第七章

X-光晶體繞射學與結構生物學

X-ray Crystallography and Structural Biology

鄭貽生、蔡麗珠、楊維仁、袁小琀

中央研究院 分子生物研究所 研究員

一、前言
晶體學(crystallography)是和天文學一般古老的科學。早在十五世紀時，科學家就發現晶
體有不同的晶面。物理學家 William C. Rontgen 在二十世紀初發現了 X-光，一對父子檔科學
家 Lawrence Bragg 和 William Bragg 緊接著在 1913 年運用 X-光照射在晶體上所產生之繞
射，而測定出一些無機鹽類小分子的結構。然而此後一直到 1960 年左右，Max F. Perutz 和
John C. Kendrew 才克服了種種困難，測定出血紅素(hemoglobin)和肌血紅素(myoglobin)這
些巨大複雜的蛋白質的三維結構，從此展開了一個承先啟後的新學門─蛋白質晶體學。
生物巨分子（包含 DNA、RNA 和蛋白質）的三維結構，已漸漸成為在分子層次上了解
各種生命現象所不可或缺的要素。而 X-光晶體繞射學是獲得高解析度蛋白質三維結構最有效
的方法。至今（2002 年 8 月）在蛋白質資料庫中共存有 16,558 個結構，其中 14,237 個結構
是經由 X-光晶體繞射技術所測定的。我們所知道的一些結構生物學基本概念，也大多源於巨
分子晶體結構的研究成果。1990 年以前在蛋白質資料庫中僅有五百多個結構，近十年來結構
測定的速度快速增加，不論在生命科學裡的哪一個領域，訊息傳遞、基因調控、免疫學、藥
物設計、基因工程等等各個學門，不可避免的將會感受到蛋白質晶體學一波又一波強大的影
響力。

二、X-光蛋白質晶體繞射學原理
1. 蛋白質純化與結晶
獲得蛋白質的晶體結構的第一個瓶頸，就是製備大量純化的
蛋白質(>10 mg)，其濃度通常在 10 mg/ml 以上，並以此為基礎
進行結晶條件的篩選。運用重組基因的技術，將特定基因以選殖
(clone)的方式嵌入表現載體(expression vector)內，此一載體通
常具有易於調控的特性。之後再將帶有特定基因的載體送入可快
圖一、大腸菌素及其免疫蛋
速生長的菌體中，如大腸桿菌(Escherichia coli)，在菌體快速生
白之蛋白質結晶
長的同時，也大量生產表現載體上的基因所解譯出之蛋白質。一
81
般而言純度越高的蛋白質比較有機會形成晶體，因此純化蛋白質的步驟就成為一個重要的決
定因素。
在取得高純度的蛋白質溶液後，接下來就是晶體的培養。蛋白質晶體與其他化合物晶體
的形成類似，是在飽和溶液中慢慢產生的，每一種蛋白質養晶的條件皆有所差異，影響晶體
形成的變數很多，包含化學上的變數，如酸鹼度、沈澱劑種類、離子濃度、蛋白質濃度等；
物理上的變數，如溶液達成過飽和狀態的速率、溫度等；及生化上的變數，如蛋白質所需的
金屬離子或抑制劑、蛋白質的聚合狀態、等電點等，皆是養晶時的測試條件。截至目前為止，
並無一套理論可以預測結晶的條件，所以必須不斷測試各種養晶溶液的組合後，才可能得到
一顆完美的單一晶體(圖一) (1-3)。
蛋白質晶體的培養，通常是利用氣相擴散法
(Vapor Diffusion Method)的原理來達成；也就是將
含有高濃度的蛋白質(10-50 mg/ml)溶液加入適當的
溶劑，慢慢降低蛋白質的溶解度，使其接近自發性
的沈澱狀態時，蛋白質分子將在整齊的堆疊下形成
晶體。舉例來說，我們將蛋白質溶於低濃度(~1.0 M)
的硫酸銨溶液中，將它放置於一密閉含有高濃度
(~2.0 M)硫酸銨溶液的容器中，經由氣相平衡，可以
緩慢提高蛋白質溶液中硫酸銨的濃度，進而達成結
圖二、Vapor Diffusion Method 原理
晶的目的(圖二)(4)。

蛋白質晶體在外觀上與其他晶體並無明顯不同之處，但在晶體的內部，卻有很大的差
異。一般而言，蛋白質晶體除了蛋白質分子外，其他的空間則充滿約 40 %至 60 %之間的水
溶液，其液態的成分不僅使晶體易碎，也容易
使蛋白質分子在晶格排列上有不規則的情形出
現，造成晶體處理時的困難及繞射數據上的蒐
集不易等缺點。但也由於高含水量的特性，讓
蛋白質分子在晶體內與水溶液中的狀態，極為
相似。所以由晶體所解出的蛋白質結構，基本
上可視為自然狀態下的結構。

2. 繞射數據的記錄
X 光繞射點蒐集，隨著時間的推移，也由
早期以閃爍計數器(scintillation counter)一次記
錄一個點及使用許多 X-光片(X-ray film)拍下繞 圖三、大腸菌素及免疫蛋白晶體，以 CCD
射點，每張 X 光片都要經過顯影的步驟；之後 所偵測之 X 光繞射點圖

82
進而使用多重金屬絲板(multiwire)自動記錄每次偵測到的繞射點。目前使用的螢光記錄板
(image plate)，則是利用磷化物經 X 光激發後會產生螢光，經螢光掃描器記錄成數位模式的
影像檔後，再以燈光照射一段時間去除記錄板上的螢光點，即可再進行下一次的記錄工作。
電荷耦合器(charge-coupled devices, CCD)的出現及技術的改良，可以不斷地記錄繞射點，
而不需螢光板掃描及去除步驟，如此將加速繞射點的蒐集。目前的同步輻射光源幾乎全部使
用 CCD 來記錄繞射數據(圖三)。

在實驗室中的 X 光光源的產生，一般使用銅作為旋轉式陽極靶(rotating anode)，可以產

生波長為 1.54 Å Cu Kα放射光。不過，以目前發表的文獻來看，在同步輻射(synchrotron)光
源所蒐集的資料有增加的趨勢，因為同步輻射所提供的 X 光束，其強度較實驗室強約百倍、
甚至上千倍，同時它也可以改變不同頻段的波長，以供非尋常散射(anomalous dispersion)
的實驗研究(見相角決定方法一節)。

3. 繞射原理
單一分子在 X 光下的訊號極弱，無
法被記錄下來，然而在晶體中通常是由
許多排列整齊的蛋白質分子所組成，當
晶體內所有的分子(數量約在 1015 個以
上)一起在同一個方向上進行繞射且繞
射波皆同步時，即足以使所產生的訊號
被記錄下來。每一個繞射波的強度與其
振幅(amplitude)的平方成正比。但繞射
波的另一個變數，繞射波的相角
(phase)，則無法直接測量得到，必須利
用其他的方法方能獲得(見相角決定方
圖四、蛋白質結晶經 X 光繞射所得之電子密度圖
法)。若是繞射點振幅與相角都可獲知， (A)解析度為 2.0 Å 之電子密度圖；
則可以進一步地來計算晶體中的電子密 (B)在鋅的吸收邊緣進行繞射實驗的非尋常散射
度圖。下列方程式即是著名的傅立葉轉 差異電子密度圖，可以標定鋅離子的位置。
換公式，ρ表示在晶體中任何一個位置上
(x, y, z)的電子密度，φhkl 為繞射光相角，|Fhkl|為繞射光振幅，可由實驗測得的繞射光強度開
平方獲得。

ρ( xyz) = ∑hkl Fhkl exp[iφhkl − 2πi(hx + ky + lz)] 傅立葉轉換公式

所以若是記錄了所有的繞射波的強度(h,k,l)，並計算出所有繞射光的相角，帶入這個公式，蛋

83
白質在晶體內的結構，就以電子密度圖的方式呈現在我們的眼前了(圖四)。

4. 相角決定方法
決 定 相 角 通 常 有 三 種 常 用 的 方 法 ， 分 別 是 同 型 置 換 法 (isomorphous replacement
method) 、 非 尋 常 散 射 法 (anomalous dispersion method) 以 及 分 子 置 換 法 (molecular
replacement) ，現在分述如下：
(a) 同型置換法
同型重原子置換法最早的應用是在 1954 年，用來解出血紅蛋白 hemoglobin 的
相角，需要在晶體蛋白質的內部加入重原子。通常以浸泡的方法使重原子能夠滲透
(diffuse)進入到晶體內部和蛋白質結合。這些重原子對 X 光產生較大的繞射，對繞射
點的強度會有明顯的差異，根據這些差異，可定出重原子的位置，並進而推算出蛋
白 質 晶 體 繞 射 光 的 相 角 。 理 論 上 ， 若 是 只 獲 得 一 組 重 原 子 衍 生 物 數 據 (single
isomorphous replacement, SIR)，經計算後，其解並不是唯一的；因此通常會結合
數個不同的重原子衍生物所得到的數據(multiple isomorphous replacement, MIR)，
來求得更精確的相角。
(b) 非尋常散射法
較重的原子會吸收特定波長的 X 光，運用接近吸收邊緣(absorption edge)的 X
光進行繞射實驗時，會產生不尋常的 X 光散射或吸收現象，稱為非尋常散射
(anomalous scattering)，此一現象可導致繞射振幅及相角的改變。經由數個不同波
長的 X 光照射，記錄吸收邊緣前後所產生的不同繞射結果，可依此計算出相角。由
於 它 使 用 數 個 不 同 波 長 ， 所 以 稱 為 「 多 波 長 非 尋 常 散 射 法 」 (multiwavelength
anomalous dispersion, MAD)。使用這個方法的前提是 X 光的波長需依重原子的特
性加以調整，而一般在實驗室的 X 光通常是屬於固定波長的，並無法滿足這個方法，
(5)
所以非尋常散射法就需要利用同步輻射可變波長的光源來完成 。目前很多實驗室
使用硒化甲硫胺酸(selenomethionine)來取代甲硫胺酸 (methionine)，在養菌的同時
加入硒化甲硫胺酸，使蛋白質的形成過程帶入含有重原子硒的硒化甲硫胺酸，接下
來養出蛋白質晶體，在硒的吸收邊緣進行繞射實驗，並運用 MAD 的方法來計算出蛋
白質晶體繞射波的相角(圖四)。
(c) 分子置換法
若是一個未知的蛋白質與另一已解出結構的蛋白質，在胺基酸序列具有 30 %以
上的一致性(identity)，表示這兩個蛋白質的結構可能類似，可以利用分子置換法來計
算出未知蛋白質的相角。利用已知蛋白質之結構分子帶入晶體中尋找旋轉及位移的
(6)
可能位置，解析出結構 。隨著蛋白質結構的增加，可以發現類似的蛋白質具有相
同的折疊方式，而出現新的折疊的機率也相對減少，所以只要未知的蛋白質在蛋白
質資料庫(Protein Data Bank, PDB)中，找到序列上具有同源性(homology)的已知結
84
 構時，即可在取得晶體繞射數據後，快速地運用分子置換法來解決相角問題。
5. 三維結構模型之建立及修正
藉由電子密度圖的三維構形，可將每一個胺基酸依蛋白質序列建立蛋白質的起始模型。
蛋白質的起始模型，常由於相角的解不夠完美，使計算出來的電子密度圖產生誤差，誤導模
型的走向，因此需要做進一步的改善，稱為修正(refinement)。修正的目的在於進行立體化學
(stereochemistry)(如胜 鍵鍵長、鍵角、胺基酸構形)最佳化的同時，減少計算與實驗繞射點
強度的差異，用來評估的數值則是「剩餘值(R-factor)」：

Σhkl (|Fobs|-|Fcalc|)
R=
Σhkl |Fobs|

其中 Fobs 及 Fcalc 分別表示觀察值與計算值的繞射光振幅。儘可能將剩餘值降到最低，直

到進一步的修正無法減少其值為止，即達最終的蛋白質結構模型。大部分修正後可接受的剩
餘值約 0.2 (20%)。但低的剩餘值，並不代表其結構就是正確的。已有數個例子顯示在蛋白質
結構上的某些部分不正確時，仍可能獲得較低的剩餘值。因此 Brünger (7)在 1992 年提出一個
交互驗證的程序，也就是取出部分的繞射點(建議為 10%)，排除於修正的程序之外，以對結
構的正確性，提供個別的檢查，稱為「自由剩餘值(R-free)」，其計算方式同剩餘值。

除了剩餘值外，解析度是另一個判斷晶體結構可信度的重要數值。解析度在蛋白質晶體
結構中通常是定義為：可以分辨二個平面的最小距離。解析度對模型的建構所造成的影響，
可以直接由電子密度圖看出，在低解析度(~6 Å)時，只能觀察到由α螺旋(α-helix)所形成的圓
柱形密度圖；隨著解析度提高(3 Å ~ 2 Å)，主鏈與支鏈結構就會出現，但個別原子仍無法由
密度圖中看出，除非解析度可以達到 1.0 Å 或更高的解析度。蛋白質結構所能達到的解析度，
主要是取決晶體內分子排列的整齊程度。小分子晶體內並沒有太多的水分子，所以常能得到
解析度高於 0.5 Å 的繞射數據。但因蛋白質結構由長的胜 鏈所組成，其間又是由較弱的氫
鍵及凡得瓦力所維繫，造成蛋白質結構富有彈性，蛋白質分子與分子的堆疊也就沒有那麼整
齊。同時分子與分子之間的空隙由水分子來填補，也因這些空隙的水分子排列比較紊亂，所
以蛋白質晶體繞射出的結果，僅有少數高解析度晶體，一般蛋白質晶體結構的解析度約在 2.0
至 3.0 Å 之間。

三、蛋白質晶體結構之應用
1. 結構與功能之相關性
每一種蛋白質各自有自己獨特的三級結構，而個別的特有結構會造就每一蛋白質特有的

85
活性功能區域。在我們想探討蛋白質或酵素( )的生物機制和功能及其化學反應時，蛋白質
的晶體三級結構最能提供詳細的資料，它能讓我們清楚地瞭解蛋白質結構與生物體功能的相
關性。蛋白質的三級結構能讓人了解它們所扮演的角色和各式各樣的功能。例如蛋白質是如
何與親和試劑結合及催化作用機制反應，抗體是怎麼應付外來的病毒等。一個詳細的晶體結
構，不僅說明了蛋白質結構與功能之密切關係，更有助於基礎科學的發展，也為酵素工程、
新藥開發等生物科技，提供了不可或缺的理論基礎。

我們藉由本實驗室測定出的晶體分子結構來探討蛋白質結構與功能機制之相關性。一種
存在於纖毛菌(Fibrobactor succinogenes)中的葡聚醣水解 1,3:1,4-β-D-glucanase 來作說
明，它在牛胃中如何扮演消化纖維質之主要角色。這個酵素可選擇性地水解β1,4 鍵與β1,3 鍵
連接的葡聚糖(β-glucans)和 lichenan。晶體結構顯示葡聚醣水解 是一個含有二個彎曲的
β-sheets 構成，此二個彎曲的β-sheets 構成一種稱為 jellyroll-sandwich topology，此結構之
特性在於其凹面有一凹槽形成，而此凹槽是酵素和醣分子結合處。配合定點突變和酵素催化

(A) (B)

凹槽

圖五、葡聚醣水解 之結構分析
(A) 葡 聚 醣 水 解 由 藍 色 和 黃 色 二 個 彎 曲 的 β-sheets 構 成 一 種 稱 為
jellyroll-sandwich topology。(B)葡聚醣水解 之表面靜電分布和綠色戊醣分子模型
複合體綠色戊醣分子卡進在葡聚醣水解 凹面之空槽。藍、紅、白色各代表正、負、
中性電荷。(A)圖以順時針方向轉 90 度即是(B)圖。

速率分析結果我們可標定出直接參與催化反應的胺基酸殘基、和醣分子結合有關的胺基酸殘
基、以及和穩定結構有關的胺基酸殘基。有了這些結構與功能的相關了解後，下一步可以試
著改變某些胺基酸殘基，以增加酵素的活性或穩定性。在基因工程上，結合結構的資訊來設
計更好的酵素，是被廣為應用的一種方法。

2. 蛋白質晶體學與藥物學
利用已知蛋白質的三級結構來設計藥物(structure-based drug design)，在 1977 年文獻
86
中已有記載。至今為止，蛋白質的結構提供了很多疾病在分子層次上的成因解釋（見表一），
然而在藥物上開發的成功例子並不很多。以遺傳疾病鐮刀形紅血球貧血症（sickle cell
anemia）為例，血紅蛋白結構中的β鏈有一個胺基酸由正常的穀胺酸殘基（glutamate）被
取代成纈胺酸殘基（valine），根據血紅素(hemoglobin)的晶體結構，這個突變位於血紅素分
子的表面，纈胺酸殘基的疏水性支鏈，正好可以插入另一個血紅素分子表面上疏水性的凹洞。
這種血紅素分子間的聚合會導致纖維化現象，而造成紅血球變形成鐮刀狀，無法正常地輸氧。
血紅素的晶體結構在原子層次上解釋了病變的原因，然而經過了很多年很多實驗室的努力，
至今依舊沒有發展出治療鐮刀形紅血球貧血症的有效藥物。

(8)
表一、晶體結構和遺傳疾病

87
 儘管數量不多，近幾年來根據蛋白質的結構也有一些藥物成功地被設計出來，其中有關
抑制愛滋病毒藥物之開發帶來相當的鼓舞及震撼。愛滋病毒的抑制藥物的發展，根源於很多
蛋白 與抑制劑結合的晶體結構。其他的例子包括根據 dihydrofolate reductase 的晶體結構
而發展出來的抗癌藥 methotrexate，以及根據 carboxylpeptidase A 的晶體結構而發展出來
的高血壓藥 captopril。雖然成功的例子不多，但可以想見這只是一個開始，以後更多的蛋白
(8)
質的功能與結構被陸續地破解後，將會有無限的可能 。

四、X-光晶體繞射學之進來發展
X-光晶體繞射學近年來有較大的變化，尤其在同步輻射光源的應用和結構基因體學的發
展上頗有突破。這些發展對結構生物學的未來會有很大的影響。簡單分述於下：
1. 同步輻射光源的應用
同步輻射是二十世紀以來科技研究最重要的光源之一，研究人員藉由同步輻射可從事物
理、化學、生物、材料、化工、環保、能源、電子、微機械等基礎與應用科學研究。現今供
實驗用的同步輻射加速器超過七十座，世界知名的同步輻射中心如美國 SSRL、APS、ALS，
歐洲的 CERN、ESRF，日本的 KEK、SPring-8 等都在生物分子結構學的研究領域上佔有一
席之地。
同步輻射光源在大分子結構學上的重要性在於其光源強大、品質穩定、以及光源能量可
調整的優勢提供了大分子結構解析最佳的工具。應用近年來大分子結構解析的主流方法
MAD，配合先進的電荷耦合器高速地收集數據，加上同步輻射的強大光源，生物大分子結構
解析的速度可大為提升。同步輻射光源強大的 X 光光源更成為結晶學家挑戰解析更大分子量
結構更高解析度的利器。因為巨大分子的晶體通常有著晶格巨大、體質脆弱、繞射數據微弱
等結晶學上的障礙。靠著同步輻射強大的光源克服以上問題，巨大分子結構的解析在近年來
有著許多重大的成就。例如 bovine heart cytochrome c oxidase (分子量：422 kD) (9)、calcium
(10)
pump of sarcoplasmic reticulum (分子量：110 kD) 、以及最近發表的 bacterial RNA
(11) (12)
polymerase holoenzyme (分子量：400 kD) 、ribosome 等，巨大的分子結構都陸續被
測定出來。

2.結構基因體學之發展
結構基因體學(Structural genomics)這門研究的主要目的是希望能快速地在基因資料庫
中加入基因編碼之蛋白質的三度空間結構資料。此項研究在美國、歐洲及日本已經有了初步
的實驗成果。結構基因體學主要進行的工作為突破下列課題中所遇到的瓶頸、改良實驗方法
並加快研究的進行：1、目標的選定；2、選殖目標基因送入適當的表現載體中；3、定序並
確認欲放大表現的基因的序列；4、表現目標蛋白質；5、確認目標蛋白質的生化特性並檢測
結晶化的可行性；6、大量表現目標蛋白質並進行結晶實驗；7、決定並最佳化結晶條件；8、
純化以硒化甲硫胺酸標記的目標蛋白質，利用 MAD 或其他方法得到晶體相位角的資訊；9、
88
決定三度空間結構；10、將結構中所獲得有用的資訊建立資料庫，嘗試藉著資料庫中的結構-
序列相關性模擬出結構未知的新分子模型；11、提供研究成果給所需要的研究單位。由於結
構基因體學的發展，很多新的方法被發展出來，好比蛋白質大量表現和晶體的養成技術逐漸
進入機械化的階段，不論在速度、數量、樣品用量控制或晶化技術都有顯著的進步(圖六) (13)。

圖六、Oryx 6 Robot form Douglas Instrument：可於一年內以約 400 種不同的

養晶條件，篩選 500 個以上的蛋白質，其搭配軟體可支援以 multivariate 程式計
算並設定最適合晶體生長的條件。

表二、美國國家衛生院 NIH 所支持的九個結構基因體研究中心

表二彙整超大型結構基因體研究計劃之研究成果，經過專業的資料庫建立，各領域的研
究人員可以透過例如 http://targetdb.pdb.org 的網站獲得這些成果。未來可預見的是各種生物
(13)
分子的三維結構數據將以驚人的速度累積 。
89
五、結語
蛋白質晶體學未來將如何發展？可預見的前景是大分子晶體結構的測定速度將愈來愈
快，蛋白質的晶體結構將會大量的累積。不但數量驚人，巨大複雜的複合物的結構也會一次
又一次地挑戰已知的極限。不過短短一、兩個世紀以前，人類還尚未擁有這些蛋白質、DNA
和 RNA 在原子層次詳細的結構資料。可想見的是這些資訊將會對生命科學的每一個領域產生
重大的影響。

六、參考文獻
1. Rhodes, C. (1999). Crystallography Made Crystal Clear: A Guide For Users Of Macromolecular
Models. 2nd Ed., Academic Press, New York.
2. Blundell, T. L. and Johnson, L.N. (1976). Protein Crystallography, Academic Press, San Diego.
3. Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-Ray Crystallography, Springer-Verlag, New York.
4. Ducruix, A. and Giege, R. (1992). Crystallization of nucleic acids and proteins- A practical
approach, Information Press Ltd., Oxford.
5. Yang, W., Hendrickson, W.A., Crouch, R.J., and Satow, Y. (1990). Structure of ribonuclease H
phased at 2 Å resolution by MAD analysis of the selenomethionyl protein. Science 249,
1398-1403.
6. Rossmann, M. G. (1972). The Molecular Replacement Method, Gordon & Breach.
7. Brünger, A. T. (1992). Free R value: a novel statistical quantity for assessing the accuracy of
crystal structures. Nature 355, 472-475.
8. Hol, W. G. and Verlinde, C. L. M. J. (1999). International tables of crystallography F, 10-43.
9. Tsukihara, T., Aoyama, H., Yamashita, E., Tomizaki, T., Yamaguchi, H., Shinzawa-Itoh, K.,
Nakashima, R., Yaono, R., and Yoshikawa, S. (1995). Structures of metal sites of oxidized
bovine heart cytochrome c oxidase at 2.8 Å. Science 269, 1069-1074.
10. Toyoshima, C., Nakasako, M., Nomura, H., and Ogawa, H. (2000). Crystal structure of the
calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 Å resolution. Nature 405, 647-655.
11. Vasslyev, D.G., Sekine, S.I., Laptenko, O., Lee, J.Y., Vassylyeva, M.N., Borukhov, S., and
Yokoyama, S. (2002). Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å
resolution. Nature 417, 712-719.
12. Ramakrishnan, V. (2002). Ribosome Structure and the Mechanism of Translation. Cell 108,
557-572.
13.Chance, M.R., Bresnick, A.R., Burley, S.K., Jiang J.S., Lima C.D., Sali, A., Almo, S.C., Bonanno,
J.B., Buglino, J.A., Boulton, S., et al. (2002). Structural genomics: A pipeline for providing
structures for the biologist. Protein Science 11, 723-738.

90