Professional Documents
Culture Documents
19 October,2020
[摘要] 研究鹿仙草总多糖( total polysaccharides from Balanophora henryi,TBP) 对酒精性肝病( alcoholic liver disease,ALD) 的
作用,并探究其可能的作用机制。C57BL /6N 小鼠随机分为 4 组,配对饮食对照组,酒精饮食模型组,模型 +TBP 干预组,TBP
-1
对照组。采用 Gao-binge 法制备慢性 ALD 小鼠模型,同时用 400 mg·kg TBP 进行干预,喂养 6 周后留取血清和组织待检测。
与饮食对照组相比,模型组小鼠肝组织表现出明显的脂肪样变和炎性细胞的大量浸润,血清谷丙转氨酶( ALT) 和谷草转氨酶
( AST) 水平升高。经过 TBP 干预后,模型组小鼠肝脏组织病理学变化明显改善,脂质沉积减少,肝细胞排列较为紧密,炎性因
子表达水平降低,同时血清 ALT 和 AST 的水平降低,说明 TBP 具有显著改善 ALD 的作用。对小鼠结肠组织的观察显示,TBP
能有效维持 ALD 小鼠肠道组织结构的完整性,增强紧密连接蛋白 occludin 的表达和降低 miR-122a 水平,更重要的是显著降低
模型小鼠血清脂多糖( LPS) 水平。这一结果表明,TBP 可能通过维持和增强肠道屏障功能来发挥对 ALD 的护肝作用。体外
实验发现,TBP 能够显著抑制乙醇暴露下 Caco-2 细胞中 miR-122a 的表达水平。在 Caco-2 细胞中过表达 miR-122a 诱导了对
occludin 蛋白生成的抑制,而 TBP 的加入可以显著干预这一作用。这些结果提示,TBP 通过增强 occludin 蛋白表达来维持肠道
屏障功能的稳定性,减少肠道 LPS 进入肝脏进而改善 ALD,其潜在机制部分可能是通过抑制 miR-122a 的表达实现的。
[关键词] 鹿仙草多糖; 酒精性肝病; miR-122a; 肠-肝轴; 肠道屏障
[Abstract] The aim of this paper was to investigate the effect of total polysaccharide from Balanophora henryi ( TBP) on alcoholic
liver disease ( ALD) and explore the possible mechanism. C57BL /6N mice were randomly divided into 4 groups: pair-feeding group,
alcohol-feeding model group,model+TBP group and TBP drug control group. The Gao-binge method was used to prepare the chronic
ALD model,and at the same time,400 mg·kg -1 TBP was given for interventional therapy. After feeding for 6 weeks,the serum,liver
and colon tissues were collected for detection. As compared with the pair-feeding group,the model group mice showed obvious fatty de-
generation and a large number of infiltration of inflammatory cells in the liver,with increased serum ALT and AST levels. After TBP in-
tervention,histopathological changes in liver tissues were significantly improved,with decreased lipid deposition,closer arrangement of
hepatocytes,lower expression level of inflammatory factors,and reduced activity of serum ALT and AST,indicating that TBP had a sig-
nificant improvement effect on ALD. The observation of colonic tissues in mice showed that TBP effectively maintained the integrity of
[收稿日期] 2020-03-13
[基金项目] 国家自然科学基金项目( 81903916,
81773959) ; 湖北省自然科学基金项目( 2018CFB644) ; 三峡大学湖北肿瘤微环境与免疫治疗
重点实验室开放基金项目( 2018KZL04)
*
[通信作者] 袁成福,教授,E-mail: yuancf46@ ctgu.edu.cn
[作者简介] 肖莉,讲师,E-mail: xiaoli-cn@ 163.com
4692
肖莉等: 鹿仙草多糖通过靶向 miR-122a 改善酒精性肝病的实验研究
intestinal tissue structure of mice with ALD,enhanced the expression of tight junction protein occludin and reduced miR-122a expres-
sion level. More importantly,TBP significantly reduced serum lipopolysaccharide ( LPS) level in model mice. These results indicated
that TBP may improve ALD by maintaining and enhancing intestinal barrier function. In vitro experiments showed that TBP significantly
inhibited the expression level of miR-122a in Caco-2 cells exposed to ethanol. Overexpression of miR-122a in Caco-2 cells induced the
inhibition of occludin protein production,and the addition of TBP significantly interfered with the effect. These results suggested that
TBP could improve ALD by maintaining the stability of intestinal barrier function and reducing LPS content into the liver,and the
mechanism may be partially related to inhibiting miR-122a expression.
[Key words] polysaccharide from Balanophora henryi; alcoholic liver disease; miR-122a; gut-liver axis; intestinal barrier
doi: 10. 19540 / j.cnki.cjcmm.20200514. 402
[13]
酒精性肝病 ( alcoholic liver disease,ALD) 是由 著 。但是鹿仙草在 ALD 中的作用及其机制还不
于长期过度饮酒导致的一种肝脏损伤性疾病,近年 明确。本实验观察鹿仙草总多糖 ( total polysaccha-
[1]
来在全球范围内的发病率和死亡率急剧升高 ,其 rides from B. henryi,TBP) 对小鼠慢性 ALD 的影响,
发病率在全球逐年增高,在中国已成为继病毒感染 并进一步探讨其可能的作用机制。
之后的第二大肝损伤原因,包括一系列临床组织学 1 材料
病变、酒精性肝脂肪变性、肝炎、肝硬化,甚至导致肝 Lieber-DeCarlic 液体饲料购于南通特洛菲饲料
细胞癌。 尽管已有多年基础、临床的研究,但目前 科技有限公司 ( 酒精饲料货号 TP4030D,对照饲料
ALD 的临床药物如糖皮质激素、磷酸二酯酶抑制剂 货号 TP4030C) ; D941 离子交换树脂购于天津浩聚
等,仍存在较大的局限性,具有疗效不确定或不同程 树脂科技有限公司; 多聚甲醛,中性树脂均购于国药
[2]
度的副作用 。因此,继续研究开发 ALD 的有效治 集团化学试剂有限公司; 总 RNA 提取试剂盒,逆转
疗药物日益迫切。从近年来中医药治疗肝脏疾病的 录试剂盒均购于大连宝生物科技有限公司; 谷丙转
疗效分析显示,中药普遍具有多途径、多靶点的作用 氨酶( ALT) 测 试 盒 ( 货 号 C009-2-1) ,谷 草 转 氨 酶
[3-4]
机制 ,这一优势使其成为研究开发治疗 ALD 药 ( AST) 测试盒 ( 货号 C010-2-1) 购于南京程健生物
物的方向之一。 工程研究所; 肿瘤坏死因子-α ( TNF-α ) ELISA 试剂
鹿仙草是蛇菰科蛇菰属植物筒鞘蛇菰 Balano- 盒( 货号 88-7324-22) ,白细胞介素-1β ( IL-1β ) ELISA
phora henryi Hemsl. 及其近似植株的全草[5],主要分 试剂盒( 货号 88-7013-22) 购于 Invitrogen 公司; 脂多
布在湖北、湖南、云南以及陕西南部地区,作为民族 糖( LPS) ELISA 试剂盒 ( 货号 BH-ELISA0356) 购于
药具有长期使用历史。 其性辛,微甘,寒,主治慢性 上海博湖生物科技有限公司; 基因引物序列由上海
[6]
肝炎、阳痿、消化道出血等疾病 。 现代药理学研 生工生物工程股份有限公司合成; miR-122a 模拟物
究证实,蛇菰具有抗炎镇痛、醒酒保肝、抗氧化、抗癌 或阴 性 对 照 由 Life Technologies 公 司 合 成; Lipo-
[7-8]
等多种生物学作用 。 从蛇菰中分离出的化学成 fectamine 2000 转染试剂盒( 货号 11668019) 购于 In-
分包括苯丙素类、黄酮类、鞣质类等均引起了研究者 vitrogen 公司。
[9]
们的广泛关注 。然而,关于鹿仙草多糖生物活性 鹿仙草植株全草采自湖北省竹溪县,由三峡大
的研究较少。已有多篇文献证实,蛇菰具有醒酒保 学医学院何毓敏副教授鉴定为蛇菰属植株。新鲜的
肝的生物学作用。不同研究者在小鼠的急性酒精中 鹿仙草全草植株,干燥,粉碎。以 6 ~ 8 倍量水煎煮 3
毒和酒精性肝损伤模型中发现,筒鞘蛇菰水提物可 次,合并煎液,减压浓缩至密度约为 1. 10 的药液。
以使小鼠酒精中毒的死亡率降低,减少酒精性肝损 将药液于 55 ℃ 保温条件下边搅拌边加入乙醇至含
伤引起的肝脏变性、坏死,说明筒鞘蛇菰具有明显的 醇为 70%; 低温静置过夜 ( 12 h) ,离心分离出沉淀
[10-12]
解酒和护肝作用 。 用蛇菰水提物干预大鼠酒 物; 以适当乙醇洗涤沉淀物数次,挥去乙醇,加水适
,
精性肝损伤模型后 发现大鼠肝组织的脂肪变性和 量重新溶解沉淀物。 经 D941 离子交换树脂脱色,
炎症浸 润 明 显 减 轻,超 氧 化 物 歧 化 酶 ( superoxide 得到鹿仙草总多糖 ( TBP ) 。 其产率为 7. 5%,蒽酮-
dismutase,SOD) 和谷胱甘肽过氧化物酶 ( glutathione 硫酸法测得多糖质量分数为 87%。
peroxidase,GSH-Px) 活性 显 著 升 高,其 保 肝 作 用 显 PCR 仪 ( 美国 Bio-Rad 公司 ) ; TS100 倒置显微
4693
2020 年 10 月 第 45 卷第 19 期 Vol. 45,No. 19 October,2020
后用显微镜观察拍照,IPP 6. 0 软件测定荧光强度。
2. 3 Caco-2 细胞培养 Caco-2 细胞于 DMEM 培养 2. 7
统计学分析 实验数据以均数 ± 标准差表示,
基,
37 ℃ 和 5% CO 2 的环境中培养分化成上皮细胞 采用 SPSS 18. 0 对组间差异进行 t 检验 ( Dunnett-t)
-1
样单层,然后加入浓度为 100 mmol·L 的乙醇诱导 或单因素方差分析 ( One-way ANOVA) ,以 P< 0. 05
-1
细胞损伤,加 入 或 不 加 入 100 μg·mL TBP,孵 育 为差异具有统计学意义。
48 h,然后收集细胞进行 RT-PCR 或取出细胞爬片 3 结果
进行免疫荧光分析。 3. 1 TBP 具有显著改善慢性 ALD 的作用 利用液
2. 4 转 染 Caco-2 细 胞 为 了 过 表 达 miR-122a, 体酒精饲料按 Gao-binge 法建立小鼠慢性 ALD 模型,
Caco-2细胞换用无血清培养基培养,按 Lipofectamine 同时使用 TBP 进行干预。结果表明,TBP 可显著减
2000 转染试剂盒说明书转染 miR-122a 模拟物或阴 少酒精摄入引起的肝细胞空泡变性、 肝组织的脂质沉
性对照。 积和炎性细胞浸润,
见图 1A,
1B。与配对喂养小鼠相
2. 5Western blot 和 ELISA 法检测 TNF-α,IL-1β 比,
酒精饲料喂养的小鼠血清 ALT 和 AST 水平显著
和 LPS 浓度检测均按 ELISA 试剂盒说 明 书 操 作。 升高( 图 1) ,
而 TBP 的干预可明显降低血清 ALT 和
为了便于分析,所有小于检测限的值均被认为是零。 AST 水平。过度的炎症反应被认为在 ALD 的发病中
[15]
小鼠结肠组织和培养后的 Caco-2 细胞在 RIPA 起着至关重要的作用 。本实验同时检测了小鼠肝
4694
肖莉等: 鹿仙草多糖通过靶向 miR-122a 改善酒精性肝病的实验研究
3. 2
TBP 显著提高 ALD 小鼠的肠道屏蔽功能 3. 4
TBP 通过抑制 Caco-2 细胞的 miR-122a 水平
长期饮酒会导致肠道菌群失调、肠道屏障功能受损 来增加 occludin 的 表 达 已 有 研 究 表 明,肠 道 中
和肠道通透性的增加。本实验观察到慢性酒精喂养 TNF-α 介导的 occludin 蛋白表达受到 miR-122a 表
[16]
的小鼠结肠组织有严重受损情况,而 TBP 的治疗改 达的调节 。本实验检测了 ALD 小鼠结肠组织中
善了酒精导致的结肠上皮细胞紊乱、肠黏膜绒毛受 miR-122a 的水平。与配对饲养组相比,酒精液体饲
损和炎症细胞浸润,见图 2A。检测肠道紧密连接蛋 料组小鼠肠道组织中 miR-122a 表达增加了约 2 倍,
白表达情况,结果显示与慢性酒精暴露小鼠相比, 添加 TBP 显著抑制了乙醇导致的肠道 miR-122a 表
TBP 显著增加了肠道组织 occludin 蛋白的表达水平 达,见图 4A。体外实验也显示,乙醇诱导提高 Caco-
( 图 2B,
2C) 。更重要的是,TBP 的使用明显抑制了 2 细胞中 miR-122a 表达的水平,而 TBP 则抑制了这
慢性酒精暴露小鼠血清中的 LPS 水平 ( 图 2D) 。 以 一作用( 图 4B) 。为了研究 miR-122a 在乙醇诱导的
上结果表明,TBP 能有效抑制酒精对肠道的损伤,维 肠道细 胞 occludin 表 达 中 的 调 节 作 用,使 用 miR-
持肠道屏蔽功能,减少肠源性 LPS 的溢出。 122a mimincs 转染 Caco-2 细胞以过表达 miR-122a。
3. 3 TBP 显 著 提 高 乙 醇 暴 露 下 Caco-2 细 胞 的 结果显示,过表达 miR-122a 明显抑制 Caco-2 细胞
occludin表达 利用乙醇暴露的 Caco-2 细胞作为体 中 occludin 蛋白的表达,而 TBP 的加入则显著逆转
外实验模型,进一步研究 TBP 对肠道屏障功能的影 了 miR-122a 抑 制 occludin 蛋 白 表 达 的 作 用 ( 图
响。结果显示,与乙醇处理的 Caco-2 细胞组相比, 4C ) 。 以 上 结 果 提 示,TBP 可 能 通 过 作 用 于
TBP 的干预显著抑制了乙醇诱导的 occludin 蛋白及 miR-122a来抑制乙醇诱导的 Caco-2 细胞中 occludin
其 mRNA 表达水平的降低,见图 3。 蛋白表达水平的降低。
4695
2020 年 10 月 第 45 卷第 19 期 Vol. 45,No. 19 October,2020
A. HE 染色( ×200) ; B. occludin 表达的免疫荧光图( ×200) ; C. 结肠组织 occludin 蛋白免疫印迹图; D.血清 LPS 浓度。
图2 鹿仙草总多糖对慢性 ALD 小鼠肠道屏蔽功能的影响
Fig.2 Effect of total polysaccharide from Balanophora henryi on the intestinal barrier function of chronic ALD mice
免疫荧光图在 200 倍镜下观察; control. 对照组; TBP. 鹿仙草总多糖; Eth. 乙醇; 与 control 组相比 * P < 0. 05,** P < 0. 01; 与 Eth 组相 比 # P <
0. 05,## P<0. 01( 图 4B 同) 。
图3 鹿仙草总多糖对乙醇处理的 Caco-2 细胞 occludin 表达水平的影响
Fig.3 Effect of total polysaccharide from Balanophora henryi on the expression of occludin in ethanol treated Caco-2 cells
4696
肖莉等: 鹿仙草多糖通过靶向 miR-122a 改善酒精性肝病的实验研究
A.慢性 ALD 小鼠模型; B.乙醇处理 Caco-2 细胞制备体外实验模型; C.用 miR-122a mimics 或 negative 转染 Caco-2 细胞试验。
图4 鹿仙草总多糖对 miR-122a 调节 occludin 表达水平的影响
Fig.4 Effect of total polysaccharide from Balanophora henryi on the expression of occludin regulated by miR-122a
4 讨论 TBP 的这种作用是否与调节肠道菌群有关还需要进
尽管其发 病 机 制 尚 未 完 全 了 解,但 肠-肝 轴 在 一步研究。
ALD 发展中的重要作用已得到研究者们的公认[17]。 occludin 是早期被鉴定的紧密连接蛋白之一,
[25-27]
长期慢性的酒精摄入会引起肠道菌群失调、肠道紧 在调节上皮紧密连接完整性中起重要作用 。
密连接 屏 障 功 能 障 碍 以 及 肠 道 内 毒 素 和 细 菌 移 occludin的过度表达能提高肠道的紧密连接,其表达
[18] [28]
位 。临床试验已经证实,急性和慢性 ALD 患者 的严重受损会导致上皮屏障缺陷和慢性炎症 。
[19]
血清 LPS 都显著升高
。 肠源性 LPS 激活肝脏巨 研究表明,miR-122a 在炎症因子 TNF-α 对 occludin
噬细胞引起的过度免疫反应与 ALD 肝脏脂肪变性、 蛋白表达的调节中起着关键作用。TNF-α 可诱导黏
[20]
坏死和纤维化密切相关 。此外,肠道细胞分泌的 液上皮中的 miR-122a 水平快速增加,抑制 miR-122a
成纤维细胞生长因子( FGF) -15 减少也可以通过肠- 可抑制 Caco-2 细胞形成的单层膜渗透性增加,阻止
[16]
肝轴导致肝脏中肝细胞色素 P450 酶 ( Cyp) -7a1 蛋 其 occludin 蛋白表达水平的降低 。 本实验也同
[21]
白表达增强 。维持肠屏障功能,抑制肝脏巨噬细 样发现,与配对饮食组相比,慢性 ALD 小鼠结肠组
胞的 过 度 活 化,一 直 是 治 疗 ALD 的 重 要 研 究 方 织中 occludin 蛋白的表达降低,同时 miR-122a 表达
[22]
向 。临床试验统计表明,预防性或治疗性使用大 增加。而 TBP 可以抑制这一变化,增强 ALD 小鼠
量抗生 素 对 于 ALD 并 没 有 达 到 更 好 的 治 疗 效 结肠组织中 occludin 的表达并抑制 miR-122a 的水
[23] [24]
果 ,但益生菌,如鼠李糖乳杆菌 GG 等,由于具 平。除此之外,体外实验也表明 TBP 可以抑制乙醇
有改善肠道的功能,已被证实有保护 ALD 的疗效。 暴露下 Caco-2 细胞中 miR-122a 的表达,显著提高
本实验观察 ALD 小鼠的肠道组织发现,TBP 能够干 过表达 miR-122a 的 Caco-2 细胞中 occludin 的表达
预酒精诱导的结肠组织黏膜损伤和炎性细胞浸润, 水平。这些结果提示,TBP 对肠道的保护作用可能
提高肠道紧密连接蛋白的表达,降低血清 LPS 浓 与抑制 ALD 小鼠肠道的 miR-122a 表达有关。
度,对 ALD 动物的肠道具有保护作用。 这一结果表 现代药理学研究表明,蛇菰具有多种生物学功
明,TBP 改善 ALD 肝损伤的可能机制是通过减少肠 能。但是鹿仙草对慢性 ALD 的保护作用及其机制
渗漏,抑制肝脏的过度炎症反应来实现的。 然而, 尚不清楚。本研究表明,TBP 对慢性酒精诱导的肝
4697
2020 年 10 月 第 45 卷第 19 期 Vol. 45,No. 19 October,2020
4698