M2巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究

学校代码：10285
学号：20154221117
SOOCHOW UNIVERSITY
硕士学位论文
□学术学位
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
A study on the mechanisms of M2 macrophages differentiating into
osteoclasts
研究生姓名台立
指导教师姓名高晓明
专业名称免疫学
研究方向自身免疫性疾病
学院生物医学研究院
论文提交日期 2018 年 04 月
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M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究中文摘要
中文摘要
类风湿关节炎（RA）患者在疾病发生过程中往往会伴随着不同程度的骨损伤，
如关节僵直、变形等，而破骨细胞在骨的破坏和吸收中起到至关重要的作用。单
核细胞、巨噬细胞、不成熟 DC 及 MDSC 均可以作为前体细胞在 RANK-RANKL
信号通路的作用下向破骨细胞分化。巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞之一，在
体内外不同的微环境的影响下可分化成具有不同功能的表型，主要包括两大类，
即经典活化型巨噬细胞 M1 和替代活化型巨噬细胞 M2。有文献报道在 RA 病人关
节腔浸润的炎性细胞中，CD163+CD206+M2 巨噬细胞占很高的比例，但其在 RA
中的作用尚不明确，其是否能够向破骨细胞分化尚未可知。本课题旨在探讨 M2
型巨噬细胞在 RA 中发挥的骨破坏作用，并对其分子机制进行深入研究。
首先，我们用 MSCF 和 IL-4 在体外分化了人和小鼠 M2 表型的巨噬细胞，在
此基础上用 M-CSF 和 RANKL 诱导其分化 6-9 天后，结果发现 M-CSF 和 RANKL
可以诱导 M2 型巨噬细胞分化成有功能的破骨细胞（TRAP 染色、F actin-ring 染色、
Q-PCR 及骨破坏功能检测实验）。且我们比较了体外分化的人和小鼠 M0、M1、
M2 三种巨噬细通过 M-CSF+RANKL 诱导向破骨细胞分化的能力，发现 M2 巨噬
细胞向破骨细胞分化的能力更强。我们建立了胶原蛋白诱导关节炎的小鼠模型，
通过流式分选的办法从发病小鼠骨髓及发病关节中分选出 M1 和 M2 巨噬细胞并在
体外利用 M-CSF+RANKL 诱导分化，结果发现无论是骨髓还是发病关节中 M2 巨
噬细胞向破骨细胞分化的能力都是明显强于 M1 表型的细胞。流式结果显示，M2
型巨噬细胞表面表达更高水平的 CD206 和 RANK，这可能是导致其更容易向破骨
细胞分化的原因。CD206 的配体甘露糖能够明显阻断 M2 表型的巨噬细胞向破骨
细胞的分化，这进一步验证了 CD206 在 M2 向破骨细胞分化过程中的作用。我们
也将健康人外周血单核细胞中 CD14+CD206+和 CD14+CD206-的单核细胞分选出来
并在体外用 M-CSF+RANK 诱导分化，结果同样是 CD206+的细胞向破骨细胞分化
的能力强于 CD206-的细胞。
本实验室前期研究发现，在 RA 患者血清中乳铁蛋白免疫复合物（LTF-IC）水
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中文摘要 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
平显著升高，且能够通过单核细胞表面的 CD32a 诱导其分化成破骨细胞。在本课

题中我们进一步发现 LTF-IC 能诱导人 M2 细胞向破骨细胞分化，且 CD32 的阻断
性抗体及 syk 的抑制剂均能够有效地阻断 LTF-IC 诱导 M2 细胞分化为破骨细胞，
提示 CD32 及其下游信号分子在此过程中发挥主要作用。
总之，本课题发现了不管是经典途径（M-CSF+RANKL）还是非经典途径
（LTF-IC）均可诱导 CD206 高表达的 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化。这为破骨
细胞的形成提供新的信号途径及为临床治疗类风湿关节炎提供了新的靶点和思
路。
关键词：替代活化型巨噬细胞 M2，破骨细胞，甘露糖受体 CD206
作者：台立
指导老师：高晓明
II
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M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究英文摘要
A study on the mechanisms of M2 macrophages

differentiating into osteoclasts
Abstract
RA patients often suffered from various degrees of bone damage, such as joint
stiffness and deformation, and osteoclasts plays an important role in this process.
Monocytes, macrophages, immature DCs and MDSCs, as progenitor cells, could
differentiate into osteoclasts through RANK-RANKL signaling pathway. Macrophages,
as one of the most important immune cells in the body, could polarize into different
phenotypes under different microenvironments, including the classical activated
macrophages (M1) and the alternatively activated macrophage (M2). It is reported that
there are high proportion of CD163+CD206+M2 macrophages in the synovial
inflammatory cells of RA patients, but the effects of M2 macrophages in RA are not
clear and whether M2 macrophages could differentiate into osteoclasts has been
unknown. Our study aims to explore the bone destruction effects and its molecular
mechanism of M2 macrophages derived- osteoclasts in RA.
Firstly, we differentiated human and mous M2 macrophages with M-CSF and IL-4
in vitro and induced M2 differentiating in the presence of M-CSF and RANKL for 6-9
days, then we used osteoclasts detection methods, such as TRAP staining, F actin-ring
staining, Q-PCR and bone destruction test, to verify that M-CSF and RANKL could
induce M2 macrophages differentiating into functional osteoclasts. Secondly, we
compared human and mouse M0, M1, M2 macrophages differentiating into osteoclasts
by M-CSF and RANKL, which results showed that M2 macrophage are stronger for
differentiating in osteoclast than M0, M1. In addition, we sorted M1 and M2
macrophages from normal and CIA mice and cultured with M-CSF and RANKL, which
results showed that the ability of M2 differentiating to osteoclasts are stronger than M1
macrophages. And the expression of CD206 and RANK on M2 were higher than M0
and M1 by flow cytometry, which may be related to M2 differentiating into osteoclasts.
Thirdly, CD206 ligand, mannan, can significantly block the differentiation of M2
III
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英文摘要 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
macrophages to osteoclasts.
Previous results in our laboratory showed that the level of the
lactoferrin-containing immunocomplex (LTF-IC) increased obviously in the serum of
rheumatoid arthritis (RA) patients, and LTF-IC can induce monocytes differentiating
into functional osteoclasts through CD32a expressed on the surface of the cell. It’s
reported that CD32a is also highly expressed on the surface of M2 macrophages,
therefore, we supposed that LTF-IC may activate M2 macrophages through the above
pathway. The results indicated that LTF-IC could induce M2 macrophages to
differentiate into functional osteoclasts and anti-CD32a antibodies and the inhibitor of
its downstream molecular Syk could block LTF-IC induced osteoclasts differentiation.
In conclusion, we have found that M-CSF+RANKL and LTF-IC can induce CD206
high expressed M2 macrophages to differentiate into osteoclasts. Our studies provide
new signal pathway for the formation of osteoclasts and provides new directions and
targets for the diagnosis and treatment of rheumatoid arthritis.
Key words: alternatively activated macrophages, osteoclast, mannose receptor
Written by: Li Tai

Supervised by: Xiaoming Gao
IV
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目录
前言 ...............................................................................................................................1
第一章材料方法 ...........................................................................................................3
1.1 实验材料 .............................................................................................................3
1.1.1 血清与培养基 ............................................................................................3
1.1.2 常用试剂 ...................................................................................................3
1.1.3 实验动物 ...................................................................................................3
1.1.4 蛋白、抗体及抑制剂 ...............................................................................3
1.1.5 相关试剂盒 ...............................................................................................4
1.1.6 实验耗材与仪器设备 ...............................................................................4
1.1.7 引物 ...........................................................................................................4
1.2 实验方法 .............................................................................................................5
1.2.1 健康人外周血单个核细胞（PBMC）分离及单核细胞纯化 .................5
1.2.2 人单核细胞来源的巨噬细胞的分化 ........................................................6
1.2.3 小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化 ................................................................6
1.2.4 细胞培养 ...................................................................................................6
1.2.5 流式细胞术 ...............................................................................................7
1.2.6 TRAP 染色 .................................................................................................7
1.2.7 RNA 提取 ...................................................................................................7
1.2.8 RNA 逆转录 cDNA ...................................................................................7
1.2.9 实时荧光定量核酸扩增（Q-PCR） .......................................................8
1.2.10 TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽染色 .......................................9
1.2.11 骨细胞培养板检测骨吸收能力 .............................................................9
1.2.12 胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）小鼠模型 ..........................................9
1.2.13 免疫组化 .................................................................................................9
1.2.14 单克隆抗体的制备、纯化与鉴定 .......................................................10
第二章人单核细胞来源的巨噬细胞及小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞的分化 .....12
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2.1 人单核细胞的纯化 ...........................................................................................12
2.2 人单核来源的巨噬细胞的分化及鉴定 ...........................................................13
2.2.1 人单核来源的巨噬细胞的分化 .............................................................13
2.2.2 人单核细胞来源的巨噬细胞的表型鉴定 ..............................................13
2.2.3 人单核细胞来源的巨噬细胞的细胞因子鉴定 .....................................14
2.3 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分化及鉴定 ...........................................................14
2.3.1 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分化 .............................................................15
2.3.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞的表型鉴定 .....................................................15
2.4 本章小结 ...........................................................................................................16
第三章 M-CSF+RANKL 诱导 M2 细胞分化成破骨细胞.........................................17
3.1 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色 ...............17
3.2 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色 .......18
3.3 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志
分子变化情况 ....................................................................................................19
3.4 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定....20
3.5 M0/M1/M2 巨噬细胞 RANK 的表达 ...............................................................21
3.6 比较 M0/M2 巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的时间与
剂量关系 ............................................................................................................21
3.7 不同分化方案获得的 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均高于其他
巨噬细胞 ............................................................................................................25
3.8 本章小结 ...........................................................................................................26
第四章 CIA 模型小鼠中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化 ..........................................28
4.1 CIA 小鼠模型建立及发病关节中 CD206+M2 巨噬细胞浸润比例 ................28
4.2 CIA 小鼠骨髓中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化 .............................................30
4.3 CIA 小鼠发病关节中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化 .....................................31
4.4 本章小结 ...........................................................................................................33
第五章 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的可能机制...................................................35
5.1 M0/M1/M2 巨噬细胞 CD206 的表达 ...............................................................35
5.2 CIA 小鼠模型中 M2 巨噬细胞表型分析 .........................................................36
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5.3 人外周血单核细胞 CD206+的单核细胞向破骨细胞分化能力强于 CD206-的
单核细胞 ..........................................................................................................37
5.4 甘露糖阻断 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化....................................................39
5.5 本章小结 ...........................................................................................................39
第六章 LTF-IC 诱导 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞 ................................................41
6.1 乳铁蛋白单抗的制备 .......................................................................................41
6.2 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色 ...........................................42
6.3 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色 ..................................43
6.4 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志分子变化情况 .......44
6.5 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定 ...............................45
6.6 比较 M0/M1/M2 巨噬细胞在 LTF-IC 作用下向破骨细胞分化的时间与
剂量关系 ..........................................................................................................46
6.7 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化的机制研究 ...............................................47
6.8 LTF-IC 不能活化 CD32a 转基因小鼠 M2 巨噬细胞 ......................................49
6.8.1 CD32a 转基因小鼠骨髓来源的 M2 巨噬细胞的分化与鉴定 ..............49
6.8.2 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 TRAP 染色 .................50
6.8.3 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 F actin-ring 染色 .........51
6.8.4 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后破骨细胞相关标志
分子 mRNA 水平变化情况......................................................................52
6.8.5 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后骨吸收功能的鉴定 ......53
6.9 本章小结 ...........................................................................................................54
第七章讨论 .............................................................................................................56
7.1 人单核细胞来源以及小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞的分化及鉴定 ...........56
7.2 M-CSF+RANKL 诱导体外分化的 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞................57
7.3 CD206 高表达的 M2 巨噬细胞表现出更强的向破骨细胞分化能力 ............58
7.4 LTF-IC 诱导 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞 ...............................................59
7.5 总结 ...................................................................................................................60
文献综述 .........................................................................................................................62
参考文献 .........................................................................................................................71
万方数据
英文缩略词 .....................................................................................................................80
个人简历 .........................................................................................................................82
致谢 .............................................................................................................................83
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究前言
前言
类风湿性关节炎（RA）是一种慢性全身性关节疾病，其发病特征主要包括关
节滑膜炎和骨组织的破坏[1]。有文献报道，45%的早期 RA 患者都会出现骨侵蚀的
现象[2]。破骨细胞是一种多核的巨细胞，其对骨的吸收作用是造成骨侵蚀的主要
原因[3]。破骨细胞在机体过量分化或活性增强会导致软骨和骨的破坏[4]。在 RA
患者中，大量的破骨细胞积累在滑膜组织，在关节处形成骨陷窝并造成局部骨质
破坏[5]。
巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞之一，在体内外不同的微环境的影响下可
分化成具有不同功能的表型，主要包括两大类，即经典活化型巨噬细胞 M1 和替代
活化型巨噬细胞 M2[6]。而替代活化型巨噬细胞由 IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因
子极化，分泌大量的抑炎性细胞因子，起到免疫调节及组织修复等功能[7]。M2 型
巨噬细胞作为一类免疫效应细胞，在 RA 的发生发展中也同样扮演着不可或缺的角
色。近年来的文献中有报道，在 RA 病人关节腔浸润的炎性细胞中，
CD163+CD206+M2 巨噬细胞占很高的比例[8]，且 80%以上的 CD14+CD163+双阳性
的 M2 细胞能够释放促炎性细胞因子 TNF-α[9]；在小鼠心肌炎模型中，TLR4、IL-1β
等在小鼠 Gr-1+F4/80+双阳性 M2 细胞中的表达也高于 M1 细胞[10]，这些研究均提
示 M2 型巨噬细胞在 RA 的发病过程中起到重要的作用。但是 M2 型巨噬细胞能否
通过向破骨细胞分化参与 RA 的发病过程目前还未可知。
单核细胞、巨噬细胞、不成熟 DC 及 MDSC 均可以作为祖细胞在
RANK-RANKL 信号通路的作用下向破骨细胞分化[11]。这一通路我们称之为破骨
细胞分化的经典途径。在 EMPD（乳腺外佩吉特氏病）病人的病变部位，科学家
们发现 60%以上的 RANK+的细胞是 CD163+CD206+Arginase-I+M2 巨噬细胞[12]，
且 M2 细胞也可以通过激活 RANK-RANKL 信号通路释放细胞因子或趋化因子在
该疾病中发挥作用[13]。因此我们推测 CD163+CD206+M2 巨噬细胞可能通过
RANK-RANKL 信号通路向破骨细胞分化，从而参与 RA 过程中的骨的破坏和吸收，
导致骨关节变形及骨质疏松。
乳铁蛋白（Lactoferrin, LTF）是一个大约有 700 个氨基酸残基构成的、分子量
1
万方数据
前言 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
大约为 80kDa 的铁离子结合糖蛋白，主要存在于乳汁中，但并非乳汁中特有。在

正常人血浆中生理浓度为 1.0μg/ml，而乳汁中高达 7mg/ml[14]。同时，乳铁蛋白还
大量存在于中性粒细胞浆内，是中性粒细胞胞浆次级颗粒之一[15]。RA 患者体内
存在多种自身抗体及免疫复合物（immune complex, IC）,如类风湿因子、抗核抗体、
抗中性粒细胞胞浆抗体等[16]。LTF 和抗 LTF 抗体特异性结合后，可形成免疫复合
物（LTF-IC）。我们实验室前期结果显示，LTF-IC 在 RA 患者血清中的含量显著高
于正常人血清，提示 LTF-IC 在某些自身免疫性疾病中发挥作用。另外，本实验室
前期研究结果发现，LTF-IC 可以通过细单核胞表面的 CD32a 活化单核细胞并使其
分化为破骨细胞，那么 LIF-IC 能否通过活化 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞参与到
RA 患者的发病过程中我们也未可知。
本课题将从诱导 CD163+CD206+M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的角度研究 M2
表型的巨噬细胞在 RA 发生发展过程中的作用并探讨其分子机制。我们将通过体外
诱导细胞分化的方法，在培养体系中加入 M-CSF+RANKL 和乳铁蛋白免疫复合物
（LTF-IC）观察是否可以诱导 CD163+CD206+M2 巨噬细胞发生细胞融合、形成多
核巨细胞；本课题旨在研究 CD163+CD206+M2 巨噬细胞在 RA 中的作用，有望为
类风湿性关节炎合并骨质疏松症提供全新的理论基础，同时也有望为破骨细胞的
形成提供新的信号途径及为临床治疗类风湿关节炎提供了新的靶点和思路，为 RA
的诊断及治疗起到指导作用。
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第一章
第一章材料方法
1.1 实验材料
1.1.1 血清与培养基
实验过程中使用 DMEM（low/high glucose）及 RPMI 1640 培养基均购自
Hyclone 公司，α-MEM 培养基购自 Corning 公司，胎牛血清均购自 Biological
Industries（BI）公司，青霉素链霉素购自碧云天生物技术有限公司（Beyotime
Biotechnology）。
1.1.2 常用试剂
Tris、NaCl、HCl、KCl、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、硫酸铵（AS）、甘氨酸、
无水甲醇、丙烯酰胺、R250 考马斯亮蓝、甲醛、丙酮、硝酸银等常用试剂均购自
国药化学试剂有限公司；DMSO、TEMED、SDS、AP、Tween-20、硫代硫酸钠等
试剂购自 Sigma 公司；BSA 购自索莱宝公司；TritonX-100 购自 aMResco 公司；人
外周血单个核细胞分离液 Ficoll 购自达科为（Dakewe）。
1.1.3 实验动物
Balb/c、C57BL/6 购自南京鹏昇生物公司，6~8 周周龄，均为雌性；DBA/1 购
自维通利华公司，6~8 周周龄，均为雄性；FcγⅡa 转基因小鼠购自 Jackson 实验室。
1.1.4 蛋白、抗体及抑制剂
人乳铁蛋白（lactoferrin，LTF）及人血清白蛋白（HSA）均购自 Sigma-aldrich
公司；HRP 标记的 goat anti-mouse IgG 购自 SBA 公司；抗人血清白蛋白（HSA）
抗体购自博奥森公司；抗人 CD14 抗体购自 R&D 公司；抗人 CD32 抗体购自 Stem
cell 公司；同型对照 mouse IgG1/2b 购自 Biolegend 公司；TRITC Phalloidin 罗丹明
标记鬼笔环肽购自上海翊圣生物科技公司，甘露糖（Mannan）和葡聚糖（Dextran）
均购自 Sigma-aldrich 公司。
人和小鼠巨噬细胞/粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子
（M-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）
、白细胞介素-10 （IL-10）、干扰素-γ（IFN-γ）、
肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及核因子 κB 受体活化因子配体（RANKL）均购自
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第一章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
PeproTech 公司。牛的二型胶原（CollagenII）购自 Chondrex 公司，完全弗氏佐剂

（CFA）与不完全弗氏佐剂（IFA）均购自 Sigma-aldrich 公司。
人 CD14-APC、CD163-APC、CD206-PE、CD16-APC、CD32-APC、CD64-FITC、
小鼠 F4/80-APC-cy7、CD206-PE、CD115-APC、CD265（RANK）-PE、CD11b-APC、
CD45-Percp-cy5.5、CD16.2-APC、CD16/32-APC、CD80-PE、CD86-PE 等流式抗体
均购自 Biolegend 公司。
Syk 抑制剂 R406 购自 selleck 公司。
1.1.5 相关试剂盒
单核细胞阳选试剂盒购自美天旎生物（Miltenyi Biotec），破骨细胞 TRAP 染色
试剂盒购自 Sigma-aldrich 公司，RNA 提取试剂盒购自 Omega 公司，逆转录试剂盒
及 Q-PCR 试剂盒购自 Takara 公司，BCA 蛋白检测试剂盒购自 Thermo Fisher 公司。
1.1.6 实验耗材与仪器设备
一次性采血针及 10ml 抗凝采血管购自 BD 公司；50ml 离心管，15ml 离心管
购自 Thermo 公司；6 孔细胞培养板、12 孔细胞培养板、24 孔细胞培养板、48 孔
细胞培养板、96 孔平底细胞培养板，96 孔酶标板等购自 Nunc 公司，骨细胞培养
表面板购自 Corning 公司；1.5ml、0.6ml EP 管、0.2ml PCR 管、各类型号微量枪
头均购自 QSP 公司；0.22μm、0.45μm 滤膜购自 Millipore 公司；Q-PCR 用 96 孔板
购自 Life 公司。
各类型号移液器、PCR 仪、低速冷冻离心机、高速冷冻离心机购自 Eppendorf
公司；8 道购自大龙公司；Q-PCR 仪 Step one plus 购自 Life 公司；5%CO2 培养箱
购自 Thermo 公司；酶标仪购自 BioTek；超净工作台、生物安全柜购自 ESCO 公司；
流式细胞仪 FACS CantoⅡ购自 BD 公司；荧光倒置显微镜及共聚焦显微镜购自
Nikon 公司；垂直板蛋白电泳槽；流式管、TS-1 水平摇床购自海门；静音混合器
购自上海普信；恒温水浴锅、恒温箱购自上海精宏。
1.1.7 引物
设计人 GAPDH、MMP-9、CTSK、TRAP 的引物，小鼠 GAPDH、Arginae1、
CD206、CD16、MMP-9、CTSK、TRAP 的引物，由金唯智（GENEWIZ）公司合
成，以无菌水溶解，分装冻存于-20℃备用（表 1.1）。
表 1.1 相关引物序列
4
万方数据
Target mRNA Forward primer（5’-3’） Reverse primer （5’-3’）

Human
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAAGATGGTGATGGGATTT
MMP-9 GGCTCCAGGCGGTGCTTG CAGATAGATGGGCTCATACCA
CTSK AATGCTGGACACCCAGTGGGA GAGGCCTCCAGGTTATGGGC
TRAP TGACAAACAAATTCGGTACATCCT AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC
RANK GCTTGCATAAAGTCTGTGA AGTCTGAGTTCCAGTGGTAGCC
Mouse
GAPDH GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCTAC TTGCTGACAATCTTGAGTGAGTTG
Arginase 1 GAACACGGCAGTGGCTTTAAC TGCTTAGCTCTGTCTGCTTTGC
CD206 TCTTTGCCTTTCCCAGTCTCC TGACACCCAGCGGAATTTC
CD16 TTTGGACACCCAGATGTTTCAG GTCTTCCTTGAGCACCTGGATC
MMP-9 CTTCTTCTCTGGACGTCAAATG CATTTTGGAAACTCACACGCC
CTSK GATGCTTACCCATATGTGGGC CATATCCTTTGTTTCCCCAGC
TRAP GCCAAGATGGATTCATGGGTGG CAGAGACATGATGAAGTCAGCG
1.2 实验方法
1.2.1 健康人外周血单个核细胞（PBMC）分离及单核细胞纯化
1.2.1.1 健康人 PBMC 分离
采集志愿者（均来自在校学生）外周血于 EDTA 抗凝采血管中，新鲜分离的
血液标本立即分离 PBMC。
于无菌 50ml 管中，PBS 1:1 稀释血液标本，以降低血液粘度；取干净的 50ml
管，分离液、血液、PBS 以 1:1:1 加入，每管 15ml 分离液，用 10ml 移液管，沿管
壁缓缓加入上述血液稀释液至 45ml 刻度处，切忌分离液液面波动；室温 500g 离
心 30min，升降速度分别调至 Slow、Off。根据血液中各组成成分密度的不同，离
心后，50ml 管内由上而下依次为淡黄色血浆层，单个核细胞白膜层，透明分离液
层，及最下方的红细胞层；用移液管轻轻吸去上层血浆层，并将白膜层转移至新
的 50ml 管中，同时加入 PBS 至 50ml，500g 离心 10min；离心结束后弃上清，用
移液枪将 PBMC 细胞沉淀吹散，再加入 PBS 至 50ml，400g 离心 10min；离心结束
后弃上清，将细胞沉淀吹散。
1.2.1.2 单核细胞纯化
单核细胞纯化采用美天旎生物提供的单核细胞阳选试剂盒。
具体步骤如下：计数上述得到的 PBMC；每 1×107 PBMC 重悬于 80μl 分选 buffer
万方数据
中（含 2mM EDTA，0.5%FBS 的 PBS）；每 1×107 PBMC 加入 CD14 磁珠 20μl，4oC

孵育 15min；每 1×107 PBMC 加入 2ml 分选 buffer 500g 离心 10min；弃上清，将细胞
沉淀重悬于 500μl 分选 buffer；将新的 LS 柱置于 MACS 磁铁分离架，以分选 buffer
冲洗，将上述细胞悬液过柱，并用分选 buffer 冲洗柱子，每次 3ml，冲洗 3 遍，加入
5ml 分选 buffer，将吸附在磁场中的细胞推出来，即为 CD14 标记的阳选单核细胞。
1.2.2 人单核细胞来源的巨噬细胞的分化
纯化的单核细胞计数铺板，以 5×105/well 铺于 24 孔板中；诱导分化巨噬细胞，
其中分化 M0 细胞，于含有 5%自体血清培养基分化 6 天后换液静息；分化 M1、
M2 细胞，于培养基中加入 20ng/ml M-CSF，隔天半量换液，并同时补入 20ng/ml
相应细胞因子，培养 6 天后，M1 细胞加入 20ng/ml IFN-γ 继续分化一天，M2 细胞
加入 20ng/ml IL-4 继续分化一天，极化一天后亦换液静息。静息后可将诱导分化完
成的细胞从 24 孔板中移出，其中，M0、M1 细胞贴壁牢固，以胰酶消化；M2 细
胞半贴壁，先吹打，再用胰酶将未吹出的细胞消化下来。
1.2.3 小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化
处死小鼠，消毒后于无菌条件下取大腿骨，去除周围肌肉组织，切除两侧骨
头端部，用吸有 PBS 的注射器于一端冲洗骨髓腔，并以无菌 50ml 管于另一端接住
冲洗出的细胞悬液，ACK 破红后，加入 PBS 20ml，500g 离心 10min 并计数；以
1×106/well 铺于 24 孔中，其中分化 M0 细胞，于培养基中加入 50ng/ml M-CSF；分
化 M1、M2 细胞，于培养基中加入 20ng/ml M-CSF，隔天半量换液，并同时补入
20ng/ml 相应细胞因子，培养 6 天后，M1 细胞加入 20ng/ml IFN-γ 继续分化一天，
M2 细胞加入 20ng/ml IL-4 继续分化一天，极化一天后亦换液静息。
1.2.4 细胞培养
分化成功的巨噬细胞，以 α-MEM 完全培养基重悬于 5×104/well，铺于 96 孔细
胞培养板中，加入 30ng/ml M-CSF、50ng/ml RANKL、30ng/ml M-CSF 和 50ng/ml
RANKL 或者加入 30μg/ml LTF、M860、M860-IC、HAS-IC，于 5%CO2 培养箱中
37oC 培养 6-9 天。
在抑制或阻断实验中，将细胞与阻断抗体或抑制剂共培养 2 个小时，再加入
刺激剂，余步骤同上。
万方数据
1.2.5 流式细胞术
将分化完成人单核细胞及小鼠骨髓细胞来源的 M0、M1、M2 的巨噬细胞以
2×105/tube，10μl/tube 平均分于 EP 管中，用 PBS 以说明书要求稀释流式抗体，50μl
体系 4oC 染色 30min，每 10min 轻弹 EP 管，染色完成后，加入 1ml PBS，3500rpm
离心 5min，弃上清，将细胞沉淀以荧光抗体保存液重悬，FACS 检测。
1.2.6 TRAP 染色
破骨细胞 TRAP 染色用 Sigma-aldrich 公司提供的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）
染色试剂盒。先固定细胞，诱导分化的细胞吸弃培养基，用试剂盒提供的固定液
搭配甲醛和丙酮进行固定（1ml 固定液含有甲醛 100ul+丙酮 810ul+枸橼酸 310ul），
96 孔板中加入 100ul 固定液室温固定 2min，固定完成后用双蒸水洗 3 遍再加入提
前在 37oC 预孵的染色液，室温染色 3-5min，待破骨细胞着色后吸掉染色液，加入
200ul 双蒸水终止染色。即可去显微镜下拍摄。
1.2.7 RNA 提取
收细胞后加入 PBS 1ml/tube，3500rpm 离心 5min，弃上清，将细胞沉淀以 500μl
GTC buffer+10μlβ-巯基乙醇裂解，将裂解液吸入 1ml 注射器，反复吹打混匀，充
分裂解；将细胞裂解液转移至 gDNA Removal Column，放置于 2ml 管中，14000g
室温离心 3min；将收集管中的 flow through 转移至新的 1.5mlEP 管中；加入 250μl
无水乙醇于裂解液中，用枪吹打混匀，将样品转移至 HiBind RNA Mini Column，
放置于 2ml 管中，10000g 室温离心 1min，弃去 flow through；将柱子放置于新的
2ml 管中，加 300μl RNA Wash BufferⅠ，10000g 室温离心 1min，弃去 flow through；
将柱子放置于新的 2ml 管中，加 400μl RNA Wash BufferⅠ，10000g 室温离心 1min，
弃去 flow through；扣干 2ml 管，将柱子放于其上，加 500μl RNA Wash BufferⅡ，
10000g 室温离心 1min，弃去 flow through；加入 500μl RNA Wash BufferⅡ，12000g
室温离心 2min；将柱子转移至新的 EP 管上，用 30μl 65oC 预热的 DEPC 水解离，
室温孵育 5min，10000g 室温离心 1min；EP 管中收集到的即为提取的 RNA。
1.2.8 RNA 逆转录 cDNA
具体步骤如下：
(1) PCR 管中配制下列模板 RNA/引物混合物，总体积为 12μl；
万方数据
表 1.2 第一步逆转录加样
试剂名称使用量
模板 RNA 1ng~1μg
Oligo（dT）12-18 Primer （50 µM） 2μl
DEPC 水 Up to 12μl
（2）将 PCR 管置于 PCR 仪中，70oC 保温 10 min 后迅速在冰上急冷 2 min 以上；
（3）离心数秒钟，使模板 RNA/引物的变性溶液聚集于 PCR 管底部；
（4）在上述 PCR 管中加入下列反转录反应液：
表 1.3 第二步逆转录加样
试剂名称使用量（μl）
上述模板 RNA/引物的变性溶液 12
5×M-MLV Buffer 4
dNTP Mixture （10 mM） 1
RNase Inhibitor 0.5
RNase M-MLV （RNase H-） 0.5
DEPC 水 2
（5）42oC 保温 1h；
（6）70oC 保温 15 min 后冰上冷却，得到的 cDNA 溶液用于 PCR 扩增。
1.2.9 实时荧光定量核酸扩增（Q-PCR）
SYBR Green 荧光染料能够特异性地掺入 DNA 双链中，发射荧光信号，而不
掺入链中的 SYBR Green 染料分子不会发射荧光信号，荧光信号的累加与 PCR 扩
增产物增加成正比，以 CT 循环值来计算目的基因相对于管家基因（GAPDH 等）
的相对表达量。
表 1.4 Q-PCR 加样
试剂名称使用量（μl）
模板 cDNA 1
Forward primer 0.2
Reverse primer 0.2
Rox 0.2
SYBR Green 5
DEPC 水 3.4
万方数据
1.2.10 TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽染色

诱导分化的细胞吸弃培养基，37oC 预热的 PBS 洗细胞两次；先用 4%甲醛固
定细胞（避免甲醇成分），室温 10min；PBS 洗细胞 3 次，每次 10min；再用
0.5%TritonX-100 透化细胞，室温 5min；PBS 洗细胞 3 次，每次 10min；将 TRITC-
鬼笔环肽（100nM）用 1%BSA 配置成工作液，每孔 50ul 室温避光染色 30min；PBS
洗细胞 3 次，每次 5min；最后用 DAPI 染色，染细胞核，室温染色 15min。即可
去荧光显微镜下观察。
1.2.11 骨细胞培养板检测骨吸收能力
将待分化的细胞直接铺进骨细胞培养板中分化 9-14 天，分化完成后吸去培养
孔中培养基，加入双蒸水裂解培养孔中的细胞 2h；各孔中加入 5%硝酸银溶液（以
双蒸水溶）100ul，将培养板置于紫外灯下照射 30min，之后倒去残留的硝酸银溶
液并用双蒸水冲洗 3 遍；各孔中再加入 5%硫代硫酸钠溶液（以双蒸水溶）100ul，
以中和残留的硝酸盐；2min 后吸出残液，室温下晾干，即可去倒置显微镜下观察。
1.2.12 胶原蛋白诱导的关节炎（CIA）小鼠模型
小鼠采用 8 周的雄性 DBA/1J 小鼠，首先在 0 天将 2mg/ml 的牛Ⅱ型胶原蛋白
（CollagenII）与完全弗氏佐剂（CFA）同体积混合乳化，乳化完成后，每只小鼠
尾部距尾根部 2cm 处皮下注射 100µl 胶原与佐剂的混合物；在第 21 天将 2mg/ml
的牛Ⅱ型胶原（CollagenII）与不完全弗氏佐剂（IFA）同体积混合乳化，乳化完成
后，每只小鼠尾部距尾根部 1cm 处皮下注射 100µl 胶原与佐剂的混合物对小鼠进
行加强免疫。从 21 天开始，小鼠每 2 天进行一次关节炎发病情况评分，评分依据
如下：0 分，没有水肿和红斑；1 分，轻微的肿胀和红斑；2 分，温和的肿胀和水
肿；3 分，严重的肿胀，明显水肿；4 分，严重肿胀和水肿与关节僵直。
1.2.13 免疫组化
组织切片脱蜡至水：二甲苯（Ⅰ）10min→二甲苯（Ⅱ）10min→二甲苯（Ⅲ）
10min→100%乙醇 5min→95%乙醇 5min→85%乙醇 5min→75%乙醇 5min→蒸馏水
洗 5min；3% H2O2 室温孵育 10min；蒸馏水洗 5min，PBS 洗 3 次，每次 5min；
加入抗原修复液，微波修复 4min，自然冷却至室温，再微波修复 3min，自然冷却
至室温，最后一次微波修复 4min，自然冷却至室温；滴加适量封闭液，放入湿盒
中室温孵育 1h 或以上，不超过 2h。弃掉封闭液，滴加一定浓度适量的一抗工作液，
万方数据
4℃过夜；取出湿盒，室温放置 30min；PBS 洗 3 次，每次 5min；滴加一定浓度的

适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的二抗，37℃孵育 30min；PBS 洗 3 次，每次 5min；
滴加一定浓度的适量的生物素标记的三抗 37℃孵育 30mi；PBS 洗 3 次，每次 5min；
显微镜下 DAB 显色 3-10min；摇床慢摇，充分冲洗；用苏木素复染，然后在流水
中充分冲洗；脱水，透明，封片：75%乙醇 1min→85%乙醇 1min→95%乙醇→100%
乙醇 1min→二甲苯（Ⅰ）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→中性树脂封片。
1.2.14 单克隆抗体的制备、纯化与鉴定
1.2.13.1 杂交瘤细胞扩大培养及腹水获取
复苏实验室细胞库中的杂交瘤细胞 860（抗人乳铁蛋白的单克隆抗体），用含
1%青霉素-链霉素，10% FBS 的 low glucose DMEM 培养基于 24 孔细胞培养板中
培养 860 细胞，待 860 扩大培养后以 5×105Cell/只的浓度腹腔注射 Balb/C 小鼠，该
小鼠需提前一周腹腔注射降植烷 500μl/只，抑制小鼠免疫力，以促进杂交瘤细胞体
内扩增；接种杂交瘤细胞后密切观察小鼠状态，待小鼠腹部胀大、大量腹水产生
后，及时处死小鼠，打开腹腔，吸取腹水，3500rpm 10min 离心，取清亮的上清冻
于-20oC 待用。
1.2.13.2 抗体纯化
取腹水 10ml 离心，以 PBS 三倍稀释腹水，并用 0.22μm 滤膜过滤，以去除腹
水中的杂质及残留的降植烷等；以 PBS 冲洗 Protein G 预装柱中保存粒子用的乙醇，
调整核酸蛋白检测仪 A280 的蛋白读数为 0，将稀释后的腹水过柱，腹水中的单克
隆抗体为 mouse IgG1 亚型，可与 Protein G 结合于预装柱中，反复过柱 3 遍，收集
flow through 冻于-20oC，换 PBS 继续冲洗至核酸蛋白检测仪读数归零；以 0.1M pH 2.7
的甘氨酸为洗脱 buffer 过柱，洗脱预装柱中结合的抗体，待核酸蛋白分析仪读数由 0
升高开始收集，收集于装有 1M pH 9.0 的 Tris-HCl 中，以中和抗体 pH 值；换 PBS 继
续冲洗预装柱，后以 20%乙醇保存，4 oC 存放；将洗脱下来的抗体转移至透析袋中，
于 PBS 中 4 oC 透析，并适时更换新鲜 PBS，透析 2~3 次；将抗体从透析袋中取出，转
移至超滤管中，于冷冻离心机中 3000g 20min 离心，浓缩抗体至 1~2ml 待用。
1.2.13.3 抗体鉴定
（1）浓度测定
将试剂盒中 2mg/ml 的标准品 BSA，以 25μl /孔倍比稀释，稀释液为 PBS，从
10
万方数据
2mg/ml 往下做 8 个稀释度，即标准品浓度依次为 2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、

0.03、0 mg/ml；将抗体 3 倍或 5 倍稀释于 25μl 体系中；按照说明书要求，50:1 配
制 AB 混合物，每孔加 200μl 上述混合物，37oC 孵箱孵育 30min，酶标仪读数，读
取波长 562nm 处的吸光度值；根据标准品浓度及其吸光度读数做标准曲线，将样
本吸光度读数带入标准曲线中，同时结合样本稀释度，计算出样本蛋白浓度。
（2）SDS-PAGE 纯度鉴定
SDS-PAGE 步骤完全参照《分子克隆实验指南（第三版）》（P.1713-1720）。
根据蛋白分子量大小，配制不同浓度的分离胶，如 10%、12%或 15%，浓缩
胶为 5%；取一定量的抗体，加入 5×loading buffer，以 PBS 凑足体系，与 1.5ml EP
管中，100oC 煮样 5 min，煮样结束后离心，冰上冷却待用；将凝胶玻璃板固定于
电泳槽中，加入 1×running buffer，将上述配制好的样品加至凝胶孔中，同时加入
彩虹预染 Marker，以此判断目的蛋白分子量是否正确；调节电泳仪电压为 80V，
以 Loading buffer 中溴酚蓝为指示剂，待样本由浓缩胶进入分离胶后，更改电压为
120 V，继续跑胶，直至指示剂跑出凝胶，及时停止电泳仪；将凝胶由凝胶板中取
出，转移至染色盘中，加入 R250 考马斯亮蓝染色液中，置于摇床上，染色两个小
时；将染色完成的凝胶加入脱色液，置于摇床震荡脱色，每半小时更换一下次新
的脱色液，直至凝胶背景脱色完全，且 Marker 与条带清晰可见为止，扫描凝胶或
拍照保存。
（3）ELISA 效价检测
将 LTF 及无关蛋白 OVA 以 2μg/ml 的浓度稀释于包被液中，包被于酶标板上，
100μl/well，37oC 包被 2 小时，或 4oC 包被过夜；拍干包被液，用 0.05% PBST ，
230μl /well 反复洗板 4 次；以 5%脱脂奶（PBST 溶解）230μl /well，37oC 封闭 2
小时；拍干封闭液，用 0.05% PBST，230μl /well 反复洗板 4 次；将待测抗体以 100μl
体系，由 2μl /ml 往下做倍比稀释；并于 37oC 孵育 2 小时；拍干样本，用 0.05%
230μl /well 反复洗板 4 次；用 PBST 1:4000 稀释 HRP 标记的 goat anti-mouse
PBST ，
IgG，100μl /well 于 37oC 孵育半小时；拍干二抗，用 0.05% PBST，230μl /well 反
复洗板 4 次；加入 TMB 显色液，100μl /well，显色 5~10min，然后加入 50μl /well
ELISA 终止液，终止显色反应，酶标仪读取波长 450nm 处的 OD 值。根据 OD 值
读数判断抗体效价。
11
万方数据
第二章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
第二章人单核细胞来源的巨噬细胞及小鼠骨髓细胞
来源的巨噬细胞的分化
本课题主要研究 M2 型巨噬细胞来源的破骨细胞在类风湿性关节炎中的作用，
成功建立其稳定的分化系统对于后续的实验开展至关重要。利用人或鼠重组巨噬
细胞集落刺激因子（M-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）诱导人
外周血单核细胞及小鼠骨髓细胞向 M1、M2 表型的巨噬细胞分化[17]，并对分化
完成的巨噬细胞进行表面标志物及细胞因子的鉴定。
2.1 人单核细胞的纯化
采集健康志愿者外周血，利用密度梯度离心法分离人的外周血单个核细胞
（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC），接着利用美天旎 CD14 阳选磁珠将人的
CD14+单核细胞分离出来，并对其分选纯度进行流式鉴定，如图 2-1 所示，我们成
功分离了高纯度的 CD14+单核细胞，为人巨噬细胞的分化提供基础。
图 2-1 人单核细胞的纯化
Figure 2-1. Purification of human monocytes. Monocytes were harvested by magnetic cell
separation from PBMCs. PMBCs (A) and monocytes (B) were stained with PE-conjugated
anti-human CD14 and subjected to analysis by flow cytometry.
12
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第二章
2.2 人单核来源的巨噬细胞的分化及鉴定
2.2.1 人单核来源的巨噬细胞的分化
人的巨噬细胞包括经典活化型巨噬细胞（Classical activated macrophages, M1）、
替代活化型巨噬细胞（Alternatively activated macrophages, M2）以及未刺激活化的
巨噬细胞（M0），M1 型巨噬细胞用 20ng/ml 的 GM-CSF 分化 6 天，或者用 20ng/ml
的 M-CSF 分化 6 天，并加 20ng/ml 的 IFN-γ 极化 1 天；M2 型巨噬细胞用 20ng/ml
的 M-CSF 分化 6 天，并加 IL-4 极化 1 天；M0 型巨噬细胞用含自体血清的完全培
养基直接分化 6 天，隔天半量换液，显微镜下观察完成分化的细胞形态。其中 M1
细胞贴壁最牢，呈圆形或椭圆形；M2 细胞贴壁能力较 M1 弱，呈梭形；M0 细胞
贴壁中等，呈圆形。
2.2.2 人单核细胞来源的巨噬细胞的表型鉴定
人单核细胞在分化为 M0、M1 及 M2 型巨噬细胞的过程中，伴随着膜分子
CD14、CD163（Scavenger receptor, SR）、CD206（Mannose receptor, MR）以及 FcγR
（CD16、CD32、CD64）表达水平的变化[18-20]。
图 2-2 人单核细胞来源的巨噬细胞表型鉴定
Figure 2-2. Phenotype identification of human monocyte-derived macrophages. Human

monocyte-derived M0/M1/M2 macrophages were stained with PE-conjugated anti-human CD14,
APC-conjugated anti-human CD163, PE-conjugated anti-human CD206, APC-conjugated
anti-human CD16, APC-conjugated anti-human CD32, and FITC-conjugated anti-human CD64 for
30 minutes, and subjected to analysis by flow cytometry.
对分化完成的人单核细胞来源的巨噬细胞进行膜分子鉴定，如图 2-2 可见在
13
万方数据
M1 细胞中，CD14 高表达，CD163 低表达，CD206 不表达；FcγRs 中，CD16、CD32、

CD64 均表达，且 CD32 表达量最高。在 M2 细胞中，CD14 高表达，CD163 和 CD206
高表达；FcγRs 中，CD32 表达大于 CD16 大于 CD64；在 M0 细胞中，CD14 高表
达，CD16 低表达，CD206 中表达；FcγRs 中，CD16、CD32、CD64 均表达，且
CD32 表达量最高。三种细胞特异性膜分子表达情况与文章中报道一致，提示人单
核细胞来源的巨噬细胞分化成功[18-20]。
2.2.3 人单核细胞来源的巨噬细胞的细胞因子鉴定
将人单核细胞分化完成的 M0、M1 及 M2 细胞，以 100ng/ml 的脂多糖（LPS）
活化 18 小时，检测其细胞培养上清中肿瘤坏死因子（TNF-α）及白介素-10（IL-10）
的含量。如图 2-3 所示，经 LPS 活化后的 M0 及 M1 细胞，释放大量 TNF-α[21, 22]；
而 M2 细胞则释放大量 IL-10。上述 M0、M1、M2 细胞活化后，其细胞因子分泌
情况与文献报道一致。
图 2-3 人单核细胞来源巨噬细胞细胞因子鉴定
Figure 2-3. Cytokines produced by human monocyte-derived M0、M1 and M2 macrophages.

Freshly differentiated M0、M1 and M2 macrophages (5×105 cells/well) were incubated with
100ng/ml LPS for 18 hours and the supernatants were collected. Concentration of TNF-α (A) and
IL-10 (B) were detected by using human TNF-α and IL-10 ELISA kit. The results are expressed as
mean±SD performed in parallel and representative of at least three experiments.
2.3 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分化及鉴定
本课题主要研究人和小鼠 M2 型巨噬细胞来源的破骨细胞在类风湿性关节炎
中的作用，用小鼠的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、干扰素-γ（IFN-γ ）、白
14
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第二章
细胞介素-4/10（IL-4/IL-10）体外诱导分化 BMDM0、BMDM1 和 BMDM2，并进

行鉴定[23, 24]。
2.3.1 小鼠骨髓来源巨噬细胞的分化
处死小鼠，无菌条件下取小鼠骨髓，加入 20ng/ml 小鼠巨噬细胞集落刺激因子
（M-CSF），隔天半量换液，诱导分化 6 天后即为 BMDM0，加 20ng/ml 小鼠干扰
素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4/10（IL-4/IL-10）继续分化一天，即为 BMDM1 及
BMDM2。
图 2-4 小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化
Figure 2-4. Differentiation protocol of mouse bone marrow derived macrophages. Mouse bone
marrow cells were differentiated into BMDM0 cells with 20ng/ml M-CSF for 6 days, and BMDM1
with extra 20ng/ml IFN-γ, BMDM2 with extra 20ng/ml IL-4 or IL-10, half replaced the medium
every two days.
2.3.2 小鼠骨髓来源巨噬细胞的表型鉴定
据文献报道，小鼠骨髓来源的 M2 细胞高表达 CD16、CD206、Arginase-Ⅰ。
对完成分化的小鼠骨髓来源的巨噬细胞，提取 RNA，逆转 cDNA 并进行荧光实时
定量 PCR 检测，考察其标志膜分子的表达情况。如图 2-5 所示，BMDM2 中 CD16、
CD206、Arginase-Ⅰ表达量明显高于 BMDM0 及 BMDM1，与文献报道一致[25, 26]，
提示小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化成功，可用于后续实验。
图 2-5 小鼠骨髓来源巨噬细胞标志物鉴定
15
万方数据
Figure 2-5. Phenotype identification of bone marrow derived macrophages. Freshly

differentiated bone marrow-derived macrophages were lysed and analyzed for mRNA expression of
BMDM2 markers, including CD16 (A), CD206 (B) and Arginase-Ⅰ(C), determined by quantitative
RT-PCR (normalized to geometric mean of GAPDH expression).
2.4 本章小结
采集人的外周血单个核细胞（PBMC），并通过 CD14 阳选磁珠纯化出单核细

胞，用重组的人的细胞因子（M-CSF/IL-4/IFN-γ），将单核细胞在体外分化为 M0、
M1 及 M2 型巨噬细胞，并对完成分化的细胞进行标志膜分子及其分泌细胞因子的
鉴定，成功分化的细胞可用于后续实验研究。用重组的小鼠的细胞因子
（M-CSF/IFN-γ/IL-4）成功地将小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞（BMDM0、BMDM1
及 BMDM2），并通过 Q-PCR 进行其标志物的表型鉴定，成功分化的细胞可用于后
续实验。
16
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第三章
第三章 M-CSF+RANKL 诱导 M2 细胞分化成破骨细

胞
近年来的文献中有报道，在 RA 病人关节腔浸润的炎性细胞中，M2 巨噬细胞

占很高的比例，并且在自身免疫疾病的发展过程中扮演着促炎的角色。RA 病人滑
膜组织中，80%以上的 M2 细胞能够释放促炎性细胞因子 TNF-α；且在小鼠心肌炎
模型中，TLR4、IL-1β 等在小鼠 Gr-1+F4/80+双阳性 M2 细胞中的表达也高于 M1
细胞，这些研究均提示 M2 型巨噬细胞在 RA 的发病过程中起到重要的作用[8-10,
21]。已有研究表明 M2 巨噬细胞表面高表达 RANKL 的配体 RANK，但是 M2 型
巨噬细胞能否通过向破骨细胞分化参与 RA 的发病过程目前还未可知。本章着重考
察 M-CSF+RANKL 能否诱导 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞。
3.1 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色
采集人的外周血单核细胞以及小鼠的骨髓细胞，按照上一章的步骤分化巨噬
细胞，分化完成后人 M2 巨噬细胞（hM2）以 30ng/ml M-CSF 与 50ng/ml RANKL
共同刺激分化，小鼠 M2 巨噬细胞（mM2）以 50ng/ml M-CSF 与 100ng/ml RANKL
共同刺激分化，以相对应浓度的单独 M-CSF 及 RANKL 为试验对照。分化 9 天后，
用 Sigma-aldrich 公司提供的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒进行染色，
并在显微镜下观察拍照。
17
万方数据
第三章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
图 3-1 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 细胞分化成破骨细胞 TRAP 染色
Figure 3-1. TRAP staining for osteolasts differentiation induced by M-CSF+RANKL on human
and mouse M2 macrophages. Human and mouse M2 macrophages were cultured in the presence of
M-CSF、RANKL and M-CSF+RANKL for 9 days, then cells were stained for TRAP. Representative
images are presented.
如图 3-1 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均不能使 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化，

而 M-CSF 和 RANKL 可以诱导人单核来源以及小鼠骨髓细胞来源的 M2 巨噬细胞
分化成 TRAP 染色阳性的破骨样细胞。
3.2 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色
肌动蛋白环（F actin-ring）是破骨细胞形成的重要标志之一，破骨细胞的溶骨
作用与含微丝构成的肌动蛋白环的形成关系密切。将分化完成后人 M2 巨噬细胞以
30ng/ml M-CSF 与 50ng/ml RANKL 共同刺激分化，小鼠 M2 巨噬细胞以 50ng/ml
M-CSF 与 100ng/ml RANKL 共同刺激分化，以相对应浓度的单独 M-CSF 及 RANKL
为试验对照。分化 9 天后，用 TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽染色破骨细
胞高表达的肌动蛋白环，在荧光显微镜下观察拍照。
图 3-2 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色
Figure 3-2. F actin-ring staining for osteolasts differentiation induced by M-CSF+RANKL on

human and mouse M2 macrophages.. Human and mouse M2 macrophages were cultured in the
presence of M-CSF、RANKL and M-CSF+RANKL for 9 days, then cells were stained for TRITC
Phalloidin. Representative images are presented.
18
万方数据
如图 3-2 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞并没有的出

现明显的环状结构，而 M-CSF+RANKL 诱导人单核来源以及小鼠骨髓细胞来源的
M2 巨噬细胞分化成的破骨样细胞能形成明显的肌动蛋白环（F actin-ring）结构。
3.3 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志分子

变化情况
采集人的外周血单核细胞以及小鼠的骨髓细胞，按照上一章的步骤分化巨噬
细胞，分化完成后人 M2 巨噬细胞以 30ng/ml M-CSF 与 50ng/ml RANKL 共同刺激
分化，小鼠 M2 巨噬细胞以 50ng/ml M-CSF 与 100ng/ml RANKL 共同刺激分化，
分别分化 3、6、9 天，收集细胞，GTC 裂解，提取 RNA，逆转 cDNA，用荧光实
时定量 PCR（Q-PCR）的方法，检测破骨细胞相关分子的转录情况。
图 3-3 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化破骨细胞相关标志分子转

录情况
Figure 3-3. Q-PCR for osteolasts differentiation induced by M-CSF+RANKL on human and
mouse M2 macrophages. Human (A) and mouse (B) M2 macrophages were cultured in the
presence of M-CSF+RANKL for 0, 3, 6, 9 days in 24-well plates, then mRNA expression of MMP-9,
CTSK and TRAP by cultured M2 macrophages were determined by Q-PCR. (normalized to
geometric mean of GAPDH expression).
如图 3-3 所示，M-CSF 和 RANKL 刺激人 M2 巨噬细胞 3、6、9 天之后，检测

破骨细胞相关特异性标志分子的表达情况，包括基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、
组织蛋白酶 K（CathapsinK, CTSK）其表达均显著上调，而抗酒石酸酸性磷酸酶
19
万方数据
（TRAP）的表达有所下调，我们猜测可能与 M2 巨噬细胞的分化相关。M-CSF 和
RANKL 刺激小鼠 BMDMM2 巨噬细胞 3、6、9 天之后，其中 MMP-9、CTSK 及
TRAP 表达均显著上调。与成熟的破骨细胞表型一致。
3.4 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定
在骨细胞培养板中培养人和小鼠的 M2 巨噬细胞，人 M2 巨噬细胞以 30ng/ml

M-CSF 与 50ng/ml RANKL 共同刺激分化，小鼠 M2 巨噬细胞以 50ng/ml M-CSF 与
100ng/ml RANKL 共同刺激分化，以相对应浓度的单独 M-CSF 及 RANKL 为试验
对照。分别分化 14 天后，将培养板中的细胞用双蒸水裂解掉并用硝酸银染骨培养
板中的骨陷窝，在显微镜下观察拍照。
图 3-4 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 细胞分化后骨吸收功能的鉴定
Figure 3-4. Bone resorption analysis for osteolasts differentiation induced by M-CSF+RANKL
on human and mouse M2 macrophages. Human and mouse M2 macrophages were cultured with
M-CSF、RANKL and M-CSF+RANKL in the Corning bone cell culture plate for 14 days, then the
plate were stained with 5% AgNO3. Representative images are presented.
如图 3-4 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞在骨培养板

中并没有的出现骨的吸收和破坏，而 M-CSF 和 RANKL 诱导人单核来源以及小鼠
骨髓细胞来源的 M2 巨噬细胞分化成的细胞在骨培养板中形成大面积的骨陷窝，
说明 M2 细胞在 M-CSF 和 RANKL 的诱导下分化的破骨样细胞是具有骨的吸收和
20
万方数据
破坏功能的，进一步证明在 M-CSF+RANKL 的诱导下人单核来源的以及小鼠骨髓

细胞来源的 M2 巨噬细胞能够分化为成熟的有功能的破骨细胞。
3.5 M0/M1/M2 巨噬细胞 RANK 的表达
我们在体外完成三种巨噬细胞的分化，人单核细胞来源的三种巨噬细胞分化
完成后直接用 GTC 裂解，提取 RNA，逆转后做 Q-PCR 检测 RANKL 受体 RANK
的表达情况，小鼠骨髓细胞来源的种巨噬细胞分化完成后，收集细胞，流式抗体
anti-mouse RANK-PE 染色，FACS 检测膜表面 RANKL 受体 RANK 的表达情况。
图 3-5 体外分化人及小鼠的 M0/M1/M2 巨噬细胞 RANK 表达
Figure 3-5. Expression of RANK on human monocytes derived and mouse bone marrow
derived-M0, M1, M2 macrophages. Freshly differentiated human monocytes-derived macrophages
were lysed and analyzed for mRNA expression of RANK determined by quantitative RT-PCR (A)
(normalized to geometric mean of GAPDH expression). Mouse bone marrow-derived macrophages
were stained with PE-conjugated anti-mouse RANK for 30 minutes, and subjected to analysis by
flow cytometry (B).
如图 3-5 所示，人单核细胞来源的三种巨噬细胞分化完成后做 Q-PCR 检测，

结果发现其中 M2 型巨噬细胞的 RANKL 受体 RANK 的表达量远远高于 M0 和 M1
型巨噬细胞；小鼠骨髓细胞来源的三种巨噬细胞分化完成后，收集细胞，流式抗
体染色，其 BMDM2 的 RANK 的表达也同样高于 BMDM0 和 BMDM1。
3.6 比较 M0/M2 巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的时间与剂量

关系
人单核细胞来源的和小鼠骨髓细胞来源的 M2 巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL

共同诱导分化成具有骨破坏功能的成熟的破骨细胞。在 RA 病人关节腔浸润的炎性
21
万方数据
细胞中，虽然存在一定数量的 M2 型巨噬细胞，但是同样也存在有 M0、M1 型巨

噬细胞，这些细胞中哪一种细胞对 RA 病人骨损坏的过程更加重要呢？为了解决这
一问题，我们设计实验比较 M0/ M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。人的单核细
胞在体外分化，其中 M0 用含自体血清培养基分化 6 天，M2 用 M-CSF 分化 6 天
再用 IL4 极化一天，分化完成后用 M-CSF（30ng/ml）和 RANKL（50ng/ml）分化
3、6、9 天以及用不同 RANKL 浓度（12.5、25、50ng/ml）分化 6 天并进行 TRAP
染色，检测三种巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。
图 3-6 人单核来源的巨噬细胞向破骨细胞分化时间关系
Figure 3-6. M-CSF and RANKL induced human monocyte-derived macrophages to

differentiate into osteolasts in time-dependant manner. Human M0, M2 macrophages were
cultured in 96-well plates with 30ng/ml M-CSF and 50ng/mlRANKL for 3, 6, 9 days, then the cells
were stained for TRAP (A) and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at
different time points are shown with histogram (B).
用人的单核细胞在体外分化 M0、M2 巨噬细胞，

并将这两种巨噬细胞用 M-CSF
和 RANKL 共同诱导分化，如图 3-6 所示，这两种细胞向破骨细胞分化的时间关系
中，M2 巨噬细胞在第三天已经开始有少量破骨细胞产生，第六天之后已经有大量的
破骨细胞产生，其 TRAP 染色阳性的细胞数目远远高于 M0 巨噬细胞。
22
万方数据
图 3-7 人单核来源的巨噬细胞向破骨细胞分化 RANKL 剂量关系
Figure 3-7. M-CSF and RANKL induced human monocyte-derived macrophages to

differentiate into osteolasts in dose-dependant manner. Human M0, M2 macrophages were
cultured in 96-well plates with 12, 25, 50ng/ml RANKL for 9 days, then the cells were stained for
TRAP (A) and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at different
concentration are shown with histogram (B).
在剂量关系中，如图 3-7 所示，M2 巨噬细胞在 RANKL 浓度在 12.5 ng/ml 时就

已经开始形成破骨细胞了，其中 RANKL 浓度越高，破骨细胞形成的数目越多。
这一结果可以看出，在体外分化的人单核来源的巨噬细胞中 M2 型巨噬细胞向破骨
细胞分化的能力明显高于 M0 巨噬细胞。
同时，我们也在小鼠骨髓分化的巨噬细胞中重复该实验，小鼠的骨髓细胞在
体外分化，其中 M0 用含 M-CSF 分化 6 天，M2 用 M-CSF 分化 6 天再用 IL4 极化
一天，分化完成后用 M-CSF（50ng/ml）和 RANKL（100ng/ml）分化 3、6、9 天
以及用不同 RANKL 浓度（10、30、100ng/ml）分化 6 天并进行 TRAP 染色，检测
两种巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。
用小鼠骨髓细胞在体外分化 M0、M2 两种巨噬细胞，并将这两种细胞用 M-CSF
和 RANKL 共同诱导分化，如图 3-8 所示，这三种细胞向破骨细胞分化的时间关系
中，在第三天时并没有明显的破骨细胞产生，第六天之后 M2 细胞培养体系中已经
有大量的破骨细胞产生，其 TRAP 染色阳性的细胞数目远远高于 M0。
23
万方数据
图 3-8 小鼠骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化的时间关系
Figure 3-8. M-CSF and RANKL induced mouse bone marrow-derived macrophages to
differentiate into osteolasts in time-dependant manner. Mouse M0, M2 macrophages were
cultured in 96-well plates with 50ng/ml M-CSF and 100ng/ml RANKL for 3, 6, 9 days, then the
cells were stained for TRAP (A) and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at
在剂量关系中，如图 3-9 所示，BMDM2 在 RANKL 浓度为 30 ng/ml 时就已经

明显开始形成破骨细胞了，在 RANKL 浓度为 100 ng/ml 时两种细胞培养体系中都
有明显的破骨细胞生成，但是 M2 细胞培养体系中有更多数目的破骨细胞生成。这
一结果可以看出，在体外分化的小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞中 BMDM2 向破骨
细胞分化的能力明显高于 M0。
图 3-9 小鼠骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化的 RANKL 剂量关系
Figure 3-9. M-CSF and RANKL induced mouse bone marrow-derived macrophages to
differentiate into osteolasts in dose-dependant manner. Mouse M0, M2 macrophages were
cultured in 96-well plates with 10, 30, 100ng/ml RANKL for 9 days, then the cells were stained for
concentration are shown with histogram (B).
24
万方数据
3.7 不同分化方案获得的 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均高于其他巨

噬细胞
上文中提到的体外分化的 M2 细胞，均是由 M-CSF 连续分化 6 天，再加 IL-4

极化一天而获得的。为了进一步确认 M2 的强破骨细胞分化能力的普遍性，我们采
用不同方案获得的 M2 巨噬细胞进行破骨细胞诱导分化实验。
取正常人外周血单核细胞在体外用 20ng/ml M-CSF 分化 6 天，参照文献报道，
在第 6 天分别用 20ng/ml IL4（M2a）、IL10（M2c）、IFN-γ（M1）等细胞因子和肿
瘤细胞培养上清（TCM）极化 1 天（肿瘤相关巨噬细胞，TCM），将这些不同细胞
因子极化的巨噬细胞重新铺板并加入 M-CSF 和 RANKL 分化 6 天进行 TRAP 染色，
观察并统计这几种巨噬细胞向破骨细胞分化的能力情况。
图 3-10 不同细胞因子极化的人巨噬细胞向破骨细胞分化的能力比较
Figure 3-10. Comparison of IL-4, IL-10, IFN-γ and tumor supernatants polarized human
monocytes-derived macrophages about differentiating into osteolasts. IL-4, IL-10, IFN-γ and
tumor supernatants polarized macrophages were cultured with 30ng/ml M-CSF and 50ng/ml
RANKL for 7 days, then the cells were stained for TRAP and the numbers of TRAP+ osteoclasts in
each sight from cultures at different macrophages are shown with histogram.. The results are
expressed as mean±SD performed in parallel and representative of three experiments with different
donors.
对不同方案极化的人 M2 细胞进行破骨细胞诱导分化实验，如图 3-10 所示，

利用 IL10 及肿瘤细胞培养上清极化的人单核细胞来源的 M2 型巨噬细胞在 M-CSF
25
万方数据
和 RANKL 共同刺激下向破骨细胞分化的能力与 IL-4 极化的 M2 型巨噬细胞一致，

均明显高于单加 M-CSF 和用 IFN-γ（M1）极化的巨噬细胞，提示人 M2 型巨噬细
胞向破骨细胞分化的能力强于其他巨噬细胞存在普遍性。
图 3-11 不同细胞因子极化的小鼠巨噬细胞向破骨细胞分化的能力比较
Figure 3-11. Comparison of IL-4, IL-10, IFN-γ and tumor supernatants polarized mouse bone
marrow-derived macrophages about differentiating into osteolasts. IL-4, IL-10, IFN-γ and
tumor supernatants polarized macrophages were cultured with 50ng/ml M-CSF and 100ng/ml
RANKL for 7 days, then the cells were stained for TRAP and the numbers of TRAP+ osteoclasts in
each sight from different macrophages are shown with histogram. The results are expressed as
mean±SD performed in parallel and representative of three experiments with different mice.
如图 3-11 所示，利用 IL-10 及肿瘤细胞培养上清极化的小鼠骨髓细胞来源的

M2 型巨噬细胞在 M-CSF 和 RANKL 共同刺激下向破骨细胞分化的能力与 IL-4 极
化的 M2 型巨噬细胞一致，均明显高于单加 M-CSF 和用 IFN-γ（M1）极化的巨噬细
胞，提示小鼠 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力强于其他巨噬细胞存在普遍性。
3.8 本章小结
本章中，我们在体外分化了人单核来源的 M2 巨噬细胞和小鼠骨髓细胞来源的
M2 巨噬细胞，并用 M-CSF 和 RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化。我们通
过 TRAP 染色、F actin-ring 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板染色等方法鉴定其分
化完成的细胞即为成熟的有功能的破骨细胞。此外，我们还比较和分析了人和小
26
万方数据
鼠 M0、M2 细胞向破骨细胞分化的能力，我们在体外分化了人和小鼠 M0、M2 细

胞，比较这两种细胞向破骨细胞分化的能力，结果发现不管是时间关系还是剂量
关系，M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均强于 M0；并且我们采用不同方案
获得的 M2 巨噬细胞进行破骨细胞诱导分化实验，结果发现 M2 型巨噬细胞向破骨
细胞分化的能力强于其他巨噬细胞存在普遍性。
27
万方数据
第四章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
第四章 CIA 模型小鼠中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
前一章的实验结果显示，M-CSF 和 RANKL 能够在体外诱导不同方案极化的

M2 巨噬细胞向破骨细胞分化，且分化能力明显强于其他表型的巨噬细胞。为了进
一步确定 M2 向破骨细胞分化的能力及其在关节炎中的作用，我们在体内用Ⅱ型胶
原蛋白诱导小鼠的关节炎模型，观察在小鼠发病关节中 M2 表型巨噬细胞的比例，
并利用流式分选分别将 M1 及 M2 分选出来进行破骨细胞分化实验。
4.1 CIA 小鼠模型建立及发病关节中 CD206+M2 巨噬细胞浸润比例
利用二型胶原蛋白免疫 DBA/1 小鼠建造胶原诱导的关节炎（CIA）模型，6-8

周后观察小鼠发病情况[27]，然后将 CIA 小鼠的发病关节取下经过固定、脱钙、脱
水、包埋、切片及染色等步骤送技术公司做免疫组化，染 M2 型巨噬细胞的标志分
子 F4/80 和 CD206，以不发病关节作为对照。
图 4-1 CIA 小鼠模型建立及发病关节中 CD206+M2 巨噬细胞浸润比例
Figure 4-1. Model of collagen-induced arthritis and CD206 + M2 macrophages infiltration ratio
in synovium of CIA mice. Bovine type Ⅱ was emulsified with with Freund’s complete adjuvant at
an equal volume. 100μl emulsion containing 100μg of CⅡ was injected into mice
intradermally at the base of the tail on day 0. The mice received a booster challenge of C
Ⅱ emulsified with Freund’s incomplete adjuvant on day 21 (A). Mice with normal and CIA were
sacrificed on day 42. Bones were fixed and decalcified with EDTA. Digital joints section was
immuohistochemical stained for F4/80 and CD206 (B).
28
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第四章
如图 4-1 所示，DBA/1 小鼠经过二型胶原免疫 6-8 周之后，前肢发生变红肿胀，

即 CIA 模型建立成功，并且将发病前肢取下做免疫组化染色，结果发现 CIA 小鼠
发病关节中 M2 型（CD206+）巨噬细胞比例增高，证实在关节炎小鼠发病关节中
浸润着大量的 CD206 高表达的 M2 型巨噬细胞，并且可能对关节炎中骨的破坏起
重要作用。
此外，我们又将 CIA 小鼠的骨髓和关节滑膜中的细胞取出以 F4/80+CD206+的
细胞来界定 M2 型巨噬细胞，利用流式染色和流式分选的方法检测 M2 型巨噬细胞
的比例及数目。
图 4-2 CIA 小鼠骨髓和关节滑膜中 M2 巨噬细胞浸润比例
Figure 4-2. Proportion of M1 and M2 macrophages from bone marrow and synovia in normal
and CIA mice. Bone marrow and synovial macrophages from CIA or normal mice were stained with
Percp–cy5.5-conjugated anti-mouse CD45, APC-conjugated anti-mouse CD11b,
APC-cy7-conjugated anti-mouse F4/80 and PE-conjugated anti-mouse CD206 for 30 minutes, and
subjected to analysis by flow cytometry (A) and the sorting number of F4/80+CD206+ and
F4/80+CD206- cells from bone marrow and synovium were shown with histogram (B).
如图 4-2 所示，首先我们将正常小鼠和 CIA 小鼠处死后取出其骨髓及发病关

节，流式鉴定结果看出在 CIA 小鼠中其骨髓内的 M2 型巨噬细胞的比例都比正常
小鼠高，而在关节中其 M2 的比例却有所下调；但是在流式分选结果中我们可以看
出无论是在骨髓细胞中还是在关节滑膜细胞中 CIA 小鼠分选出的 M2 型巨噬细胞
的数目都是高于正常小鼠的。这提示我们在 CIA 小鼠骨髓和关节中有一定数目的
29
万方数据
M2 细胞浸润。
4.2 CIA 小鼠骨髓中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
上文中提到的人和小鼠的巨噬细胞都是在体外完成分化的。为了进一步确定
M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的能力，我们采用流式分选的方法将 CIA 小鼠骨髓中
M1（F4/80+CD206-）及 M2（F4/80+CD206+）型巨噬细胞分选出来并在体外用 M-CSF
和 RANKL 共同诱导分化，以不发病小鼠骨髓做对照组，然后 TRAP 染色在显微
镜下观察拍照并统计。
图 4-3 流式分选 CIA 小鼠骨髓中 M1 巨噬细胞及 M2 巨噬细胞
Figure 4-3. M1 and M2 macrophages from normal and CIA mice by FACS. M1 and M2
macrophages from CIA or normal mice were stained with Percp–cy5.5-conjugated anti-mouse CD45,
APC-conjugated anti-mouse CD11b, APC-cy7-conjugated anti-mouse F4/80 and PE-conjugated
anti-mouse CD206 for 30 minutes, and subjected to analysis by flow cytometry for reverse detected.
如图 4-3 所示，将未发病小鼠及 CIA 小鼠骨髓取出后用流式分选仪圈出

CD45+CD11b+F4/80+的细胞，并在其中将 M1 及 M2 细胞分选出来。我们反测了分
选后的细胞，结果显示在未分选之前小鼠骨髓 CD45+CD11b+F4/80+中 M2 细胞大约
占 10%，M1 细胞占 90%左右；分选完成之后 M2 骨髓细胞比例在 50%左右，M1
细胞比例在 99%以上，纯度大大提高。将分选出来的这四组细胞在体外培养用
30
万方数据
M-CSF+RANKL 共同诱导分化 7-9 天，TRAP 染色检测这四组细胞向破骨细胞分化

的能力。
图 4-4 CIA 小鼠骨髓中 M1 巨噬细胞及 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的比较
Figure 4-4. Comparison of M1 and M2 macrophages from normal and CIA mice about
differentiating into osteolasts. M1 and M2 macrophages from CIA or normal mice were cultured
with 50ng/ml M-CSF and 100ng/ml RANKL for 6 days, then the cells were stained for TRAP (A)
and the number of TRAP+ osteoclasts in each sight from different macrophages are shown with
histogram (B). The results are expressed as mean±SD performed in parallel and representative of
three experiments with different mice.
如图 4-4 所示，TRAP 染色后并统计其结果显示，无论是在 CIA 小鼠骨髓中直

接分选出来还是未发病小鼠骨髓中分选出来的 M2 细胞向破骨细胞分化的能力均
强于 M1 细胞，这与上一章体外分化的巨噬细胞的结果是一致的。与对照组相比，
CIA 小鼠骨髓来源的 M2 细胞具有更强的向破骨细胞分化的能力。
4.3 CIA 小鼠发病关节中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
分选骨髓细胞的同时，我们也将 CIA 小鼠发病的关节取出，剔除其周围的肌肉

组织再用四型胶原酶将关节中的细胞消化下来，接着再用流式分选的方法将 M1
及 M2 巨噬细胞分选出来并在体外用 M-CSF 和 RANKL 诱导分化，以不发病小鼠
骨髓做对照组，然后 TRAP 染色在显微镜下观察拍照并统计。
31
万方数据
图 4-5 流式分选出 CIA 小鼠关节中 M1 巨噬细胞细胞及 M2 巨噬细胞
Figure 4-5. M1 and M2 synovial macrophages from normal and CIA mice by FACS. M1 and
M2 synovial cells from CIA or normal mice were stained with Percp –cy5.5- conjugated anti-mouse
CD45, APC- conjugated anti-mouse CD11b, APC-cy7-conjugated anti-mouse F4/80 and
PE-conjugated anti-mouse CD206 for 30 minutes, and subjected to analysis by flow cytometry for
reverse detected.
如图 4-5 所示，将未发病小鼠及 CIA 小鼠肿胀关节周围细胞取出后用流式分

选仪圈出 CD45+CD11b+F4/80+的细胞，根据是否表达 CD206 将 M1 和 M2 两群细
胞分选出来。对分选后的细胞进行反测，结果看出在未分选之前未发病小鼠关节
CD45+CD11b+F4/80+中 CD206+M2 细胞大约占 60%，CD206-M1 细胞占 30%左右；
分选完成之后 M2 巨噬细胞比例在 96%以上，M1 巨噬细胞比例在 98%以上；CIA
小鼠关节 CD45+CD11b+F4/80+中 M2 细胞大约占 40%，M1 细胞占 58%左右；分选
完成之后 M2 巨噬细胞比例在 85%以上，M1 巨噬细胞比例在 98%以上，纯度大大
提高。
接着我们将分选出来的这四组细胞在体外培养用 M-CSF 和 RANKL 共同诱导
32
万方数据
分化 7-9 天，TRAP 染色检测这四组细胞向破骨细胞分化的能力。如图 4-6 所示，

TRAP 染色后并统计其结果显示，无论是在 CIA 小鼠关节中直接分选出来还是未
发病小鼠关节中分选出来的 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均强于 M1 巨噬细
胞。且相较于未发病鼠，来源于 CIA 小鼠关节中的 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
的能力明显更强。
图 4-6 CIA 小鼠关节中 M1 及 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的比较
Figure 4-6. Comparison of M1 and M2 synovial macrophages from normal and CIA mice
about differentiating into osteolasts. M1 and M2 synovial macrophages from CIA or normal mice
were cultured with 50ng/ml M-CSF and 100ng/ml RANKL for 6 days, then the cells were stained for
TRAP (A) and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from different macrophages are
shown with histogram (B). The results are expressed as mean±SD performed in parallel and
representative of three experiments with different mice.
4.4 本章小结
本章中，由于 M2 型巨噬细胞其 CD206 的表达高于 M0 及 M1，所以我们以

CD206 的高表达来界定 M2 型巨噬细胞。首先我们将 CIA 小鼠模型中发病前肢取
下做免疫组化染色，结果发现 CIA 小鼠发病关节中 CD206+巨噬细胞比例增高，证
实在关节炎小鼠发病关节中浸润着大量的 CD206 高表达的 M2 型巨噬细胞，并且
可能对关节炎中骨的破坏起重要作用；同时我们也比较了正常小鼠和 CIA 小鼠骨
髓和关节滑膜中 M2 巨噬细胞的比例及分选后 M2 巨噬细胞的数目，结果发现在骨
髓和关节滑膜中 CIA 小鼠 M2 巨噬细胞的数目均高于正常小鼠；我们还通过流式
分选将正常和 CIA 小鼠骨髓及关节中的 M2 巨噬细胞分选出来并在体外培养，结
33
万方数据
果发现小鼠 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均强于 M1 巨噬细胞，并且相比较

于未发病小鼠，CIA 小鼠骨髓和关节中的 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的能力明显
更强。这些结果均提示我们 M2 型巨噬细胞可以通过更容易向破骨细胞分化在 RA
中发挥作用进而影响着 RA 的病程。
34
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第五章
第五章 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的可能机制
由上一章的实验结果中可知，在体外分化完成的 M2 型巨噬细胞可以通过
M-CSF 和 RANKL 分化为有功能的破骨细胞并且 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化
的能力均强于 M0 和 M1 型巨噬细胞；此外，从 CIA 小鼠骨髓和关节内分选出来
的 CD206+的 M2 型巨噬细向破骨细胞分化的能力同样高于 CD206-的 M1 巨噬细
胞。这提示我们 CD206 可能参与到 M2 型巨噬细向破骨细胞分化的过程中，并且
可能具有重要的意义。为了验证我们的猜想，我们设计了如下实验：
5.1 M0/M1/M2 巨噬细胞 CD206 的表达
在巨噬细胞分化鉴定的过程中，甘露糖受体即 CD206 的表达也有显著的不同，

我们将分化完成后的三种巨噬细胞收集，用流式抗体 anti-human CD206-PE 和
anti-mouse CD206-PE 染色，FACS 检测 CD206 的表达情况。
图 5-1 体外分化人及小鼠的 M0/M1/M2 巨噬细胞 CD206 表达情况
Figure 5-1. Expression of CD206 on human monocytes derived and murine bone marrow
derived-M0, M1, M2 macrophages. human monocytes- and murine bone marrow-derived M0, M1,
M2 macrophages were stained with PE-conjugated anti-mouse CD206 for 30 minutes, and subjected
to analysis by flow cytometry.
35
万方数据
第五章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
如图 5-1 所示，人和小鼠三种巨噬细胞的 CD206 的表达情况与其相对应的

RANK 的表达情况一致，M2 型巨噬细胞 CD206 的表达量是最高的，其次是 M0
巨噬细胞，最后是 M1 巨噬细胞。结果提示 CD206 可能和 RANK 一样参与到 M2
型巨噬细胞分化成破骨细胞的过程中。
5.2 CIA 小鼠模型中 M2 巨噬细胞表型分析
将正常小鼠和 CIA 小鼠的骨髓细胞取出并利用 50ng/ml M-CSF 分化 6 天之后

再用 50ng/ml IL-4 极化一天在体外分化成 M2 型巨噬细胞，分化完成后收集细胞，
流式抗体 CD14、CD16.2、CD16/32、CD115、CD265、F4/80、CD206、CD80、
CD86 染色，FACS 检测其表面相关的膜分子表达情况。
图 5-2 CIA 小鼠 M2 巨噬细胞高表达 CD206 和 RANK
Figure 5-2. Phenotype identification of bone marrow derived-M2 macrophages from CIA and
normal mice. Bone marrow-derived M2 macrophages from CIA and normal mice were stained with
anti-mouse CD14-PE, anti-mouse CD16.2-APC, anti-mouse CD16/32-APC, anti-mouse
CD115-APC, anti-mouse CD265-PE, anti-mouse F4/80-APC, anti-mouse CD206-PE, anti-mouse
CD80-PE, anti-mouse CD86-APC for 30 minutes, and subjected to analysis by flow cytometry.
如图 5-2 所示，正常和 CIA 小鼠骨髓来源的 M2 型巨噬细胞分化完成后经过

流式鉴定结果发现，其相关膜表面分子 CD14、CD16.2、CD16/32、CD115、F4/80、
CD80、CD86 在两组细胞中都没有明显的差异，而 CIA 小鼠 M2 巨噬细胞 CD265
（RANK）和 CD206 的表达却高于正常小鼠 M2 细胞。
36
万方数据
此外，我们将这两组 M2 细胞在体外用 M-CSF 和 RANKL 共同培养分化 3，6，

9 天，TRAP 染色检测这两组细胞向破骨细胞分化的能力。
图 5-3 正常和 CIA 小鼠 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的比较
Figure 5-3. M-CSF and RANKL induced CIA mouse bone marrow-derived macrophages
differentiating into osteolasts in time-dependant manner. CIA or normal M2 macrophages were
cultured in 96-well plates with 50ng/ml M-CSF and 100ng/ml RANKL for 3, 6, 9 days, then the
cells were stained for TRAP (A) and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at
如图 5-3 所示，TRAP 染色后并统计其结果显示，正常小鼠和 CIA 小鼠 M2 型

巨噬细胞向破骨细胞分化的时间点关系中，CIA 小鼠 M2 细胞在第 3，6，9 天分化
的破骨细胞数目均比正常 M2 细胞多。
5.3 人外周血单核细胞 CD206+的单核细胞向破骨细胞分化能力强于 CD206-

的单核细胞
上文中对 CIA 小鼠的 CD206+的细胞进行了分析，在实验结果中对照组即不发

病小鼠的 CD206+细胞向破骨细胞分化的能力与 CIA 小鼠是一致的，所以我们也将
健康人外周血收集，利用淋巴细胞分离液将 PBMC 分出来，接着用 CD14 磁珠分
选出其中的 CD14+ 的单核细胞，最后利用流式抗体 anti-human CD14-APC、
anti-human CD68-FITC 和 anti human CD206-PE 流式分选出三种细胞 [28] ：
CD14+CD68-CD206-、CD14+CD68+CD206-、CD14+CD68-CD206+在体外用 M-CSF
和 RANKL 共同培养诱导分化，然后 TRAP 染色在显微镜下观察拍照并统计。
37
万方数据
图 5-4 流式分选人 PBMC 中的 CD206+及 CD206-单核细胞
Figure 5-4. CD14+CD206+ and CD14+CD68+ monocytes from human peripheral blood by
FACS. CD14+CD206+ and CD14+CD68+ monocytes were stained with APC-conjugated anti-human
CD14, FITC-conjugated anti-human CD68 and PE-conjugated anti-human CD206 for 30 minutes,
and subjected to analysis by flow cytometry for reverse detected.
如图 5-4 所示，将健康人外周血单核细胞中 CD14+CD68-CD206-、

CD14+CD68+CD206-、CD14+CD68-CD206+分选出来，流式结果显示在 CD14+的单
核细胞中，CD206+的单核细胞有 3%左右，CD68+的单核细胞有 0.1%左右，比例
相对较低。接着我们将分选出来的这三组细胞在体外培养用 M-CSF 和 RANKL 共
同诱导分化 6 天，TRAP 染色检测这三组细胞向破骨细胞分化的能力。
图 5-5 人 CD206+及 CD206-的单核细胞向破骨细胞分化的比较
Figure 5-5. Comparison of CD68-CD206-, CD68+CD206- and CD68+ CD206+monocytes about

differentiating into osteolasts. CD68-CD206-, CD68+CD206- and CD68-CD206+ monocytes were
cultured with 30ng/ml M-CSF and 50ng/ml RANKL for 6 days, then the cells were stained for
macrophages are shown with histogram (B). The results are expressed as mean±SD performed in
parallel and representative of three experiments with different donors.
如图 5-5 所示，TRAP 染色后并统计其结果显示，在分选出来的三种单核细胞
38
万方数据
中表达 CD206 的单核细胞能够明显分化成破骨细胞，而不表达 CD206 的单核细胞

却几乎不能分化成破骨细胞。
5.4 甘露糖阻断 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
为了进一步确认 CD206 在 M2 细胞向破骨细胞分化过程中的作用，我们利用

受体阻断的方法，在培养体系中先加入 CD206 的配体甘露糖（Mannan, 1mg/ml）
与 M2 巨噬细胞于培养箱中共孵 2h，再加入 M-CSF+RANKL 共同诱导 9 天，以葡
聚糖（Dextran）作为阴性对照。TRAP 染色检测破骨细胞分化的情况。
图 5-6 甘露糖阻断 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化
Figure 5-6. Mannan blocked effects of M-CSF+RANKL on human M2 macrophages

differentiating into osteolasts. Human M2 macrophages were exposed to 30ng/ml M-CSF and
50ng/ml RANKL for 9 days after preincubating with 1mg/ml Mannan , Dextran for 2 hours, then
the cells were stained for TRAP and the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures
are shown. The results are expressed as mean±SD performed in parallel and representative of three
experiments with different donors.
如图 5-6 所示，甘露糖预处理过 M2 巨噬细胞之后再用 M-CSF 和 RANKL 诱

导其向破骨细胞分化，结果发现破骨细胞的分化受到了严重的抑制；反之没有经
过处理的以及经过葡聚糖处理的 M2 型巨噬细胞都可以正常分化成破骨细胞。这一
结果显示 CD206 参与了 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的过程。
5.5 本章小结
本章中，我们分析了 CD206 这一膜型分子在 M2 细胞向破骨细胞分化的过程

中发挥的作用。
首先我们在体外分化的人单核细胞来源和小鼠骨髓细胞来源的 M0、M1 和 M2
型巨噬细胞，并通过流式检测三种细胞 CD206 表达情况，结果发现人和小鼠 M2
39
万方数据
型巨噬细胞其 CD206 的表达高于 M0 及 M1；此外，我们也发现 CIA 小鼠骨髓来

源的 M2 细胞其 CD206 的表达也高于正常小鼠，并且 CIA 小鼠 M2 细胞向破骨细
胞分化的能力也高于正常小鼠 M2 细胞。同时我们将人外周血来源的单核细胞通过
流式分选将 CD206+ 及 CD206- 的单核细胞分选出来并在体外培养，结果也发现
CD206+的单核细胞向破骨细胞分化的能力强于 CD206-的单核细胞。接着我们利用
受体阻断的方法，将 CD206 的配体甘露糖加入到培养体系中，结果发现甘露糖能
够有效地抑制 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化的过程。以上现象提示我们 CD206 确
实在 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞的过程中发挥重要的作用。
40
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第六章
第六章 LTF-IC 诱导 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞
RA 患者体内存在多种自身抗体及免疫复合物（immune complex，IC）,如类风
湿因子、抗核抗体、抗中性粒细胞胞浆抗体等[16]。类风湿因子（RF）及其抗体可
形成免疫复合物沉积于关节滑膜中，在 RA 的发展中发挥重要作用[29]。抗 LTF 抗
体是抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）的一种，既往研究证实在类风湿关节炎（RA）、
系统性红斑狼疮（SLE）等多种自身免疫性疾病患者血清中抗 LTF 抗体含量升高
[15]。LTF 和抗 LTF 抗体特异性结合后，可形成免疫复合物（LTF-IC）。我们实
验室前期结果显示，LTF-IC 在 RA 患者血清中的含量显著高于正常人血清，并且
LTF-IC 能够刺激人单核细胞向破骨细胞分化，以及 LTF-IC 可以通过表面的 CD14
和 CD32a 活化 M2 巨噬细胞，释放大量促炎性细胞因子，以上均提示我们 LTF-IC
可能在 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化起着某种作用。
6.1 乳铁蛋白单抗的制备
为了探究 LTF-IC 对人单核细胞来源的及小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞免疫学

功能及其机制研究，实验室前期，扈晓敏师姐制备了小鼠抗人的乳铁蛋白的单克
隆抗体，并命名为 M860，能够与其抗原 LTF 形成 LTF-IC。大量制备该单抗 M860
用于后续试验，为研究 LTF-IC 对人单核细胞来源的巨噬细胞的免疫学功能奠定了
物质基础。
大量克隆扩增该杂交瘤细胞株 M860，待细胞数扩增至一定数量时，以 5×105
的细胞数目腹腔注射于提前注射降植烷的 Balb/c 小鼠，待 10-15 天左右小鼠腹腔
胀大后，脱颈处死小鼠，打开腹腔，取出腹水，过 Protein G 的亲和层析预装柱，
将单抗从腹水中提取出来。
将纯化的 M860 用 BCA 蛋白检测试剂盒测定其浓度，按照其浓度取 6μg，用
PBS 及 5×loading buffer 制样，同时配制 12%的 SDS-PAGE 蛋白凝胶，跑胶并以预
染彩虹 Marker 为标记，跑胶结束后，取下凝胶，于摇床上考马斯亮蓝室温染色 2
个小时，脱色过夜，观察蛋白凝胶上的条带，鉴定 M860 的纯度。
在酶标板中 37oC 包被 2μg/ml 的 LTF 或无关蛋白（Ovalbumin, OVA）两个小
41
万方数据
第六章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
时，5%脱脂奶封闭，将 M860 由 2μg/ml 往下做倍比稀释，并于 37oC 培养箱中孵

育，加二抗孵育半个小时后，PBST 洗板并用 TMB 显色，读取 OD450nm 处的吸
光度值，鉴定 M860 的效价。
图 6-1 M860 的纯度及效价鉴定
Figure 6-1. The purity and specificity of M860 antibody. Followed by purification,M860 was run
on 12% SDS-PAGE. Lane 1 represented pre-stained protein maker. Lane 2 represented purified
M860 monoclonal antibody (A). The titer of M860 monoclonal antibody was detected using LTF or
OVA-based ELISA, followed by HRP-conjugated goat anti-mouse IgG. The results were expressed
as absorbance at OD450 nm with standard deviation (B).
如图 6-1 所示，我们用 Protein G 亲和层析柱从小鼠腹水中，能够纯化得到大

量高纯度、高效价的抗人 LTF 的单抗 M860，以用于后续实验。
6.2 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色
采集人的外周血单核细胞以及小鼠的骨髓细胞，按照第一章的步骤分化巨噬
细胞，分化完成后人 M2 巨噬细胞以 30μg/ml LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC
刺激分化，以相对应浓度的单独 LTF 及 M860 和人血清白蛋白抗原抗体复合物为
试验对照。分化 6 天后，用 Sigma-aldrich 公司提供的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）
染色试剂盒进行染色，并在显微镜下观察拍照。
42
万方数据
图 6-2 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色
Figure 6-2. LTF-IC induced human monocyte-derived M2 macrophages to differentiate into

osteolasts for TRAP staining. Human M2 macrophages were cultured in the presence of 30μg/ml
LTF, M860, LTF-IC, HAS-IC for 6 days, then cells were stained for TRAP. Human monocytes were
cultured under similar conditions of 30μg/ml LTF-IC as positive control. Representative images are
presented.
如图 6-2 所示，LTF、M860 及另一种复合物 HAS-IC 单独均不能使 M2 巨噬细

胞向破骨细胞分化，而 LTF-IC 可以诱导人单核来源的 M2 巨噬细胞分化成 TRAP
染色阳性的破骨样细胞。
6.3 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色
刺激分化，以相对应浓度的单独 LTF 及 M860 为试验对照。分化 6 天后，用 TRITC
Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽染色破骨细胞高表达的肌动蛋白环，在荧光显微镜
下观察拍照。
43
万方数据
图 6-3 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色

osteolasts for TRITC Phalloidin. Human M2 macrophages were cultured in the presence of
30μg/ml LTF, M860, LTF-IC for 6 days, then cells were stained for TRITC Phalloidin. Human
monocytes were cultured under similar conditions of 30μg/ml LTF-IC as positive control.
Representative images are presented.
如图 6-3 所示，LTF 及 M860 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞并没有的出现明

显的环状结构，而 LTF-IC 诱导人单核来源的 M2 巨噬细胞分化成的破骨样细胞能
形成明显的肌动蛋白环（F actin-ring）结构。阳性对照图出自本实验室曾克勤博士。
6.4 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志分子变化情况
刺激分化 6 天后，收集细胞，GTC 裂解，提取 RNA，逆转 cDNA，用荧光实时定
量 PCR 的方法，检测破骨细胞相关分子的转录情况。
44
万方数据
图 6-4 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志分子变化情况

osteolasts for Q-PCR. Human M2 macrophages were cultured in the presence of 30μg/ml LTF-IC
for 6 days in 24-well plates, then mRNA expression of TRAP (A), MMP-9 (B) and CTSK (C) by
cultured M2 macrophages were determined by QPCR. (normalized to geometric mean of GAPDH
expression).
如图 6-4 所示，LTF-IC 刺激人单核来源的 M2 型巨噬细胞 6 天之后，其中抗

酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织蛋白酶 K
（CathapsinK, CTSK）表达均显著上调。与成熟的破骨细胞表型一致。
6.5 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定
采集人的外周血单核细胞，按照第一章的步骤分化巨噬细胞，分化完成后人
M2 巨噬细胞以 30μg/ml LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC 刺激分化，以相对
应浓度的单独 LTF 及 M860 为试验对照。分别分化 14 天后，将培养板中的细胞用
双蒸水裂解掉并用硝酸银染骨培养板中的骨陷窝，在显微镜下观察拍照。
如图 6-5 所示，LTF 及 M860 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞在骨培养板中并
没有的出现骨的吸收和破坏，而 LTF-IC 诱导人单核来源以及小鼠骨髓细胞来源的
M2 巨噬细胞分化成的细胞在骨培养板中形成由于破骨细胞骨吸收而造成的骨陷
窝，说明 M2 细胞在 LTF-IC 的诱导下分化的破骨样细胞是具有骨的吸收和破坏功
能的，进一步证明在 LTF-IC 的诱导下人单核来源的以及小鼠骨髓细胞来源的 M2
巨噬细胞能够分化成成熟的有功能的破骨细胞。
45
万方数据
图 6-5 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定

osteolasts for the bone resorption analysis. Human M2 macrophages were cultured with 30μg/ml
LTF, M860, LTF-IC in the Corning Bone cell Culture Plate for 14 days, then the plate were stained
with 5% AgNO3. Representative images are presented.
6.6 比较 M0/M1/M2 巨噬细胞在 LTF-IC 作用下向破骨细胞分化的时间与剂量

关系
人的单核细胞在体外分化，其中 M0 用含自体血清培养基分化 6 天，M1 用

M-CSF 分化 6 天再用 IFN-γ 极化一天，M2 用 M-CSF 分化 6 天再用 IL4 极化一天，
4、6 天以及用不同 LTF-IC 浓度（7.5、15、30μg/ml）
分化完成后用 LTF-IC 刺激分化 2、
分化 6 天并进行 TRAP 染色，检测三种巨噬细胞向破骨细胞分化的能力。
图 6-6 LTF-IC 诱导人单核来源的巨噬细胞向破骨细胞分化时间关系
Figure 6-6. LTF-IC induced human monocyte-derived macrophages differentiating into

osteolasts in time-dependant manner. Human M0,M1,M2 macrophages were cultured in 96-well
plates with 30μg/ml LTF-IC for 2, 4, 6 days, then the cells were stained for TRAP (A) and the
46
万方数据
numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at different time points are shown with
histogram (B).
用人的单核细胞在体外分化 M0、M1、M2 三种巨噬细胞，并将这三种细胞用

LTF-IC 共同刺激诱导分化，如图 6-6 所示，这三种细胞向破骨细胞分化的时间关
系中，M2 巨噬细胞在第四天已经开始有大量破骨细胞产生，第六天与第四天产生
破骨细胞数持平，并且其 TRAP 染色阳性的细胞数目远远高于 M0 和 M1 巨噬细胞。
图 6-7 人单核来源的巨噬细胞向破骨细胞分化 LTF-IC 剂量关系
Figure 6-7. LTF-IC induced human monocyte-derived macrophages differentiating into

osteolasts in dose-dependant manner. Human M0, M1, M2 macrophages were cultured in 96-well
plates with 7.5, 15, 30μg/ml LTF-IC for 6 days, then the cells were stained for TRAP (A) and the
numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight from cultures at different time points are shown with
histogram (B).
在剂量关系中，如图 6-7 所示，M2 巨噬细胞在 LTF-IC 浓度在 7.5μg/ml 时就已

经开始形成大量破骨细胞了，其中 LTF-IC 浓度越高，破骨细胞形成的数目越多。
这一结果可以看出，在体外分化的人单核来源的巨噬细胞中 M2 型巨噬细胞在
LTF-IC 刺激下向破骨细胞分化的能力明显高于 M0 和 M1 型巨噬细胞。
6.7 LTF-IC 诱导人 M2 巨噬细胞分化的机制研究
此前的工作我们已经证明了 LTF-IC 能够刺激人单核细胞来源的 M2 型巨噬细

胞并诱导其分化成破骨细胞，但其活化的机制上有待进一步探究。LTF-IC 是由乳
铁蛋白及其抗体共同组成的，文献报道乳铁蛋白能够通过乳铁蛋白的受体发挥对
靶细胞的活化或抑制作用[30, 31]；同时，乳铁蛋白的抗体亦可以通过 FcγRs 活化
47
万方数据
细胞并传导下游信号。以上提示我们可以从乳铁蛋白的受体以及 FcγRs 这两方面

来探讨 LTF-IC 诱导 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞的机制。
据文献报道，CD14 可以作为乳铁蛋白的一个重要受体，活化细胞介导下游信
号转导[31]，LTF-IC 另一个重要组成部分 LTF 的抗体能够与膜表面的 FcγRs 结合，
介导下游信号[18]，前期分化替代活化型巨噬细胞 M2 时，我们可以看到 M2 表面
表达 FcγRs，包括 CD16（FcγRⅢ）、CD32（FcγRⅡ）、CD64（FcγRⅠ），其中 CD32
表达量最高，CD64 表达量最低[21]，而我们实验室前期研究中已经证实了 LTF 的
抗体是通过 CD32 活化细胞介导下游信号转导的。所以根据以上提示，我们分别用
CD14 的阻断性抗体、CD32 的阻断性抗体以及 FcγRs 下游的 syk 的抑制剂 R406
来验证我们假设。
将 2μg/ml CD14 的抗体及等浓度的同型对照 mIgG1、5μg/ml CD32 的抗体及等
浓度的同型对照 mIgG2b、3μM syk 的抑制剂 R406 及其溶剂 DMSO 与 M2 细胞预
孵育两个小时后，再加入 30μg/ml LTF-IC 持续活化三天并进行 TRAP 染色，显微
镜下拍照并统计其破骨细胞生成情况。
如图 6-8 所示，LTF 的受体 CD14 的阻断性抗体对 LTF-IC 诱导 M2 细胞向破
骨细胞分化没有抑制效果，但是 LTF 抗体的受体 CD32 的阻断性抗体及 syk 的抑
制剂均能够有效地阻断 LTF-IC 诱导 M2 细胞分化为破骨细胞，而抗体的同型对照
mIgG2b 和 R406 的溶剂 DMSO 对均无效，提示我们在 LTF-IC 诱导 M2 细胞分化
成破骨细胞的过程中，发挥主要作用受体分子是 CD32，即 FcγRⅡ，且通过其介
导下游信号转导。
48
万方数据
图 6-8 CD14 抗体、CD32 抗体及 R406 对 LTF-IC 活化 M2 细胞的阻断作用
Figure 6-8. Anti-CD14 antibodies, anti-CD32 antibodies and Syk inhibitor R406 blocked effects
of LTF-IC on human M2 macrophages differentiating into osteolasts. Human M2 macrophages
were exposed to 30μg/ml LTF-IC for 3 days after preincubating with 2μg/ml anti-CD14, 5μg/ml
anti-CD32 antibodies and 3μM syk inhibitor for 2 hours, then the cells were stained for TRAP and
the numbers of TRAP+ osteoclasts in each sight are shown with histogram.
6.8 LTF-IC 不能活化 CD32a 转基因小鼠 M2 巨噬细胞
既然 LTF-IC 能够活化人的 M2 型巨噬细胞，进一步考察其对小鼠巨噬细胞功

能的影响。我们实验室前期已经确认 LTF-IC 并不能活化野生型小鼠的巨噬细胞，
其原因是因为野生型小鼠髓系细胞并不表达 CD32a（FcγRⅡa），即 LTF 抗体的细
胞表面受体，所以 LIF-IC 并不能刺激小鼠 M2 型巨噬细胞并激活细胞下游信号。
因此，我们实验室引进了在小鼠髓系细胞上表达人源化 FcγRⅡa 的转基因小鼠
[32]，在此基础上，我们将转基因小鼠的骨髓来源的 M2 型巨噬细胞进行考察分析。
6.8.1 CD32a 转基因小鼠骨髓来源的 M2 巨噬细胞的分化与鉴定
处死对照小鼠和 CD32a 转基因小鼠，无菌条件下取小鼠骨髓，加入 50ng/ml
小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），隔天半量换液，诱导分化 6 天后加 50ng/ml
49
万方数据
小鼠白细胞介素-4（IL-4）继续分化一天，即为 BMDM2。分化完成后，收集细胞
进行流式染色，anti-mouse F4/80-APC 和 anti-mouse CD206-PE 作为 M2 细胞的标
志分子， anti-human CD32-APC 作为鉴定转基因小鼠的分子及 anti-mouse
CD16.2-APC 作为细胞表面分子的对照。
图 6-9 CD32a 转基因小鼠骨髓来源的 M2 巨噬细胞的分化与鉴定
Figure 6-9. Identification of markers on bone marrow derived M2 macrophages from CD32a
transgenic or normal mice. Freshly differentiated bone marrow-derived macrophages from CD32a
transgenic or normal mice were stained with APC-conjugated anti-mouse F4/80, PE-conjugated
anti-mouse CD206, APC-conjugated anti-human CD32 and APC-conjugated anti-mouse CD16.2 for
30 minutes, and subjected to analysis by flow cytometry.
如图 6-9 所示，分化完成的小鼠骨髓细胞来源的 M2 型巨噬细胞经过流式鉴定

其 F4/80 及 CD206 均是高表达，与文献报道一致，提示小鼠骨髓来源的 M2 巨噬
细胞分化成功；同时，我们也鉴定了转基因小鼠中人 CD32 的表达，结果中也看到
转基因小鼠的人 CD32 是高表达的，而对照组小鼠是不表达人 CD32 的，并且其它
细胞表达受体分子如 CD16.2 的表达是没有区别的，提示该转基因小鼠人 CD32 的
表达并没有影响其他细胞表面分子的表达，鉴定后细胞分化没有问题[33]，可用于
后续实验。
6.8.2 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 TRAP 染色

将对照小鼠和 CD32aTg 小鼠骨髓取出在体外分化 BMDM2，然后用以 30μg/ml
50
万方数据
LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC 刺激 M2 细胞 6 天后，用 Sigma-aldrich 公

司提供的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒进行染色，并在显微镜下观察
拍照。
图 6-10 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 TRAP 染色
Figure 6-10. LTF-IC induced bone marrow derived M2 macrophages from CD32a transgenic
or normal mice to differentiate into osteolasts for TRAP staining. Bone marrow-derived M2
macrophages from CD32a transgenic or normal mice were cultured in the presence of 30μg/ml
LTF-IC for 6 days, then cells were stained for TRAP. Representative images are presented.
如图 6-10 所示，LTF-IC 刺激小鼠 M2 细胞 6 天后，经 TRAP 染色发现 CD32a

转基因小鼠 M2 细胞培养体系中出现大量融合变大的细胞，但是其细胞形态和染色
情况与典型的破骨细胞不同，其着色较浅，没有明显的多核现象，并不能确认有
破骨细胞生成；对照组小鼠 M2 细胞经 LTF-IC 刺激并没有明显的变化及破骨细胞
的生成。
6.8.3 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 F actin-ring 染色
LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC 刺激 M2 细胞 6 天后，用 TRITC Phalloidin
罗丹明标记鬼笔环肽染色肌动蛋白环，在荧光显微镜下观察拍照。
51
万方数据
图 6-11 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后 F actin-ring 染色
or normal mice to differentiate into osteolasts for TRITC Phalloidin. Bone marrow-derived M2
macrophages from CD32a transgenic or normal mice were cultured in the presence of 30μg/ml
LTF-IC for 6 days, then cells were stained for TRITC Phalloidin. Representative images are
presented.
如图 6-11 所示，LTF-IC 刺激小鼠 M2 细胞 6 天后，经 TRITC Phalloidin 罗丹

明标记鬼笔环肽染色发现 CD32a 转基因小鼠 M2 细胞培养体系中出现类似于破骨
细胞肌动蛋白环的结构；而对照组小鼠 M2 细胞经 LTF-IC 刺激并没有明显的变化
及破骨细胞的生成；这提示我们 LTF-IC 刺激 CD32a 转基因小鼠 M2 巨噬细胞可以
诱导细胞发生融合现象。
6.8.4 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后破骨细胞相关标志分子
mRNA 水平变化情况
将对照小鼠和 CD32aTg 小鼠骨髓取出在体外分化 BMDM2，分化完成后以
30μg/ml LTF、30μg/ml M860、30μg/ml LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC 刺
激分化 6 天后，收集细胞，GTC 裂解，提取 RNA，逆转 cDNA，用荧光实时定量
PCR 的方法，检测破骨细胞相关分子的转录情况。
52
万方数据
图 6-12 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后标志分子变化情况
or normal mice to differentiate into osteolasts for QPCR. Bone marrow-derived M2 macrophages
from CD32a transgenic or normal mice were cultured in the presence of 30μg/ml LTF, M860,
LTF-IC for 6 days in 24-well plates, then mRNA expression of TRAP (A), MMP-9 (B) and CTSK
(C) by cultured M2 macrophages were determined by QPCR. (normalized to geometric mean of
GAPDH expression).
如图 6-12 所示，LTF-IC 刺激小鼠骨髓细胞来源的 M2 型巨噬细胞 6 天之后，

其中抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、组织蛋白酶
K（CathapsinK, CTSK）的表达情况与对照小鼠以及对照处理组比并没有明显的上
调，反而有点下降，这与成熟的破骨细胞表型相反。
6.8.5 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后骨吸收功能的鉴定
LTF 与 30μg/ml M860 混合形成 LTF-IC 刺激 M2 细胞分别分化 14 天后，将培养板
中的细胞用双蒸水裂解掉并用硝酸银染骨培养板中的骨陷窝，在显微镜下观察拍照。
如图 6-13 所示，LTF-IC 刺激 CD32aTg 小鼠骨髓细胞来源的 M2 型巨噬细胞
14 天之后在骨培养板中并没有形成由于破骨细胞骨吸收而造成的骨陷窝形状，与
对照小鼠处理后的结果相同，进一步证明在 LTF-IC 的诱导下 CD32aTg 小鼠骨髓
细胞来源的 M2 型巨噬细胞不能够分化成破骨细胞。这也提示我们单独具有细胞表
面受体 CD32a 不能诱导小鼠 M2 型巨噬细胞成功的往破骨细胞分化，在这其中是
否还有其他的胞内信号分子参与值得我们进一步探讨。
53
万方数据
图 6-13 LTF-IC 处理 CD32a 转基因小鼠 BMDM2 后骨吸收功能的鉴定
or normal mice to differentiate into osteolasts for the bone resorption analysis.. Bone
marrow-derived M2 macrophages from CD32a transgenic or normal mice were cultured with
30μg/ml LTF-IC in the Corning Bone cell Culture Plate for 14 days, then the plate were stained with
5% AgNO3. Representative images are presented.
6.9 本章小结
通过 Protein G 亲和层析的方法，从小鼠腹水中纯化出乳铁蛋白单抗 M860，

经鉴定具有很高的纯度和抗原识别能力，可用于后续实验。采集人外周血单核细
胞并在体外分化成 M2 巨噬细胞，然后用 LTF-IC 处理诱导该细胞分化，通过 TRAP
染色、F actin-ring 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板染色等方法鉴定其分化完成的
细胞即为成熟的有功能的破骨细胞；接着我们在体外分化了人 M0、M1、M2 细胞，
比较这三种细胞通过 LTF-IC 诱导后向破骨细胞分化的能力，结果发现不管是时间
关系还是剂量关系，M2 细胞通过 LTF-IC 诱导后向破骨细胞分化的能力均强于其
他两组巨噬细胞。此外，我们利用细胞表面受体阻断及 syk 抑制剂实验证明了 LTF
抗体的受体 CD32 的阻断性抗体及 syk 的抑制剂均能够有效地阻断 LTF-IC 诱导 M2
细胞分化为破骨细胞，提示 CD32 及其下游信号分子在此过程中发挥主要作用。
我们将 CD32a 转基因小鼠骨髓来源的 M2 巨噬细胞分化出来并用 LTF-IC 诱导
其分化，结果发现培养体系中存在着融合的多核巨噬细胞，虽然这种细胞 F
54
万方数据
actin-ring 染色呈现阳性，但是 TRAP 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板检测都没有

出现破骨细胞形成时的现象，所以 LTF-IC 不能够诱导 CD32a 转基因小鼠骨髓细胞
来源的 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞，我们推测经过转基因的方法在小鼠体内转
入一个单纯的膜表面分子可能不能完全激活整个破骨细胞形成的信号通路，这一
问题还有待我们继续探讨。
55
万方数据
第七章 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
第七章讨论
RA 患者在疾病发生过程中往往会伴随着不同程度的骨损伤，如关节僵直、变
形等，而破骨细胞在骨的破坏和吸收中起到至关重要的作用。单核细胞、巨噬细
胞、不成熟 DC 及 MDSC 均可以作为祖细胞在 RANK-RANKL 信号通路的作用下
向破骨细胞分化[11]。在正常生理条件下，机体关节滑膜组织中巨噬细胞浸润比例
较低，但在某些自身免疫性疾病如 RA 患者的关节滑膜组织中，大量的巨噬细胞在
关节滑膜组织浸润。有文献报道在 RA 病人关节腔浸润的炎性细胞中，
CD163+CD206+M2 巨噬细胞占很高的比例[8]，该细胞在 RA 中的作用尚不明确，
其是否能够向破骨细胞分化尚未可知。因此进一步考察 M2 巨噬细胞在 RA 中的功
能作用，能够加深我们对 RA 的理解，从而为其诊疗提供新思路。本课题研究 CD206
高表达的 M2 巨噬细胞在 RA 发病过程的免疫学作用，并对其机制进行探究。
7.1 人单核细胞来源以及小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞的分化及鉴定
本课题研究的靶细胞为人单核细胞来源以及小鼠骨髓细胞来源的替代活化型
巨噬细胞，因此完成对其的成功分化并鉴定能够为后续课题的研究提供良好的基础。
在机体内环境改变，细胞因戏分泌情况不同以及疾病发生发展的不同时期，
巨噬细胞可向不同的方向极化，其中包括释放大量促炎性细胞因子的经典活化型
M1 巨噬细胞、释放抑炎性细胞因子的替代活化型 M2 巨噬细胞以及未活化的巨噬
细胞 M0 型巨噬细胞[17]。人单核细胞来源的巨噬细胞分化方案是：用人巨噬细胞
集落刺激因子（M-CSF）分化 6 天后再加入干扰素-γ（IFN-γ）分化 M1 细胞、用
人巨噬细胞集落刺激因子分化 6 天后再加入白细胞介素-4（IL-4）分化 M2 细胞、
用含 5%人自体血清的培养基培养 6 天为 M0，均分化 6 天且隔天半量换液。小鼠
骨髓细胞来源的巨噬细胞分化方案是：用小鼠巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），
隔天半量换液，诱导分化 6 天后即为 BMDM0，加入小鼠干扰素-γ（IFN-γ）、白细
胞介素-4/10（IL-4/IL-10）继续分化一天，即为 BMDM1 及 BMDM2。
对分化完成的人单核细胞来源的巨噬细胞进行膜分子鉴定，如图 2-2 可见在
M1 细胞中，CD14 高表达，CD163 低表达，CD206 不表达；FcγRs 中，CD16、CD32、
56
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究第七章
CD64 均表达，且 CD32 表达量最高。在 M2 细胞中，CD14 高表达，CD163 和 CD206

高表达；FcγRs 中，CD32 表达大于 CD16 大于 CD64；在 M0 细胞中，CD14 高表
达，CD163 低表达，CD206 中表达；FcγRs 中，CD16、CD32、CD64 均表达，且
CD32 表达量最高[18, 34, 35]。同时对三种巨噬细胞进行分泌细胞因子的鉴定，LPS
活化 M0、M1 细胞后，以释放大量促炎性细胞因子 TNF-α 为主，几乎不释放 IL-10；
而活化 M2 细胞，则以释放大量抑炎性细胞因子 IL-10 为主，只释放少量的 TNF-α。
同时也对分化完成的小鼠骨髓细胞来源的巨噬细胞进行其标志性分子的鉴定，据
文献报道，小鼠骨髓来源的 M2 细胞高表达 CD16、CD206、Arginase-Ⅰ。对完成
分化的小鼠骨髓来源的巨噬细胞，提取 RNA，进行荧光实时定量 PCR 检测，考察
其标志膜分子的表达情况。如图 2-5 所示，BMDM2 中 CD16、CD206、Arginase-
Ⅰ表达量明显高于 BMDM0 及 BMDM1，与文献报道一致[25, 26]。以上信息提示
人单核来源的巨噬细胞及小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化成功，可用于后续试验。
7.2 M-CSF+RANKL 诱导体外分化的 M2 巨噬细胞分化成破骨细胞
采集在校大学生志愿者的外周血，分离外周血的单个核细胞 PBMC，通过 CD14

阳选磁珠过柱分选出单核细胞，用 M-CSF、IFN-γ、IL-4 等细胞因子分化成巨噬细
胞。而小鼠的骨髓细胞取出之后，直接用 M-CSF、IFN-γ、IL-4 等细胞因子分化成
巨噬细胞。然后在培养体系中加入 M-CSF+RANKL 共同培养 6-9 天后，通过 TRAP
染色[36]、F-ring 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板染色等方法鉴定其分化完成的细
胞即为成熟的有功能的破骨细胞。即 M-CSF+RANKL 能够诱导人和小鼠的 M2 型
巨噬细胞分化成破骨细胞。
破骨细胞是一种衍生于单核/巨噬细胞系和造血干细胞的一种终末分化的多
核巨细胞，由破骨细胞前体细胞分化而成的破骨细胞对骨的吸收以及维持骨骼的
结构、功能和重构是非常重要的[3]。而破骨细胞前体细胞的大量扩增可能导致过
量的破骨细胞的形成，从而致使骨的破坏。有文献报道，在银屑病关节炎患者中
破骨细胞前体细胞的数量是大大增多的[37]，并且其骨破坏的功能也大大增加[38]。
同样的情况也在胶原诱导的关节炎（CIA）小鼠中被发现，即 CIA 小鼠骨髓中的
破骨细胞前体细胞也显著增加[39]。在 RA 患者中，大量的破骨细胞积累在滑膜组
织，在关节处形成骨陷窝并造成局部骨质破坏。而我们之前的实验现象也提示我
57
万方数据
们 M2 型巨噬细胞可能在此过程中起到破骨细胞前体细胞的作用。
7.3 CD206 高表达的 M2 巨噬细胞表现出更强的向破骨细胞分化能力
我们在体外分化了人和小鼠 M0、M1、M2 细胞，比较这三种细胞向破骨细胞

分化的能力，结果发现不管是比较分化的时间还是比较 RANKL 的剂量关系，M2
型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均强于 M0 及 M1 型巨噬细胞；并且我们又采用
了不同分化方案获得的 M2 巨噬细胞进行破骨细胞诱导分化实验，结果发现 M2 型
巨噬细胞向破骨细胞分化的能力强于其他巨噬细胞这一现象存在普遍性。我们利
用流式检测了人和小鼠 M0、M1 及 M2 型巨噬细胞表面 RANKL 的受体 RANK 以
及甘露糖受体（CD206）的表达量，结果是 M2 型巨噬细胞其 RANK 以及 CD206
的表达都是高于 M0 及 M1 细胞，这一结果提示我们 RANK 及 CD206 可能在此过
程发挥着重要的作用。
众所周知，M2 型巨噬细胞由 M-CSF、IL-4、IL-13、IL-10、糖皮质激素、转
化生长因子-β（TGF-β）、维生素 D3 和前列腺素 E2（PGE2）等诱导分化，且其抗
原提呈能力较低，通过分泌 IL-10、CCL17、CCL18、CCL22 和 TGF-β 等抑制性细
胞因子，下调免疫应答，介导肿瘤的免疫逃逸，在肿瘤的发展、浸润和转移中发
挥重要作用[40-42]。RANK-RANKL 信号通路是经典的破骨细胞分化的途径，在
EMPD（乳腺外佩吉特氏病）病人的病变部位，科学家们发现 60%以上的 RANK+
的细胞是 CD163+CD206+Arginase-I+M2 巨噬细胞[43]，在乳腺癌疾病的发展过程
中，RANKL 也可以与 RANK+的癌细胞结合并转移至骨组织中从而加重疾病进程
[44]；且 RANK-RANKL 信号通路也可以通过刺激 M2 细胞释放细胞因子或趋化因
子在该疾病中发挥作用[11]。因此我们推测 RANK 高表达的 M2 巨噬细胞可能更容
易通过 RANK-RANKL 信号通路向破骨细胞分化，从而参与 RA 过程中的骨的破
坏和吸收，导致骨关节变形及骨质疏松。
有文献报道，细胞表面表达甘露糖类型的低聚糖能够调控细胞-细胞之间的融
合反应，包括精卵细胞融合[45, 46]、成肌细胞融合[47]；并且这种甘露糖残基也出
现在一些病毒感染的过程中，例如在流感病毒感染过程中肥大细胞融合相关的抗
原也与终端甘露糖类型低聚糖相关[48]。而破骨细胞的形成，由单核/巨噬细胞系
和造血干细胞分化而来一种多个核的细胞，这一过程也是经过细胞融合而发生的
58
万方数据
[49]。细胞表面的甘露糖残基是通过与其受体即甘露糖受体（CD206）相结合从而
发挥作用[50]，甘露糖受体是表达在巨噬细胞系的表面其中主要是表达在 M2 型巨
噬细胞表面。在单核细胞以及小鼠骨髓细胞向破骨细胞分化的过程中，其细胞表
面是含有甘露糖残基的。所以我们通过流式分选将人外周血单核细胞中
CD14+CD206+/CD14+CD206- 和 CIA 小鼠骨髓及发病关节中的
F4/80+CD206+/F4/80+CD206-的细胞分选出来并在体外利用 M-CSF+RANKL 共同培
养诱导其分化，结果发现无论是人还是小鼠 CD206+细胞向破骨细胞分化的能力均
强于 CD206-细胞，并且甘露糖能够有效地抑制这一过程，这一结果与我们之前的
设想是一致的。
7.4 LTF-IC 诱导 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞
我们实验室前期结果显示，乳铁蛋白及其抗体结合形成的免疫复合物
（LTF-IC）在 RA 患者血清中显著高于正常人，RA 是一类自身免疫性疾病，患者
体内存在多种抗自身抗体及免疫复合物，其中类风湿因子及其抗体形成的免疫复
合物在 RA 的发生发展中起到重要作用。而乳铁蛋白是中性粒细胞的次级颗粒，抗
乳铁蛋白抗体是中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）的组成成分之一，提示 LTF-IC 在
某些自身免疫性疾病中，可能作用于单核、巨噬等免疫活性细胞，参与免疫应答
并释放炎性细胞因子。除此之外，我们实验室前期结果显示，LTF-IC 能够刺激人
单核细胞向破骨细胞分化，以及 LTF-IC 可以通过表面的 CD14 和 CD32a 活化 M2
巨噬细胞，释放大量促炎性细胞因子[51]，以上均提示我们 LTF-IC 可能在 M2 巨
噬细胞向破骨细胞分化起着某种作用。
采集人外周血单核细胞并在体外分化成 M2 巨噬细胞，然后用 LTF-IC 处理诱
导该细胞分化，通过 TRAP 染色、F-ring 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板染色等
方法鉴定其分化完成的细胞即为成熟的有功能的破骨细胞；接着我们在体外分化
了人 M0、M1、M2 细胞，比较这三种细胞通过 LTF-IC 诱导后向破骨细胞分化的
能力，结果发现不管是时间关系还是剂量关系，M2 细胞通过 LTF-IC 诱导后向破
骨细胞分化的能力均强于其他两组巨噬细胞。
为进一步探讨 LTF-IC 作用于 M2 细胞的机制，我们从组成复合物的两部分入
手，分别考察乳铁蛋白及乳铁蛋白抗体在这一活化过程中发挥的作用。乳铁蛋白
59
万方数据
有很多存在于细胞膜表面的受体，包括蛋白多糖，LRP，核仁蛋白，CD14 等，而
M2 巨噬细胞是一类高表达 CD14 的巨噬细胞，但是 CD14 的阻断性抗体不能够阻
断 LTF-IC 对 M2 细胞的诱导分化；作为乳铁蛋白复合物的另一个组成部分，乳铁
蛋白的抗体，其受体为 CD32a（FcγRIIa）[51]。我们用 CD32 阻断型抗体抑制 LTF-IC
对 M2 细胞的活化，结果显示，CD32 的抗体能够明显阻断 LTF-IC 对 M2 细胞的
诱导分化作用，同时其下游的 Syk 的抑制剂也同样发挥作用，提示我们 LTF-IC 通
过 FcγRII/CD32 及其下游的 Syk 向下传递信号诱导 M2 细胞分化成破骨细胞，提示
CD32 及其下游信号分子在此过程中发挥主要作用。而 LTF-IC 不能够诱导 CD32a
转基因小鼠骨髓细胞来源的 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞可能因为小鼠细胞表
面还具有受体 FcγRIIb，为 FcγRII 中的抑制性的受体[52]，接受 LTF-IC 的刺激可
能激活了其抑制性的信号通路，从而使得小鼠骨髓来源的巨噬细胞对 LTF-IC 不反
应的现象。
7.5 总结
我们的研究发现，用 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化，我们

通过 TRAP 染色、F-ring 染色、Q-PCR 以及骨细胞培养板染色等方法鉴定其分化
完成的细胞即为成熟的有功能的破骨细胞。
我们在体外分化了人和小鼠 M0、M1、M2 细胞，比较这三种细胞通过
M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的能力，结果发现不管是时间关系还是 RANKL
剂量关系，M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均强于其他两组巨噬细胞；并且
我们采用不同方案获得的人和小鼠 M2 巨噬细胞进行破骨细胞诱导分化实验，结果
发现 M2 型巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的能力强于其他巨噬细
胞存在普遍性。由于 M2 型巨噬细胞其 CD206 的表达高于 M0 及 M1，我们通过流
式分选将人外周血中和小鼠骨髓及关节中的 CD206+细胞分选出来并在体外培养，
结果发现无论是人还是小鼠 CD206+细胞通过 M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的
能力均强于 CD206-细胞，这提示我们 CD206 在破骨细胞的分化过程中具有重要的
作用。
用 LTF-IC 处理诱导该细胞分化，通过 TRAP 染色、F-ring 染色、Q-PCR 以及
骨细胞培养板染色等方法鉴定其分化完成的细胞即为成熟的有功能的破骨细胞；
60
万方数据
接着我们在体外分化了人 M0、M1、M2 细胞，比较这三种细胞通过 LTF-IC 诱导

后向破骨细胞分化的能力，结果发现不管是时间关系还是 LTF-IC 剂量关系，M2
细胞通过 LTF-IC 诱导后向破骨细胞分化的能力均强于其他两组巨噬细胞。此外，
我们利用细胞表面受体阻断及 syk 抑制剂实验证明了 LTF 抗体的受体 CD32 的阻
断性抗体及 syk 的抑制剂均能够有效地阻断 LTF-IC 诱导 M2 细胞分化为破骨细胞，
提示 CD32 及其下游信号分子在此过程中发挥主要作用。而 LTF-IC 不能够诱导
CD32a 转基因小鼠骨髓细胞来源的 M2 型巨噬细胞分化成破骨细胞。
总之，本课题发现了 CD206 高表达的 M2 型巨噬细胞可以通过向破骨细胞分
化在 RA 中发挥骨破坏作用，不管是经典途径 M-CSF+RANKL 还是非经典途径
LTF-IC 的作用。这为破骨细胞的形成提供新的信号途径及为临床治疗类风湿关节
炎提供了新的靶点和思路，为 RA 的诊断及治疗起到指导作用。
61
万方数据
文献综述 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
文献综述
类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种以对称性多关节炎为主要

临床表现的异质性、系统性、自身免疫性疾病。主要表现为关节滑膜持续性炎症、
关节软骨及骨的破坏等慢性进行性病变，以及破坏性对称性的关节病变，从主要
的关节症状到关节外多系统受累的表现[53]。类风湿关节炎（RA）患者在疾病发
生过程中往往会伴随着不同程度的骨损伤，如关节僵直、变形等，而破骨细胞在
骨的破坏和吸收中起到至关重要的作用。破骨细胞是一种衍生于单核/巨噬细胞系
和造血干细胞的一种终末分化的多核巨细胞，由破骨细胞前体细胞分化而成的破
骨细胞对骨的吸收以及维持骨骼的结构、功能和重构是非常重要的[3]。而破骨细
胞前体细胞的大量扩增可能导致过量的破骨细胞的形成，从而致使骨的破坏。
巨噬细胞作为机体重要的免疫细胞之一，在免疫应答中发挥着不可忽视的作
用。同时，巨噬细胞具有较强的可塑性和异质性，在体内外不同微环境的影响下，
可分化成具有不同功能的表型即极化，主要包括两大类，即经典活化型巨噬细胞
M1 和替代活化型巨噬细胞 M2[17, 20]。而替代活化型巨噬细胞由 IL-4、IL-10、
TGF-β 等细胞因子极化，分泌大量抑炎性细胞因子，起到免疫调节及组织修复等
功能。M2 细胞作为一类免疫效应细胞，在 RA 的发生发展中也同样扮演着不可或
缺的角色。
乳铁蛋白是有一种 80kDa 的多功能糖蛋白，也是中性粒细胞胞浆颗粒之一，
参与机体免疫调节，在某些病理条件下，其血清浓度会大大提升[14]，可与其抗体
形成免疫复合物，大量循环免疫复合物的沉积是一些自身免疫性疾病的重要致病
因素，提示 LTF-IC 在 RA 中发挥功能。
1 类风湿关节炎及其发病机制
RA 是一种常见的自体免疫疾病，影响类风湿关节炎发病的因素其中有 50%是
由遗传因素引起的，而吸烟是主要的环境影响因素。在工业化国家，每年类风湿
关节炎的患者占比为 0.5-1.0%，约每 10 万例新病例中有 5-50 例[36, 54]。RA 的发
病特点是慢性滑膜关节炎症，包括滑膜增生，炎症细胞浸润，纤维蛋白沉积，关
62
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究文献综述
节损坏等[55]。但是其具体病因及发病机制尚不明确，可能与具有某些特殊遗传背
景的人群，对某些自身抗原具有敏感性，从而引发机体过度免疫应答，导致关节
滑膜组织病理性改变有关。大量文献报道，在 RA 患者的滑膜组织中出现异常增
多的淋巴细胞、细胞因子、自身抗体等，提示这些物质有可能参与 RA 的发生和
发展[29, 56]。
1.1 巨噬细胞与炎性细胞因子在 RA 中的作用
巨噬细胞被认为是滑膜炎性细胞因子的重要来源，炎症风湿性关节炎关节肿
胀反映出滑膜炎症激活，并以白细胞浸润为特征进入滑膜腔，巨噬细胞和滑膜纤
维细胞在滑膜中的激活和随后的细胞因子释放可能是通过模式识别受体发生的
（PRRs），例如 toll 样受体 2（TLR2），TLR3，TLR4 还有 TLR6，它能识别各
种微生物产品，以及内源性配体，包括热休克蛋白和纤连蛋白[57, 58]。滑膜间的
炎症环境是由一个复杂的细胞因子和趋化因子调控的网络组成；临床实验证明在
这些成分中，肿瘤坏死因子（TNF），白细胞介素 6，粒细胞-单核细胞集落刺激
因子对这一过程至关重要[59]，例如 TNF-α 诱导白细胞和内皮细胞活化，滑膜纤维
细胞激活和生存，疼痛受体敏化和血管新生，它们共同代表了类风湿性关节炎的
病理特点；IL-6 是一种单核细胞来源的效应细胞因子，在 CIA 小鼠的诱导过程中
起重要作用[60]。这些细胞因子和趋化因子通过激活内皮细胞和募集免疫细胞进入
滑膜腔来诱导和加重关节炎症。被激活的纤维母细胞，募集的 T 细胞 B 细胞，以
及单核-巨噬细胞最终都会通过由 T 细胞、B 细胞和成纤维细胞表达并分泌的核因
子 κ B 受体活化因子配体（RANKL）和其表达在巨噬细胞、树突状细胞（DC）和
破骨前体细胞表面的受体 RANK 结合从而引发破骨细胞的生成。
1.2 破骨细胞和炎症性骨侵蚀在 RA 中的作用
在 RA 中，关节炎症和骨破坏是紧密相连的[61-63]。正常机体中在骨形成和骨
破坏之间形成了一种平衡关系从而维持骨骼的内稳态，但是在 RA 患者中，由于骨
破坏的增加导致平衡被扰乱。骨的破坏这一过程就是由破骨细胞来发挥功能[64]，
RA 中破骨细胞在滑膜组织和关节骨之间发挥破侵蚀的功能，反过来其它细胞又入
侵到滑膜上，最终导致关节翳的形成[65]。这个过程依赖于破骨前体细胞（OCP）
大量涌入到滑膜组织中，并将这些细胞分化成成熟的破骨细胞。破骨细胞分化的
经典途径是由 M-CSF 和 RANKL 共同作用诱导 OCP 分化成破骨细胞，这两种分子
63
万方数据
缺失任何一种皆不能使破骨细胞完成分化[66]。M-CSF 主要表达在滑膜间充质细
胞，也有少量的 T 细胞表达[67]。肿瘤坏死因子（TNF）可以诱导滑膜间充质细胞
释放 M-CSF，同样的 IL-17 也可以促进 Th1 细胞释放 M-CSF。M-CSF 与其在单核
细胞表面表达的受体 M-CSFR 结合从而诱导破骨细胞的早期分化，M-CSF 与其受
体 M-CSFR 的相互作用对破骨细胞的形成是必不可少的，但是单独的
M-CSF-M-CSFR 并不足以诱导其最后的分化。RANKL 是 TNF 超家族的成员之一，
主要在间质细胞表达，例如滑膜成纤维细胞和活化的滑膜 T 细胞[68]。在关节炎模
型和类风湿滑膜组织中，RANKL 的表达是上调的，并且被认为是破骨细胞分化的
重要先决条件[69, 70]。RANKL 表达受炎症细胞因子的调控，如 TNF，IL-1，IL-6
和 IL-17，但也受到非细胞因子炎性介质的影响，如前列腺素 E2[71, 72]。RANKL
的加入促成了破骨细胞的最终分化并且获得骨吸收活性。骨保护素（ OPG,
TNFRSF11B）是一种在滑膜间质细胞中表达并分泌的可溶性的 RANKL 的受体，
RANKL 与 RANK 的相互作用是受 OPG 调控的[73]。在 RA 中，OPG 与 RANKL
的不平衡表达能够促进 RANKL-诱导的骨损坏过程；在小鼠的体内实验也有证明，
外源的 OPG 表达增加能够显著的抑制关节炎中骨损坏的现象[69]。
炎症环境中的其他细胞因子也在骨破坏的过程发挥作用，TNF 可以通过叠加 R
ANKL[74]释放或者直接与 TNFR 作用进而促进破骨细胞生成，TNF 也可以动员骨
髓中 CD11b+的破骨前体细胞[37, 75]；IL-1β 可以同时调控 RANKL 及 RANK 的表
达；IL-17 诱导滑膜成纤维细胞表达及释放 RANKL、TNF 和 IL-1β 表达进而促进
破骨细胞的形成；Th17 细胞诱导的细胞因子，包括 IL-23，TGF-β 和 IL-6，也可能
通过影响 M-CSF-RANKL 这条途径对破骨细胞形成发挥作用[76]。然而, 由 IL-18
或 IL-12 刺激 Th1 细胞可以诱导 IFN-γ 和 GM-CSF 的表达，两者都有抑制破骨细
胞分化的功能[77, 78]。
2 巨噬细胞极化及替代活化型 M2 细胞的功能
2.1 巨噬细胞极化
巨噬细胞作为机体不可缺少的固有免疫细胞之一，在免疫应答中发挥着重要
的作用，其中包括维持组织内的稳态，清除外来或自身病原体，解决炎症和组织
修复等作用[79, 80]。巨噬细胞具有较强的可塑性和异质性，由血液中在单核细胞
64
万方数据
在某些特定的内环境下，受体内外不同微环境的影响，发生形态及功能的变化，
即分化成具有不同功能的表型，又称为极化，主要包括两大类，根据 Th1/Th2 细
胞的命名法，分为经典活化型 M1 巨噬细胞和替代活化型 M2 巨噬细胞[7]。
经典活化型 M1 巨噬细胞由 IFN-γ 及 LPS 等极化产生，高表达 MHC-Ⅱ和 CD86
并能够释放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23 等促炎性细胞因子以及 CCL15、
CCL20、CXCL8-11 和 CXCL13 等趋化因子，促进 Th1 细胞分化，发挥细胞毒及
组织损伤功能。总的来说，M1 细胞在病毒及微生物感染时，通过释放炎性细胞因
子、免疫激活因子及趋化因子，通过急性促炎反应、免疫活化反应以及细胞吞噬
功能，有效清除肿瘤和入侵病原体；同时还作为抗原提呈细胞（antigen presenting
cells, APCs），促进适应性免疫应答的发生[5, 6, 17]。
替代活化型 M2 巨噬细胞由抑制性细胞因子极化产生，是一类抑制性细胞，分
泌 IL-10、TGF-β 等抑炎性细胞因子、免疫抑制因子及多种促肿瘤生长的细胞因子，
促进 Th2 细胞分化，发挥免疫调节及组织修复功能，以高表达 IL-4 受体（IL-4R）、
清道夫受体（Scavenger receptors, SR, CD163）、甘露糖受体（Mannose receptors, MR,
CD206）、Fizz1、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）为特点，同时抗原提
成能力较弱。Mantovani 等提出进一步对 M2 细胞分类的定义：由 IL-4 或 IL-13 诱
导产生的巨噬细胞称为 M2a，主要介导 Th2 型免疫反应、变态反应；免疫复合物、
Toll 样受体（toll like receptors, TLRs）的配体等诱导产生 M2b，主要参与 Th2 型 T
细胞活化，并执行免疫调节功能；由 IL-10 和糖皮质激素诱导分化为 M2c，主要抑
制免疫反应的发生，在基质沉淀和组织重塑中发挥作用[40, 81]。在炎症、肿瘤等
病理情况下，M2 细胞起到抑制炎症反应、促进血管新生及重塑、促进肿瘤生长与
转移等。M2 细胞还可表现为特异性代谢途径的改变，如精氨酸代谢向生成鸟氨酸
为主，而不是瓜氨酸及一氧化氮等。值得一提的是，M2 细胞可以通过下调 M1 细
胞介导的免疫功能控制炎症反应的发生[41, 82-84]。
65
万方数据
图1 人单核细胞来源的巨噬细胞极化[85]
Fig. 1. Human macrophages polarization. Polarizing cytokines, surface markers, secreted

factors and physiologic functions.
2.2 M2 细胞与疾病的关系
在整个生命周期中，巨噬细胞可以通过分泌对基质重塑、感染、免疫调节和
炎症至关重要的细胞因子和酶来适应环境信号并影响周围环境[10]。在生理情况
下，M1/M2 细胞处于平衡的状态，调节机体免疫应答有条不紊的进行[42]。巨噬
细胞极化的过程中，影响分化的关键因子为巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF。
Martinez 等人通过对人单核细胞分化为巨噬细胞的转录谱分析发现，M-CSF 对巨
噬细胞的分化与转录水平的关键性变化密切相关，而 IL-4 的持续刺激对于基因水
平的改变甚小，但使其表型特征如 CD163、CD206 等表达上调[19]。当 M1/M2 细
胞数目失衡时，即可导致病理改变，M1 细胞数目显著增多，可引起慢性炎症性疾
病，而 M2 细胞数目增多，则会导致严重的免疫抑制发生。
2.2.1 M2 细胞与感染性疾病
当机体受到某些微生物包括分枝杆菌、李斯特菌、利什曼、锥虫和弓形虫等
病原体感染时，主要引起 Th1 或 Th17 介导的免疫反应，M1 细胞通过 Toll 样受体
66
万方数据
和干扰素协同作用诱导 NO 以及 iNOS 的释放，进而清除胞内感染的病原体[86]；

相比之下，当机体受到线虫和三聚体虫，如甲状圆线虫、弓虫、裂体虫等病原体
感染时，则需要由 IL-4 或 ILl-13 触发 Th2 型免疫反应来清除病原体，并诱导 M2
细胞发挥主要作用[83, 87, 88]。在感染或受伤后，病情从急性到慢性的发展通常
从 Th1 主导的 M1 细胞免疫反应转移到 Th2 主导的 M2 细胞免疫反应作为适应性
免疫反应的过程，这种 M1 到 M2 的比例变化转变也可能发生在炎症部位。我们观
察到从 Th1、M1 细胞主导免疫反应到 Th2、M2 细胞主导的免疫反应的一些病原
体感染包括麻疹病毒，HIV，CVB3，曼氏血吸虫，疟原虫夏布迪和克鲁氏病毒感
染，因此，从 M1 到 M2 细胞免疫反应的转变可能是感染或组织损伤后的共同特征，
这对解决炎症和伤口愈合很重要[86, 89]。
2.2.2 M2 细胞与自身免疫病
自身免疫性疾病是仅次于心脏性疾病及肿瘤的第三类高发疾病，其中女性高
发，约占患者总数的 80%[90]。在自身免疫性疾病的急性炎症期，除了抗原特异性
的 T 细胞、B 细胞诱导的应答外，巨噬细胞及中性粒细胞也在炎性浸润中发挥重
要作用[91, 92]。
当机体组织受到损伤，M2 型巨噬细胞可以通过自身受体如甘露糖受体、清道
夫受体等有效地清除损伤的自体组织。因此，M2 可能通过呈递自身抗原给 T 细胞
从而加重自身免疫病的病程。M2 也可能通过释放 IL-1β、TGF-β、纤维连接蛋白（F
ibronectin）、基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases, MMP）等促纤维化因子
从而加剧免疫复合物（IC）调控的纤维化过程，这是女性高发自身免疫性疾病的
一个标志[10]。同样也有研究发现，在急性病毒性或自身免疫性心肌炎中，M2 细
胞的比例占浸润的总细胞的 30%到 70%，且 M2 在机体内的比例变化与免疫复合
物的沉积、纤维化和慢性自身免疫病理有关[93]。有研究表明，雌激素除了能够刺
激 B 细胞诱导抗体产生外，还能够通过增加 IL-4、IL-10 和 TGF-β 等细胞因子，
促进纤维化的发生，抑制 Th1 反应，促进巨噬细胞向 M2 细胞极化[94]。因此，由
于雌激素能够促进 Th2 介导的免疫反应从而使女性患 M2 介导的自体免疫疾病的
风险升高。
RA 的发病率女性高于男性（3:1）。近年来的文献中有报道，在 RA 病人关节
腔浸润的炎性细胞中，CD163+CD206+Arginase-I+M2 巨噬细胞占很高的比例[8]，
67
万方数据
并且 RA 病人滑膜组织中，80%以上的 CD14+CD163+双阳性的 M2 细胞能够释放促

炎性细胞因子 TNF-α，扮演者促炎的角色[9]。
2.2.3 M2 细胞与肿瘤
巨噬细胞参与肿瘤的发生发展，巨噬细胞不同极化类型对肿瘤产生的作用不
同。M1 巨噬细胞通过多种途径杀伤肿瘤细胞，而 M2 巨噬细胞却参与了肿瘤的发
生、生长、侵袭和转移的过程，常常表现为促进肿瘤细胞生长、肿瘤血管生成以
及肿瘤细胞迁移等作用[95]。单核细胞在 CCL2 等趋化因子的作用下，在肿瘤局部
微环境中聚集，分化而成的巨噬细胞称之为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated
macrophages, TAMs），TAM 是一种具有 M2 表型的巨噬细胞，它能够分泌趋化因
子，形成正相关，持续大量募集巨噬细胞至肿瘤局部并分化成 TAM，参与肿瘤发
展[96]。
近年来的研究中，乳腺癌、前列腺癌、EMPD（乳腺外佩吉特氏病）等肿瘤疾
病在发生发展中都会伴随着有骨转移的现象。前列腺癌骨转移通常是成骨细胞或
成骨细胞与破骨细胞混合的病变而造成，在前列腺癌症模型中已经有实验证明
TAM 与其早期的转移级联效应相关，并且可能参与主要作用。此外，在 pc-3 小鼠
肿瘤生长的模型中进行骨骼研究显示，癌细胞释放出的 IL-6 能够募集巨噬细胞到
肿瘤部位并且促进肿瘤侵袭，而巨噬细胞或 IL-6 的减少可以降低骨病变的发生、
骨溶解的程度以及淋巴结转移的发生率[97]。在 EMPD 病人的病变部位，科学家
们发现 60%以上的 RANK+的细胞是 CD163+CD206+Arginase-I+M2 巨噬细胞[43]，
且 RANK/RANKL 信号通路也可以通过刺激 M2 细胞释放细胞因子 IL-1β、IL-8 或
趋化因子 CCL5、CCL17 在疾病中发挥作用。细胞因子 IL-8 能够作用于肿瘤细胞
和肿瘤间质成纤维细胞从而促进小鼠的乳腺癌肿瘤的生长；IL-1β 能够通过
IL-1β/β-连环蛋白信号通路对乳腺癌的发病进程产生影响；而趋化因子 CCL17 则可
以通过招募 Treg 细胞在该疾病中发挥作用[11]。
3 免疫复合物的形成及致病
3.1 免疫复合物的形成
游离抗原与相应抗体结合形成的复合物称为免疫复合物（immune complex,
IC），或称为抗原抗体复合物。抗原的持续存在是形成 IC 的先决条件，在一般情
68
万方数据
况下，抗原刺激机体产生抗体，形成的免疫复合物后可被单核-巨噬系统清除；但
当抗原大量且持续存在时，可导致 IC 不断形成并沉积于血管壁，可导致组织损伤
[98]。在机体持续感染时，微生物持续或间歇性繁殖，血流中可出现大量抗原，为
IC 的形成提供了条件[99]。
形成 IC 的分子大小受抗原、抗体比例影响，可由此导致不同的后果：当抗原
量过剩时，形成小分子可溶性复合物不易沉积，一般通过肾小球过滤而被清除；
抗原、抗体比例适当时，形成大分子不溶性复合物，其类似于颗粒抗原，易被吞
噬细胞清除；抗原稍过剩时，形成中等大小的可溶性 IC，其不易被吞噬，可持续
存留于血流中，在适当条件下，如血管壁通透性增加时，可随血流沉积于某些部
位如毛细血管壁或嵌积于肾小球基膜上，进而激活补体的经典活化途径。
抗原抗体的性质，是决定所形成 IC 分子大小的重要因素。抗原分子表面抗原
表位的数目越多，越易形成不溶性的 IC，单价或双价抗原则形成可溶性的 IC，而
多价抗原可结合多个抗体分子，形成较大的不溶性的 IC。可溶性抗原与相应沉淀
性抗体（IgG 和 IgM）结合为 IC 时，抗体分子量越大，所形成的 IC 也越大。IgM
五聚体的分子量和结合价均 5 倍于 IgG，故由其与抗原结合而成的 IC 较由 IgG 形
成的大。
同时抗原与抗体结合的亲和力，对免疫复合物的形成也至关重要。抗体与抗原
高亲和力结合，易形成体积大而稳定的复合物；抗原与抗体低亲和力或中等亲和
力结合，易形成分子量较小的可溶性复合物，可长期循环与血流中，易沉积于毛
细血管壁，引起免疫复合物病（immune complex disease, ICD）[100]。
3.2 免疫复合物的致病
免疫复合物的沉积是导致组织损伤的始动因素，也是其主要致病机制。复合
物的数量及性质亦影响其沉积。进入局部的抗原量较多，与体内相应抗体在局部
形成较大量的 IC，以致不易被清除；沉淀性 IC 多存在于进入的局部组织（如 Arthus
反应所见等）；循环 IC 多沉积于肾小球、关节滑膜、心肌等处的血管壁。此外，
某些自身抗原与特定组织或器官具有较高的亲和力。如系统性红斑狼疮 SLE 患者
中，IC 通常沉积于肾脏[100, 101]，而类风湿性关节炎 RA 患者，关节是 IC 的主要
沉积部位[102]。
沉积于局部不能被及时清除的 IC，可诱导诱导Ⅲ型超敏反应，激活补体，并
69
万方数据
在血小板、中性粒细胞及其他细胞的参与下，引发一系列连锁反应而致组织损伤，
诱发类风湿性关节炎等免疫复合物病 ICD。IC 通过激活补体，产生过敏毒素，诱
导肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放组胺和趋化因子（如 C3a、C5a 等），促进血小板
释放血管活性胺类，趋化中性粒细胞，释放碱性蛋白并聚集于 IC 周围，进而沉积
于内皮细胞之间，或穿过内皮细胞间隙而沉积于集基底膜；同时沉积的 IC 能够促
使巨噬细胞将溶酶体释放出细胞外，从而引起血管壁、基底膜病变；内皮基底膜
的暴露，可使血小板凝聚，形成血栓，从而导致局部组织缺血、淤血和出血[103]。
3.3 免疫复合物与 RA
在类风湿性关节炎患者体内，病原微生物持续性感染，或感染过程中，中性
粒细胞吞噬细菌后释放溶酶体酶，使得自身 IgG 分子结构发生改变，并刺激机体
产生抗变性 IgG 的以 IgM 为主的抗体，即为类风湿因子 RF，进而反复产生的自身
抗体与变性 IgG 形成免疫复合物，大量免疫复合物沉积于关节滑膜，诱导Ⅲ型超
敏反应的发生是类风湿关节炎 RA 不可忽视的重要病因之一[104]。
70
万方数据
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万方数据
英文缩略词 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
英文缩略词
英文缩写英文全称中文名称
TRAP Tartrate resistant acid phosphatase 抗酒石酸酸性磷酸酶

Anti-neutrophil cytoplasmic
ANCA 抗中性粒细胞胞浆抗体
antibodies
BMDM Bone marrow derived macrophages 骨髓来源的巨噬细胞
cDNA Complementary DNA 互补 DNA

Receptor Activator for Nuclear
RANK 核因子 κB 受体活化因子
Factor-κ B
Receptor Activator for Nuclear 核因子 κB 受体活化因子
RANKL
Factor-κ B Ligand 配体
ELISA Enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验
CTSK Cathapsin K 组织蛋白酶 K
MMP-9 Matrix Metalloproteinases 基质金属蛋白酶 9
Factin-ring Filament actin ring 肌动蛋白环
FITC Fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素

Macrophage colony-stimulating
M-CSF 巨噬细胞集落刺激因子
factor
Granulocyte-macrophage colony 巨噬细胞 /粒细胞集落刺
GM-CSF
stimulating factor 激因子
TAM Tumor associated macrophage 肿瘤相关巨噬细胞
CIA Collagen-induced arthritis 胶原诱导的关节炎
IC Immune complex 免疫复合物
IL Interleukin 白介素
OPG osteoprotegerin 骨保护素
kDa Kilodolton 千道尔顿
80
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究英文缩略词
LTF Lactoferrin 乳铁蛋白
EMPD Extramammary Paget’s disease 乳腺外佩吉特氏病
M1 Classical activated macrophages 经典活化型巨噬细胞
M2 Alternative activated macrophages 替代活化型巨噬细胞
MR Mannose receptor 甘露糖受体
OD Optical density 吸光度
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBMC Peripheral blood mononuclear cell 外周血单个核细胞
PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
PE Phycoerythrin 藻红蛋白
RA Rheumatoid Arthritis 类风湿性关节炎
RNA Ribonucleic acid 核糖核酸
SDS Sodium dodecyl sulfate 十二烷基硫酸钠
OCP osteoclasts precursor 破骨细胞前体细胞
SR Scavenger receptor 清道夫受体
TGF Transforming growth factor 转化生长因子
TLR Toll-like receptor Toll 样受体
TMB Tetramethylbenzidine 四甲基联苯胺
IFN Interferon 干扰素

TNF
Tumor necrosis factor 肿瘤坏死因子
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万方数据
个人简历 M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究
个人简历
基本信息
姓名：台立性别：女
籍贯：安徽六安名族：汉
出生年月：1993-12 邮箱：taili0902@163.com
教育背景
2015.09~2018.06 苏州大学生物医学研究院免疫学理学硕士

2011.09~2015.06 安徽师范大学生命科学学院生物科学理学学士
科研成果
1. Chenhui Gao*,Hongliang Dong*,Li Tai*,Xiaoming Gao. Lactoferrin-Containing

Immunocomplexes Drive the Conversion of Human Macrophages from M2 into M1-like Phenotype.
Frontiers in Immunology.2017. (*co-first author)
82
万方数据
M2 巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究致谢
致谢
三年时光飞逝，不觉中，我才突然意识到自己快毕业了，一路走来，有很多
的感想要付诸笔端，首先，衷心地感谢我的导师高晓明教授对我的指导。高老师
严谨的治学态度，对科研敏锐的洞察力及强大的知识储备，为我们树立了优秀的
榜样。感谢高老师对于我研究课题的思路提点，感谢每一次组会上高老师的批评
指正，感谢高老师对我学位论文的耐心评阅。高老师对我的谆谆教诲将一生受用。
感谢董红亮老师亲力亲为的指导和帮助，为我课题的顺利开展排疑解惑；感
谢王俊老师，龚方苑老师，洪超老师在课题进展中给出的意见和建议；感谢马淑
燕老师，王洪民老师提供的实验技术上的支持。
感谢已毕业的钟桥师兄，扈晓敏师姐，高晨慧师姐，马子涵师姐，李雅师姐，
周哲师兄，冯静师姐，陈鸽师姐，感谢曾克勤师兄，花盛浩师兄，董潇师姐以及
龚政，缪杰，朱璨，李洁，金荣，程忠艳，杨玥尧，陈铭，潘晓华，秦潇源在生
活上及实验中的关心和帮助。大家因为共同的梦想聚在一起，在这个和睦的大家
庭中，一起面对挫折，一起走过困境，共同进步，共同成长。
最后，感谢我的家人对我的理解和支持。
83
万方数据

M2巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究

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M2巨噬细胞分化为破骨细胞的机制研究

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学校代码：10285

平显著升高，且能够通过单核细胞表面的 CD32a 诱导其分化成破骨细胞。在本课

关键词：替代活化型巨噬细胞 M2，破骨细胞，甘露糖受体 CD206

A study on the mechanisms of M2 macrophages

Key words: alternatively activated macrophages, osteoclast, mannose receptor

Written by: Li Tai

大约为 80kDa 的铁离子结合糖蛋白，主要存在于乳汁中，但并非乳汁中特有。在

PeproTech 公司。牛的二型胶原（CollagenII）购自 Chondrex 公司，完全弗氏佐剂

Target mRNA Forward primer（5’-3’） Reverse primer （5’-3’）

中（含 2mM EDTA，0.5%FBS 的 PBS）；每 1×107 PBMC 加入 CD14 磁珠 20μl，4oC

1.2.10 TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽染色

4℃过夜；取出湿盒，室温放置 30min；PBS 洗 3 次，每次 5min；滴加一定浓度的

2mg/ml 往下做 8 个稀释度，即标准品浓度依次为 2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、

Figure 2-2. Phenotype identification of human monocyte-derived macrophages. Human

M1 细胞中，CD14 高表达，CD163 低表达，CD206 不表达；FcγRs 中，CD16、CD32、

Figure 2-3. Cytokines produced by human monocyte-derived M0、M1 and M2 macrophages.

细胞介素-4/10（IL-4/IL-10）体外诱导分化 BMDM0、BMDM1 和 BMDM2，并进

Figure 2-5. Phenotype identification of bone marrow derived macrophages. Freshly

采集人的外周血单个核细胞（PBMC），并通过 CD14 阳选磁珠纯化出单核细

第三章 M-CSF+RANKL 诱导 M2 细胞分化成破骨细

近年来的文献中有报道，在 RA 病人关节腔浸润的炎性细胞中，M2 巨噬细胞

3.1 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 TRAP 染色

图 3-1 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 细胞分化成破骨细胞 TRAP 染色

如图 3-1 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均不能使 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化，

3.2 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色

图 3-2 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后 F actin-ring 染色

Figure 3-2. F actin-ring staining for osteolasts differentiation induced by M-CSF+RANKL on

如图 3-2 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞并没有的出

3.3 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后破骨细胞相关标志分子

图 3-3 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化破骨细胞相关标志分子转

如图 3-3 所示，M-CSF 和 RANKL 刺激人 M2 巨噬细胞 3、6、9 天之后，检测

3.4 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 巨噬细胞分化后骨吸收功能的鉴定

在骨细胞培养板中培养人和小鼠的 M2 巨噬细胞，人 M2 巨噬细胞以 30ng/ml

图 3-4 M-CSF+RANKL 诱导人和小鼠 M2 细胞分化后骨吸收功能的鉴定

如图 3-4 所示，M-CSF 及 RANKL 单独均刺激分化的 M2 巨噬细胞在骨培养板

破坏功能的，进一步证明在 M-CSF+RANKL 的诱导下人单核来源的以及小鼠骨髓

3.5 M0/M1/M2 巨噬细胞 RANK 的表达

图 3-5 体外分化人及小鼠的 M0/M1/M2 巨噬细胞 RANK 表达

如图 3-5 所示，人单核细胞来源的三种巨噬细胞分化完成后做 Q-PCR 检测，

3.6 比较 M0/M2 巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL 向破骨细胞分化的时间与剂量

人单核细胞来源的和小鼠骨髓细胞来源的 M2 巨噬细胞通过 M-CSF+RANKL

细胞中，虽然存在一定数量的 M2 型巨噬细胞，但是同样也存在有 M0、M1 型巨

Figure 3-6. M-CSF and RANKL induced human monocyte-derived macrophages to

用人的单核细胞在体外分化 M0、M2 巨噬细胞，

图 3-7 人单核来源的巨噬细胞向破骨细胞分化 RANKL 剂量关系

Figure 3-7. M-CSF and RANKL induced human monocyte-derived macrophages to

在剂量关系中，如图 3-7 所示，M2 巨噬细胞在 RANKL 浓度在 12.5 ng/ml 时就

在剂量关系中，如图 3-9 所示，BMDM2 在 RANKL 浓度为 30 ng/ml 时就已经

图 3-9 小鼠骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化的 RANKL 剂量关系

3.7 不同分化方案获得的 M2 型巨噬细胞向破骨细胞分化的能力均高于其他巨

上文中提到的体外分化的 M2 细胞，均是由 M-CSF 连续分化 6 天，再加 IL-4

对不同方案极化的人 M2 细胞进行破骨细胞诱导分化实验，如图 3-10 所示，

和 RANKL 共同刺激下向破骨细胞分化的能力与 IL-4 极化的 M2 型巨噬细胞一致，

如图 3-11 所示，利用 IL-10 及肿瘤细胞培养上清极化的小鼠骨髓细胞来源的

鼠 M0、M2 细胞向破骨细胞分化的能力，我们在体外分化了人和小鼠 M0、M2 细

第四章 CIA 模型小鼠中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化

前一章的实验结果显示，M-CSF 和 RANKL 能够在体外诱导不同方案极化的

4.1 CIA 小鼠模型建立及发病关节中 CD206+M2 巨噬细胞浸润比例

利用二型胶原蛋白免疫 DBA/1 小鼠建造胶原诱导的关节炎（CIA）模型，6-8

图 4-1 CIA 小鼠模型建立及发病关节中 CD206+M2 巨噬细胞浸润比例

如图 4-1 所示，DBA/1 小鼠经过二型胶原免疫 6-8 周之后，前肢发生变红肿胀，

图 4-2 CIA 小鼠骨髓和关节滑膜中 M2 巨噬细胞浸润比例

如图 4-2 所示，首先我们将正常小鼠和 CIA 小鼠处死后取出其骨髓及发病关

4.2 CIA 小鼠骨髓中 M2 巨噬细胞向破骨细胞分化