптації
клітин у навколишньому середовищі (наприклад, гени антибіотикостійкості).
Мегаплазміди, можливо, утворюються за рахунок неточного вирізання епісом
(інтегрованих у хромосому плазмід) або шляхом коінтеграції декількох різних
плазмід чи плазміди з іншими генетичними елементами. Кількість копій даних
плазмід на клітину становить, як правило, не більше 1-2.
Деякі плазміди можуть утворювати у клітині багато ідентичних копій (30 і
більше), їх ДНК може становити від 0,01 до 8-10 905 генома. Такі плазміди
називають мультикопійними.
Шляхом ампліфікації (збільшення кількості копій) маса плазмідної ДНК у
клітині може бути збільшена до 50 90 1 більше, а кількість копій може досягати
декількох сотень і навіть 3 тис. на клітину. Метод ампліфікації застосовують у
генній інженерії для клонування векторних плазмід, що несуть вбудований
цільовий ген. Для цього плазмідовмісні клітини обробляють хлорамфеніколом
або вирощують клітини за підвищеної температури (42°C). За таких умов
реплікація хромосомної ДНК припиняється, а синтез плазмідної ДНК
відбувається без перешкод, завдяки чому плазміда розмножується.
Плазміди можуть існувати у 3 основних структурних формах:
- ССС-форма - (від англ. сомаіепііу сіозеа сікгкіе) - ковалентно замкнуте
кільце. Ця форма характерна для суперскручених плазмід із 8-10 супервитками;
- форма релаксованого кільця характерна для плазміди, із розривом в
одному з ланцюгів ДНК. Очевидно, плазміди переходять у таку форму перед
початком реплікації (подвоєння), оскільки в суперскрученому стані просування
реплікативної вилки вздовж хромосоми неможливе;
-. лінійна форма плазміди утворюється в результаті дволанцюгового розриву
в молекулі. Перехід у таку форму може передувати інтеграції плазміди в
хромосому або в інший елемент генома.
 160

Описані | форми плазмід | можуть бути розділені шляхом

ультрацентрифугування у градієнті сахарози з додаванням бромистого етидію.
За функціями плазміди можна розподілити на регуляторні та кодуючі
(фенотипові). Регуляторні плазміди несуть гени регуляторних білків, що можуть
виправляти або компенсувати певні дефекти метаболізму бактеріальної клітини.
Кодуючі (фенотипові) плазміди вносять у клітину нову генетичну інформацію, а
саме гени, що забезпечують клітині нові незвичайні властивості, наприклад,
стійкість до антибіотиків, ксенобіотиків, здатність синтезувати нові сполуки
(бактеріоцини, токсини, гемолізини, адгезини тощо). Таким чином, плазміди
забезпечують адаптацію клітин в агресивних умовах оточуючого середовища.
Саме з наявністю плазмід пов'язують різноманіття бактерій та їх еволюцію.
12.1.2. Властивості плазмід
Найкраще вивчені плазміди бактерій і одноклітинних грибів (дріжджів). За
властивостями плазміди подібні до інших елементів генома, але мають і деякі
специфічні особливості. Для плазмід характерні: здатність до самореплікації,
трансмісивність, інтегративність, поверхневе виключення, несумісність |
здатність забезпечувати певні фенотипові ознаки.
Здатність до самореплікації - це спроможність плазмід до самоподвоєння.
Головною властивістю більшості плазмід є їх здатність до автономної реплікації.
Плазміди - це незалежні реплікони, зазвичай замкнені в кільце, за винятком
деяких лінійних плазмід у представників родів Streptomyces, Borrelia 1
КЛлоаососсиз. Реплікація плазмід здійснюється за допомогою ферментів реплікації
клітини, але по-різному у великих і малих плазмід.
Великі плазміди (довжиною 20-30 тис. п.н.) зазвичай малокопійні, у клітині
їх не більше 1-2 копій. Це - плазміди зі строгим контролем реплікації. Таку
назву вони отримали через те, що їх синтез відбувається паралельно з реплікацією
хромосом. Причому перед початком реплікації плазміда прикріплюється до
виросту цитоплазматичної мембрани в тому ж місці, що і хромосома. У бактерій
реплікацію великих плазмід здійснює ДНК-полімераза Ш - головний фермент
реплікації хромосомної ДНК.
Малі плазміди (довжиною 10-20 тис. п.н.), як правило, мультикопійні,
кількість їх копій у клітині бактерії може сягати 40-50, а іноді 300 і більше. Це -
плазміди з послабленим контролем реплікації. Їх синтез відбувається за
допомогою ДНК-полімерази І (допоміжної репаративної реплікази).
У більшості малих плазмід (типу Со/ ЕГ) реплікація односпрямована, із
формуванням однієї реплікативної вилки. Починається і закінчується синтез ДНК
в Огі С, тобто реплікативна вилка рухається по кільцю, поки не буде подвоєна вся
плазміда. Для великих плазмід більш характерна двоспрямована симетрична
реплікація, коли дві реплікативних вилки з Огі С рухаються у двох протилежних
напрямках назустріч одна одній, поки не зустрінуться у термінус-центрі.
Регуляція реплікації. Усі вивчені плазміди самі контролюють власне
розмноження за механізмом негативного зворотного зв'язку на стадії ініціації
реплікації.
 161

У регуляції реплікації беруть участь три основні транс-активні елементи:

1) антисмисловий транскрипт РНК, здатний пригнічувати ініціацію
реплікації за рахунок блокування комплементарної РНК-затравки, або інгібування
трансляції ініціаторного Кер-білка;
2) білок-репресор гена гер, що пригнічує транскрипцію Кер-білка;
3) короткі повторювані нуклеотидні послідовності - ідентичні тим, ЯКІ в
сайті початку реплікації зв'язують Вер-білок, перешкоджають поєднанню
вказаного білка з ДНК плазміди і таким чином блокують початок реплікації.
Трансмісивність (інфекційність або кон'югативність) - здатність
плазмід інфікувати клітини завдяки перенесенню плазмідної ДНК від клітини-
донора в клітину реципієнта за допомогою процесу кон'югації.
Кон'югація - це специфічний рекомбінативний механізм, у процесі якого
між двома клітинами утворюється цитоплазматичний місток. По ньому плазмідна
ДНК може передаватися від клітини-донора у клітину-реципієнт.
Трансмісивність зазвичай є ознакою великих плазмід, а у малих плазмід відсутня.
Для всіх трансмісивних плазмід характерна наявність особливого
іга-оперона - групи генів, що відповідають за перенесення плазміди з однієї
клітини в іншу. Гени (га-оперона зчеплені на одній ділянці довжиною 34 тис. п.н.
У ага-оперонах бактеріальних плазмід між одним загальним промотором 1
термінатором послідовно розташовані гени, що кодують білки та ферменти для
забезпечення кон'югації, причому в плазмідах різних бактерій зустрічаються
подібні та-гени:
е гени білків, шо формують Е-пілі (цитоплазматичні містки) - утворення у
вигляді видовжених виростів (ворсинок) і каналом усередині, по якому плазміда
транспортується з клітини-донора в клітину-реципієнт;
еген, кодуючий хеліказу (фермент, що розриває водневі зв'язки між
комплементарними ланцюгами ДНК для забезпечення утворення одноланцюгових
молекул, які можуть легко просуватися по каналу Е-пілі);
є ген, кодуючий ендонуклеазу (топоізомеразу ГТ), яка робить розрив в одному
з ланцюгів плазмідної ДНК, що забезпечує його вивільнення з дуплекса
(дволанцюгової ДНК) і подальше переміщення по Е-пілі.
Механізм передачі кон'югативних (трансмісивних) плазмід добре
вивчений у Е. сої при перенесенні з клітини в клітину плазміди фертильності --
Е-плазміди (або Е-фактора). Кон'югація (з'єднання клітин) обов'язково
супроводжується утворенням цитоплазматичних містків Е-пілів, які нібито
притягують клітини одна до одної. По Е-пілях може просуватись плазмідна ДНК
із клітини донора у клітину реципієнта.
На початку кон'югації ендонуклеаза (очевидно, топоізомераза ГЇ) впізнає на
плазміді певну нуклеотидну послідовність - оріджин перенесення, робить у
ньому одноланцюговий розрив і ковалентно зв'язується з 5'-кінцем розірваного
ланцюга. Фермент хеліказа за участю АТФ розриває водневі зв'язки між двома
ланцюгами плазмідної ДНК, завдяки чому розірваний ланцюг вивільняється і
своїм 5'-кінцем по цитоплазматичному містку проштовхується з клітини донора у
клітину реципієнта. Специфічний білок (топоізомераза І), що на початку процесу
 162

кон'югації зв'язався з 5' -кінцем розірваного ланцюга, у реципієнтній клітині

замикає перенесену плазмідну ДНК у кільце. Далі відбувається репаративна
реплікація і ланцюги, яких не вистачає, добудовуються і в донорній, і в
реципієнтній клітинах. По завершенні процесу плазміди виявляються вже в обох
клітинах, реципієнт теж стає донором плазміди, тобто плазміда «розмножується».
Нещодавно встановлено, що перед початком кон'югаційного перенесення у
певних ділянках плазміди утворюються так звані релаксосоми -- нуклеопротеїнові
комплекси, що складаються із надспіралізованої (суперспіралізованої) плазмідної
ДНК і компонентів релаксази, специфічно зв'язаних із сайтом початку
перенесення. Релаксази - ферменти, здатні робити розрізи та з'єднання у
специфічних сайтах ДНК. Сумісно з хеліказами релаксази сприяють розплітанню
суперпетель, переводять ДНК у релаксований стан, вивільняють окремі ланцюги
й після перенесення відновлюють цілісність ланцюгів, усуваючи розрізи.

знов На рис. 12.2 (фото)

зображено процес
кон'югаціїї між двома
клітинами. На схемі
можна побачити, що
по цитоплазматичному
містку відбувається
перенесення плазміди з
донорної клітини У
Перехід Е-плазміди у кайнну реципієнта клітину реципієнта,
Е-плазміда | Е-плазміда після чого плазміди вже
4. -5 а наявні в обох клітинах.
Старий донор Новий донор

Рис. 12.2. Кон'югація у бактерій, що супроводжується перенесенням К-плазміди

Завдяки такому перенесенню плазмідної ДНК у популяції бактерій кількість
клітин, що містять плазміди, збільшується. Раніше вважали, що в донорній клітині
плазмідної ДНК не залишається, і вона з Е -клітини перетворюється на Е-клітину.
Імовірно, у деяких випадках це можливо через деградацію ДНК нуклеазами.
Трансмісивні плазміди, що мають /га-оперон, можуть здійснювати перенесення:
1) власної молекули у клітини реципієнта;
2) хромосоми з клітини-донора у клітину-реципієнт;
3) фагової ДНК та інших позахромосомних елементів.
4) некон'югативних плазмід шляхом утворення коінтегратів із
кон'югативними плазмідами;
Кон'югативні / плазміди розрізняються | структурою і поверхневими
рецепторами пілів, що слугують для адсорбції фагів. За наявністю специфічних
рецепторів пілів кон'югативні плазміди поділяють на 3 основні групи - Е-, І- і Ikl-
подібні плазміди:
 163

є К-подібні плазміди мають структурну схожість із Е-фактором Е. соїї, що

забезпечує кон'югацію; на поверхні пілів, які кодуються такими плазмідами, є
рецептори для адсорбції Е-специфічних фагів - М52, РІ7, 72, ОБ, т2, /а;
е І-подібні плазміди не несуть генів для експресії рецепторів для
адсорбції Е-специфічних фагів на пілях, але забезпечують адсорбцію = I-
специфічних фагів;
є ІКІ-подібні плазміди | мають гени, що кодують рецептори пілів для
адсорбції фага /КІ/ 1 подібних йому.
На відміну від великих плазмід малі плазміди, як правило, нетрансмісивні
(некон'югативні), оскільки не мають /га-оперона. Самостійно переходити з
клітини в клітину вони не здатні, але можуть бути перенесені в клітину-реципієнт
за допомогою великих хелперних плазмід, що мають tra-onepoH. Taki
нетрансмісивні малі плазміди називають мобілізованими або мобілізаційними.
Вони містять додаткову точку початку перенесення -- огіТ. До мобілізаційних
плазмід відносять СоЇЕ1(6,6 т.п.н.), К5К1010 (8,7 т.п.н.), р5С101 (9,3 т.п.н.).
Інтегративність - це здатність плазмід вбудовуватись у хромосому та інші
елементи генома (в інші плазміди, фаги). Такі генетичні елементи, що існують у
клітині автономно (поза хромосомою), а за певних умов тимчасово можуть
вбудовуватись у хромосому і ставати її складовою частиною, називають
епісомами. До них належать не тільки інтегративні плазміди, але й лізогенні
фаги, такі як фаг / (фаг-лямбда), /-фаг (мю-фаг), 5РОЇ.
Зазвичай здатність до інтеграції в хромосому виявляють у великих
малокопійних плазмід, що містять іта-оперон, тобто ця ознака корелює з
трансмісивністю. Вбудовування плазмід у хромосому відбувається завдяки ІЗ- і
Тп-елементам (транспозонам), які звичайно входять до складу плазмід. Наявність
транспозонів сприяє об'єднанню плазмід між собою або з фаговою ДНК. У такий
спосіб утворюються коінтеграти, що являють собою гібриди двох або декількох
генетичних елементів. У клітинах реципієнтів коінтеграти, як правило,
розпадаються і продовжують далі автономне існування.
Плазміди складаються із модулів. Обов'язковим модулем є основний
реплікон, що містить точку початку реплікації 1 гени, що забезпечують і
контролюють процес реплікації. Великі плазміди зі строгим контролем реплікації
мають інший обов'язковий модуль - іта-оперон. Більшість плазмід мають ще гени
системи розподілу реплікованих плазмід між розділеними клітинами.
Поверхневе виключення. Якщо в бактеріальну клітину вже проникла
велика плазміда зі строгим контролем реплікації, то подібні за структурою інші
плазміди в цю клітину вже не проникають або частота їх перенесення значно
знижується (у 10-100 разів). Учені припускають, що це може бути пов'язано зі
зміною конформації поверхневих рецепторних білків, що беруть участь у
проведенні плазміди всередину клітини реципієнта.
Несумісність плазмід. Ця властивість проявляється у генетично
споріднених плазмід. Система регуляції реплікації клітини їх не розрізняє, через
це вони несумісні в одній клітині. Крім того, великі трансмісивні плазміди
зазвичай конкурують між собою за центр зв'язування на внутрішній поверхні
 164

цитоплазматичної мембрани, де перед реплікацією прикріпляється 1 плазміда, і

сама бактеріальна хромосома. Тому структурно подібні споріднені плазміди
відносять до однієї групи несумісності. Одночасно реплікуватися у клітині
можуть декілька плазмід, але з різних груп несумісності.
Таким чином, плазміди з однаковим типом контролю реплікації несумісні,
тобто в даній популяції клітин неможлива стабільна реплікація двох типів
плазмід. Якщо у клітину все ж таки потрапляє споріднена плазміда, то вихідна -
уже наявна у клітині плазміда - втрачається. Водночас плазміди з різним типом
контролю реплікації сумісні. Несумісність визначає властивість основного
реплікона плазміди і не залежить від додаткових генів плазміди.
Фенотипові ознаки плазмід. Зазвичай плазміди несуть гени, необов'язкові
для метаболізму клітини, але вони відіграють важливу роль в адаптації клітин до
факторів навколишнього середовища. Ці додаткові гени саме і визначають
фенотипові властивості плазмід. Найчастіше в геномі плазмід виявляють гени
стійкості до антибіотиків, бактеріоцинів, важких металів, ксенобіотиків (камфори,
нафталіну, нафтопродуктів), аніонів (арсенату та ін.), мутагенів (акридинових
барвників). Плазмідні гени стійкості до бактеріоцинів забезпечують бактеріям
несприйнятливість до бактерицидних речовин споріднених штамів. Плазміди
також контролюють синтез антибіотиків, інсектицидів, пігментів, поверхневих
антигенів; містять гени факторів патогенності, а саме токсинів, гемолізинів,
фібринолізинів, ферментів інвазії та ін. Гени факторів патогенності як правило,
зібрані в групи, оточені з кінців специфічними повторами. Їх називають
«островами патогенності». Вони можуть передаватися із клітини в клітину у
складі плазмід, транспозонів, а також інтегруватися у вірусні геноми.
Плазміди синтезу антибіотиків наявні в багатьох видів стрептоміцетів. Деякі
плазміди несуть гени системи рестрикції-модифікації, що надає клітинам-хазяїнам
стійкості до проникнення фагової та іншої чужорідної ДНК. У псевдомонад часто
виявляють плазміди з наборами генів для деградації аліфатичних (октану, декану
та їн.) 1 ароматичних вуглеводнів (ксилолу, толуолу, нафталіну), а також їх
окиснених похідних (саліцилату, бензоату), терпенів і хлорвмісних вуглеводнів, у
тому числі пестицидів. Деякі плазміди можуть нести набори генів ферментів для
деградації вуглеводів (цукрози, рафінози, лактози та ін.), причому ці гени можуть
бути зібрані в оперони 1 регулони.
Фенотиповою ознакою Ті-плазмід (від агл. Титог іпаисіпе - індукція
пухлини), виділених із А?гобастегіит шште/асіепе, є здатність індукувати в рослин,
уражених названою бактерією, синтез опінів. Ці плазміди можуть преноситись у
клітини рослин 1 паразитувати в них. За рахунок синтезу опінів у рослин
розвиваються пухлини - корончасті гали. Здатність бактеріальних Ті-плазмід
експресуватися у клітинах рослин застосовують у генній інженерії під час
конструювання векторів для перенесення генів у рослинні організми.
Великі плазміди бактерій роду КЛігофбійт (симбіонтів бобових рослин)
несуть гени, необхідні для азотфіксації, - поа/уїг 1 пії.
Статеві феромони. Важливою особливістю перенесення плазмід у
Енпіегососсиз /аесайз є участь у міжклітинному контакті статевих феромонів.
 165

Безплазмідні клітини-реципієнти секретують принаймні 5 специфічних

феромонів, що притягують клітини-донори плазмід і забезпечують міжклітинні
контакти. Набуття клітиною плазміди припиняє у ній синтез феромонів.
У Угарпу/ососсизх айгейз поширені кон'югативні плазміди, що переносять
гени стійкості до антибактеріальних перепаратів. Так, плазміда рСОЇ (52 т.п.н.)
обумовлює резистентність до триметоприму, гентаміцину та сполук амонію. У цій
плазміді ідентифіковано сайт початку перенесення 1 сайт розрізання, проте нічого
не відомо про міжклітинні контакти, при електронній мікроскопії не виявлено ані
пілів, ані інших структур, що відповідають за кон'югацію. Під час кон'югації у
стафілококів переноситься одноланцюгова ДНК, як і в грамнегативних бактерій.
Ця подібність, а також гомологія локусів ОгіТ і сайтів розрізання дозволяють
припустити загальне філогенетичне походження 0 кон'югативних систем
грампозитивних і грамнегативних бактерій і участь в їх еволюції транспозонів.
У прокаріотів зустрічаються плазміди, що не кодують жодних фенотипових
ознак, а тільки здатність до перенесення в інші клітини. Зокрема, однією із
перших виділених плазмід була плазміда фертильності (Е-фактор) кишкової
палички, що не має специфічних генів і відповідних фенотипових ознак, однак
містить гени, які беруть участь у кон'югації та власному перенесенні. У деяких
бактерій знаходять криптичні плазміди, фенотипові ознаки яких невідомі.
Плазміди зустрічаються і в клітинах еукаріотичних організмів, зокрема у
дріжджів, деяких рослин і тварин, але найбільше їх у бактерій. Серед них краще
вивчені Е-фактор (плазміда фертильності), плазміди антибіотикорезистентності
(г- 1 В-плазміди), плазміди бактеріоциногенії, токсиноутворення, Ті-плазміди.
12.1.3. Е-фактори та їх варіанти
К-фактори (від англ. Кетіййу - плодючість) уперше були відкриті
Дж. Ледербергом 1 Е. Татумом у 1946 р. у ході вивчення процесу кон'югації в
Е. coli. Дослідники змішували культури двох мутантних ауксотрофних штамів
кишкової палички, які не могли рости на мінімальних (бідних) живильних
середовищах без додавання ауксинів - амінокислот. Кожен мутант потребував
додавання двох різних амінокислот. Але після висівання змішаної культури двох
ауксотрофів на мінімальне середовище було отримано колонії бактерій, які не
потребували додавання амінокислот. Учені зробили висновок, що в цих гібридних
мікроорганізмів прототрофність відновлено за рахунок рекомбінації генів двох
батьківських ауксотрофних штамів. Було з'ясовано, що саме Е-фактор (плазміда
фертильності) відповідає за перенесення генетичної інформації від однієї
клітини до іншої. Установлено, що це перенесення відбувається в одному
напрямку - від донора («чоловічого» Е "-штаму), який містить Е-фактор, до
реципієнта («жіночого» К-штаму), у якого Е-фактор відсутній. Причому
рекомбінація відбувається в клітинах реципієнта. Він зберігає більшу частину
своїх власних генів і отримує деякі геномні фрагменти від донора. Даний
механізм дещо нагадує статевий процес в еукаріотів, тому отримав назву
парасексуального процесу. Генетичні рекомбінанти в ході кон'югації виникають
із частотою 107 подібно до частоти спонтанних мутацій.
 166

Е-фактори - це великі плазміди, які містять Іта-оперони, отже, виявляють

трансмісивність і можуть інтегруватися у хромосому. Для них характерні Й такі
властивості, як поверхневе виключення та несумісність.
Е-фактори можуть існувати у трьох формах:
Г) Е-фактор - автономна плазміда в суперскрученій ССС-формі;
2) Н/г-фактор - плазмідна ДНК інтегрована у хромосому;
3) Е"- фактори - різновиди Е-плазмід, які під час вивільнення із хромосоми
захоплюють хромосомні гени, розташовані поблизу сайта інтеграції.
І83 На рис. 12.3 зображено схему великої
кон'югаційної плазміди - Е-фактора, що
Tni000
містить 100 тис. пар нуклеотидів. До її складу
входять /га-оперон (гга-гени) 1 декілька
Е-фактор мобільних генетичних елементів, а саме
іга-оперон

100 т.п.н. 152 | транспозон Tn1000 Ta інсерційні

послідовності - І52 і 2 копії І93. Крім того,
перед /га-опероном розташований основний
сайт ініціації переносення (огіТ). ОгіУ - сайт
oriT початку вегетативної двоспрямованої
реплікації.
Рис. 12.3. Схема будови К-фактора
Мобільні генетичні елементи (152, дві копії І53 та Тп1000) у складі
Е-плазміди утворюють кластер довжиною 20 тис.п.н. Наявність даних МГЕ
дозволяє Е-плазміді інтегруватись у декілька ділянок хромосоми хазяїна за
рахунок реципрокної рекомбінації між гомологічними І5-елементами, що мають
подібні прямі повтори.
К-фактори (класичні автономні Е-плазміди) зустрічаються у клітинах
бактерій у кількості 1-2 копій і в процесі росту клітини реплікуються за 0-типом
незалежно від хромосоми, але синхронно з нею. Молекулярна маса Е-факторів у
різних бактерій зазвичай варіює в межах 34-64 - 10? Да. Суперскручені молекули
(ССС-форми) Е-плазміди | утворюють комплекси з клітинним білком
ендонуклеазою. Остання за певних умов, очевидно, здійснює релаксацію
суперскрученої молекули і перехід її у форму відкритого кільця, що надзвичайно
важливо для проходження реплікації. Обробка протеїназами та додецилсульфатом
натрію (5105) також сприяє релаксації плазмідної молекули, що, можливо,
відбувається в результаті активації ендонуклеази вказаними сполуками.
Автономні Е-фактори чутливі до дії акридинового оранжевого, етидій-броміду,
кристалічного фіолетового й антибіотика рифампіцину, які пригнічують
реплікацію плазміди.
Дослідниками побудована 0 фізична (генетична) карта Е-плазміди 1
встановлена наявність у ній таких нуклеотидних послідовностей:
е послідовність, гомологічна у Е-фактора 1 всіх Е-подібних плазмід
(RI, R6, R100, ColV);
е. послідовності, що кодують гени трансмісії, тобто /га-оперон;
 167

е послідовності, які детермінують автономну реплікацію і оріджин-сайт

(О-пункт) кон'югаціїного перенесення;
е. послідовності, які кодують гени резистентності до фагів 73, Т7/ іфії;
е послідовності, що являють собою «гарячі точки» інтеграції Е-плазміди у
хромосому.
Механізм передачі Е-факторів такий самий, як у всіх кон'югативних плазмід.
Механізм кон'югативного перенесення плазмідної ДНК складається з 6
основних етапів: 1) утворення і стабілізація міжклітинного контакту за
допомогою Е-пілів; 2) сайт-специфічне розрізання у сайті початку перенесення
(ОкіТ) одного з ланцюгів ДНК, призначеного для перенесення; 3) розкручування
ДНК і перенесення розрізаного ланцюга ДНК, починаючи з 5-кінця, у клітину
реципієнта; одночасно розпочинається замісний синтез втраченого ланцюга ДНК
у донорній клітині за механізмом кільця, що котиться; 4) рециркуляризація
перенесеного ланцюга ДНК; 5) синтез комплементарного ланцюга в клітині
реципієнта та відновлення суперспіралізації плазмідної ДНК; 6) розходження
клітин. За кон'югативного перенесення плазмідою хромосомних генів 4-6 етапи
замінені гомологічною рекомбінацією, завдяки якій гени вбудовуються у
хромосому. і
Незважаючи на незначну частоту кон'югації (107) у популяції бактерій, у разі
прямого контакту Е"- і Е -клітин і утворенні Е-пілів частота передачі Е-фактора
сягає майже 100 95. У результаті успішної кон'югації Е-клітини (реципієнти)
перетворюються на Е'-клітини і стають потенційними донорами Е-плазмід.
Кон'югативні, або статеві, пілі (Е-пілі) - це волосоподібні вирости на
поверхні бактеріальної клітини, що забезпечують первинний контакт між
клітиною-донором Е-плазміди і потенційно реципієнтною клітиною. Пілі
формуються з білка піліну. Синтез і складання Е-пілів контролюють 13 генів, що
входять до складу Іга-оперона Е-плазміди. Сам пілін складається із багатьох
субодиниць, які кодуює ген /га4. Спочатку на вказаному гені експресується
синтез поліпептиду із 121 амінокислотних залишків, від якого шляхом процесингу
відщеплюється зайвий фрагмент із 51 амінокислоти. Молекули піліну в ХоОді
збирання Е-піля за рахунок п'ятикратної кругової симетрії формують
циліндричний виріст із діаметром 8 нм, усередині якого є порожнина діаметром
2 нм. Теоретично через цей циліндр могла б проникати одноланцюгова ДНК,
проте це перенесення поки що не вивчено. Проте з'ясовано, що безпосередній
контакт між клітинами під час кон'югації забезпечується саме між кінчиком піля і
рецепторним сайтом на поверхні клітини-реципієнта. Для стабілізації контакту
відбувається скорочення піля шляхом часткової деполімеризації.
Нії-фактор являє собою Е-фактор, інтегрований у бактеріальну хромосому
шляхом рекомбінації. У кишкової палички на хромосомі виявлено близько 20
специфічних сайтів, куди може вбудовуватися ДНК Е-фактора. У цих
інтеграційних сайтах хромосоми, як правило, містяться гомологічні інсерційні
послідовності - І5-елементи, що входять і до складу Е-плазміди. Процес інтеграції
забезпечує механізм КесА-залежної гомологічної рекомбінації між ідентичними
І5-елементами плазмідної і хромосомної ДНК.
 168

Інтеграція Е-фактора у хромосому бактерій дуже нагадує інтеграцію фага 2

(лямбда) у клітину хазяїна. На основі цієї подібності навіть було зроблено
припущення, що плазміди походять від дефектних вірусів, які втратили здатність
формувати капсид (білкову оболонку вірусу).
Установлено, що в інтегрованому Нії-стані Е-плазміда не втрачає здатності
до переходу в інші клітини. Перед початком кон'югації бактеріальна хромосома
реплікується, починаючи із сайта включення Е-фактора (оріджину перенесення),
новий синтезований ланцюг своїм 5 -кінцем починає проштовхуватись по каналу
Е-піля у клітину реципієнта. Таким чином, Нії-фактор забезпечує не тільки
перенесення власної ДНК, але й наступних хромосомних генів. Це було
підтверджено в експериментах зі схрещуванням Ниії-клонів і Е -клітин, в яких
рекомбінанти утворювались у 1000 разів частіше, ніж при використанні як
донорів Е'-клітин. Тому клітини, що забезпечували високу частоту рекомбінацій,
отримали назву Нії-клітин (від англ. Нієй /гедиепсу о/ гесотфіпаїоп - висока
частота рекомбінації), Термін мерогенота (від меро- - частковий) або
диплогенота застосовують для позначення екскон'югантів, у яких за рахунок
перенесення плазмідою частини хромосоми донора деякі гени подвоїлись.
Якщо в експериментальних умовах проводити кон'югацію і через певні
проміжки часу відбирати проби 1 струшувати їх для руйнування Е-пілів, то можна
отримати низку трансформантів із усе більшим розміром перенесених фрагментів
ДНК. При аналізі їх та відповідних білкових продуктів можна побудувати
генетичну карту бактеріальної хромосоми, де часова послідовність перенесення
генів буде відповідати порядку їх розташування на хромосомі. Чим далі певний
ген знаходиться від оріджину перенесення, тим пізніше він буде перенесений і
тим менша імовірність його потрапляння у клітину-реципієнт. Але за сприятливих
умов (37"С), якщо кон'югація не переривається, у реципієнтну клітину EL. coli 3a
100 хв може перейти ціла копія хромосоми. При застосуванні методу кон'югації
для генетичного картування бактеріальних хромосом можна відстежити
перенесення генетичного матеріалу в термін, не менший | хв. Для більш
детального генетичного картування застосовують аналіз зчеплення генів під час
трансдукції (перенесенні генів фагом).
К'-фактори - ще одна форма існування плазмід фертильності. Е'-фактори
мають більшу молекулярну масу, ніж Е-плазміди, - 52-78 - 10? Да. Вони
утворюються за рахунок неточної ексцизії (вирізання) інтегрованого НЕ-фактора i
захоплення розташованого поблизу фрагмента бактеріальної хромосоми. Оскільки
на хромосомі існує понад 20 сайтів інтеграції Е-факторів, то різні Е'-фактори
розрізняються кількістю та природою захоплених хромосомних генів. В E. coli
вже відомо понад 100 варіантів Е-факторів.
Процес передачі від донора реципієнту фрагментів хромосоми, зчеплених із
Е'-фактором, називають сексдукцією. У результаті сексдукції реципієнтні клітини
можуть штати неповними диплоїдами (мерозиготами, меродиплоїдами).
Диплоїдність виявляють за тими хромосомним генами, що увійшли до складу
вищепленого Е'-фактора. Цікаво, що локус хромосоми 5/а-2 (зех-/астог адїпіу), із
якого був вирізаний Е'-фактор, зберігає «пам'ять» про споріднені Е-фактори і
 169

«заборонений» для подальшої інтеграції гомологічних плазмід. Це забезпечує

стабілізацію Е-факторів в автономному стані. У деяких бактеріальних хромосомах
виявляють два інтегровані Е-фактори, завдяки чому в результаті ексцизії
(вирізання) із хромосоми утворюються довгі Е'-фактори.
Плазміди суттєво розрізняються колом хазяїв. Відомі вузькоспецифічні
плазміди з одним характерним видом-хазяїном і широкоспецифічні плазміди, що
можуть переноситись практично в будь-які грамнегативні бактерії (наприклад,
КР4). Такі плазміди мають повний набір генів для забезпечення власної
автономної реплікації і не залежать від системи реплікації хазяїна.
Е-фактори видоспецифічні й в основному передаються між клітинами в
межах певного виду чи роду бактерій. Проте виявлено можливість перенесення
Е-факторів із Е. соїї КІ2 у клітини інших представників родини ентеробактерій,
зокрема, у клітини сальмонел і шигел.
У клітинах бактерій процес рекомбінації може проходити не тільки між
плазмідою і хромосомою, але й між Е-фактором та іншими нехромосомними
елементами (різними плазмідами, транспозонами та фагами).
12.1.4. В-плазміди
К-плазміди (плазміди резистентності) містять гени резистентності, що
забезпечують стійкість до антибіотиків і сульфаніламідів. Вони можуть
переноситись між клітинами віддалених у систематичному плані бактерій,
поширюючи в популяції мікроорганізмів гени стійкості до антибактеріальних
препаратів. Так, можливе перенесення В-плазмід між практично всіма
грамнегативними бактеріями - ешеріхіями, сальмонелами, псевдомонадами,
цитробактерами, холерними вібріонами та їн. Наприкінці минулого століття було
доведено можливість перенесення плазмід і в грампозитивних бактерій. Існування
такого широкого кола хазяїв В-плазмід обумовлює швидке поширення
антибіотикостійких штамів мікроорганізмів.
У 1955 р. у Японії вперше було виділено штам шигели з множинною
стійкістю до сульфаніламідів й антибіотиків (стрептоміцину, хлорамфеніколу 1
тетрацикліну). У 1961 р. японські дослідники Ватанабе і Фуказава довели, що
передача множинної лікарської резистентності може відбуватися між різними
родами бактерій від шигел до кишкової палички і сальмонел тільки в результаті
клітинних контактів шляхом кон'югації, причому незалежно від бактеріальної
хромосоми 1 не за участю Е-системи фертильності, тобто кон'югативну передачу
генів стійкості забезпечують не Е-фактори, а інші генетичні елементи. Відомо, що
горизонтальні перенесення генів антибіотикостійкості можуть здійснювати
трансдукційні фаги, але в даному випадку поява резистентного штаму шигели
була пов'язана з наявністю у клітинах неописаних раніше В-плазмід. У випадку
гібридизації резистентного і чутливого штамів передача антибіотикостійкості
відбувалася через 15 хв після початку схрещування. Повторна передача
спостерігалася дуже рідко, в І Ус випадків.
Плазміди резистентності в бактерій зустрічаються у двох основних формах -
великих В-плазмід (В-факторів) 1 малих г-плазмід.
 170

К-фактори - великі кон'югативні плазміди зі строгим контролем

реплікації, проявляють такі властивості, як несумісність і поверхневе виключення.
У клітині-хазяїні вони в основному перебувають у ССС-формі із формуванням
4-6 суперспіралізованих обертів на І мегадальтон. Перед реплікацією вони часто
виявляються у релаксованій кільцевій формі у комплексі з білком ендонуклеазою.
Кон'югативність В-факторів може пригнічувати білок-репресор, який кодується
геном самої плазміди.
В основному В-фактори перебувають у клітині в кількосі 1-2 копій в
автономному стані. Проте існують дані про потрапляння генів В-факторів,
кодуючих пеніциліназу (стійкість до пеніцилінів), у хромосому 5тарпуЇососсиз
аийгейз. Отже, слід зазначити, що В-фактори - інтегративні плазміди і здатні
вбудовуватись у хромосому. Вони можуть здійснювати не тільки перенесення
власних генів і г-плазмід, але й мобілізувати до переносення і хромосомні гени. За
рахунок інтеграції К-фактора y з хромосому клітини реципієнта гени
резистентності можуть потрапляти у хромосомну ДНК і там залишатися назавжди
за умов неточної ексцизії (вирізання). За припущенням Ватанабе В-фактори
мають складну природу і містять дві зчеплені генетичні одиниці:
е статевий фактор КТЕ (від англ. Кезізіепсе ікапу/ег /асіог), що відповідає
за автономну реплікацію і кон'югативне перенесення резистентності;
е мала некон'югативна г-плазміда, яка безпосередньо переносить гени
ферментів, що забезпечують резистентність до сульфаніламідів й антибіотиків.
Гіпотезу Ватанабе було підтверджено експериментально і доведено, що в
деяких бактерій у стаціонарній фазі росту культури спостерігається дисоціація
К-факторів на дві окремі генетичні одиниці - КТЕ 1 г-плазміду (із молекулярною
масою відповідно 54 і 12 мегаДа). Таким чином, КТЕ становить приблизно 75 Уб
В-фактора. За молекулярною структурою RTF має суттєву гомологію з
Е-фактором в області їга-оперона. У деяких В-факторів (Кб і К222) виявлено
інвертовані повтори у складі І5-елементів, що обмежують по краях групу
зчеплених генів резистентності. Завдяки цьому вони можуть вищеплятися і
формувати самостійний мобільний генетичний елемент - г-плазміду.
г-плазміди можуть існувати як у складі В-факторів, так і автономно. Вони не
мають власного апарату трансмісії і самостійно не потрапляють у клітини
реципієнтів шляхом кон'югації, але можуть бути мобілізовані іншими
кон'югативними плазмідами тобто являють собою мобілізаційні плазміди.
Плазміди резистентності іноді поділяють на два класи: у В-плазмід класу І
гени перенесення, реплікації та резистентності зчеплені, а у В-плазмід класу П
вони дискретні й можуть передаватися окремо.
Для ВК-факторів характерна висока частота перенесення в популяції, яка
становить 1,5- 7,6 Ус. Існує висока імовірність перенесення плазмід резистентності
під час кон'югації між Salmonella typhimurium 1 Vibrio cholerae, Serratia
marcescens, Yersinia pestis, Mix Pseudomonas aeruginosa i Echerichia соїї. Найбільш
«нерозбірливими» у виборі клітин-хазяїв є В-плазміди псевдомонад. Дуже часто
К-фактори виявляють в умовно-патогенних штамах стафілококів, стрептококів,
кишкових паличок, клебсієл, мікобактерій туберкульозу та інших, що є серйозною
 171

проблемою в лікуванні інфекційних хвороб. Деякі В-фактори здатні відразу

обумовлювати резистентність до 8 і більше антибіотиків, а також детермінують
стійкість до важких металів (ртуті, нікелю, кадмію, кобальту). В останні роки
виділяють штами мікобактерій туберкульозу, одночасно стійкі до 13-15
антибактеріальних препаратів.
К-фактори для власних клітин-хазяїв забезпечують дуже високий рівень
резистентності до антибіотиків. Так, шигели завдяки плазмідам виживають за
концентрації стрептоміцину 10000 мкг/мл; сальмонели -- нечутливі до
стрептоміцину за концентрації 10-25 мкг/мл, до тетрацикліну - 10 мкг/мл;
кишкові палички проявляють резистентність до тетрацикліну при концентрації
100-250 мкг/мл.
Механізми резистентності до антибіотиків визначають відповідні гени
плазмід, кодуючих ферменти, що спричиняють або модифікацію, або руйнування
лікарської речовини. Так, ферменти, детерміновані плазмідними генами, можуть
спричиняти аденілювання стрептоміцину, ацетилювання хлорамфеніколу,
фосфорилювання і ацетилювання канаміцину й шнеоміцину, гідролітичне
розщеплення бета-лактамного кільця пеніщилінів і цефалоспоринів.
Нераціональне застосування антибіотиків у медицині та сільському
господарстві призвело до появи штамів полірезистентних бактерій, одночасно
стійких до 10 і більше антибіотиків. Поширення антибіотикостійкості в популяції
бактерій відбувається за рахунок горизонтальної передачі В-плазмід.
12.1.5. Плазміди бактеріоциногенності
У 1925 р. у деяких штамів Е. сої було виявлено здатність продукувати
бактерицидні речовини, названі коліцинами. Пізніше подібні сполуки були
знайдені і в інших бактерій та отримали специфічні назви залежно від виду
продуцента: аероцини -- із Аегососсиз аего?епез5, церецини - із Васійиз сегец,
mezauunu — 13 Bacillus megaterium, necmuyunu — i3 Yersinia pestis, niouunu — із
Pseudomonas piocyanea (aeruginosa), cmaginoxoxuunu — 13 Staphylococcus aureus,
пневмоцини - i3 Klebsiella pneumoniae. Tinbku B Е. соїї на сьогодні відомо
декілька десятків бактеріоцинів, об'єднаних у групи.
Бактеріоциногенія - це генетично детермінована здатність бактерій
продукувати специфічні речовини, що спричиняють загибель бактерій
філогенетично споріднених видів. Здатність до бактеріоциногенії визначає
наявність. у бактерій позахромосомних спадкових факторів - плазмід
бактеріоциногенності.
Плазміди бактеріоциногенності містять гени, які детермінують синтез
білків-бактеріоцинів. Бактеріоцини -- це бактерицидні сполуки, які виробляються
клітинами одного штаму бактерій (плазмідовмісного) і вбивають клітини
споріднених штамів, у яких плазміди бактеріоциногенності відсутні. Таким
чином, плазміди бактеріоциногенності надають мікроорганізмам певні переваги в
боротьбі за існування з конкурентними видами.
У бактерій виявляють як трансмісивні (кон'югативні), так і нетрансмісивні
плазміди бактеріоциногенності. Плазміди бактеріоциногенності відрізняються
 172

також здатністю репресувати Е-фактор, сумісністю з іншими плазмідами та

чутливістю до елімінуючої дії акридинових барвників.
До великих кон'югативних плазмід (Соі-факторів) належать добре вивчені
плазміди С. соїї - Сої!, СоїВ, Сої У, до малих некон'югативних плазмід - СоіЕї,
ColE2, ColE3. Для кон'югативних плазмід характерна складна структура, що
визначається наявністю фактора перенесення 1 генів коліциногенності. Очевидно,
Со!-фактори утворилися в результаті інтеграції малих Соі/-плазмід у Е-фактори.
Більшість Со/-плазмід представлена у клітинах кишкових паличок декількома
копіями суперспіралізованих CCC-dopm. Підвищення температури під час
вирощування плазмідовмісних штамів бактерій або обробка їх хлорамфеніколом
можуть спричинити появу множинних кільцевих форм. Частіше Со/-плазміди
автономні, але серед них зустрічаються й ті, що можуть інтегруватися у
хромосому (СоОП/). | Плазміди Сої/2 їі Сої/3 елімінуються акридиновим
оранжевим, плазміди СОоЇЇІВ і Со!ЕІ нечутливі до цього барвника.
Усі бактеріоцини, які кодуються генами плазмід, за хімічною природою
білки. За фізико-хімічними властивостями їх можна розподілити на дві групи:
1) бактеріоцини з невеликою молекулярною масою, термостабільні, не
осаджуються ультрацентрифугуванням, невидимі при електронній мікроскопії;
2) бактеріоцини з великою молекулярною масою, термолабільні, легко
осаджуються ультрацентрифугуванням та візуалізуються при електронній
мікроскопії у вигляді інтактних фагових корпускул або фагових відростків.
Молекулярна будова бактеріоцинів другої групи свідчить про вірусне
походження плазмід бактеріоциногенності. Більшість коліциногенних факторів
розглядають як геноми дефектних вірулентних фагів, що втратили гени синтезу
білків капсиду, але зберегли гени летальних білків (бактеріоцинів). Бактеріоцини
виділяються клітиною назовні та добре дифундують в агарові середовища,
утворюючи зони пригнічення росту чутливих бактерій. Більшість бактеріоцинів
термолабільні, проявляють антигенні властивості, адсорбуються на специфічних
рецепторах клітини-мішені (часто загальних із рецепторами адсорбції фагів).
Коліцини, кодовані Со/-плазмідами, мають різні механізми дії: коліцин El
підвищує проникність мембрани, Е2 спричиняє деградацію ДНК, а ЕЗ - рРНК.
Бактеріоцини діють летально на клітини бактерій близького виду або на
споріднені штами в межах одного виду. Для самої клітини-продуцента синтез
бактеріоцину летальний, але інші клітини даного штаму проявляють стійкість до
нього. Бактеріальна клітина продукує близько 6,5 тис. летальних частинок
бактеріоцину, здатна адсорбувати приблизно 100 частинок, а гине під впливом
1-2 частинок. Мутанти бактерій, що втратили рецептори для бактеріоцинів,
стають стійкими до їх літичної дії. Летальна дія бактеріоцинів пов'язана з
блокуванням енергетичних функцій цитоплазматичної мембрани клітини-мішені.
Це призводить до різкого порушення метаболізму клітини, атакованої
бактеріоцином, у ній пригнічується синтез ДНК, РНК, білка, ферментів,
припиняються ріст і розмноження. Загибель клітини відбувається через автоліз.
У патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів бактеріоциногенність --
один із факторів патогенності, оскільки бактеріоцини надають перевагу
 173

бактеріям, що їх продукують, у конкурентній боротьбі з іншими спорідненими

видами й сприяють проникненню мікроба в організм хазяїна.
12.1.6. Плазміди токсиноутворення
Плазміди токсиноутворення несуть гени, що детермінують синтез токсинів
у патогенних та умовно-патогенних бактерій. Так, у Е. сої виявлено плазміду
Епі, що кодує ентеротоксин, і плазміду НІу, що забезпечує продукцію гемолізину.
Усі плазміди токсиноутворення обумовлюють патогенні властивості бактерій.
Плазміди Ent являють собою гетерогенну групу позахромосомних
генетичних елементів, які відрізняються здатністю до трансмісії, інтеграції у
хромосому і належать до різних груп несумісності. Їх молекулярна маса суттєво
варіює в межах 20-30 мегаДа, що свідчить про наявність відмінностей у їх складі.
Під контролем плазмід Киї, що належать до різних груп несумісності, в
ентеротоксигенних штамів Є. сої можуть синтезуватися токсини двох класів:
- 5Т -- низькомолекулярний термостабільний неантигенний токсин;
е- ІТ- високомолекулярний термолабільний антигенний токсин.
Плазміди Епі кишкових паличок, виділених у людей, мають високу
кон'югативність. Завдяки цій властивості вони можуть передавати плазмідні гени
токсиноутворення іншим ентеробактеріям, у тому числі й інших видів і родів.
Плазміди К88 1 К99 знайдені також у кишкової палички. До їх складу
входять гени поверхневих антигенів бактерій, що беруть участь в адгезії бактерій
на слизових оболонках шлунково-кишкового тракту та колонізації | в них.
Вважають, що крім адгезинів, кодованих плазмідою КЗ88, у прикріпленні
кишкових паличок до фібрил тонкого кишечнику беруть участь поверхневі
антигени, що експресуються під контролем плазміди 987Р.
У деяких представників роду Ехсйегіспіа виявляють плазмідні комплекси
К38'К99", які утворюються за рахунок коінтеграції двох плазмід. У кишкових
паличок, що містять такі гібридні плазміди, значно збільшується вірулентність
(ступінь патогенності). При зараженні ними у тварин розвивається сильна діарея.
Плазміди патогенності в Е. соїї можуть нести також гени термочутливого
токсину, близького за структурою і властивостями до холерного токсину. Так,
сумнозвісна E. сої серотипу О157Н7, що викликає важкий коліентерит із
геморагічним синдромом і ураженням нирок, виробляє шиготоксин і веротоксин,
гомологічні до токсинів шигел дизентерії та холерного вібріона. Імовірно гени
цих токсинів потрапили в кишкову паличку у складі плазмід із інших збудників.
Плазміди токсиноутворення знайдено також у різних патогенних і умовно-
патогенних бактерій: збудника чуми, холери, клостридій ботулізму, газової
анаеробної інфекції, правця, стафілококів, стрептококів та багатьох інших.
Очевидно, плазміди токсиноутворення можуть поєднуватись між собою і
входити до складу так званих островів патогенності. Останні передаються
горизонтально між клітинами різних видів мікроорганізмів і надають їм
патогенних властивостей.
ШшеР-плазміди - плазміди з широким колом хазяїв. Вони наявні та стійко
передаються з покоління в покоління практично у всіх грамнегативних бактерій,
 174
завдяки чому ШшеР-плазміди широко застосовують у генетичних дослідженнях і в
генній інженерії. У Е. Соїї зазвичай виявляють 6-3 копій ПеР. У мінімальному
наборі генів цих плазмід знаходять тільки два генетичні елементи - огіЙ (сайт
початку вегетативної реплікації) і /7/ (від англ. trans-acting replication function).
Білок, кодований геном /г/, зв'язується з огі/і активує його для впізнавання
апаратом реплікації клітини-хазяїна. У деяких ПР додатково виявляють (і/-сог-
регулон із 5 репресорних генів, що кодують летальні для хазяїна функції, якщо
експресія самих цих генів не регулюється. Функції К//-генів остаточно ще не
з'ясовано.
12.2. Транспозони
Транспозони - це група мобільних генетичних елементів (МГЕ), здатних
переміщатися з одної ділянки генома в іншу шляхом специфічного механізму
транспозиції. Вперше транспозони були відткриті в 40-х рр. ХХ ст. Барбарою
Мак-Клінток у клітинах індійського зерна (червоної кукурудзи). Протягом
наступних тридцяти років вони були знайдені майже у всіх живих істот -
бактерій, червів, плодових мушок (дрозофіл) і ссавців. До 70-х рр. минулого
століття вважали, що геноми організмів достатньо стабільні Й гени, які
детермінують структурні та біохімічні ознаки, розташовані на хромосомах у
статичній послідовності. Однак відкриття транспозонів повністю змінило це
догматичне уявлення. Стало зрозуміло, що окремі ділянки генома (і навіть певні
гени) за допомогою транспозонів та інших МГЕ можуть «здійснювати прогулянки
хромосомами», тобто стабільність геномів достатньо відносна. Цей вид
генетичних перебудов поряд із мутаціями дає чималий матеріал для природного
добору Й еволюції живих істот. До речі, частота транспозицій може бути
порівняна з частотою спонтанних мутацій і коливається у межах 10" -10"" (на
покоління). У 1983 р. Б. Мак-Клінток за відкриття транспозонів нагородили
Нобелівською премією 1 транспозони почали грунтовно вивчати.
У результаті аналізу багатьох досліджень було встановлено наявність
спільних ознак у транспозонів, виявлених у різних біологічних об'єктів:
Т)усі транспозони можуть існувати як автономно, так і у складі інших
генетичних елементів (хромосом, плазмід, вірусів);
2)незалежно від будови вони мають гени ферментів, що забезпечують їх
транспозицію (ген транспозази і звичайно гени білків-регуляторів транспозази);
3)транспозони фланковані інвертованими повторами - послідовностями,
однаковими з двох кінців у транс-положеннях, але розташованими у протилежних
напрямках; у прокаріотів - до 40 п.н., в еукаріотів - до 100 п.н. і більше;
4) іноді танспозони по краях мають ще й прямі повтори із 4-9 п.н., у яких
наявна повна або часткова гомологія послідовностей, проте прямі повтори не є
власним компонентом транспозона, а підхоплюються ним із кінців сайта-мішені, з
якого транспозон вищеплюється;
5) певні транспозони мають декілька сайтів ініціації транскрипції й трансляції
і, відповідно до цього, можуть кодувати синтез декількох білків, причому
транскрипція може відбуватися не тільки в одному, а й у різних напрямках;
 175

6)транспозони можуть вбудовуватись у декілька сайтів у геномі, але

зазвичай ці сайти є «гарячими точками» рестрикції; щодо нуклеотидної
послідовності сайта-мішені, то, очевидно, транспозони мало розбірливі.
Рекомбінації, пов'язані з переміщенням транспозонів, отримали назву
«транспозицій». Транспозиція - це нереципрокне переміщення транспозона у
межах хромосоми, між хромосомами та між іншими генетичними елементами.
Транспозиції можуть бути спрямованими й неспрямованими. За
спрямованої транспозиції переміщення МГЕ відбувається в певний сайт
хромосоми або іншого генетичного елемента, а за неспрямованої - у будь-яку
ділянку генома. Функції мобільних генетичних елементів можуть виконувати не
тільки транспозони та плазміди, а й деякі віруси, причому переміщення МГЕ
може відбуватися як між різними одиницями генома в одній клітині, так і між
різними клітинами. Крім того, транспозиції можуть здійснюватись за рахунок
вбудовування у хромосоми продуктів зворотної транскрипції - ДНК-копій,
зчитаних з ІРНК за допомогою зворотної транскриптази (ревертази) ретровірусів.
Таким чином, очевидно, сформувалися ретропозони та ретротранспозони в
еукаріотів.
Переміщення транспозонів називають «незаконною рекомбінацією»,
оскільки воно практично не залежить від системи генів Кес АВС і не потребує
наявності гомологічних ділянок. За звичайних умов саме ця система забезпечує
рекомбінації у клітині. Ще однією відмінною рисою «незаконної транспозиції» є
те, що вона відбувається за участю особливого ферменту транспозази. Хоча за
своєю суттю механізм транспозиції є рекомбінацією, він супроводжується також і
різноманітними мутаціями, серед яких найчастіше зустрічаються випадіння
ділянок хромосом (делеції), вставки фрагментів ДНК (інсерції), повороти на 180?
(інверсії) і навіть значні генетичні перебудови (транслокації).
12.2.1. Мобільні генетичні елементи прокаріотів
Дослідження транспозонів різних прокаріотичних об'єктів засвідчили їх
велике різноманіття як за розмірами, так і за складом структурних компонентів,
механізмами транспозиції та походженням. Таксономія їх достатньо складна,
однак, узагальнюючи всі їх властивості й структурні особливості, у прокаріотів
можна виділити такі характерні типи транспозонів: ІЗ5-елементи (найпростіші
транспозони), транспозони, у т. ч. І5-подібні елементи й 15-модулі. Нумерують
І5-елементи й транспозони відповідно до хронології їх відкриття.
Інсерційні послідовності - І5-елементи (від англ. /п5еніоп 5едиепсе) -
найпростіші мобільні елементи, поширені у клітинах прокаріотів, зустрічаються у
бактеріофагів і плазмід. Були відкриті на початку 1970-х рр. П. Старлінжером,
Г. Седлером 1 Дж. Шапіро в ході вивчення незвичайних мутацій у галактозному
опероні кишкової палички.
І5-елементи - вставні послідовності (або інсерційні сегменти) довжиною
від 200 до 5700 п.н. (частіше 1-2 тис. п.н.). На обох кінцях І5-елементів
розташовані в цис-положеннях практично ідентичні інвертовані послідовності. Це
найпростіші за будовою транспозони. В їх структурі виявлено два основні гени:
 176

еген транспозази - ферменту, що забезпечує вирізання (ексцизію)

І5-елемента з одного сайта генома і переміщення в інший сайт. Транспозаза -
продукт гена /пр, що міститься всередині І5-елемента і має відкриту рамку
зчитування. Цей фермент взаємодіє з інвертованими кінцями в процесі їх
переміщення І5-елемента;
е ген, кодуючий білок-регулятор, що контролює транскрипцію транспозази
й сам процес транспозиції.
І5-елементи оточені інвертованими та прямими повторами.
Інвертовані повтори - ідентичні послідовності нуклеотидів, які обмежують
гени, розташовані всередині І5-елемента. У різних ланцюгах ДНК вони повернуті
у транс-положенні на 180? (як у паліндромах). Зазвичай в інвертованих повторах
І5-елементів нараховують 3-40 пар нуклеотидів. Як правило, інвертовані повтори
на різних кінцях генетичного елемента ідентичні (досконалі), але іноді
зустрічаються й неїдентичні повтори (недосконалі).
Прямі повтори по краях транспозонів - це послідовності з 5-9 п.н.,
розташовані в одному напрямку. Це дупліковані послідовності ДНК-мішені, тобто
тієї молекули, куди вбудовується МГЕ. Як же вони виникли? Згідно з
загальноприйнятою гіпотезою | ДНК-мішень, у яку вбудовується транспозон,
розщеплюється з утворенням «липких» кінців, а транспозон приєднується до
виступаючих (більш довгих) кінців ДНК-мішені. При цьому в ланцюгах із
короткими «липкими» кінцями утворюються виломи, які репаративно
забудовуються шляхом комплементарного синтезу, що призводить до появи
прямих повторів. Таким чином, прямі повтори з'являються в І5-елементах після
вбудовування в нову ДНК-мішень. Якщо І5-елемент входить до складу плазміди в
НЕ-формі (інтегрованої у хромосому), то іноді за рахунок неточного вищеплення
у Е-факторі може змінюватися місце локалізації 15-елемента.
І5-елементи в основному зустрічаються у прокаріотів. Їх позначають
номерами відповідно до хронології виділення: І51, І52, І53 тощо. Вони здатні
«перескакувати» у різні місця генома бактерій, іноді з доволі високою частотою
(103-107). Такі переміщення можуть відбуватися не тільки в межах самої
бактеріальної хромосоми, але й між хромосомою та іншими репліконами,
наявними у клітині (плазмідами, помірними фагами), а також між симбіотичними
репліконами, сформованими в результаті коінтеграції різних МГЕ.
Транспозони можна розглядати як більш складні за структурою і функціями
15-елементи. Їх позначають як Тп-елементи із відповідними номерами: ТпіІ, Тп2,
То3 тощо. Вони зазвичай складаються із декількох тис. п.н. (4,5 тис. п.н. і більше)
і вирізняються своєю будовою. Розрізняють 15-подібні транспозони і І5-модулі.
Наявність ІЗ-елементів по всій довжині хромосоми забезпечує області
гомології, куди можуть інтегруватись Е-плазміди. Таким чином І85-елементи і
транспозони забезпечують пластичність генома, важливу для еволюції і для
зберігання колективного генома бактерій. Колективний геном складається з генів,
наявних в окремій клітині, і всіх генів, що можуть передаватися горизонтально
між штамами. Наприклад, окрема клітина Е. соїї містить лише 80 90 від загальної
кількості генів, що зустрічаються у різних штамів даного виду. Тобто
 177

колективний геном, як правило, більший, ніж індивідуальний. Мабуть тому

кількість генів у представників певного виду іноді суттєво коливається.
І5-подібні транспозони за будовою схожі на І5-елементи, але крім
характерних для І5-елементів структурних компонентів вони несуть додатковий
ген-пасажир, розташований у напрямі зчитування за генами транспозази й
білка-регулятора. Як ген-пасажир у транспозоні може бути наявний ген стійкості
до антибіотика, ген стійкості до важкого металу або будь-який інший ген із тих,
які зустрічаються у плазмідах і визначають їх фенотипові ознаки. Вважають, що
такі транспозони сформувались шляхом захоплення І5-елементами додаткового
гена-пасажира. Існують навіть експериментальні підтвердження перетворення
15-елемента на транспозон за рахунок вставки бактеріального гена.
На теперешній час найбільш детально досліджений І5-подібний транспозон
Тп3 (рис. 12.4). Він складається приблизно з 5 тис. пар нуклеотидів, оточений по
краях інвертованими (по 38 п.н. ) і прямими повторами (по 5 п.н.).

Напрям транскрипції Напрям транскрипції

«фа о

ПП | ШІ | Ген транспозази |і Ген резолвази Ген В-лактамази ПП

Рис. 12.4. Будова транспозона Тп3

Примітка: ПИ - прямі повтори (5 п.н.), ПІ - інвертовані повтори (38 п.н.), СЗР - сайт
зв'язування резолвази (як репресора). У цьому ж сайті знаходяться точки ініціації транскрипції,
до яких приєднується РНК-полімераза перед початком синтезу ІРНК. Причому, як показано
стрілками, транскрипція розташованих праворуч від СЗР і ліворуч ділянок здійснюється у двох
протилежних напрямках і до того ж на різних ланцюгах ДНК, оскільки синтез ІРНК завжди
відбувається у напрямку 5/-» 3", а комплементарні ланцюги антипаралельні.
Як бачимо на рис. 12.4, транспозон Тп3 несе 3 гени. Два з них кодують
ферменти, необхідні для транспозиції, - транспозазу (фермент перенесення, який
розпочинає вирізання транспозона) і резолвазу (фермент, що закінчує
транспозицію 1 регулює активність транспозази). Третім - геном-пасажиром - у
транспозоні Тп3 є ген р-лактамази (ген стійкості до пеніциліну та деяких його
похідних).
Транспозон Тп3 має власну систему регуляції, яка працює за механізмом
аутогенного контролю. А саме резолваза, що кодується другим геном
транспозону, виконує одночасно дві функції - ферменту, що забезпечує
транспозицію, і білка-регулятора (репресора), здатного блокувати транскрипцію
транспозона. Резолваза зв'язується з ДНК у некодуючій ділянці між геном
транспозази і власним геном, перекриває сайти ініціації транскрипції обох генів і
унеможливлює саму транспозицію. Таким чином, резолваза, крім ферментативної,
виконує ще функцію білка-репресора. Ген резолвази наявний тільки у Тп3 і
практично не зустрічається в інших транспозонах.
Бактерії, що мають у складі хромосом такий транспозон, захищені від згубної
дії антибіотиків пеніцилінового ряду. Транспозон Тп3, будучи захопленим
 178

трансмісивною плазмідою, може опинитись у багатьох клітинах популяції

мікробів, що обумовлює поширення антибіотикостійкості. Безумовно існує
генетичний зв'язок між плазмідами та транспозонами. У середині 70-х рр. ХХ ст.
мікробіологи встановили, що гени стійкості до антибіотиків потрапляють у
плазміди за рахунок вбудовування (інсерції) в них транспозонів, звідси і схожість
наборів генів у плазмідах і транспозонах.
15-модулі - це складні транспозони, які, очевидно, утворилися шляхом
захоплення хромосомних генів двома близько розташованими І5-елементами.
Причому по краях таких транспозонів є або однакові копії І5-елементів, або ж два
різні 15-елементи. За наявності двох однакових І5-елементів по краях транспозона
вони можуть мати як пряму (Тп9, рис. 12.5), так і взаємно протилежну орієнтацію
нуклеотидних послідовностей (Тп5, рис. 12.6).
Напрям транскрипції Напрям транскрипції
м м
Ш | І51-елемент [ex crilikocti 10 x0pamdenikoy Il ISl-enement | Ш
710 п.н. 1100 п.н. 710 п.н.

Рис. 12.5. Будова транспозона Тп9

Примітка: транспозон Тп9 - модуль із двох сусідніх І51-елементів, між якими опинився
ген стійкості до антибіотика хлорамфеніколу. Причому, як вказано стрілками над
151-елементами, напрямок послідовностей нуклеотидів і транскрипції в них однаковий.
ШІ - інвертовані повтори, що обмежують 15 1-елементи.
Кожен із розташованих по краях І5-елементів має свою власну систему
транспозиції і може вищеплюватись із ДНК самостійно або ж у складі утвореного
І5-модуля. Чим ближче один до одного в ДНК розташовані І5-елементи, тим
більша ймовірність утворення такого модуля, а також подальшого вищеплення
(ексцизії) його з одного сайта і вбудовування (інсерції) в інший сайт генома як
єдиного цілого. Слід відмітити, що частота переміщення І5-модулів швидко
знижується зі збільшенням відстані між фланкуючими І85-елементами.
На рис. 12.6 подано схему будови ще одного 15-модуля - транспозона Тп5, у
якого кінці утворені І550-елементами, що зчитуються в різних напрямах.
Напрям транскрипції Напрям транскрипції
шу РР
ШІ | І550-елемент | ШІ leu crilikocTi 10 KaHaMillMHy І550-елемент | ШІ
1500 п.н. 2800 п.н. 1500 п.н.

Рис. 12.6. Будова транспозона Тп5

Примітка: транспозон Тп5 - модуль із двох сусідніх 1550-елементів, між якими
розташований ген стійкості до антибіотика канаміцину. Стрілки над І8550-елементами
демонструють, що спрямованість послідовностей нуклеотидів і транскрипції в них взаємно
інвертована на 1809. ШІ - інвертовані повтори, що фланкують І550-елементи.
Цікаво те, що два І5-елементи, розташовані в кільцевій плазміді, можуть
утворити два різні І5-модулі залежно від того, який сегмент плазмідної ДНК буде
захоплений і транспозований ними.
 179

В останні роки дослідники широко обговорюють аспекти еволюції

мобільних генетичних елементів. У прокаріотів їх утворення можна подати таким
еволюційним рядом: І5-елементи -» транспозони -» плазміди -» бактеріофаги.
12.2.2. Мобільні генетичні елементи еукаріотів
У клітинах еукаріотів різних систематичних груп було виявлено
різноманітні МГЕ, що розрізняються за розмірами, наявністю прямих та
інвертованих повторів, їх довжиною, а також механізмами транспозиції. Їх
таксономія складна, не збігається в різних літературних джерелах і, можливо,
буде постійно доповнюватись у зв'язку з вивченням нових біологічних об'єктів.
Проте найгрунтовніше в еукаріотів вивчено такі родини транспозонів:
1) МГЕ, подібні до бактеріальних транспозонів, - зустрічаються у дріжджів-
сахаромщетів 1 дрозофіл; мають невеликі розміри і невеликі кінцеві повтори;
розташовані в різних частинах генома; деякі з них не мають власної транспозази,
але переміщаються за допомогою інших МГЕ;
2) Ту-елементи (від англ. Тігаперозоп уеазі) - велика родина МГЕ дріжджів,
подібні до складних транспозонів бактерій типу транспозона Ти3; їх довжина -
приблизно 6 тис. п.н., по краях оточені довгими кінцевими прямими повторами;
кількість Ту-елементів на геном становить 30-35 копій, за рахунок чого вони
можуть давати ефект «мутаційного вибуху»;
3) Соріа-подібні елементи дрозофіл із довжиною близько 5 тис. п.н., мають
ідентичні прямі повтори (-276 п.н.); іноді зустрічаються у вигляді автономних
кільцевих молекул ДНК, що відрізняє їх від бактеріальних транспозонів, які не
існують за межами генома. Їх довгі повтори, очевидно, виконують функції
промоторів генів;
4) Ас- і Дз5-елементи кукурудзи - транспозони, відкриті Б. Мак-Клінток у
клітинах насіння червоної кукурудзи, здатні переміщуватись з одного сайта
хромосоми в інший за допомогою апарату транспозиції, причому Ас-елемент
(активатор) може переміщуватись самостійно, а І)5-елемент (дисоціатор) - тільки
в разі його інтеграції з Ас-елементом. Вбудовування названих транспозонів у ген,
відповідальний за синтез оранжево-червоного пігменту клітин перикарпу,
призводить до появи знебарвлених плям. За рахунок цього зерна набувають
мозаїчного забарвлення;
5) МГЕ з довгими термінальними повторами ІТК (від англ. Доп terminal
repeats) по 300-400 пар нуклеотидів - зустрічаються у дріжджів, дрозофіл,
хребетних тварин, рослин; поводять себе як стабільні гени, але зовнішні фактори
можуть спровокувати їх переміщення. Такі МГЕ мають певну подібність із
ретровірусами, для яких теж характерна наявність ІТК по 250-500 п.н.;
6) ретротранспозони -- очевидно, походять від ретровірусів, оскільки вони є
продукти зворотної транскрипції; мають довгі кінцеві повтори ІТВ. Траскрипція
ретротранспозонів здійснюється за допомогою РНК-полімерази П еукаріотів.
Кількість ретротранспозонів на геном коливається від декількох одиниць до
сотень 1 тисяч копій;
7) ретропозони - це, імовірно, продукти зворотної транскрипції, а саме
 180

ДНК-копії, синтезовані зворотною транскриптазою ретровірусів на матрицях

клітинних ІРНК. Вони можуть містити довгі повтори, але можуть і не мати
типової будови. У ссавців їх вміст складає до 10 З генома. У деяких із них
(псевдогенів) відсутні інтрони, а на 3'-кінці вони поліаденільовані, що свідчить
про їх походження від РНК. Певні ретропозони (ретрогени) можуть
вбудовуватись під чужий промотор.
8)короткі повтори відносять до ретропозонів, вони представлені
послідовностями АЇиц. У людини вони складають до 5-6 Ус генома, зустрічаються
3-10? разів на геном. Можливо, це частково процесовані копії тРНК (транспортної
РНК) і 75 РНК, яка входить до складу рибосом і забезпечує їх прикріплення до
ендоплазматичного ретикулума.
В еукаріотів виділяють два основні класи мобільних генетичних елементів.
До першого класу належать МГЕ, які розмножуються і переміщаються
завдяки зворотній транскриптазі (ревертазі) подібно до ретровірусів. Вони несуть
ген, кодуючий ревертазу. Цей фермент застосовує їРНК, транскрибовану з
транспозона, як матрицю 1 на ній синтезує ДНК-копії, що можуть вбудовуватись в
інші локуси генома. Таким чином, відбувається розмноження транспозонів. У
свою чергу МГЕ першого класу розподіляють на два підкласи:
а) ретровірусоподібні елементи з довгими термінальними повторами (1. ТВ)
на кінцях, які зустрічаються в геномах дріжджів, комах, ссавців і рослин; до цього
підкласу можна віднести описані вище групи 35 16;
6) невірусні генетичні елементи, що не мають на кінцях ІЛЕ, але мають ген
ревертази; до цього підкласу можна віднести групу 7.
До другого класу МГЕ належать власне транспозони, які мають на кінцях
короткі обернені повтори, а усередині - ген, що кодує транспозазу, а іноді ще й
ген білка-регулятора синтезу транспозази. До цього класу відносять описані вище
групи 1-4. Серед них добре вивчені МГЕ кукурудзи Ас і 5, мобільні елементи
дрозофіли Р 1 Норо, МГЕ тагіпег, знайдений уперше в одного ендемічного виду
дрозофіл з строва Маврикій і пізніше виявлений у багатьох досліджених
організмів від нематод до людини.
Цікаво, що види одного роду часто розрізняються типами виділених МГЕ, що
може свідчити про екзогенне вірусне походження мобільних генетичних
елементів, причому зараження різними вірусами відбувалося не одномоментно 1
часто вже після дивергенції вірусних геномів.
12.2.3. Механізми транспозиції
Молекулярні механізми транспозиції сумісні з реплікацією транспозонів як
окремих реплікативних одиниць, але суттєво відрізняються в організмів різних
систематичних груп. У процесі реплікації транспозони можуть подвоюватись, що
зрештою призводить до появи їх копій у різних елементах генома (хромосомах,
плазмідах, помірних фагах і вірусах еукаріотів).
Досліджено три основні механізми транспозиції, пов'язані з
копіюванням транспозонів за рахунок реплікації або зворотної транскрипції:
консервативний, напівконсервативний (реплікативний) і РНК-опосередкований.
 181

За консервативного механізму транспозиції обидва ланцюги ДНК

транспозона вирізаються з вихідної молекули і далі вбудовуються в ДНК-мішень
(наприклад, у плазміду). Причому транспозаза вирізає транспозон, гідролізуючи
відразу обидва ланцюги ДНК в одному сайті з утворенням «тупих» кінців і може
замикати вирізаний транспозон у кільце. За таким механізмом транспозиція
відбувається в таких МГЕ, як Тп5, Тпі10, 151, 15903 і деяких інших, У разі інсерції
(вставки) даних мобільних елементів у ДНК-мішень молекула мішені
розривається в паліндромному сайті з утворенням «липких» кінців, тому між
флангами транспозона Й кінцями ДНК-мішені утворюються одноланцюгові
виломи. Для забудовування виломів вмикається реплікативна репарація, у
результаті чого відбувається дуплікація кінців мішені з утворенням прямих
повторів із 9 п.н.
Транспозон На схемі (рис. 12.7) зображено
консервативний механізм транс-
нання ооо позиції - вирізання транспозона з
одного місця генома і перенесення
—s його в інший сайт. У нижній
РР частині рисунка видно, що в місці
ї бу Bion BHULeMJICHHA транспозона BHJIOM
І че, забудовується за рахунок репарації,
чими причому матрицею для відновлення
on пошкодженого ланцюга слугує
Поуденування зранснення щойно синтезована | у | процесі
Забудовування вилома реплікації копія другого ланцюга
a
a ДНК. Цей процес нагадує пост-
_—- —- ——
реплікативну репарацію.
Ділянка транспозона

Рис. 12.7. Консервативний механізм транспозиції

Якщо ж у місці вищеплення транспозона для забудовування вилому

(делетованої ділянки) відсутня матриця, то може відбуватися так звана
«самовбивча» транспозиція, що супроводжується деградацією всієї ДНК за
рахунок гідролітичної дії екзонуклеаз, які приєднуються до 5'- і 3'"-кінців ДНК у
ділянці вилому і починають послідовно видаляти один нуклеотид за іншим.
Слід зауважити, що такий механізм транспозиції властивий як окремим
І5-елементам, так і складним транспозонам (15-модулям), причому в кожному
випадку наявні певні особливості як при вирізанні, так і вбудовуванні
транспозона в інше місце генома.
За напівконсервативного механізму транспозиції у дволанцюговій
молекулі ДНК праворуч 1 ліворуч від транспозона фермент транспозаза розриває
по одному ланцюгу в транс-положенні (рис. 12.8). Цей самий фермент розрізає 1
ДНК-мішень з утворенням «липких» кінців (по 5 п.н.). Після цього відбувається
з'єднання розірваних кінців транспозона з «липкими» кінцями ДНК-мішені за
 182

допомогою транспозази (чи інших білків). У результаті такого з'єднання

формується коінтеграт -- зчеплені кільця ДНК-донора (наприклад, хромосоми,
що містить транспозон) ї ДНК-мішені (плазміди).
Транспозон , ‘ М .
м
а Sa
Хо sw соту У коінтеграті із двох боків транспозона
nd so : :
ene ( 7) залишаються по два нез'єдні кінці, які
Розриви, внесені
с Р 201. со ДНК-мішень
імітують реплікативні вилки. Саме з
транспозазою Й них їі розпочинається реплікація, в
І
| Транспозаза з'єднує
результаті чого даний транспозон
; жі розривів подвоюється. Після реплікації фермент
М і 4/7 уч | резолваза здійснює сайт-специфічну
0 = рекомбінацію шляхом розрізання
Р he м-/ зчеплених ланцюгів і з'єднання їх
| хрест-навхрест. У результаті сайт-
| Реплікація специфічної рекомбінації зчеплені
' Дуплікація ДНКомішені | кільця коінтеграта роз'єднуються і по
A : GT) одній копії транспозона опиняється і в
вихідній молекулі ДНК-донора, і в
на ДНК-мішені.

Рис. 12.8. Напівконсервативний механізм транспозиції

Таким чином, транспозон залишається на старому місці Й з'являється в
новому елементі генома, тобто розмножується.
Напівконсервативний механізм транспозиції добре вивчений на прикладі
у-фага, який можна розглядати як транспозон. На відміну від описаного
механізму у и-фага до кінців транспозона приєднуються білок А (продукт гена A),
який як транспозаза вивільнює два кінці у транс-положенні. Білок В (продукт гена
В) робить розрив у ДНК-мішені з утворенням «липких» кінців у 5 п.н. і
приєднується до них. Після цього відбувається з'єднання розірваних кінців
транспозона з «липкими» кінцями ДНК-мішені за допомогою білків А і В. Потім
відбуваються реплікація і сайт-специфічна рекомбінація.
Напівконсервативний процес транспозиції характерний для великих
транспозонів ТпА-родини, до яких віднесені у-фаг, Тиї, Ти3, Тп21, Та501, Тп1000
і деякі інші МГЕ.
Іноді складні транспозони розподіляють на два класи залежно від механізму
транспозиції. Транспозони І класу містять на кінцях І5-елементи, здатні
переміщувати розташовані між ними гени. Транспозони І класу переміщуються за
рахунок нереплікативного (консервативного) механізму. У багатьох таких
транспозонів 15-елементи можуть бути неідентичними, і тільки один із них може
кодувати функціонально активну транспозазу. Транспозони П класу мають на
кінцях інвертовані послідовності, але не І5-елементи. Типовим транспозоном П
класу є Тп3, що належить до родини ТпА-транспозонів, для яких характерна
наявність не тільки гена транспозази, але й гена резолвази - білка-регулятора.
Транспозони II класу переміщуються завдяки реплікативному
 183

(напівконсервативному) механізму з утворенням проміжного продукту -

коінтеграта, що являє собою зчеплені хрест-навхрест подвоєні фрагменти
транспозона 1 ДНК-мішені. Тому продукти транспозиції по завершенні процесу
розділяються за рахунок сайт-специфічної рекомбінації B JIOKYCi res.
РНК-опосередкований механізм транспозиції зустрічається в основному в
еукаріотів при розмноженні та переміщенні ретротранспозонів і ретропозонів.
Дані МГЕ формуються за рахунок зворотної транскрипції на вірусних РНК
(ретротранспозони) або клітинних РНК (ретропозони). За допомогою ферменту
зворотної транскриптази відбувається синтез ДНК-копій на матрицях молекул
РНК. Утворені ДНК-копії вбудовуються в ДНК хромосом, однак можуть легко із
них вищеплятися і переноситись в інші сайти генома, причому кількість їх копій у
процесі транспозицій може збільшуватися.
12.2.4. Складні мобільні генетичні елементи
В останні роки в молекулярній біології широко обговорюють питання про
існування так званих геномних островів. Геномні острови, можливо, виникли
внаслідок модифікації плазмід. Вони містять низку генів, що визначають певну
групу властивостей. Уже названі вище острови патогенності являють собою
кластери (групи) генів, кодуючих синтез антибіотика і стійкість до нього, білка,
що регулює їх активність, а також містять гени різноманітних факторів
патогенності.
Завдяки рекомбінативним процесам можуть утворюватися дуже складні МГЕ,
що складаються із плазмід і вбудованих у них транспозонів (рис. 12.9).
Касета мобільних генів
ARI AR2
Region2

ва ..
«АТ? опе аа? 5 155

Тп 5036 of нан нн \ Tné02 Tn2t

та) 154321 пра inp IRS х / зивсвт Ба sal of5 іпр іа ||| засСсаідд| / ta tA IRt merE merD
Г У J

Інтегрон І класу+ ,
f і
ae

is a umuD 155

сук
мії —

151422
Транспозон 1 Region 1 -
Транспозон 2
Кон'югаційна плазміда

Рис. 12.9. Будова складного модуля МГЕ на прикладі кон'югаційної плазміди

КіеБзіеНа рпеитопіа, що забезпечує резистентність до багатьох антибіотиків
 184

На рис. 12.9 зображено схему будови складного МГЕ на прикладі плазміди

Klebsiella pneumonia, що забезпечує бактерії мультирезистентність до
антибіотиків. Даний МГЕ формується на основі кон'югаційної плазміди, яка
містить у своєму складі декілька транспозонів (7п 1000, Tn 402, Tn 21),
І5-елементів й інтегрон із касетою генів, вбудований у транспозон Ти 2036.
Подібні модулі мобільних генетичних елементів мають у своєму складі відразу
декілька генів стійкості до антибіотиків та інших антибактеріальних препаратів,
чим зумовлюють появу полірезистентних штамів мікроорганізмів, які отримали
назву «супербактерій».
Цікаво те, що подібні за складом модулі зустрічаються у різних патогенних
бактерій, незалежно від роду та виду, причому в різних регіонах світу.
Наприкінці слід відмітити, що мобільні генетичні елементи (плазміди,
транспозони, віруси) здійснюють вагомий внесок у мінливість організмів.
Мутації, викликані переміщеннями транспозонів, будучи підхоплені добором,
сприяють адаптації організмів до постійно змінюваних умов середовища.
Мінливість, опосередкована МГЕ, має особливий характер: можливі масові
спадкові зміни, наприклад спалахи мутацій генів-мішеней або певні «вибухові»
перебудови хромосом, спричинені сайт-специфічною рекомбінацією. Маючи у
своїй структурі промотори, МГЕ можуть бути рухомими тканиноспецифічними
регуляторами генної активності або створювати нові генетичні конструкції.
Мобільні генетичні елементи забезпечують обмін спадковим матеріалом між
різними клітинними структурами й між різними видами.
Таким чином, МГЕ відіграють значну роль у горизонтальному перенесенні
генів, що доводить існування «спільного генофонду всього живого світу» і
можливість обміну генами не тільки між різними видами та родами
мікроорганізмів, але й між неспорідненими організмами -- бактеріями й вищими
тваринами 1 рослинами. Одним із підтверджень цього є той факт, що приблизно
0,5 Ус генома людини представлено генами, що мають бактеріальне походження, а
кількість вірусних генів ще більша. Гени, що з'явилися в певному геномі в
результаті горизонтального перенесення, запропоновано називати ксенологами.
Імовірно горизонтальна передача генів існувала протягом усього еволюційного
процесу й відбувається і в теперешній час.
 185

Розділ 13. РЕПАРАЦІЯ. МЕХАНІЗМИ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ

СТАБІЛЬНОСТІ ГЕНОМА
Для забезпечення стабільності геномів і передачі генетичної інформації в
ряду поколінь дуже важливе значення має репаративна система клітин, яка
відстежує всі зміни генетичного матеріалу і виправляє їх.
ДНК достатньо стабільна молекула завдяки тому, що реакційноздатні групи
нібито «сховані» всередині дволанцюгової спіральної молекули, а також за
рахунок більшої стійкості дезоксирибози порівняно з рибозою. Усе це забезпечує
певну стабільність цукрофосфатного остова молекули ДНК, що позначається на її
фізико-хімічних властивостях. ДНК достатньо стабільна відносно кислот і лугів,
витримує нагрівання до 60 С. У процесі поступового підвищення температури
молекула ДНК починає плавитись за рахунок руйнування водневих зв'язків між
двома комплементарними ланцюгами, у результаті чого ланцюги розходяться.
Проте при повільному охолодженні розчину плавленої ДНК може відбуватися
ренатурація молекули і ланцюги знову починають сходитися за правилом
комплементарності. Інактивація ДНК починається за достатньо високої
температури - 859С, і тільки за температури, вищої 90"С, відбувається
денатурація молекули.
Постійність складу генетичного матеріалу зумовлена також високою
точністю процесу реплікації. ДНК-полімерази, що здійснюють реплікацію,
завдяки наявності екзонуклеазної активності здатні самі виправляти власні
помилки під час синтезу нового дочірнього ланцюга. За деякими даними помилки
в процесі реплікації, які спричиняють неправильне вбудовування нуклеотидів,
трапляються дуже рідко, не частіше 107 -10". Однак, незважаючи на високу
стабільність молекули ДНК, вона все-таки може хімічно змінюватись у результаті
впливу певних факторів. І передусім це стосується структури азотистих основ,
що входять до складу нуклеотидів і визначають їх унікальність. Заміна азотистих
основ у нуклеотидах може призвести до суттєвих змін у генетичному коді
організму.
Серед факторів, які мають найбільше значення в еволюції генетичних змін
живих істот, слід розглядати ті, що спричиняють зміни змісту генетичної
інформації, структурні пошкодження молекули ДНК, надають можливість
функціонування в клітинах чужорідного генома. До таких факторів відносять:
- спонтанні мутації (частота 107-107"), що відбуваються у результаті
впливу теплової енергії, активних метаболітів, помилок у роботі ДНК-полімераз;
- індуковані мутації в результаті ультрафіолетового випромінювання,
іонізуючої радіації, численних хімічних мутагенів; так, ультрафіолетові промені
(УФП) обумовлюють утворення тимінових димерів; рентгенівські промені
спричиняють хромосомні аберації; аналоги азотистих основ, включаючись
у ДНК, зупиняють реплікацію або порушують комплементарність ланцюгів;
формальдегід | може «зшивати» між собою ДНК, РНК, білки; гідроксиламін
специфічно реагує з цитозином, а його деривати замість гуаніну зв'язують аденін;
азотиста кислота (НХО») окиснює й пошкоджує азотисті основи ДНК;
 186

- рекомбінативні процеси, що відбуваються в ДНК спонтанно або за участю

мобільних генетичних елементів - МГЕ (плазмід, транспозонів, вірусів);
- помилки рекомбінації, які виникають через порушення точності
рекомбінацій ділянок ДНК під час кросинговеру, що призводить до обміну
невідповідними ділянками хромосом і порушення генного складу хромосом -
хромосомних мутацій;
- помилки реплікації, що виникають у випадку | приєднання
некомплементарних азотистих основ. Якщо помилки не були виправлені ДНК-
полімеразою, вони передаються наступним поколінням у процесі реплікації.
Унікальною особливістю всіх живих істот є їх здатність до збереження та
самозахисту генетичного апарату клітин, яка запрограмована в самому геномі й
реалізується шляхом індукції певних генів, кодуючих спеціальні репаративні
ферменти. Дані ферменти входять до складу так званої репаративної системи,
яка існує в усіх клітинних організмів від бактерій до високорозвинутих ссавців і
відіграє важливу роль у виправленні пошкоджень ДНК, спричинених мутаціями
та рекомбінаціями. Процеси репарації здійснюються за допомогою спеціальних
наборів ферментів: ДНК-полімераз, ендо- та екзонуклеаз, ДНК-лігаз, ДНК-
глікозилаз, фотоліаз тощо. Репаративні ферменти можуть діяти локально в місці
пошкодження, виправляючи точкові мутації (наприклад, у разі прямої репарації та
фотореактивації), а можуть і видаляти достатньо великі ділянки пошкодженої
ДНК (наприклад, у випадку ексцизійної 1 темнової репарації). Утворені у
результаті цього процесу делеції забудовуються реплікативними ферментами --
ДНК-полімеразами, які використовують непошкоджені ланцюги ДНК як матриці
для синтезу відсутнього фрагмента ДНК. У випадку особливо потужного впливу
мутагенів вмикається 505-індукована репарація, призначення якої - збереження
цілісності ДНК за будь-яку ціну, навіть за допомогою помилкового включення
нуклеотидів.
В організмів різних систематичних груп виявляють як універсальні, так і
специфічні механізми репарації, але всі вони можуть бути класифіковані за
трьома основними групами:
І. | Система модифікації та рестрикції в прокаріотів.
П. Реплікаційна репарація - корекція ДНК за допомогою ДНК-полімераз
та інших ферментів у процесі реплікації.
Il. Постреплікаційна penapauia (рекомбінаційна) - виправлення
пошкоджень після реплікації вже у синтезованій молекулі ДНК.
Далі розглянуто найбільш вивчені механізми репарації, що належать до
перелічених вище трьох груп.
13.1. Система модифікації та рестрикції (МВ-система) у прокаріотів
Система модифікації та рестрикції (МВ-система) у бактерій заснована на
активності ферментів двох типів - метилаз і рестриктаз і відповідає за
знищення чужорідної ДНК, що потрапляє в клітину ззовні.
 187

Метилази мітять метильними групами аденін 1 цитозин у специфічних

ділянках власної ДНК для того, щоб неметильована чужорідна ДНК (наприклад,
вірусна) могла бути виявлена та зруйнована рестриктазами. Мічення метильними
групами аденіну та цитозину відбувається в специфічних ділянках ДНК --
паліндромах. Паліндромами називають такі послідовності ДНК, у яких відносно
умовної осі симетрії в транс-положенні розташовані інвертовані повтори, тобто
однакові, але повернуті на 1807? (відносно одна одної) послідовності нуклеотидів.
Приклад паліндрома наведено нижче (рис. 13.1).

ААГГЦА| ТГЦЦТТ
ТТЦЦГТ| АЦГГАА
Рис. 13.1. Приклад паліндрома
Примітка: стрілкою позначено умовну вісь симетрії, відносно якої нуклеотидні
послідовності ДНК повернуті на 130 у транс-положенні.

Рестриктази - це специфічні ендонуклеази, які в певних ділянках -

«гарячих точках» рестрикції можуть розрізати ДНК, якщо вона неметильована,
шляхом гідролізу фосфодіефірного зв'язку між сусідніми нуклеотидами. Система
рестрикції-модифікації як система захисту від проникаючої всередину клітини
чужорідної ДНК спрямована, перш за все, на знищення вірусів (бактеріофагів).
Проте якщо відразу після реплікації в синтезованих дочірніх ланцюгах не
відбудеться метилювання метилазами, то навіть власна ДНК може бути
деградовна рестриктазами.
MR-cuctTemy вперше було виявлено під час вивчення взаємодії бактеріофагів
(вірусів бактерій) із клітинами бактерій-хазяїв. Відомо, що віруси бактерій дуже
специфічні й здатні інфікувати тільки клітини певного штаму бактерій. Очевидно
це пов'язано з тим, що в клітинах інших штамів і видів бактерій система
рестрикції-модифікації повністю | знищує вірусну ДНК. А до аналогічної
системи рестрикції-модифікації власного хазяйського бактеріального штаму
віруси вже пристосувались, а точніше - навчилися її обходити.
Деякі рестриктази розрізають ДНК у паліндромах із утворенням «тупих»
кінців, тобто з формуванням рівних фрагментів ДНК у місці гідролізу (рис. 13.2).

A AT AATT АЦТАТААТТАТ
й ТАТТААТГАТ АТТААТА

Б АГЦЦГГААЦ Est weeцгг цт

тцггццттг ЦААГГ цц ГА

Рис. 13.2. Схема гідролізу ДНК рестриктазами з утворенням

«липких» і «тупих» кінців:
а - рестрикція ДНК з утворенням «липких» кінців;
б - рестрикція ДНК з утворенням «тупих» кінців
 188

Інші рестриктази утворюють «липкі» кінці, розрізаючи сайт рестрикції зі

зміщенням і утворенням виступу в одному ланцюзі і вкороченого кінця - в
іншому. «Липкі» кінці, сформовані в ході розрізання рестриктазами,
комплементарні один одному. Таку властивість рестриктаз широко застосовують
у генній інженерії для вбудовування генів у вектори - плазміди, транспозони,
віруси та ін.Метилазна й рестриктазна активності можуть належати одному білку-
ферменту, а можуть - двом різним білкам. Метилювання «своєї» ДНК у
специфічних сайтах захищає її від руйнування власними рестриктазами. Дією
метилаз можно пояснити появу в ДНК мінорних метильованих азотистих основ -
5-метилцитозину Й б-метиламінопурину. Вони з'являются відразу після
реплікації.
В. Арбер у 1962 р. уперше довів існування рестриктаз у бактерій. Пізніше
Д. Натанс і Г. Сміт виділили ферменти рестриктази з бактеріальних клітин.
Однією з перших було описано рестриктазу кишкової палички Ксо КІ. У наш час
уже відомі та вивчені понад 1000 мікробних рестриктаз, здатних розпізнавати
приблизно 120 сайтів рестрикції. Згідно з номенклатурою, запропонованою
Д. Натанс 1 Г. Сміт, назва рестриктази складається з трьох основних літер - 13
великої літери родової назви бактерії-продуцента та двох малих літер видової
назви. Наприклад, рестриктази, виділені з Е5йегіспіа соїї, отримали назву Есо, із
Bacillus зибіййз - Вхзи тощо. Окремі штами певного виду бактерій іноді
продукують специфічні рестриктази. Для позначення штамової належності до
назви рестриктази додають літеру, що відповідає назві штаму. Так, рестриктази,
виділені зі штамів Е. соїї В ії К, названо відповідно ЕсоВ 1 ЕсокК, рестриктазу з
Haemophylus influenzae d — Hind. Y найменуванні рестриктази Есо К/ літера К
означає, що ген, кодуючий названий фермент, знаходиться в В-плазміді.
Римськими цифрами (І, П, ПІ тощо) позначають порядковий номер даної
рестриктази в ряду інших ендонуклеаз, що продукує даний мікроорганізм.
Рестриктази з одної бактерії-продуцента, які впізнають та розрізають одні Й ті
самі паліндромні послідовності, але розрізняються за своїми фізико-хімічними
властивостями, називають ізошизомерами.
Типи рестриктаз
У прокаріотів виявлено рестриктази трьох типів, які входять до складу
трьох основних МВ-систем і розрізняються наявністю метилазної активності й
особливостями розпізнавання сайтів рестрикції.
Рестриктази І типу. Типовим прикладом рестриктаз цього типу є
рестриктази ЕсоВ 1 ЕсоК, які продукуються двома штамами кишкової палички --
E. coli Bi K відповідно. Вони містять по три білкові субодиниці 5, М іБ, за синтез
яких відповідають гени Йза), П5аїМ і йзаїк. Кожна з білкових субодиниць ферменту
має специфічну активність:
-. 5-субодиниця розпізнає сайт рестрикції;
- М-субодиниця має активність метилази;
е- ЕК-субодиниця здійснює рестрикцію.
 189

Отже, рестриктази І типу зазвичай предствлені одним білком-ферментом,

який проявляє три різні типи активності. Усі субодиниці ферменту діють
злагоджено. Спочатку 5-субодиниця приєднується до сайта впізнавання на ДНК.
Причому ця ділянка може бути розташована за значній відстані від сайта
рестрикції (понад 1000 пар нуклеотидів).
Далі починає діяти або метилаза, або рестриктаза - залежно від походження
ДНК. У власній | ДНК під час реплікації материнський матричний ланцюг
метильований, а новий синтезований дочірній ланцюг - не метильований. До
такої напівметильованої ДНК приєднується М-субодиниця ферменту, активується
і метилює аденін і цитозин у паліндромній послідовності сайта рестрикції. При
роботі М-субодиниці донором СНугруп для метилювання нуклеотидів є
5-аденозилметіонин. Він же є алостеричним ефектором рестриктази. Очевидно,
«відпрацьований» 5-аденозилметіонин, який віддав свою метильну групу для
метилювання, перетворюється на негативний ефектор, який інгібує активність
К-субодиниці. Тому після метилювання рестрикція ніколи не відбувається. У
такому механізмі регуляції ферментативної активності є важливий біологічний
сенс, оскільки своя власна ДНК, яка вже помічена метильними групами, не
повинна бути зруйнована рестриктазою.
Якщо в клітину бактерії потрапляє неметильована фагова ДНК, то після
розпізнавання ферменту специфічного сайта 5-субодиницею віддразу активується
К-субодиниця і починає розрізати по сайтах рестрикції чужорідну фагову ДНК.
Звертає на себе увагу просторова проблема в роботі рестриктаз І типу, що
виникає через віддаленість сайтів впізнавання та рестрикції. Відомо, що молекула
ДНК має суперспіралізовану просторову укладку з утворенням петель, тому
вважають, що за рахунок зближення кінців петель два вказані сайти (для
приєднання двох різних субодиниць ферменту) можуть виявитись розташованими
один поряд із іншим.
Pecmpuxma3u I muny (EcoRI, Bst I, Ніпа ПІ, Аи І, Р5і І та ін.) - мають тільки
рестриктазну активність, а метилювання здійснює інший специфічний фермент -
метилаза. Сайти розпізнавання та рестрикції збігаються, тобто рестриктази П типу
розрізають ДНК прямо в сайтах впізнавання, а саме у неметильованих
паліндромах із центральною симетрією. У таких паліндромах в антипаралельних
ланцюгах нуклеотидні послідовності в напрямку 5'-» 3' читаються однаково, але
відносно один одного вони повернуті на 1809 (див. рис. 13.1). Так, в одному
ланцюзі в паліндромі може існувати послідовність ЗААГЦТТУ, а в
комплементарному йому - З"ТТЦГААЗ.
При гідролізі неметильованої ДНК рестриктази П типу утворюють
фрагменти з тупими або липкими кінцями. Ці ферменти дуже специфічні й
розпізнають у сайті рестрикції унікальну послідовність з 4-6 нуклеотидів.
Рестриктази П типу застосовують для проведення рестрикційного аналізу
ДНК. Якщо зразки ідентичної ДНК спочатку окремо обробити обробити двома
різними рестриктазами, а третій зразок обробити, застосувавши їх комбінацію, то
можна отримати різні фрагменти | ДНК. Після ix аналізу шляхом
 190

електрофоретичного розділення можна побудувати рестрикційну карту даної

ДНК, на якій буде відображено послідовність розташування сайтів рестрикції.
Pecrpuxtasu II tuny EcoRI, Bst I, Hind Ill, Alu I, Pst I широко застосовують у
генній інженерії для створення рекомбінантних ДНК. Обробивши одною
рестриктазою два зразки ДНК із різних організмів, можна отримати фрагменти з
однаковими «липкими» кінцями, які в разі змішування комплементарно
спаровуються і утворюють нові незвичні комбінації генів.
Рестриктази ПІ типу при порівнянні з рестриктазами | i П типів можуть
бути віднесені до ферментів проміжного типу. Такі ферменти проявляють і
рестриктазну, і метилазну активності (подібно до рестриктаз І типу), але сайт
впізнавання для ферменту розташований поблизу сайта рестрикції (зазвичай на
відстані 24-26 п.н.). Рестриктази ПІ типу розпізнають на ДНК асиметричні
послідовності довжиною в 5-7 пар нуклеотидів, тобто ті, в яких не можна
провести умовну вісь симетрії.
Системи рестрикції-модифікації виявлено практично у всіх досліджених
прокаріотів. В еукаріотів метилювання також відбувається, але метилази не
пов'язані з дією рестриктаз. Метилювання в клітинах еукаріотів забезпечує різні
функціональні стани генів. Захист від вірусів в еукаріотичних організмів
здійснюється по-іншому.

13.2. Реплікаційна система репарації

Реплікаційна система репарації включає всі механізми відновлення ДНК,
характерні для синтезу ДНК. Вони можуть здійснюватись за допомогою
ферментів, що беруть участь безпосередньо в процесі реплікації, а також за
участю специфічних репарувальних ферментів. Виділяють такі механізми
реплікаційної репарації: репарація по ходу реплікації, реплікаційна репарація
після метилювання дочірнього ланцюга, пряма репарація, екцизійна репарація,
темнова репарація, 505-індукована репарація. Розглянемо їх докладніше.

13.2.1. Механізми репарації для виправлення помилок реплікації

Репарація по ходу реплікації. Реплікаційна система репарації слугує для
перевірки правильності синтезу ДНК. У прокаріотів цю функцію безпосередньо
по ходу реплікації здійснюють ДНК-полімераза І і ДНК-полімераза ПІ, а,
можливо, 1 ДНК-полімераза П. Як вже було описано у розділі «Реплікація», для
всіх ДНК-полімераз бактерій характерна наявність не тільки полімеразної
активності, яка забезпечує синтез ДНК, але Й екзонуклеазної активності, дуже
важливої для реалізації репарувальної функції. Точність синтезу ДНК
перевіряється під час реплікації декількома способами. По-перше, указані
ДНК-полімерази приєднують кожен наступний нуклеотид тільки до спарованого з
матрицею попереднього нуклеотиду. По-друге, якщо нуклеотид, приєднаний
ДНК-полімеразою, не комплементується з нуклеотидом матричного ланцюга, то
за рахунок 3/-екзонуклеазної активності самої ДНК-полімерази «неправильний»
нуклеотид відразу відщеплюється від синтезованого ланцюга.
 19]

В еукаріотів екзонуклеазна активність наявна не у всіх ДНК-полімераз. Дану

ферментативну активність встановлено в ДНК-полімерази-д - ферменту, що
містить 2 субодиниці (з полімеразною та 3/-екзонуклеазною активністю). Завдяки
цьому фермент може не тільки синтезувати ДНК, але й видаляти затравки
(праймери). Можливо саме ДНК-полімераза-д 1 виконує репарувальну функцію. Є
відомості й про те, що в еукаріотів існує спеціальна екзонуклеаза, яка працює в
комплексі з ДНК-полімеразою-а, 1 забезпечує корекцію синтезу ДНК.
Реплікаційна репарація після метилювання дочірнього ланцюга.
Віддразу після реплікації обох матричних ланцюгів ДНК молекула стає
напівметильованою, тобто метильованими є тільки матричні материнські
ланцюги. Ця різниця в материнських і дочірніх ланцюгах виявляється 3a
допомогою специфічного ферменту (продукту гена «ат), здатного розпізнавати
деякі паліндромні послідовності ДНК і особливо ті, в яких є інвертовані
фрагменти ГАТЦ. У материнських ланцюгах у таких паліндромах зазвичай
наявний метильований аденін. Фермент, кодований геном аат, метилює аденін і в
щойно синтезованих дочірніх ланцюгах ДНК. Якщо метилювання не відбувається
відразу після реплікації, виникають мутації.
У природі поширене метилювання цитозину, який є потенційно мутагенний,
оскільки продуктом його дезамінування є тимін, що спаровується за правилом
комплементарності з аденіном. Метильовані цитозини в паліндромах 13
інвертованими фрагментами ЦЦГГ є «гарячими» точками мутагенезу, тобто
сприяють закріпленню мутацій. Виправлення таких мутацій у випадках
некомплементарного вбудовування нуклеотиду здійснюється шляхом вирізання
«неправильного» фрагмента ДНК у дочірньому ланцюзі та забудовування виломів
шляхом репараційного синтезу із використанням материнського ланцюга як
матриці. У даному процесі беруть участь білки - продукти генів тиг5, шуг), а
також АТФ і дезоксирибонуклеотиди.
Структурні зміни в ДНК відбуваються не тільки внаслідок помилок під час
реплікації, але Й в результаті дії численних внутрішніх і зовнішніх чинників:
хімічних, фізичних і біологічних мутагенів, факторів, що спричиняють
рекомбінативні процеси. Мутації та рекомбінації, що при цьому виникають,
можуть спричиняти локальні зміни в одному нуклеотиді (точкові мутації), а
також призводити до пошкоджень значних ділянок у ДНК, у тому числі
транслокацій, хромосомних аберацій і навіть розривів цукрово-фосфатного остову
молекули. У разі таких значних пошкоджень ДНК репаративної дії реплікативних
ферментів уже недостатньо. Зі збільшенням тиску пошкоджуючого фактора до
виправлення помилок залучаються все більш складні репаративні системи, які
забезпечують пряму, ексцизійну, темнову та 505-індуковану репарацію.

13.2.2. Пряма репарація

Пряма репарація включає декілька найбільш простих механізмів корекції

ДНК, які здійснюються зазвичай за допомогою одного специфічного
 192

репарувального ферменту. За таким механізмом відбуваються пряма

реактивація та пряма фотореактивація.
Пряма реактивація важлива для «виправлення» алкільованих (в основному
метильованих та етильованих) азотистих основ, що можуть з'являтись у
молекулах | ДНК під впливом алкілювальних хімічних мутагенів
(нітрозометилгуанідину, нітрозометилсечовини та деяких інших). Приєднання
метильних та етильних груп до азотистих основ призводить до Змін у
нуклеотидах, унаслідок чого під час реплікації вони неправильно зчитуються, що
може призвести до виникнення мутацій - транзицій або трансверсій. Для
запобігання закріплення таких мутацій у бактерій є спеціальний фермент
метилтрансфераза, що відщеплює алкільну групу від «неправильного»
нуклеотиду й переносить її на цистеїновий залишок власної молекули. У
результаті сам фермент інактивується, але може слугувати регулятором власного
гена та інших генів, які входять до індуцибельної системи репарації.
Пряма фотореактивація (світлова репарація) важлива для виправлення
піримідинових (тимінових) димерів, що утворюються у результаті дії УФП (із
довжиною хвилі 220-320 нм), тобто за умов УФ-мутагенезу. Тимінові димери
формуються за рахунок утворення додаткових ковалентних зв'язків між двома
сусідніми тимінами в ланцюгу ДНК. Для виправлення таких пошкоджень слугує
фермент фотоліаза (М.м. 35 кД), виявлений у багатьох бактерій. За допомогою
невеликого фрагмента РНК (10-15 основ), що входить до складу ферменту,
фотоліаза знаходить на пошкодженій ДНК тиміновий димер і приєднується до
нього. Активація фотоліази відбувається під впливом видимого світла 13
довжиною хвилі 300-600 нм. Активований фермент розриває утворені в процесі
мутації ковалентні зв'язки між сусідніми залишками тимінів і завдяки цьому
«розшиває» димери. Після відновлення структури ДНК фермент відпадає від
сайта репарації. У виправленні УФ-пошкоджень ДНК у бактерій беруть участь й
інші системи репарації, зокрема вмикається темнова репарація, а в разі потужного
УФ-мутагенезу - ще й індукована 505-репарація.

13.2.3. Ексцизійна репарація

Ексцизійна репарація включає більш складні механізми відновлення

пошкодженої ДНК, за яких «неправильні» ділянки ДНК вирізаються за
допомогою спеціальних ферментів. Таку систему репарації образно називають
«вирізай та латай». Розглянемо найбільш поширені типи ексцизійної репарації.
Видалення «неправильної» азотистої основи з утворенням АР-сайта.
Цей механізм ексцизійної репарації у прокаріотів відбувається за участю
ферменту ДНК-У-глікозилази, aKa розриває глікозидний зв'язок між
«неправильною» азотистою основою та дезоксирибозою B мутованому
нуклеотиді. У результаті видаляється тільки змінена мутацією азотиста основа, а
цукрофосфатний остов залишається цілим. Таким чином утворюється АР-сайт
(від слів апуринізація або апіримідинізація). Установлено, що в кишкової палички
репарування АР-сайта можуть здійснювати понад 20 різних ДНК-М-глікозилаз.
 193

Вони розпізнають різноманітні варіації мутованих нуклеотидів, що з'являються у

результаті впливу алкілювальних та інших хімічних мутагенів. Так, уже виявлено
декілька подібних ферментів - урацил-ДНК-М-глікозилазу, 3-метиладенін-ДНК-
М-глікозилазу та ін. Описана репарація являє собою приклад локальної (або
точкової) репарації, оскільки виправлення відбувається тілько в одному
зміненому нуклеотиді. Для подальшої репарації включаються додаткові
механізми, які дещо відрізняються в прокаріотів та еукаріотів.
В еукаріотів знайдено специфічний фермент інсертазу, який забудовує
АР-сайт «правильною» азотистою основою, комплементарною нуклеотиду
сусіднього протилежного ланцюга. Існують й інші типи ексцизійної репарації, які
забезпечують виправлення відразу декількох пошкоджень Ha достатньо
протяжному фрагменті ДНК. Це -- ексцизійна репарація за участю
АР-ендонуклеаз і темнова репарація.
Ексцизійна репарація за участю АР-ендонуклеаз і реплікативних
ферментів. У всіх організмів | існує складний механізм ексцизії, що
реалізується за участю АР-ендонуклеаз. Найбільш детально цей процес вивчено в
кишкової палички. Спочатку АР-ендонуклеази гідролізують пошкоджений
ланцюг ДНК з 3 або 5"-кінця АР-сайта. ДНК-полімеразаІ за допомогою 3'- або
5" -екзонуклеазної активності послідовно відщеплює декілька нуклеотидів разом
із АР-сайтом, а за участю полімеразної активності та сама ДНК-полімераза І
забудовує утворені виломи в ланцюгу ДНК. ДНК-лігаза зшиває кінці
розташованих поряд фрагментів ДНК у репарованому ланцюзі.
Слід зауважити, що в Е. соїї гідроліз пошкодженого фрагмента ДНК може
здійснювати не тільки ДНК-полімераза І. Подібну функцію виконує специфічний
фермент екзонуклеаза ПІ (продукт гена х//А), що починає гідролізувати
пошкоджений ланцюг із дезоксирибози в АР-сайті, якщо вона знаходиться на
5'-кінці розриву, зробленого АР-ендонуклеазою. Що стосується відновлення
ланцюга, де відбулась ексцизія, то в прокаріотів основним репарувальним
ферментом є ДНК-полімераза І, яка синтезується конститутивно і забудовує
невеликі виломи ДНК довжиною 20-30 нуклеотидів. Якщо мутації мають масовий
характер, то до репарації приєднується головний фермент реплікації ДНК-
полімераза ПІ, яка може відновлювати за рахунок репаративного синтезу значно
більші фрагменти ДНК довжиною 1500-9000 нуклеотидів. Після репарації
фрагменти ДНК зшиваються ДНК-лігазою.
У прокаріотів знайдено й інші ферменти, що здійснюють ексцизії. Так, у
кишкової палички виявлено біфункціональний фермент ендонуклеазу ПІ, який
проявляє АР-ендонуклеазну та ДНК-М-глікозилазну активності. Таким чином, в
ексцизійній репарації беруть участь специфічні АР-ендонуклеази 1 реплікативні
ферменти - ДНК-полімераза І, ДНК-полімераза Ш і ДНК-лігаза. Крім того, в
ексцизійній репарації, імовірно, бере участь ще один фермент реплікації -
хеліказа, яка розриває водневі зв'язки між двома комплементарними азотистими
основами нуклеотидів і допомагає відокремлювати пошкоджений фрагмент від
протилежного ланцюга.
 194

DEPT Try reer eer rrr rt Тиміновий димер

ДНК-М-глікозилаза б
а

АР-ендонуклеаза Serr

ра
СОСГОСГОСІ | ЕОСІХТТТІГІГІ Розриви | Пугавс
| Екзонуклеаза

TOT nt Perr
rrr rr
вивеннифановнвівнвивина
. UvrD
ДНК-полімераза PolA
ДНК-лігаза
ТТІТІГІГТТТТІІІ І ІІІ рр Ser

Рис.13.3. Механізми ексцизійної репарації:

а - ексцизійна репарація з утворенням АР-сайта (відбувається в основному за участю
реплікативних ферментів); б - темнова репарація тимінових димерів (здійснюється за участю
спеціальних ферментів - продуктів генів шуг А, В, С, Р)

Темнова репарація. Цей вид виправлення пошкоджень ДНК - різновид

ексцизійної репарації (рис. 13.3), однак темнова репарація реалізується завдяки дії
спеціальних ферментів, кодованих генами шуг А, В, С, Р. Дана репарація може
відбуватися незалежно від наявності видимого світла, на відміну від прямої
фотореактивації, тому 1 отримала назву темнової. Цей механізм може вмикатися
за умов повної темряви, коли не працює фотоліаза, а УФ-ушкоджень у ДНК дуже
багато. Ендонуклеаза Цуг АВС (УФ-ендонуклеаза) розпізнає тимінові димери та
інші УФ-ушкодження 1 здійснює інцизії, а саме розриває фосфодіефірні зв'язки в
пошкодженому ланцюзі ДНК на відстані 6-7 нуклеотидів від мутованого сайта з
3'- 1 5'-кінців (іноді на значно більшій відстані). Хеліказа П розводить
комплементарні ланцюги молекули ДНК, а фермент (луг Р видаляє
пошкоджений фрагмент молекули, поступово один за одним відщеплюючи
нуклеотиди. Тобто фермент шуг ФР) проявляє екзонуклеазну активність.
Реплікативний фермент ДНК-полімераза І заново забудовує утворений вилом,
використовуючи непошкоджений ланцюг ДНК як матрицю.
Слід відмітити, що в деяких мутантів кишкової палички, дефектних за
ДНК-полімеразою І, забудова виломів, утворених у процесі ексцизії, може
здійснюватися завдяки дії ферменту-дублера ДНК-полімерази П. ДНК-лігаза
зшиває фрагменти непошкодженої та виправленої ДНК, відновлюючи цілісність
молекули. Звертає на себе увагу подібність процесів простої ексцизійної і
темнової репарації.
Різноманіття видів ексцизійної репарації в організмів різних систематичних
груп, очевидно, не обмежується розглянутими механізмами, але їх значення
важко переоцінити. Так, у людей із дефектними генами ферментів ексцизійної 1,
зокрема, темнової репарації (у гомозиготному стані) спостерігаються підвищена
чутливість до сонячного світла, накопичення в хромосомах тимінових димерів,
схильність до аномальної пігментації шкіри і розвитку злоякісних новоутворень
 195

на шкірі. За наявності мутацій у гені УФ-ендонуклеази розвивається важке

захворюванння пігментна ксеродерма.

13.2.4. Індукована 505-репарація

Функціонування описаних вище систем репарації базується в основному на

дії конститутивних ферментів, синтез яких відбувається постійно, не залежить від
умов існування клітин і не потребує наявності індуктора для вмикання експресії.
Крім зазначених конститутивних репаративних систем практично у всіх
організмів існують додаткові індуцибельні репаративні системи, які активуються
тільки за умов появи індукторів. Такими індукторами є самі фрагменти ДНК,
пошкодженої ультрафіолетом, іонізуючою радіацією, алкілювальними сполуками
та іншими мутагенами.
До систем репарації, що перебувають під індуцибельним контролем,
належить так звана 505-репарація. На відміну від конститутивних систем
репарації вона блокується інгібіторами біосинтезу білка - хлорамфеніколом,
циклогексимідом та іншими. Це один із найскладніших механізмів репарації.
505-репарацію виявлено у вірусів, прокаріотів та еукаріотів. Її суть полягає в
індукованому вмиканні окремих генів (в еукаріотів) або групи генів
(у 505-опероні прокаріотів), що забезпечують синтез специфічних репаративних
ферментів. Останні виправляють ДНК, пошкоджену ультрафіолетом. Сигналом
для вмикання 505-репарації слугує затримка реплікації на пошкоджених ділянках
матриці, завдяки чому в клітині починають накопичуватись олігонуклеотиди,
фрагменти ДНК із тиміновими димерами, одноланцюгові ДНК. Саме вони 1 є
індукторами для вмикання генів 505-репарації.
Найбільш детально механізм індукованої 505-репарації вивчено в EL. coli.
Ферменти 505-репарації у кишкової палички кодуються 17 генами (рис. 13.4).

IIpo- | One- | uvrA | uvrB | uvrC | uvrD | LexA | RecA | Inu | umuC | umuD | Tepmi-
мотор | ратор гени натор
РНК- Тех Гех Вес
пол А т А А

ї Rec \

Рис. 13.4. Регуляторні ділянки та найбільш важливі гени в 505-опероні Е.соїї

Примітка: РНК-пол - РНК-полімераза, що здійснює транскрипцію генів оперона; /ехаА i
RecA — білки-регулятори; пуг А, В, С, Д - гени системи темнової репарації; итиС, итий, итиф --
гени-мутатори; Інд. - індуктор (фрагменти ДНК).
 196

Гени 505-репарації зібрані в один великий оперон, який працює за типом

індуцибельного оперона з аутогенним контролем (див. розділ «Регуляція експресії
генів»). 505-система активізується, коли в хромосомній ДНК є багато
пошкоджень, а інші системи репарації не встигають їх виправляти або
заблоковані. У прокаріотів поява 30-60 ушкоджень у геномі достатня для запуску
5О05-системи.
Експресія генів 505-оперона відбувається не одномоментно, а поступово, зі
зростанням кількості фрагментів пошкодженої ДНК (індуктора) і нагадує роботу
реостата. У цьому опероні за регуляторними ділянками (промотором 1
оператором) розташована зона структурних генів, у якій спочатку лежать гени
ферментів темнової репарації шуг А, В, С, Р, за ними - гени регуляторних білків
LexA i RecA, потім - декілька генів із нез'ясованими функціями 1 наприкінці
структурної області оперона розташовані гени итиС, итиф, ити5 (гени-
мутатори). Кінцевою ділянкою оперона є регуляторна зона термінатора.
У 505-опероні кишкової палички білок Геха відіграє роль універсального
репресора всіх генів: і власного гена, і генів, кодуючих репаративні ферменти.
Тому за відсутності мутацій, коли білок ГехА приєднується до ділянки оператора
в промоторній зоні, транскрипція всіх генів даного оперона блокується.
Фрагменти ДНК, що з'являються в результаті потужної мутагенної дії
ультрафіолетового опромінювання, як індуктори зв'язуються з іншим білком-
регулятором RecA. Під впливом індуктора (пошкоджених фрагментів ДНК) білок
КесА перетворюється на активну протеїназу, яка, приєднуючись до білка ІехА,
гідролізує його з утворенням двох неактивних фрагментів. Зруйнований білок
LexA відпадає від оператора. Завдяки цьому РНК-полімераза, яка здійснює
транскрипцію, може вільно просуватися по матричному ланцюгу ДНК 1 зчитувати
гени репаративних ферментів. Спочатку відбувається транскрипція генів мугА, В,
С, Б, завдяки чому розпочинається темнова репарація. Якщо для виправлення
мутацій ферментів темнової репарації виявляється достатньо, то експресований
далі ГехА знову блокує оператор і транскрипція припиняється. Якщо ж
пошкоджена ДНК (індуктор) продовжує утворюватись за рахунок дії мутагена, то
експресований слідом білок-регулятор RecA активується індуктором
(фрагментами ДНК) і знову прибирає репресор ІехА з оператора. Таким чином
транскрипція продовжується далі й зчитуються інші гени, у тому числі штиС і
итир. Ці гени називають мутаторами, оскільки їх білкові продукти здатні
інгібувати екзонуклеазну активність є-субодиниці ДНК-полімерази ПІ, яка
приєднується до процесу репарації для забудови ексцизійних виломів у ДНК
достатньо великої протяжності. Саме є-субодиниця ДНК-полімерази ПІ відповідає
за корекцію синтезу. За відсутності такої репаративної активності фермент
починає пропускати помилки в синтезі, приєднуючи до нарощуваного ланцюга
«неправильні» нуклеотиди. Таким чином, для запобігання повної деградації ДНК
50О5-система «дозволяє» навіть неправильне вбудовування нуклеотидів заради
збереження цілісності генома.
Підтвердженням існування 505-репарації стало з'ясування механізму
реактивації Уейгла (ИЙ/-реактивації), виявленого в бактеріофагів кишкової
 197

палички. Уейгл установив, що фаг 2. може розмножуватись тільки в опромінених

ультрафіолетовим світлом клітинах бактерій, у яких уже активовано
SOS-cuctemy репарації. Власних репаративних ферментів фаг не має, тому без
індукції ультрафіолетом синтезу репаративних ферментів у клітині-хазяїні він не
може виправити свою пошкоджену ДНК. Коли 505-система вже активована,
мутації, у тому числі Й летальні, виправляються і у власній ДНК клітини, і у
фаговій ДНК. Крім того, відомо, що репресор фага, який забезпечує лізогенний
цикл розвитку, має таку ж структуру, як і білок ІехА. Тому репресія транскрипції
фогових генів знімається за рахунок дії активованої протеїнази КесА.
Існують Й інші системи 505-репарації, що виправляють мутації, спричинені
алкілювальними мутагенами. Виявилось, що активована метилтрансфераза, що
перенесла алкільну групу від мутованого нуклеотиду на свою молекулу, слугує
активатором транскрипції ряду генів - свого власного та гена, кодуючого ДНК-М-
глікозилазу, специфічну до алкільованих основ (див. розділ «Пряма реактивація»).
13.3. Постреплікативна (рекомбінаційна) репарація
Постреплікативна (рекомбінаційна) репарація з вмикається | вже після
реплікації ДНК у тому випадку, якщо за участю інших репаративних систем
(МВ-системи, прямої, ексцизійної репарації, 505-системи) не були повністю
виправлені всі мутації та пошкодження. Наприклад, якщо в материнському
матричному ланцюзі є в наявності тиміновий димер, то в процесі реплікації
ДНК-полімераза ПІ перед ним призупиняється (приблизно на 10 секунд), а далі
синтез продовжується на відстані приблизно 1000 нуклеотидів за рахунок
формування нової реплісоми. У результаті в дочірньому ланцюзі утворюється
вилом, тобто не вистачає певного фрагмента. Репарація вилому після реплікації
відбувається шляхом рекомбінації за участю білків RecA, В, С, РД (рис. 13.5).

ПРА Й A г п

Репараційна реплі-
Реплікація кація

Нуклеази ДНК-полімераза І
та інші біл- ДНК-лігаза
ки рекомбі-
нації

val vi Vi Vv gb
Рис. 13.5. Механізм постреплікативної репарації
Поліфункціональний фермент RecBCD (Mae топоізомеразну, екзо- та
ендонуклеазну активності) вирізає із непошкодженого матричного ланцюга
фрагмент, якого не вистачає, а білок КесА (за участю АТФ) вбудовує його у
вилом дочірнього дефектного ланцюга, спаровуючи донорну та реципієнтну
 198

молекули. Вилом, що з'явився у матричному ланцюзі, відновлюється шляхом

репаративної реплікації із використанням матриці дочірнього ланцюга.
Постреплікативна репарація існує не тільки в прокаріотів, але Й в еукаріотів.
Люди зі спадковим порушенням постреплікативної репарації можуть страждати
на такі важкі захворювання, як синдром Блума, що характеризується високою
частотою хромосомних аберацій, 1 пігментну ксеродерму (тип Хруаг), що зазвичай
супроводжується розвитком раку в ранньому віці.
Аналіз різноманітних репаративних систем і процесів доводить важливе
значення репарації для забезпечення стабільності геномів живих істот і
збереження видової індивідуальності організмів. Слід відмітити високу
поліфункціональність білка КесА. Він активує експресію багатьох генів, бере
участь у різних рекомбінаційних і репараційних процесах, зокрема в 505-
індукованій і постреплікативній репараціях.

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

Инге-Вечтомов, С.Г. Введение в молекулярную генетику |Тексті: учебник /

С.Г. Инге-Вечтомов. - М.: Вьшсш. шк., 1983.-320 с.
Курочкина, Л.П. Фолдинг белка в клетке |Текст| / Л.П. Курочкина,
В.В. Месянжинов // Успехи биол. химии. - 1996. - Т. 36. - С. 49-86.
Льюин, Б. Геньт ГТексті|: монография / Б. Льюин. - М.: Мир, 1987.- 600 с.
Негруцький, Б.С. Організація білкового синтезу у вищих еукаріотів |Тексті:
монографія / Б.С. Негруцький. - К.: Обереги, 2001. -- 165 с.
Огурцов, А.Н. Основьг молекулярной биологии. |Текст|: в 2 ч: учебник /
А.Н. Огурцов. - Х.: НТУ «ХПИ», 2011. - Ч. 2: Молекулярнье генетическиє
механизмь. - 240 с.
Рис, З. Введение в молекулярную биологию. От клеток к атомам. |Тексті:
учебник: пер. с англ. / З. Рис, М. Стернберг. - М.: Мир, 2002. - 142 с.
Сиволоб, А.В. Молекулярна біологія |Тексті): підручник / А.В. Сиволоб. -
К.: Видав.-поліграф. центр «Київ. Ун-т», 2008. - 384 с.
Спирин, А.С. Молекулярная биология: структура рибосомь и биосинтез
белка ГТексті|: учебник / А.С. Спирин. - М.: Вьісш. шк., 1990. - 350 с.
Тоцький, В.М. Генетика |Текст|: підручник / В.М. Тоцький. -
О.: Астропринт, 2008.- 710 с.
Уотсон, Дж. Молекулярная биология гена |Тексті|: монография / Дж.Уотсон.
- М.: Мир, 1978. - 700 с.
Clancy, S. RNA transcription by RNA polymerase: Prokaryotes vs Eukaryotes
[Text]: manuscript/ 5. Clancy // Nature Education. — 2008. — Nel. — P. 10-20.
Jackson, R.J. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of
its regulation [Text]: manuscript / R.J. Jackson, C.U.T. Hellen, T.V. Pestova // Nature
Rev. Mol. Cell Biol. — 2010. — Vol. 10. — P. 113-127.
Kapp, L.D. The molecular mechanics of eukaryotic translation [Text]:
manuscript / L.D. Kapp, J.R. Lorsch // Ann. Rev. Biochem. — 2004. — Vol. 73. —
Р. 657-704.
 199

Klarer, A. Replication of damaged genomes [Text]: manuscript / A. Klarer // Crit.

Rev. Eukaryot. Gene Expr. — 2011. — Мої. 21, Мо4. - Р. 323-336.
Lalli, E. Signal transduction and gene regulation: the nuclear response to cAMP
[Text]: manuscript / E. Lalli, P. Sassone-Corsi // JBC. — 1994. — Vol. 269, Ne 26. —
P. 17359-17362.
Lenart, P. DNA, the central molecule of aging [Text]: manuscript / P. Lenart,
L. Krejci // Mutat Res. — 2016. — Vol. 786. — Р. 1-7.
MacInnes, A.W. The role of the ribosome in the regulation of longevity and
lifespan extension [Text]: manuscript / A.W. MaclInnes // Wiley Interdiscip. Rev. RNA.
-2016. - Мої. 7, Ме 2. -Р. 198-212.
Molecular architecture of the human Mediator-RNA polymerase II-TFIIF
assembly [Text]: manuscript / C. Bernecky [et al.] // PLoS Biol. — 2011. — Vol. 9. — P.3.
On the way of revealing coactivator complexes cross-talk during transcriptional
activation [Text]: manuscript /A.N. Krasnov, M.Y. Mazina, J.V. Nikolenko,
N.E. Vorobyeva // Cell Biosci. — 2016. — Vol. 24. — Р. 6-15.
Realini, C.A. Histone shuttling by poly(ADP-ribosylation) [Text]: manuscript /
C.A. Realini, F.R. Althaus // JBC. —1992. — Vol. 267, Ne 26. — P. 18858-18865.
Schmitt, E. Eukaryotic and archaeal translation initiation factor 2: A
heterotrimeric tRNA carrier [Text]: manuscript / E. Schmitt, M. Naveau, Y.Mechulam //
FEBS Lett. — 2010. — Мої. 584. - Р. 405-412.
St John, J.C. Mitochondrial DNA copy number and replication in reprogramming
and differentiation [Text]: manuscript / J.C. St John // Semin. Cell Dev. Biol. — 2016. —
Vol. 52. — P. 93-101.
Zharkov, D.O. Base excision DNA repair [Text]: manuscript / D.O. Zharkov //
Cell. Mol. Life Sci. — 2008. — Vol. 65. — Р. 1544-1565.
Zhong, D. Electron transfer mechanisms of DNA repair by photolyase [Text]:
manuscript / D. Zhong // Annu. Rev. Phys. Chem. — 2015. — Vol. 66. — P. 691-715.
 Темплан 2016, поз. 11

Навчальне видання

Галина Олександрівна Ушакова

Грина Євгеніївна Соколова

Основи молекулярної біології

Навчальний посібник

Редактор Л.В. Дмитренко

Техредактор Т.І. Севост'янова
Коректор Л.В. Дмитренко

Видавець «ФОП Середняк Т.К.», 49000,

Дніпропетровськ, 18, а/с 1212
Свідоцтво про внесення суб'єкта видавничої
справи до Державного реєстру
видавців, виготівників і розповсюджувачів видавничої
продукції ДК Хо 4379 від 02.08.2012.
Ідентифікатор видавця в системі І5ВМ 7029

Підписано до друку 18.04.2016. Формат 60х84 1/16.

Папір офсетний
11,6. Обл.-вид. арк. 11,6.
Умовн. друк. арк. 11,6. 11,6.
Зам. Хо, Наклад 100 прим.
Віддруковано на базі поліграфічно-видавничого центру «Адверта»
49000, Дніпропетровськ, 18, а/с 1212
тел. (063)-401-55-03, (056)-798-22-47
www.adverta.com.ua,
www.vk.com/izdatelstvo_adverta,
www.isbn.com.ua