中華科技大學

生物科技系健康科技碩士在職專班
碩士學位論文

分離自咖啡豆酵母菌族群的分子鑑定
Molecular Identification of Yeast Populations
Isolated from Coffee Beans

研究生：洪政崴

指導教授：張晉峰博士

中華民國 105 年 7 月 7 日
 誌謝

研究生的生活即將告一個段落，首先我要感謝我的指導教授-張晉峰博士，

在就讀研究所的這段期間，老師對學生的幫忙、包容、教誨，使我受益良多，由

此我由衷深達感激。另外感謝天賜爾生物科技公司陳智宏博士與陳煜沛博士對本

論文的校閱與指導。還有鍾院長竺均、郭主任鐘達、黃老師秀如、胡老師寶元及

吳老師碧玉等對我諸多照顧跟指導，深深感謝。

在研究期間，感謝祥欽、昌宏、哲偉、逸泓、志和、莎莎姐等人的照顧與協

助，謝謝你們的包容和體諒，有你們的歡笑添加了生活許多的樂趣，有你們的陪

伴真的很快樂，要感謝的人太多了，所以我在此，祝福大家在未來身體健康、事

事順心。

最後，我要感謝最親愛的爸爸、媽媽、弟弟及妹妹，謝謝你們一直以來的照

顧與辛苦，謝謝你們對我無怨無悔付出，給予關愛，尤其是我最愛的老婆曉婷總

在背後給我支持與鼓勵，讓我無後顧之憂，你們是我最重要的精神支柱，謝謝你

們。
 Abstract

The present study was aimed at the isolation and identification of indigenous

yeasts isolated from Arabica coffee beans from two production site at Hualien and

Nantou in Taiwan. A total of 48 strains were isolated. Isolated yeast strains were

grouping by PCR fingerprinting with the primer (GTG) 5 and identified by sequence

analysis of the D1/D2 domain of the 26S rRNA gene. Isolated yeast strains contain 4

genera and 7 species, both of Nantou and Hualien isolates contain 4 genera and 5

species. Hanseniaspora uvarum were the most frequent isolates (41.7%), followed by

Candida quercitrusa 、 Saturnispora silvae 、 C. natalensis 、 Pichia kluyveri 、

Saturnispora sp. and P. fermentans. S. silvae and Saturnispora sp. only isolated from

Nantou samples, P. kluyveri and P. fermentans only isolated from Hualien samples.

These yeast strains have a great potential for use as starter cultures in wet processing

of coffee and may possibly help to control and standardize the fermentation process

and produce coffee beverages with novel and desirable flavor profiles.

Keyword: Yeast, Coffee beans, isolation, molecular identification

i
 摘要

本論文主要目的是由位於台灣花蓮與南投兩處生產咖啡農場中的阿拉比卡

咖啡豆進行分離與鑑定原生酵母菌種。採取的樣品總共分離出 48 株酵母菌菌

株。分離的菌株利用引子(GTG) 5 進行 PCR 指紋圖譜的菌株分群與 26S rRNA

D1/D2 基因序列的分子鑑定。所有分離株包括 4 個屬 7 種菌種，其中南投與花

蓮的樣品都分別分離出 3 個屬 5 個種。Hanseniaspora uvarum 是分離頻率最高的

酵 母 菌 種 (41.7%) ， 再 依 序 是 Candida quercitrusa 、 Saturnispora silvae 、 C.

natalensis、Pichia kluyveri、Saturnispora sp. 與 P. fermentans.菌種。Saturnispora

silvae 與 Saturnispora sp. 僅 在 南 投 的 樣 品 中 被 分 離 出 ， P. kluyveri 與 P.

fermentans 僅在花蓮的樣品被分離出。這些菌株皆具有潛力被應用在咖啡豆濕式

處理的過程作為發酵菌母，在發酵過程控制與標準化咖啡豆的發酵，使咖啡產生

新穎與合意的風味。

關鍵詞：酵母菌、咖啡豆、分離、分子鑑定

ii
 目錄

Abstract ..............................................................................................................................i 

摘要 ....................................................................................................................................ii 

目錄 ...................................................................................................................................iii 

表目錄 ...............................................................................................................................vi 

圖目錄 ..............................................................................................................................vii 

第一章 前言 .....................................................................................................................1 

第一節 研究背景 .....................................................................................................1 

第二節 研究動機 .....................................................................................................2 

第三節 研究目的與內容 ........................................................................................2 

第二章 文獻回顧 .............................................................................................................3 

第一節 咖啡簡介 .....................................................................................................3

壹、咖啡種原 ..................................................................................................3 

貳、台灣咖啡豆種類 ......................................................................................5 

參、咖啡生長環境 ...........................................................................................5

肆、台灣咖啡栽種區域 ..................................................................................7 

第二節 咖啡製程 .....................................................................................................8

壹、咖啡處理步驟 ..........................................................................................8 

貳、咖啡處理方式 ........................................................................................10 

參、台灣咖啡處理現況.................................................................................15

第三節 影響咖啡風味因子 ..................................................................................15

壹、咖啡風味定義 ........................................................................................15 

貳、影響咖啡風味因子 ................................................................................16 

iii
 第四節 咖啡發酵風味影響 ..................................................................................15

壹、發酵之影響 ............................................................................................18 

貳、酵母菌之影響 ........................................................................................19 

第五節 酵母菌簡介 ..............................................................................................20 

壹、酵母菌定義 ............................................................................................20 

貳、酵母菌分佈 ............................................................................................20 

參、酵母菌分類 .............................................................................................21

第六節 酵母菌分子鑑定 ......................................................................................22 

壹、聚合酶鏈鎖反應 ....................................................................................22 

貳、隨機擴增多型性 DNA...........................................................................23  

參、限制性片段長度多態性.........................................................................23

肆、DNA 序列分析法 ..................................................................................23 

伍、核糖體 DNA 序列 ..................................................................................23

陸、變性梯度凝膠電泳 ................................................................................24 

第七節 前人研究 ...................................................................................................24

壹、國內相關研究 ........................................................................................24 

貳、國外相關研究 ........................................................................................27 

第三章 材料與方法........................................................................................................29

第一節 實驗器材....................................................................................................29

第二節 酵母菌分離培養基...................................................................................30

第三節 酵母菌的分離純化與保存 .....................................................................31 

第四節 酵母菌的分子鑑定 ..................................................................................32

壹、DNA 的萃取 ...........................................................................................32 

貳、隨機擴增多型性連鎖反應之 DNA 指紋分析法...................................32 

參、PCR 增幅 LSU rDNA D1/D2 區域 .....................................................33

肆、PCR 產物的定序與序列分析...............................................................33

iv
 第五節 實驗架構 ...................................................................................................34 

第四章 結果與討論 .......................................................................................................35 

第一節 酵母菌的分離與鑑定 ..............................................................................35

壹、酵母菌的分離與純化 ............................................................................35 

貳、RAPD 分群結果 ....................................................................................35 

參、酵母菌的分子鑑定.................................................................................35

第二節 酵母菌族群組成的分析 ..........................................................................39

壹、分離頻率 ................................................................................................39 

貳、地區、方法與培養基分離株分析 .......................................................40 

第五章 結果與建議 .......................................................................................................46 

第六章 參考文獻 ...........................................................................................................47

第七章 附錄 ...................................................................................................................52

v
 表目錄

表 1. 2015 年世界前十大咖啡生產國家產量及豆種....................................................4

表 2. 三大咖啡原種栽種特性分析.................................................................................6

表 3. 2015 年台灣主要咖啡產區種植面積與收穫面積統計 .......................................8

表 4. 咖啡處理方式優劣分析 .......................................................................................14

表 5. 台灣咖啡研究主題概況分析...............................................................................24

表 6. 咖啡豆酵母菌分離株的菌株代號、基因資料庫比對鑑定結果 ....................41

表 7. 花蓮與南投咖啡豆樣品中所分離的酵母菌菌株數及頻率.............................42

表 8. 不同採樣地點、不同分離方法與不同培養基條件下酵母菌菌株分離結果43

vi
 圖目錄

圖 1. 咖啡製程步驟....................................................................................................10

圖 2. 酵母菌分離株 RAPD-PCR 分群電泳圖.........................................................45

圖 3. 酵母菌分離株 NRA1(左)及 NRA2(右)平板型態...........................................52

圖 4. 酵母菌分離株 NRA3(左)及 NRA4(右)平板型態...........................................52

圖 5. 酵母菌分離株 NRA5(左)及 NRA7(右)平板型態...........................................53

圖 6. 酵母菌分離株 NRA8 平板型態.......................................................................53

圖 7. 酵母菌分離株 NRD1(左)及 NRD2(右)平板型態...........................................54

圖 8. 酵母菌分離株 NRD3(左)及 NRD4(右)平板型態...........................................54

圖 9. 酵母菌分離株 NDA2(右)平板型態 .................................................................55

圖 10. 酵母菌分離株 NDA5(左)平板型態 ...............................................................55

vii
 第一章 前言

第一節 研究背景
「黑金」咖啡僅次於石油為全球第二大貿易產品，另與茶葉、可可並稱為世

界三大飲料，而論產量、產值與消費量，咖啡高居其冠。根據國際咖啡組織

(International Coffee Organization)統計資料顯示，2015 年全世界的咖啡產量約為

868 萬公噸，在台灣，一年咖啡市場產值可高達 700 億元。臺灣星巴克預估每人

一年平均喝掉 100 杯(2015)，與 2010 年（平均每人約 78 杯）飲量比較，已大幅

成長 28％。另依財政部資料顯示，2014 年個人經營咖啡店及連鎖咖啡店已突破

2000 多家，突顯出咖啡產業目前在台灣蓬勃發展中。台灣咖啡從過去迄今，在

世界賽事中均曾有榮獲肯定，並獲得佳績之紀錄，如惠蓀林場 1936 年所產咖啡

即曾獲美國「農產品世界品嚐會」銀牌獎殊榮；2011 年南投魚池水晶咖啡豆獲

得世界風壼咖啡大賽亞軍，「咖啡教母」娥娜‧努森亦稱讚其香氣特別帶有巧克

力風味，媲美牙買加頂級藍山咖啡。另自 2013 年 6 月至 2015 年 12 月，已有 48

支台灣咖啡豆獲得美國咖啡品質協會（Coffee Quality Institute）的「精品級認證」

（Q Certificate），顯示台灣咖啡豆在風味品質上應有在世界佔有一席之潛力。

目前台灣咖啡栽植者為了確保咖啡品質，並定位台灣咖啡為精品咖啡及結合

在地文化及觀光產業，已從栽種、後製、烘培及銷售等所有流程作一連貫作業。

但咖啡是一種勞力密集的作物，從行政院農業委員會農糧署統計資料顯示，近年

台灣雖已盛行栽種咖啡，種植面積呈現大幅增加趨勢，惟生產成本極高，遠比國

外昂貴，且種植面積規模亦無法與國外相比，產量供應遠不及市場需求，主要仍

依賴國外進口，無法與進口咖啡價格競爭。另台灣咖啡後製技術尚不足，常給人

帶有土味或木質味，厚實度薄，甚至鹹澀口感之風味印象(韓懷宗，2015)。因此，

台灣咖啡仍面臨價格昂貴、總產量少、後製技術及品質管控待提升等問題，所以

1
如何改良咖啡製程，做出市場區隔，展現台灣咖啡特有風味，應是未來台灣咖啡

產業可以努力方向之一。

第二節 研究動機
美國遺傳學家 Aimée Dudley 等人在探討酵母菌多樣性的過程中，發現中南

美洲、非洲和亞洲資料較欠缺，而這些國家都有出產咖啡，且咖啡製作過程會以

發酵方式處理。於是他們開始廣為收集咖啡豆，培養其酵母菌及萃取 DNA，並

進行基因體定序，進而比較酵母菌多樣性。雖然該研究並未針對不同菌種的酵母

菌是否與咖啡風味有關，但過去研究發現葡萄釀酒的過程中，酵母菌來源和葡萄

酒的風味有關，而咖啡酵母菌的多樣性比釀酒酵母還高，故推論酵母菌對於咖啡

風味應有重要影響(Catherine 等，2016)。過去台灣針對海洋、河川、土壤、葉表

及大型真菌子實體酵母菌多樣性調查研究中，已突顯在台灣酵母菌的多樣性，深

值我們深入去探討。但目前台灣對於咖啡酵母菌研究並不多，在咖啡先天種植環

境不可抗拒的因素下，本研究進行咖啡豆酵母菌多樣性的研究，為後續探討對咖

啡風味的影響建立生物資源庫。

第三節 研究目的與內容
本研究是分析台灣咖啡豆酵母菌的多樣性，探討咖啡豆上酵母菌分布的情

形。實驗是挑選台灣南投與花蓮農場種植的咖啡豆，利用培養的方式純化出酵母

菌菌株，利用 RAPD 分子分型法將菌株分群後，以聚合酶鏈鎖反應放大 26S rRNA

D1/D2 domain 的序列進行定序後，進行酵母菌的分子鑑定，並分析菌株出現的

頻率。未來可透過酵母菌多樣性的研究，建立生物資源庫，並應用於咖啡發酵製

程中，創造咖啡新風味，產生原創和獨特風味咖啡，為未來咖啡發酵及新風味研

究者提供參考，進而給予台灣咖啡產業發展一個不同之方向。

2
 第二章 文獻回顧

第一節 咖啡簡介
壹、咖啡種原

咖啡一詞最初源於阿拉伯語 Qahwah，意思是植物飲料，後來傳到土耳其變

成 Kahve，再演變成今日英文 Coffee。咖啡為常綠灌木，植物學分類屬龍膽目

(Gentianales)，茜草科(Rubiaceae)，咖啡屬（Coffea），學名 Coffea spp.，屬於熱

帶經濟作物，具有速生、高產、價高之特點。

野生咖啡一般可長到 5 至 10 公尺，莊園咖啡則為了增加結果量、方便採收

及栽植管理，在播種後 2、3 年，高度大多修剪 1.5 至 2 公尺(田口護，2011)。咖

啡葉子呈現各種不同濃度的深淺綠色；咖啡花是白色，成簇群，有著類似西班牙

茉莉花濃郁清香，花期約為 2-3 天，花謝後幾個月開始結果。一般咖啡播種 4 年

後即開始結果，第 5 年後的 20 年內均為採收期。同一棵樹上果實的成熟期不同，

未熟豆、成熟豆及過熟豆會同時一起出現，初期為深綠色，慢慢轉變成黃色，成

熟果實則像櫻桃般鮮紅，所以咖啡又稱咖啡櫻桃(Coffee Cherry) ，如過熟則轉變

成深紅色至黑色。果實由外而內，依序為外皮、果肉、果膠層、內果皮(亦稱羊

皮)、銀皮及種子所形成。其中種子位於果實中心部分，因形狀像豆子，所以被

稱為咖啡豆，也就是咖啡原料所指的生豆。一般果實內有 2 個成對種子（又稱平

豆、雙瓣豆、母豆），但也有果實內只有 1 個種子（又稱圓豆、單瓣豆、公豆）。

咖啡適合生長在熱帶或亞熱帶，在美洲、非洲、亞洲地區均有種植，因其主

要沿著以赤道為中心，南北迴歸線之間生長，此區又稱為咖啡帶或咖啡區（Coffee

Belt or Coffee Zone），而台灣位處其中，並自年起開始有栽種咖啡紀錄。以產量

而論，非洲大部分面積雖皆位於咖啡帶內，因氣候環境特性非全適合種植咖啡，

所以並非產量最多之地區。而目前全世界產量以中南美洲 56%最高、亞洲佔 32%

3
次之，非洲只占 12%。現今咖啡生產交易國約有 60 多國，依美國農業部 2015

年統計資料，以巴西生產最多，其次分別為越南及哥倫比亞。

現今咖啡栽種種分為原種系統、突變系統及若干雜交種，約有 70 幾種，僅

有約 10 餘種具有商業價值(張淑芬等，2006)。目前最主要栽種樹種有 Arabica

coffee 阿拉比卡種咖啡（又稱阿拉伯咖啡、小果咖啡、小粒咖啡）、Robust coffee

羅布斯塔種咖啡 (又稱剛果咖啡、中果咖啡、中粒咖啡）及 Liberia coffee 賴比瑞

亞種咖啡 (又稱利比亞咖啡、大果咖啡、大粒咖啡)等三大原種，其中阿拉比卡

種咖啡佔世界總產量最多，其次則為羅布斯塔種咖啡，賴比瑞亞種咖啡僅有在利

比亞、象牙海岸等西非生產國家及少數北歐地區消費，其他國家甚少流通交易。

根據國際咖啡組織(International Coffee Organization)統計，2015 年全球咖啡產量

約 868 萬公噸(14,475,2000 袋，60KG)，其中阿拉比卡種咖啡占了 59%，羅布斯

塔種咖啡占了 41%，世界咖啡前十大生產國家產量及豆種如表 1，依其品種、產

地及品牌不同會有各自不同的風味特性。

表 1. 2015 年世界前十大咖啡生產國家產量及豆種

排名 國家 產量(萬公噸) 豆種別

1 巴西 254.928 阿拉比卡種為主

2 越南 165.000 羅布斯塔種為主

3 哥倫比亞 163.758 阿拉比卡種為主

4 印尼 73.902 羅布斯塔種為主

5 衣索比亞 38.400 阿拉比卡種為主

6 印度 34.998 羅布斯塔種為主

7 宏都拉斯 34.500 阿拉比卡種為主

8 烏干達 28.530 羅布斯塔種為主

4
 9 墨西哥 23.400 阿拉比卡種為主

10 瓜地馬拉 20.400 阿拉比卡種為主

資料來源：ICO 統計及本研究整理

貳、台灣咖啡豆種類

1918 年台灣殖產局園藝試驗場嘉義分場（今農業試驗所嘉義分所前身）成

立，進行試驗種植，試種結果顯示阿拉比卡種咖啡為最適合台灣氣候環境栽種(張

淑芬等，2011)。目前台灣地區三大原種咖啡均有種植，但栽種目的不盡相同，

其中商業豆以阿拉比卡種咖啡為主。

參、咖啡生長環境

一、地形與海拔高度

一般咖啡生長地區在赤道至南北迴歸線之間的熱帶、副熱帶地區，即咖

啡帶(Coffee Belt)。在中美洲、歐洲國家普遍認為高海拔地區所產咖啡較低

海拔品質佳且價格高，主因在高海拔氣溫低、日夜溫差大及易起晨霧，可緩

和熱帶地區特有強烈日照，讓咖啡果實有時間充分發育成熟。牙買加藍山咖

啡、夏威夷可娜咖啡等精品咖啡則在適合氣候與土壤條件下，在低海拔地區

仍可栽種(田口護，2004)，所以海拔高度雖然重要，但並非高品質絕對標準。

二、氣候

咖啡生長會受氣溫影響，且易受到霜害，種植區域以熱帶地區為宜，咖

啡在生長期喜溫暖，成熟與收穫期則宜較乾燥天氣。一般咖啡栽種適合在

16°C-28°C 之間的溫度，如在 30°C 以上的高溫栽種，會造成光合作用降低

及對樹葉傷害，且易造成果實提早成熟，較易感染銹病；如在較低溫的環境

栽種，則咖啡生長遲緩，導致較矮小，產量也變少。另咖啡栽培適合的年降

雨量在 1500-2500 毫米間，但是降雨量不足、過多或長久乾旱對咖啡產量均

有影響(張等，2011)。

5
 三、土壤

栽種咖啡土壤以有足夠溼氣且富含有機質肥沃火山岩最適宜，此土壤因

富含腐植質，排水性好，可耕性較佳(堀口俊英，2013)。如衣索比亞高原即

佈滿火成岩風化土，另巴西高原、中美高地、非洲高原、西印度群島等主要

咖啡產區均擁有水份充足的肥沃土壤，其中部分土壤也是火成岩風化土(田

口護，2004)。另以品種而論，阿拉比卡種咖啡最適宜於火山岩土壤，羅布

斯塔種咖啡適合生長於含豐富腐植質的土壤，賴比瑞亞種咖啡則適應力極

強，對土壤沃度要求並不高(如表 2)。在乾燥地區栽種咖啡，除灌溉水須充

足外，土壤應具有良好保水性，平坦地區必須注意排水。咖啡栽培的最佳土

壤為微偏酸，pH 值介於 5.2-6.2 之間，但在過度偏酸的土壤栽培易罹患病

害，如咖啡褐根病。

四、日照

一般咖啡栽培對日照的要求並不高，且不耐熱，如接受大量日照，會使

葉片溫度上升，導致咖啡樹光合作用效率降低。因此，以阿拉比卡種咖啡為

例，因其對日照耐受性較低，故旁邊須種植遮陰樹，以減少陽光直射；另如

哥斯大黎加或部分巴西地區因午後較多雲，所以不需要遮陰樹(堀口俊英，

2013)。目前有雜交培育出能耐受強日照咖啡品種，但品質較沒有比利用遮

蔭方式栽培咖啡好(張等，2011)。

表 2. 三大咖啡原種栽種特性分析

阿拉比卡種咖啡 羅布斯塔種咖啡 賴比瑞亞種咖啡

適合 1000-2000 公尺 適合 1000 公尺以下 適合 200 公尺以下平

地形與海拔
高海拔坡地種植。 坡地或平地種植。 地種植。

6
 喜溫和白天及較涼夜
晚，不耐高溫、低溫，耐高溫、耐寒、耐濕、耐高溫、低溫、耐濕、
氣候與日照
不耐濕、不耐多雨或 耐旱，耐多雨、少雨。耐多雨、少雨。
少雨。

適合富含有機質肥沃 適 合 有 機 質 肥 沃 壤
對土壤肥力要求較
土壤 火山灰地質土，其次 土 ， 需 要 較 多 腐 質
少，適應力強。
為片麻岩、砂岩等。 土。

資料來源：咖啡栽培管理(張淑芬等，2011)

肆、台灣咖啡栽種區域

台灣位於咖啡帶區內，氣候屬亞熱帶氣候，由中部的台中到南部屏東區域為

台灣主要咖啡栽種地區。但過去在缺乏政府的推動及補助，台灣咖啡產業並不發

達，甚至在 1982 年台灣農業年報顯示，已無咖啡種植資料。直到在 1999 年的

921 大地震後，台灣中部災區遭受大規模土石流破壞。經過深入研究後，才發現

檳榔樹是土石流禍首。政府與民間部分人士為了兼顧農民的生計及結合地區觀光

發展事業重建，開始鼓勵災區的農民改為種植水土保持能力較檳榔樹強，且具經

濟價值的咖啡樹，才使台灣咖啡產業近年開始蓬勃發展(張等，2011)。

近幾年台灣從北由新北市淡水及南至屏東縣恆春都有咖啡種植，在台中市、

南投縣、彰化縣、雲林縣、嘉義縣、台南市、高雄市、屏東縣、台東縣、花蓮縣

都有栽培。依行政院農業委員會農糧署統計，全國咖啡栽培面積自 2005 年 254.3

公頃，收穫面積 171.6 公頃，逐年快速攀升至 2015 年栽培面積已達到 976.1 公

頃，收穫面積 959.67 公頃，而種植區域主要分布在屏東縣、台東縣、南投縣、

嘉義縣及花蓮縣等縣市為主(如表 3)。種植面積以屏東縣最多，其次是台東縣及

南投縣，而產區分布於屏東縣泰武鄉、三地門鄉，台東縣達仁鄉、太麻里鄉，南

投縣國姓鄉、仁愛鄉，嘉義縣中埔鄉、阿里山鄉，台南市東山區及雲林縣古坑鄉

等地區。

7
表 3. 2015 年台灣主要咖啡產區種植面積與收穫面積統計

種植面積 收穫面積
排名 縣市名
(公頃) (公頃)

1 屏東縣 217.99 216.42

2 台東縣 173.44 172.69

3 南投縣 131.27 129.47

4 嘉義縣 124.25 124.25

5 花蓮縣 68.72 63.91

6 高雄市 57.96 57.96

7 台南市 54.56 54.56

8 雲林縣 51.17 51.17

資料來源：行政院農業委員會農糧署統計

第二節 咖啡製程
壹、咖啡處理步驟

一、採收

由於咖啡果實成熟速度不同，在一棵咖啡樹上同時會有黃、綠、紅 3

種顏色果實，混雜著成熟豆和未熟豆，只有成熟豆會呈現出飽滿如櫻桃

般紅潤色澤，此時果膠層糖分已大部分滲入果實中，會大幅增添甜度、

果香度；如果是未熟豆，則會含大量綠原酸及高濃度檸檬酸，使咖啡果

8
實添增酸澀口感。現今各國一般採收方式可分成整枝手工採收、精緻手

工採收、機械式採收等 3 種。

二、水選

利用比重原理淘汰不良之咖啡果實，亦即所謂「水選」咖啡果實。

新鮮咖啡果實採收後，必須在外果皮發酵前立刻處理，先將咖啡果實置

入大型水槽，若有浮於水面的果實，即為不良或發育不完全之瑕疵豆或

未熟豆，必須汰除。

三、去皮：將水選後咖啡果實置入咖啡去皮機內，將外皮與果肉去除。

四、乾燥

可將咖啡豆鋪於空地上進行日曬，亦可將咖啡豆用機械以低溫方式

進行烘乾等 2 種方式，但通常以天然日曬會比機械烘乾更能保持咖啡豆

風味。

五、脫殼

日照曬乾完成後，將帶有內果皮硬殼咖啡豆放入脫殼機中脫殼，將

咖啡豆內果皮與銀皮去除。

六、烘焙

咖啡豆烘焙時，因碳水化合物受熱分解後產生二氧化碳，咖啡豆細

胞增大，造成咖啡豆外型體積膨脹，會比生豆大三分之一；不同深度的

烘焙，決定了咖啡豆不同風味，咖啡豆烘焙程度大致可分為淺焙、中焙

與深焙等 3 種。

七、儲存

目前咖啡豆包裝有使用單向閥門鎖袋，充氣包裝、真空鋁罐等均要

排出氣體，以保存咖啡豆新鮮度。

9
 採收

水選

去皮

乾燥

脫殼

烘培

儲存

圖 1. 咖啡製程步驟

貳、咖啡處理方式

咖啡處理方式依產區地理環境、氣候因素、成本考量等而有所不同，目前

有日曬法、水洗法、巴西式半日曬法、半水洗法、體內發酵法及蜜處理等方式。

一、日曬法(Natural Process)

是最古老的處理法，較缺水或極乾燥且地勢平坦的咖啡豆產國如巴

西、衣索比亞、葉門、印尼等會採用此種較為傳統處理方式(田口護，

2004)。這方法是先將咖啡果實倒進大水槽水選, 挑選沉入水底的成熟飽

滿果實後，即在露天日曬場以陽光進行曝曬，為避免乾燥不平均或發酵，

須適時攪拌。日曬時間則視果實成熟度而定，如成熟度越高則僅需數日，

10
未成熟者一般則要 2 到 4 周時間日曬，再以去殼機去掉乾硬的果肉和內

果皮，取出咖啡豆。

日曬法不需水洗設備，製程簡單，成本花費相對最低，雨量少國家

最愛此法，但因受制於天候好壞，影響咖啡豆品質落差甚大。此法最怕

遇雨或乾燥不完全致使微生物附著於咖啡豆上，造成損壞；如過度乾燥

則導致產量降低，為避免上述情形，須嚴格控制日曬天數。另日曬豆豆

體易因去殼機的去殼過程而造成缺角，且顏色偏黃，外觀賣相較差。但

優質的日曬豆在乾燥過程會吸取果糖精華，果香濃郁，具有深厚醇度，

優於半水洗或水洗豆，惟日曬豆的酸味稍低(韓，2014)。

二、水洗法(Washed Process)

水洗法始於 18 世紀中期荷蘭開創的技術，也是目前最盛行的精品咖

啡豆處理方式，如哥倫比亞、瓜地馬拉等中南美洲地區(除巴西以外)多使

用此種方式。處理過程是先從水槽水選篩除品質不佳的浮豆，再將沉入

槽底的紅果子和快熟的青果子，在去除果肉後，再移入水槽進行最重要

的水洗發酵處理，除去內果皮上的果膠層。此一透明黏稠物不易用水沖

除，需以水槽內各種微生物進行水解，此時槽內會自然產生蘋果酸、檸

檬酸、醋酸、乳酸和丙酸。將果膠分解成果膠酸，加速果膠層脫離內果

皮。一般發酵時間視溫度和溼度而定，約需 16 至 36 小時(韓，2015)。

水洗處理的發酵過程可增加豆子的醋酸濃度，有益咖啡風味。這些

酸性物不但可抑制霉菌孳生，部份酸香也會滲進豆裡，但必須隨時檢視

內果皮上的黏稠果膠層是否除淨，再決定是否停止發酵。一旦超過 36 至

72 小時，就可能會發酵過度，產生過多脂肪酸和酪酸而發出惡臭，而且

咖啡豆如滲進過多酸性物，亦會使咖啡過於酸澀，淪為劣質豆。

水洗豆色澤美觀，均一整齊，賣相佳，且較日曬法多一次挑選步驟，

瑕疵豆較少，因此具有較高品質，交易價格亦較日曬豆高。水洗豆酸香

11
味和明亮感較佳，風味純淨，無雜味。但其處理設備成本較高，且要使

用大量清水，產區附近須有水源，另處理步驟多，較耗工耗時，生產成

本相對提高。再者，如因發酵槽清理不完全，溫、溼度變化過大，造成

微生物發生變化等管理不善情形，則會導致咖啡豆在發酵過程中沾附上

發酵味，且因水洗豆外觀較一致，不易挑除瑕疵豆，因而影響咖啡品質。

三、巴西式半日曬法(Pulp Nature)

巴西過去慣用日曬法，但品質無法妥善管控，致好壞落差大。為了

提升品質，於 90 年代開始進行咖啡品質改革，將日曬法改良成巴西式半

日曬法。這種方法是果實採收後，即移入大水槽剔除浮豆，篩出沉豆，

再以果肉篩除機，刨掉果肉，取出沾滿果膠的豆莢。但不再依水洗法後

續程序處理，即不移入水槽發酵，而改為日曬，再翻動豆莢，使裡外均

勻乾燥，以免受潮發臭，約 2-3 天日曬後，豆莢即可達到一定程度的脫水

度。接著再以機械進一步乾燥及儲存熟成，以求品質穩定。

巴西式半日曬與日曬法最大的不同在於不讓咖啡豆留在果肉裡發

酵，而改以人工控管乾燥，降低失控變數，以提升咖啡豆品質。此法最

大優點是咖啡豆上的果膠糖份可滲進豆裡，具有優質日曬豆的甜感與醇

厚度，卻降低了日曬豆易感染霉菌、發酵過度有雜味的缺點。但半日曬

豆的果酸味低於水洗豆，酸味亦明顯偏低。另巴西半日曬法並非所有咖

啡產國均可適用，氣候乾燥是此法最重要的先決條件，而少有具巴西半

日曬的優越環境，溼氣較重地區經日曬後仍不易脫水，反而易滋生霉菌，

影響咖啡品質(韓，2014)。

四、半水洗法(Semi-Washed Process)

水洗法耗水量極大，故水資源有限地區開始發展出半水洗法，此洗

亦可稱為簡化式水洗處理法，近年使用此法的國家很多，包括中南美洲

溼度較高產區與亞洲的印尼、緬甸、寮國等缺水或水洗技術尚不成熟地

12
區。此法製程為先將咖啡果實經果肉刨除機取出豆莢，但不需日曬，亦

不需倒入水槽發酵，而直接放入機械一次處理去除果肉、內果皮及果膠

層處理而成。

半水洗法可大幅減少用水量，縮短處理時間，具有益環保及高效率

優點，且只需設置果肉刨除機和果膠刮除機，即可獨力運作，成本相對

降低。採用此處理法的咖啡，風味較接近水洗豆，但醇度稍弱，酸味比

水洗豆低，但較日曬豆高；甜味則較比日曬豆低 (田口護，2004)。

五、體內發酵法(麝香貓咖啡，Civet Coffee)

這種處理方法是利用動物消化道的乳酸菌與消化液，來除去果肉及

果層膠，因豆子無法消化，所以最後隨動物消化道排出後，再撿拾清洗

出的體內發酵豆。依處理方式還可分天然產地及人工豢養等 2 種，最主

要產地在印尼地區，其他如菲律賓、巴西、印度、泰國等地也有生產。

目前有運用此方式之動物，有包括麝香貓(印尼、菲律賓)、鳳冠雉(巴西)、

猴子(印度)和大象(泰國)等(韓，2014)，其中以麝香貓咖啡豆最為知名，

並有「世上最昂貴咖啡」之稱。而在歐美國家，因印尼麝香貓咖啡豆年

產量不到 500 公斤，因產量非常少，物稀價高，所以特別昂貴，每公斤

至少可以賣到 800 美元（約新台幣 2 萬 4000 元）。

麝香貓咖啡因發酵過程特殊，風味較一般咖啡獨特，但品嘗後反應

偏二極化，偏好者認為口感較濃稠香醇，不喜者則認為咖啡豆經動物發

酵後造成酸度降低，口感偏平淡，較無味。另此類豆因處理過程特殊，

尚有衛生觀感不佳，而在體內消化時可能將好菌壞菌都跑入咖啡豆裡，

造成疾病傳染之疑慮。

六、蜜處理法(Honey Process)

傳統的水洗法用清水處理，但因為中美洲的哥斯達黎加(2003)地理環

境水資源有限，且國內施行嚴格環保政策，無法使用水洗法，所以改良

13
 巴西式半日曬法成蜜處理法，即咖啡豆帶著果膠層進行日曬乾燥的製

法，目前中南美洲地區開始流行這種新興處理法。這種方法是先水選成

熟果實，並去掉果肉後，將帶著黏稠狀果膠層豆子以日曬方式乾燥處理。

根據保留果膠的比例不同與乾燥方式而分為黃蜜(保留 25%果膠，直接曝

曬，日曬時間較短)、紅蜜(保留 50%果膠，部分遮蔽曝曬)、黑蜜(保留 100%

果膠，須覆蓋曝曬，日曬時間最長)等方式。

此方法優點在於能妥善保存咖啡豆原始甜美風味，較日曬豆更甘

甜，且醇度深厚、香氣豐富。這種方法可仔細挑選成熟豆，但處理過程

工法講究且耗時，曝曬時間須嚴格掌握。如曝曬時間過短，無法得其蜜

處理優點，展現特有風味；如曝曬時間過長，發酵易滋生黴害，產生不

良的發酵味，影響咖啡品質。

表 4. 咖啡處理方式優劣分析錯誤! 連結無效。資料來源：本研究整理

參、台灣咖啡處理現況

目前台灣咖啡豆處理計有日曬法、水洗法、蜜處理法等方式，其中台灣南投

國姓鄉業者以蜜處理法的咖啡豆，2015 年參加美國 CQI 精品咖啡評鑑拿下 86.08

的高分，獲得好評。而台灣過去也有體外發酵(或菌種發酵)處理之案例，如雲林

古坑咖啡果農將咖啡去果皮後，再加入 3 種益生菌發酵脫膠處理，該咖啡豆於

2014 年參加行政院農業委員會農糧署國產咖啡評鑑，奪得冠軍(韓，2015)。另台

東咖啡農民則與工業技術研究院學者研究改良出果子狸咖啡，這是從果子狸排洩

物中提煉 4 種益生菌，再加入咖啡豆採體外發酵，除能增加咖啡產能外，也創造

出獨特風味。而屏東科技大學則由印尼麝香貓咖啡豆，以生物科技方法，從中分

析出 1000 多株微生物菌種，再篩選 136 種，經過逐一配對，最後分離出 16 種菌

14
株與麝香貓腸胃道的發酵環境相同，並進行麝香貓消化系統模擬，進而研發出兼

具牛奶、肉桂等多重香氣的咖啡。

第三節 影響咖啡風味因子
壹、咖啡風味定義

一、稠度(Body)

稠度是感受咖啡入口時重量、質量上對於舌頭的觸覺印象，感受可

區分清淡如水般的淡薄，中度如濃湯的稠實及深度如糖漿般的超高濃脂

狀。

二、酸度(Acidity)

酸度係指一種分佈在舌頭後側的味覺，較檸檬等酸感更為清新、明

亮與爽朗，通常產自高海拔之阿拉比卡種咖啡豆具有這種特性，而低海

拔之羅布斯塔種咖啡豆並沒有此特性。

三、苦味(Bitter)

通常羅布斯塔種咖啡比阿拉比卡種咖啡苦，另深烘培因焦糖化及碳

化程度較淺烘培重，苦味較高，或因咖啡因高，萃取時間越久，也會形

成若味。

四、甘度(Sweet)

甘度是指味道均勻回甘、無瑕疵、具完美協調的口感，一般形容優

質咖啡才能散發出來的風味。

五、香氣(Aroma)

指沖調完成的咖啡所發出的味道，用來形容氣味包括有焦糖味、水

果味、花味、濃郁、香辛等。

六、濃烈(Strong)

15
 指深烘焙下咖啡豆強烈的風味，但並非指含有大量咖啡因的咖啡。

七、辛烈(Tangy)

形容咖啡帶有較濃烈的酸味，介於水果酸與發酵成水果酒中間味道。

八、鹹味(Briny)

該風味通常指因加熱過度或是咖啡豆本身礦物質含量太過豐富，而

產生一種含鹽的味道。

貳、影響咖啡風味因子

目前咖啡市場潮流已從一開始的即溶咖啡，歷經連鎖店咖啡，到現在精品咖

啡，強調根據個人喜好口味，來追求最愛風味之咖啡(林，2016)。而精品咖啡

(Specialty Coffee)是 1978 年台灣俗稱「咖啡教母」娥娜‧努森在法國咖啡國際會

議上提出之概念，她的定義是：來自獨特地理環境和氣候，產出具有特殊風味的

咖啡。目前精品咖啡並無確切定義，是由各國精品咖啡協會自訂，沒有嚴苛且統

一的定義。

美國精品咖啡協會(Specialty Coffee Association of America)對精品咖啡的最

初定義為：「精品咖啡通常是指生長在優良氣候區域的優質咖啡豆。因為每個產

區的土壤、氣候、海拔、濕度皆不同，所以不同產地的咖啡豆就蘊釀著不同養份，

產生不同的風味，也造就了每個精品咖啡獨特的香氣風味。」該協會最新的定義

則為：「慎選最適合的品種，栽植於最有助咖啡風味發展的海拔、氣候與水土環

境。慎選水洗與日曬咖啡製程，精選無瑕疵最高級生豆，運輸過程零缺點，送到

客戶水中。經過烘焙師高超手藝，引出最豐富地域之味，再以公認的萃取標準，

泡出風味絕佳之咖啡。」該協會二則定義比較，最初的定義是主要針對咖啡豆生

長環境及風味，最新的定義則擴及到整個咖啡製程。

日本精品咖啡協會(Specialty Coffee Association of Japan)的定義，從咖啡豆製

成咖啡所有階段，必須貫徹統一制度、工程和品質管理，咖啡風味絕佳，讓人留

16
下深刻印象，經消費者評價為好喝且感到滿意的咖啡(田口護，2004)。綜合上述

定義，可歸納 5 項影響咖啡風味因子：

一、品種

二、栽種環境

三、咖啡製程

四、烘培技術

五、沖泡手法

從上述 5 項影響咖啡風味因子分析，烘培技術與沖泡手法部分屬於後續人為

技術處理程序，最關鍵還是在於咖啡豆品種、栽種環境及製程部分，決定咖啡豆

品質與風味優劣。如要改變品種及栽種環境，則需要耗費極大金錢、時間及人力

成本來試種或調整栽種環境，如針對咖啡製程予以改良，則相對較易獲得回饋，

提升咖啡豆品質。如巴西改變日曬法為巴西式半日曬法，哥斯大黎加改良為蜜處

理法等，均是改良製程獲得極大成效之範例。台灣過去改變製程方式則有台東果

子狸咖啡及屏科大以模擬麝香貓消化液產出之咖啡等例，其中台東果子狸咖啡，

從過去年業績僅有新台幣 3 萬，到目前每年達百萬元營業額。

第四節 咖啡發酵風味影響
壹、發酵之影響

以微生物作用的角度來說明咖啡製作過程，其中酵母菌在發酵時扮演最重要

的角色，影響最終咖啡氣味與品質。在咖啡去皮後，外面會有一層薄薄的果膠層，

果膠層由多醣類、酶類及果膠質等組成，經由咖啡發酵可除去，發酵時會產生檸

檬酸，蘋果酸及醋酸等酸性物質滲入生豆。如發酵不完全，殘留果膠層會在儲藏

及乾燥過程中成為微生物生長媒介，發生二次發酵，造成咖啡產生異味。如發酵

過度，則有乙酸、丙酸、丁酸等代謝物形成，使咖啡出現較重的酸味和苦味，影

響品嘗風味(Silva 等，2000)。

17
 有機酸對於咖啡風味影響甚大，尤其在香味、氣味上有著重要角色，透過改

變 pH 值以影響代謝，達到調節咖啡果實酸味之作用，形成最後咖啡風味。而主

要有 5 種有機酸會影響酸味，分別是蘋果酸、檸檬酸、乳酸、草酸及琥珀酸。這

幾種酸口味均不同，如蘋果酸口感青酸，檸檬酸為清新涼爽，乳酸則微酸帶有乳

香味道，草酸口感微酸硬，琥珀酸口感是先鹹後微苦(Flores 等， 2012；董，2013)。

咖啡經發酵而可能產生咖啡風味如下：

一、水果味

有益性腐敗或乳酸菌皆能促進果膠層完全分解，一旦耗盡其食物來

源，分解作用即變緩，酵母菌慢慢增多，進一步消化水溶性果膠層，酵

母菌並產生酒精和特殊水果香氣。如咖啡發酵過度，酵母菌會死亡，水

果味更明顯，酒精則會轉換成醋酸，形成帶酸味的咖啡。所以發酵程度

決定形成水果香味輕重的因素。

二、花香、酒香味

酒精酵母菌因發酵作用，會產生許多特別香味。因酒精容易被水解，

在水洗和乾燥過程中，容易揮發掉；而各種不同的乙醛、酮類和芳香類

化學物質，會與生豆油脂結合，特有香味在烘焙時即會表現出來。

三、洋蔥味

果膠層因含有大量糖分，可大幅增加有益菌。但如咖啡如去皮時使

用過多清水處理或去皮前泡水過久，即將大部份水溶性糖分排出，導致

水中糖分與果膠層之比例太低，因而形成洋蔥味。此洋蔥味是因發酵過

程中出現丙酸菌，丙酸菌會使醋酸和乳酸變成丙酸，丙酸的量越多時，

洋蔥味就越重。

貳、酵母菌之影響

咖啡是發酵產物，而發酵經由混合酵母菌共同完成，產生各種風味，所以發

酵對於咖啡最終風味形成至關重要。過去檢測咖啡發酵過程發現會產生多種微生

18
物，包含細菌、酵母菌及真菌等 3 種，數量則以細菌最多，酵母菌次之，真菌最

少。其中發酵初期以細菌為優勢菌種，然而在發酵後期，因酸度逐漸降低，細菌、

真菌逐漸減少，而酵母菌較耐酸，數量逐漸增加，進而取代細菌分解果膠

(Avallone，2001)。因此，酵母菌在發酵後期扮演相當重要角色。

奶酪是過去有名的發酵實例，其使用混合細菌發酵可以產生各種不同風味，

並進而產出不同風味的奶酪，如豪達奶酪和瑞士奶酪等。另再添加真菌也會產生

不同風味奶酪，如布里奶酪或藍紋奶酪，顯示了風味的高度多樣性，這都是利用

不同微生物發酵而成，且越來越多創造新風味的新型酵母菌不斷從自然界分離出

來，近來「經濟學人」也有報導不同產地的咖啡豆中可分離鑑定酵母菌多樣性，

研究學者先採集世界各地咖啡豆，分離出酵母菌在實驗室培養，並萃取 DNA 進

行基因體定序，來比較咖啡的遺傳多樣性。研究亦發現酵母菌遺傳關係和地理位

置有密切關聯，所有酵母菌可分為三大族群，一個來自歐洲釀酒的酵母、一個來

自北美的橡樹，另一個來自亞洲。另分析發現哥倫比亞的咖啡酵母，是北美橡樹

酵母和歐洲釀酒酵母的混血；而葉門的咖啡酵母，則是亞洲品系和歐洲釀酒酵母

的混血等(Catherine 等，2016)。故如從咖啡豆中分離的酵母菌進行其他咖啡發酵

或其他應用，這可為咖啡產業帶來更多樣性風味。

第五節 酵母菌簡介
壹、酵母菌定義

早期酵母菌（Yeast）一詞源自麵包或釀酒發酵過程中所產生的發泡現象，

因此酵母菌常被認為是一群進行出芽生殖之發酵菌種，但並非所有酵母菌均以

「發酵」及「出芽」定義認定。因此，酵母菌並不是分類學上名詞，目前普遍認

知酵母菌係一群行出芽或分裂生殖的單細胞真菌，且不會產生子實體 (Kurtzman

and Fell ， 1998) ， 並 存 在 於 真 菌 各 分 類 體 系 中 ， 主 要 包 括 子 囊 菌

19
(Ascomycetous yeasts) 和 擔 子 菌 (Basidiomycetous yeasts) 和 不 完 全 菌

(Deuteromycota yeasts)。

一般酵母菌直徑約在 5μm，形態通常有球形、卵圓形、橢圓形或藕節形等，

結構上有細胞壁、細胞膜、細胞核、細胞質。酵母菌體含有豐富蛋白質、脂肪、

糖分和維生素 B 群及酶、輔酶、核糖核酸和一些新陳代謝中間產物。酵母菌在

分類學上重要單位為「種(species)」，但因同種酵母菌中，不同菌株可能在生理

生化試驗的表現上有所差異，因此酵母菌的歸類鑑定基礎以「菌株(strain)」為主，

菌株係指純種培養中單一菌落之子代。

貳、酵母菌分佈

酵母菌在自然界的分佈非常廣泛，但並不會隨機分布在任意區域，而是具有

固定的菌落群 ，主要分布在偏酸性、潮濕且含糖較高環境中，舉凡空氣、淡水、

海水、土壤、植物表皮、樹枝、花朵、果實，甚至一些條件極端嚴苛的自然環境

中也有分布。此外，亦有研究發現酵母菌還能寄生於人類身上或一些昆蟲腸道

內，目前已知有超過 100 個酵母菌屬，1200 個以上的酵母菌種(徐，2008)。

參、酵母菌分類

酵母菌屬真菌類，形態簡單，可分為無性及有性生殖，對於無性生殖之酵母

菌，1998 年 Yarrow 發展出多達 60-90 種藉由發酵、碳源、氮源、營養需求、

抗生素耐性以及代謝產物等試驗，作為酵母菌分類特徵。除上述生理生化試驗

外，酵母菌也以菌落形態、細胞形態、菌絲生成和有性世代特徵等，做為主要描

述的形態特徵。酵母菌的形態大小會因酵母種類不同而出現差異，而同種酵母菌

也會因培養條件或發育時期不同而有變化(Yarrow，1998；徐，2008)。有性生殖

之酵母菌則以孢子形態觀察特徵作鑑定。

酵母菌無性生殖主要有分裂(fission)、出芽(bud)、形成無性孢子等型式。其

中出芽方式可分為：單極出芽（monopolar）、雙極出芽（dipolar）和多極出芽

（multilateral）等 3 種，單極出芽係指僅在細胞一端出芽；雙極出芽則是在細胞

20
兩側出芽；多極出芽則是細胞週邊均可出芽。其中出芽方式以多極出芽型式最為

常見，而單極及雙極等特殊出芽型式則可作為菌種分類鑑定的主要參考特徵。另

分裂方式可分為 2 種，其中一種為出芽分裂，出芽後基部不縮小，在子細胞與母

細胞之間會直接分裂，另一種為非出芽模式分裂，而是在細胞中央形成隔膜再分

裂成兩個細胞者。

無性孢子生殖上，有些酵母菌會形成特有的厚膜休眠孢子(teliospore)或形成

具彈射能力之射出孢子(ballistospore)，另部分酵母菌在特殊條件上會產生節孢子

等。在不利於生長的環境中，部分的酵母菌會行有性生殖，子囊酵母會在子囊內

形成子囊孢子，孢子數目會依不同的菌種而有所不同，擔子酵母則會在擔子上形

成擔孢子。有些菌種會發展形成菌絲或偽菌絲的生長，有些酵母菌會形成如同黴

菌具有隔膜(septum)的菌絲(mycelium)。偽菌絲(pseudomycelium)藉出芽模式附著

延長細胞，而呈菌絲狀者。

第六節 酵母菌分子鑑定
由於酵母菌外觀特徵相當簡單，且其生理生化試驗和形態特徵具多變性，易

有種間特徵混淆不清困擾(柳怡如，2010)，因此需要經過特殊訓練人員才能正確

判斷菌種，此方面人才較少，且鑑定步驟繁雜，所需時間較長，無法在短時間內

提供準確結果，所以傳統鑑定方式已不敷使用。

近年來，因分子生物方法簡便快速，靈敏度及重複性高(Olsen，2000)，其技

術迅速發展，已廣泛的應用於酵母菌等微生物分類(Olive 等，1999)、流行病學

的診斷及食品品質監測上等。這些分子生物技術大致上以 DNA 為核心之技術

及電泳類相關技術為主，其中 DNA 部分如核糖體轉錄外區間(Sequencing

ofinternal transcribed spacer, ITS)或 5S、5.8S、18S 及大單元核糖體 DNA 或 RNA

序 列 分 析 、 隨 機 擴 增 多 型 性 DNA(Randomly amplified polymorphic DNA,

RAPD)、限制片段多型性 DNA(Restriction fragment length polymorphism, RFLP)、

21
擴增片段多型性 DNA(Amplified fragment length polymorphism, AFLP)等；另電泳

類相關技術則有變性梯度電泳圖譜分析(Denaturing gradient gel electrophoresis,

DGGE)等，以下就酵母菌常用分子鑑定技術說明概況：

壹、聚合酶鏈鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）

聚合酶鏈鎖反應是在短時間內將微量特定 DNA 片段擴增至 1010 倍或以

上，以鑑定菌屬或菌種的分子生物方法。原理是以某段 DNA 片段經高溫加熱後

分開成兩股單股之 DNA，此時所選擇之引子（primer）將分別與這 2 股 DNA 黏

合，在 Taq 聚合酶的作用下複製 2 條新的雙股 DNA。此變性（Denatured）、黏

合（Annealing）、延展（Extension）三個程序重複循環 25-35 次，DNA 的數量

即以指數增加至數百萬倍以上，PCR 產物再以電泳分離，經過染色及紫外光照

射後可以在電泳圖上觀察結果。

貳、隨機擴增多型性 DNA(Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)

這種方法主要利用聚合酶鏈鎖反應技術以較短的引子與模板 DNA 進行 PCR

反應，在 DNA 上隨機配對而進行增幅(Welsh 等，1990；Willwams 等，1990)。

一旦 DNA 有插入、突變等基因序列改變，擴增的多態性指紋圖譜就會隨之變化。

由於相同族群的個體 DNA 序列變異較少，所以放大之 DNA 片段差異亦小；而

不同族群的個體間差異較大，所以放大之 DNA 片段差異則大。隨機擴增多型性

DNA 即利用偵測大小不同之 DNA 片段差異分析親源。

參、限制性片段長度多態性（Restricted fragment length polymorphism, RFLP）

限制性片段長度多態性主要運用 DNA 長度多型性(length polymorphism)現

象，先抽出菌種之 DNA，以一種或多種限制酶將 DNA 切割成大小不一片段，再

藉由凝膠電泳分離所得電譜(又稱 DNA 指紋)，區分出不同來源 DNA 差異性。這

種技術因為幾乎所有的 DNA 片段都會呈現，造成判定困難，尚無法應用在分析

大量菌種。

肆、DNA 序列分析法（DNA sequencing analysis）

22
 這種方法是先將菌種 DNA 萃取後，並進行 DNA 定序，再以序列比對方式

進行鑑定。酵母菌目前多採用分析 rDNA 基因，rDNA 可用來決定生物多樣性及

其種源關係。目前已有許多菌種之 DNA 序列公開放置在網路上供研究參考，較

完整的基因資料庫有 GenBank、EMBL、SWISS-PROT 等，但目前多數資料庫中，

酵母菌的完整序列有限，尚無法進行大量的酵母菌種比對。

伍、核糖體 DNA 序列

rRNA 基因存在於所有生物體中，為保留性極高的結構基因，藉由 PCR 引

子可擴増出 rRNA 基因的不同片段，進而比對出不同酵母菌種之該段基因序列

的差異(Prasad，2007)。酵母菌的 DNA 中含有重複性且高保守性的核糖體 DNA

基因，包含小單元體(18S)、5.8S 及大單元 26S 核糖體 DNA 基因，在這些 rDNA

片段中有兩段轉錄外區間（Internal transcribed spacers, ITS），ITS1 及 ITS2。該

基因被視為生物間共有相同的演化起源，故其差異可說明與測量基因演化關係，

可作為物種間親緣關係比對的證據之一。酵母菌種具有獨特核糖體 DNA 序列，

因此建立完整資料庫可快速、精確的比對大部分的酵母菌種和新種的確立

(Kurtzman 等， 2006)，並可減少傳統試驗所需時間。

陸、變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradientgel electrophoresis，DGGE）

變性梯度凝膠電泳是利用鹼基序列所構成之 DNA 雙股，在溫度及化學變性

劑影響下，產生 DNA 變性解鍊現象，使電泳分離中速度變慢，進而分離鑑定出

野生型與突變型片段，最早是應用在監測核酸突變之篩選。目前在酵母菌應用上

主要是以特性探討及鑑定為主。其中特性探討部分主要觀察發酵期間酵母菌株變

化情形。

第七節 前人研究
壹、國內相關研究

23
 目前國內針對咖啡主題研究報導極多，惟大多以市場分析、消費行為、行銷

管理等面向進行探討最多，另外則集中於製程技術研究、咖啡成分分析、咖啡設

備研發、保健成效分析及咖啡渣再利用研究等領域，對於咖啡發酵或咖啡風味研

究相對甚少(如表 5)。

表 5. 台灣咖啡研究主題概況分析

主題 研究人 研究題目 參考文獻

咖啡製造商對通路商關係行銷策略之研
簡于珊 簡于珊，2014
究:A 品牌咖啡與通路商雙向觀點

連翊君 台灣咖啡農民於精品咖啡產業之研究 連翊君，2016

市場分
析、消費 適地性服務對消費者至連鎖咖啡店消費意
王 媛 王 媛，2015
行為、行 願之研究
銷管理
台灣連鎖咖啡業複合經營之行動商務創新
方淑宜 方淑宜，2014
模式之研究—以丹堤咖啡為例

台灣在地咖啡供應鏈之初探 _以花蓮瑞穗
陳怡婷 陳怡婷，2011
咖啡為例

生咖啡豆在不同烘焙條件下焙炒後所調製
詹豐銘 詹豐銘，2007
咖啡之成分分析

咖啡成 台灣地區咖啡之成分分析與抗氧化活性之
張楓愈 張楓愈，2013
分分析 研究

沖泡咖啡之製備及咖啡豆炒焙程度對抗氧
金晴嵐 金晴嵐，2003
化能力之影響

應用低溫低濕乾燥機對台灣咖啡生豆乾燥
鍾志琛 鍾志琛，2004
之研究
製程技
術研究
劉德珮 以專利分析探討台灣咖啡產業之關鍵技術 劉德珮，2009

24
 黃義鈞 半熱風咖啡烘焙機之滾筒設計與探討 黃義鈞，2016

咖啡設
張峰嘉 可程式控制器咖啡豆烘烤機之開發 張峰嘉，2015
備研發

蔡嘉蔚 利用影像辨識的自動煮咖啡機器人之研製 蔡嘉蔚，2015

咖啡酸預防高胰島素血症大鼠阿茲海默症
鄭勤巧 鄭勤巧，2014
之機制

不同焙度的咖啡對於受到皮質固酮誘導損
保健成
劉宜婷 傷的細胞可能具有神經保護及改善神經可 劉宜婷，2014
效分析
塑性之功效

咖啡對於牙周病菌-牙齦卟啉單胞菌之生長
鄒欣樺 鄒欣樺，2014
以及細胞生成發炎物質之影響

林以萱 咖啡渣再利用之研究 林以萱，2014

咖啡渣
再利用 劉承祐 咖啡渣吸附水中銅離子之研究 劉承祐，2015
研究
酵素水解對廢咖啡渣的多酚化合物和抗氧
彭凱群 彭凱群，2014
化活性之影響

劉瑛勝 咖啡豆烘焙及儲藏條件對其風味之影響 劉瑛勝，2009

咖啡
風味
建立一種氣體分析方法學：以熱脫附儀氣相
栗嘉徽 栗嘉徽，2013
層析質譜儀分析咖啡豆風味

咖啡 探討複合菌發酵咖啡豆利用不同沖泡方式
湯子嘉 湯子嘉，2014
發酵 之抗氧化力

資料來源：本研究整理

25
 國內目前針對咖啡發酵或咖啡風味做過研究，其中有湯子嘉探討複合菌發酵

咖啡豆利用不同沖泡方式之抗氧化力，此研究係採阿拉比卡種咖啡豆使用複合菌

發酵方式處理，與一般水洗式咖啡及印尼麝香貓咖啡作為比較，發現 3 種咖啡豆

都具有抗氧化能力與抗氧化成分，其中麝香貓咖啡與發酵咖啡差異不大，並由此

判斷發酵咖啡豆與麝香貓咖啡豆口感有相似之處，以此延伸對咖啡風味口感之探

討(湯，2014)；而屏東科技大學謝寶全教授日前帶領學生研究印尼麝香貓咖啡，

從麝香貓的消化系統取出乳酸桿菌等 16 種菌種，並利用生物科技模擬消化系

統，研發新風味咖啡，已申請專利。另劉瑛勝使用氣相層析質譜儀，以官能品評

及系統化之方式，研究咖啡豆烘焙及儲藏條件對其風味之影響，藉以探究咖啡香

氣與風味之交互影響(劉，2009)；栗嘉徽利用熱脫附儀串聯氣相層析質譜儀

(TD-GC-MS) 鑑定出 17 種咖啡豆的主要風味成分，並分析不同烘培程度的咖啡

豆風味，以及其發生化學反應機制與途徑，加以說明風味成分變化與趨勢，建立

一種氣體分析方法學(栗，2013)。

另國內對於酵母菌研究則偏重於應用面，對酵母菌改變食物風味研究有限，

如謝美娟以添加不同酵母菌所製得黑后葡萄酒及有無添加乳酸菌在不同階段之

物化分析與香氣成分分析，研究外接發酵菌種對黑后葡萄酒風味品質之影響。結

果顯示添加酵母菌 Candida stellata CCRC21668 所釀造黑后葡萄酒之酒精產率為

最高達 13.68%；隨著熟成時間增加，香氣成分種類並沒有改變，只有含量改變。

另添加酵母菌 Saccharomyces cerevicia CCRC51959 且添加乳酸菌所釀黑后葡萄

酒與不添加酵母菌但添加乳酸菌所釀黑后葡萄酒，其乳酸含量均高於不添加乳酸

菌黑后葡萄酒(謝，2002)。再者，高乾龍利用不同酵母菌、紅麴添加量及不同發

酵溫度等因素，對紅露酒風味之探討，從官能品評分析結果紅麴的添加量、酵母

菌種類及醱酵溫度皆會影響紅露酒之風味(高，2004)。曾美芳則針對甜味種楊桃

醃漬發酵過程中醃漬液菌相及成分變化之研究，結果顯示酵母菌是主要參與甜楊

桃汁發酵之菌種(曾，2004)。而劉詩文曾利用分子標誌區分楊桃鹽醃發酵過程中

26
酵母菌之菌相，探討甜味種與酸味種楊桃鹽醃發酵過程酵母菌菌相之變化，並對

其揮發性化合物進行分析研究(劉，2005)。

貳、國外相關研究

由國外文獻發現，目前國外對於咖啡發酵中微生物研究較國內為多， Silva

對巴西小粒咖啡發酵過程中微生物多樣性研究(Silva，2000)，Massawe 等對坦桑

尼亞咖啡發酵過程中乳酸菌進行研究(Massawe 等，2010)。從國外研究發現，細

菌、酵母菌和絲狀真菌已在溼式發酵過程中發現；而成團腸桿菌、大腸桿菌、巨

大芽孢桿菌和芽孢桿菌浸麻乳酸菌等則是乾式發酵主要細菌種類。Pederson 及

Danielle 等研究咖啡乾式發酵中，研究發現在乾式發酵微生物種群變化，在整個

發酵過程中，以細菌數量為最多，其次是酵母菌，真菌數量最少(Pederson 等，

1946、Danielle 等，2010)。

而過去咖啡豆酵母菌種分離如 Avallone 等研究顯示咖啡豆與發酵初期主要

優勢菌種是酵母菌 Hanseniaspora uvarum(Avallone 等，2001)。而在 Masoud 等研

究酵母菌 Pichia kluyveri 是咖啡豆發酵過程的主要優勢菌種(Masoud 等，2004)。

另 一 利 用 分 離 的 方 法 研 究 咖 啡 豆 發 酵 過 程 中 酵 母 菌 則 顯 示 酵 母 菌 Pichia

fermentans 由初期到發酵 48 小時之間展現相當高的比率 (de Melo Pereira 等，

2014 )。國外對咖啡乾式發酵與溼式發酵微生物均有研究紀錄，但多數研究均採

用傳統方法分離微生物，獲取微生物種群並未完整，另外國外多數針對乾式發酵

研究，對於溼式發酵研究則較少。

中國董紅紅對於雲南小粒咖啡(即阿拉比卡咖啡)溼法發酵中微生物研究，深

入分析鑑定了產生果膠酶之菌種，發現發酵初期以細菌為主要優勢菌種，隨著發

酵時間越久，細菌與真菌數量逐漸減少，酵母菌則持續增加。而在咖啡發酵過程

中針對各階段溫度、含水量及 pH 值等因子進行檢測，研究顯示上述因子變化與

微生物變化及咖啡品質有密切關聯；另對咖啡發酵中重要 8 種有機酸含量測定，

27
結果發現發酵越久，草酸、乙酸及乳酸含量逐漸增加，而蘋果酸、檸檬酸、琥珀

酸及丙酸在發酵過程變化很小，檢測過程則未發現丁酸 (董，2013)。

VanPee 等研究則在羅布斯塔咖啡溼式發酵中，酵母菌數量大於細菌與真

菌。而造成菌種比例不同最大影響因子就是 pH 值不同。在溼式發酵中因產生酸

性代謝物，pH 值隨之逐漸降低，造成細菌數量減少，酵母菌數量逐漸增加(VanPee

等，1972)。Avallone 研究墨西哥阿拉比卡咖啡發酵檢測，發現乳酸及乙酸造成

pH 值降低，進而推測有機酸含量決定 pH 值，在發酵後期，因酸度較低，此時

由於酵母菌較能耐酸性環境，因而能替代細菌分解果膠。因此 pH 值變化除了可

反映發酵過程微生物變化外，也間接影響咖啡風味(Avallone 等，2001)。中國程

金煥等人對於酶促發酵在咖啡初加工過程中的應用研究，分析酶促發酵脫膠與機

械脫膠及自然發酵脫膠效果對比分析，為咖啡製程尋求一高效穩定的處理方法。

惟上述研究僅針對發酵微生物及脫膠效果分析，並非尋求改變咖啡風味(程等，

2016)。

由國外文獻可發現對咖啡發酵中微生物菌種有許多研究，相較之下，在國內

則甚少研究；針對咖啡發酵過程變化、有機酸含樣變化等相關研究亦少探討；另

國內對酵母菌鑑定與分類、生態及多樣性調查方面的文獻較少，僅有針對台灣河

川(田志仁，2002)、海洋(張晉峰，2009、雲妮兒，2014)、土壤(劉純豪，2007、

謝智雯，2009)、山區植物(徐惠珠，2008)、菇類(黃莉媖，2010)等自然環境中酵

母菌做菌種分析研究，惟目前甚少對台灣咖啡豆做酵母菌菌種鑑定分析研究。

因此，為了瞭解台灣咖啡豆酵母菌族群的分佈情況與後續利用於咖啡豆發酵

改良風味與品質的測試，本實驗由台灣南投與花蓮兩處生產咖啡的農場進行採

樣，進行酵母菌的分離與純化，並利用 RAPD 分群法與 26S rRNA 基因定序法進

行酵母菌的分子鑑定，以了解咖啡豆上酵母菌的分布情形。

28
 第三章 材料與方法

第一節 實驗器材
壹、1.8 ml 冷凍保存管(Nalgene Nunc Internal, USA)。

貳、81 孔冷凍保存盒

參、1.5 ml 與 0.2 ml 微量離心管。

肆、各式 Tip

伍、玻璃珠(0.1mm Biospec INC, USA)。

陸、PCR 試管

柒、螺旋試管(16mm x 125 mm)。

捌、90 mm x 15 mm 培養皿。

玖、15 ml 和 50 ml 離心管。

拾、L 形玻棒等等，各器材皆為實驗室用等級。

29
 第二節 酵母菌分離培養基
Yeast extract-malt extract (YM) medium
Glucose (Difico) 10 g
Malt extract (Difico) 3g
Peptone (Difico) 5g
Yeast extract (Difico) 3g
Agar (Oxoid) 20 g
Water 1000 mL
pH 5.5-6.0
濕熱滅菌(121°C, 15 lb/in2, 15 分鐘)

Acidified yeast extract-malt extract (YM) medium

Glucose (Difico) 10 g
Malt extract (Difico) 3g
Peptone (Difico) 5g
Yeast extract (Difico) 3g
10% (w/v) 酒石酸 Tartaric acid 16 mL
Agar (Oxoid) 20 g
Water 1000 mL
pH 3.5
濕熱滅菌(121°C, 15 lb/in2, 15 分鐘)

二氯喃玫瑰紅氯黴素培養基（Dichloran rose Bengal chloramphenicol agar,

DRBC）

Glucose (Difico) 10 g

磷酸二氫鉀（KH2PO4） 1g

Peptone (Difico) 5g

硫酸鎂（MgSO4˙7H2O） 0.5 g

5% (w/v)孟加拉玫瑰紅溶液（rose bengal） 0.5 mL

0.2% (w/v)二氯喃乙醇溶液（0.2% dichloran in ethanol） 1 mL

30
 氯黴素 0.l g

Agar (Oxoid) 20 g

Water 1000 mL
濕熱滅菌(121°C, 15 lb/in2, 15 分鐘)

第三節 酵母菌的分離純化與保存
採集南投縣與花蓮縣農場出產阿拉比卡種咖啡豆為樣品，以 DRBC 和

AYMA 進行菌株分離，接著使用光學顯微鏡做初步篩選，將所有可能的不同菌

株挑選出來後以 YMA 純化。純化後的菌株接種於 YMA 斜面培養基於 25°C 下

培養，短期的保存(1-3 個月)則將生長於對數期的菌株維持在 4°C 下，長期的保

存則將菌液維持在 30%的甘油中於-80°C 保存。

第四節 酵母菌的分子鑑定
壹、DNA 的萃取

試驗菌株以 YM 固態培養基在 25°C 培養 48 小時後，取約 2 個接種環大小

的菌量懸浮在 500 μL 的萃取緩衝液中(50 mmol L-1 Tris, 250 mmol L-1 NaCl, 50

mmol L-1 EDTA, 0.3% w/v SDS, pH 8)並包含約 200 μL 大小在 425–600 μm 的無

菌玻璃珠。經高速震盪 3 分鐘後在 65°C 下反應 1 小時。懸浮液在 14,000 × g 轉

速下離心 30 分鐘後進行核酸的純化(Sampaio et al., 2001)。酵母菌基因組核酸的

純化使用勁因公司(台北，台灣)生產的基因體萃取套組來進行，步驟則參照原廠

手冊。

貳 、 隨 機 擴 增 多 型 性 連 鎖 反 應 之 DNA 指 紋 分 析 法 (Random Amplified

Polymorphism DNA, RAPD)

本 實 驗 所 使 用 的 隨 機 引 子 為 (GTG) 5 (5’-GTGGTGGTGGTGGTG-3’)

(Naumova et al., 2004)。反應內容物包含：37.5μl 二次去離子水、5μl 10 倍 PCR

反應緩衝液、1.5μl dNTP (10mM)、2.5μl (GTG) 5 引子(10μM)、1.5μl Taq polymerase

31
(1U/μl) 及 2μl template DNA，反應總體積 50μl。反應時間為：95°C 預熱變性

(denaturation) 3 分鐘；92°C 變性 1 分鐘，使 DNA 雙股解離；50°C 引子黏合

(annealing)1 分鐘；72°C 進行 DNA 延長擴增(extension) 1 分鐘，共重複擴增 32

次後，以 72°C 擴增延長 5 分鐘，待反應結束後冷卻至 4°C，並將擴增後產物置

入-20°C 冰箱中保存，作為電泳分析使用。

將 PCR 擴增後的產物於含有 0.5 倍 TBE 緩衝溶液的電泳槽中，以 2% agarose

(Amresco)進行電泳分析，隨後以 ethidium bromide (0.5 μg/ml) (Sigma)溶液進行染

色，直至色帶清晰後照相存檔。

參、PCR 增幅 LSU rDNA D1/D2 區域

增幅 LSU rDNA D1/D2 區域主要利用 primer F63 (5'-GCA TAT CAA TAA

GCG GAG GAA AAG-3')及 LR3 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3')

(Scorzetti et al., 2002)。利用 PCR 擴增反應將大單元核糖體 RNA 基因之 D1/D2

區域序列擴增，其內含物包含：17.5 μl 二次去離子水、2.5 μl 10 倍 PCR 反應緩

衝液、1 μl dNTP (10 mM)、1 μl F63 引子(10μM)、1 μl LR3 引子(10 μM)、1 μl

template DNA (10 ng/μl)、1 μl Taq polymerase (1 U/μl)，反應總體積 25 μl。反應

時間為：95°C 預熱變性 3 分鐘；92°C 變性 1 分鐘，使 DNA 雙股解離；55°C 引

子黏合 1 分鐘；72°C 進行 DNA 延長擴增 1 分鐘，共重複擴增 32 次後，以 72°C

擴增延長 5 分鐘，待反應結束後冷卻至 4°C，並將擴增後產物置入-21°C 冰箱中

保存，接著委託生物科技公司進行定序。

肆、PCR 產物的定序與序列分析

PCR 產物的定序主要是委託源資公司(台北，台灣)來進行。DNA 定序反應

試劑是採用 BigDye Terminator V3.1(Applied Biosystems, USA)。DNA 樣本經定序

32
PCR 反應，條件為 96°C 30 秒、50°C 15 秒、60°C 4 分鐘進行 25 個循環。定序

PCR 反 應 後 以 酒 精 沉 澱 的 方 法 去 除 多 餘 的 dye terminators 。 後 以 Applied

Biosystems 3730 DNA Analyzer(Applied Biosystems, USA)進行序列分析。定序後

的序列經 NCBI(National Center for Biotechnology Information)基因資料庫搜尋後

找出相似度最高的菌株，最相似菌株的挑選標準以相似度最高的模式菌株為主，

再配合其他相似度高並且已發表的序列作搜尋。

第五節 實驗架構

咖啡豆樣品

酸化 YM 與 DRBC 培養基

直接分離培養 強化培養

菌株純化與形態鑑定

菌株保存

RAPD 分型試驗

33
 26S rRNA 基因序列定序

GenBank BLAST 資料庫分析鑑定

酵母菌族群分析

34
 第四章 結果與討論

第一節 酵母菌的分離與鑑定
壹、酵母菌的分離與純化

南投與花蓮採取的咖啡豆樣品中總共分離出 48 株酵母菌菌株，花蓮樣品分

離株占了 45.8% 有 22 株酵母菌菌株，南投樣品分離株占了 54.2% 有 26 株酵母

菌株。代號的命名上由花蓮所分離的菌株字首為 H (Hualien)而由南投分離出的菌

株為 N (Nantou)，再根據直接分離 D 與強化培養 R 與個別使用培養基 D (DRBC)

與 A(AYMA)進行分組後，再依分離的順序給予不同的數字編號。

貳、RAPD 分群結果

將所收集的酵母菌利用(GTC)5 引子進行 PCR 的結果可以將這些酵母菌作初

步的分群。48 株酵母菌根據電泳的結果可以歸納出 14 種不同的類型(圖 2)，由

每分群中挑選 1-2 株菌株進行 26S rDNA D1/D2 區域序列的定序。隨機擴增多形

性 DNA (Randomly amplified polyporphic DNA, RAPD)是一種簡單快速的分子技

術(Williamse 等, 1990)，和傳統之 PCR 反應不同，RAPD 以不具專一性之引

子，隨機互補至染色體 DNA，並增殖出許多大小不同之 DNA 片段，後續再比

對電泳圖譜上 DNA 片段的分佈與大小，可以快速進行酵母菌株或菌種的區別

(Paffetti 等 l., 1995)。因此在針對數量較多的多樣性菌株研究過程中，可快速分

型減少後續定序的數量與花費的成本。

參、酵母菌的分子鑑定

由不同 RAPD 類型的組別中各取 1-2 株菌株作代表進行 26S rDNA D1/D2 區

域的定序。定序後的序列經 NCBI 基因資料庫搜尋後找出相似度最高的菌株作為

分子鑑定的結果(表 6)，相似度最高菌株的挑選標準必須是屬於已經發表於期刊

中的菌株為主。

35
 26S rDNA D1/D2 區域的序列的 5’端包含了兩段高度保留性區域：1-126 bp

和 423-636 bp，與兩段變異區域序列：127-264 bp (D1)和 423-636 bp (D2)的區域，

此段區域合稱為 D1/D2 區域(D1/D2 domain)，這段區域已成為酵母菌分子鑑定與

分類的主要應用(Guadet 等，1989)。根據統計的結果評估，同種的不同菌株之間

顯示不超過 0-3 核苷酸的不同(0-0.5%)，而不同種的菌種之間則顯示有大於 6 個

以上核苷酸的不同(1%) (Rosa and Gabor，2006)。此資料庫的建立允許針對大量

分離株的偵測，同時也使得非分類學家只要藉由定序長度約 600 bp 的 D1/D2 區

域的序列並且進入 NCBI 資料庫進行 BLAST 的搜索就能得到快速的初步結果

(Kurtzman and Fell，2006)。以下針對 14 群分子鑑定的結果進行說明(表 6):

一、Group 1:

此群共分離出 14 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 (KT922489)有 99.8%的
相似性僅有 1 個核甘酸的差異性(1 gap)。因此，該群菌株鑑定為屬於
Hanseniaspora uvarum。

二、Group 2:

此群共分離出 4 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Candida quercitrusa MB144 (KF830174)有 99.8%的相似性僅
有 1 個核甘酸的差異性(1 gap)。因此，該群菌株鑑定為屬於 Candida
quercitrusa。

三、Group 3:

此群共分離出 4 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 (KT922489)有 99.8%的
相似性僅有 1 個核甘酸的差異性(1 gap)。因此，該群菌株鑑定為屬於
Hanseniaspora uvarum。Group3 與 group1 由於 RAPD 圖形不同，但鑑定
菌種相同，屬同種的不同菌株。

四、Group 4:

36
 此群共分離出 2 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，
該分群株菌與 Pichia fermentans ZIM 2398 (HE660054)有 100%的相似性，
無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Pichia fermentans。

五、Group 5:

此群共分離出 3 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Candida quercitrusa MB144 (KF830174)有 100%的相似性，
無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Candida quercitrusa。Group
5 與 group 2 由於 RAPD 圖形不同，但鑑定菌種相同，屬同種的不同菌株。

六、Group 6:

此群共分離出 3 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Pichia kluyveri CEC RMab-1-37 (JX103191)有 100%的相似
性，無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Pichia kluyveri。

七、Group 7:

此群共分離出 2 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Saturnispora sp. UFMG-CM-Y292 (KC832478)有 98.9%的相
似性，有 6 個核甘酸的差異性，位於不同種 6 個核苷酸以上差異的邊緣，
可再進一步以 ITS 序列確認。因此，該群菌株鑑定為屬於 Saturnispora sp.。

八、Group 8:

此群共分離出 5 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Candida natalensis VTT C-04521 (DQ377636) 有 99.8%的相
似性僅有 1 個核甘酸的差異性(1 gap)。因此，該群菌株鑑定為屬於 Candida
natalensis。

九、Group 9:

此群共分離出 2 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Saturnispora silvae 30-14 (GQ222354)有 100%的相似性，無
核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Saturnispora silvae。

十、Group 10:

37
 此群共分離出 5 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，
該分群株菌與 Saturnispora silvae 30-14 (GQ222354)有 100%的相似性，無
核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Saturnispora silvae。Group
10 與 group 9 由於 RAPD 圖形不同，但鑑定菌種相同，屬同種的不同菌株。

十一、Group 11:

此群共分離出 1 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Pichia kluyveri CEC RMab-1-37 (JX103191)有 100%的相似
性，無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Pichia kluyveri。

十二、Group 12:

此群共分離出 1 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 (KT922489)有 100%的相
似性，無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Hanseniaspora
uvarum。Group12 與 group3 、group1 由於 RAPD 圖形不同，但鑑定菌種
相同，屬同種的不同菌株。

十三、Group 13:

此群共分離出 1 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 (KT922489)有 100%的相
似性，無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Hanseniaspora
uvarum。Group13 與 group 12 、group3 、group1 由於 RAPD 圖形不同，
但鑑定菌種相同，屬同種的不同菌株。

十四、Group 14:

此群共分離出 1 株菌株，根據 BLAST 比對 D1/D2 序列的結果顯示，

該分群株菌與 Candida quercitrusa MB144 (KF830174)有 100%的相似性，
無核甘酸的差異性。因此，該群菌株鑑定為屬於 Candida quercitrusa。
Group14 與 group 5、group 2 由於 RAPD 圖形不同，但鑑定菌種相同，屬
同種的不同菌株。

38
 第二節 酵母菌族群組成的分析
壹、分離頻率
樣品總計分離出 4 屬、7 種與 48 株酵母菌，花蓮咖啡豆分離出 3 屬、5 種與
22 株酵母菌。南投咖啡豆分離出 3 屬、5 種與 26 株酵母菌。在所有分離菌種的
出現頻率方面，以 Hanseniaspora uvarum 占 41.7%最多，Candida quercitrusa 占
16.7%次之，Saturnispora silvae 占 14.6%再次之，此三菌種屬分離頻率最高的優
勢菌種。以地區的分離頻率分析，花蓮咖啡豆中以 Hanseniaspora uvarum 佔 54.5%
最多，另 Pichia kluyveri 占 18.2%次之，Candida quercitrusa 佔 13.6%再次之。南
投咖啡豆中以 Hanseniaspora uvarum strain 30.8%最多，Saturnispora silvae strain
30-14 占 26.9%次之，另 Candida quercitrusa 占 19.2%再次之(表 7)。

分離的菌種中，Candida quercitrusa、Candida natalensis、Hanseniaspora

uvarum 屬於兩採樣區域重複分離出者，其中 Hanseniaspora uvarum 除在兩地區
皆分離到外，也是所有分離株中分離頻率最高者(41.7%)，可能屬於咖啡豆上的
主要優勢菌種。而 Saturnispora sp. 與 Saturnispora silvae 兩種酵母菌是僅在南投
樣品被分離出，Pichia fermentans 與 Pichia kluyveri 兩種酵母菌是僅在花蓮樣品
被分離出，也顯示這些菌種可能有地區的獨特性(表 7)。過去相關的研究中也顯
示，Hanseniaspora uvarum 是咖啡豆與發酵初期的主要優勢菌種，但數量會隨著
要咖啡豆的乾燥程序而降低(Avallone 等，2001)。Pichia kluyveri 的菌種在 Masoud
等(2004)的研究中是咖啡豆發酵過程的主要優勢菌種，在本研究中的南投樣品也
被分離出。在另一利用分離的方法研究咖啡豆發酵過程中酵母菌菌株的研究中顯
示，Pichia fermentans 由初期到發酵 48 小時的期間展現相當高的比率、其他與本
研究相同分離出的菌種還包括 Pichia kluyveri 與 Candida quercitrusa (de Melo
Pereira 等，2014 )。Saturnispora 屬在自然界的分布廣泛，在許多棲地都曾被分
離出，包括果蠅、紅樹林和口水樣、花朵、土壤、昆蟲糞便、落葉、沼澤水樣、
植物的根、酸菜、樹幹及滲出液與野生菇類等(Liu & Kurtzman, 1991; Kurtzman,
1998; Morais 等, 2005; Boonmak 等, 2009; Canelhas 等, 2011; Limtong 等,
2010)，而在咖啡豆或發酵過程被分離出的報告較少，在本研究中也僅自南投樣
品中被分離出，在分離頻率上屬南投第二，整體第三的情形，代表此菌株在地域
上的特殊性。

39
貳、地區、方法與培養基分離株分析
採取自南投與花蓮的咖啡豆樣品中，共分離出 48 株酵母菌菌株，其中花蓮

樣品分離出 22 株酵母菌菌株占總數的 45.8%，南投樣品分離出 26 株酵母菌菌株

占總數的 54.2%。代號命名由花蓮咖啡豆所分離出的菌株字首為 H(Hualien)，而

由南投咖啡豆所分離出的菌株字首為 N(Nantou)；再根據直接分離 D 與強化培養

及個別使用培養基 D(DRBC)與 A(AYMA)進行分組後，再依分離順序給予不同數

字編號而成。直接由花蓮樣品分離出的酵母菌菌株有 5 株占 22.7%，強化培養則

有 17 株占 77.3%；而由南投樣品分離酵母菌菌株有 6 株占 23.1%，強化培養則

有 20 株占 76.9%。花蓮樣品使用培養基 D 有 12 株占 54.5%，培養基 A 則有 10

株占 45.5%；南投樣品使用培養基 D 有 13 株占 50%，培養基 A 則有 13 株占 50%。

40
表 6. 咖啡豆酵母菌分離株的菌株代號、基因資料庫比對鑑定結果
Sequencing Accesion Difference Gap
Groups Isolates Match strains Similarity Identities
lengths (bp) number (bp.) (bp.)
1 NRA1 587 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 KT922489 99.8% 587/588 1 1
2 NDA11 588 Candida quercitrusa MB144 KF830174 99.8% 586/587 1 1
3 NDA7 593 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 KT922489 99.8% 593/594 1 1
4 HRD7 578 Pichia fermentans ZIM 2398 HE660054 100% 576/576 0 0
5 HRD2 585 Candida quercitrusa MB144 KF830174 100% 584/584 0 0
6 HRD10 588 Pichia kluyveri CEC RMab-1-37 JX103191 100% 587/587 0 0
7 NRD7 550 Saturnispora sp. UFMG-CM-Y292 KC832478 98.9% 539/545 6 0
8 NRD8 583 Candida natalensis VTT C-04521 DQ377636 99.8% 583/584 1 1
9 NRD2 561 Saturnispora silvae 30-14 GQ222354 100% 561/561 0 0
10 NRA3 560 Saturnispora silvae 30-14 GQ222354 100% 560/560 0 0
11 HRA2 588 Pichia kluyveri strain CEC RCS-0-39 JX103190 100.0% 587/587 0 0
12 HRD6 587 Hanseniaspora uvarum NS-PDC-19 KT922489 100.0% 587/587 0 0
13 HRD17 591 Hanseniaspora uvarum NS-O-198 KT922917 100.0% 591/591 0 0
14 HRD8 587 Candida quercitrusa MB144 KF830174 100% 587/587 0 0

41
表 7. 花蓮與南投咖啡豆樣品中所分離的酵母菌菌株數及頻率
HCB NCB
Species No. of % of total
% No. of isolates %
isolates
Candida quercitrusa 3 13.6 5 19.2 16.7

Candida natalensis 1 4.5 4 15.4 10.4

Hanseniaspora uvarum 12 54.5 8 30.8 41.7

Pichia fermentans 2 9.1 0 0.0 4.2

Pichia kluyveri 4 18.2 0 0.0 8.3

Saturnispora sp 0 0.0 2 7.7 4.2

Saturnispora silvae 0 0.0 7 26.9 14.6

Total of 22 26 48
HCB: Hualien Coffee Beans; NCB: Nantou Coffee Beans

42
 表 8. 不同採樣地點、不同分離方法與不同培養基條件下酵母菌菌株分離結果
HCB NCB
Groups Numbers Isolates NO. NO. NO. of NO. of NO. NO. NO. of NO. of
of D of R DRBC AYMA of D of R DRBC AYMA
HRA12
HDD1
HDA2
HDA3
HRD5
HRA11
HRA3
1 14 3 6 2 7 1 4 2 3
HRA4
HRA7
NDA5
NRD12
NRD8
NRA1
NRA7
HDD4
NRA4
2 4 1 0 1 0 1 2 1 2
NDA11
NRD5
NDA8
NDA7
3 4 0 1 1 0 2 1 1 2
NRD13
HRD15
HRD9
4 2 0 2 2 0 0 0 0 0
HRD7
HRD2
5 3 NRD1 0 1 1 0 0 2 1 1
NRA8
HRD11
6 3 HRD10 0 3 2 1 0 0 0 0
HRA6
NRD7
7 2 0 0 0 0 1 1 2 0
NDD2-2
8 5 NRD3 1 0 0 1 1 3 2 2

43
 HDA5
NDA2
NRA2
NRD8
NRD2
9 2 0 0 0 0 0 2 2 0
NRD6
NRA6
NRA3
10 5 NRD4 0 0 0 0 0 5 2 3
NRD11
NRA5
11 1 HRA2 0 1 0 1 0 0 0 0
12 1 HRD6 0 1 1 0 0 0 0 0
13 1 HRD17 0 1 1 0 0 0 0 0
14 1 HRD8 0 1 1 0 0 0 0 0
total of 48 5 17 12 10 6 20 13 13
HCB: Hualien Coffee Beans; NCB: Nantou Coffee Beans

44
 M NRD HR HDA NRD HD HR ND HD HR HR NR HR NR HR NR
12 A7 2 8 D1 D5 A5 A3 A12 A11 A1 A3 A6 A2 A3

M HD NR ND NR ND ND NR HR NRD NR HR NRA HR HR HRD HR

D4 A4 A11 D5 A8 A7 D13 D15 1 A8 A4 7 A6 D9 6 D7

M HR HR NR ND NR HD ND HR NR NR NR NR NR HR HR NR
D11 D10 D7 D2- D3 A5 A2 D17 A2 D2 D11 A5 D6 D2 D8 D4
2

圖 2. 酵母菌分離株 RAPD-PCR 分群電泳圖

45
 第五章 結果與建議
咖啡豆熟成後由咖啡樹上摘下，經過乾式或溼式的處理移除將咖啡生豆外

附著的外果皮(pulp)、果肉(mucilage)等物質。生豆處理的過程中，各種酵母菌

與細菌生長在這些環境，產生果膠分解、半纖維素分解與其他酵素活性來協助

果皮與果肉的分解。微生物的其他代謝反應會造成咖啡豆風味與特性上正面或

負面的影響，但是這些特定的微生物所產生特定的反應與咖啡品質的連結目前

尚不清楚。過去有一些研究咖啡豆發酵過程酵母菌族群的研究顯示，包括

Candida , Saccharomyces、Kluyveromyces、Saccharomycopsis、Hanseniaspora、

Pichia與 Arxula等被分離出，但是進一步研究相關連結與功能性的試驗就是後

續必須進一步進行的(Silva等，2000 ; Masoud等，2004 )。

本研究以咖啡豆為分離源，分離出4屬7種的酵母菌，其中Hanseniaspora

uvarum 無論在本研究中或是其他相關咖啡豆酵母菌的研究都顯示是主要的

優勢菌種之一，其他如Candida quercitrusa與Pichia kluyveri也都是曾由咖啡中

被分離的優勢菌種。這些由咖啡豆中所分離出的酵母菌未來會進一步透過如

pH生長範圍、滲透壓耐受範圍、溫度生長範圍、酒精與酸耐受範圍等試驗進

一步篩選，並藉由發酵過程的風味成分分析，以期找出可以利用在提升咖啡豆

風味的發酵菌母。

46
 第六章 參考文獻

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51
 第七章 附錄

圖3. 酵母菌分離株NRA1(左)及NRA2(右)平板型態

圖4. 酵母菌分離株NRA3(左)及N RA4(右)平板型態

52
圖5. 酵母菌分離株NRA5(左)及N RA7(右)平板型態

圖6. 酵母菌分離株NRA8平板型態

53
圖7. 酵母菌分離株NRD1(左)及NRD2(右)平板型態

圖8. 酵母菌分離株NRD3(左)及NRD4(右)平板型態

54
圖9. 酵母菌分離株NDA2(右)平板型態

圖10. 酵母菌分離株NDA5(左)平板型態

55