30/05/2023

HPLC
• Dikembangkan mulai 1970 an
HIGH PERFORMANCE LIQUID • Kualitatif dan kuantitatif
• Kegunaan : organik, anorganik, analisis
CHROMATOGRAPHY (HPLC) ketidakmurnian, senyawa tidak mudah
menguap, dalam jumlah sekelumit

1 2

HPLC Applications Keuntungan HPLC

Bioscience
Chemical proteins

polystyrenes
peptides
nucleotides 1.Kerja lebih mudah karena sistem atomatis/
dyes
phthalates instrumentasi
2.Volume sampel kecil
tetracyclines
Pharmaceuticals corticosteroids
3.Selektivitas sangat baik
antidepressants
barbiturates Consumer Products 4.Sensitivitas sangat tinggi
lipids
antioxidants 5.Metode analisis yang cepat, akurat, tepat,
sugars
Environmental reprodusibel
polyaromatic hydrocarbons Clinical
Inorganic ions
herbicides
amino acids
vitamins
6.Pilihan fasa gerak dan fasa diam sangat banyak
homocysteine 7.Senyawa organic/ anorganik
3 4

Separations
Separation in based upon differential
Injector
migration between the stationary and
mobile phases.
Mixer Stationary Phase - the phase which
remains fixed in the column, e.g. C18,
Silica

Pumps Mobile Phase - carries the sample

through the stationary phase as it
moves through the column.
Column

Detector

Waste
Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

5 6

1
 30/05/2023

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

High Performance Liquid Chromatograph

7 8

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

9 10

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

11 12

2
 30/05/2023

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

13 14

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

15 16

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

17 18

3
 30/05/2023

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

19 20

Separations
Injector Chromatogram
Separations
Injector Chromatogram

Mixer mAU Mixer mAU

Pumps Pumps

Start Injection time Start Injection time

Column Column

Detector Detector

Solvents Solvents

21 22

HPLC
❖Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan
cara melewatkan senyawa melalui fase diam
(stationary phase)
❖Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi
dengan fase gerak (mobile phase)
❖Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom
atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga
akan mempengaruhi kekuatan interaksi senya-
wa dengan fase diam dan fase gerak
HPLC
❖Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi
dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan
sebagai kromatogram
❖Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu
retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak
❖Untuk:
- analisis kualitatif digunakan informasi tR,
- analisis kuantitatif digunakan informasi luas
area/tinggi puncak kromatogram

23 24

4
 30/05/2023

Kualitatif vs Kuantitatif
HPLC
❖Metode hplc dipilih bila akan menganalisis
senyawa dalam sampel:
- yang tercampur dengan matriks yang
sangat kompleks
- dengan kadar sangat kecil
Skrang sudah ditemukan UPLC → Lebih cepat
dan sensitif

❖Metode hplc dipilih bila akan menganalisis

beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)
25 27

Tujuan akhir Bagaimana Memilih Kolom ?

❖Untuk memilih kolom (fase diam), perhatikan
beberapa sifat senyawa seperti:
HPLC - kelarutan
- kepolaran

❖Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut,

kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut ini
Pemisahan

28 32

Memilih Kolom HPLC

33 34

5
 30/05/2023

HPLC Analysis Parameters

Mobile Phases

Flow Rate
Composition

Injection Volume
Column
Oven Temperature
Wavelength
Time Constant
35 36

1. Reservoir Fase Gerak

Instrumen HPLC ↓
Bisa lebih dari 1 jenis
↓
dari gelas / stainless steel (inert)
↓
Daya tampung 1- 2 L
Dilengkapi degasser (menghilangkan gas terlarut) → gas
NO2 & O2 → membuat gelembung-gelembung di
dalam kolom & detector (FG harus HPLC grade)
↓
- Pelebaran pita analit
- Respon detektor terganggu
37 38

• Degassing → Diluar dan didalam bagian alat Solvent (Fase Gerak)

diluar alat → Degasser (sonikator)
Didalam → Menyatu dengan alat HPLC, fungsi?
Solven disaring dengan kertas Millipore
Pemisahan dengan 1 jenis FG dengan konsentrasi konstan →
Elusi Isokratik
Bila dengan 1 atau lebih FG yang polaritasnya berbeda pada
saat proses running berjalan → Elusi Gradien → menaikkan
resolusi
Digunakan FG segar → mendapatkan hasil yang
reprodusibilitas optimum dalam pemisahan 39
→Solvent harus transparansi dalam detector UV,
ex. Etil asetat tidak cocok dibaca pada 254 nm,
karena mengabsorpsi uv
→Harus Inert, HPLC Grade
→Senyawa yg bersifat asam harus di elusi dgn FG
bersifat asam, begitu juga basa. pH hanya dapat
diatur 2-8,5.
→Pada sistem normal (Fase diam lebih polar dari
FG), dengan kenaikan kepolaran FG maka akan
meningkatkan kemampuan elusi.
40

6
 30/05/2023

2. Pompa 3. Sistem Injeksi Sampel

Tekanan ≥ 1000 psi (4000 – 5000psi)
Syringe yg terbuat dari tembaga tahan
Kec. Alir 1-3ml/menit
karat
Bahan harus resisten secara kimiawi (inert) Sampel dimasukkan dengan tekanan
Ex : dari teflon & stainless steel tinggi → merupakan pita dengan sampel
Kontinyu, tepat, reprodusibel, konstan, bebas dari tipis → pelebaran diperkecil
gangguan.
Konvensional atau automatik
41
Tidak boleh ada gelembung 42

4. Kolom Kromatografi 5. Fase Diam

Bentuk tabung, permukaan dalam rata →Silika yang termodifikasi secara kimiawi →
Dari gelas / stainless steel silanol yang termodifikasi dengan gugus
Kolom konvensional dan mikrobor (lebih sensitive tertentu (Ester, tionil klorida dll) → silica fase
dan efisien) terikat → lebih selektif.
Lapisan luar kadang dilapisi logam → menahan → dengan reagen kimia klorosilan, tujuannya
tekanan ad 5000 psi (mikrobor), rx kimia dari FG mengurangi reaksi hidrolisis dan lebih selektif
Panjang kolom (10 – 30) cm → Silika yang dimodifikasi dengan rantai karbon
Analisis pemisahan cepat (3 – 8) cm C-18 → ODS (oktadesil silica) → Fase diam non
polar
Internal diameter (4 – 5)mm
Partikel diameter (3 – 5) µm
43 44

6. Detektor
Paling umum : detector PDA (photodiode-array) dan
detector UV-Vis
Karakteristik detector yg baik :
→Respon cepat
→Sensitifitas yang tinggi
→Stabil selama beroperasi
→Mempunyai sel volume yg kecil, meminimalisir
pelebaran pita
→Signal harus linier dengan konsentrasi
→Tidak peka terhadap perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak 45 46

7
 30/05/2023

DETEKTOR PDA (Photodiode array)

• Detektor PDA → untuk analisis
multikomponen, lebih sensitive Bagaimana jika senyawa obat tersebut tidak
• Merupakan detector UV-Vis dengan berbagai dapat menyerap baik di UV-Vis sedangkan kita
keistimewaan (lebih sensitive dgn akurasi harus menggunakan detector UV-vis??
tinggi)
• Mampu memberikan kumpulan kromatogram
secara simultan dengan menggunakan
Panjang gelombang yang berbeda-beda dalam
sekali proses (single run)

47 49

Derivatisasi Derivatisasi/modivikasi Instrumen HPLC

Apa arti derivatisasi … ?

Apa tujuannya … ?
Bagaimana caranya … ?
Derivatisasi Post-/Pre-column … ?

50 51

Tujuan Derivatisasi Syarat Derivatisasi

❖Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa • Produk yang terbentuk harus mampu
dengan pereaksi (agen) penderivat untuk
menyerap baik di UV-vis
menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs
• Proses harus cepat dan mnghasilkan sebisa
❖Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa mungkin 100% produk
dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-
kromofor → senyawa berkromofor) • Stabil selama derivatisasi dan saat deteksi
• Sisa pereaksi tidak menggangu pemisahan
❖Meningkatkan daya deteksinya (senyawa kromatogram
berkromofor UV → senyawa berkromofor
fluorescensi)

52 53

8
 30/05/2023

Jenis derivatisasi Struktur Kromofor

Group Structure nm
• Pre coloumn → proses nya sebelum sampel Karbonil >C=O 280
masuk ke kolom, saat sebelum injeksi, Azo -N = N- 262
dilakukan diluar sistem alat Nitro -N=O 270
• Post Coloumn → Proses setelah senyawa Thioketon -C =S 330
melewati kolom, dalam sistem alat Nitrit -NO2 230
Diena terkonjugasi -C=C-C=C- 233
Triena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C- 268
Tetraena terkonjugasi -C=C-C=C-C=C-C=C- 315

54
Benzena 261 55

Captopril Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide

HS CH3 HS CH3
O O
O
N COOH + Br C-CH2-Br
N COOH

Captopril p -Br fenacylbromide

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC

dengan detektor UV ?
56 57

Hasil derivatisasi : PK. Captopril (HPLC)

Captopril + p -Br Fenacylbromide
❑ Parameter HPLC : (J.Pharm.Biomed.Anal., 1995, 13:
HS CH3 655-660)
O - Column : 250 x 4.6 mm, Kontron Analytical S5
ODS2
O O
- Mobile phase : MeCN: 1% Acetic acid (60:4)
N C-O-CH2-C Br - Flow rate : 1.3 mL/min.
- Detector : UV 260 nm
- Retention time : 4.0 min
- Limit of detection : 15 ng/mL
Dapat dideteksi secara UV - Limit of quantitation : 30 ng/mL
58 59

9
 30/05/2023

Kunang-kunang Asam Salisilat

O
C
OH

H
O
60 61

As.Salisilat - Fluorescensi Papaverin HCl

O
C H3CO
OH
OCH3
N
H3CO .HCl
OCH3
H CH2
O
62 63

Riboflavin 7.Interpretasi output dari Detektor/integrator

OH OH OH
• Direkam berupa rangkaian puncak-puncak
CH2-CH-CH-CH-CH2OH • Puncak untuk data kualitatif dan kuantitatif
H3C N N O

NH
H3C N
O
64 65

10
 30/05/2023

Profil kromatogram INTERPRETASI DATA

• Data yang dihasilkan oleh intstrumen adalah
berupa respon baik berupa AUC (HPLC)
maupun absorbansi (Spektro dan AAS).

Dalam gambar, area di bawah puncak Y < dibanding dengan area

dibawah puncak X. Hal ini mungkin disebabkan : • Bagaimana kita mengetahui konsentrasi
a.Karena Y lebih sedikit dari X sampel yang terukur??
b.Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih
sedikit dibanding dengan X.
• PERLU TEKNIK KUANTIFIKASI
66 67

Terima Kasih

68

11