Chlorophyll a

2.5 Chlorophyll a
Nguồn gốc xanh của sự sống
(SP-4-2)-[(2E,7R,11R)-3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecenyl (3S,4S,21R)-9-ethenyl-14-ethyl-21-
(methoxycar-bonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinepropanoato(2-)-κN23,κN24,κN25,κN26]-
Magnesium

Đồng nghĩa: chlorophyll-1, α-chlorophyll

Từ lá rau bina đông lạnh sâu (Spinacia oleracea L.)
C55H72MgN4O5, MW 893.51 g×mol–1
Số đăng ký CAS 479-61-8
Màu xanh đen, kim sáp, mp 117-120°C (RÖMPP)

Hình 2.5-1 Cấu trúc của chlorophyll a (đánh số theo

Scifinder®, xem thông tin hỗ trợ)

Hình 2.5-2 Cây me chua (Chi: Oxalis L.) không liên quan cỏ bốn lá mang lại may mắn (Chi: Trifolium L.)

151
 Hợp chất màu

1. Cơ sở
Nó xanh rất xanh (trong cây xanh trên núi)
Không có sản phẩm tự nhiên nào mà chúng tôi đã mô tả trong cuốn sách này có tầm quan
trọng cơ bản như vậy. Sau đó, nếu không có chất diệp lục thực sự cổ xưa, thứ đánh dấu sự
khởi đầu của sự sống và giúp quá trình quang hợp diễn ra mạnh mẽ, những chất diệp lục
khác sẽ không tồn tại.
Khi vào mùa xuân, cây cối xanh tươi, cảm xúc tích cực được giải phóng, mà hầu hết
chúng ta đều liên tưởng đến sự thay đổi màu sắc này. Nó không quan trọng, chúng tôi
muốn nói đến màu xanh nào, màu xanh lá cây cỏ, màu xanh lá cây phấn, màu xanh rêu
hoặc màu xanh lá cây ô liu, tất cả chúng đều thích hợp hơn màu xanh lá cây kép. Chúng
tôi liên kết màu xanh lá cây với sự tươi mát, tăng trưởng, hy vọng, tự tin và tự nhiên với
thiên nhiên. Nó có ý nghĩa cơ bản. Trong Kitô giáo, nó là màu của sự phục sinh vào lễ
Phục sinh. Ở nhiều quốc gia Hồi giáo, nó xuất hiện trong màu cờ của họ, chẳng hạn như
của Mauritania. Nó được sử dụng phổ biến như một màu tín hiệu, để cho biết rằng thiết
bị đã được bật hoặc nơi chúng ta có thể tìm thấy lối ra trong rạp chiếu phim, nếu bộ phim
nhàm chán.
Không bao giờ cần thiết như trong trường hợp hiện nay, để lại thông tin, bởi vì những
cuốn sách khổng lồ đã được viết về chất diệp lục [1]. Nó đã là một nguồn cảm hứng cho
khoa học tự nhiên và mang lại cho những người khám phá ra nó Giải thưởng Nobel. Chỉ
là thí nghiệm có vẻ đơn giản, để chuẩn bị và mô tả đặc tính của một mẫu chlorophyll a
tinh khiết (Hình 2.5-1), đã khiến chúng tôi bận rộn trong nhiều năm. Nhưng điều đó
không là gì đối với những chú ngựa xanh.
Các mốc quan trọng trong lịch sử của chất diệp lục
Hình 2.5-3 Vân sam có chồi vào tháng 5
Các nhà hóa học các hợp chất thiên nhiên nổi tiếng của Pháp, Pelletier và Caventou,
mong muốn trở thành người đầu tiên phân lập được chất diệp lục. Năm 1818, họ đặt tên
cho nó, chất diệp lục có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp chlorós (xanh nhạt, tươi) và phýllon
(lá) [2]. Vào khoảng năm 1871, nhà thực vật học, sinh lý học và Darwinist C. Timiriazeff
đã đề cập đến phép phân tích quang phổ của chất diệp lục trong luận án của mình. Ông
phát hiện ra rằng ánh sáng đỏ có hiệu quả nhất đối với quá trình quang hợp, bởi vì đó là
nơi hấp thụ chính của sắc tố xanh lá cây. Do đó, ông kết luận rằng chất diệp lục đảm nhận
vai trò của một chất cảm quang hóa học và quang học trong quá trình quang hợp. Vào
thời điểm đó, ông đã hình thành tư tưởng tiên phong, rằng sự hấp thụ ánh sáng của chất
diệp lục có thể gây ra sự thay đổi lý hóa, do đó tạo ra các phản ứng quang hợp sâu hơn.
Vẫn nổi tiếng là nhà thực vật học người Nga M. Tswett, người đã phát triển phương pháp
cắt lớp sắc độ. Những gì anh ấy tách ra, là các sắc tố từ lá cây. Ông đã nghiên cứu hơn 100
chất hấp phụ khác nhau, chẳng hạn như canxi cacbonat dạng bột hoặc polysaccharid,
được lấp đầy trong các cột, để xem liệu chúng có phù hợp làm pha tĩnh cho quá trình
phân tách hay không, khi dung dịch chất màu được rửa giải trên chúng. Lần đầu tiên ông
quan sát các vòng màu xanh lá cây và màu vàng của các sắc tố lá khác nhau, điều này dẫn
ông đến cái tên sắc ký (hình dung bằng màu sắc) [3a, b]. Điều đó nghe có vẻ hơi thơ
nhưng chất thơ đã bị mất trong các phòng thí nghiệm của ngày hôm nay. Có một sự trùng
hợp thú vị, tên của ông "Tswett" là từ tiếng Nga để chỉ màu sắc (nomen est omen).
Năm 1915, nhà hóa học lão làng R. Willstätter đã đoạt giải Nobel hóa học "nhờ nghiên
cứu về sắc tố thực vật, đặc biệt là chất diệp lục". Mẹ của anh ấy có thể nghĩ gì, người khi
anh ấy còn là một cậu học sinh đã cố khích động anh ấy bằng lời nhận xét, "Richard, con
sẽ không bao giờ thành công!" Willstätter cũng phân bổ chất diệp lục đóng vai trò quan
trọng trong quá trình quang hợp.

152
 Chlorophyll a

Giải Nobel tiếp theo đề cập đến các hợp chất thiên nhiên được trao vào
năm 1930 cho Hans Fischer "vì những nghiên cứu của ông về cấu tạo của
haemin và chất diệp lục và đặc biệt là sự tổng hợp haemin". Fischer, người
ban đầu tham gia vào cấu trúc của sắc tố pyrrole, mà sắc tố mật là
biliverdin và bilirubin, đã thành công vào năm 1928 trong việc tổng hợp
huyết sắc tố haemin, phần liên kết oxy của hemoglobin. Ông đã tiếp nhận
công trình của Willstätter về chất diệp lục, nhận ra mối quan hệ cấu trúc
và xuất bản một lượng lớn công trình đáng kinh ngạc về nó. Năm 1940,
ông đã làm sáng tỏ cấu trúc của chlorophyll a và b [4] và đóng góp đầu
tiên vào việc làm rõ hóa học lập thể. Việc làm sáng tỏ cấu hình tuyệt đối
của chlorophyll a và b (viết tắt Chl a và Chl b) cuối cùng đã được H.
Brockmann jr thực hiện. năm 1971 [5] sử dụng phương pháp giáng hóa cổ
điển và kỹ thuật quang phổ hiện đại.
Chl a và Chl b thường xảy ra theo tỷ lệ 3: 1. Ví dụ, cây tầm ma và rau bina
rất giàu chất diệp lục và thích hợp để phân lập nó. Chúng chứa 185 mg
hoặc 95 mg Chl a tương ứng trong 100 g lá tươi. Sự cô lập là một thách
thức, như được mô tả ở đây và trong thông tin hỗ trợ.

Năm 1965, một trong những nhà hóa học các

hợp chất thiên nhiên nổi tiếng nhất, R. B.
Woodward, cuối cùng đã giành được giải
Nobel hóa học "vì những thành tựu xuất sắc
của ông trong nghệ thuật tổng hợp hữu cơ",
trong đó tổng hợp chất diệp lục a [6] đã được
tìm thấy, trong đó xác nhận cấu trúc do
Fischer đề xuất.
Cấu trúc và tính chất của Chlorophyll a
Đầu tiên, chúng ta hãy xem cấu trúc của
chlorophyll a màu xanh lam chỉ khác với
chlorophyll b xanh lục vàng ở chỗ nó có
nhóm metyl trên C-13 thay vì nhóm anđehit
-CHO (Câu E). Hình 2.5-4 Cây tầm ma.
Cẩn thận khi chạm vào!
Phân tử được cấu tạo bởi những gì và những tính chất nào bắt nguồn từ
các thành phần của nó? Chl a là phức của ion trung tâm Mg2 + với phối tử
tetradentate, vòng lớn. Bốn nguyên tử N cho tổng cộng 4 cặp electron cho
obitan của Mg2+ -ion (xem Câu B và C). Phối tử có nguồn gốc từ porphin,
và là chất dẫn xuất 2,3-dihydroderi của nó, được đặt tên là chlorin (Hình
2.5-6). Một macrocycle thơm được bền theo quy tắc Hückel có trong phối
tử. Quy tắc Hückel tuyên bố rằng một phân tử đồng phẳng, vòng liên hợp
với (4n + 2) điện tử π bền hơn so với một mạch hở tương tự, hệ liên hợp.
Được biết đến nhiều nhất là benzen bền về mặt năng lượng với n = 1. Đối
với Chl a n = 4, tức là ở quan vòng bên trong có 9 cặp electron liên hợp
theo vòng, tức là 18 electron π, tổng số chẵn có 20 electron π. Phối tử
chlorin được bềnhóa năng lượng nhưng quan trọng nhất, các electron π
liên hợp của nó hấp thụ một phần của quang phổ khả kiến, đó là lý do tại
sao chất diệp lục có màu xanh lam (chi tiết xem phổ UV-Vis).

153
Hợp chất màu
Frankfurter Green Sauce
("Grie Soss") sốt rau thơm
Thành phần cho 3 phần ăn
1 gói thảo mộc có chứa: cây me vườn,
cây anh đào, lá hẹ, mùi tây, cây burnet,
cải xoong và cây lưu ly
2 quả trứng luộc chín
3 muỗng canh giấm rượu
6 muỗng canh dầu
1 muỗng cà phê mù tạt nóng vừa
3 muỗng canh kem, crème fraîche hoặc
kem chua
1 củ hành tây thái hạt lựu nhỏ
muối, tiêu, đường
Nước sốt này nên chứa 7 loại thảo mộc.
Bỏ các loại thảo mộc ra khỏi thân cây
dày, sau đó dùng dao làm bếp cắt
nhuyễn các loại thảo mộc. Không nghiền
chúng trong máy trộn. Ép lòng đỏ của
trứng luộc qua rây rồi trộn với hành tây
thái hạt lựu, mù tạt, muối, tiêu, giấm,
dầu và một chút đường thành nước sốt.
Thêm rau thơm đã cắt nhuyễn và lòng
trắng trứng gà vào trộn đều. Thêm kem
hoặc crème fraiche vv tùy theo khẩu vị.
Ăn kèm với thịt bò luộc và khoai tây mới
luộc.
Từ: http://www.chefkoch.de/rezep-
te/429061133924705/
Frankfurter-gruene-Sauce.html
(5.3.2016)
Hình 2.5-5 Bèo tấm thông thường (đậu lăng nước)
154
Trong macrocycle, phối tử có ba tâm bất đối xứng, tại C-3, C-4 và C-21.
Danh pháp không thông thường, đặc biệt là vì có một số hệ thống danh
pháp. Như mọi khi, chúng tôi sử dụng danh pháp từ Scifinder®, cơ sở dữ
liệu hóa học lớn nhất. Hai gốc axit cacboxylic trên C-21 và C-3 được este
hóa, một với metanol, còn lại với chất diterpene alcohol transphytol bất
đối, được Willstätter phân lập lần đầu tiên vào năm 1909 bằng cách thủy
phân chất diệp lục. Phytol cực kỳ kỵ nước. Đặc tính này được chuyển sang
chất diệp lục, do đó chất này không tan trong nước. Về mặt sinh học, điều
này có ý nghĩa, bởi vì sắc tố vẫn còn trong lá. Vì vậy, rau xanh không bị mất
màu xanh, khi nấu chín. Không thể tạo màu xanh cho một thứ gì đó bằng
dung dịch nước chứa chất diệp lục. Yêu cầu từ một đài truyền hình địa
phương gửi đến một trong các tác giả trước Lễ Phục sinh "chúng tôi muốn
đến thăm bạn một thời gian ngắn, để chúng tôi có thể quay phim về bạn,
hướng dẫn chúng tôi cách tô màu những quả trứng Phục sinh thành màu
xanh lá cây bằng chất diệp lục", có thể được coi là một ý tưởng quyến rũ
nhưng ngây thơ.
Tuy nhiên, chất diệp lục có thể hòa tan trong etanol, axeton hoặc ete. Chất
diệp lục tinh khiết có dạng sáp, là hệ quả của cấu trúc ester phytol có thể
được trải nghiệm trên phương diện vĩ mô. Bất kỳ ai đã từng rơi trên cỏ đều
biết rằng những vết cỏ không thể rửa sạch bằng nước.
Chl a có trung tâm CH có tính axit trên C-21, tại đó sau khi đồng phân
xeto-enol trên đồng phân lại của dạng enol không chỉ chlorophyll a mà còn
cả chlorophyll a 'có cấu hình (S)-trên C- 21 có thể được hình thành [7]
(Hình 2.5-7).
Chl a và Chl b có thể phản ứng với và nhạy cảm với axit và bazơ cũng như
với các chất oxi hóa và khử [8]. Với axit, magiê bị loại bỏ. Điều này làm
thay đổi màu của phối tử tự do kim loại của Chl a từ xanh lam sang xanh ô
liu và của Chl b từ xanh lục vàng sang đỏ Bordeaux. Ở điều kiện bazơ, vòng
xiclopentenon mang chức metyl
este được mở. Năm vòng có ghi
nhớ này thể hiện sự khác biệt rõ rệt
với phối tử haem trong huyết sắc
tố. Khi thủy phân, metanol và
phytol được phân tách từ các este.
Trái ngược với phối tử achiral của
huyết sắc tố, phối tử của Chl a và
Chl b quang hoạt, do đó phổ CD có
thể được ghi lại.
 Chlorophyll a

Hỡi cây thông Noel (một người Đức)

O cây thông noel, o cây thông noel

Lá (kim) của bạn trung thành như thế nào.
Bạn không chỉ xanh trong mùa hè,
Mùa đông cũng không, khi trời có tuyết
O cây thông noel, o cây thông noel
Lá (kim) của bạn chân thật như thế nào.

Ernst Anschütz (1780–1861)

Hình 2.5-6 Các dẫn xuất porphin chlorin (2,3

dihydroporphin) protoporphyrin IX hemin (hemin b, tinh
thể Teichmann) chlorophyllin, chất tạo màu thực phẩm
E141

Hình 2.5-7 Tatome hóa keto-enol của Chl a cho

Chl a '

16a 11a 6a

16a' 11a' 6a'

δH / ppm

Hình 2.5-8 Cân bằng thời gian từ Chl a và Chl a '. Vết dưới cùng: phần ban đầu của phổ 1H NMR của chlorophyll a, được phân
lập bằng sắc ký dòng ngược, trong THF-d8; vết giữa: quang phổ sau 23 giờ ở 295 K; phần trên cùng của vết 1H NMR: quang phổ
sau 52 giờ. Xem thông tin hỗ trợ cho thí nghiệm nghịch đảo với chlorophyll a 'làm nguyên liệu ban đầu.

155
 Hợp chất màu

Hệ vòng Porphyrin - một thành công ban đầu của sự tiến hóa
Khi chúng ta so sánh chlorin, từ sắc tố lá xanh, với haemin từ huyết sắc tố, có vẻ
hợp lý khi cho rằng vào thời kỳ đầu trong quá trình tiến hóa, "Nature" đã tìm
thấy phối tử tetradentate porphyrin như một thứ hữu ích, từ đó có thể phát triển
ra những thứ khác nhau. Do đó, các sinh vật tận dụng quá trình quang hợp nhận
được sắc tố thu nhận ánh sáng, trong khi động vật thu được chất vận chuyển
ôxy. Trong trường hợp đầu tiên, màu sắc là chủ yếu; thứ hai, màu sắc được xác
định về mặt cấu trúc nhưng không cần thiết cho sự hấp thụ ánh sáng, vì O2 liên
kết với -ion Fe2 + mà không có tác động của ánh sáng. Có một tiền chất sinh hóa
chung cho cả hai phối tử, protoporphyrin IX (Hình 2.5-6). Trong cả hai trường
Hình 2.5-9 Cây thường xuân thường xanh
hợp, nó là chất trung gian trong quá trình sinh tổng hợp.
Sử dụng hàng ngày cho Chlorophyllin
Đương nhiên, các chất từ một lớp như chất diệp lục, vốn xuất hiện rất phổ biến
trong tự nhiên, đã được nghiên cứu về các ứng dụng khả thi của chúng. Không
nhẹ hoặc không mạnh, chúng không thích hợp để tạo màu. Đối với tự nhiên,
điều đó không quan trọng, vì chúng được hình thành mới mỗi năm. Một dẫn
xuất, chlorophyllin, được sử dụng trong da liễu như một loại thuốc dễ bị tổn
thương, vì nó khuyến khích quá trình tạo hạt và biểu mô hóa. Chất diệp lục có
tác dụng khử mùi. Bạn có mong đợi điều đó không? Nó làm giảm hoạt động của
các protease cụ thể. Do đó, "Viên diệp lục" trung hòa mùi hôi miệng và cơ thể.
Đó là muối trinatri của chlorophyllin được lấy (Chất tạo màu thực phẩm E141),
một chất diệp lục đã được biến đổi về mặt hóa học mà sau khi mất ester phytol
sẽ hòa tan tốt trong nước (Hình 2.5-6). Ngoài ra, ion trung tâm Mg2 + được trao
đổi với Cu2 +, làm bền hóa phức chất, làm đậm màu xanh lục và tăng độ bền dưới
ánh sáng cho các ứng dụng tạo màu.
Máu và Lá - Mối Liên Kết Hóa Học Phải Mạnh Đến Mức Nào?
Con dê rình mò trên ngọn đồi lâu Khả năng sửa đổi cho thấy rằng quá trình tiến hóa đã chọn không cung cấp cho
năm, Đã ăn lá non cả ngày trên chất các liên kết hóa học sức mạnh tối đa của chúng, mà chỉ làm cho chúng "đủ
diệp lục.
mạnh", tức là mạnh một cách tối ưu. Điều này có giá trị đối với ion sắt trong
Magnus Pyke (1908–1992) hemoglobin - như một nguyên tố vi lượng có giá trị, nó được tái sử rộng rãi, khi
một hồng cầu bị thoái hóa. Theo cách tương tự, Mg2 + -ion trong diệp lục là "đủ",
sau đó diệp lục phân huỷ vào mùa thu. Tự nhiên phải làm gì với những chiếc lá
không mục nát? Mg2 + được tái sử dụng một phần. Phân tử O2 cũng liên kết "vừa
đủ mạnh" với hemoglobin. Trong tế bào, nó phải được giải phóng với nỗ lực ít
nhất có thể. Carbon monoxide độc hại liên kết mạnh hơn 300 lần, gần như
không thể đảo ngược.
Về sinh tổng hợp chất diệp lục
Quá trình sinh tổng hợp chlorophyll a và b đã được làm rõ một cách chi tiết.
Theo mục đích của chúng tôi, để mô tả một cách rộng rãi sự phân lập và quang
phổ của chlorophyll a, chúng tôi sẽ tránh tính toán từng bước về quá trình sinh
tổng hợp của nó. Thay vào đó, chúng tôi giới thiệu người đọc đến các chương
10-18 trong [1], cũng đề cập đến sự giánghóa của chất diệp lục, sự tiến hóa của
chất diệp lục và các phản ứng của quá trình quang hợp. Chúng tôi chỉ muốn đề
cập đến một vài điểm quan trọng. Axit 5-aminolevulinic là tiền chất mạch hở
của bốn pyrrole cần thiết cho phối tử tetradentate của quá trình sinh tổng hợp
porphyrin. Trong quá trình sinh tổng hợp tetrapyrrole này, bản chất là chất
trung gian trung tâm, protoporphyrin IX, từ đó bằng cách sửa đổi, nó có thể đi
đến chlorophylls hoặc haem, hoặc nếu bạn muốn, đến thế giới thực vật hoặc
Hình 2.5-10 Nguyên liệu ban đầu của chúng tôi động vật (Hình 2.5- 6).

156
 Chlorophyll a

Chlorophylls hoàn thành một số nhiệm vụ. Vì chúng hấp thụ ánh sáng và
truyền năng lượng hấp thụ đi xa hơn, chúng hoạt động như chất cảm
quang. Các phức thu ánh sáng được cấu tạo đến mức chúng thể hiện một
khu vực rộng lớn và tạo thành một "phễu năng lượng", qua đó năng lượng
chảy đến trung tâm phản ứng. Ở đó, hai phân tử Chl a, một cặp đặc biệt,
đóng vai trò là chất nhận năng lượng có thể thực hiện sự phân tách điện
tích để bắt đầu quá trình quang hợp. Sự chuyển giao năng lượng xảy ra
trong pico giây. Tất cả những điều này đã và vẫn đang được nghiên cứu
chi tiết, với mục đích là sử dụng năng lượng mặt trời cho quá trình quang
hợp nhân tạo.

2. Cô lập
2.1 Nguyên tắc
Chiết xuất Chlorophyll từ lá rau bina đông lạnh sâu
Nguyên liệu ban đầu cho quá trình chiết xuất
Lá rau bina đông lạnh sâu (xem Hình 2.5-10) 2 × 800 g.
Điều kiện thí nghiệm [9]
Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện dưới ánh sáng dịu. Chất chiết
xuất được làm khô trong điều kiện chân không cao và bảo quản trong tủ
đông sâu ở nhiệt độ - 80 ° C.

2.2 Phương pháp

Chuẩn bị chiết xuất rau bina từ 800 g rau bina đông lạnh sâu
Chất diệp lục trong rau bina đông lạnh sâu (800 g) được hòa tan trong
axeton chưng cất (2,4 L) chứa trong cốc (4 L) và khuấy liên tục trong 4 giờ. Với Ruy băng màu xanh lá cây đàn
Cốc được bọc trong lá nhôm và phần mở được bọc bằng lá nhôm. Trong nguyệt
quá trình chiết, rau muống mất dần màu xanh đậm. Sau 4 giờ, sau khoảng "Thật là xấu hổ về dải ruy băng xanh, nó
thời gian mà rau bina có vẻ bị tẩy trắng, huyền phù được lọc qua phễu sẽ mờ dần ở đó trên tường, tôi thích màu
xanh lá cây rất nhiều!"
Büchner vào bình lọc (1 L). Bình lọc bổ sung và phễu Büchner được sử Vì vậy, bạn đã nói chuyện với tôi ngày
dụng theo yêu cầu và giấy lọc trong phễu Büchner được thay thế khi quá hôm nay, em yêu của tôi, Và ngay lập tức
trình lọc trở nên quá chậm vì bị tắc. tôi sẽ tháo nó ra và đưa nó cho em,
Vì vậy, bây giờ hãy tận hưởng màu xanh
Dịch chiết được chia giữa hai bình (2 L) được bọc trong lá nhôm. Thêm lá cây!
vào mỗi bình 1,4-dioxan (150 mL) và khuấy liên tục. Sau đó, thêm từng Và ngay cả khi người em yêu là người da
giọt nước cất (150 mL) vào bình cầu trong quá trình khuấy liên tục trong trắng hoàn toàn,
20 phút. Các bình kín được bảo quản qua đêm ở -22 ° C. Vào ngày hôm Tuy nhiên, màu xanh lá cây nên có vị trí
danh dự của nó, Và tôi cũng thích nó.
sau, cả hai lô đều được lọc qua phễu Buchner. Tổng sản lượng thu được là Vì tình ta mãi xanh tươi, Vì nơi xa hy
650 mg phức chất diệp lục-dioxan. vọng nở hoa xanh tươi,
Và vì vậy chúng ta thích nó.
Phân tích TLC Vì vậy, bây giờ cuộn vào những lọn tóc
của em
Rửa giải: petroleum ether (30-80°C)/isopropanol 9:1 (v/v)
Ruy băng xanh, nếu bạn vui lòng,
Rf = 0.15 (neoxanthine), Rf = 0.35 (violaxanthine), Rf = 0.50 (xanthophylls), Vì em thích màu xanh lá cây rất nhiều.
Rf = 0.57 (chlorophyll b), Rf = 0.60 (chlorophyll a), Rf = 0.94 (carotenoids) Sau đó, tôi sẽ biết nơi hy vọng cư trú, Sau
đó, tôi sẽ biết nơi tình yêu chủ đạo, Khi
Phức chlorophyll-dioxane được xử lý lại như trên. Nó được hòa tan trong đó tôi thực sự sẽ thích màu xanh lá cây.
Wilhelm Müller (1794–1827) Die schö-
axeton cất (1,5 L) chứa trong một bình (2 L) được bọc trong lá nhôm. 1,4-
ne Müllerin, đặt thành nhạc bởi F.
Dioxan (210 mL) được thêm vào khi khuấy liên tục. Sau đó, thêm từng Schubert Bản dịch từ Celia Sgroi: http://
giọt nước (210 mL). Bình kín được bảo quản ở - 22 ° C trong hai ngày. www.gopera.com/lieder/translations/
Dung dịch được lọc qua phễu Büchner. schubert_795.pdf

157
Hợp chất màu

Thu được phức chất diệp lục-dioxan (85 mg). TLC cho thấy vật liệu này
chỉ chứa chlorophyll a và b và các carotenoit. Để có thêm nguyên liệu, quá
trình hoàn chỉnh được lặp lại với 800 g rau bina đông lạnh sâu.

2.3 Tinh chế

Sắc ký lỏng-lỏng

a)
b)
Hình 2.5-11 Ảnh chụp đĩa từ các thiết bị
thủy tĩnh của các nhà sản xuất khác
nhau. a) Armen Instruments (Model
TCPC250); b) Kromaton Technologies
(FCPC250)
Sắc ký lỏng-lỏng (LLC), còn được gọi là sắc ký ngược dòng (CCC) hoặc
sắc ký phân vùng ly tâm (CPC) được phát triển vào những năm 1960 bởi
Ito [10]. LLC khác với các kỹ thuật tách sắc ký lỏng khác ở chỗ không chỉ
pha động mà pha tĩnh cũng là chất lỏng. Kể từ những ngày đầu được xác
lập, LLC đã được sử dụng chủ yếu để tách và tinh chế các sản phẩm tự
nhiên [11]. Phổ ứng dụng rộng hơn của nó bao gồm việc tách các hợp chất
hoạt động dược phẩm, vitamin, chất màu, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu và
các nguyên tố.
Dụng cụ
Các thí nghiệm CCC được thực hiện trên thiết bị Armen SCPC-250
(Armen Instrument, Saint Ave, Pháp) ở nhiệt độ môi trường (xem Hình
2.5-11 và -12). Thiết bị này bao gồm hai cột, mỗi cột có thể tích cột tối đa
là 125 mL được ghép nối tiếp với nhau. Các cột được gắn vào hai rôto độc
lập với tốc độ quay tối đa là 3000 vòng / phút (gia tốc 280 g) và có thể hoạt
động với độ giảm áp suất 100 bar.

Hình 2.5-12 Cấu tạo của thiết bị SCPC-250 (Armen Instrument, Saint Ave, Pháp) với thể tích cột 250 mL

Sắc ký lỏng-lỏng tách chất diệp lục

Để tách khoảng 120 mg dịch chiết thô từ rau bina, hệ thống dung môi hai
pha bao gồm n-heptan / etanol / axetonitril / nước (10: 8: 1: 1, v / v) đã
được sử dụng (Jubert và Bailey [ 12]). Hệ dung môi được chuẩn bị bằng
cách trộn các lượng dung môi tương ứng ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp dung
môi được lắc mạnh và để cân bằng ở nhiệt độ phòng trong ít nhất hai giờ.
Sử dụng phễu chiết, hai pha được tách ra và bảo quản trong hai thùng
chứa riêng biệt. Trước khi sử dụng, các pha được khử khí trong bể siêu âm.

158
 Chlorophyll a

Để tách CCC, pha dưới được sử dụng làm pha động (chế độ giảm dần).
Hỗn hợp ban đầu bão hòa (hỗn hợp nạp máy) được chuẩn bị, bằng cách
thêm xấp xỉ . 25 mL pha tĩnh vào dịch chiết thô từ rau bina.
Khi bắt đầu tách CCC, cột được lấp đầy bằng pha tĩnh (phía trên, pha giàu
heptan) với tốc độ dòng 40 mL x min – 1. Sau đó, tốc độ quay được đặt ở
1900 vòng / phút và pha động được bơm ở 12 mL x min – 1 cho đến khi
không còn pha tĩnh nào được rửa giải khỏi cột. Sau đó, mẫu được tách ra
sẽ được tiêm vào.
Trong quá trình của dự án này, hai
lần phân tách đã được thực hiện,
theo đó các lượng khác nhau của
hỗn hợp mẫu được sử dụng: cho
lần tách thứ nhất 10 mL và lần tách
thứ hai 18. Sắc ký đồ của lần tách
1800

Chlorophyll a
đầu tiên được thể hiện trong Hình 1600

2.5-13.Độ lưu giữ pha tĩnh là 1400 Chlorophyll b

Detector signal / mAU

khoảng 53%.
1200

1000
Việc tách chiết xuất thô từ rau bina
800
được thực hiện với pha dưới là pha
động (chế độ giảm dần) với tốc độ 600

dòng 12 mL × min – 1. Sự phân tách 400

Chlorophyll b‘
hoàn toàn được phân đoạn, sao cho 200
Chlorophyll a‘

các phần có chlorophyll a, a ’và b

nguyên chất có thể được phân tách 0
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00

hoàn toàn khỏi nhau, các đỉnh của

Thời gian / phút
chlorophyll b và b’ chồng lên nhau. Hình 2.5-13 Sắc ký đồ của sự phân tách CCC của dịch chiết diệp lục với bước sóng
Sau khi tách CCC, các mẫu sau detector 440 nm
được sử dụng để phân tích NMR:

chlorophyll a: 17 mg in 0.8 mL THF-d8

chlorophyll b: 45 mg in 0.8 mL THF-d8
chlorophyll a’: 21 mg in 0.6 mL THF-d8
Mô tả chi tiết về sự phân lập cổ điển và tinh chế chất diệp lục bằng
phương pháp sắc ký cột được đưa ra trong thông tin hỗ trợ.

159
Hợp chất màu

3.Phổ và biện luận

Quang phổ UV-Vis trong Ethanol
Dải cường độ mạnh ở 425 nm
(vùng bước sóng xanh lam) được 160000
đặt tên là dải Soret theo tên người
phát hiện ra nó là Jaques-Louis
Soret (1883). Nó gần như nằm 120000
trong quang phổ cực đại của ánh
sáng mặt trời trên cạn (Hình

ε / cm2 × mmol–1
2.5-14). Hơn nữa, một số dải tồn 80000
tại trong khoảng từ 555 đến 700
nm với cực đại ở 660 nm, tức là
trong vùng bước sóng màu đỏ. 40000
Dải này được gọi là dải Q và hấp
thụ phần bước sóng dài của ánh
sáng mặt trời. Vì chất diệp lục 0
200 300 400 500 600 700 800
hấp thụ các phần màu xanh và đỏ λ / nm
của ánh sáng mặt trời nên nó rất
thích hợp như một chất thụ cảm Hình 2.5-14 Phổ UV-Vis của chlorophyll a
ánh sáng và xuất hiện trước mắt
chúng ta như một chất màu xanh Phổ CD
lục đậm. Nhiều bài báo quan tâm
đến việc giải thích cơ học lượng 10

tử của quá trình chuyển đổi π-π *

5
này trong hệ phorbine và với mức
độ phân cực huỳnh quang của nó
Δε / cm2 × mmol–1

0
[13, 14].
-5

-10

-15
200 250 300 350 400 450 500 550 600

λ / nm

Hình 2.5-15 Phổ CD của chlorophyll a

Dải hấp thụ Q của chất diệp lục ở bước sóng 660 nm cho thấy hiệu ứng Cotton âm tính, tuy nhiên, không thể
thấy được trong phổ CD được hiển thị (Hình 2.5-15), vì điều này chỉ được ghi lại ở bước sóng 600 nm. Khi đi
đến các bước sóng thấp hơn xen kẽ dương (420, 330 và 265 nm) và âm (375, 300 và 230 nm) Các hiệu ứng
Cotton được quan sát, việc giải thích hóa học của chúng dường như là khó khăn, đặc biệt là trong dung dịch
này, lượng cân bằng của epimer chlorophyll a 'có mặt. Houssier đưa ra một cuộc thảo luận chi tiết về phổ CD
[15].

160
 Chlorophyll a

Phổ hồng ngoại tính trong KBr

100
95
90
85
80
75
70
65
60
%T

55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3000 2000 1500 1000 500

Số sóng (cm )
−1

Hình 2.5-16 Phổ IR của chlorophyll a trong KBr

Ngoài dải từ nước dư từ 3500 đến 3200 cm – 1, tín hiệu phức tạp từ dao động CH với dải nhỏ từ các nguyên tử
C lai hóa sp2 ở 3050 được quan sát (Hình 2.5-16). Phần chính nằm trong vùng béo 3000–2900 cm – 1. Hai dải
C = O khác nhau rõ ràng ở 1750 và 1700 cm – 1 có thể được gán cho nhóm C = O C-20 và nhóm este C-211 và
C-31, trong khi tín hiệu khá rộng ở 1620 cm – 1 được tạo ra bởi nhiều liên kết đôi. Sự gán trong vùng vân tay
đã được mô tả một phần trong tài liệu [16].

Phổ 700 MHz NMR trong THF-d8

Tất cả các phổ NMR [17-21] được ghi lại ở 700 MHz trong THF-d8 và
được tham chiếu đến TMS. Phổ 1H, 15N-HMQC sử dụng thang đo Ξ với
tham chiếu thông thường cho sinh học cấu trúc. Phổ 25Mg NMR không
thể thu được trong dung dịch.
Việc phân tích quang phổ của chlorophyll a là một nhiệm vụ đầy thách
thức, không nằm ngoài dự đoán đối với một hợp chất có công thức phân
tử C55H72MgN4O5. Ngoài ra, cân bằng của epimers ở C-21, cho a:a' trong
THF-d8 ở 295 K là khoảng 100: 20, làm phức tạp thêm vấn đề. Chỉ với
phương pháp sắc ký ngược dòng [11], chúng tôi đã thành công trong việc
tách chlorophyll a khỏi b, b 'và đồng thời a'. Sau công trình nghiên cứu của
Jubert và Bailey [12], chúng tôi đã có thể thu được phổ 1H NMR của
chlorophyll a tinh khiết tepimeric . Cân bằng epimeric ở C-21 đã đạt
được, trong 24 giờ trong dung dịch THF (Hình 2.5-8).

161
Hợp chất màu

Phổ 1H NMR
16 11 6 21

92t 92c
91

δH / ppm

Hình 2.5-17 Sự mở rộng phổ 1H NMR của chlorophyll a trong vùng olefinic / thơm

Phổ 1H NMR của chlorophyll a (Hình 2.5-17) cho thấy, trong vùng olefinic được khử che chắn mạnh, ba
singlets nhọn ở δH = 9,61, 9,36 và 8,44 có thể ngay lập tức được gán cho các proton 6, 11 và 16 của porphyrin
vòng.
Tuy nhiên, các phép gán độc lập yêu cầu đánh giá phổ NOESY. Một tín hiệu xuất hiện dưới dạng doublet kép
ở δH = 8.10 với các hằng số ghép cặp 11,5 và 17,8 Hz, do đó phải được gán cho nguyên tử H-91 của nhóm vinyl.
Các tín hiệu của hai proton vinyl đầu mạch liên quan có thể dễ dàng tìm thấy ở δH = 6,2 (H-92t) và δH = 5,93
(H-92c). Một singlet từ một proton xa hơn được xếp chồng lên tín hiệu đầu tiên trong hai tín hiệu này. Theo
phổ HSQC, tín hiệu này ở δH = 6,19 được liên kết với một nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học δC = 66,4,
tức là một nguyên tử C lai hóa sp3. Do đó, nó được phân bổ cho proton H-21. Tính khử tương đối mạnh là do
hai nhóm C = O lân cận gây ra và minh họa tính axit của proton này. Điều này giải thích sự biến đổi
epimerisation của phân tử.

Phổ HSQC
16 11 6 21 141181131
P1 81
91 92t 92c P2 4 3 212
δC / ppm
131, 81, 181
142

4, 3, 212
P1
21

6
11
16

92, P2

91

δH / ppm

Hình 2.5-18 Mở rộng 1 của phổ HSQC của chlorophyll a

162
 Chlorophyll a

HMBC Spectrum
16 11 6 21

91 92t 92c
δC / ppm

4, 3, 212
P1
21

6
11
1, 16

92, P2
91
19, 18, 13
8, 9, P3, 14
15, 17, 10, 12
7, 2, 22
5, 211, 31

20

δH / ppm
Hình 2.5-19 Trích từ phổ HMBC của chlorophyll a trong vùng proton olefinic

Chúng tôi bắt đầu kiểm tra phổ HMBC (Hình 2.5-19) và do đó là sự gán các nguyên tử C bậc bốn với vòng
pyrrole III. Các proton của nhóm metyl 81 cũng như cặp H-92t và H-11 với nguyên tử C ở δC = 139,3, xác nhận
đây là C-9. Cặp H-6 và H-81 với nguyên tử cacbon ở δC = 135,8 có thể được gán là C-8. C-7 ở δC = 154,2 được
nhận biết bởi H-6 và H-81, C-10 ở δC = 148,0 ghép cặp chủ yếu với H-91. Các chi tiết khác về phổ HMBC được
cung cấp trong thông tin hỗ trợ.

181
212 81
16 11 6 21 P1 131
δH / ppm 91 92t 92c P2 4 3 142

131, 81
181, 212
142, 3

4, P1

P2

92c
21, 92t

91
6

11, 16

δH / ppm

Hình 2.5-20 Phổ NOESY của chlorophyll a

163
Hợp chất màu

Proton được khử che chắn nhiều nhất của vòng porphyrin ở δH = 9,61 cho thấy hai tín hiệu chéo NOE rõ ràng
với proton 141 và với nhóm metyl ở δH = 3,6 (xem Hình 2.5-20 trong thông tin hỗ trợ). Phát hiện này xác định
gán của nó là H-16 và nhóm metyl là H-181. Proton tiếp theo của vòng porphyrin ở δH = 9,36 hiển thị ba tín
hiệu chéo NOE tới proton H-91, H-92t và tới tín hiệu của nhóm metyl ở δH = 3,29. Điều này xác định việc gán
nó cho H-11 và nhóm metyl là H-131. Proton thứ ba của vòng porphyrin ở δH = 8,44 cũng cho thấy ba lần
giãn chéo thành H-4, thành nhóm metyl ở δH = 3,34 và thành H-41. Đây là bằng chứng cho sự gán cho H-6 và
nhóm metyl là H-81. Thực tế là trong số ba proton trên vòng porphyrin H-16 là loại phản chắn mạnh nhất, có
thể dễ dàng bắt nguồn từ cấu trúc giới hạn liên kết hóa trị mesomeric. Không thể hình thành điện tích dương
trên C-6.

Như dự đoán, H-91 cho thấy

thêm hai cực đại NOE, thành
H-92c và với nhóm metyl H-81.
Tương ứng, H-21 hiển thị tín
hiệu chéo đến H-3, 31 và 32. Các
đỉnh chéo giữa P2 và P1 cũng như
P4 là không đáng kể. Một đỉnh
chéo yếu có thể được nhìn thấy
giữa P2 và P5. H-4 cho thấy
hiệu ứng NOE đến H-31 và H-41,
do đó xác nhận phép gán của nó, cũng như đỉnh chéo giữa P1 và P3a. Một lần nữa, các liên kết NOE giữa H-3
và H-31/32 và H-41 lại rất nhỏ. Các proton 141 hiển thị tín hiệu chéo với H-131 và tất nhiên với H-142. Hai
proton diastereotopic H-32 được kết nối với nhau bằng tương tác NOE mạnh và đồng thời với H-31. P4 cho
thấy bốn mối tương quan dọc theo chuỗi phytyl.

Phổ 1H15N HMQC 16 11 6

δN / ppm

25
23

24

26

δH / ppm
Hình 2.5-21 Phổ 1H15N HMQC của chlorophyll a

164
 Chlorophyll a

Phân tích phổ HMQC 1H15N (Hình 2.5-21) xác nhận việc gán riêng lẻ của ba proton vòng porphyrin H-6,
H-11 và H-16. Mỗi một cặp đôi qua ba liên kết với hai nguyên tử nitơ, một nguyên tử N lai hóa sp3 và một sp2.
Do đó, chúng tôi mong đợi sáu tín hiệu, theo đó hai cặp tín hiệu sẽ dẫn đến cùng một nguyên tử N. H-16 kết
đôi với N-23 tại δN = 195,3 và với N-24 tại δN = 212,3. H-11 kết đôi với N-25 tại δN = 193,8 và cũng với N-24
tại δN = 212,3. Giống như H-11, H-6 ghép cặp với N-25 và với N-26 tại δN = 252,3. Một lần nữa, tính phản
chắn của N-26 có thể được giải thích bằng các cấu trúc giới hạn liên kết hóa trị. Cấu trúc tương tự cho ba
nguyên tử N còn lại là không thể. Dữ liệu 15N NMR của chúng tôi đồng ý với công việc trước đó sử dụng vật
liệu có đánh dấu 15N [22].

"Tôi thật sự đau buồn biết bao, Mademoiselle thân mến, đã nhớ bạn", ông Greenlee
nói vài ngày sau đó, khi Tony, người đang trở về sau một chuyến đi chơi, gặp ông ở
góc đường Breiten và Meng. "Tôi đã rất táo bạo, để bày tỏ lòng kính trọng của tôi đối
với người mẹ thân yêu của bạn và tôi nhớ bạn kinh khủng ... Nhưng tôi rất vui mừng
biết bao, được gặp mẹ ngay bây giờ!" Khi ông Greenlee bắt đầu nói, cô Buddenbrook
đứng yên, nhưng đôi mắt cô nhắm hờ và bỗng tối sầm lại, hướng không cao hơn ngực
của ông Greenlee và quanh miệng cô nở một nụ cười chế nhạo và hoàn toàn tàn
nhẫn, cùng với đó là một nụ cười cô gái trẻ mất phí và từ chối một người đàn ông…
môi cô ấy run lên - cô ấy nên trả lời gì đây? Ha! Nó phải là thứ gì đó đã đẩy lùi, phá
hủy Bendix Greenlee này một cách tốt đẹp và mọi lúc…. Nhưng nó phải là một cái gì
đó thông minh, hài hước, mạnh mẽ đồng thời gây thương tích và ấn tượng cho anh
ta…. "Đó không phải là của nhau!" cô nói, ánh mắt nhìn chằm chằm vào ngực ông
Greenlee, và sau khi cô bắn mũi tên tẩm độc này, cô để ông đứng, ngả đầu ra sau và
đỏ bừng vì tự hào về tài hùng biện châm biếm của mình, về nhà, nơi cô biết được
rằng ông Greenlee đã được mời nướng thịt bê vào Chủ nhật sắp tới…

Thomas Mann (1875–1955) Buddenbrooks

Tính toán hóa học lượng tử

So sánh độ dịch chuyển hóa học

của chlorophyll a được đo bằng
thực nghiệm trong THF-d8 (xem
Bảng gán) cho thấy hợp lí thỏa
đáng với dữ liệu dịch chuyển
được dự đoán bởi
ChemBioDraw® đối với các tín
hiệu 13C NMR của chuỗi phytyl,
ngay cả khi trình tự của các tín
hiệu không luôn được dự đoán
chính xác. Sự thay đổi ước tính
đối với các nguyên tử C của vòng
lớn, ví dụ: C-2, C-5, C-6, C-11,
C-15, C-16 cho thấy độ lệch rất
lớn lên đến +20 ppm. Các điều
kiện điện tử của vòng porphyrin
gây ra bởi sự liên hợp π và tạo
phức magie không được tính đến
bởi chương trình dự đoán Hình 2.5-22 Cấu trúc 3D của chlorophyll a được tính toán bằng phương
chuyển dịch hóa học theo kinh pháp ab Initio
nghiệm.
Tuy nhiên, các phương pháp hóa học lượng tử có thể tính toán ab khởi đầu cấu trúc điện tử (Hình 2.5-22), sự
phân bố điện tích và tính chất phổ NMR của bất kỳ phân tử nào. Cấu trúc của chlorophyll a được tính toán
bằng cách sử dụng BP86/cc-pVTZ.

165
Hợp chất màu

Sự dịch chuyển hóa học 13C NMR được tính toán cho các nguyên tử C của vòng porphyrin bằng cách sử dụng
BP86 và bộ triple-ζ cơ bản TZVP (xem Bảng gán) cho thấy sự thống nhất tốt hơn (Δδ ~ -1 đến +9 ppm) so với
ước tính thực nghiệm, bởi vì môi trường điện tử gây ra bởi sự liên hợp và tạo phức π được tính đến. Tính toán
hóa học lượng tử của điện tích nguyên tử NBO và sự thay đổi 1H và 13C thống nhất với thực nghiệm quan sát
thấy khả năng phản chắnhơn của C-16/H-16 và C-11/H-11 so với C-6/H-6 (xem các cấu trúc cộng hưởng liên
kết hóa trị đóng góp đã thảo luận ở trên).

Sự sai lệch giữa dịch chuyển hóa học 13C thực nghiệm và
tính toán của các nguyên tử C của vết phytyl là kết quả của
giá trị trung bình của các đồng phân cấu tạo có năng lượng
tương tự trong dung dịch không được xem xét trong tính
toán. Điện tích âm riêng phần giảm dần của bốn nguyên tử
nitơ theo thứ tự N-23> N-25> N-24> N-26 thu được từ phép
tính NBO phù hợp với mô hình và sự khác biệt tương đối
của sự dịch chuyển hóa học 15N từ phép tính GIAO và từ
những điều thu được bằng thực nghiệm.
So sánh dữ liệu thực nghiệm, ước tính và dữ liệu được tính
toán lượng tử cho sự thay đổi hóa học phổ NMR cho thấy
khả năng ứng dụng hạn chế của hệ thống gia tăng để dự
đoán thực nghiệm về độ dịch chuyển hóa học, khi áp dụng
cho các phức kim loại của hệ vòng macro liên hợp. Các tính
toán cơ học lượng tử của độ dịch chuyển hóa học NMR dựa
trên tính toán môi trường điện tử của hạt nhân nguyên tử, là
nguyên nhân trực tiếp của độ dịch chuyển hóa học.

166
 Chlorophyll a

Bảng gán

Tín hiệu Loại Gán Tín hiệu Bằng chứng Bằng chứng C-NMR
13 C-NMR * và 15N-
13

13C-NMR nguyên 1H-NMR (ghép cặp (NOE từ tín hiệu NMR ** tính toán
δ [ppm] tử C δ [ppm], HMBC từ proton sang dự đoán bởi hóa lượng tử
J [Hz] proton đến proton) Chem-Bio- BP86/
nguyên tử C) Draw® cc-pVTZ//BP86/
TZVP
189.6 Cq C-20 H-21 189.8 193.7
173.0 Cq C-3 3
P1, H-3 1
173.1 175.7
171.3 Cq C-211 H-21, H-212 170.2 176.7
167.7 Cq C-5 H-4, H-4 1
150.3 168.3
161.7 Cq C-22 H-21 163.1 163.3
156.0 Cq C-2 H-21, H-4 164.6 160.8
154.2 Cq C-7 H-6, H-8 1
155.6 152.7
151.7 Cq C-12 H-11, H-13 1
146.6 154.6
148.2 Cq C-17 H-181 148.1 154.5
148.0 Cq C-10 H-9 1
148.7 147.5
146.4 Cq C-15 H-14 1
164.6 150.1
144.4 Cq C-14 H-131, 142, 136.6 147.5
H-16
142.5 Cq P3 P3a, P1 141.9 165.0
139.3 Cq C-9 H-8 , H-9 ,
1 2t
140.0 143.7
H-92c, H-11
135.8 Cq C-8 H-91, H-6, 136.8 138.1
H-81
134.4 Cq C-18 H-181, H-16 134.4 140.5
134.3 Cq C-13 H-13 , H-11,
1
138.4 139.9
H-141
132.2 Cq C-19 H-181 130.4 133.5
131.8 CH C-91 8.10 H-92t H-11, H-92c, 130.5 136.3
H-81
119.7 CH P2 5.19 P1 118.5 120.4
119.0 CH2 C-9 2
trans: 6.20 H-11, H-9 1
120.3 123.0
cis: 5.93
107.3 CH C-16 9.61 - 141, 181 86.5 107.3
106.5 Cq C-1 H-21 105.5 115.8
100.2 CH C-11 9.36 - H-91, H-92t, 119.5 105.6
H-131
92.9 CH C-6 8.44 - H-4, H-41, 117.6 96.4
H-81
66.5 CH C-21 6.19 - 65.6 72.8
61.5 CH2 P1 4.47 - 60.7 62.5
52.1 CH3 C-21 2
3.72 - - 52.0 54.3
51.8 CH C-3 4.14 H-4 H-21 48.1 59.0
50.2 CH C-4 4.50 H-6 H-6, H-31, 46.7 53.3
H-41

167
Hợp chất màu

Tín hiệu Loại Gán Tín hiệu 1H- Bằng chứng Bằng chứng C-NMR
13 C-NMR * và 15N-
13
13C-NMR NMR δ
nguyên (ghép cặp (NOE từ tín hiệu NMR ** tính toán
δ [ppm] tử C [ppm], J [Hz] HMBC từ proton sang dự đoán bởi hóa lượng tử
proton đến proton) Chem-Bio- BP86/
nguyên tử C) Draw® cc-pVTZ//BP86/
TZVP
40.6 CH2 P4 1.90 P2, P3a 39.3 48.1
40.3 CH2 P14 1.14 P16, P15 39.9 44.2
38.4 CH2 P8 1.22 P7a 37.7 43.1
38.3 CH2 P10 1.22 37.7 44.0
38.2 CH2 P12 1.22 37.7 46.0
37.6 CH2 P6 1.03 P7 37.8 44.7
33.8 CH P11 1.34 P11a 33.2 40.2
33.6 CH P7 1.34 P7a 33.3 40.4
31.2 CH2 C-3 2
a: 2.42 b: H-3 H-3 , H-21
2b
32.4 34.5
2.05
30.7 CH2 C-31 a: 2.57 b: H-4 H-21, H-3, 31.4 33.5
2.39 H-31b, H-21,
H-4, H-31a
28.9 CH P15 1.51 P16, P14 28.1 31.7
26.0 CH2 P5 1.36 P4 24.9 32.8
25.7 CH2 P9 1.30 P7, P11 24.6 32.8
25.4 CH2 P13 1.28 uncertain 24.3 32.0
24.0 CH3 C-41 1.74 H-4, H-6 H-4, H-3 23.6 26.3
23.1 CH3 P16 0.85 P15a, P15, P14 23.2 26.2
23.0 CH3 P15a 0.85 P16, P15, P14 23.2 20. 8
20.3 CH2 C-141 3.79 H-16, H-131, 19.7 23.7
H-142
20.1 CH3 P11a 0.79 P11, P10 21.0 18.1
20.0 CH3 P7a 0.83 P7, P8 21.0 18.6
18.1 CH3 C-142 1.73 H-141 H-16, H-141 15.6 20.9
16.3 CH3 P3a 1.59 P2 P1 16.0 18.1
12.6 CH3 C-8 1
3.34 - H-6, H-9 ,
1
11.8 12.3
H-92t
12.6 CH3 C-181 3.60 - H-16 12.6 12.6
11.3 CH3 C-131 3.29 - H-11, H-141 12.1 11.3
193.8 N N-25 214.4**
195.3 N N-23 211.7**
212.3 N N-24 228.2**
252.3 N N-26 274.7**

*chắn tham chiếu: TMS (Td) BP86/cc-pVTZ//BP86/TZVP, 181,447

**chắn tham chiếu:: NH3 (C3ν) BP86/cc-pvtz//BP86/TZVP, 259,338
Số màu đỏ xem câu hỏi G.

168
 Chlorophyll a

Phổ khối
Sự hóa hơi chưa phân hủy của chất diệp lục đã từng là một thách thức lớn
đối với việc làm sáng tỏ cấu trúc khối phổ. "trong chùm" -EI và các
phương pháp giải hấp phụ khác nhau (giải hấp plasma 252Cf, giải hấp
trường (FD), bắn phá nguyên tử nhanh (FAB), giải hấp laze) đã được sử
dụng. Tổng quan có thể được tìm thấy trong [23, 24]. Ngày nay, với
phương pháp tia điện đã có một phương pháp lý tưởng để khảo sát chất
diệp lục. Điều này được minh họa trên ví dụ chlorophyll a, nó đại diện cho
toàn bộ nhóm chất. Các nghiên cứu với HPLC-ESI MS / MS cũng đã
chứng minh là thành công trong việc làm sáng tỏ cấu trúc của các chất dị
hóa diệp lục mùa thu (phyllobilins) [25].

(a)

(b)

(c)

Hình. 2.5-23 Phổ khối lượng ESI (+) của dung

dịch chlorophyll a (a) <10–6 M trong
(d) acetonitril (b) máy tính tạo ra phân bố đồng vị
cho M+ (c) sau khi thêm 0,06% axit formic (d)
máy tính tạo ra phân bố đồng vị cho [M+H]+

Phép đo ESI (+) với dung dịch chlorophyll a <10–6 M trong acetonitril cho thấy dạng đồng vị điển hình của
ion phân tử M+, như được xác nhận bằng cách so sánh với phân bố đồng vị được tạo ra bằng máy tính (Hình
2.5-23). Khối lượng chính xác thực nghiệm của 892,5351 phù hợp với giá trị lý thuyết của
12C 1H 14N 16O 24Mg là 892,5348. Giữa m / z 1785 và 1791, bội số của M2+ được phát hiện với cường độ thấp
55 72 4 5
hơn, phù hợp với một hợp chất của một phân tử không tích điện và một phân tử ion hóa của chlorophyll a. Ở
nồng độ cao hơn, M2 + -ion có thể tăng cường độ và cuối cùng chiếm ưu thế trong phổ.
Sự hình thành các ion xảy ra bằng quá trình oxy hóa anốt trong bề mặt ESI chứ không phải bằng quá trình
proton hóa. Nếu thêm 0,06% axit fomic vào dung dịch chlorophyll a, thì sự thay đổi cường độ tương đối của
dạng pic xảy ra. Cường độ của tín hiệu với m/z 893,54 tăng lên so với cường độ của m/z 892,54 (Hình 2.5-23).
Điều này là do sự hình thành các ion [M+H]+ - bằng cách proton hóa chlorophyll a cạnh tranh với sự hình
thành các M+. -Ions, tạo ra một dạng đỉnh, trong đó dạng đồng vị của M+. (Hình 2.5 -23) và [M+H]+ (Hình
2.5-23) chồng lấp. Trong phép đo dẫn đến Hình 2.5-23, dạng phân bố tương ứng với tỷ lệ hỗn hợp M+:[M +
H]+ ≈ 2: 1.

169
Hợp chất màu

Phép đo các dung dịch đã axit hóa của chlorophyll a chứng tỏ một sự thay đổi đáng kể trong phổ ESI. Bắt đầu
bằng m/z 871,57 một bội số nữa có dạng đồng vị tương ứng với 55 nguyên tử C xuất hiện. Nó xảy ra bằng
cách chuyển vị proton của ion Mg2 + bởi hai proton và hình thành ion bán phân tử tương ứng bằng cách
proton hóa trong nguồn ion ESI. Trong một mẫu chlorophyll già, ion [M-Mg+3H]+ - được phát hiện mà
không bị axit hóa.

Hình 2.5-24 Phổ MS / MS của M +. -ion

từ chlorophyll a

Phổ MS / MS của M+. -Ion của chlorophyll a lúc đầu chỉ cho thấy một đoạn có m/z 614,24. Sau khi tăng năng
lượng va chạm, một ion mảnh tiếp theo có m/z 481,19 xuất hiện (Hình 2.5-24).

Hình 2.5-25 Phân cắt vết phytyl với sự hình thành m/z 614,24

Thành phần của hạt trung tính bị loại bỏ trong quá trình hình thành m/z 614,24, thu được từ các khối phân
giải cao, tương ứng với C20H38 và do đó vết phytyl trừ đi một nguyên tử H. Quá trình cơ bản có thể được mô
tả một cách thuyết phục với loại chất M+.- A, trong đó điện tích và gốc tự do được định xứ trên nhóm chức
este 33 (Hình 2.5-25).

170
 Chlorophyll a

Hình 2.5-26 Sự hình thành ion với m/z 481.19 bằng cách kích hoạt va chạm

Sự khác biệt về khối lượng giữa m/z 614,24 và mảnh có m/z 481,19, ngoài ra còn xuất hiện ở năng lượng va
chạm cao hơn, có thành phần nguyên tố là C5H9O4. Điều này tương ứng với tổng các nhóm thế vẫn còn trên
C-3, nhóm methoxycarbonyl trên C-21 và một nguyên tử H khác từ khung của chất diệp lục. Phát hiện này
cho phép chúng tôi phỏng đoán rằng sẽ không dễ dàng để hợp lý hóa quá trình phân mảnh. Điều kiện tiên
quyết để phân cắt gốc tự do C5H9O4. là sự hình thành liên kết giữa phần dư trên C-3 và nhóm metoxycacbonyl
trên C-21.
Đề xuất của chúng tôi bắt đầu với việc tách gốc tự do của nguyên tử H từ C-31. Trung tâm gốctuej do tiếp
theo tấn công nhóm cacbonyl (Hình 2.5-26) của nhóm thế trên C-21 thông qua một trạng thái chuyển tiếp
vòng sáu. Một gốc tự do ở tâm O hình thành, tách ra một nguyên tử H trên C-32. Gốc tự do được hình thành
như vậy sẽ lấy một nguyên tử H từ C-4. Do đó, một điều kiện khác, rằng nhóm tách loại phải chứa một
nguyên tử H từ khung của chất diệp lục, được đáp ứng. Sự phân cắt của C-3-C-31 được kết nối với chuyển vị-
H. Về nguyên tắc, vết C5H9O4 được hình thành. Sự phân cắt của nó có thể được thực hiện bởi sự chuyển vị
1,2-hydrua với sự hình thành liên kết đôi ion hóa giữa C-31-C-32 và sự phân cắt α gây ra điện tích tiếp theo.

4. Câu hỏi
A. Vitamin nào giống chlorophyll a và b và các vitamin khác nhau có vẻ
là một phức chất thiết yếu và ion kim loại nào là ion trung tâm của
nó?
B. Những điểm chung nào và sự khác nhau về nguyên tắc nào giữa liên
kết cộng hoá trị và liên kết cộng hoá trị phối trị (cộng hoá trị gốc)?
C. Động lực nào để cố định các -ion Mg2 + trong chlorophyll a và Fe2 +
trong haem b, xảy ra trong hemoglobin, myoglobin và cytochrom
P450?

171
Hợp chất màu
Hình 2.5-27 Lá của rượu vang nho
thông thường rất hấp dẫn và thường
được dùng để trang trí nhãn chai rượu.
172
D. Lớp sắc tố tổng hợp, có màu nào có cấu trúc liên quan đến cấu trúc của
diệp lục, loại haem và cực kỳ bền vững?
E. Mắt người có cơ quan thụ cảm màu nào? Từ màu nào chúng ta có thể
phân biệt các sắc thái nhất?
F. Tại sao quang phổ hấp thụ của Chl a và Chl b phải khác nhau như vậy?
G. Trong Bảng gán, rõ ràng là dữ liệu 13C được tính toán với sự hỗ trợ của
chương trình ChemBioDraw® phù hợp tốt với dữ liệu thử nghiệm. Chỉ các
giá trị được đánh dấu màu đỏ cho C-5, C-2, C-15, C-16, C-11 và C-6 cho
thấy độ lệch mạnh bất thường. Giải thích tại sao lại như vậy.
H. Trong chlorophyll b, nhóm CH3 C-131 được thay thế bằng một nhóm
formyl. Trong phổ proton, thứ tự của các tín hiệu từ H-16 và H-11 được
thay đổi. Tại sao?
I. Tính toán với sự trợ giúp của sự phong phú tự nhiên của các đồng vị
cacbon và magiê, dạng đồng vị đối với M+. của chlorophyll a. 12C (98,93),
13C (1,07%), 24Mg (78,99%), 25Mg (10,0%), 26Mg (11,01%).
J. Sự mở vòng của xiclopentenon ở điều kiện bazơ thuộc loại phản ứng
nào?
5. Tài liệu tham khảo
[1] B. Grimm, R. Porra, W. Rüdiger, H. Scheer (Ed.) "Chlorophylls and
Bacteriochlorophylls: Biochemistry, Biophysics, Functions and Appli-
cations", vol. 25 of the series: Advances in Photosynthesis and Respi-
ration, 1. edition, Springer Verlag, Dordrecht 2006; "Chlorophylls" H.
Scheer (Ed.) CRC Press Boca Raton 1991.
[2] P. J. Pelletier, J. B. Caventou "Sur la Matiere verte des Feuilles" An-
nales de Chimie et de Physique 1818, 9, 194–196.
[3] a) M. Tswett "Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode.
Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls" Ber. Dtsch. Botan.
Ges. 1906, 24, 384–393; b) M. Tswett "Das sogenannte »krystallisi-
erte Chlorophyll« - ein Gemisch", Ber. Dtsch. Chem. Ges. 1910, 43,
3139–3141.
[4] H. Fischer "Fortschritte der Chlorophyllchemie" Naturwissenschaften
1940, 28, 401–405.
[5] H. Brockmann jr. "Die absolute Konfiguration der Chlorophylle a und
b" Liebigs Ann. Chem. 1971, 754, 139–148.
[6] R. B. Woodward, W. A. Ayer, J. M. Beaton, F. Bickelhaupt, R. Bonnett,
P. Buchschacher, G. L. Closs, H. Dutler, H. Hannah, F. P. Hauck, S. Ito,
A. Langemann, E. LeGoff, W. Leimgruber, W. Lwowski, J. Sauer, Z.
Valenta, H. Voltz "The total synthesis of chlorophyll" J. Amer. Chem.
Soc. 1960, 82, 3800–3802.
[7] P. H. Hynninen, M. Wasiewleski, J. J. Katz "Chlorophylls VI. Epi-
merization and Enolization of Chlorophyll a and its Magnesium free
derivatives" Acta Chem. Scand. 1979, B33, 637–648.
 Chlorophyll a

[8] J. Lutomski, H. Speichert "Die Brennessel in Heilkunde und Er-

nährung" Pharm. Unserer Zeit 1983, 12, 181–186.
[9] K. Iriyama "A rapid and convenient method for purification and isola-
tion of chlorophyll a from porphyra yezoensi" Biochem. Biophys. Res.
Comm. 1978, 83, 501–505.
[10] Y. Ito, M. Weinstein, I. Aoki, R. Harada, E. Kimura, K. Nunogaki "Coil
Planet Centrifuge" Nature 1966, 212, 985.
[11] G. F. Pauli, S. M. Pro, J. B. Friesen "Countercurrent Separation of Nat-
ural Products" J. Nat. Prod. 2008, 71, 1489–1508.; J. B. Friesen, J. B.
McAlpine, S.-N. Chen, G. F. Pauli, Countercurrent Separation of 598
Natural Products: An Update, J. Nat. Prod. 2015, 78, 1765–1796.
[12] C. Jubert, G. Bailey "Isolation of chlorophylls a and b from spinach by
counter-current chromatography" J. Chromatography A 2007, 1140,
95–100.
[13] H. Scheer "Structure and Occurence of Chlorophylls" in "Chloro-
phylls" H. Scheer (Ed.) CRC Press Boca Raton 1991, 3–30.
[14] A. J. Hoff, J. Amesz "Visible Absorption Spectroscopy of Chloro-
phylls" in "Chlorophylls" H. Scheer (Ed.) CRC Press Boca Raton
1991, 723–738.
[15] C. Houssier K. Sauer "Circular Dichroism and Magnetic Circular Di-
chroism of the Chlorophyll and Protochlorophyll Pigments" J. Amer.
Chem. Soc. 1970, 92, 779–791.
[16] M. Lutz, W. Mäntele "Vibrational Absorption Spectroscopy of Chlo-
rophylls" in "Chlorophylls" H. Scheer (Ed.) CRC Press Boca Raton
1991, 855–902.
[17] R. J. Abraham, A. E. Rowan "NMR Spectroscopy of Chlorophyll" in
"Chlorophylls" H. Scheer (Ed.) CRC Press Boca Raton 1991, 797–
Hình 2.5-28 Rừng sồi ở hồ Stechlin
834.
[18] S. Lötjönen, T. J. Michalski, J. R. Norris, P. H. Hynninen "High-Field
Proton NMR Study of the Liquid Solution Structure of Monomeric
Bacteriochlorophyll a and Chlorophyll a" Mag. Reson. Chem. 1987,
25, 670–674.
[19] S. Lötjönen, P. H. Hynninen "Complete Assignment of the Carbon-13
NMR Spectrum of Chlorophyll a" Org. Mag. Reson. 1981, 16, 304–
308.
[20] S. Lötjönen, P. H. Hynninen "Carbon-13 NMR Spectra of
Chlorophyll a, Chlorophyll a', Pyrochlorophyll a and the Correspond-
ing Pheophytins" Org. Mag. Reson. 1983, 21, 757–765.
[21] N. Risch, H. Brockmann "Chlorophyll 6. Totalzuordnung des
13
C-NMR-Spektrums" Tetrahedron Lett. 1983, 24, 173–176.
[22] S. G. Boxer, G. L. Closs, J. J. Katz "The Effect of Magnesium Coordi-
nation on the 13C and 15N Magnetic Resonance Spectra of Chlorophyll
a. The Relative Energies of Nitrogen nπ* States as Deduced from a
Complete Assignment of Chemical Shifts" J. Amer. Chem. Soc. 1974,
96, 7058–7066.

173
Hợp chất màu

[23] J. E. Hunt, T. J. Michalski "Desorption-Ionization Mass Spectrometry

of Chlorophylls" in "Chlorophylls" H. Scheer (Ed.) CRC Press Boca
Raton 1991, 835–853.
[24] M. J. Dale, K. F. Costello, A. C. Jones and P. R. R. Langridge-Smith
"Investigation of Porphyrins and Metalloporphyrins Using Two-step
Laser Mass Spectrometry" J. Mass Spectr. 1996, 31, 590–601.
[25] T. Müller, S. Vergeiner, B. Kräutler "Structure elucidation of chlo-
rophyll catabolites (phyllobilins) by ESI-mass spectrometry – Pseu-
domolecular ions and fragmentation analysis of a nonfluorescent chlo-
rophyll catabolite (NCC)" Int. J. Mass Spectr. 2014, 365–366, 48–55.
[26] This article was first published by A. Klaproth, M. Najdanova, M.
Minceva, D. Sicker, H.-U. Siehl, K.-P. Zeller, S. Berger "Am grünen
Ursprung des Lebens: Chlorophyll" Chem. Unserer Zeit 2016, 50,
260–274.

Hình 2.5-29 Một lá của Gunnera

manicata, được gọi là đại hoàng khổng
lồ Brazil hay thức ăn cho khủng long, là
một trong những lá lớn nhất được biết
đến. Đường kính 1 m là phổ biến. Mặt
dưới của nó được bao phủ bởi gai. Có
nguồn gốc từ Nam Mỹ, mẫu vật này là
từ Vườn Bách thảo Jena, Đức.

174