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研究

勝肽定序 NAA 辨識和開關結合動⼒學。

整合半導體裝置上的即時動態單分⼦蛋⽩質 ⽤於單分⼦測量的互補⾦屬氧化物半導體晶

定序 ⽚和整合系統

布萊恩·D·⾥德1*，邁克爾·J·邁耶1, ⽡倫丁·阿布拉姆宗1, 奧⾺爾阿德1派特·阿德科克1, 費薩爾 我們使⽤互補⾦屬氧化物半導體製造技術構建

·R·艾哈邁德1, 古恩·阿爾帕伊1, 詹姆斯·A·鮑爾1, 詹姆斯海灘1, 多明尼克⾙爾哈切⽶1, 安東尼⾙洛 了具有奈秒精度的客製化時域敏感半導體晶
菲奧裡1, ⿆可⾙洛斯1, 胡安費利佩⾙爾特蘭1, 安德魯⾙茨1, 穆罕默德·⽡杜德·布伊亞1, 克⾥斯汀布萊 ⽚，其中包含⽤於單分⼦檢測的完全整合組
克洛克1, 羅伯特·波爾1, ⼤衛·布⽡維特1, 諾曼布勞特1, 亞倫·布克斯鮑姆1, 史蒂夫·卡普⾥奧1, 崔昌勳 件，包括光電感測器、光波導電路和⽤於⽣物
1, 托⾺斯·D·克⾥斯蒂安1, 羅伯特·克蘭西1, 約瑟夫·克拉克1, 湯瑪斯·康諾利1, 凱瑟倫·芬克·克羅 分⼦固定的反應室（圖S1） 、B 和 C)。我們透
⿑1, 理查卡倫1, 梅爾戴維1, 傑克戴維森1, 穆罕默德·M·埃爾謝納維1, ⿆可費⾥尼奧1, 丹尼爾·弗⾥爾1, 過附近波導在反應室底部的漸逝照明實現了 <5
薩克斯古迪帕蒂1, 史蒂芬妮·哈⽶爾1, 何兆⽟1, 薩拉特·霍薩利1, ⿈海東1, ⿈樂1, 阿⾥卡⽐⾥1, 根納迪· 阿托升的觀察體積，從⽽能夠在⾼濃度 (>1⽶
克⾥格1, 布列塔尼·拉斯羅普1, 安莉1, 彼得林1, 史蒂芬·劉1, 羅⾶翔1, 呂彩霞1, ⾺曉曉1, 埃⽂·⿆科⾺克 M) ⾃由擴散染料。
1, ⽶歇爾·⽶爾漢姆1羅傑·納尼1, 曼朱拉潘迪1, 約翰·帕⾥洛1加亞特⾥·帕特爾1, 道格拉斯·H·派克

1, 凱爾普雷斯頓1艾德琳·⽪查德-科斯塔奇2, 凱爾·⾥⾥克1托德·雷⾥克1, ⾺可·裡⾙⿑-克⾥⾱拉⾥2,

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傑拉德·施密德1, 喬納森·舒爾茨1, ⽯興華1, 巴德⾥⾟格1尼基塔·斯⾥⽡斯塔⽡1, 香農·F·斯圖曼1,
瑟斯頓1, 菲利普·特⾥奧利1, 珍妮佛·圖爾曼1, 王鑫1, 王彥志1, 埃⾥克·⾱伯斯特1, 張志卓1、豪爾赫·
祖尼加1, 斯⽶塔·帕特爾3, 安德魯D.格⾥菲斯2, 安托萬·範·奧伊延 (Antoine M. van Oijen)4, ⿆可⿆肯
納1, ⾺修D戴爾1, 喬納森·M·羅斯伯格1
此半導體晶⽚採⽤無濾波器系統，根據光⼦
到達時間排除激發光，實現⼊射激發光衰減
>10,000 倍。消除整合濾光層提⾼了螢光收集
蛋⽩質體的研究將⼤⼤受益於直接定序和數位量化蛋⽩質以及以單分⼦靈敏度檢測翻譯後修飾的⽅法。 的效率，並實現了晶⽚的可擴展製造。為了透
在這裡，我們展⽰了使⽤動態⽅法的單分⼦蛋⽩質定序，其中透過染料標記的 N 端氨基酸識別器的混合 過螢光壽命和強度區分附著在 NAA 識別器上的
物即時探測單⼀勝肽，並同時透過氨肽酶切割。我們透過測量整合半導體晶⽚上的螢光強度、壽命和結 螢光染料標籤，晶⽚在與每個雷射脈衝相關的
合動⼒學來註釋胺基酸並識別勝肽序列。我們的結果證明了動⼒學原理，使識別器能夠以資訊豐富的⽅ 早期和晚期訊號收集視窗之間快速交替，從⽽
式識別多個氨基酸，從⽽能夠區分單個氨基酸取代和翻譯後修飾。隨著進⼀步的發展，我們預計這種⽅ 收集指數螢光壽命衰減曲線的不同部分。這些
法將為單分⼦蛋⽩質體研究和應⽤提供⼀個敏感的、可擴展的和可訪問的平台。 收集視窗中的相對訊號（稱為「箱⽐」）提供
了螢光壽命的可靠指⽰（圖 S1、D 到 H 以及材
料和⽅法）。

中號
蛋⽩質組的測量為⽣物過程提供了深⼊ 以及無法複製或擴增蛋⽩質。直接對單⼀蛋⽩
⽽有價值的⾒解。然⽽，需要更⾼靈敏 質分⼦進⾏定序的⽅法可提供最⼤可能的檢測
度的⽅法來充分了解細胞中蛋⽩質組的 靈敏度，並有可能實現單細胞輸⼊、基於讀數
複雜動態狀態以及疾病狀態下蛋⽩質組 計數的數字定量、翻譯後修飾(PTM) 和低豐度 單肽分⼦上 NAA 的即時有序識別和切割
的變化，並使這些資訊更容易獲得。蛋 或異常蛋⽩型的檢測以及成本和通量有利於廣
⽩質組的複雜性和蛋⽩質的化學性質對實現與 泛採⽤的程度。 為了使 NAA 結合蛋⽩發揮辨識器的作⽤，辨識
DNA 定序技術同等的靈敏度、通量、成本和採 器-勝肽複合物必須保持⾜夠⻑的結合時間（通
⽤提出了幾個基本挑戰（1, 2).這些挑戰包括每 常平均>120 ms）以產⽣可偵測的單分⼦結合
個細胞存在⼤量不同的蛋⽩質（>10,000）以及 事件。我們⾸先關注來⾃ N 端規則適配器家族
更多的蛋⽩質形式（3）；細胞和⽣物體液中蛋 在這裡，我們提出了⽤於蛋⽩質體研究的單 ClpS 的蛋⽩質，它們天然結合 N 端苯丙胺酸、
⽩質豐度的動態範圍⾮常廣泛 (4, 5)且與轉錄⽔ 分⼦蛋⽩質定序⽅法和整合系統。我們將勝肽 酪胺酸和⾊氨酸（7-9）。使⽤ PS610，我們從
平缺乏相關性（6);⽬前質譜⽅法的成本和⾼檢 固定在半導體晶⽚上的奈⽶級反應室中，並使 ClpS2 派⽣的識別器根癌農桿菌（表 S1），我
測極限（2）； ⽤染料標記的 NAA 識別器即時檢測 N 端氨基酸 們確定該識別器可檢測地與帶有這些 NAA 的固
(NAA)。氨肽酶依次去除單⼀ NAA，以暴露後 定肽結合。我們也確定每種 NAA 的結合動⼒學
續的氨基酸進⾏識別，從⽽無需複雜的化學和 不同。為了證明這些特性，我們使⽤PS610 在
流體學（圖 1）。我們建造了⼀個桌上型設 單獨的晶⽚上孵育包含初始N 端序列FAA、YAA
備，配備⽤於螢光激發的 532 nm 脈衝雷射光 或WAA（A，丙胺酸；F，苯丙胺酸；W，⾊胺
源和⽤於訊號處理的電⼦裝置（圖 S1A）。我 酸；Y，酪胺酸）的固定化勝肽，並收集數據10
們的半導體晶⽚使⽤螢光強度和壽命，⽽不是 ⼩時（參⾒材料與⽅法）。我們觀察到 PS610
發射波⻑，來區分染料標籤。我們的識別器可 識別 NAA，其特徵是在潛伏期內連續開關結
偵測⼀種或多種類型的 NAA，並根據時間順序 合，每個脈衝持續時間 (PD) 不同
提供勝肽識別信息
1Quantum-Si, Inc.，吉爾福德，CT 06437，美國。2⽣物化學
實驗室，巴黎 ESPCI，PSL ⼤學，CNRS UMR 8231，巴黎，
法國。3羅格斯⼤學⽣物化學與分⼦⽣物學系，⽪斯卡塔⾱，
新澤西州 08854，美國。
4分⼦視野，臥⿓崗⼤學，臥⿓崗，新南威爾斯 2522，澳
洲。
* 通訊作者。電⼦郵件：breed@quantum-si.com

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勝肽 識別器
開關裝訂
蛋⽩質
右 右 L我VF是⽡
右 L L 氨肽酶
L 我 我 我
我 F F F F
F A 右 A L A 我 A
反應 A
室

半導體晶⽚
右 L 我 F

圖 1. 即時動態蛋⽩質定序概述。蛋⽩質樣品被消化成勝肽⽚段，固定在奈⽶ 在N末端暴露，從⽽產⽣特徵脈衝圖案。NAA 被氨肽酶切割，暴露下⼀個氨基

級反應室中，並與⾃由擴散的 NAA 識別器和氨肽酶的混合物⼀起孵育，以執 酸以供識別。NAA 識別的時間順序和結合動⼒學能夠識別勝肽，並且對調節
⾏定序過程。當標記的辨識器的同源 NAA 之⼀是時，標記的辨識器會與勝肽 結合動⼒學的特徵（例如 PTM）敏感。
結合或斷開。

圖 2. NAA 識別和動態定序。（A到C）範例跡線展⽰了 PS610 (A)、PS961 (B) （E到G）使⽤ PS610 和 PS961 對合成勝肽 LAQFASIAAYASDDD 進⾏動態定 2024 年 2 ⽉ 6 ⽇於國⽴中正⼤學 https://www.science.org 下載
和 PS691 (C) 的單分⼦ N 端辨識。(A) ⾄ (C) 中顯⽰了每個勝肽的每個 RS 脈衝 序。(E) 中顯⽰了範例跡線。(F) 中顯⽰了 RS 平均 PD 與 bin ⽐率的散佈圖，
數與 RS 平均 PD 的散點圖，並標明了中位數 PD。（D）合成勝肽 說明了 bin ⽐率對識別器的區分以及 PD 對 NAA 的區分。每個 RS 的脈衝數
FAAWAAYAADDD 動態定序的範例跡線。中位數 PD 顯⽰在每個 RS 上⽅。 與 RS 平均 PD 的散佈圖（以分配給 RS 的胺基酸標籤分組）如 (G) 所⽰。

肽（圖2A）。FAA、YAA 和 WAA 的中位 PD 分 為了擴展可辨識的 NAA 集，我們進⼀步研究 與 N 端亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸天然結合。

別為 2.49、0.73 和 0.31 秒。這些值反映了每種 了 N 端規則路徑蛋⽩作為額外辨識器的來源。 我們應⽤定向進化技術產⽣了浮黴菌 ClpS 變體
類型的蛋⽩質-NAA 相互作⽤的不同解離速率驅 在對多種 ClpS 家族蛋⽩的全⾯篩選中，我們發 ——PS961（表 S1）——對 N 端亮氨酸、異亮
動的結合親和⼒的差異（7） （圖 S2、A 和 現了⼀組來⾃浮黴菌⾨的 ClpS 蛋⽩， 氨酸和纈氨酸具有亞微摩爾親和⼒，並證明了
B）。 對這些的識別

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圖 3. 具有⾼精度動⼒學輸出的多種勝肽的動態定序。（A到E）勝肽
DQQRLIFAG 的動態定序。(A) 中顯⽰了範例追蹤。(B) 顯⽰了 RS 平均 PD 與
bin ⽐率的散佈圖。(C) 中顯⽰的是 DQQRLIFAG 勝肽動態定序的其他範例痕
跡。(D) 所⽰為定序過程中所取得的每個 RS 和 NRS 的持續時間分佈，平均值
為
指⽰的持續時間。(E) 中顯⽰了總結 DQQRLIFAG 勝肽特徵定序⾏為的動⼒學
特徵圖。（F到G） 合成勝肽 DQQIASSRLAASFAAQQYPDDD（上）、
RLAFSALGAADDD（中）和 EFIAWLV（下）的動態定序。(F) 中顯⽰了每個勝
肽的範例跡線。(G) 中顯⽰了相應的動⼒學特徵圖。

NAA（圖2B）。與N 端LAA、IAA 和VAA（I，異 肽酶來⾃堀越⽕球菌 (11)。收集到的痕跡由不 PS961 分別使⽤可區分的染料 atto-Rho6G 和

亮氨酸；L，亮氨酸；V，纈氨酸）的肽結合的
中位數PD 分別為1.21、0.28 和0.21 s，與批量
表徵⼀致（圖S2C） ）。
在另⼀個篩選中，我們研究了來⾃泛素連接
酶 UBR 家族的⼀組不同的 UBR-box 結構域，
這些結構域天然結合 N 端精氨酸、賴氨酸和組
氨酸。10）。來⾃酵⺟的 UBRbox 結構域⾺克
斯克魯維酵⺟UBR1 蛋⽩（表 S1）對 N 端精胺
酸表現出最⾼的親和⼒，我們使⽤該蛋⽩產⽣
精胺酸辨識器 PS691。PS691 可辨識具有 N 端
RLA（R，精胺酸）的勝肽中的精胺酸，中位
PD 為 0.23 秒（圖 2C）。與 N 端賴氨酸和組氨
酸的較低親和⼒結合（圖 S2、D 和 E）不⾜以
進⾏單分⼦檢測。
同脈衝的區域組成，我們稱之為識別段
（RS），由缺乏識別脈衝的區域[⾮識別段
（NRS）]分隔開。我們開發了分析軟體，可根
據螢光特性和脈衝動⼒學⾃動識別跡線內的脈
衝區域和轉變點（請參閱材料和⽅法）。跡線
從苯丙胺酸的識別開始，中位 PD 為 2.36 秒
（圖 2D），與僅識別測定中 FAA 觀察到的 PD
⼀致。這種模式在氨肽酶添加後終⽌（平均添
加後11 分鐘），隨後出現兩個RS 的有序出
現，中位PD 分別為0.25 和0.49 秒（圖2D），
對應於我們的YAA 和中獲得的短和中PD僅 WAA
識別分析。因此，在反應中引⼊氨肽酶活性導
致離散RS以正確的順序連續出現，並具有預期
的動⼒學特性。
Cy3，並將序列 LAQFASIAAYASDDD（D，天冬
胺酸；Q，麩醯胺酸；S，絲胺酸）的固定勝肽
暴露於含有兩種辨識器的溶液中。15分鐘後，
我們增加了兩個堀越松具有涵蓋所有 20 個氨基
酸的綜合活性的氨肽酶 — PhTET2 和 PhTET3
（11、12）。收集的跡線顯⽰根據勝肽序列中
可辨識胺基酸的順序在 PS961 和 PS610 之間交
替的離散脈衝⽚段（圖 2E）。與每個 RS 相關
的平均箱⽐和平均 PD 很容易區分兩種染料標
籤和四種類型的公認 NAA（圖 2F）。N 端
LAQ、FAS、IAA 和 YAS 的中位數 PD 分別為
2.71、1.40、0.25 和 0.64 s（圖 2G）。

先前的研究表明，NAA 結合的 ClpS 和 UBR

為了證明單⼀勝肽分⼦中的胺基酸可以依次 蛋⽩也會與 N 端的位置 2 (P2) 和位置 3 (P3) 的
被氨肽酶暴露並以可區分的動⼒學即時識別， 殘基接觸，從⽽影響結合親和⼒。9、13、
我們將包含初始序列 FAAWAAYAA 的固定勝肽 14）。這些影響反映在取決於下游 P2 和 P3 殘
與 PS610 孵育 15 分鐘，然後添加 PhTET3（⼀ 基的 PD 調節中，正如我們在上⾯觀察到的
種氨基肽）。 - LAA (1.21 s) 與
為了⽰範使⽤兩個 NAA 識別器的動態定序，
我們標記了 PS610 和

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圖 4. 單⼀胺基酸變化和 PTM 的檢測。（A和⼆）對單⼀胺基酸不同的合成勝
肽進⾏動態定序：RLAFAYPDDD（上）、RLIFAYPDDD（中）和
RLVFAYPDDD（下）。(A) 中顯⽰了範例跡線。RS 平均 PD 與 bin ⽐率的散佈
圖如圖 (B) 所⽰。 （C和D）檢測勝肽 RLMFAYPDDD 中的氧化蛋胺酸。亮氨
酸的平均 PD 分佈如 (C) 所⽰；標籤表明⼈群
LAQ（2.70 秒）。我們發現這些對 PD 的影響
在資訊有利的範圍內變化，並且可以根據經驗
確定或透過電腦近似來模擬勝肽定序⾏為的先
驗（圖 S2，F 到 H）。這種識別⾏為在勝肽鑑
定⽅⾯的⼀個強⼤特徵是，每個 RS 都包含有關
潛在下游 P2 和 P3 殘基或 PTM 的信息，無論
這些位置是否是 NAA 識別器的⽬標。
⽤模型勝肽說明動態蛋⽩質定序原理
為了評估我們的動態定序⽅法應⽤於不同序列
時的動⼒學原理，我們⾸先表徵了合成勝肽
DQQRLIFAG（G，⽢胺酸），對應於⼈類泛素
的⼀段（圖 3，A 到 E）。我們透過組合三種不
同標記的識別器（PS610、PS961 和 PS691）
和兩種氨基肽酶（PhTET2 和 PhTET3）進⾏定
序反應（參⾒材料和⽅法）。圖 3A 中的範例軌
跡以 NRS 開始，該 NRS 對應於初始 DQQ 基序
中的殘基出現在 N 端的時間間隔。第⼀個 RS
在 120 分鐘開始，在 N 端精胺酸暴露於辨識後
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亮氨酸，然後是蛋氨酸 (LM) 或蛋氨酸亞砜 (LMo)。(D) 中顯⽰的是⽰例跡線，
其中蛋氨酸被 PS961 識別，亮氨酸表現出⻑ PD（頂部），或者其中蛋氨酸由
於氧化⽽未被識別，⽽亮氨酸表現出短 PD（底部）。（E）對於未控制氧化
（左）或蛋胺酸完全氧化（右）的運⾏，RS 平均 PD 與箱⽐的散點圖。
由 PS691 定義。隨後的切割事件依序將 N 端亮 ⼀個螢光團分⼦（圖 S1F）。識別器開啟速率
氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸暴露給相應的識別 和濃度控制每個 RS 的 IPD；辨識器濃度越⾼，
器，從⼀個 RS 到下⼀個 RS 的快速轉換（平均 平均 IPD 越短，脈衝速率越快（圖 S3、A 和
<10 秒）。PS961 從亮氨酸識別到異亮氨酸識 B）。然⽽，較⾼的識別器濃度會增加⾃由擴散
別的轉變很容易被識別為平均 PD 的急劇變 的識別器的螢光背景，導致較低的脈衝信噪
化。這種總體模式在同⼀勝肽的許多定序實例 ⽐，並且可以與氨肽酶競爭 N 端訪問。實際
中複製，並且在跡線中具有相似的PD 統計數 上，約 2 ⾄ 10 秒範圍內的 IPD 在這些因素之間
據，因為每個勝肽分⼦在定序運⾏過程中遵循 提供了良好的平衡。
相同的反應途徑（圖3、B 和C） 。由於裂解事
件的隨機時間，每個軌跡顯⽰每個 RS 的不同開
始時間和持續時間（圖 3C）。
RS 持續時間在⼀組重複跡線中的分佈定義了
每個可識別 NAA 的切割速率。對於
DQQRLIFAG 勝肽，我們觀察到N 端精胺酸、亮
胺酸、異亮胺酸和苯丙胺酸的平均切割時間分
該⽅法報告了每個可識別氨基酸位置的結合 別為30、55、40 和88 分鐘，每個位置的近似
動⼒學以及氨肽酶沿肽序列切割的動⼒學。從 單指數衰減統計（圖3D 和圖3D） .S3C）。
單⼀跡線中可以獲得⾼精度的結合動⼒學訊 NRS 持續時間的分佈報告了⼀個或多個未識別
息，因為每個RS 通常包含數⼗到數百個開關結 的 NAA 運⾏的裂解率。初始 DQQ 基序的平均
合事件，從⽽產⽣可進⾏統計分析的PD 和脈衝 NRS 持續時間為 155 分鐘（圖 3D）。平均裂
間持續時間(IPD) 測量值的分佈。每個 NAA 的 解率是關鍵參數，由測定中氨肽酶濃度控制
重複探測還提供了準確的識別器調⽤，因為調 （圖 S3、D 和 E）。鑑於指數⾏為，我們的⽬
⽤不是基於與關聯的單⼀事件的容易出錯的檢 標是平均 RS 持續時間為 10 ⾄ 40 分鐘
測。
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圖 5. 混合物中勝肽的區分以及將勝肽映射到⼈類蛋⽩質組。（A）對同⼀晶⽚ 兩種勝肽，DQQRLIFAGK（上）和 EFIAWLVK（下），分別從重組⼈類蛋⽩
上的勝肽 DQQRLIFAG 和 RLAFSALGAADDD 的混合物進⾏定序的範例跡線； 泛素和 GLP-1 中分離出來。（C）該圖說明了根據動⼒學訊息，在⼈類蛋⽩
晶⽚視窗指⽰為每個勝肽產⽣定序讀取的反應室的位置。（⼆）動態排序的 質組的電腦消化中識別出與 DQQRLIFAGK 肽的動⼒學特徵相匹配的蛋⽩質
追蹤範例 泛素。

為脈衝資料收集提供⾜夠的時間，避免因快速 包含⼀組三種勝肽——RLAFAYPDDD、 除了胺基酸序列組成的變化之外，定序讀取

切割⽽錯過 RS，並最⼤限度地減少過⻑的 RS RLIFAYPDDD 和 RLVFAYPDDD——僅在⼀個位
持續時間。我們發現將勝肽的定序概況視覺化 置不同，位於 PS961 N 端⽬標亮氨酸的下游
為動⼒學特徵圖很有幫助－完整勝肽定序時間 （圖 4A）。該位置的每種類型的氨基酸對
過程的簡化軌跡表⽰，包含每個RS的中位數PD PS961 識別 N 端亮氨酸過程中獲得的 PD 都有
以及每個RS和NRS的平均持續時間（圖3E） 。 不同的影響。我們觀察到 LAF、LIF 和 LVF 的中
這些⾼度特有的特徵提供了豐富的序列依賴性 位數 PD 分別為 1.29、2.22 和 4.21 秒（圖
信息，⽤於繪製從肽到其來源蛋⽩質的踪跡。 4B）。除了亮氨酸的 PD 差異外，每個勝肽在
亮氨酸和苯丙氨酸識別之間的間隔內都顯⽰出
特徵性 RS 或 NRS（圖 4A 和圖 S4A）。這些結
果證明了定序讀取對單⼀位置變化的敏感性，
並說明直接識別的 NAA 和相鄰殘基都可以影響
從定序獲得的完整動⼒學特徵。
為了證明此核⼼⽅法及其動⼒學原理適⽤於
廣泛的勝肽序列，我們對合成勝肽
DQQIASSRLAASFAAQQYPDDD、
RLAFSALGAADDD 和EFIAWLV（E，⾕氨酸；
P，脯氨酸）（⼈類胰⾼⾎糖素樣勝肽的⼀段）
進⾏了定序- 1 (GLP-1)—在與 DQQRLIFAG 相同 因為 RLIFAYPDDD 等勝肽中 YP 基序的氨酰
的定序條件下（圖 3F）。每個勝肽根據其序列 基-脯氨酸鍵不能被 PhTET 氨肽酶裂解（11,
產⽣特徵動⼒學特徵（圖3G）。我們獲得了肽 12),在跡線末端觀察 YP 脈衝可確保切割已從第
DQQIASSRLAASFAAQ-QYPDDD 中第 18 位 ⼀個可識別氨基酸到最後⼀個可識別氨基酸完
（最遠可識別的氨基酸）的讀數，說明該⽅法 全進⾏。因此，RLIFAYPDDD 的定序輸出提供
與⻑肽相容，並且能夠深度獲取肽中的序列資 了⼀個⽅便的資料集，⽤於檢查可能導致勝肽
訊。 鑑定錯誤的⾮理想⾏為的⽣化來源。痕跡中不
完整資訊的主要來源是由於快速連續裂解事件
的隨機發⽣⽽導致的預期 RS 的刪除（圖 S4B）
以及由於光損傷或表⾯分離導致的讀取提前終
⽌（圖 S4C）。
對 PTM 引起的變化也很敏感。作為⼀個例⼦，
我們檢查了蛋氨酸的氧化。甲硫胺酸側鏈的硫
醚部分在勝肽合成和定序過程中容易被氧化。
我們確定 PS961 與 N 端甲硫胺酸的勝肽結合，
解離常數為 (Kd）為 947 ± 47 nM（圖
S4D），並假設氧化導致極性甲硫氨酸亞砜側
鏈，當位於 P2 時，會消除結合併降低 NAA 結
合親和⼒。我們透過計算確定，蛋氨酸亞砜在
PS961 NAA 結合⼝袋中⾮常不利，並且⾮極性
殘基在 P2 處是⾸選（圖 S4E 和圖 S2H）。我
們對合成肽RLMFAYPDDD（M，蛋氨酸）進⾏
了測序，並觀察到具有不同動⼒學特徵的兩個
痕跡群體——第⼀個群體包含亮氨酸識別，中
位PD 為0.86 s，第⼆個群體的中位數PD 為0.35
s（圖4C） 。來⾃第⼀群體的痕跡也顯⽰出在
亮氨酸和苯丙氨酸識別之間的時間間隔內具有
短PD的甲硫氨酸識別（圖4D）。第⼆群的痕跡
中不存在甲硫胺酸辨識（圖4D ），顯⽰這些勝
肽中的甲硫胺酸側鏈不能被PS961辨識。當我
們透過與過氧化氫預孵育來完全氧化蛋氨酸時
（參⾒材料和⽅法），我們觀察到蛋氨酸識別
和亮氨酸都被消除

單⼀胺基酸變化和 PTM 的獨特動⼒學特徵

為了說明從定序獲得的動⼒學參數如何對序列
組成的變化敏感，我們進⾏了定序

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如預期的那樣，識別簇具有較⻑的中位數 PD 探測（15-17）。奈⽶孔⽅法提供了即時讀數和 15. J·斯⽡⽶納坦等⼈，納特。⽣物技術。36、1076‒1082（2018）。

（圖 4E）。這些結果證明了由於 PTM 對辨識 簡單性的潛⼒，但⾯臨著與多肽的⼤⼩和⽣物 16. JD埃格森等⼈，bioRxiv 2021.10.11.463967 [預印本]（2021）；

https://doi.org/10.1101/2021.10.11.463967。
的動⼒學效應⽽具有極其靈敏的檢測能⼒。 物理複雜性相關的巨⼤挑戰。18-20）。我們的 17. M. Chee、K. Gunderson、MP Weiner，利⽤核酸編碼進⾏⼤分
定序技術的功能很容易擴展，並且有多個領域 ⼦分析（2019）；https://pdfaiw.uspto。gov/.aiw?
需要改進。蛋⽩質組覆蓋範圍的擴⼤可以透過 Docid=20190145982。
18.張三等⼈，納特。化學。13、1192‒1199（2021）。
辨識器的定向進化和⼯程來實現。這裡展⽰的 19. H. Brinkerhoff、ASW Kang、J. Liu、A. Aksimentiev、C. Dekker、 科
對勝肽混合物進⾏定序並繪製源⾃⼈類蛋⽩質 NAA 標靶約佔⼈類蛋⽩質組的 35.6%，但親和 學374、1509‒1513（2021）。
的勝肽圖譜 ⼒較低的 NAA 標靶需要更⻑的 PD 才能在所有 20.JA阿爾法羅等⼈，納特。⽅法18、604‒617（2021）。
21.J.斯⽡⽶納坦、AA布爾加科夫、EM⾺科特、PLOS 計算。
蛋⽩質體學應⽤需要鑑定來⾃⽣物來源的混合 序列環境中進⾏檢測。新胺基酸或 PTM 的識別
⽣物。11、e1004080 (2015)。
物中的勝肽。為了將我們的結果擴展到勝肽混 器可以從⽬前的識別器進化⽽來，或在其他⽀ 22. BD Reed、MJ Meyer、JF Beltrán，「整合半導體裝置上
合物和⽣物衍⽣勝肽，我們進⾏了兩項實驗。 架的篩選中被識別，例如其他類型的 NAA 或 的即時動態單分⼦蛋⽩質定序」的程式碼和資料。澤諾多
(2022)；https://doi.org/10.5281/zenodo.7017750。
⾸先，我們混合 DQQRLIFAG 和 PTM 結合蛋⽩或適體。對於從頭測序來說，擴
RLAFSALGAADDD 勝肽，將它們固定在同⼀晶 展到檢測所有 20 種天然氨基酸和多個 PTM 是
⽚上，並進⾏定序。數據分析（參⾒材料和⽅ 可⾏的；然⽽，部分序列對於⼤多數蛋⽩質體 致謝
法）確定了與每個勝肽相對應的兩組痕跡，其 學應⽤來說已經⾜夠了，這些應⽤依賴於映射 我們感謝陳陳在準備⼿稿過程中進⾏的有益討論。資⾦：這項⼯作
由 Quantum-Si, Inc. 資助。 作者貢獻：ADG、AL、AMvO、AP-K.、
動⼒學特徵與單⼀勝肽運⾏中鑑定的動⼒學特 到預定義的候選蛋⽩質組
BDR、BS、CL、DHP、EM、FL、GP、HH、JAB、JP、JT、JZ、
徵⾮常⼀致（圖5A和圖S4F）。其次，為了證

2024 年 2 ⽉ 6 ⽇於國⽴中正⼤學 https://www.science.org 下載

KB、
明我們的⽅法擴展到⽣物衍⽣的勝肽，我們對 KFC、M.Mi.、MME、MP、MR-C.、MWB、NDB、NS、OA、RB、
RN、S.Ha.、SG、SSP、TDC、XS 和 Y.-CW 開發了蛋⽩質定序⽅法
使⽤AspN/LysC 消化的重組⼈泛素（76 個氨基
和試劑；A. Bu.、D. Be.、DF、GA、GK、JFB、MD、MJM、SFS、
酸）和GLP-1（37 個氨基酸）蛋⽩的簡單⼯作 SL、VA 和 ZZ 開發的軟體；和 A. Bel.、A. Bet.、AK、BL、CC、
流程⽣成的肽庫進⾏了測序，胰蛋⽩酶，分別 D.Bo.、EAGW、FRA、GS、JB、JC、JD、JS、KP、KR、LH、
（參⾒材料和⽅法）。對於這兩個⽂庫，數據 MB、MF、PA、
PL、PT、R.Cl.、R.Cu.、S.Ho.、SC、TC、TR、TRT、XM、XW 和
分析很容易識別出與泛素和GLP-1 的蛋⽩酶裂 ZH 開發了半導體晶⽚、奈⽶光⼦學、雷射和儀器。JMR、M.Mc.、
解產物DQQRLIFAGK 和EFIAWLVK（K，賴氨 (21)。可以對氨基肽酶進⾏改造，以優化切割 TR、BDR、MD、GS、MF、PL 和 MDD 監督和/或獲取資源和資⾦。
酸）的預期識別模式相匹配的痕跡，並產⽣與 速率並最⼤限度地減少快速連續切割造成的 RS BDR、MJM、MP 和 BS 設計了實驗和/或產⽣了圖中所⽰的單分⼦辨
識和定序資料。BDR、MJM 和 JFB 分析了定序數據並準備了圖表。
這些肽的合成版本⼀致的動⼒學特徵（圖.5B和 缺失。我們預計，樣品的動態範圍和最適合系 MP 和 GP 表徵了辨識器整體動⼒學特性。OA 從重組蛋⽩中產⽣⽂
圖S4G)。我們利⽤動⼒學資訊提供的簡單序列 統的應⽤將傾向於隨著晶⽚上反應室的數量⽽ 庫。HH 和 Y.-CW 產⽣模型勝肽。DHP 進⾏了計算建模。BDR 領導
約束，在⼈類蛋⽩質組中鑑定了與泛素肽 擴展，並且對於某些應⽤，動態範圍的壓縮將 了這項研究，並在合著者的審查和評論下撰寫了⼿稿。所有作者均符
合作者⾝份標準，並透過進⾏實驗、開發⽅法和概念、分析和解釋數
DQQRLIFAGK 的動⼒學特徵的匹配（參⾒材料 是必要的。我們預計該平台的未來發展將提⾼ 據、開發軟體、監督研究或獲取資⾦，為定序⽅法和平台的發展做出
和⽅法）。我們發現除了泛素之外，只有⼀種 蛋⽩質體學研究的可近性，並促進⽣物學和臨 了關鍵貢獻。利益爭奪： Quantum-Si, Inc. 的所有附屬作者以及
蛋⽩質含有可能與該特徵相符的勝肽（圖 床研究的發現。 ADG 和 AMvO 均為 Quantum-Si, Inc. 所擁有專利的股東和/或被列為
發明⼈；ADG 和 AMvO 是 Quantum-Si, Inc. 科學顧問委員會的成
5C）；因此，即使是短簽名也可以表現出<⼗分
員，並且是付費顧問。本⽂介紹的技術是 Quantum-Si, Inc. 向美國
之⼀的蛋⽩質組豐度4蛋⽩質。這些結果說明了 專利商標局和國際辦事處提交的眾多待審或已授予專利的主題。數據
定序的完整動⼒學輸出的潛⼒，可以實現勝肽 和材料可⽤性：本⽂中使⽤的資料和⾃訂程式碼可以在 Zenodo (
22）。 根據材料轉讓協議，可以從 Quantum-Si, Inc. 獲得定序試劑
與其來源蛋⽩質的數位映射。
和儀器。許可證資訊： 版權所有 © 2022 作者，保留部分權利；獨家
被授權⼈美國科學促進會。沒有聲稱擁有美國政府原創作品。
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