TIBBİ BİYOKİMYA LABORATUVARI

NİTEL KARBOHİDRAT ANALİZLERİ

DERS NOTU
2022-2023
 NİTEL KARBOHİDRAT ANALİZLERİ
Karbohidratlar yapılarında fonksiyonel grup olarak aldehid veya keton grupları içeren
polihidroksi alkollerdir.
Monosakkaritler: En basit ve hidroliz edilemeyen şekerlerdir. Karbon sayılarına ve içerdikleri
fonksiyonel gruba göre isimlendirilirler.
Aldoz Ketoz
Trioz Gliseraldehid Dihidroksiaseton
Tetroz Eritroz Eritrüloz
Pentoz Riboz, Ksiloz Ribüloz, Ksilüloz
Heksoz Glukoz, Galaktoz, Mannoz Fruktoz

Disakkaritler: İki monosakkarit biriminin birbirine farklı pozisyonlarda glikozid bağıyla

bağlanmasıyla oluşan şekerlerdir.
Polisakkaritler: 10’dan daha çok sayıda monasakkarit biriminin birleşmesiyle oluşan
karbohidratlardır. Nişasta ve glikojen homopolisakkarittir.
Karbohidratların nitel analizi prensiplerine göre gruplara ayrılabilir:
1. Karbohidratlara derişik asitlerin etkisi (furfural oluşumu) : Karbohidratlar, oksitleyici
olmayan mineral asitlerle reaksiyona girdiklerinde 3 molekül su kaybederek dehidrate olurlar
ve furfural ya da hidroksimetil furfural ismi verilen bileşikler meydana getirirler. Bu türevler,
çeşitli polifenollerle kondanse olarak renkli bileşik oluştururlar. Bu renk reaksiyonları ile bir
çözeltide bulunan karbohidratların nitel analizi yapılabilir.
Molish deneyi, Seliwanoff deneyi, Bial deneyi
2. Karbohidratlardaki aldehid ve keton gruplarının derişik alkali ve ısı etkisiyle
kondensasyonu: Moore deneyi
3. Karbohidratlardaki aldehid ve keton gruplarının fenilhidrazinle reaksiyonu
Ozazon oluşumu
4. Monosakkaritlerin disakkaritlerden ayrılması: Barfoed deneyi
5. Karbohidratlara özgü indirgeme deneyleri: Karbohidratların yapısında bulunan serbest
aldehid ya da keton gruplarının indirgeyici özelliğine dayalı deneylerdir. Alkali ortamda ısı
etkisiyle bu gruplar, ortamda bulunan ağır metal iyonlarını (Cu+2, Bi+3 vb) indirgerler. Bu
indirgeme olayı renk değişikliği ile beraberdir.
Fehling deneyi, Benedict deneyi

MOLİSCH DENEYİ
Prensip: Polisakkaritlerin derişik H2SO4 ile hidrolizi monosakkaritleri verir. Bunların da
dehidratasyonu sonucu furfural bileşiği oluşur. Bu reaksiyon, furfural bileşiğinin α-naftol ile
kondense olarak renkli bir hale geçmesi temeline dayanır. Bu reaksiyon karbohidratların genel
reaksiyonu olarak bilinir. Spesifik bir test olmamakla beraber negatif sonuç ortamda
karbonhidrat bulunmadığını gösterir. Karbohidrat ister serbest isterse diğer organik
maddelerle (örneğin proteinlerle) bileşik halde olsun, bu reaksiyon karbohidrat içeren
maddelerle pozitif sonuç verir. Karakteristik olan kırmızı-menekşe renktir. Dörtten fazla
karbon içeren monosakkaridler (glukoz, arabinoz, galaktoz, mannoz vb.) disakkaridler
(sakaroz, laktoz, mantoz vb.) ve polisakkaridler (glikojen, nişasta vb.) pozitif sonuç verirler.
4’ ten az karbon içeren monosakkaridlerle, türev monosakkaridlerden amino şekerler,
bunlardan türeyen polisakkaridler bu reaksiyonu vermezler. Bu reaksiyon idrarda şeker
aranması için kullanılmaz.
Ayıraçlar: 1. Derişik H2SO4
2. Glukoz, nişasta çözeltileri (%1)
3. α-nafrol ayıracı (%10): 5 gr α-naftol 100 ml. alkolde (%95 lik) çözülerek
hazırlanır.
Deneyin Yapılışı: Bir tüpe 2 ml şeker çözeltisi konur. Üzerine 2 damla α-naftol ayıracı
katılarak iyice çalkalanır. Bundan sonra tüp eğilerek kenarından, iki sıvı tabaka yapacak
şekilde 2 ml kadar derişik H2SO4 sızdırılır. Böylece 2 tabaka oluşur. İki tabaka arasında
kırmızı menekşe renkli bir halkanın görülmesi reaksiyonun pozitif olduğunu gösterir.
İYOT DENEYİ
Prensip: İyot, polisakkaritlerle renkli kompleksler oluşturur. Nişasta, iyotla mavi-mor bir
renk verirken glikojenle kırmızı renk verir.

Ayıraç (Lugol solüsyonu): 100 ml distile su içinde 10 gr KI eritilir. KI tamamen eridikten

sonra üstüne 5 gr iyot eklenir. İyot parçacıkları tamamen eriyene kadar karıştırılır.

Deneyin Yapılışı: 3 ml karbonhidrat çözeltisine birkaç damla iyot ayıracından damlatılır.

Mavi-mor renk nişasta, kırmızı renk glikojenin varlığını gösterir.
BİAL DENEYİ
Prensip: Pentozlara özgü bir deneydir. Pentozlar konsantre HCl ile ısıtıldığında furfural
oluştururlar. Bu da demir iyonları varlığında orsinolle kondanse olarak mavi-yeşil renk
oluşturur.
Ayıraç: Bial ayıracı: 0,3 gr orsinal, 100 ml derişik HCI içinde çözülür. Üzerine % 1’lik
demir-3- klorür çözeltisinden 3 ml ilave edilir.
Deneyin Yapılışı: Bir deney tüpündeki 5 ml bial ayıracı üzerine 2 ml numune eklenir. 1 dk
kaynatılır. Mavi-yeşil rengin oluşması pentozların varlığını gösterir.
SELİWANOFF DENEYİ
Prensip: Ketozlara özgü bir deneydir. Reaksiyon sırasında HCI etkisiyle fruktozdan 4-
hidroksimetil furfural oluşur. Bu da, rezorsinol ile birleşerek kırmızı bir bileşik oluşturur.
Ayıraç: Seliwanoff ayıracı: İhtiyaca göre 3 mol/L HCl hazırlanır. Oran 0.5 gr/L olacak
şekilde rezorsinol, hazırlanan HCl çözeltisinde çözülür.
Deneyin Yapılışı: 2 damla karbohidrat solüsyonu (%1’lik glikoz ve fruktoz çözeltisi) üzerine
2 ml seliwanoff reaktifi ilave edilir ve kaynar su banyosunda 1 dk ısıtılır. Kırmızı renk
oluşması fruktoz varlığını gösterir.
MOORE DENEYİ
Prensip: Isı etkisiyle alkali ortamda glukoz veya fruktoz gibi şekerlerin serbest aldehid ve
keton gruplarının birleşmesiyle oluşan polimer yapıdaki maddelerin renk değişikliğine neden
olması esasına dayanır. Farklı tondaki koyu renkler ve karamel kokusu birleşme sırasında bazı
moleküllerin parçalanmasından ileri gelir.
Ayıraçlar: % 40 lık NaOH çözeltisi
Deneyin yapılışı: Deney tüpüne bir miktar şeker çözeltisi konur. Üzerine yarısı kadar derişik
alkali katılarak iyice karıştırılır. Tüp kaynatılır. Çözeltinin renginin önce sarardığı sonra
koyulaştığı kaynatma sürdürüldüğünde ise rengin kahverengi hatta siyaha döndüğü görülür.
OSAZON DENEYİ
Prensip: Karbohidratlardaki aldehid ve keton gruplarının fenil hidrazinle oluşturdukları
reaksiyondur. Serbest aldehid ve keto grubu taşıyan şekerler, fenil hidrazinle ısıtıldıklarında
osazon adı verilen sarı renkli kristal bileşikler teşekkül eder. Osazonların kristal şekilleri,
erime noktaları ve çökelme zamanları farklıdır. Böylece şekerlerin türü belirlenebilir ve
birbirlerinden ayrılabilmesi sağlanır. Osazon deneyi en çok idrardaki indirgen şekerin cinsinin
(glikoz mu, laktoz mu) tespitinde kullanılmaktadır. Glukozazon kristalleri yelpaze şeklinde ya
da çam dalları görünümünde ince iğneler, laktozazon kristalleri ise ortaları kahverenginde
koyu, saçakları açık ve parlak iğneler şeklinde görünürler.
Ayıraçlar: 1. Katı fenilhidrazin klorhidrat, Katı Na-asetat, Asetik asit (%30)
2. Glukozlu veya laktozlu örnek (%10)

Deneyin Yapılışı: Bir miktar örnek alınır, damla damla asetik asit katılarak asitlendirilir. Ayrı
bir tüp içine 1 cm yükseklikte katı Na-asetat, onun üzerine 1 cm. aynı yükseklikte katı fenil
hidrazin klor hidrat konur. Bunun üzerine tübün yarısına kadar asitlendirilmiş örnek katılarak
ısıtılır ve katı maddeler eritildikten sonra 30 dakika kaynar su banyosunda tutulur. Tüp sudan
çıkarılarak soğumaya bırakılır. Dipte toplanan kristallerden alınan örnekler mikroskopta
incelenir.

BARFOED DENEYİ

Prensip: Barfoed reaktifi zayıf asidik olup yalnızca monosakkaritler tarafından indirgenir.
Böylece bu deney monosakkaritlerin disakkaritlerin ayırt edilmesine olanak sağlar.
Ayıraç: 9 gr bakır asetat 100 ml distile suda çözülerek üzerine 1,2 ml glasiyel asetik asit
katılır ve karıştırılır.
Deneyin yapılışı: Monosakkarit ve disakkarit çözeltilerinde 1’er ml alınır ve tüplere konur.
Daha sonra tüplerin üzerine Barfoed ayıracından 3’er ml konur ve tüpler aynı anda kaynar su
banyosuna daldırılır. Birkaç dakika su banyosunda tutulur. Kırmızı-turuncu rengin ya da
çökeleğin görülmesi çözeltide monosakkarit olduğunu gösterir. Aynı koşullarda disakkarit
içeren tüpün renginde ise bir değişiklik görülmez.
FEHLİNG DENEYİ
Prensip: Olay bir oksido – redüksiyondur. Şekerlerin yapısında bulunan serbest aldehid ya
da keton gruplarının indirgeyici özelliğine dayalı deneydir. Aldehid ve keton grupları, alkali
ortamda ısı etkisiyle bakır iyonunu indirger. Bu indirgeme sonucunda tüpteki mavi renk, sarıya
döner. Sarı renkli CuOH (bakır (I) hidroksit), ısıtılmaya devam edildiğinde kırmızı renkli Cu 2O
(bakır (I) oksit)’e dönüşür. Oluşan sarı ve kırmızı renkteki bileşikler nedeniyle tüpte turuncu renk
görülür. Bu arada şekerin kendiside oksitlenir.
Bakır (II) hidroksit bakır (I) hidroksit bakır (I) oksit
Cu(OH)2 CuOH Cu2O
mavi sarı çökelti kırmızı çökelt
Ortamda şeker yoksa ısıtma sonunda tüpte mavi renk değişmez.
Serbest aldehid grubu bulunan disakkaritler de Fehling deneyinde pozitif sonuç verir. Sakkaroz,
bir glikozun aldehid grubu ile fruktozun keto grubunun kondansasyonuyla oluşur (1,2 glikozid
bağı). Sakkaroz, serbest aldehid veya keton grubu bulunmadığından Fehling ayıracına etki etmez.
Ancak iki damla derişik HCl eklendikten sonra kaynatılırsa hidrolize uğrayarak heksozlarına
ayrılır ve bu nedenle de bakırı indirger. Reaksiyon sonucu oluşan kırmızı renkli erimez Cu2O,
pozitif reaksiyonun göstergesidir. Fehling testi spesifik bir test değildir. Aldehidler, fenoller,
aminofenoller, ürik asit, katekol, formik asit, rezorsinol gibi birçok bileşik bu ayıraçla pozitif
reaksiyon verir. Deney idrarda şeker tayininde kullanılır.
Ayıraçlar: Fehling 1: 34,6 gr bakır sülfat distile suyla çözüldükten sonra son hacim 500 ml
ye tamamlanır.
Fehing 2: 35 gr sodyum potasyum tartarat, 10 gr sodyum hidroksit distile suyla
çözüldükten sonra son hacim 100 ml tamamlanır.
Ayıraçtaki tartarat, alkali ortamda Cu 2+ iyonlarının çözünürlüğünü sağlayarak Cu(OH)2 halinde
çökmelerini engeller.
Deneyin Yapılışı: Deney tüpüne 1ml Fehling I ve 1 ml Fehling II konur ve kaynatılır.
Bulanıklık olursa ayıraç bozulmuştur, kullanılmaz. Bulanıklık olmazsa, üzerine damla damla
numune (idrar olabilir) konur ve kaynatılmaya devam edilir. Şeker varlığında sarı bulanıklık
ya da çökelti görülür. Renk oluşmazsa yani şeker miktarı az olan numune, ayıraç miktarına
eşit oluncaya kadar eklemeye devam edilir. Sarı veya kırmızı çökelti oluşursa numunede şeker
vardır.
BENEDİCT DENEYİ
Prensip: Reaksiyonun temeli Fehling deneyindeki gibidir. Fehling deneyine bir üstünlüğü de
uygun yapıldığında meydana gelen çökelti renginin, incelenen örnekteki (örn: idrar) şeker
miktarını kabaca belirtme olanağı vermesi (semikantitatif) dir. Glukoz, sıcak alkali ortamda
Cu+2 iyonlarını Cu+1 halinde indirger. Sonuçta sarı renkli CuOH veya kırmızı renkli Cu2O
oluşur.
Ayıraç: Benedict Ayıracı: 17,3 gr CuSO4.5H2O 100 mL distile suda çözülür. Başka bir
beherde 173 gr sodyum sitrat ve 100 gr sodyum karbonat ısıtılmak suretiyle distile suda
çözülür ve soğutulur. Soğuduktan sonra bakır sülfat çözeltisiyle karıştırılır. Son hacim 1 L’ ye
tamamlanır. Bu ayıraç oldukça stabildir.
Deney: Bir deney tüpüne 5 ml benedict ayıracı konur, üzerine 8-10 damla incelenecek örnek
katılır ve çalkalanır. 5 dk iyice kaynatılır şeker varsa, bulunan miktar ile orantılı olarak mavi
rengin yeşil, sarı ya da kırmızıya değiştiği görülür. Soğumaya bırakılır. Sarı ya da tuğla
kırmızısı bir çökelti dibe çöker. İdrarda şeker yoksa çözeltinin rengi değişmez. Glukoz
miktarının çok düşük olması halinde bile çökelti meydana gelir. Pozitif deneylerde çökeltinin
miktarına göre idrardaki şeker miktarı hakkında kabaca bilgi edinilebilir.
Sıvı yeşil bir renk almışsa eser miktar, sarı renkli ise az miktarda, kırmızı renkli ise çok
miktarda şeker var demektir.