空间多组学助力生物标志物挖掘

市场部产品组， 2022-06-14
CONTENTS
01 公司定位

02 RNA signature介绍与应用

03 GeoMx DSP平台技术介绍

04 多色免疫荧光技术与简要方案介绍

05 Olink产品技术概览
公司定位
裕策生物核心优势——生物标志物的筛选/验证/转化
新标志物挖掘 标志物临床转化 已有标志物优化
DNA Biomarker
—NeoAgTM 、PLUSTM
• 优化的WES、基于新生抗原的大panel HLA HED TMB
• 独有的TruNeo算法 HLA LOH MSI TMB+ITH
• 天梯近4000例各癌种临床案例
RNA Signature
— iSCANTM
• NGS（RNA seq）、nCounter双平台兼顾投入产出比与样本兼容性 TIS IES
• 已有的20多种Signature可供选择 IES
• 丰富的Signature挖掘经验与验证队列

Protein Biomarker
—YuTimeTM
• 高证据等级生物标志物检测、前沿靶点标志物开发 MHC-II CD73
• YuTime系列综合评估免疫微环境状态，提供多靶标双阳
分析、免疫分型、细胞间距离分析
PD-L1… LAG3…
PD-L1/PD-1+CD8+
Circulating Protein (Cluster)
—Olink
• 高灵敏度、高通量的检测
• 疗效、毒副作用各类相关蛋白综合分析
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裕策生物多组学生物标志物挖掘与验证平台

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RNA Signature介绍与应用
- nCounter
RNA signature

基因表达谱Gene Expression Profiling, GEP

特定GEP组合，关联细胞或组织的生理过
程——RNA Signature

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nCounter ：最适合临床样本RNA表达研究的平台
nCounter®
System
Launched in
NanoString数字化多重核酸定量技术 2008

➢ qPCR的准确性
➢ RNA-Seq的通量
➢ NGS的操作便捷性

➢ 样本友好-FFPE、新鲜样本
➢ 批间差、室间差小 Target-specific
Capture
➢ 看家基因：归一化分析 Probe
Target-specific
Reporter
Probe
技术特点 特点内容
nCounter通常使用nanostring自研的
No Amplification，low bias - 直接检测，无需逆转录酶反应，PCR扩增
nAlgorithm和nSolver分析常见的TIS， - 细胞裂解液直接上样，不需提取RNA
pathway，Cell type等RNA signature。
FFPE samples friendly - RNA RIN 值3以上可以检测

Low input RNA testing - 10 ng, 2~3 slides of FFPE

Customized panel - 定制化panel服务

Simple Data Analysis -正版授权分析软件，包括TIS score

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常规基因表达研究技术平台性能对比

技术平台 NGS Microarray qPCR nCounter

技术原理 PCR 固相杂交 PCR 液相杂交
检测基因数 全基因组 /2.5万 全基因组 /2.5万 1 800
序列信息 已知/未知 已知 已知 已知
准确度 *** **** ***** *****
检测稳定性 ！ *** *** *****
后续验证 qPCR qPCR / /
样本友好度 ** ** *** *****
价格吸引力 ***** **** ** ***
人工建库 人工标记
自动化程度 手动加样 15分钟手动+自动
自动测序 自动检测
实验时间 6-8 days 3 days 1 days 1-2 days

-nCounter 是现有基因表达研究技术中最高效易用的平台！

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 nCounter 技术定位

功能描述 特点
qPCR nanoString
单次检测基因数量 800余个目标基因表达情况
Sensitivity

样本起始量 普通：200ng 微量：10ng

Microarrays 检测限 0.5 fM/15μL

/NGS
Fold change ＞1.5-fold（if＞5 copies per cell）
sensitivity ＞2-fold （if＞1 copy per cell）
1 10 100 1000 10,000 R2≥0.95
Multiplexing # of Transcripts

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重现性高——跨实验室结果

Rapid, Reliable, and Reproducible Molecular Sub-grouping of Clinical Medulloblastoma Samples

Northcott P.E. et al., Acta Neuropathologica; November 16, 2011

R2 Site1 v Site 2 = 0.97

R2 Site1 v Site 3 = 0.98

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与qPCR一致但更精准

Khan et al., 2011

nCounter 得到的结果与qPCR一致，但准确性，稳定度更高。

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检测FFPE样本的表现 nCounter Vs qPCR

Reis et al., 2011 BMC Biotech.

19 Fresh Frozen vs 19 FFPE oral carcinomas

Correlation coefficient R=0.90 Correlation coefficient R=0.50
nCounter SYBR qPCR

nCounter 得到比qPCR更好
的结果，主要是不需要RT与
PCR。

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fold change 结果与RNA-Seq一致

得到的fold change 结果，与 Illumina RNA-Seq 有很高的相关性。

Sun et al. PLoSone, Feb, 2011

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裕策生物的RNA signature开发优势
平台优势
nCounter平台具有可重复性高、定量精准等特点，
可以有效提升RNA signature的可重复性和验证成功
率。
同时nCounter与qPCR RNA定量一致性很高，且不
同实验室的可重复性高。
数据挖掘优势
裕策生物生信团队基于ssGSEA等算法自主开发了更多
pathway, cell type等RNA signature的自动化分析流程，
并基于svm，e-net+cox等机器学习算法，搭建了挖掘
疗效或预后相关signature的平台。与常规的使用差异表
达分析等统计方法相比，大幅提高了signature开发的效
率和成功率。
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 自主研发项目IES(Immune exhaustion score)
 裕泰抗原自主开发biomarker: 15个基因的signature，利用比例风险回归模型在发现集探索出跟ICI单药应答和预后相关的
加权平均算法，在另外三个独立队列中验证
 在肺癌中，IES预测效果比TIS更优

IES VS TIS
在肺癌里面预测效果更好

发现集：Prat et al,
nCounter IO360 panel,
N = 65

三个验证集

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 样本要求
样本类型 保存介质 样本量要求 样本年限要求 运输方式 备注
1）手术组织≥50 mg（黄豆粒大小）
冷冻组织为离体后在液氮中迅速冷冻的
新鲜冷冻组织 冻存管 2）穿刺组织不少于2针（组织直径1-2 mm， —— 干冰运输
组织
长度≥10 mm）
石蜡块 蜡块托 1块，≥50mg 保存时长＜10年 常温运输
——
石蜡卷 1.5mL EP管 一卷 切出1个月内 常温运输
手术样本：5-10μm厚的未染色切片 推荐最小 从10年内石蜡块新鲜切出的石蜡切片，
组织量（基于5μm厚组织切片）为48mm2 石蜡块表面两层（10μm）切片由于氧
石蜡切片 切片盒 切片数量：3-4 张（通常）2-3张（极小量RNA） 切出1个月内 常温运输 化较多，不建议用于nCounter检测，如
穿刺样本：总计40μm厚的未染色切片 需用于HE质控，需要标记并于送样时备
（8*5μm， 4*10μm或2*20μm） 注。
1）DV200 ≥ 30%，
RIN值为2以上
Total RNA 1.5mL EP管 总RNA样本量 ≥ 200ng —— 干冰运输 2）A260/A280: 1.7-2.3，
A260/A230: 1.8-2.3
3）封口膜密封管口，干冰充足

1）DV200 ≥ 30%，
RIN值为2以上
极小量RNA 1.5mL EP管 总RNA样本量 ≥ 10ng —— 干冰运输 2）A260/A280: 1.7-2.3
A260/A230: 1.8-2.3
3）封口膜密封管口，干冰充足

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GeoMx DSP平台技术介绍
表达谱技术的发展历程

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 Hot but non-Infiltrated Tumor Highly Infiltrated Tumor

Pan-CK
CD45
CD3
Syto13

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 GeoMx Digital Spatial Profiler: 空间分子标志物发现

GeoMx DSP:主要技术优势
样本兼容度高 FFPE/FF/TMA
多维分析物 RNA and 蛋白
高度复杂的蛋白质和RNA空间图谱
超高重数 96种蛋白/1000+RNA通过是原位
定量
数字化定量 提供每一种靶分子原位数字化定量
信息
FFPE兼容的高复杂性空间分析
丰富灵活的区域圈选策略 5种ROI选择策略，一张切片分析多
种问题
细胞群体及内在分子机制 Cell type markers and及不同信号
GeoMx 共分析 通路基因全覆盖
从聚焦小组到整个转录组
Digital Spatial Profiler 高度集成、自动化的硬件设备
集成化的数据分析流程，无需专业
简单易用 生信能力

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具有自动化工作流的灵活ROI选择
标准化工作流程，无需样本条件摸索

兼顾效率，高效可控的项目运转周期！

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• GeoMX DSP平台样本要求
客户样本信息采集：
1 样本类型—
兼容样本类型： 2 样本数量—
病例数、组织样本数、ROI/AOI预估数量
3 是否拼样—
新鲜组织（手术组织/穿刺组织）、新鲜冷冻组织 4 蜡块年限—
5 预估准备的玻片张数
1）具体玻片样本数，需待拼样、检测内容都确定后明确
FFPE样本（石蜡块、石蜡卷、石蜡切片）、组织芯片。 2）如果蛋白、RNA都检测，每个样本提供6-10张切片；
如果只检测蛋白或RNA，每个样本提供5-6张切片
6 提供病理报告，供HE染色结果判读使用，照片可接受

样本寄送要求:建议顺丰快递
a. 石蜡切片在常温条件下运输即可。冰冻切片
要保证干冰量足够。
b. 请将样本安全的包装，固定并填充好，推荐
使用切片盒运输。

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 • RNA signature检测及数据挖掘平台：全面、先进

针对RNAseq及ncounter平台搭建
生信分析平台，包含5大分析模块：

 标志物检测：包括TIS等50+种已
知的signature检测

 肿瘤微环境分析：整合4钟免疫
微环境解析方法，分析不同的免
疫微环境细胞丰度

 新的Signature挖掘：整合6种机
器学习模型挖掘新的Signature

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多色免疫荧光技术与简要方案介绍
- mIF
如何筛选蛋白靶标：科研成果与临床实验的关键环节

医学研究成果 PhaseⅠ Phase II Phase III

文献与数据库 DSP mIHC IHC

有限样本，高通量，定量化，
增加样本，缩小范围，可视
精确筛选， 可视化，标准规范，病理解
海量RNA、蛋白层面的信息 化，空间分析，共定位，形
蛋白靶点，细胞互作，肿瘤微 读，IVD
态学，
环境

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mIF应用日趋广泛

珍稀样本

单张样本
多重技术
尽可能多的信息

临床样本管理法律法
规、指导意见

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荧光：概念、特点和应用

细胞免疫荧光技术 化学荧光基团 滤光片： 截取需要的荧光波段

人眼可见光谱： 400~760 nm wavelength

荧光产生的原理 / 激发光/ 发射光

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使用Akoya Polaris 扫描系统解决 Multiplex-IF 技术困境

Polaris光谱拆分扫描系统：
解决光谱重叠最佳手段

Polaris光谱拆分原理

光谱拆分系统——七标八色的技术基础 37
染片技术介绍——
酪酰胺信号放大技术(TSA，Tyramide signal amplification)
通过多轮重复
信号强、定制化友好、抗体 逐个添加marker
选择友好、流程稳定
荧光二抗 TSA 放大

荧光直标

• 一抗识别 二抗放大
• 二抗连接的辣根过氧化酶复合物，会催化携带酪胺基团的荧光染
料，与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，
这样抗原附近富集大量荧光基团。
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 病理技术平台：病理图像分析HALO系统

• HALO是一个mIHC/IHC/HE的病理图像分析工具，在药物研发和临 • 组织分型
床研究行业中认可度较高，可实现功能丰富，是病理图像定量分析
中广泛使用的工具。 • 标记物定量

• 细胞分型

• 细胞定位、定量

• 共定位分析

HALO对mIF的处理前（左）和处理后（右）

HALO对mIF和HE结果进行映射
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自主研发的mIF panel：YuceTME 系列（6标7色）

DAPI DAP
I

CD8 PanC
K

PD- ɑ-
L1 SMA

CD6 PanCK CD4 FoxP CD4 CD8 CD2 CD6

8 3 0 8
YuTime TILs/PD-L1 panel：CD4/CD8/CD68/FoxP3/panCK/PD-L1 YuTime TILs/CAF panel：CD4/CD8/CD20/CD68/panCK/ɑ-SMA

利用平台优积累 CD4 PD1 CD163 TIM 3 PD-L1 Nectin 2 CD31 FOXP3 OX40
的mIF有效性验 CD8 HLA-DR/DP/DQ CD68 LAG-3 Ki67 Claudin18.2 Granzyme B CD19 CD73
证抗体库
CD45 CD20 CD56 CTLA4 CD3 HDAC2 TIGIT CD11c
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Panel 检测方法学开发与验证
预实验 初步确认一抗浓度范围 IHC
一抗浓度 一抗浓度梯度实验 IF
检测体系开发 抗体染料配对 除了核染DAPI之外，其他抗体对对应荧光染料的确认 IF
抗原修复次数 根据抗原修复效果为mIF循环染色确定次序 mIF
多色预实验 初步确认多色的实验条件 mIF
图像分析流程开发 指标与分析流程 基于HALO、Inform的图像分析

验证内容
准确度是由系统误差和随机误差所决定的,它反映结果的
准确度
可靠性。
而精密度是由随机误差所决定的,它代表方法的稳定性和
精密度
重现性。

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42
Olink产品技术概览
- Olink技术平台介绍
血液循环蛋白质组学研究

血浆/血清：
➢ 唯一可在身体各器官内自由流动的液体，
包含自身和全身其他组织器官释放的成千
上万种类的不同丰度的蛋白

➢ 主要的临床标本，可提供临床生理或病理
信息，已成为临床生物标志物研究的主要
研究对象

血浆/血清 蛋白质组学仍面临技术挑战：
⚫ 蛋白种类多，丰度差异大，高低丰度蛋白相差10个数量级以上
⚫ 高丰度蛋白含量高，例如血清中前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上，对低丰度蛋白检测造
成干扰
⚫ 其他蛋白质组金标准检测技术，例如质谱，灵敏度有限，对ng/ml~pg/ml的低丰度蛋白检出较少

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Olink技术原理
Proximity Extension Assay (PEA) : 邻位延伸分析技术

A) 一对寡核苷酸标记的抗体同时与一个靶蛋白结合
B) 抗体接近促成寡核苷酸杂交，并通过DNA聚合酶延伸
C) 杂交延伸后的DNA条形码进行PCR预扩增
D) qPCR对扩增子进行定量检测

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Olink技术平台介绍

3072/1536/384

1-6 μL

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Olink技术平台介绍

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Olink技术参数对比

在检测范围、灵敏度和检出率上与质谱对比了一致性

➢ 用质谱和Olink检测了 170个样本
➢ Olink检测到了700个蛋白质；
质谱只检测到了700当中的45个
（红色点代表质谱检测到的部分）

质谱：μg-mg/ml vs Olink：fg-mg/ml

Stefanie M. Hauck团队的在“Systems biology in

cardiovascular disease: a multiomics approach”文中写道：
高丰度蛋白质的存在，如血清白蛋白或免疫球蛋白，在高
度复杂的血浆基质中直接影响质谱检测的灵敏度，使得低
丰度蛋白质如细胞因子没办法好的被检测出来。而邻位延
伸技术(Olink)相对于质谱分析增加了蛋白质组覆盖的深度。

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Olink技术平台总结

高特异性

高灵敏度

广阔的检测范围

验证过的靶标库

高通量

高性价比

极少样本量

可量化

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Olink最新文献
杂志｜Nature（IF=49.962)
1 文章｜多组学研究mRNA疫苗BNT162B2人体免疫应
答 关键词｜新冠、mRNA疫苗 、再次免疫
杂志｜Cell Research （IF= 25.617）
2 文章｜中国学者首发新冠病毒无症状感染组免疫学特征和
蛋白标志物
关键词｜新冠、队列研究、患者分层
杂志｜Science （IF = 47.728）
3 文章｜Olink超灵敏血浆蛋白组挑战基因与疾病间之鸿
沟 关键词｜蛋白组学、多组学、pQTL
杂志｜Lancet Respir Med（IF =30.7）
文章｜Olink助力多中心队列研究首发PFILD进行性纤维
7 8
化 性间质性肺病蛋白组特征
关键词｜进行性肺纤维化、蛋白组学、Machine
Learning
杂志｜Alzheimers‘ Dementia （IF=21.566）
4 文章｜叶玉如院士借助 Olink 19-plex panel更准确地
筛查 并分期阿尔茨海默症
关键词｜AD、蛋白标志物、无创检测
5
杂志｜Cell （IF = 41.582）
文章｜多组学研究揭示发酵食品可降低人体炎症标志物
关键词｜多组学、宏基因组、肠道菌群
杂志｜Annals of Oncology （IF = 32.976）
6 文章｜Olink助力预测免疫检验点阻断剂抵抗的全新生物标志
物 关键词｜ICB、癌症治疗耐药、生物标志物
杂志｜JACC （IF = 24.094）
文章｜Olink蛋白质组联合机器自学习学习显著提高死亡风险
预 测有效性
关键词｜心血管、蛋白质组、Machine Learning
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Olink平台-官方力荐的蛋白质组学检测平台
Olink平台字上市以来备受瞩目，先后获得人类血浆蛋白质组官方推荐、入选“癌症登月计划”肿瘤免疫
生物标志物临床实验技术指南方法学第一梯队，并获得蛋白质组学研究的推动型技术等诸多殊荣。

美国国家癌症研究所于2018年将Olink技术纳入肿瘤免
疫疗法临床试验指南（CIMAC-CIDC）

https://www.proteinatlas.org/humanproteome/blood https://cimac-network.org/assays/
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 卡瑞利珠单抗联合艾立布林以及阿帕替尼治疗晚期三阴性
乳腺癌临床试验

➢ 基线和治疗后样本进行Olink Target 96 Immuno-

Oncology检测；
➢ 在基线样本（n=40）中CASP-8、IL-18、EGF或ARG1水
平较低的患者容易发生泌尿系统或全身不良反应。治疗三
➢ 36例患者基线标本进行蛋白质组学分析，共鉴定出6149个蛋白质，研究发
周后(n=29) CXCL5水平较高的患者倾向于发生更多的皮肤
现肿瘤中早幼粒细胞白血病蛋白(PML)和赖氨酸羟基化酶3（PLOD3）与患
和皮下组织相关的不良事件。
者ORR呈显著负相关. 52
THANKS