器官

生物的構成與組織層級

分子

組織

族群
巨分子
體

種
聚合酶連鎖反應
Polymerase Chain Reaction

胞器

群聚
系統

生態系
個
細胞
1 2

Covid-19 Detection
 What is Ct?

利用物理及化學的操作方式在分子層級研究基因結構與功
能的現代生物學。

3 4
 DNA Polymerization

Nucleotide
Polymerase Chain Reaction 5’ Primer 3’

(PCR)

3’ DNA
Template DNA 5’
Polymerase

5 6

Principle of PCR Principle of PCR 4 copies

8 copies
2 copies

5’ 3’ N
5’
Denaturation
升溫至94~96°C
N x cycle數
reverse primer
打開雙股的配對

Nx 2cycle數 forward primer

Annealing
降溫至合適溫度
引子配對互補序列

Elongation
升溫至72°C Denaturation Annealing Elongation
聚合酶作用延伸 升溫至94~96°C 降溫至合適溫度 升溫至72°C
互補股完成複製 打開雙股的配對 引子配對互補序列 聚合酶作用延伸
互補股完成複製

5’ a PCR cycle
3’ 5’
經過30 cycles可產生230(約10億)條目標序列DNA
Original By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=32003643
7 8
Principle of PCR 2 copies
4 copies
8 copies

reverse primer
 「那是在1983年的一天，我正開車疾馳在高速公路上。漸漸地，我的視
forward primer
線模糊了，思緒飄回到實驗室……突然，我好像看見DNA分子近在咫尺，
藍色的、粉色的，都那麼鮮亮，糾纏在一起……」

Denaturation Annealing Elongation

…穆利斯自傳《心靈裸舞》
聚合酶作用延伸
升溫至94~96°C
打開雙股的配對
降溫至合適溫度
引子配對互補序列 互補股完成複製 Dancing Naked in the Mind Field: Kary Mullis

a PCR cycle

Kary B. Mullis
1993 Nobel Prize
Original By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=32003643
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Principle of PCR 2 copies

4 copies
8 copies
Thermus aquaticus
1976年台灣科學家錢嘉韻(Alice Chien)
reverse primer
從黃石國家公園溫泉發現的水生棲熱菌
forward primer

Denaturation Annealing Elongation

升溫至94~96°C 降溫至合適溫度 聚合酶作用延伸
打開雙股的配對 引子配對互補序列 互補股完成複製

a PCR cycle

⼀般Enzyme的活性
在高溫會被破壞 Kary B. Mullis
1993 Nobel Prize
Original By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=32003643
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Principle of PCR 4 copies
8 copies
生命體的遺傳物質- DNA
2 copies

真核細胞
reverse primer
原核生物
forward primer

Denaturation Annealing Elongation

升溫至94~96°C 降溫至合適溫度 升溫至72°C 高溫下可以作用
打開雙股的配對 引子配對互補序列 聚合酶作用延伸
互補股完成複製
的聚合酶
a PCR cycle
真核細胞中的粒線體
經過30 cycles可產生230(約10億)條目標序列DNA 與葉綠體也有DNA
Original By Enzoklop - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=32003643
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真核生物粒線體與葉綠體的起源-內共生理論 粒線體來⾃⺟親
 精卵結合時，精子只有提供細胞核
 粒線體DNA可作為⺟系遺傳的追蹤依據

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Human Mitochondrial DNA

Human mtDNA
(16,569 bp)
37 genes

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Mitomaster Website
https://www.mitomap.org/foswiki/bin/view/MITOMASTER/WebHome

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Flowchart – PCR 請檢查實驗用品
 萃取mtDNA  2X Master Mix: 36 μl (Mix)(紅色)
 取口腔皮膜細胞 或 毛囊  Primer Forward: 12 μl (F)
 煮沸法打破細胞  Primer Reverse: 12 μl (R)
 PCR  ddWater: 100 μl (ddW)
 設定假設，設計你的實驗變因  Sample buffer: 50 μl (s)
 如：DNA濃度、不同Primer組合或其他藥品對結果的影響
 ⼀種測試只改變⼀種反應物  空PCR tube x3, 空0.6 tube x1
 也可以做Negative control  牙籤 x1
 計算所需反應物並寫下表格  Micropipette ⼀組
 混合反應物  Yellow Tip ⼀盒
 放入PCR machine，開始反應  抗酒精筆 x 1
 電泳檢測  夾鏈袋 (請把用過的tip及廢棄管子置入)

21 22

取得細胞
 取得人體細胞
 以牙籤刷刮取口腔內膜，取得皮膜細胞
 或拔取三根頭髮(要有毛囊) (不建議)

 放入30 μl Sample buffer中

 加熱95°C，10分鐘

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設計實驗組 其他可用變因
Component R1 R2 R3 以R1為control
 除了可以改變本來反應物的濃度外，尚有：
2X Master Mix 10 10 10  EDTA (10 mM) (請算最終濃度)
Template (mtDNA) 2  二價陽離子螯合劑
Primer Forward (2 μM) 2  MgCl2 (30 mM)
Primer Reverse (2 μM) 2  Primer L set (夾取片段較⻑)
其他你想測試的藥品 -  HeLa cell extract (做為正對照組) L-F S-F
ddWater 4
Total Volume 20 20 20
(μl)
 填寫訂單： S-R L-R

 各管需要的藥品跟總量寫好
 其他反應物都先加好，最後再拿給助教加

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實驗藥品—2X Master Mix About Primers

 0.4 mM each dNTP  人工合成的短DNA片段(單股)
 提供核酸原料 (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)  通常在18~25 base之間
 Tm (melting temperature)
 3 mM MgCl2
 Tm決定Annealing步驟所需要的溫度
 Mg2+為Taq輔酶；調整Primer專⼀性
 引子⻑度越⻑，Tm越高
 GC含量(GC content)越高，Tm越高
 Taq (0.2 units/μl)
 可被溶液內的金屬離子濃度所調控
 高溫活性DNA聚合酶

 Buffer
 提供Taq作用環境

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mtDNA And Primer Set Forward and Reverse Primers
Forward 5’ Sense Strand 3’
Target sequence

3’ Reverse or 5’
Antisense Primer
Human mtDNA Reverse Forward or Sense
16,596 bp 5’ Primer 3’
37 genes

3’ Antisense Strand 5’

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ex. 13組第1管
設計實驗組 請在管蓋及管壁側邊寫上 13 13
PCR Condition
組別-編號 -1 -1
35 cycles
Component R1 R2 R3 以R1為control
2X Master Mix 10 10 10 95°C 95°C
Template (mtDNA) 2 5 mins 30 s 72°C 72°C
52.5°C 30 s 10 mins
Primer Forward (2 μM) 2
30 s
Primer Reverse (2 μM) 2 4°C
其他你想測試的藥品 - Denaturation Annealing Elongation ∞
ddWater 4
Total Volume 20 20 20 如果有用Primer L set
(μl) Elongation延⻑至1:10

算完就開始動手吧！
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