Chương 2: Enzyme

Năng lượng được giải phóng ra phản ứng exergonic yêu cầu 1 lượng năng lượng năng lượng
input

Thậm chí các phản ứng exergonic hoặc kể cả các phản ứng tự phát cần được cung cấp 1 lượng
năng lượng ( input energy) để có thể diễn ra trước khi chúng diễn biến đến bước giải phóng ra
năng lượng

Tại sao là phản ứng exergonic cần được cung cấp năng lượng (input energy) để diễn ra?

Để phản ứng diễn ra thì 1 vài hoặc tất cả các liên kết trong chất tham gia phản ứng phải cần được
bẻ gãy để hình thành liên kết mới để đưa các liên kết lên trạng thái cho phép chúng được bẽ gãy
thì các phân tử phải bị biến dạng hoặc uốn cong đến một trạng thái không ổn định được gọi là
trạng thái chuyển tiếp

1.Năng lượng hoạt hóa (Activation energy)

Trạng thái chuyển tiếp (Transition state)

Trạng thái chuyển tiếp là 1 thời điểm nhanh của

phân tử mà tại đó có những sự kiện như sự bẻ gãy
liên kết, hình thành liên kết và phát triển điện tích
được diễn biến đến đúng thời điểm mà tại đó sự
phân ra thành cơ chất hoặc sản phẩm là như nhau.

Trạng thái chuyển tiếp là 1 trạng thái có mức năng

lượng cao vì vậy 1 lượng năng lượng cần phải
được cung cấp để phân tử đạt trạng thái đó và lượng năng lượng đó được gọi là năng lượng hoạt
hóa (∆Gǂ).

2. Activation energy and reaction rate

Năng lượng hoạt hóa (NLHH) là rào cản năng lượng của các phản ứng hóa học. Tuy nhiên các
rào cản này rất quan trọng đối với sự sống

Tại sao NLHH lại quan trọng? (Tại sao rào cản năng lượng lại quan trọng?)
Nếu không có NLHH thì những cấu trức phức tạp, bậc cao cũng như những con đường trao đổi
chất của tế bào không thể tồn tại được.

VD: Da, tóc, móng vừa được hình thành lại bị phân hủy thì con người sẽ không thể tồn tại.

Năng lượng hoạt hóa càng cao thì tốc độ phản ứng xảy ra càng chậm.

Rất nhiều phản ứng hóa học có NLHH cao đến nổi chúng hầu như không xảy ra nếu như không
cung cấp năng lượng.

VD: ethanol khi cung cấp nhiệt lượng thì phân tử ethanol sẽ tăng chuyển động, tăng lực va chạm
khi đó liên kết hóa học bị uốn cong, bẻ gãy và giải phóng ra năng lượng, năng lượng đó cung cấp
cho các phân tử ethanol khác, gây ra phản ứng dây chuyền; đốt cháy nhiên liệu propane

Nguồn NLHH thường là nhiệt với các phân tử cơ chất sẽ hấp thụ nhiệt năng từ môi trường xung
quanh làm tăng tần số lực va chạm và các liên kết bị xô đẩy uốn cong

NLHH của hầu hết các phản ứng hóa học bên trong tế bào cũng cao đến nổi để mà nó có thể diễn
ra một cách đáng kể ở nhiệt độ phòng.

 Quá trình đẩy nhanh phản ứng bằng cách giảm NLHH được gọi là quá trình xúc tác
(catalysis)
 Tác nhân được thêm vào để giảm NLHH (chất không phải cơ chất) được gọi là chất xúc
tác catalyst (chất xúc tác).
 Chất xúc tác có bản chất sinh học (do sinh vật tổng hợp): enzymes

Trong quá trình tiến hóa, các enzyme đã được phát triển để giảm NLHH một cách có chọn lọc
cho các phản ứng cần thiết cho sự sống.

3.Giới thiệu về enzyme

Enzymes có bản chất là protein giúp làm tăng tốc độ phản ứng trong tế bào. Nếu không có
enzyme thì phản ứng vẫn diễn ra nhưng rất chậm để duy trì sự sống.

 Mỗi enzyme có một trung tâm hoạt động nơi mà cơ chất sẽ gắn với enzyme tại trung tâm
hoạt động
  Enzyme có tính đặc hiệu cơ chất.( khả năng chọn lọc phản ứng xúc tác): mỗi enzyme chỉ
xúc tác cho 1 phản ứng nhất định, thậm chí chỉ xúc tác cho một phản ứng duy nhất

 Enzyme có thể tái sử dụng được: một phân tử enzyme có thể xúc tác chuyển hóa cho
hàng ngàn phân tử cơ chất

Enzyme là những protein đặc biệt và nổi bật.

+ Enzymes có hoạt lực xúc tác mạnh mẽ.

+ Có tính đặc hiệu cơ chất ( khả năng chọn lọc phản ứng xúc tác): mỗi enzyme chỉ xúc tác
cho 1 phản ứng nhất định, thậm chí chỉ xúc tác cho một phản ứng duy nhất

+ Enzyme là trung tâm của mọi chuyển hóa hóa sinh, enzyme xúc tác cho hàng trăm các
phản ứng phân giải hợp chất dinh dưỡng, bảo tồn và chuyển hóa NLHH và sinh tổng hợp các đại
phân tử từ những tiền chất nhỏ hơn đơn giản hơn..

Các nghiên cứu về enzymes có tầm quan trọng thực tiễn to, là công cụ quan trọng trong ngành
CNTP, CNHH..

4. Hầu hết enzymes là proteins

Tất cả enzyme là protein tuy nhiên có một số ngoại lệ một vài phân tử RNAs có khả năng xúc
tác.

Hoạt tính xúc tác của enzyme phụ thuộc vào tính toàn vẹn của cấu trúc protein

Hoạt tính xúc tác sẽ luôn bị mất đi nếu enzyme bị biến tính hoặc phân ly thành các tiểu đơn vị.

→ Cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3, bậc 4 của protein enzyme rất cần thiết đối với hoạt tính xúc tác
của nó.

Trọng lượng phân tử: 12.000 - 1.000.000.

Protein được cấu tạo từ các axit amin bằng liên kết peptide.

•Cấu trúc bậc 1: trình tự sắp xếp của các axit amin trên chuỗi polypeptide.

•Cấu trúc bậc 2: xoắn α và gấp nếp β .

 •Cấu trúc bậc 3: xoắn α và gấp nếp β cuộn thành từng búi có hình lập thể đặc trưng của
từng loại protein.

•Cấu trúc bậc 4: bao gồm các cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc 3.

Enzyme cofactors (cofactor là hợp chất hỗ trợ cho hoạt lực enzyme, coenzyme là 1 loại của
cofactor):

Là một hoặc một vài ion kim loại, chẳng hạn như Fe2 +¿¿, Mg 2+¿¿ , Mn 2+¿¿, Zn2+¿¿ .

Nếu không phải ion vô cơ mà là hợp chất hữu cơ không phải protein được gọi là: Coenzymes:

 Là phân tử hữu cơ nhưng không phải protein.

 Đóng vai trò là những chất vận chuyển tạm thời của nhóm chức nào đó.

 Hầu hết là có dẫn xuất từ vitamins.

Một số enzymes bắt buộc cần có một coezyme và một hoặc nhiều hơn một ion kim loại cho hoạt
tính xúc tác.

Nhóm ngoại (prosthetic group) là một coenzyme hoặc ion kim loại mà liên kết rất chặt chẽ hoặc
liên kết cộng hóa trị với thành phần protein enzyme.

Bảng 6-1: Ví dụ một số ion vô cơ đóng vai trò cofactor cho enzyme

Bảng 6-2: 1 số coenzyme đóng vai trò chất vận chuyển nhóm chức tạm thời
Khi cofactor gắn với enzyme tại trung tâm hoạt động thì enzyme trở nên hoàn chỉnh
(holoenzyme)

Holoenzyme: là một enzyme có hoạt lực xúc tác hoàn chỉnh, có cấu tạo bởi apoenzyme gắn với
coenzyme và/ hoặc ion kim loại.

Apoenzyme hoặc apoprotein: Thành phần protein của các enzyme này (holoenzyme)

5. Enzymes được phân loại dựa trên các phản ứng chúng xúc tác:
 Nhiều enzymes được đặt tên bằng cách thêm hậu tố “-ase” vào tên cơ chất của chúng hoặc vào
đuôi của từ hoặc cụm từ mô tả hoạt tính xúc tác của chúng.

- Urease: enzyme xúc tác cho sự thủy phân Ure.

- DNA polymerase: enzyme xúc tác phản ứng polymer hóa DNA.

Các enzymes khác được đặt tên bởi những người tìm ra chúng, trước khi phản ứng xúc tác được
biết tới. VD: pepsin, lysozyme

Đôi khi 1 enzyme giống nhau có 2 hoặc nhiều tên, hoặc 2 enzymes có cùng tên.

→Tên phân loại quốc tế của enzyme (International Classification of Enzymes)

Hệ thống đặt tên và phân loại enzyme

Hệ thống này chia enzyme thành 6 lớp lớn, mỗi lớp có nhiều tổ (subclasses) dựa vào kiểu phản
ứng mà nó xúc tác

Bảng 6-3: Tên phân loại quốc tế của enzyme

Lớp Tên lớp Kiểu phản ứng xúc tác Tổ

dehydrogenase, oxidase,
Vận chuyển electron (ion hydride và H). Xúc
1 Oxidoreductases oxigenase reductase,
tác phản ứng oxy hóa khử sinh học.
peroxidase, hydroxylase
2 Transferases Vận chuyển nhóm ngoại phân tử, vận chuyển Transcarboxylase,
nhóm từ phân tử này đến phân tử khác. Ví dụ transaminase,
của các nhóm chức được vận chuyển là amino, transmethylase
carboxyl, carbonyl, methyl, phosphoryl, acyl.
Tên thông thường của các enzyme này thường
 bắt đầu bằng trans
Xúc tác phản ứng thủy phân, vận chuyển esterase, phosphatase,
3 Hydrolases
nhóm chức đến H2O . peptidase
Xúc tác cho sự bẻ gãy liên kết C-C, C-O, C-N
và những liên kết khác bằng phương pháp loại decarboxylases, hydratase,
4 Lyases
trừ. Để lại liên kết đôi hoặc vòng hoặc thêm dehydratases, deaminase
nhóm vào liên kết đôi ( H2O, CO2, NH3)
Epimerases: chuyển đổi
các nguyên tử carbon bất
Vận chuyển nhóm nội phân tử để tạo các dạng
5 Isomerases đối xứng
đồng phân. Sugars, isomerase.
Mutases: xúc tác vận
chuyển nhóm nội phân tử
Xúc tác hình thành liên kết C-C, C-O, C-S, C-
N bằng các phản ứng trùng ngưng, kết hợp với
6 Ligases Synthetase, carboxylase
sự phân giải ATP hoặc các cofactor tương
đương.

Mỗi enzyme được quy ước theo số phân loại gồm 4 phần và một tên hệ thống, khi xác định phản
ứng nó xúc tác.

ATP + D-glucose → ADP + D-glucose 6-phosphate

→Tên hệ thống: ATP : glucose phosphotransferase (xúc tác chuyển 1 nhóm phosphoryl từ
ATP đến glucose)

→E.C number: EC.2.7.1.1

 (2): Tên lớp ( transferase)

 (7): Tổ (Phosphotransferase)
 (1): Phosphotransferase có nhóm OH đóng vai trò là chất nhận (nhận phosphoryl
từ ATP đến glucose)
 (1): D-glucose là nhóm nhận phosphoryl

→Tên phổ biến (trivial name): hexokinase

6. Cách hoạt động của enzymes (How enzyme work)

-Một phản ứng enzyme đơn giản có thể được viết:

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

•E: Enzyme

•S: cơ chất (gắn với enzyme tại trung tâm hoạt động)

•P: sản phẩm

•ES, EP: Phức chất chuyển tiếp của E với S hoặc phức chất chuyển tiếp của E và với P

Một phản ứng do enzyme xúc tác tại 1 ” túi” xác định trên enzyme gọi là trung tâm hoạt động
( active site).

Vai trò của enzyme là giảm năng lượng hoạt hóa từ đó tăng tốc độ phản ứng từ 105- 1017

Chất xúc tác không làm thay đổi cân bằng phản ứng. (phản ứng tự phát vẫn là tự phát)

Trung tâm hoạt động (active site):

Là khu vực gắn với cơ chất và cofactor nếu có. Đây là một rãnh không gian 3 chiều được tạo bởi
các nhóm chức đến từ các phần khác nhau của chuỗi acid amin. Trung tâm hoạt động chỉ chiếm
một phần rất nhỏ so với tổng thể tích của enzyme

Cơ chất sẽ được giữ lại ở trung tâm hoạt hoạt động bởi các tương tác yếu (liên kết hidro, tuowng
tác kị nước, liên kết ion,…) yếu để tạo phức ES.

 Năng lực xúc tác và tính đặc hiệu cơ chất của E được quyết định bởi:
Nguyên tắc 1: Có sự hình thành các liên kết cộng hóa trị tạm thời giữa cơ chất và các nhóm chức
hoạt động của enzyme (mạch bên của acid amin hoặc chính là ion kim loại hoặc coenzyme) hoặc
sự chuyển nhóm tạm thời từ cơ chất đến Enzyme.

→ Tương tác cộng hóa trị giữa enzymes và cơ chất làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng
bằng cách tạo ra một đường hướng phản ứng thay thế có năng lượng hoạt hóa thấp hơn.

Nguyên tắc 2: Sự hình thành các liên kết yếu giữa Enzyme và cơ chất (liên kết Hydrogen, kị
nước và ion) giúp tạo phức ES. Khi phức ES được hình thành sẽ giải phóng năng lượng được gọi
là liên kết (binding energy Δ G B) → Giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng.

Mô hình tương tác enzyme với cơ chất

Giải thích hình:

(a) Không có enzyme: trước khi thanh kim loại bị bẻ gãy, thì nó sẽ bị uốn cong, trạng thái bị
uốn cong ( được gọi là trạng thái chuyển tiếp - transition state) sau một thời gian dài thì mới có
thể đưa thanh kim loại này đến trạng thái chuyển tiếp và cũng mất một thời gian dài thì thanh
kim loại này mới bị bẻ gãy (phản ứng exergonic)

(b) Enzyme bổ trợ cho cơ chất:

-Mô hình (b) là mô hình chìa khóa ổ khóa. Enzyme stickase 1 có trung tâm hoạt động là túi có
từ tính tương tác với cơ chất và khớp với cơ chất. Vì khớp với thanh kim loại ( E hút chặt và S)
nên rất bền nên năng lượng hoạt hóa rất cao, không hỗ trợ cho xúc tác. Enzyme stickase 1 với túi
nam châm (magnet) bao thanh kim loại (substrate) lại, ổn định bề mặt. Quá trình uốn thanh kim
loại sẽ bị ảnh hưởng bởi từ tính giữ thanh kim loại và stickase (b)

(c). Enzyme bổ trợ cho trạng thái chuyển tiếp.

-Mô hình (c) năng lượng liên kết enzyme và cơ chất là tối ưu, xúc tác chuyển thanh kim loại
thành 2 mảnh. Một enzyme được bổ sung vào trạng thái chuyển tiếp phản ứng sẽ làm cho thanh
kim loại bị mất ổn định, góp phần xúc tác phản ứng. Năng lượng liên kết của từ tính sẽ bù cho sự
tăng năng lượng cần để uốn cong thanh kim loại. (c)

-Nam châm tạo ra lực hút → sự tương tác yếu giữa enzyme và cơ chất. Tương tác tối ưu nằm
ngay đỉnh đầu.

-Các biểu đồ phản ứng cho thấy kết quả năng lượng bổ sung cho trạng thái chuyển tiếp (phức EP
bị loại bỏ, Δ G m thể hiện sự khác nhau giữa năng lượng chuyển đổi của phản ứng không xúc tác
và có xúc tác và là sự góp phần của tương tác từ giữa thanh kim loại và stickase

-Khi enzyme bổ sung cho chất nền thì phức ES phức tạp hơn nhiều so với chỉ có 1 mình chất
nền. Kết quả là tăng năng lượng kích hoạt.

Vai trò của năng lượng liên kết

- Năng lượng liên kết làm giảm entropy của cơ chất. Giúp giữ cơ chất ở hướng thích hợp
để phản ứng
- Sự hình thành liên kết yếu giữa cơ chất và enzyme dẫn đến sự phá vỡ lớp vỏ hydrate của
cơ chất vì tương tác giữa ES thay thế hầu hết liên kết Hidro giữa cơ chất và H2O)
- Năng lượng liên kết làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme để đưa các nhóm chức
hoạt động của enzyme đến vị trí thích hợp cho các tương tác với cơ chất mô hình khớp
cảm ứng
- Tạo nên tính đặc hiệu cơ chất

→Giảm năng lượng hoạt hóa tăng vận tốc phản ứng
  Nguyên lý quan trọng của phản ứng enzyme. Các tương tác liên kết yếu giữa enzyme và
cơ chất sẽ tạo nên động lực mạnh mẽ cho sự xúc tác của enzyme

7.Động học enzyme (enzyme kinetics)

Xác định tốc độ phản ứng của một phản ứng cho enzyme xúc tác

Để xác định được tốc độ phản ứng thì xác định nồng độ cơ chất mất đi trong một đơn vị thời gian
hoặc nồng độ sản phẩm tạo ra trong một đơn vị thời gian

nồng độ cơ chất

Đơn vị giống nhau

Đơn vị giống nhau

Michaelis Menten đưa ra biểu thức này dựa vào giả thiết cơ bản rằng bước phân giải phức ES
thành sản phẩn và enzyme tự do là bước có tốc độ giới hạn ( the rate- limiting step) (là bước có
năng lượng hoạt hóa cao nhất)

 Phương trình phản ứng enzyme

K1: hằng số tốc độ phản ứng tạo phức ES

K-1: hằng số tốc độ phản ứng phân li nghịch phức ES

K2: hằng số tốc độ phản ứng tạo sản phẩm từ phức ES

- Ở giai đoạn đầu của phản ứng, [P] không đáng kể, phản ứng P → S có thể bỏ qua.

- Trạng thái giả định (Steady-state assumption): tốc độ phản ứng ban đầu phản ánh 1 trạng thái
ổn mà tại đó [ES] là không đổi (hằng số).

- Tốc độ ES tạo thành = tốc độ ES mất đi

- Đặt Km= (k-1+ k2)/k1

 [ Et ][S]
[ES] = Km+[S]

- Mặt khác, tốc độ của cả quá trình:

dP ∆P
Vo= dt = ∆ t =K 2 [ ES] (tốc độ phản ứng ban đầu)

[ E t ] [S ]
Vo= K 2
[ S] + K m

Khi [S] đủ lớn thì tất cả các phân tử E đều nằm trong phức ES ([Et] = [ES]), tốc độ phản
ứng sẽ đạt cực đại (Vo =Vmax )

 k2[Et] = Vmax
V max [ S]
 Vo= [ S ] + K
m

 Phương trình Michaelis-Menten

V max [ S]
Vo=
[ S ]+ K m

=> Phương trình Michaelis-Menten dành cho phản ứng enzyme chỉ có 1 cơ chất.

V max [ S]
 Ở [S] thấp, Km [S]: Vo= , ở nồng độ cơ chất thấp Vo phụ thuộc tuyến tính [S]
Km

 Ở [S] cao, [S] Km: Vo =Vmax → tốc độ phản ứng cực đại, không phụ thuộc [S] ([S] cao
enzyme bão hòa cơ chất]
1
 Khi Vo= V → Km = [S]
2 max

- Đây là định nghĩa rất hữu ích và thực tiễn của Km

- Km tương đương với với nồng độ cơ chất S mà tại đó tốc độ phản ứng ban đầu = ½ tốc độ phản
ứng cực đại (Vo=1/2 Vmax) (Km có đơn vị nồng độ cơ chất S)

- Nguyên tác này đúng cho hầu hế enzyme tuân theo động học Michealis – Menten→chắc chắn
Km= [S] mà tại đó Vo= ½ Vmax
  Xác định Km và Vmax:

Sử dụng đồ thị Lineweaver-Burk

V max [ S]
Vo=
[ S ]+ K m

Lấy nghịch đảo 2 vế

1 Km 1 1
= +
V o V max [ S] V max

(có dạng y=ax+b, phương trình tuyến tính)

 Cho phép xác định Vmax chính xác hơn. Nếu tuân theo Michaelis menten thì phương
trình sẽ là 1 đường thằng
 Phương trình Michaelis-Menten:

- Đối với hầu hết enzyme, Km : 10-1-10-7M

- Km: có thể thay đổi khác nhau giữa các E, và giữa các cơ chất của cùng E; phụ thuộc điều kiện
môi trường phản ứng như pH, nhiệt độ và lực ion

- Khi phản ứng Enzyme có 2 bước, Km có 2 ý nghĩa:

(1) Km=[S] khi Vo=1/2 Vmax

→ Km bằng với nồng độ của cơ chất S mà tại đó một nữa số trung tâm hoạt động của enzyme
đang bị chiếm chỗ

( Km bằng với nồng độ của cơ chất mà tại đó 50% số trung tâm hoạt động đang bị chiếm chỗ bởi
cơ chất)

k 2 +k −1
(2) Km=
K1

- Khi k2 là tốc độ giới hạn, k2<<k -1 (phức ES phân ly thành E và S nhan hơn sản phẩm tạo
thành)

K−1
→Km =
K1

→Km hằng số phân li giữa phức ES, thể hiện ái lực của E và S trong phức ES)

→Km càng cao thì ái lực E và S càng thấp và ngược lại

(ý nghĩa của Km trong phản ứng có 2 bước ?nêu tất cả các trường hợp)

Lưu ý: Km được coi là hằng số phân ly k2<<k -1

-Vmax: thay đổi tùy thuộc vào enzyme

 Nếu phản ứng E có 2 bước, với k2 là tốc độ giới hạn “rate-limiting”

Vmax= k2 [Et] với [Et]=[E] + [ES]

 Nếu phản ứng E có 3 bước, với EP → E + P là tốc độ giới hạn

Trong trường hợp này hầu hết các enzyme đều đang ở dạng phức[EP] ở trạng thái bão hòa. Vì
vậy, Vmax= k3[Et], với [Et]=[E] + [EP].

 kcat : hằng số mô tả tốc độ giới hạn của phản ứng Enzyme ở trạng thái bão hòa.
 → Nếu phản ứng có nhiều bước trong đó có một bước là tốc độ giới hạn (rate – limiting) thì
kcat sẽ tương đương với hằng số tốc độ của bước phản ứng đó

V max
→ Vmax= kcat[Et], kcat= Vmax/[Et] => kcat= [1/thời gian (giây, phút, giờ)]
[ Et ]

→kcat: hằng số tốc độ bậc 1 (s -1 ): cho biết số phân tử cơ chất được chuyển hóa thành sản phẩm
trong 1 đơn vị thời gian tại 1 phân tử E khi E bão hòa với S→Số vòng quay(turnover number)

 Phương trình Michaelis-Menten viết lại:

k cat . [ Et ] .[S ]
Vo =
k m +[S ]

-VD: dung dịch chứa 10-6M carbonic anhydrase xúc tác tạo 0.6M H2CO3 /s khi enzyme bão hòa
với cơ chất. Tính kcat

kcat= 0,6.10-6= 6.105 M

- kcat và Km: được dùng để so sánh cơ chế xúc tác (đơn giản hay phức tạp)

- kcat/Km(M-1.s-1): hằng số đặc hiệu: là hằng số tốc độ bậc 2 của chuyển hóa E+SE+P

Khi [S] Km từ phương trình (*) V0= kcat[Et][S]KmV0 phụ thuộc vào [Et] và [S] tốc độ
phản ứng bậc 2

-Được dùng để so sánh hiệu quả xúc tác của các E khác nhau hoặc cùng 1 E chuyển hóa các cơ
chất S khác nhau.

◾kcat/Km108- 109

◾kcat/Km108- 109: E có năng lực xúc tác hoàn hảo

 Trường hợp 1E xúc tác phản ứng có nhiều hơn 1S:

-Ví dụ:
  Tốc độ của phản ứng đa cơ chất cũng tuân theo phương trình Michaelis-Menten với Km
khác nhau cho mỗi cơ chất.
 Các kiểu cơ chế xúc tác:

(a) Cả 2 S đồng chất cùng gắn với Enzyme tạo thành phức 3 cấu tử → lần lượt từng S gắn với E
một cách ngẫu nhiên hoặc theo thứ tự.

(b) S1 gắn vào E và được chuyển thành P 1 ,sau đó S2 gắn vào E tạo P2 và giải phóng E→không có
sự hình thành 3 cấu tử