· 246· 滨州医学院学报 2023 年 8 月第 46 卷第 4 期 BMU Journal，August. 2023，Vol. 46，No.

地黄饮子对缺血性脑卒中的血管新生
作用及机制研究

1 1 1 2 1 1* 1*
王欣宇 孟维然 徐晓艳 李丽娅 闫 超 叶 蕾 宫健伟
1 滨州医学院康复医学院 山东 烟台 264003； 2 潍坊市中医院 山东 潍坊 261000

【摘要】 目的 研究地黄饮子对氧糖剥离再灌注（ OGD / Ｒ） 损伤 PC12 细胞和对缺血 / 再灌注损伤大鼠的神经保护作用

及作用机制。方法 （ 1） 采用 PC12 细胞制备 OGD / Ｒ 细胞损伤模型。MTT 法检测不同浓度地黄饮子对 PC12 细胞活性
的影响； MTT 法检测 OGD / Ｒ 细胞模型制备的最佳时间； 荧光倒置显微镜下观察各组细胞的形态； EDU 染色检测 OGD / Ｒ
损伤以及地黄饮子给药处理对 PC12 细胞增殖的影响； Western blot 检测 PC12 细胞内 p-PI3K / PI3K、p-AKT / AKT、p-eNOS /
eNOS 相关通路蛋白的表达。（ 2） 健康 SPF 级 SD 雄性大鼠 50 只，随机分为假手术组，模型组，地黄饮子低、中、高剂量组
（ 8、 32 g·kg － 1 ） ，每组 10 只。除假手术组外其余 4 组均建立双侧颈总动脉夹闭再灌注损伤（ BCCAO / Ｒ） 模型，缺血再
16、
灌注模型制备结束后，于次日灌胃给药，
1 次 / 天，连续给药 7 d 后，采用 Western blot 检测大鼠脑组织中 p-PI3K / PI3K、p-
AKT / AKT、p-eNOS / eNOS 相关通路蛋白以及血管内皮生长因子（ VEGF） 的表达。结果 地黄饮子能显著提高细胞存活
率（ P ＜ 0． 01） ； OGD / Ｒ 处理 4 h 能显著降低细胞增殖率，为最佳缺氧时间（ P ＜ 0． 01） ； OGD / Ｒ 损伤显著降低细胞的增殖
而地黄饮子能显著提高细胞的增殖率（ P ＜ 0． 01） ； 地黄饮子给药处理后，PC12 细胞内 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 水平显
率，
著上升（ P ＜ 0． 05） ； 脑缺血再灌注损伤大鼠血管新生通路调节蛋白 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 以及 VEGF 水平显著上升（ P
＜ 0． 05，P ＜ 0． 01） 。结论 地黄饮子可能通过调节 PI3K / AKT / eNOS 信号通路表达，对经 OGD / Ｒ 损伤的 PC12 细胞产生
保护作用，并调节 VEGF 蛋白表达水平从而促进脑缺血再灌注损伤大鼠血管新生，发挥脑保护作用，为临床应用地黄饮
子治疗脑缺血疾病提供了理论基础。
【关键词】 地黄饮子； 细胞增殖； 血管新生； 缺氧 / 再灌注损伤； PC12 细胞； SD 大鼠
【中图分类号】 Ｒ285． 5 【文献标志码】 A 【文章编号】 1001-9510（ 2023） 04-0246-08
DOI： 10． 19739 / j． cnki． issn1001-9510． 2023． 04． 002
Exploring the Vasculogenesis Effects and Mechanisms of Dihuangyinzi in Ischemic Stroke
* *
WANG Xinyu1 MENG Weiran1 XU Xiaoyan1 LI Liya2 YAN Chao1 YE Lei1 GONG Jianwei1
1 School of Ｒehabilitation Medicine Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，P． Ｒ． China；
2 Weifang Traditional Chinese Medicine Hospital，Weifang 261000，Shandong，P． Ｒ． China
【Abstract】 Objective Study of the neuroprotective effects and mechanisms of Dihuangyinzi on PC12 cells after oxygen
gluoose stripping reperfusion （ OGD / Ｒ） injury and SD rate after ischemia / reperfusion injury． Methods （ 1） A model of OGD /
Ｒ cell injury was prepared using PC12 cells； the effect of different concentrations of Dihuangyinzi on the activity of PC12 cells
was examined by MTT； the optimal time for the preparation of OGD / Ｒ cell model was examined by MTT； the morphology of each
group of cells was observed under fluorescence inverted microscope； the proliferation of PC12 cells under OGD / Ｒ injury and Di-
huangyinzi administration was examined by EDU staining； the effect of PC12 cell proliferation under Dihuangyinzi administration
was examined by Western blot． Western blot was performed to detect the expression of p-PI3K / PI3K，p-AKT / AKT and p-eNOS /
eNOS related pathway proteins in PC12 cells． （ 2） Fifty healthy SPF-grade SD male rats were randomly divided into the sham-op-
erated group，the model group and Dihuangyinzi low，medium and high dose groups （ 8，16 and 32 g·kg － 1 ） ，with 10 rats in
each group． The ischemic / reperfusion injury （ bilateral common carotid artery occlusion reperfusion ischemic injury，BCCAO / Ｒ）
model was established in all four groups except the sham-operated group，and the ischemic / reperfusion model was prepared and

基金项目： 山东省自然科学基金（ ZＲ2019MH104） ； 山东省高等学校科技计划（ J18KA264） ； 烟台市重点研发计划（ 2019XDHZ107） ； 大学生

创新创业训练计划 （ S202110440118）
通信作者： 宫健伟，E-mail： jwgongfzh@ 163． com； 叶蕾，E-mail： bzmcyelei@ 163． com
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administered by gavage on the next day，once / day． After 7 days of continuous administration with once a day，the expression of
p-PI3K / PI3K，p-AKT / AKT，p-eNOS / eNOS-related pathway proteins and vascular endothelial growth factor （ VEGF） in rat
brain tissues were detected by Western blot． Ｒesults Dihuangyinzi significantly increased the cell survival rate （ P ＜ 0． 01） ；
OGD / Ｒ treatment for 4 h significantly decreased the cell proliferation rate，which was the optimal time for hypoxia （ P ＜ 0． 01） ；
OGD / Ｒ injury significantly decreased the cell value-added rate，while Dihuangyinzi significantly increased the cell proliferation
rate （ P ＜ 0． 01） ； The levels of p-PI3K，p-AKT and p-eNOS in PC12 cells increased significantly after the treatment with Dihuan-
gyinzi （ P ＜ 0． 05） ． The levels of p-PI3K，p-AKT，p-eNOS and VEGF were significantly increased in rats with cerebral ischemi-
a / reperfusion injury （ P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01） ． Conclusion Dihuangyinzi may have a protective effect on OGD / Ｒ danaged PC12
cells by regulating the expression of PI3K / AKT / eNOS signaling pathway，and regulate the expression level of VEGF protein to
promote cerebral neovascularization in rats with cerebral ischemia / reperfusion injury，providing a theoretical basis for the clinical
application of Dihuangyinzi in the treatment of cerebral ischemic diseases．
【Keywords】 Dihuangyinzi； cell proliferation； angiogenesis； hypoxia / reperfusion injury； PC12 cells； SD rat

脑卒中是临床中老年人常见的一种脑血管疾
病，同时也是当前患者死亡的首要原因。 脑卒中包
括缺血性脑卒中和出血性脑卒中两种，其中缺血性
脑卒中患者数占脑卒中总数的 80%
卒中，又名脑梗死，其最基本的病理过程是局部缺血
导致的脑组织供氧严重不足，常由与脑组织供血的
相关动脉血管发生闭塞引起。 对于该病的临床治
疗，西医主要采取血管再通、改善脑循环、促进血管
及神经再生以及置入动脉支架等措施 。其中药物溶
栓是目前最有效的治疗方法，然而药物溶栓受到缺
血 / 再灌注损伤潜在损害的限制
民间名方，其有效成分主要为熟地黄、山茱萸、巴戟
天、肉苁蓉、炮附子、石斛、肉桂、五味子、茯苓、麦冬、
远志、石菖蒲、生姜、大枣等。 研究表明，地黄饮子
具有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、促脑血管组织重构
等作用，为脑卒中的治疗提供了新方法
血管新生在恢复脑组织的氧供方面具有明确的
［7］
作用 。血管新生是毛细血管网再生的一种，它是
在原血管的解剖结构基础上进行的，其主要实现方
式是血管内皮细胞的分裂与再生，使其功能与局部
［8-9］
需要相适应的生物学过程
血性脑卒中之间联系的分子机制值得更为深入的研
究。在脑缺血再灌注损伤机制中炎症反应与血管新
生都属于为抵抗损伤所形成的防御机制，两者在脑
缺血再灌注生理病理过程中关系密切 。课题组前期
从多角 度 验 证 了 地 黄 饮 子 对 脑 缺 血 的 脑 保 护 作
［10］
用 。实验研究证实在脑缺血模型大鼠脑组织中 ，
应用地黄饮子可以促进血管内皮生长因子 （ vascular
endothelial growth factor，VEGF） 的释放和表达，并且
可以有效地促进脑缺血再灌注模型大鼠脑组织缺血
［11］
区域的血管新生 。 然而地黄饮子促进脑缺血血
管新生的作用机制尚不明确。本研究采用氧糖剥离
再灌 注 （ oxygen glucose stripping reperfusion，OGD /
Ｒ） 细胞损伤模型和缺血 / 再灌注损伤大鼠模型，观
［1］
。 缺血性脑 察地黄饮子促进细胞增殖和对血管新生的作用 ，探
讨其对大脑保护作用的机制，为临床应用地黄饮子
治疗脑缺血疾病提供理论基础。
1 材料与方法
实验细胞 PC12 细胞由武汉普诺赛生命科技
1． 1
有限公司提供。
1． 2 实验动物 购买实验性 SPF 级雄性 SD 大鼠
［2-3］
。 地黄饮子，为 50 只，
8 周龄，体质量控制在 （ 250 ± 50） g，由济南朋
悦实验动物繁育有限公司提供，动物质量合格证号
为 1107261911003054，许 可 证 号 为 SCXK （ 鲁 ）
20190003。
1． 3 实验药物及试剂 地黄饮子按原方比例 （ 熟
［4-6］
。 地黄、山茱萸、巴戟天、肉苁蓉、炮附子、石斛、肉桂、
五味子、茯苓各 30 g，麦冬、远志、石菖蒲各 15 g，生
姜 3 片、大枣 2 枚） 配伍 （ 山东省滨州医学院附属医
院门诊部中药房 ） 提供，药物用 10 倍量和 8 倍量的
水煎煮 2 次，每次 1 h，合并水煎液，用旋转蒸发仪浓
。因此，血管新生与缺 缩，于 4 ℃ 恒温冰箱保存。 水合三氯乙醛 （ 北京百
灵威科技有限公司 ） ，用生理盐水配置为 10% 水合
氯醛、高效 ＲIPA 组织 / 细胞裂解液 （ 上海碧云天生
物公司） 、Western blot 凝胶试剂盒、彩虹 marker（ 北
京索莱宝科技有限公司 ） 、鼠抗 β -actin 多克隆抗体
（ 上海远慕生物科技有限公司 ） 、兔抗 PI3K 单克隆
抗体、兔抗 p-PI3K 多克隆抗体、兔抗 AKT 多克隆抗
体、兔抗 p-AKT 多克隆抗体、兔抗 eNOS 多克隆抗
体、兔抗 p-eNOS 单克隆抗体（ 艾博抗 （ 上海 ） 贸易有
限公司 ） 、兔抗 VEGF 多克隆抗体 （ 武汉三鹰生物技
术有限公司 ） 、高糖 DMEM 细胞培养基、青-链霉素
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混合液（ 100 × ） 、无糖 DMEM 细胞培养基 （ 美国 Hy- 1． 7． 1 MTT 法检测各组细胞存活率

分组处理结
Clone 公司） 、胎牛血清 （ 美国 GIBCO 公司 ） 、胰蛋白 束后，将 96 孔板取出，给药组每孔加入 200 uL PBS
酶-EDTA 消化 液 （ 南 京 康 成 生 物 园 ） 、二 甲 基 亚 砜 润洗 1 遍以防止药物着色的影响，然后加入新鲜的
（ 永力学试剂有限公司 ） 、EdU 试剂盒 （ 北京全式金 完全培养液 200 μL 。 在避光条件下所有实验孔每
生物技术有限公司） 、MTT 试剂盒 （ 上海炎熙生物科 孔加入 20 μL MTT 液体，于 37℃ 培养箱中孵育 3 h。
技有限公司） 。 孵育结束后，在避光情况下，用移液器轻轻吸除各孔
1． 4 实验仪器 超净工作台 （ 西班牙 TELSTAＲ 公 内的液体，然后 150 μL / 孔 DMSO 排枪加入，振荡器
司） 、CO2 培 养 箱、三 气 培 养 箱 （ 美 国 THEＲMO 公 震荡 10 min，酶标仪 490 nm 波长检测吸光度值。
司） 、荧光倒置显微镜（ 德国 Leica 公司） 、高内涵（ 美 给药组 OD 值 － 空白组 OD 值
增殖率 = × 100%
谷分子仪器（ 上海） 有限公司） 、电子天平 （ 上海良平 对照组 OD 值 － 空白组 OD 值
仪器仪表有限公司） 、电热恒温水浴锅 （ 南京建成仪 按照如上公式计算 PC12 细胞的增殖率，以地
器公司） 、离心机（ 上海博翎精锐设备有限公司 ） 、高 黄饮子的浓度为 X 轴，PC12 细胞的增殖率为 Y 轴
压蒸汽灭菌器（ 松下健康医疗器械株式会社 ） 、低温 画出线性回归曲线。
离心机（ 德国 Eppendorf 公司） 、倒置荧光显微镜 （ 德 倒置显微镜下观察细胞形态 消化离心收
1． 7． 2
国 Leica 公司） 、多功能酶标仪 （ 德国 BMG Labtech） 集细胞，在两组 6 孔板中加入细胞悬液。24 h 贴壁
蛋白电泳转移系统购于美国 Bio-Ｒad 公司。 完成后，正常组于正常培养箱培养 4 h。模型组换为
1． 5 造模方法 无糖无血清培养液于三气培养箱培养 4 h，建立细胞
1． 5． 1 PC12 细胞 OGD 造模方法 先用胰蛋白酶 OGD / Ｒ 模型。加药完成后，静置稳定 15 min，然后
消化收集 PC12 细胞，根据种板所需总液体量，将细 放回正常培养箱 24 h。最后，于倒置显微镜下观察，
4
胞浓度稀释至 5 × 10 / mL。 在 96 孔板最外围一周 并用高内涵拍照记录。
每孔加入 200 μL PBS 防止边际效应，其余实验孔中 1． 7． 3 EdU 染色检测阳性细胞率
按照不同实验
加入细胞悬液，每孔 100 μL，于细胞工作超净台中 组处理细胞，完成后进行 EdU 染色。EdU 工作液发
静置稳定 10 min，种板后于正常培养箱培养 24 h，贴 挥作用后，PBS 1 mL 润洗细胞 2 遍，再固定 15 min。
壁结束后每孔换为无糖无血清培养液 100 μL，于三 固定结束，用配比好的细胞通透液于室温环境通透
气培养箱培养 4 h，制备细胞 OGD 模型。 时间 15 min。向两组 6 孔板中每孔加入染色工作液
1． 5． 2大鼠双侧颈总动脉夹闭再灌注损伤 （ bilater- 1． 2 mL，于室温环境避光条件处理 30 min。 再向两
al common carotid artery occlusion reperfusion ische- 组 6 孔板每孔加入 1． 2 mL Hoechst 反应液，于室温
mic injury，BCCAO / Ｒ） 模型的制备 SD 大鼠术前禁 环境避光条件处理 15 min。 最后，将 6 孔板放于荧
食 12 h。用 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，仰 光倒置显微镜下观察，并用高内涵拍照记录。
卧位固定，备皮后切开颈前皮肤，暴露两侧颈总动 1． 7． 4 Western blot 法检测蛋白水平
用含有蛋白
脉，并将其与迷走神经分离，用无创动脉夹夹闭两侧 酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，采用 BCA 法测量蛋
颈总动脉 30 min，造成大鼠急性脑缺血。30 min 后 白浓度。蛋白变性后，恒压 SDS-PAGE，半干法转膜
松开动脉夹再灌注 30 min，30 min 后再次用无创动 PVDF 膜。5% 脱脂牛奶封闭 1 h，Ⅰ 抗 4℃ 孵育过
脉夹夹闭两侧颈总动脉 30 min，松开后缝合结束模 夜，Ⅱ抗室温孵育 1 h，每一步孵育后均使用 TBST
型制备。整个手术造模过程，均用浸有温热生理盐 洗膜 15 min × 3 次。ECL 发光检测，用 Image J 软件
水的纱布覆盖切口表面。 测量图像灰度值进行分析。
1． 6 分组及给药 PC12 细胞设定组别为正常组 统计学方法 本研究选择 SPSS 23． 0 统计软
1． 8
（ 对照组和地黄饮子 80 μg / mL 组） 和模型组 （ OGD / 件。定量数据以（ x ± s） 表示，经正态性检验后，组间
Ｒ 模 型 组 和 OGD / Ｒ 模 型 + 地 黄 饮 子 80 μg / mL 差异用单因素方差分析。P ＜ 0． 05 表示差异有统计
组） 。雄性 SD 大鼠 50 只，饲养于滨州医学院实验 学意义。
动物中心，适应性喂养一周，根据体质量随机分为 5 2 结果
组，分别为假手术组，模型组，地黄饮子低、中、高剂 地黄饮子对 PC12 细胞活力的影响 MTT 法
2． 1
量（ 8、 ） 组，每组 10 只。 通过增殖率的计算，结果显示，在正常培养条件下，
－1
16、
32 g·kg
1． 7 实验方法 与对照组相比，不同浓度的地黄饮子（ 10、
20、
40、
80、
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160、 640 μg / mL） 剂量组增殖率显著升高 （ P ＜

320、 地黄饮子对 PC12 细胞增殖的影响 EdU 染
2． 4
0． 05 或 P ＜ 0． 01） 。 根据实验结果的稳定性，筛选 色显示细胞增殖能力。与对照组比较，地黄饮子 80
出给药浓度为 80 μg / mL，用于后续实验。见图 1。 μg / mL 组蓝色、黄色荧光数量增加，EdU 阳性率占
比增加（ P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01） 。 与正常组比较，模型
组蓝色荧光、黄色荧光减少，EdU 阳性率占比减少
（ P ＜ 0． 05，P ＜ 0． 01） ，与 OGD / Ｒ 模型组比较，OGD /
Ｒ 模型 + 地黄饮子 80 μg / mL 组蓝色、黄色荧光明显
减少， EdU 阳性率占比减少明显， P ＜ 0． 01。见图 4。

图1 不同浓度地黄饮子处理 24 h 后
PC12 细胞活力的变化（ n = 3）
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01。
OGD / Ｒ 模型对 PC12 细胞活力的影响 MTT
2． 2
法检测细胞 OGD / Ｒ 模型增殖率，结果显示，与对照
组相比，2、4、6、8 h 模 型 组 增 殖 率 显 著 降 低 （ P ＜
0． 05 或 P ＜ 0． 01） 。OGD 损伤时间与细胞增殖率呈
反比，OGD 损伤时间延长，细胞增殖率逐渐 降 低，
OGD / Ｒ 模型损伤了细胞的活力。 根据实验结果的
稳定性，最终筛选 OGD 损伤时间为 4 h，用于后续实
验。见图 2。

A． PC12 细胞 EdU 染色荧光图像； B． PC12 细胞 EdU 染色荧光定量

图（ n = 3） 。
图4 荧光显微镜下观察地黄饮子对 PC12 细胞增殖的影响
# ## ＊＊
与对照组比较， P ＜0． 05， P ＜0． 01。与 OGD/ Ｒ 模型组比较， P ＜0． 01。
2． 5 地黄饮子对 PC12 细胞通路相关蛋白的影响
图 2 不同 OGD 损伤时间对 PC12 细胞细胞活力的变化（ n =3）
Western blot 结果显示，与对照组比较，地黄饮子
与对照组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01。
80 μg / mL 组 PI3K、AKT、eNOS 蛋白表达无明显变
地黄饮子对 PC12 细胞形态学的影响 荧光
2． 3
化，p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 蛋 白 表 达 升 高 （ P ＜
倒置显微镜下观察发现： 正常组细胞形态呈梭型，与
0． 05） ； 与对照组比较，OGD / Ｒ 模型组 PI3K、AKT、
对照组比较，地黄饮子 80 μg / mL 组细胞数量增多；
eNOS 蛋白表达无明显变化，p-AKT 蛋白表达降低
与正常组比较，模型组细胞形态皱缩，细胞数量减
（ P ＜ 0． 05 ） ，p-PI3K、p-eNOS 蛋 白 表 达 明 显 降 低
少，其中 OGD / Ｒ 模型组细胞形态明显皱缩，细胞数
（ P ＜ 0． 01） 。 与 OGD / Ｒ 模型组比较，OGD 模型组
量明显减少。见图 3。
+ 地黄饮子 80 μg / mL 组 PI3K、AKT、eNOS 蛋白表
达无明显变化，p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 蛋白表达升
高（ P ＜ 0． 05） 。见图 5。
2． 6 地 黄 饮 子 对 大 鼠 脑 组 织 通 路 相 关 蛋 白 及
VEGF 表达的影响 Western blot 结果显示，地黄饮
图3 显微镜下观察地黄饮子对 PC12 细胞形态的影响 子中剂量组 p-PI3K 蛋白表达明显升高 （ P ＜ 0． 01） ，
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p-AKT、p-eNOS 蛋白表达升高（ P ＜ 0． 05） ，地黄饮子 组织 VEGF 表达明显升高 （ P ＜ 0． 01） 。 与模型组比

低、高剂量组 p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 蛋白表达明显 较，地黄饮子各剂量组大鼠脑组织 VEGF 表达升高
升高（ P ＜ 0． 01） 。 与假手术组比较，模型组大鼠脑 （ P ＜ 0． 05） 。见图 6。

A． PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT、eNOS 和 p-eNOS 蛋白条带； B． PI3K 和 p-PI3K 蛋白检测结果定量分析； C． AKT 和 p-AKT 蛋白检测结果
定量分析； D． eNOS 和 p-eNOS 蛋白检测结果定量分析。
图5 地黄饮子对 PC12 细胞通路相关蛋白的影响（ n = 3）
与对照组比较，# P ＜ 0． 05，## P ＜ 0． 01。与 OGD / Ｒ 模型组比较，* P ＜ 0． 05。
3 讨论 AKT 之 间 的 链 接 涉 及 磷 脂 酰 肌 醇-4，5-二 磷 酸
缺血性脑卒中因致残率高且发病急，已然成为 （ Phosphatidylinositol 4，5-diphosphate，PIP2 ） 和 磷 脂
现代社会中老年人不可避免的健康隐患 。脑卒中的 酰肌 醇-3，4，5-二 磷 酸 （ Phosphatidylinositol 3，4，5-
发病机制复杂，且影响因素众多，治疗效果也不理 diphosphate，PIP3） 2 个代谢物。 首先 PI3K 加一个 3
想。通过药物溶栓或者手术取栓实现局部血管再灌 位磷酸基团后使 PIP2 磷酸化为 PIP3，PIP3 充当第
注，可以减缓阻塞程度，但由于再通时间短暂且不能 二 信 使 将 磷 酸 肌 醇 依 赖 性 蛋 白 激 酶-1 （ phos-
根治，导致再灌注损伤，造成更严重的后果。采用地 phoinositidedependen tkinase-1，PDK1 ） 和 AKT 聚 集
［16］
黄饮子从脑卒中的病理机制出发，从根本上解决脑 到细胞膜上 。AKT 被认为是 PI3K / AKT 信号通
卒中的危害。从促血管新生的角度出发，构建血液 路 的 中 枢 介 质，是 PI3K 的 下 游 靶 点。 接 下 来
循环通路，从而减轻脑卒中局部血流受阻的影响 。 PDK1、PDK2 分别磷酸化 AKT 蛋 白 上 的 不 同 位 点
血管新生是指根据血管内皮细胞的各项运动方 Thr308 和 Ser473，AKT 激活启动发挥效益［17］。AKT
［12］
式形成新的血管的一种生物学过程 。 血管新生 进一步通过磷酸化最终导致一些下游靶标如内皮型
的调控因子与通路多种多样，其中胞内磷脂酰肌醇 一 氧 化 氮 合 酶 （ endotheLiaL nitric oxidesynthase，
激酶（ phosphatidylinositol3-kinase，PI3K） / 丝氨酸苏 eNOS） 的磷酸化的发生，进而参与血管新生［18］。 另
氨酸蛋白激酶 （ amino acid threonine protein kinase， 一方面，PI3K / AKT 通路的激活又刺激 VEGF 的表
［13］
AKT） 通路是目前研究较明确的缺血后促进血管 达升高。 地黄饮子对 PC12 细胞内的 PI3K、AKT 和
新生的机制之一。PI3K 可以使肌醇环第三位羟基 eNOS 总蛋白的表达并没有明显的影响。 但是研究
［14］
磷酸化 。PI3K 细胞外活化信号来源于多种生长 发现 OGD / Ｒ 细胞模型损伤下 p-PI3K、p-AKT 和 p-
［15］
因子和信号传导复合物，如 VEGF 等 。PI3K 与 eNOS 蛋白表达降低，同时正常组地黄饮子给药处理
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A． PI3K 和 p-PI3K、AKT 和 p-AKT、eNOS 和 p-eNOS、VEGF 蛋白条带； B． VEGF 蛋白检测结果定量分析； C． AKT 和 p-AKT 蛋白检测结果定量
分析； D． PI3K 和 p-PI3KT 蛋白检测结果定量分析； E． eNOS 和 p-eNOS 蛋白检测结果定量分析。
图6 地黄饮子对大鼠脑组织通路相关蛋白及 VEGF 的影响（ n = 3）
与假手术组比较，# P ＜ 0． 05，## P ＜ 0． 01。与模型组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊ P ＜ 0． 01。
以及 OGD / Ｒ 模型组地黄饮子给药处理后 p-PI3K、 促脑缺血再灌注血管新生的作用 。
p-AKT 和 p-eNOS 蛋白表达升高，地黄饮子促进了 本研究运用了大鼠模型模拟疾病的发生 。大鼠
PI3K、AKT 和 eNOS 磷酸化蛋白的表达。 与细胞实 脑缺血再灌注模型一直是人脑卒中损伤模型研究中
［19-23］
验相同，地黄饮子对大鼠脑组织中的 PI3K、AKT 和 的常用疾病模型 。 在体实验脑缺血再灌注模
［24］
eNOS 总蛋白的表达并没有明显的影响 ，但是在脑缺 型的制备中，齐磊等 使用改良线栓法研究丙泊酚
血再灌注模型损伤下 p-PI3K、p-AKT 和 p-eNOS 蛋 对脑缺血 再 灌 注 大 鼠 的 神 经 保 护 作 用 以 及 PKA /
白表达降低，同时地黄饮子低、中高剂量给药处理后 CＲEB 通路进行了验证。 方晓艳等［25］ 使用结扎法
p-PI3K、p-AKT、p-eNOS 蛋白以及 VEGF 表达逐渐升 进行实验观察。但是由于老鼠品系、个人解剖手法
［26］
高，这提示地黄饮子促进了 PI3K、AKT 和 eNOS 磷 等的影响 ，模型制备的灵活度、成功率以及稳定
［27］
酸化以及 VEGF 的表达。 综上所述，地黄饮子发挥 性存在较大的差异。 本研究在令狐艳等 夹闭两
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侧颈总动脉方法的基础上调整了动脉夹闭 、再灌注 et al． Docosanoids Promote Neurogenesis and Angiogenesis，Blood-

Brain Barrier Integrity，Penumbra Protection，and Neurobehavioral
时间为 30 min 进行大鼠脑缺血再灌注模型的制备。
Ｒecovery After Experimental Ischemic Stroke． ［J］． Molecular neu-
该方式灵活高效的同时又保证较高的成功率与大鼠 robiology，2018，55（ 8） ： 7090-7106．
存活率，为进一步观察地黄饮子对大鼠脑缺血再灌 ［10］ 宫健伟，叶 蕾，樊 巧 玲． 地 黄 饮 子 对 脑 缺 血 再 灌 注 模 型 大 鼠
注的干预作用奠定基础。 在细胞实验中，本研究通 Bax，Bcl-2，Caspase-3 蛋白表达的影响［J］． 中国实验方剂学杂
志， 19（ 5） ： 248-251．
2013，
过改变细胞的培养条件，将高糖完全培养基换为无
［11］ 李丽娅，
刘昊，
王超云，
等． 地黄饮子对大鼠脑缺血再灌注后炎症
糖基础培养基，正常培养箱换为三气培养箱对 PC12 32（ 1） ： 23-28．
反应的抑制作用［J］． 中药新药与临床药理，
2021，
细胞进行 OGD 细胞缺氧缺糖模型的制备。 氧糖剥 ［12］ NOWAK-SLIWINSKA P，ALITALO K，ALLEN E，et al． Consen-
夺 OGD 模型近年来被用于细胞水平的人脑卒中损 sus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays
［28］ ［29］
伤模型研究中 。 李丽丽等 通过对 PC12 细胞 ［J］． Angiogenesis，2018，21（ 3） ： 425-532．
［13］ PENG H，YANG H，XIANG X，et al． MuicroＲNA-221 partici-
建立 OGD 损伤模型发现知母须根总皂苷对 OGD 损
pates in cerebral ischemic stroke by modulating endothelial cell
伤下 PC12 细胞的保护作用。 本研究中首先进行了 function by regulating the PTEN / PI3K / AKT pathway［J］． Exp T-
不同 OGD 造模时间的研究。 研究发现 2 h OGD 造 her Med，2020，19（ 1） ： 443-450．

模时间下细胞基本无损伤，恢复正常培养条件后，细 ［14］ FＲUMAN D A，CHIU H，HOPKINS B D，et al． The PI3K Path-
way in Human Disease［J］． Cell，2017，170（ 4） ： 605-635．
胞迅速恢复； 8 h 及以上 OGD 造模时间下细胞损伤
［15］ WEN N，GUO B，ZHENG H，et al． Bromodomain inhibitor jq1
严重，恢复正常培养条件后，细胞难以进行进一步实 induces cell cycle arrest and apoptosis of glioma stem cells through
验研究。根据数据的稳定性，选择地黄饮子给药浓 the VEGF / PI3K / AKT signaling pathway［J］． Int J Oncol，2019，
度为 80 μg / mL 与 4 h OGD 造模时间进行实验。 55（ 4） ： 879-895．
［16］ YANAMANDＲA M，KOLE L，GIＲI A，et al． Development of
本研究从促血管新生层面对地黄饮子治疗缺血
highly sensitive cell-based AKT kinase ELISA for monitoring PI3K
性脑卒中及脑保护作用机制进行了初步探讨，取得了 beta activity and compound efficacy［J］． J Immunoassay Immuno-
较为满意的结果。下一步将在此研究基础上，从构建 chem，2017，38（ 6） ： 663-674．
血管和神经细胞再生等相关信号通路等更深层次开 ［17］ KILIC U，CAGLAYAN A B，BEKEＲ M C，et al． Particular phos-

展研究，
以期揭示地黄饮子治疗缺血性中风的深刻内 phorylation of PI3K / Akt on Thr308 via PDK-1 and PTEN mediates
melatonin's neuroprotective activity after focal cerebral ischemia in
涵，
为临床上合理应用地黄饮子提供实验依据。
mice［J］． Ｒedox Biol，2017，12657-12665．
［18］ ICLI B，WU W，OZDEMIＲ D，et al． MicroＲNA-615-5p Ｒegu-
参 考 文 献
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