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故事

Exosome
新趨勢：
Exosome miRNA

Exosome miRNA
打開生物性標記新視野

打開生物性標記新視野
撰稿:詹喬瑋

Exosome是細胞所分泌出的囊泡，可在細胞間傳遞分子訊息。而Exosome microRNAs (exomiRs)近年來備受關

注，因為已有越來越多的證據表明，將microRNAs裝入Exosome中並非『隨機』而是生物體有意為之的行為。許多臨
床前研究更是已經確定exosome miRNAs對於癌症的影響。其中所調控的機制也變得越來越明朗，如exomiR receptor
(miRceptor)。因此exomiRs非常適合作為現今個人化醫療世代的非侵入性生物標記。

MicroRNAs (miRNAs)是一種短片段的non-coding RNA，被認為是轉錄後調控的主調控因子，並且一旦miRNAs呈現失調

狀態，往往就會引起某種疾病。除了針對自體細胞的調控，它們也會存在於Exosome中並隨之在細胞間轉移，因此也有越來
越多的人針對Exosome miRNAs (exomiRs)作為生物標記的可能性進行更深入研究。

Exosome是天然存在於真核生物中，用於包覆物質並釋放至細胞外的特殊小囊泡，平均大小約落在40-100 nm，不同
狀態、不同微環境產生的Exosome亦有不同的組成。這些小囊泡就像是生物體中的外送員，將各種貨物，例如蛋白質、
microRNA、mRNA等，運送 (擴散) 至指定的鄰近細胞或其他位置，進而有效率地控制細胞基因表現和蛋白質功能的表達。

自1981年首次被確認，並在隨後的幾十年裡被證明多種不同細胞類型都會分泌Exosome。然而早在1980年，就有醫學研
究發現在癌症病人身上有特殊的包裹囊泡，將專屬癌症組織的抗體(antibody)由媽媽傳遞給新生兒而造成細胞表現異常1，然而
對比其他胎盤組織的細胞卻沒有直接產生變異。有了這個前例，醫學研究開始發現有許多過去認定細胞變異造成的異常，其
實都是Exosome所造成，而不是細胞原生的惡化或突變。而基因層次的研究也發現，如果exosome中包裹了mRNA或microRNA
，甚至在近似物種間的轉移也能直接影響後續的基因表達。Valadi等人的研究中，就採用人類和小鼠的細胞株進行研究，發現
在人類細胞培養液中可以分離到大量exosome，內含多種在細胞中表現量非常低的mRNA，該exosome可以攜帶這群mRNA
直接傳遞給小鼠細胞株與其他人類細胞，並且可以在接受的細胞中直接看到相關基因表現狀況被造成影響2。

除了蛋白質與mRNA這類可以直接對目標細胞的蛋白表現造成影響的因子之外，近年來對於Exosome中的miRNA的研究
也越來越多，所以甚至創造了新的名詞exomiRNAs來描述這類型miRNA。因為exomiRNAs可以影響的層面相較於蛋白質或
mRNA來的更廣更深，使其極具潛力成為新一代的疾病生物標記。

根據Qiao等人於去年(2019)3所發表的文章中，比較了心臟衰竭患者心臟基質細胞分泌的exosome (FEXO)與正常心臟基質
細胞所分泌的exosome (NEXO)，發現後者具有促進內皮血管新生及心肌細胞增生的效果，而來自心臟衰竭患者的exosome反
而破壞了這些細胞再生相關的能力。
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故事
Proliferation 進一步分析兩者miRNA的差異後，發現FEXO
Angiogenesis
中的miR-21-5p的表現呈現失衡的狀態。若是補
Exosome

Apoptosis

Normal cell exosomes 足FEXO中的miR-21-5p的話，則可以將丟失的再

miR-21
生功能再次恢復，如同正常的exosome (NEXO)
Exosomes
一樣。更進一步地探討其中機制的話，則發現
新趨勢：

Proliferation exosome中的miR-21-5p是藉由抑制phosphatase
Angiogenesis
miR-21 Apoptosis 的功能從而強化Akt Kinase的活性而使得細胞有
Patient cell exosomes 更佳的再生功能。由以上的結果可知，心臟衰竭
miR-21
不只影響到心肌細胞本身，更會影響到其所分泌
的exosome並損害心肌細胞原有的再生能力。而
Exosome miRNA

Casp3 Apoptosis exosome中的miR-21-5p則是藉由phosphatase/Akt

Angiogenesis
pathway增進血管新生與心肌細胞的存活(圖一)。
圖一、Exosome中的miR-21-5p可透過PTEN pathway影響細胞本身的再生能力 3。
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然而成熟miRNA短片段的特性，讓我們難以用一般的PCR法輕易的放大並得知其表現量如何。再加上其在總RNA中的比例
也非常的低，如果想要直接檢測其存在的話，則會需要非常大量的樣本。其次，Total RNA中不僅包含成熟的miRNA，也包含
了成熟前的pre-miRNA及pri-miRNA，使得引子需要特殊的設計才能準確辨別我們所想要的miRNA。因此RT-qPCR法可說是目
前檢測miRNA最佳的方法。RT-qPCR的檢測結果準確且經濟實惠，亦無需大量的樣本，同時檢測範圍靈活。使用qPCR檢測
miRNA時，有幾個重要因子需要特別留意，包括Total RNA的品質、cDNA合成、引子設計、檢測和資料均一化。

來自新加坡的MiRXES，提供從反
轉錄的步驟開始到PCR放大過程，共
使用三種專一性primer。特殊設計之
反轉錄引子，可以專一性的與成熟
miRNA結合，且不會被結合未成熟之
前趨lncRNA或是序列相似的miRNA
，大幅降低非專一性產物的生成，使
後續PCR放大可以完全不受影響。
PCR放大過程Forward/Reverse皆使
用針對Target設計之專一性引子，更
進一步避免相似miRNA所帶來的偽訊 圖二、利用獨特的專一性三引子設計，MiRXES ID3EAL miRNA qPCR solution得以鑑別僅有
單核甘酸差異的高同源miRNA家族，並且擁有超越其他系統的靈敏度。
號。即使是同一家族僅有1-2個mer差
異的miRNA也可以準確區分。MiRXES獨特的三引子設計使其相較於其他miRNA檢測系統具有更高專一性的靈敏度，即使是非
常微量的miRNA也可以輕易檢測出來(圖二)。

然而經由PCR放大後所得到的結果，畢竟是『間接』的結果，每一次的PCR反應都有可能造成的些許誤差，連鎖反應下來
，這個誤差就會逐漸變得越來越大，因此在miRNA量充足的情況之下，我們也可以考慮另一種全新的方法，運用ELISA的原理
直接偵測樣本內的miRNA含量，最大程度的避免反轉錄與連鎖反應所造成的誤差放大效果。來自捷克的BioVendor MiREIA kit
便是採用這一類檢測法，在底部coating專利抗體，專一性辨識DNA/RNA Hybrid，並以可見光呈色，只要一般的ELISA reader
，無須高階設備即可分析miRNA的含量，靈敏度最高可達0.13 amol/μl，以達到真正且直接的定量(圖三)。

TMB substrate

SAV-HRP
BI BI
OT OT
IN IN

miRNA/DNA-biot hybrids miRNA/DNA-biot hybrids

Incubation with Incubation with

miRNA/DNA hybrids SAV-HRP

CAPTURE MAB CAPTURE MAB CAPTURE MAB

圖三、利用專一性辨識 DNA/RNA Hybrid
16 的抗體偵測樣本中的miRNA。

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Exosome中除了miRNA以外，也帶有大量的蛋白質，而其中的蛋白質組成根據分泌的細胞及環境的不同，也有相當大的
差異。因此為了快速探討Exosome裡的蛋白質，就需要一項高通量的偵測工具。來自新加坡A*STAR Institute of Medical

Exosome
Biology (IMB)研究機構的LAI等人，利用RayBiotech Label-based Human Antibody Array (圖四)結合LC MS/MS，統計出人類
的間質幹細胞Exosome (MSC Exosome)共有857種蛋白質，並利用生物資訊分析軟體 PANTHER，分析出其中部分蛋白質參
與了蛋白水解反應，且序列與20S Proteasome序列相似，因此推斷出MSC的Exosome存在20S Proteasome。20S Proteasome

新趨勢：
的功能為降解不穩定、變性或錯誤折疊的蛋白質。因此Lai團隊推論MSC Exosome具有組織修復的能力。在進一步動物實驗證
實，在心肌缺血再灌注myocardial ischemia/reperfusion (MI/R) injury的小鼠中注入MSC exosome，一天後可以明顯降低缺血
再灌注所造成的損傷，減少損傷後心臟中錯誤摺疊的蛋白質 (圖五)。由此原理能進一步推斷，MSC exosome不只能降低心肌
缺血再灌注所造成的心臟損傷，並且也能緩和由變性蛋白累積引起的疾病，如阿茲海默症、帕金森氏症及Prion疾病等，為未
來疾病治療將帶來極大的幫助。

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圖四、Label-based Human Antibody Array 圖五、Exosome降低oligomer之in vivo實驗

另外，Exosome除了影響生理性失調所導致的疾病，現在
發現Exosome也會影響病毒的傳播模式。病毒可將病毒蛋白
、病毒基因或完整的病毒顆粒載入Exosome中，從而感染周
圍正常細胞。美國喬治梅森大學的Jaworski團隊發現，在被
人類T淋巴細胞白血病病毒(human T-cell leukemia viruses 1,
HTLV-1)感染的細胞Exosome中，帶有病毒的致癌因子Tax蛋
白。Tax為引起成人T細胞自血病(ATL)的重要致病蛋白。研究
證實帶有Tax的細胞，抗apoptosis能力增加，具有促癌作用。
作者進一步使用RayBiotech Human Cytokine Array C1證實，
受到HTLV-1感染的細胞Exosome比起未受到HTLV-1感染的細
胞Exosome，含有更多的促炎性Cytokine GRO、GRO-α、GM-CSF、IL-6。綜合研究結果，在HTLV-1 infected cell的Exosome
中，會攜帶病毒之致癌因子及豐富的促炎性Cytokine，從而影響周圍的正常細胞，改變正常細胞的存活率及炎症因子的表現。藉
由了解Exosome中的蛋白質成份，將有助於了解HTLV-1感染的發病機制，在未來有助於應用在治療更多的白血病患者。

miRNA長期以來都是探討疾病生物標記的熱門選項，現在發現miRNA與Exosome之間存在一定的關係，使miRNA的影響
將不再侷限於病灶附近，而是有可能隨著體內循環系統影響到身體的各部位。與此同時，也為miRNA的功能性開啟了全新的
研究領域。而Exosome中所帶蛋白質針對疾病的生理微環境的影響，一直以來也都是疾病研究的主角，現在更發現除了
Exosome除了攜帶自體的蛋白質，也有可能裝入病毒的蛋白、基因甚至病毒顆粒，這使得Exosome一定程度的參與病毒感染
的過程，也讓病毒學家對於病毒感染途徑研究有了一個新的方向。然而這些研究通常都需要高通量檢測，對實驗室的人力與資
源需求也比較高，岑祥公司能體會您的煩惱，特別設立檢測代做實驗室並成為亞洲唯一通過RayBiotech原廠認證的代測中心
，協助您獲得穩定且有效的實驗數據。

References:
1. Taylor DD, Homesley HD, Doellgast GJ. Binding of specific peroxidase-labeled antibody to placental-type phosphatase on tumor-derived
membrane fragments. Cancer Res. 1980 Nov;40(11):4064-9
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QIAO, Li, et al. microRNA-21-5p dysregulation in exosomes derived from heart failure patients impairs regenerative potential. The Journal of
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Lai, Tan, Teh, Sze, Arslan, de Kleijn, Choo, Lim. Proteolytic Potential of the MSC Exosome Proteome: Implications for an Exosome-Mediated
5. Delivery of Therapeutic Proteasome. Int J Proteomics.2012;2012:971907.
Jaworski, Narayanan, Van Duyne, Shabbeer-Meyering, Iordanskiy, Saifuddin, Das, Afonso, Sampey, Chung, Popratiloff, Shrestha, Sehgal,
Jain, Vertes, Mahieux, Kashanchi. Human T-lymphotropic virus type 1-infected cells secrete exosomes that contain Tax protein.J Biol Chem.
2014 Aug 8;289(32):22284-305.
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