Effects of Medium Chain Fatty Acid On Arachidonic Acid and Propionibacterium Acnes-Induced Inflammation

國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系
碩士論文
中鏈脂肪酸對痤瘡桿菌誘導發炎反應之
影響
Effects of medium chain fatty acid on arachidonic
acid and Propionibacterium acnes-induced
inflammation
指導教授：蔡帛蓉博士 ( Po-Jung Tsai, Ph.D.)
研究生：黃鈺涵 ( Yu-Han Huang )
中華民國 102 年 7 月
謝誌
研究所兩年的時間就這樣過去了，能夠順利畢業展開計畫好的旅程真的很開
心，此時此刻只想好好感謝我身邊的你們。
回想起一開始，真的很感謝蔡帛蓉老師願意收我當研究生，這兩年來不管是
學術研究方面或是為人處事都讓我學會了很多事情。除了實驗，也感謝蔡老師時
時提醒我做事情應該擁有的正確態度，在學生涯的最後階段能夠遇到您真的是太
好了；感謝吳文惠教授與葉松鈴教授在論文撰寫的提點；也感謝蔡宗憲醫師、
鄒嘉倫醫師與台大獸醫系切片室的曾姐在病理切片方面的協助。
感謝實驗室的大家一路走來對我的幫助與照顧! 感謝育亭學姊和助理佑
家，從頭開始教我做實驗的方法與技巧，總是聽我抱怨一些大小事，在實驗遇到
困難時你們總是可以給我很好的建議與協助，讓我一開始沒有實驗室經驗的不安
減少很多；感謝宥苡學姊，妳的處變不驚和冷靜的做事態度都是我需要學習的!
感謝賴佩、若涵學姊，參與你們有趣的對話，一起大笑完都會讓我得到繼續努力
動力!感謝碩二時代，每次聚餐都好精彩，最後的時間大家一起為了論文苦惱擔
心，一路走來還好有妳們的支持陪伴!感謝貼心的雅欣，半夜的實驗還好有妳，
我都不是孤單一個人，也感謝學長文程在實驗方面的幫助，希望你們的實驗可以
非常順利!另外，感謝小小白們的陪伴，希望祢們在另一個世界過的安穩。
最後要感謝親愛的鈺嵐，懂事那刻開始就一直受妳的照顧，這兩年更是還好
有妳的鼓勵、傾聽和陪伴，讓我的心情能夠抒發，也才能讓我繼續堅持下去。感
謝我的爸爸、媽媽，當初若不是你們的堅持，我的人生或許就不會那麼精彩!感
謝親愛的張譽，從大學到現在給予的幫助、包容，在深夜或周末假日來實驗室陪
伴我實驗，真的很謝謝你!最後，謝謝老天爺爺給了我自己也想像不到的一條道
路，也謝謝您替我帶來許多貴人，帶領我在灰心時還可以走回自己的路，且能夠
繼續走下去。
謹以此論文獻給我最親愛的你們
鈺涵 2012 / 08 / 24
中文摘要
尋常性痤瘡（acne vulgaris）又稱青春痘，除了好發於青春期男女外，在成
年人也常見。其致病因子複雜，包括過多皮脂分泌（sebaceous hyperproductiom）
、
毛囊過度角化（follicular hyperkeratinization）
、氧化壓力、發炎反應（periglandular
dermal inflammation）和男性賀爾蒙都可能造成尋常性痤瘡的發生。痤瘡發展過
程中痤瘡桿菌（P. acnes）被認為扮演重要的角色，P. acnes 在阻塞的皮脂腺內大
量繁殖會吸引單核球細胞（monocytes），而藉由活化單核球細胞與角質細胞的
toll-like receptor，啟動其下游的訊息傳遞路徑使發炎介質產生而誘導痤瘡發炎；
另外 P. acnes 誘發產生活性氧分子（ROS）也參與發炎反應。中鏈脂肪酸包括
caproic acid （C6:0）, caprylic acid （C8:0）, capric acid （C10:0）和 lauric acid
（C12:0）。本研究目的為:以 THP-1 細胞以及皮脂腺細胞 SZ95，探討中鏈脂肪
酸對於痤瘡桿菌誘導發炎反應的影響。capric acid 於本實驗室先前的研究結果顯
示可降低 in vitro 實驗中以 P. acnes 誘導 THP-1 monocytes 產生的促發炎激素 IL-8,
TNF-IL-1，而將 P. acnes 與 capric acid 注射進 ICR 小鼠耳朵的 in vivo 實驗結

果顯示可以減少小鼠耳朵因 P. acnes.造成的腫脹與重量。
以 broth dilution method 實驗的結果發現 capric acid 在高濃度時能抑制痤瘡桿
菌生長；三種中鏈脂肪酸皆能夠減少 P. acnes 刺激 THP-1 monocytes 所產生的促
發炎細胞激素 TNF-, IL-8,IL-1蛋白質和 mR。capric acid IC50 為 22.9 M，
以 capric acid 作為後續機制探討的樣品，結果顯示 capric acid 在 25, 50, 100 M，

皆可以顯著降低 p38, ERK, JNK, p65 蛋白質磷酸化的表現；於 in vivo 抗發炎實驗
中顯示，三種中鏈脂肪酸能夠抑制 P. acnes 誘發的發炎反應與耳朵腫脹現象。
另外，花生四烯酸（AA）會使 P. acnes 誘使 THP-1 產生的 IL-8 增加，且也
同時增加皮脂腺脂質的堆積。capric acid 則會降低單獨 P.acnes 和 AA+P.acnes 產
生的 IL-8；另外 SZ95 預處理 AA 後，AA+P.acnes 組產生的 IL-8 高於單獨 AA 組
別；capric acid 會降低單獨 P.acnes 和 AA+P.acnes 產生的 IL-8。
關鍵字: 痤瘡、痤瘡桿菌、中鏈脂肪酸、發炎
I
Abstract
Acne vulgaris is a common skin disease involving pilosebaceous follicle. The
pathogenesis of acne vulgaris is multifactorial, including increased sebum production,
comedogenesis and Propionibacterium acnes proliferation. P. acnes plays an
important role not only in the process of inflammation but also in the formation of
comedones. Previous studies have shown that P. acnes is one of the most important
factors in acne. P. acnes activate toll-like receptor-2 on monocytes, which triggers the
release of proinflammatory mediators（TNF-, IL-8）, some studies have found that
reactive oxygen species (ROS) will participate in the progression of acne. Medium
chain fatty acid（MCFA）including caproic acid （C6:0）, caprylic acid （C8:0）, capric
acid （C10:0）和 lauric acid （C12:0）.
We investigated the effect of MCFA on inflammation caused by P. acnes.Human
monocytes THP-1 cells and SZ95 were treated with P. acnes alone or in the presence
of MCFA.Our previous studies have shown capric acid, lauric acid reduced P. acnes
would activate monocytes to secrete pro-inflammatory cytokines.In addition, capric
acid, lauric acid reduced P. acnes-induced inflammation of mice ear and then showed
in vivo anti-inflammatory activity.
Our results showed capric acid effectively inhibited the growth of P. acnes.
Capric acid, caprylic acid and caproic acid potently suppressed the production of
pro-inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor-, interleukin (IL)-8, and
IL-1 by human monocytes THP-1 cells stimulated with P. acnes. The IC50 of capric
acid was 22.9 M, we further evaluated the anti-inflammatory mechanism of capric
acid, the results showed that significantly inhibited P. acnes-enhanced
phosphorylation of p38, ERK, JNK and p65.MCFA reduced P. acnes-induced
inflammation of mice ear and showed in vivo anti-inflammatory activity.
Arachidonic acid（AA） significantly enhanced IL-8 by P. acnes-stimulated
THP-1 cells, and AA stimulated lipogenesis of SZ95 sebocyte. Capric acid reduced P.
acnes-induced and AA+ P. acnes-induced IL-8 expression.In addition, pretreatment
with AA stimulated enhanced IL-8 by P. acnes- stimulated SZ95 sebocyte, Capric acid
reduced P. acnes-induced and AA+ P. acnes-induced IL-8 expression.
Key words: acne, P. acnes, inflammation, medium chain fatty acid
II
目錄
第一章緒論 ............................................................................................................................. 1
一、研究動機 ........................................................................................................................... 1
二、研究目的 ........................................................................................................................... 2
第二章文獻探討 ..................................................................................................................... 3
第一節皮膚結構 ..................................................................................................................... 3
第二節痤瘡的致病機制 ....................................................................................................... 6
壹、痤瘡的成因 ............................................................................................................... 6
貳、痤瘡桿菌與發炎反應 ............................................................................................. 10
一、 Toll-like receptors (TLRs) ..................................................................................... 11
二、痤瘡桿菌誘導之促發炎細胞激素 ....................................................................... 13
三、 Arachidonic acid signaling pathway ...................................................................... 13
第三節痤瘡的治療 ............................................................................................................... 16
第四節實驗材料 ................................................................................................................... 17
一、脂肪酸 ................................................................................................................... 17
第三章材料與方法 ............................................................................................................... 19
第一節研究材料 .................................................................................................................... 19
一、實驗架構 ............................................................................................................... 19
二、藥品與試劑 ........................................................................................................... 20
三、儀器設備與耗材 ................................................................................................... 24
四、細胞培養 ............................................................................................................... 25
五、細菌培養 ............................................................................................................... 27
第二節實驗方法 .................................................................................................................... 28
一、抑菌實驗 ............................................................................................................... 28
二、細胞存活率測定 (MTT) ...................................................................................... 28
三、抗發炎活性評估 ................................................................................................... 29
III
四、促發炎細胞激素 mRNA 表現量 .......................................................................... 30
五、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced p-38, ERK, JNK 磷酸化之影響 .................. 33
六、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NF-κB)活化分析 ........................................... 35
七、動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估) ................................................................... 36
八、統計分析 ............................................................................................................... 40
第四章結果 ........................................................................................................................... 41
第一節中鏈脂肪酸之抑菌與抗發炎作用 ............................................................................. 41
壹、抑菌實驗 ............................................................................................................... 41
貳、細胞存活率測定(MTT) ........................................................................................ 43
第二節評估中鏈脂肪酸的抗發炎能力 ............................................................................... 44
壹、In vitro 抗發炎活性評估 ........................................................................................ 44
貳、In vivo anti-inflammatory effect .............................................................................. 53
參、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced MAPK pathway and NF- B 磷酸化之影響 55
第三節 capric acid 對 pretreated AA 刺激 P. acnes- induced IL-8 之影響 .......................... 61
第四節脂質堆積 ................................................................................................................. 66
壹、細胞存活率測定(MTT) .......................................................................................... 66
貳、中鏈脂肪酸之 SZ95 脂質堆積的影響................................................................... 67
參、AA 之脂質堆積的影響 .......................................................................................... 68
第五章討論 ........................................................................................................................... 69
一、抗發炎活性與作用機制 ................................................................................................. 69
二、 In vivo 抗發炎活性評估 ................................................................................................ 79
三、總結 ................................................................................................................................ 81
第六章參考文獻 ................................................................................................................... 82
第七章附錄(動物實驗同意書) ............................................................................................ 89
IV
圖目錄
圖 2-1 皮膚構造解剖圖………………………………………………………… 3
圖 2-2 P. acnes 藉由活化 IGF-1/IGF-1R System 而促使角質增生和皮脂分
泌…………………………………………………………………………. 7
圖 2-3 P. acnes 誘使痤瘡發炎機制…………………………………………….. 8
圖 2-4 Toll-like receptor signaling………………………………………………. 12
圖 2-5 Arachidonic acid 代謝產生 eicosanoids 的途徑和 eicosanoid 的活化… 14
圖 2-6 LTB4 藉由 CpG signaling 誘使單核球釋出 cytokine 的可能機制……… 15
圖 4-1 Capric acid, caprylic acid, Caproic acid 抑制 P. acnes 生長結果………. 41
圖 4-2 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 抑制 P. acnes 生長效果………. 42
圖 4-3 以 MTT 方法測試不同濃度之 caprylic acid 和 caproic acid 處理 THP-1
cell 之細胞存活率……………………………………………………….. 43
圖 4-4 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細
胞之 IL-8 cytokines 生成………………………………………………… 45
胞之 TNF- cytokines 生成…………………………………………… 46
胞之 IL1-1 cytokines 生成……………………………………………. 47
圖 4-7 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 P.acnes 刺激 THP-1 產生
IL-8 mRNA 的影響……………………………………………………... 49
TNF- mRNA 的影響………………………………………………….. 50
IL-1mRNA 的影響……………………………………………………. 51
圖 4-10 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1
細胞之 IL-8 生成………………………………………………………... 52
圖 4-11 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 P. acnes 引起小鼠耳朵腫脹與
重量變化之影響…………………………………………………………. 54
圖 4-12 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 p38 蛋白質磷酸化表現量之影
響…………………………………………………………………………. 56
圖 4-13 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 ERK 蛋白質磷酸化表現量之
影響………………………………………………………………………. 57
V
圖 4-14 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 JNK 蛋白質磷酸化表現量之影 58
響…………………………………………………………………………
圖 4-15 capric acid, lauric acid NF-κB 分析結果………………………………… 60
圖 4-16 pretreated AA 對 P. acnes 刺激 THP-1 產生 IL-8 的影響………………. 62
圖 4-17 capric acid 對 AA 預處理的 THP-1 受 P.acnes, AA 刺激產生 IL-8 的
影響……………………………………………………………………… 64
圖 4-18 capric acid 對 AA 預處理的 SZ95 受 P.acnes, AA 刺激產生 IL-8 的影
響…………………………………………………………………………. 65
圖 4-19 以 MTT 方法測試不同濃度之 capric acid, caprylic acid, caproic acid 處
理 SZ95 cell 之細胞存活率……………………………………………… 66
圖 4-20 比較 LA 與 capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 SZ95 脂質堆積影
響…………………………………………………………………………. 67
圖 4-21 AA 對 sz95 脂質合成的影響……………………………………………. 68
圖 5-1 LPS-induced RAW264.7 細胞的發炎現象……………………………… 70
圖 5-2 模式識別受體和先天性免疫訊息調控…………………………………. 72
圖. 5-3 Proposed mechanisms of velutin in inhibiting TNF-α and IL-6
production in macrophages.……………………………………………… 74
圖 5-4 細胞內 5-LOX 活化與 AA 代謝………………………………………… 77
VI
表目錄
表 2-1 Propionibacterium acnes 於痤瘡致病機制中的作用機制相關文
獻…………………………………………………………………. 9
表 2-2 痤瘡的重要發展及其治療………………………………………. 9
表 2-3 中鏈脂肪酸………………………………………………………. 17
表 4-1 Capric acid, caprylic acid, Caproic acid 抑制 P. acnes 生長效
果………………………………………………………………….. 42
VII
第一章緒論
一、研究動機
尋常性痤瘡（acne vulgaris）俗稱青春痘是一個非常常見的皮膚疾病，是毛
囊皮脂腺（pilosebaceous follicle）的慢性發炎疾病，通常開始於青少年時期，一
般好發在臉部、背部與和胸部。痤瘡並不會對生命造成危害，但是過度嚴重的痤
瘡會造成患者心理、身體與社會觀感的問題。
尋常性痤瘡病發生的位置在毛囊皮脂腺的毛囊（pilosebaceous follicle），當
毛囊中皮脂分泌增加以及不正常的角質化，首先會形成無臨床症狀的微小粉刺
（microcomedone），接著發展成開放性或是閉鎖性粉刺（open and closed
comedones）以及發炎的病變像是丘疹（papules）
、膿皰（pustules）
、結節（nodules）
和囊腫（cyst） (Olutunmbi et al., 2008)。
目前對於痤瘡之發病機制並不是完全清楚，但主要可歸因於幾種因素:皮脂
分泌增加（increased sebum production）
、皮脂性質的改變（alteration of the quality
、皮脂類固醇的調節（regulation of cutaneous steroidogenesis）
of sebum lipids）、雄
性激素的刺激（androgen activity）、毛囊過度角質化（follicular
hyperkeratinization）、增生的痤瘡桿菌作用（action of Propionibacterium acnes）
和發炎反應(Zouboulis et al., 2008)。正常皮膚毛囊中的革蘭氏陽性厭氧菌---痤瘡
桿菌，會誘發產生免疫反應，進而加重痤瘡發炎的情況，被認為在痤瘡的發炎病
程中扮演重要的角色(Grange et al., 2010)。
臨床上使用抗生素治療痤瘡是一個常見的的方法，藉由減少皮膚毛囊中的痤
瘡桿菌，達到改善痤瘡的效果，但大量使用抗生素，使得增加痤瘡桿菌的抗藥性
(Espersen, 1998)，因此開發非抗生素類的治療藥物是一個漸受重視的議題。
皮膚表面的游離脂肪酸（free fatty acids, FFAs）
，具有自我抗菌防禦功能，能
夠對抗微生物增殖；有多種游離脂肪酸已經被證實具有抗菌的特性，能夠對抗一
些革蘭氏陽性菌。游離脂肪酸中的lauric acids（C12:0）已被證實是最有效的抗菌
飽和脂肪酸(Wille & Kydonieus, 2003)，在in vitro的實驗中也具有抑制P. acnes生長
1
的能力，並且在in vivo實驗中對於P. acnes誘發的發炎反應也具有抑制的效果
(Nakatsuji et al., 2009)。
二、研究目的
本研究欲探討中鏈脂肪酸capric acid, caprylic acid, hexanoic acid是否具有抑制

痤瘡桿菌生長的作用，與對於P. acnes誘導THP-1 monocytes產生之促發炎介質的
抑制作用，更進一步探討三種中鏈脂肪酸降低促發炎細胞激素之作用機轉；並將
P. acnes注射至ICR小鼠耳朵，測試樣品in vivo抗發炎效果。
2
第二章文獻探討
第一節皮膚結構
皮膚為身體最大的器官，其表面積大約 2 平方公尺，主要功能為抵抗外來病
原菌的侵襲和防止水份散失 (Calleja-Agius, Muscat-Baron, & Brincat, 2007) 。皮
膚由外到內可分為三層:表皮層 (epidermis)、真皮層 (dermis)、皮下組織
(subcutaneous layer)。皮膚結構的解剖圖如圖 2-1 所示 (Tortora, 2005)。
圖 2-1 皮膚構造解剖圖(TORTORA, 2005)
一、表皮(epidermis)
表皮層是由角質化的鱗狀上皮所組成，主要包含四種細胞型態:角質細胞
（Keratinocytes）、黑色素細胞（Melanocytes）、蘭格罕細胞（Langerhans cell）
3
和麥克爾氏細胞（Merkel cell）。角質細胞大約為表皮細胞的 90%，角質細胞會
產生角質素，形成強韌的纖維蛋白可以保護皮膚和皮下組織對抗微生物、物理性
與化學性的傷害。黑色素細胞大約為表皮細胞的 8%，由胚胎發展的神經脊細胞
（neural crest cell）分化而來，會產生黑色素。黑色素可以決定皮膚顏色並保護
皮膚免於紫外線的傷害。蘭格罕氏細胞由紅骨髓移動到表皮層，於表皮細胞中占
比較小的比例，參與免疫反應並幫助皮膚抵抗外來微生物，其容易受紫外線而損
壞。麥克爾氏細胞是表皮中數量最少的細胞，於表皮的最深層，與皮膚的觸覺有
關。
表皮層由內至外依序分為基底層（stratum basale）、棘狀層（stratum
、顆粒層（stratum graunlosum）
spinosum）、以及角質層（stratum corneum）四層。
其中基底層為單層細胞所構成，含幹細胞（stem cells）會不斷分化產生新的角質
細胞，新細胞漸漸往皮膚上層移動，在棘狀層中角質細胞會開始出現分化現象，
細胞內的細胞質慢慢被角質素取代，隨著細胞繼續由顆粒層向外移行，死亡的角
質細胞形成角質層，是身體最主要的屏障，持續被推向皮膚表面，最後形成皮屑
脫落。
二、真皮層 (dermis)
真皮層是由緻密不規則排列的結締組織（dense irregular arranged connective
tissue）所組成，分別是彈力纖維（elastin），膠原蛋白（collagen）及網狀纖維
（reticulum fibers）所構成，與皮膚之彈性有密切關係。存在真皮層中的細胞包
括纖維母細胞（fibroblast）、巨噬細胞（macrophage）與脂肪細胞（adipocyte）。
真皮層包括神經末梢、汗腺、皮脂腺、毛囊以及血管。
真皮層由外而內可分成乳頭狀層（papillary dermis）和網狀層（reticular
dermis）。乳頭層為真皮層與表皮接觸之突出之乳頭體及乳頭體以下部份。除了
結締組織之外，還含有特殊的神經網路與神經末梢，目的是傳遞感覺訊息，如溫
度、痛覺、壓覺以及觸覺。皮膚的腺體包括汗腺（sweat glands）和皮脂腺（sebaceous
glands）。汗腺可以幫助調節溫度；皮脂腺製造豐富的皮脂，留於皮膚表面以保
持皮膚濕潤，毛髮潤澤，且有保護作用(Tortora, 2005)。血管可提供皮膚營養素並
調節體溫。網狀層的膠原蛋白及彈性纖維使皮膚強韌（strength）、可伸展
（extensibility）並且具有彈性（elasticity）。
4
皮脂腺(sebaceous gland)
人類皮脂腺主要可分泌皮脂，包括飽和與不飽和的游離脂肪酸、甘油酯類、
固醇類及角鯊烯等脂質，可以幫助保濕、維持水分與潤滑皮膚。但過多皮脂分泌、
毛囊過度角化（follicular hyperkeratinization）、氧化壓力、發炎反應和男性賀爾
蒙都可能造成尋常性痤瘡（acne vulgaris）的發生(Schuster et al., 2011)。
三、皮下組織 (subcutaneous layer)

在真皮層的下方是由疏鬆結締組織（loose connective tissue）組成的皮下層
（subcutaneous layer），皮下層含有多量的脂肪組織，具有彈性，能夠緩衝外來
衝擊，達保護體內組織功能。
5
第二節痤瘡的致病機制
壹、痤瘡的成因
尋常性痤瘡的發生被認為是毛囊皮脂腺（pilosebaceous follicles, PSU）慢性

發炎所引起。痤瘡發生的位置在毛囊皮脂腺單位，於臨床上可分為皮脂溢
（seborrhoea）
、非發炎與發炎病變；典型痤瘡的發生，首先臉部油脂會生成增加
和形成無臨床症狀的微小粉刺（microcomedone）
，接著發展成開放性或是閉鎖性
粉刺（open and closed comedones）以及發炎的病變像是丘疹（papules）、膿皰
（pustules）
、結節（nodules）和囊腫（cyst） (Olutunmbi, et al., 2008)。痤瘡好發
於青少年時期(15~17歲)，一般好發在臉部、頸部、背部和胸部(Williams et al.,
2012)。
典型痤瘡的發生，首先臉部油脂會生成增加和產生深層粉刺，接著會造成發
炎性的損傷（inflammatory lesions）
。早發性痤瘡（early-onset acne）
，通常發生於
12歲以前，容易引起發炎，可能是因為此時身體還無法產生足夠的皮脂來負荷大
量的痤瘡桿菌(Friedlander et al., 2010)。早發性粉刺痤瘡（early onset of comedonal
acne）可能與日後發生嚴重痤瘡有很大關係，且具家族遺傳性(Ghodsi et al.,
2009)。月經週期、情緒、壓力都可能造成痤瘡。尋常性痤瘡是一種慢性疾病，
通常會持續好幾年。
目前對於痤瘡之發病機制並不是完全清楚，但主要可歸因於幾種因素:皮脂
分泌增加（increased sebum production）
、皮脂性質的改變（alteration of the quality
、皮脂類固醇的調節（regulation of cutaneous steroidogenesis）
of sebum lipids）、雄
性激素的刺激（androgen activity）、毛囊過度角質化（follicular
hyperkeratinization）、增生的痤瘡桿菌作用（action of Propionibacterium acnes）
和發炎反應(Zouboulis, et al., 2008)。痤瘡桿菌（P. acnes）是一種革蘭氏陽性厭氧
菌（Gram-positive anaerobic bacterium）
，屬皮膚正常菌叢之一，生長在毛囊的皮
脂腺，會隨著皮脂的分泌移動到皮膚的表面。P. acnes藉由代謝皮脂中的三酸甘
油酯（triglyceride fraction）而存活，於青春期時大量皮脂分泌，會使得P. acnes
大量繁殖。由於嚴重痤瘡會使人在心理、生理、和社會都感到不舒服，所以對於
6
痤瘡形成、預防痤瘡的相關研究發展已經超過好幾十年，對於痤瘡的主要成因普
遍認為與皮膚表面P. acnes聚集在上皮毛囊相關，主要是P. acnes所產生細胞外酵
素（extracellular enzymes）會分解組織（host tissues）
，啟動免疫反應機制，引起
發炎(Nakatsuji et al., 2008)。一開始PSU發生不正常的型態變化而形成微小粉刺，
當伴隨雄性激素（androgen）的分泌增加，會導致皮脂腺細胞（sebocyte）增生
與分化使皮脂分泌增加（sebaceous hyperplasia），此時會促進毛囊中微生物增殖
（microbial proliferation），特別是P. acnes；大量的P. acnes會刺激角質增生與增
加皮脂分泌(Isard et al., 2011)，並會活化巨噬細胞與嗜中性白血球造成趨化作
用，並經由CD4+T cell的調控啟動發炎反應，增加角質細胞促發炎激素的產生
(Gollnick, 2003)，其中IL-1的增加會更加促使毛囊角質化，使得P. acnes更快速

增生。
圖2-2 P. acnes藉由活化IGF-1/IGF-1R system而促使角質增生和皮脂分泌。(Isard,

et al., 2011)
一些研究為了檢視P. acnes與痤瘡之間的關係，將P. acnes 注射入皮膚中，

結果發現P. acnes會誘發皮膚的發炎反應，因此，青春痘的生成被認為與痤瘡桿
菌有顯著的相關，特別是和由粉刺變成發炎性病灶的過程有極密切的關係(Kim,
7
2005b)；一直以來臨床上使用抗生素來治療痤瘡，但抗生素的濫用使得P. acnes
的抗藥性增加(Coenye et al., 2007)，若P. acnes躲過免疫毒殺反應而存活下來的
話，往往會造成痤瘡治療失敗。P. acnes所引發的免疫發炎反應被認為是重要的
致病因子(Farrar & Ingham, 2004) 。
圖2-3 P. acnes誘使痤瘡發炎機制(CM Tahir, 2010)
8
表2-1 Propionibacterium acnes於痤瘡致病機制中的作用機制( mechanism of
action)相關文獻資料(Dessinioti & Katsambas, 2010)
 P.acnes 會產生 lipases, proteases, hyaluronidases 和嗜酸性白血球趨化因子。

 P.acnes 會誘使單核球釋出促發炎細胞激素 TNF-, IL-1, IL-8 在痤瘡病人身上
(Jeremy et al., 2003)。
 P.acnes 經由 TLR-2-dependent pathway 引發痤瘡致病機制，誘使單核球釋出細胞激
素(IL-12、IL-8)(Kim et al., 2002)。
 將人類角質細胞與 P.acnes 共培養會增加 TLR-2, TLR-4, MMP-9 的表現(Jugeau et al.,
2005)。
 P.acnes 會藉由角質細胞的 TLR-2, TLR-4 誘發 IL-8, -defensin-2 的表現(Nagy et al.,
2005)。
 P.acnes 在 In vitro 實驗中會促使角質細胞生長(Jugeau, et al., 2005)。
 P.acnes GroEL(一種熱休克蛋白)會使角質細胞增加產生促發炎細胞激素(Graham et
al., 2004)。
 P.acnes 可能也與細微粉刺形成有關(Jarrousse et al., 2007a)。
表2-2 痤瘡的重要發展及其治療(Williams, et al., 2012)
 痤瘡是一種慢性疾病，會持續到成年
 痤瘡的產生與心理疾病有很大關係
 毛囊角質化和P. acnes的聚集所引起的免疫相關發炎反應
 痤瘡與飲食的相關還未清楚
 比較研究結果，可以幫助降低許多現行住療方針開始與維持治療
 長期使用口服抗生素可能增加細菌抗藥性
 口服A酸能有效治療痤瘡，但它具有些許致畸作用和其他副作用
9
貳、痤瘡桿菌與發炎反應
皮膚是人體最大器官，也是抵禦環境的初級屏障，當皮膚受傷造成皮膚屏障
受損，可能會進一步讓致病微生物入侵，若這些病原體在體內繁殖，則會造成人
體產生疾病。因此，為了抵禦微生物病原體，除了皮膚的屏障功能之外也需要完
整的免疫系統共同防護。人體的防禦系統有三道防線，第一道：先天性免疫(innate
immunity)、第二道防線：適應性免疫(adaptive immunity)與第三道防線：自體免疫
(autoimmunity)，第一道以吞噬細胞為主的反應屬於非特異性防禦，而第二道與
第三道防線是經抗原呈現給T cell與B cell後活化，所引發的特異性防禦(Kupper &
Fuhlbrigge, 2004)。
對於環境的第一道防線是皮膚、黏膜，但若病原體通過受損皮膚進到體內，
第二道防線就會啟動-即適應性免疫，除嗜中性白血球、單核球與巨噬細胞開始
吞噬、清除致病的病原體外，受傷組織也會釋出一些化學物質引起發炎反應；儘
管發炎是正常的反應，但是過度的發炎反應會造成慢性發炎，會促進發炎調節因
子的產生並損傷組織而加重發炎的情況。在痤瘡中，P. acnes會誘發皮膚產生保
護的抗菌反應以消滅P. acnes，但是當發炎反應過度且失衡後，會因為釋出的多
種發炎介質而增加發炎的情況，造成更嚴重的痤瘡(Kupper & Fuhlbrigge, 2004)。
目前已經知道P. acnes為痤瘡的致病因子，因此，在發炎型痤瘡中P. acnes的
治療便成為主要目標。P. acnes可經由數種機制引起毛囊上皮損傷而進一步引起
發炎反應。P. acnes會分泌酵素lipase,protease, hyaluronidases，並造成組織受損與
發炎(Hoeffler, 1977)。Lipase會促使皮脂中游離脂肪酸的生成，引發病理反應像
是刺激皮膚發炎、生成粉刺、也會產生嗜中性白血球趨化因子(neutrophil
chemotactic factors)吸引嗜中性白血球(neutrophils)聚集至毛囊，而嗜中性白血球
能夠吞噬毛囊中的P. acnes或是產生可毒殺P. acnes的活性氧分子(Reactive oxygen
species, ROS)，加上其所釋放的水解酶(hydrolases)會分解毛囊組織，與過量產生
的ROS共同促使發炎反應惡化。另外，P. acnes藉活化Toll-like receptors(TLRs)來
啟動先天性免疫系統，誘使促發炎細胞激素(proinflammatory cytokines)的合成，
包括interleukin (IL)-1β, IL-8, IL-12 and tumor necrosis factor- (TNF-)(Kim,

2005a; Nagy et al., 2006)。以下將分別討論痤瘡桿菌誘發產生的發炎反應與痤瘡
10
形成之間的關連性。
一、 Toll-like receptors (TLRs)

Toll-like receptors (TLRs)為穿透細胞膜的蛋白質，是一種模式識別受體
(pattern recognition receptors, PRRs)，能夠辨識微生物的病原相關分子模式
(pathogen-associated molecular patterns；PAMPs)，參與多種對抗致病微生物的宿
主防禦反應(Iwasaki & Medzhitov, 2004)。TLR細胞外的部份是由leucine-rich
repeats 所組成，而細胞內部則和IL-1 receptor形成homology。當暴露在微生物
(ligands) 下，會活化TLRs，使宿主產生發炎反應。
TLR會啟動訊息傳導而活化先天性免疫系統(innate immune system)，主要與
早期發炎反應有關，像是monocyte/macrophage的吞噬作用(phagocytosis)與補體活
化(complement activation)；透過辨識外來抗原而啟動適應性免疫系統(adaptive
immune system)，使T淋巴細胞與B淋巴細胞(T and B lymphocytes)產生與增殖，
進而誘發抗體調控免疫反應。TLR會活化先天性免疫系統，進而影響到後續的後
天性免疫系統。
目前已知有十種TLRs，每一種都會辨識不同形式的ligands，例如：TLR2能
辨認細菌的peptidoglycan (PGN)，有研究指出，分離P.acnes的各種不同組成
(fractions)，只有細胞壁peptidoglycan的部分能夠顯著增加細胞表面TLR2的表現
(Jarrousse et al., 2007b)；TLR3所能辨識的ligand為double-stranded RNA
（dsRNA）；而TLR4能辨認革蘭氏陰性菌之內毒素(LPS)。
當LPS與TLR4結合，會使內部的domain誘發MyD88-dependent pathway或
MyD88-independent pathway，再經由路徑中的轉接者（adapters）TRIF和TRAF
將訊息放大並傳遞下去(Pitha, 2004)，接著活化IB kinase (IKK) complex，導致IB
的磷酸化及降解，當IκB降解之後，轉錄因子NF-B即移動到細胞核內，調控許
多與免疫反應有關基因的表現，包括cytokines, chemokines, antimicrobial peptides
的合成，活化宿主的免疫細胞與抗菌的防禦機制(圖2-4)(Miller & Modlin, 2007)。
11
近年來的研究指出P. acnes藉由活化毛囊周圍皮脂腺巨噬細胞表面的TLR2進
一步活化下游的NF-B，誘發cytokine的反應。另外，在人類初代單核球細胞
(primary human monocytes)中P. acnes會誘導IL-12和IL-8的產生，而這些cytokine
的生成會因為anti-TLR2-blocking antibody而被抑制(Kim, 2005b)。這些研究都證
實P. acnes可藉由活化TLR2誘導促發炎細胞激素的合成。
圖 2-4 Toll-like receptor signaling.
12
二、痤瘡桿菌誘導之促發炎細胞激素
P. acnes活化先天性免疫細胞（innate immune cells）像是monocyte/macrophage
而誘導發炎反應，並分泌促發炎細胞激素，包括TNF-α, IL-1β, IL-8；這些由P.
acnes所誘導的促發炎細胞激素會造成血管及皮膚黏附分子（adhesion molecules）
的表現(Vowels et al., 1995)。其中，經由TLR2產生的IL-8在痤瘡的致病機轉中扮
演著重要的角色，IL-8是一個已知的嗜中性球化學趨化因子（chemoattractant），
會吸引嗜中性白血球聚集到毛囊皮脂線單位，而嗜中性球是導致發炎的病灶形成
的原因(Kim, 2005b)。P. acnes導致痤瘡的發炎，是透過活化TLR2的訊息傳遞路
徑，經由MAPK路徑影響IB kinase（IKK）-NF-B，進而影響促發炎相關基因
的表現。過去研究發現，nicotinamide可以藉向下調控MAPK與IB路徑，而降低
P. acnes誘導產生的IL-8，有助改善治療痤瘡(Grange et al., 2009)。
三、 Arachidonic acid signaling pathway
花生四烯酸（Arachidonic acid; AA）是屬於ω-6必需脂肪酸。當組織暴露

在不同的生理、病理刺激下（例如:生長因子、賀爾蒙或細胞激素），AA藉由磷
脂質酶A2（phospholipase A2）作用而自細胞上的磷脂產生，經代謝成不同的
eicosanoids。
現已知AA主要經由三種不同的代謝路徑，產生多種不同代謝物，分別是:
P-450 epoxygenase, cyclooxygenase（COXs）, lipoxygenases（LOXs）(圖2-5)。
在代謝過程中會產生eicosanoids，包含前列腺素（prostaglandin, PG）、前列
凝素（thromboxanes）
、白三烯（leukotrienes）與其他氧化衍生產物，會參與調控
發炎反應；脂質過氧化產物也會誘使前發炎物質cytokines產生，且也可能活化
peroxisome proliferators-activated（PPARs）。
COXs可將花生四烯酸代謝成前列腺素（PG），於不同組織經不同酵素作用
再轉變為PGI2 、血栓素A2（thromboxane A2; TXA2）、PGE2或PGF2α。依不同的
雙鍵數而有PGE1、PGE2和PGE3：PGE1 、PGE3具有抗發炎反應之作用；相反地，
PGE2被證實為促發炎因子(Zhang et al., 2006)，在 in vivo 實驗中顯示，小鼠增加
表現cyclooxygenase-2（COX2）和PGE2，會使得皮脂腺增生與提高皮脂分泌
13
(Neufang et al., 2001)。另外，在 in vitro實驗中顯示，COX2的表現可能會調控
PPAR-的活化。而有更多的實驗也證實，脂質的過氧化會使PPAR-活化且也會
誘使皮脂腺增加皮脂分泌(Makrantonaki & Zouboulis, 2007)。而COX-2的表現會誘
發macrophages產生IL-6(Bagga et al., 2003)會促使發炎反應之發生。PGE1和PGE2
間呈現一微妙的調節機轉。
Membrane phospholipids
Phospholipase A2
Arachidonic acid
5-Lipoxygenase Cyclooxygenase(COX-1, COX-2)
Leukotriene A4 Prostaglandin H2
hydrolase
LTB4 LTC4 PGE2 TXA2 PGI2

Biological activities
Promotes secretion of:
IL-1, 2, 4,
5, 6, 8, 10,
TNF-IFN
圖2-5 Arachidonic acid代謝產生eicosanoids的途徑和eicosanoid的活化(摘自

Cannon, 2005)
AA也會經由另一路徑代謝，此為脂氧化作用(lipoxygenation)，經代謝後生
成hydroperoxy eicosatetranoic acid compounds（HPETEs）, hydroxyeicosa tetranoic
acids（HETEs）及leukotriene A4 （LTA4）
。LTA4會經不同酵素作用轉變成LTB4、
LTC4或LTE4等介質，例如:在嗜中性白血球及某些吞噬細胞會受到LTA4 hydrolase
催化而代謝成leukotriene B4 （LTB4）
。LTB4會使白血球聚集在內皮細胞上，會趨
化嗜中性白血球（neutrophils）、嗜伊紅性白血球（eosinophils）及單核球
（monocytes）到局部發炎組織來，同時會促進pro-inflammatory cytokines分泌、
惡化發炎反應。於過去研究中發現，LOX產物可能會促使角質過度增生，而使皮
膚產生發炎疾病(Yokomizo et al., 2001)。目前已有研究發現LTB4在痤瘡發炎過程
14
確實扮演重要的角色。另有研究發現，在病人痤瘡病灶5-LOX, COX-2活性上升，
此外，也發現皮脂腺的IL-6和IL-8的表現量也提高(Alestas et al., 2006)。若是給予
5-LOX inhibitor則發現可以降低促發炎激素產生和皮脂的合成(Zouboulis et al.,
2005)。
LBT4藉由CpG-mediated intracellular signaling路徑，活化JNK, p38，促使單
核球和neutrophils的cytokines （TNF, IL-8）分泌量增加 (圖2-6) (Gaudreault &

Gosselin, 2009)。人類THP-1 cell有分泌LTB4的能力也被認為具有CpG-mediated機
制(Gaudreault and Gosselin, 2009)。若以5-LOX inhibitor（MK886）和PLA2 inhibitor
（AACOCF3）處理SZ95 sebocytes，結果顯示均具降低LTB4和PGE2濃度的作用，
並且會顯著降低SZ95的IL-6、IL-8表現，顯示這些eicosanoids可能與
pro-inflammatory cytokines（IL-6, IL-8）有交互作用。
由上述研究中，推測P. acnes可能與AA pathway產物- LTB4，有加乘作用共

同促進cytokines分泌，最後導致痤瘡發炎病灶發生。
圖 2-6 LTB4 藉由 CpG signaling 誘使單核球釋出 cytokine 的可能機制。(Gaudreault

& Gosselin, 2009)
15
第三節痤瘡的治療
痤瘡可依嚴重程度分為輕度、中度及嚴重這三種程度，並給予適當的治療。
治療痤瘡的方法除了可加強皮膚清潔外，藥物使用可分為口服和外用兩大類。依
據藥物使用途徑、皮膚痤瘡嚴重程度不同，治療的藥物與方式也有些微差異，以
下是針對患部嚴重程度及給予的治療之介紹：
一、粉刺:塗抹外用杜鵑花酸(Azelaic, Tretinoin, Tazarotere)及維它命 A 酸，具分解
粉刺、抑制皮質腺分泌並促進表皮細胞代謝更新。
二、輕度痤瘡﹕一般單一藥品為外用抗生素(Clindamycin）及 fusidic acid 或過氧
化製劑(Benzoyl Peroxide）
，或兩種藥品合併使用，可以收斂、溶解粉刺作用，且
可減輕發炎並抑制痤瘡桿菌的滋生。
三、中度痤瘡:口服抗生素為主，使用四環黴素、doxycycline、erythromycin、
minocycline，可減少毛囊內細菌，降低游離脂肪酸量及發炎反應。
四、重度痤瘡:以口服異維它命 A 酸(Isotretinoin)為主，治療中度痤瘡非常有效，
針對嚴重發炎且口服抗生素治療無效情形下服用。
五、其他類型的痤瘡:口服類固醇 corticosteroid 和 isotretinoin 治療臉部膿皰。
口服 A 酸，可以矯正不正常毛囊的角化現象，可改善毛孔阻塞。另外，還
可以抑制皮脂分泌，抑制細菌增生，並減緩發炎反應的作用。研究發現 all-trans
retinoic acid 能夠減少因 P. acnes 誘發產生的促發炎細胞激素，如 IL-12 與
TNF-α，藉由抑制單核球細胞（monocyte）表面的 TLR2(Jalian et al., 2008)。但初
期使用 A 酸很多患者會有局部病灶紅腫、脫皮的現象，這時須在醫師指示下配
合其它藥物使用改善。皮膚表面若是缺乏 MUFA，會使傷口較難癒合，同時也會
增加皮膚表面革蘭氏陽性菌的生長(Zouboulis et al., 2011)。皮膚表面具有自我抗
菌防禦功能，其中游離脂肪酸（free fatty acids, FFAs）與抗菌胜肽（antimicrobial
peptides）扮演部份角色，能夠對抗微生物增殖。游離脂肪酸中的 lauric acids
（C12:0）在皮脂中雖然含量占少數，但已被證實是最有效的抗菌飽和脂肪酸
(Wille & Kydonieus, 2003)，在 in vitro 的實驗中也具有抑制 P. acnes 生長的能力，
並且在 in vivo 實驗中對於 P. acnes 誘發的發炎反應也具有抑制的效果(Nakatsuji,
et al., 2009)。
16
第四節實驗材料
一、脂肪酸
Carboxylic acids 為一群具有 12~20 個碳的脂肪酸，在室溫成液態且具難聞氣
味，由於具有多個氫鍵，所以沸點較同分子量的其他物質高，同時也增加短鏈
carboxylic acids 的水溶特性；而隨著碳鏈增長，沸點越高，水溶性質越低。
脂肪酸與其相對應的 triacylglycerols 可區分為短鏈（< 4 carbons）、中鏈
（MCFA or MCT; 6-12 carbons）或長鏈（LCFA or LCT; > 14 carbons），本研究
使用中鏈脂肪酸（Capric acid, Caprylic acid and Hexanoic acid）為研究樣品。
中鏈脂肪酸（Medium-chain fatty acid, MCFA）包括 caproic acid （hexanoic
acid, C6:0）, caprylic acid（octanoic acid, C8:0）, capric acid（decanoic acid, C10:0）,
lauric acid （dodecanoic, C12:0） (表 2-3)。
表 2-3 中鏈脂肪酸
碳數學名俗名熔點(oC) 食物來源
6 n-Hexanoic Caproic acid -8.0 牛奶脂肪
大部分牛奶和某些種子
8 n-Octanoic Caprylic acid 12.7
triacylglycerols
大部分牛奶和某些種子
10 n-Decanoic Capric acid 29.6
triacylglycerols
某些種子(棕櫚核仁或椰子油)油脂中
12 n-Dodecanoic Lauric acid 42.2
的主成分
Medium-chain triglycerides （MCTs）是 MCFA 甘油酯化產物。MCT 獨特的

代謝方式，使其廣泛用於臨床吸收不良的營養治療；LCFA 進入人體的代謝途徑
會先形成乳糜微粒，再經淋巴管、靜脈進入肝臟，然後儲存於肌肉、肝臟脂肪組
織，必要時再分解成能量。而臨床使用的 MCT，代謝途徑則是經由肝門靜脈快
速送達肝臟分解成熱量代謝、可顯著降低體脂肪、體重與腰圍，且不會囤積在體
內較不容易造成身體的負擔。
過去研究顯示皮脂成分中的飽和與不飽和脂肪酸具有抗菌活性，其中以
17
lauric acids（C12:0）為最具抗菌效果的飽和脂肪酸(Wille & Kydonieus, 2003)。在
in vitro 的實驗中也具有抑制 P. acnes 生長的能力，並且在 in vivo 實驗中對於 P.
acnes 誘發的發炎反應也具有抑制的效果(Nakatsuji, et al., 2009)。另外，Capric acid
能夠抑制經 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 inducible nitric oxide
synthase（iNOS）mRNA 進而降低 nitric oxide（NO）產生，顯示具有降低氧化
傷害的能力(Park et al., 2011)。除此之外，lauric acid 與 capric acid (10:0)在文獻
中發現亦能夠抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2，顯示也具有
抗發炎的能力(Wu et al., 2009)。另一方面，在一個橫斷性研究結果顯示，每天攝
取>7 g MCT 有助於過重的糖尿病患者腰圍的控制(Siener et al., 2011)。血糖控制
不好的糖尿病患者身體時常處於急性發炎階段，而腰部脂肪的減少，可改善胰島
素抗性，也使糖尿病患者的血糖較易控制，減少高血糖帶來的發炎現象。
18
第三章材料與方法
第一節研究材料
一、實驗架構
19
二、藥品與試劑
(一) 細胞培養
1. RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, US)
2. Sebomed basal Medium (SBM, BIOCHROM, F8205)
3. 10% fetal bovine serum (Gibco)
4. 0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma)
5. Antibiotic- Antimycotic (Gibco)
6. DMSO (Dimethyl suLfogxide, Sigma, ＃D8418)
7. PBS (Phosphate Buffered Saline, 10X)
NaCl (Sodium chloride) (Sigma) 80.0g
NaH2PO4 (Disodium hydrogen phosphate) (Sigma) 29.2g
KH4PO4 (Potassium phosphate monobasic) (Sigma) 2.0g
KCl (Potassium chloride) (Sigma) 2.0g
溶於 800 mL 蒸餾水，調 pH 至 7.4，再定量至 1L，即為 10 X PBS。使用時
以蒸餾水稀釋成 1x PBS，經高壓滅菌斧(121℃，30 分鐘)滅菌後使用。
(二) 細菌培養
1. brain heart infusion (BHI) broth (Difco, Detroit, MI, USA)
2. Glucose (Sigma)
3. agar 粉末(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)
4. BBL GasPak systems (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville,
MD, USA).
(三) 細胞存活率測定
1. Trypan Blue（Sigma）
2. 3-(4,5-dimethyl thiazol -2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT (Sigma)
3. HCl
4. Isopropanol
(四) 抗發炎實驗
1. TNF-α, IL-8, and IL-1β ELISA set (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
20
(五) 定量聚合酶連鎖反應(Quantitative-Polymerase Chain Reaction,
Q-PCR)
1. TRIZOL Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)
2. Chloroform (Merck, Darmstadt, Germany)
3. DEPC- H2O
取 1mL diethyl pyrocarbonate, DEPC (Sigma)溶於 1 L 純水中，混合攪
拌隔夜，滅菌後使用。DEPC 為 RNase 抑制劑。
4. 反轉錄試劑套組 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)
5. iQ SYBR Green Supermix (iQTM SYBR Green Supermix；內含 2X reaction
buffer with dNTPs, iTaq DNA polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I,
fluorescein, stabilizer) (Bio-Rad)
(六) 西方墨點法(western blot)
1. 10 X cell lysis buffer (Cell Signaling, Beverly, MA,USA)
1x lysis buffer
10 x lysis buffer 100 μL
PMSF (1M) (Sigma) 10 μL
純水 890 μL
總體積 1000 μL
1. DC Protein Assay 套組(Bio Rad)
2. SDS 電泳膠片製備：
A 液：30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) solution (Bio-Rad)
B液(分離膠體緩衝液)：
Tris (Tris Base, 1.5 M) (Sigma) 90.8 mg
TEMED (Sigma) 1.8 mL
溶於300 mL純水中，調整pH至8.8，加水定量至500 mL。
21
C液(焦集膠體緩衝液)：
Tris (Tris Base 0.5 M) 6.0 mg
TEMED 0.4 mL
溶於 40 mL 純水中，調整 pH 至 6.8，加水定量至 100 mL。
10% separation gel (分離膠體，2片 1.5 mm )
純水 8.0 mL
A液 6.7 mL
B液 5.0 mL
10% SDS 0.2 mL
APS (100 mg/mL) (Sigma) 0.1 mL
總體積 20 mL
4% stacking gel (焦集膠體)
純水 2.95 mL
A 液 0.65 mL
C 液 1.24 mL
10% SDS 0.05 mL
APS (100 mg/mL) 0.1 mL
總體積 5 mL
22
3. Running buffer (10X 濃度) 配方如下:
Tris (Sigma) 30 g
Glycine (Sigma) 144 mg
SDS 10 g
加水至800 mL，調整pH至8.3，加水定量至1000 mL，使用時以十倍稀釋
4. Transfer buffer (10X 濃度) 配方如下:
Tris 30.25 mg
Glycine 144 mg
加水至750 mL，調整pH至8.3，加水定量至1000 mL，使用時以十倍稀釋
5. 10X PBST 配製
KH2PO4 3.54 mg
NaHPO4 14.8 mg
NaCl 85 mg
Tween 20 (Sigma) 10 mL
調整 pH 至 7.0 定量到 1000 mL
一級抗體
1. Phopho-p38 MAPK (T180/Y182)(D3F9)XP(TM) Ranbbit mAb (Cell Signaling)
2. p38 MAPK Ranbbit Ab (Cell Signaling)
3. Anti- b-actin Mouse pAb (Epitomics)
4. Phopho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204)Ranbbit mAb (Cell Signaling)
5. p44/42 MAPK (Erk1/2) Ranbbit mAb (Cell Signaling)
23
二級抗體
1. goat anti mouse IgG alkaline phosphatease (Sigma)
2. goat anti rabbit IgG alkaline phosphatease (Sigma)
(七) 化學純品和脂肪酸
1. Capric acid (Sigma, #C1875)
2. Caprylic acid(Sigma, #L4250)
3. Caproic acid (Sigma, #O1383)
4. Linoleic acid (Sigma)
5. Arachidonic acid (Sigma)
6. WY14643(Cayman)
三、儀器設備與耗材
(一) 儀器設備
1. 桌上型粉碎機 (原泰奇機械，台北市)
2. 細胞計數器(hemacytometer, Sigma)
3. 倒立式顯微鏡 (Nikon, Tokyo, Japan)
4. 離心機(Hettich)
5. 無菌操作台(LIAN SHEN)
6. 二氧化碳培養箱(Thermo Co., Waltham, MA, USA)
7. ELISA reader (Biotek Instruments, Winooski, VT, USA)
8. Pipet-Aid XP (Drummond SCIENTIPIC Co., USA)
9. 96-well, 6 cm dish, and 10cm dish (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ,
USA)
10. -80℃冰箱(Thermo)
11. 定量聚合酶連鎖反應儀 iQ5 (Bio-Rad)
12. 電泳槽(Bio-Rad)
13. 影像分析系統 ChemeDoc XRS+配合 Image Lab 影像分析軟體(Bio-Rad)
24
(二) 丟棄式無菌塑膠耗材
1. 細胞培養皿 75T
2. 6 公分 dish
3. 96-well、6-well 組織培養盤
4. 離心管
5. 冷凍管
6. 微量離心管
四、細胞培養
1. THP-1 (Human acute monocytic leukemia)
本實驗所使用的 THP-1cells 購自新竹食品工業發展研究所生物資源保存及
研究中心，使用 RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island, NY, US)培養液，內含 2 μM
L-glutamin, 4.5 g/L glucose, 10 μM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate (Sigma)，再另
外加入 10% fetal bovine serum (Gibco)、0.05 mM 2-mercaptoethanol (Sigma)以及
1%的抗生素 Antibiotic- Antimycotic (Gibco) ，內含 penicillin G sodium 100
units/mL, streptomycin sulfate 100 μg/mL, amphotericin B 250 ng/mL，培養液儲存

o
於 4 C 冰箱。
o
將 THP-1 cells 培養於 75T flask 中，置於 37 C, 5% CO2 的細胞培養箱中培
養，約三至五天更換一次培養液。繼代時以滅菌吸管將細胞懸浮液移至滅菌離心
o
管中，以 1000 rpm, 25 C 離心五分鐘，離心完畢之後吸掉上清，加入適量的新鮮
培養液混合均勻，依照細胞量與實驗需求分盤培養或是種入多孔盤中，以第 5-10
代進行實驗。
2. SZ95 皮脂細胞
本實驗使用 SZ95 皮脂細胞株，由 Dr. Zouboulid（Departments of Dermatology,
Venereology, Allergology and Immunology, Dessau Medical Center）所提供。SZ95
皮脂細胞具有許多人類皮脂細胞特性，會分泌鯊烯、蠟脂和三酸甘油酯等成分，
25
也同時有多種受器表現(Zouboulis, 2000)。
使用 Sebomed basal Medium（SBM BIOCHROM, F8205）
，內含 2.0g/L NaHCO3,
L-glutamine, 外加 5g/mL recombinant human epidermal growth factor（EGF）,
50g/mL gentamicin（SIGMA）, Calcium chloride （SHIYAKU）以及 10% fetal

bovine serum（FBS）（Gibco）。
以 10% FBS SBM 培養 SZ95 皮脂細胞株於 37℃、5%CO2 培養箱，每三天換
一次培養基。先移去長滿細胞之大 Dish，以 1/3 倍培養液體積 1xPBS 清洗兩次,
加入 0.25% trypsin EDTA 均勻浸潤細胞，於培養箱作用 10 分鐘待細胞黏附後取
出，添加 10% FBS SBM 終止 trypsin 反應, 收下細胞液以 1000 rpm 離心 5 分鐘,
添加 10% FBS SBM 將細胞懸浮均勻，取少許細胞液以 trypan blue solution 進行
染色。
3. 細胞解凍活化
為避免冰晶對細胞造成傷害，由液態氮移出的細胞需快速解凍。細胞活化後
需要經過幾次繼代生長，其本身特性和表現才會趨於穩定。解凍方法為:將細胞
由液態氮桶拿出後，迅速至於水浴槽(37℃)解凍，待冰塊完全融解後，取出細胞，
加入已有培養液之培養基中，均勻搖晃後放入 CO2 培養箱培養，於解凍隔天需
更換新鮮培養液。
4. 細胞冷凍保存
細胞冷凍濃度以 1×106cells/mL 為佳，將細胞懸浮液移至滅菌離心管中，以
o
1000 rpm, 25 C 離心五分鐘之後去除上清，加入以 7% DMSO (Dimethyl
suLfogxide, Sigma, ＃D8418)與 93%新鮮培養液配製而成的細胞冷凍保存液混合
o
均勻，之後各以 1 mL 分裝至冷凍管中。先將冷凍管放在保麗龍盒中於-80 C 冰
存 overnight，隔天移到液態氮桶中保存。
5. 細胞數目計算
活細胞會排斥Trypan Blue（SIGMA）染劑，故死細胞會被染成深藍色，可
於顯微鏡（Nikon）計算血球計數盤的亮點，可知細胞存活率。細胞處理同繼代
步驟，取20 µL細胞懸浮液與Trypan Blue對半稀釋，以血球計數盤計算四大格總
26
數，單位以cell/mL表示。
總細胞數 = 4 大格細胞總數÷ 4 ×稀釋倍數× 104
五、細菌培養
1. 試驗菌株：痤瘡桿菌 (Propionibacterium acnes, BCRC10723)
本實驗室所使用的痤瘡桿菌 Propionibacterium acnes (BCRC10723)，購買自
新竹食工所生資中心。
2. 新購入乾燥菌株之開封與活化
以沾有 75%酒精之棉花擦拭外管後於火焰上加熱外管之尖端，滴數滴無水
於加熱處使外管破裂，以硬棒敲破尖端，再取出隔熱纖維紙和內管，以滅菌過的
鑷子取出內管之棉塞，用無菌吸管吸取 0.3-0.5 mL 的培養液滴入內管，使乾燥菌
體溶解直到均勻懸浮，並取 0.1-0.2 mL 的菌體懸浮液滴入平板培養基的邊緣附
近，以四區劃線法接種於平板培養基，經過厭氧培養、菌種活化，分離純化後得
到的單一菌落再以培養液培養 24-72 小時，加入 20-25%的甘油冰存於-80oC。
3. 培養液及培養基製備
取 18.5 g Brain heart infusion (BHI) broth (Becton, Dicksinson and company,
U.S.A)溶於 500 mL 的去離子水中，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2
滅菌 30 分鐘，冷卻後加入以 0.2 μm filter 過濾成無菌的葡萄糖溶液並將 glucose
濃度調整為 1%，以 4 oC 保存，實驗時回溫至 37 oC。
培養基製備方式為配製培養液時同時加入 7.5 g 的 agar 粉末 (Difco
Laboratories, Detroit, MI, USA)，置於殺菌釜以溫度 121oC、壓力 1.2 kg/cm2 滅菌
30 分鐘，略微降溫後分裝至培養皿內，待其凝固後於 4 oC 保存。
4. 菌種活化與厭氧培養
實驗時，將冰凍在-80oC 的 BCRC 10723 痤瘡桿菌取出一個 loop 量，加至 10
mL 含 1% Glucose 的 BHI broth 培養液中，於 37oC 的厭氧箱培養 48 小時，之後
再取 2mL 的菌液加入 fresh BHI broth 培養液於 37oC 的厭氧箱培養 24 小時。以
活化的菌株進行後續的實驗。厭氧缸中放置三包厭氧包(BBL GasPack; Becton
27
Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD, USA)，根據使用情況大約一
星期更換 1-2 次厭氧包。
第二節實驗方法
一、抑菌實驗
1. 培養液稀釋法( Broth Dilution Method )
將三種脂肪酸 (stock 100 mM in DMSO)以 broth 稀釋成 4000 g/mL 的培養
液後，以 0.22 μM PVDF filter 進行過濾。之後進行對半序列稀釋(2000, 1000, 500,
250, 125, 62.5, 31.25, 15.625g /mL)。將活化後的懸浮菌液調整濃度至 P. acnes

為 2x108 CFU/mL，每 well 中加入 100 μL 的菌液，於適當條件培養時間( P. acnes
置於厭氧箱中恆溫 37 oC 培養 48hr)培養。此實驗以 DMSO 或 PBS 當作 vehicle
control，tetracycline 當作 positive control。含脂肪酸之培養液加 100 μL broth 為
sample blank。培養後以肉眼辨識 well 中無任何菌落生成，也讀取吸光值
600nm，扣掉 sample blank 後值小於 0.05 者，即為該萃物樣品之最低抑菌濃度
（Minimal inhibitory concentration, MIC）。
二、細胞存活率測定 (MTT)
測定細胞存活率的原理是利用活細胞粒線體中 succinate dehydrogenase 會打
斷 MTT 中的 [3-(4,5-dimethyl thiazol -2-yl)- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]
tetrazolium ring，將黃色的 MTT 轉變為紫色的生成物 formazan 並累積於細胞中
(Mosmann 1983)，當紫色 formazan 越多，代表細胞粒線體活性越高。此產物的
吸光波長是 550 nm，藉著吸光值與活細胞的多寡有正比的相關性，可決定出細
胞的存活率。為了排除脂肪酸對細胞造成毒性而影響細胞的表現，事先應進行細
胞存活率之測定。
本實驗的步驟如下：將 1×106 cell/ml 的 THP-1 cells 溶液種入 96-well plate
中，每格各加 100 μL 的細胞液，同時加入 100 μL 不同濃度的脂肪酸，於 5% CO2,
37oC 培養箱培養 24 小時後加入 20 μl 的 MTT 溶液，繼續放入 37oC 二氧化碳培
養箱中培養 2 小時，取出細胞液離心去上清，加入溶劑（0.04N HCl / Isoprpanol）
28
溶出 formazan，再利用 ELISA reader 讀取 550 nm 波長的吸光值。可得知細胞在
加入三種中鏈脂肪酸處理之後的細胞存活情形。所有的後續細胞實驗均採用脂肪
酸對細胞無明顯的毒性(存活率> 90%)的濃度做為實驗條件。
三、抗發炎活性評估
在發炎過程中巨噬細胞會受到刺激而活化，並分泌大量的促發炎細胞激素，
如：IL-8、TNF-等，因此藉由這些 cytokine 與抗體之間的作用，來檢測中鏈脂
肪酸是否能夠降低促發炎細胞激素的分泌，達到具有抑制發炎反應的效果。以存
活的痤瘡桿菌(BCRC 10723)刺激 THP-1 monocytic cells 產生促發炎細胞激素的
模式，來評估中鏈脂肪酸的抗發炎能力。
1. P. acnes 處理
取一無菌的微量離心管秤空重，加入活化 24 小時的 P. acnes 懸浮液，以 5,000
rpm 離心 10 分鐘，之後去除上清，再以適量的 PBS wash 2 次，之後離心去除上
清秤重(註：最後一次離心的轉速可提高，並盡可能移除殘留的 PBS，以避免影
響 P. acnes 秤重)，最後的重量扣除微量離心管的空重之後可得到 P. acnes 的重
量，實驗時以 RPMI 配製成 100 mg/mL 的 stock。
2. 人類單核球細胞 (human monocyte, THP-1)培養

THP-1 cells 培養在含 10% FBS 的 RPMI medium，於 5% CO2, 37oC 培養。將
THP-1 cells 以 2×106 cell/ml 種入 96-well plate，之後加入不含痤瘡桿菌 (negative
control) 或含有痤瘡桿菌(200 μg/ml)及中鏈脂肪酸(100 μL)，於 5% CO2, 37oC 培
養箱共同培養 24 小時後，收集上清液，採用市售套組分析 IL-8, TNF-α, IL-1β
含量(酵素免疫分析法)，依廠商說明書操作步驟進行。
3. IL-8, TNF-α, IL-1β 蛋白質量測定(酵素免疫分析法，ELISA)
以市售三明治酵素免疫分析 ELISA sets (Invitrogen)分析 IL-8 蛋白質的濃
29
度，實驗步驟如下：
實驗前一天需在 96 well ELISA plate coating capture antibody 100 μL，於 4oC
放置 12-18 小時，之後甩掉 capture antibody，以 wash buffer 清洗多餘或未固定在
盤底 capture antibody 一次，以 assay buffer blocking 1 小時以降低非特異性的干
擾，blockin 結束之後甩乾 assay buffer，依序加入 100 μL 的 standard 與待測量之
細胞培養上清，並分別加入 detection antibody 50 μL 共同反應 2 小時，以 wash
buffer 清洗五次，再加入 100 μL 的 enzyme reagent (avidin-HRP)反應 30 分鐘，以
wash buffer 清洗五次後以 TMB (tetramethylbenzidine)呈色系統反應 30 分鐘，最
後加入 2N H2SO4 終止反應，測量 450 nm 吸光值，吸光值越高表示樣品中含有的
該種蛋白質濃度越高，濃度以標準曲線換算再乘上樣品稀釋倍數即為實際產生的
蛋白質含量。
4、Maximum inhibition (%)計算

(一) Maximum inhibition (%)
以空白組(blk)的抑制百分率為 100%，P.acnes 刺激組(FoL100)的抑制百分
率為 0%，求樣品最大抑制量相對於空白組(blk)，其抑制百分比為多少。
Inhibition maximum (%)=(PFoL100- Ps(inhibition max))/( PFoL100- Pblk ) x 100%
Ps(inhibition max):樣品在最高效應濃度下，THP-1 細胞 cytokines 生成量
PFoL100:給予 200g/mLP.acnes 刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量

Pblk:在無任何刺激下，THP-1 細胞 cytokines 生成量
四、促發炎細胞激素mRNA表現量
本實驗室已建立實驗條件，將live P.acnes (200g/mL)與THP-1 cells (2 ×106
cell/mL)共同培養16小時，能顯著地增加IL-8, TNF-α, IL-1β的mRNA表現量，因
此選擇培養16個小時做為實驗的培養時間，探討脂肪酸是否能於此實驗條件下影
響促發炎細胞激素的mRNA表現。
30
1. 檢視三種脂肪酸抑制 P.acnes 刺激下 THP-1 細胞的促發炎細胞激
素 mRNA 表現
將細胞與 200 g/mL 之 P.acnes 以及不同濃度的脂肪酸共同培養於直徑 6 公
分的培養皿中，16 小時後抽取 RNA，進行 real-time PCR 檢視三種脂肪酸是否能
抑制 TNF-α, IL-1β, IL-8 三種促發炎細胞激素 mRNA 的表現。
2. 細胞RNA抽取
將進行不同處理後的THP-1細胞收集於1.5mL離心管，離心後將培養液移
除，以適量的1X PBS清洗殘留的培養液，接著加入1mL TRIzol reagent (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) ，pipeting使細胞溶解，於室溫靜置反應五分鐘，移至-80℃
保存備用。由-80 ℃冰箱中取出先前收集之細胞，於室溫中解凍2-3分鐘，加入
0.2 mL 氯仿(chloroform)，混合均勻後，votex至少20秒，於室溫下靜置3分鐘，
於4℃ 12,000 rpm離心15分鐘，離心後溶液會分為三層，小心吸取最上層之透明
溶液至1.5mL離心管，再加入同體積的冰異丙醇(isopropanol)混勻，於室溫下反應
10分鐘，再於4℃12,000rpm離心15分鐘，移除上清液，利用1mL的75%乙醇清洗
RNA上雜質與有機溶劑，最後以DEPC-H2O回溶備用。取樣品加DEPC-H2O檢測
RNA在260 nm與280 nm之吸光值，利用260 nm之吸光值來計算RNA的濃度、280
nm之吸光值檢測蛋白質濃度；260 nm吸光值除以280 nm吸光值可得知所萃RNA
之純度，最後以DEPC-H2O調整樣品RNA濃度使所有RNA樣品的濃度一致。
3. 將RNA合成cDNA
每管加入1 μg的RNA，以70℃加熱5分鐘，置於冰上5分鐘，再加入oligo(dT),
DEPC H2O, transcriptase, RT 5X buffer, MgCl2, dNTP (ImpromⅡ；Promega,
Madison, WI, USA)至總體積為20 μL於PCR tube中，放入預先開機的PCR機器(42
℃，60分鐘、70℃，15分鐘)，離心並移至-20℃保存備用。
31
4. 定量聚合酶連鎖反應（Quantitative-Polymerase Chain Reaction,
Q-PCR）
(1) 溫度梯度
新合成的primer在使用前需先找出最適合的使用溫度。將反轉錄後cDNA各
取1g於8-strip PCR tube，每管加入12.5 L reagent(iQTM STBR Green Supermix；

內含2X reaction buffer with dNTPs、iTaq DNA polymerase、6 mM MgCl2、SYBR
Green I、fluorescein、stabilizer) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)、0.5 L 5’-primer、
0.5 L 3’-primer，以滅菌水調整體積至25 L；另做一組無cDNA的NTC，可確定

所使用的滅菌水沒有受到汙染。設定iQ5 (Bio-Rad) 溫度梯度，使用primer廠商所
建議5’-primer和3’-primer作用溫度為最高和最低溫度，再將其等分為6個溫度，
共計8個溫度值進行quantitative real-time PCR (Bio-Rad)，最後可自電腦軟體中收
得Ct值進行換算，選定基因表現量最高的為執行溫度。本實驗以62℃為IL-8表現
量最高的溫度，所以選定62℃為執行溫度。
(2) Real-time PCR

反轉錄後的cDNA各取1g於8-strip PCR tube，每管加入12.5 L reagent
(iQTM STBR Green Supermix；內含2X reaction buffer with dNTPs, iTaq DNA
polymerase, 6 mM MgCl2, SYBR Green I, fluorescein, stabilizer) (Bio-Rad, Hercules,
CA, USA)、0.5 L 5’-primer、0.5 L 3’-primer，以滅菌水調整體積至25 L後進
行quantitative real-time PCR (Bio-Rad)放大。
PCR反應步驟
步驟反應條件 Cycle
Initial denaturation 95℃ 3 分鐘 1
Denaturation 95℃ 10 秒
Annealing 55℃ 30 秒 40
Extension 72℃ 30 秒
(Optional) Melt curve 55℃ 10 秒 1
32
Primer序列
基因方向 5’→3’ bp
F TGCCAAGGAGTGCTAAAG
IL-8 196
R CTCCACAACCCTCTGCAC
PCR結束後可透過melting curve的圖分析melting temperature，區別出

primer-dimer與PCR特異性產物。所獲得的PCR產物之相對量以iQ5 version2.1軟體
分析。
五、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced p-38, ERK, JNK 磷酸

化之影響
將 THP-1 種於 6 公分培養皿中(密度為 1×106 cell/ml)與中鏈脂肪酸、P. acnes
共培養 2 小時後抽取蛋白質。
1. 蛋白質抽去
將細胞培養於6公分培養皿中，接受不同的方式處理後，將其上清液移
除，以PBS清洗離心再移除PBS後，加入1X lysis buffer 以14000 rpm離心10分鐘，
取其上清液。
2. 蛋白質定量
使用 Lowry method 檢測蛋白質含量，自 Bio Rad 購得 DC Protein Assay 套
組，套組包含 A, B 液，A 液為鹼性酒石酸銅溶液，B 液為稀釋後的 Folin reagent。
當樣品加入 A 液後，銅離子在鹼性溶液中與 peptide bonds 形成複合物，此複合
物可與 Folin reagent 作用，使其進行還原反應而生成藍色產物。

蛋白質標準品配製：
33
蛋白質濃度
0 200 400 600 800 1000
（μg/mL）
1mg/ml BSA (μL) 0 20 40 60 80 100
DDW (μL) 100 80 60 40 20 0
將不同濃度標準品及樣品各取 5 μL，先加入 A 液 25 μL，再加入 B 液 200 μL，
於室溫作用 15 分鐘後，使用 750 nm 吸光值。不同濃度標準品測出吸光值並與蛋
白質濃度畫出標準曲線，求出趨勢線方程式後，帶入各樣品吸光值，即可以內插
法求出蛋白質濃度。
3. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

先將定量好之蛋白質與 5X sample buffer 以 4：1 均勻混合稀釋後，以 100oC
加熱 10 分鐘，冷卻後將變性的蛋白質 loading 到 10％ SDS-polyacrylamide gel well
中，置入電泳槽以 120 V 進行 90 分鐘電泳。
4. 西方墨點法(western blotting)
電泳結束後，將 SDS-PAGE 轉印到 PVDF membrane 上。PVDF membrane

需先用 100%甲醇浸潤，再放到轉印緩衝液浸泡。依序由負極放海綿、3M 濾紙
膠體、PVDF membrane、3M 濾紙，最後再放上海綿，膠體與 PVDF membrane
夾層中不能有氣泡，之後蓋上上蓋，將正負極電源插上以 400 mA 進行 90 分鐘
轉印。轉印完後取出 PVDF membrane 加入明膠 NET 進行 blocking 37oC 反應 60
分鐘後取出加入一級抗體於室溫反應 1 小時後，取出以 PBST 清洗 3 次，每次
shaking 10 分鐘，之後加入二級抗體於室溫反應 1 小時，取出以 PBST 清洗 3 次，
每次 shaking10 分鐘，最後與 ECL 反應 1 分鐘，並使用照相系統偵測蛋白質表現。
34
六、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NF-κB)活化分析
細胞受刺激活化 NF-κB 的訊息傳遞路徑中，IκB 降解使 free NFκB protein 能

夠轉移到細胞核中，進而調控免疫相關基因的表現。本實驗以市售套組 NFκB/p65
ActivELISA Kit (Imgenex, San Diego, CA, USA)進行分析，此實驗的原理為偵測存
在於細胞核中的 NFκB protein，來代表 NFκB 的活化情形。
1. 核蛋白抽取
(1) 收集細胞：
將活化的 P.acnes (200 μg/mL)和不同濃度之樣品與 THP-1 cells (3×106
cell/mL) 加入 6 well 盤中共同培養 16 小時後，收集細胞於 15 mL 離心管，以 4
℃、1,000rpm 離心 5 分鐘後除去上清，以冰 1xPBS-PMSF wash (resuspend)，接
著以 4 ℃、 1,000rpm 離心 5 分鐘，移除上清，將 cell pellet 置於冰上。
(2) cytoplasmic fraction：
以 500 μL 冰 1x hypotonic 1buffer 重新懸浮 cell pellet，移到微量離心管，置
於冰上 15 分鐘，再加入 25 L 10% detergent solution，充分 votex 10 秒，以 4 ℃

14,000 rpm 離心 30 秒，將上清移到新的微量離心管，即為 cytoplasmic fraction，
以 4℃保存。pellet 為 nuclear fraction。
(3) nuclear fraction：
先以 1xPBS-PMSF wash 清洗微量離心管 1-2 次，移除上清之後將 cell pellet
移到新的微量離心管，以 60 L nuclear lysis buffer 重新懸浮 nuclear pellet。充分

votex 後於 4℃搖晃 30 分鐘，votex 30 秒後接著以 4℃ 14,000 rpm 離心 10 分鐘，
得到上清移至新的微量離心管即為 nuclear fraction，保存在-80℃備用。將抽取之
核蛋白進行定量，並調整濃度為 1 mg/mL。
2. 細胞核內 NF-κB 蛋白質定量分析
分析細胞核內 NF-κB 之蛋白質濃度根據 ELISA 原理測量，流程依據廠商說

明書簡述如下：
預先在 96 well ELISA plate 上 coating capture antibody 100 µL 後，放置於 4
℃ overnight。以 wash buffer 清洗掉多餘或未固定於盤底的 capture antibody，接
35
著以 blocking buffer 進行 blocking 的步驟以降低非特異性的干擾，1 小時後甩乾，
並依序加入 100 µL 的標準品及 nuclear fraction 於 4℃反應 overnight。隔天將樣品
甩掉，以 wash buffer 清洗後加入 100 µL detection antibody 於室溫下反應 1 小時，
以 wash buffer 清洗，再加入 100 µL AKP-conjugated secondary antibody 反應 1 小
時，之後以 wash buffer 清洗，再加入 100 µL pNPP substrate 呈色，於室溫下反應
30 分鐘，測量 405 nm 之吸光值。吸光值愈高者表示樣品中所含之濃度愈高，其
濃度利用標準曲線換算，即為 NF-κB 蛋白質含量。
七、動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估)

本實驗室在先前的實驗中參考 Nakatsuji 等人(2009)於文獻中建立的動物模
式，將 P. acnes 活菌注射在 ICR 小鼠耳朵皮下組織中引起發炎反應，以評估三種
脂肪酸的 in vivo 抗發炎效果。
(一) 實驗動物
使用的實驗動物為 ICR 公鼠，週齡為 4-8 週，購買自樂斯科(宜蘭)，餵食 chow
diet 適應 3-7 天後分組進行實驗，每組五隻。
(二) 實驗方法
(1) 菌液配製
參考本實驗室之前測定 600 nm 吸光值下菌液的相對活菌數，以無菌的 1X
PBS 將活化的 P. acnes 調整濃度至 6×107 CFU/mL。
72 小時活化 OD 600nm CFU/mL
BCRC10723 1.7 ≒6×1010
(2) 樣品配製
Capric acid, caprylic acid 和 caproic acid 作為實驗樣品，並以 PBS 作為正對照
36
組。樣品皆以無菌之 1X PBS 調整至適當濃度後以 0.22 μM PVDF 過濾器過濾成
無菌，並在無菌操作台內將樣品取至 0.3 mL 胰島素針內。預實驗中確認三種脂
肪酸單純注射至小鼠耳朵不會引起腫脹發炎的濃度: 8 μg/10 μL。
(3) 注射方式
使用 0.3 mL 的胰島素針進行注射，將小鼠以乙醚麻醉之後依照下表組別分
組進行注射，注射時以棉花棒撐起小鼠耳朵，以大約 20-30 度的角度入針，待確
定入針後緩緩將菌液與樣品注入耳朵皮下組織，成功注射可清楚看見水泡隆起。
分組
Control
左耳右耳
PBS
+ P. acnes
Vehicle
總體積 10 μL 10 μL
分組
Capric acid Caprylic acid Caproic acid
左耳右耳左耳右耳左耳右耳
P. acnes P. acnes P. acnes
P. acnes + + +
+ Capric P. acnes Caprylic P. acnes Hexanoic P. acnes
FA acid acid acid
(8μg) (8μg) (8μg)
總體積 10 μL 10 μL 10 μL 10 μL 10 μL 10 μL
註：Vehicle=與萃取物等量之 DMSO
(4) 動物犧牲與組織採樣
注射後 24 小時以 3 倍劑量之 pentobarbital 犧牲小鼠，使用微測徑器(Mitutoyo,
Kanagawa, Japan)測量耳朵厚度，並取下直徑 4 mm 之等面積的耳朵組織進行組
織秤重，並切片染色觀察發炎細胞浸潤情形。
耳朵厚度增加百分比=左耳(P.acnes+FA)/右耳(P. acnes) × 100%。。
37
(5) 組織切片染色
5-1 藥品配製：4% paraformaldehyde
取 20g paraformaldehyde 粉末加入 1X PBS 至 500 mL，隔水加熱至完全溶解。
5-2 組織包埋
將經過 4% paraformaldehyde 固定之小鼠耳朵組織分別至於裝有新 PBS 的樣
品瓶 1 小時後(每 30 分鐘更換一次)，在更換新的 PBS 保存於 4oC 至進行石蠟包
埋(paraffin embedding)，過程如下。
目的藥品時間
50% alcohol 30 分鐘×2
70% alcohol 30 分鐘
脫水 (dehydration)
95% alcohol 30 分鐘×2
absolute alcohol 50 分鐘
absolute alcohol 30 分鐘×2
Xylene 45 分鐘
組織透明化 (clearing)
Xylene 45 分鐘
Xylene : paraffin = 1 : 1
滲入 (infiltration) 30 分鐘×2
50-60oC
包埋 (embedding) paraffin 50-60oC 60 分鐘×2
5-3 組織石蠟切片
將包埋好的石蠟塊固定於包埋盒座上，以切片機進行 5 μm 厚度切片，將切
38
下的薄片小心放入 37-40 oC 水域槽中進行展片，再移至上有 poly-L-lysine 之玻片
上，接著放置在 37 oC 烘片機上乾燥，最後放在玻片盒中保存備用。
5-4 組織染色(Hematoxylin & Eiosin staining)
完成切片進行蘇木精-伊紅染色 (Hematoxylin & Eiosin staining)，過程如下：
目的藥品時間
脫蠟 xylene 3 分鐘×2
組織再水化
(rehydration)
H2O 3 分鐘
hematoxylin 2 分鐘
流水沖洗 25 分鐘
染色 (staining)
Eosin 15 秒
流水沖洗 3 分鐘
75% alcohol 5秒
85% alcohol 5秒
組織脫水 (dehydration) 95% alcohol 5秒
100% alcohol 5秒
Xylene 1.5 分鐘×2
封片以 xylene 專用封片膠封片
組織切片染色委託國立台灣大學獸醫系切片室(http://www.vm.ntu.edu.tw/DVM/)
協助製作。
組織切片照相委託萬芳醫院皮膚科鄒嘉倫醫師協助拍攝。
39
八、統計分析
每次實驗皆有三次重複的獨立實驗，結果皆以 mean ± SD 表示。實驗數據以
SPSS 12.0 軟體進行分析，根據 One-Way ANOVA 事後檢定 LSD 與 Duncan 作為
統計分析，若 p＜0.05，表示統計上具有顯著的差異。
40
第四章結果
第一節中鏈脂肪酸之抑菌與抗發炎作用
壹、抑菌實驗
中鏈脂肪酸之抑菌能力評估
測定三種中鏈脂肪是否能夠抑制痤瘡桿菌生長，結果如圖 4-1，顯示只有
capric acid 在高濃度下才可抑制 P. acnes 生長，其它兩種中鏈脂肪沒有好的抑制
P.acnes 生長的效果(表 4-1)。
0.7
Capric acid
Caprylic acid
0.6
Caproic acid
0.5
0.4
OD 600
0.3
0.2
0.1
0.0
DMSO 7.58 15.675 31.25 62.5 125 250 500 1000
g/mL
圖 4-1 Capric acid, caprylic acid 和 Caproic acid 抑制 P. acnes 生長結果
41
表 4-1 CAPRIC ACID, CAPRYLIC ACID 和 CAPROIC ACID 抑制 P. ACNES 生長效果
Table 4-1 Susceptibility of bacteria to capric acid, caprylic acid and caproic acid
MIC(µg/mL)
Fatty acid P. acnes BCRC10723
capric acid 500
caprylic acid >1000
caproic acid >1000
capric acid caprylic acid caproic acid
1000
500
250
125
62.5
31.25
15.625
7.8
圖 4-2 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 抑制 P. acnes 生長效果
Figure 4.2 Susceptibility of bacteria to capric acid, caprylic acid 和 caproic acid
42
貳、細胞存活率測定(MTT)
三種中鏈脂肪之實驗濃度選定，以不影響細胞存活率為原則，避免影響細胞
生長進而造成細胞數目不同而成為實驗的干擾因素。以 MTT 試劑來測定細胞存
活率。本實驗室先前已測試過 capric acid 處理 THP-1 cell 之細胞存活率(李,
2011)，故補充另外兩種中鏈脂肪酸對於 THP-1 cell 之細胞存活率。
因為在較高濃度 200 M 會對 THP-1 cell 產生毒性而排除該濃度。實驗結果
三種中鏈脂肪以 25, 50, 100 M 作為後續實驗所使用的濃度。
圖 4-3 以 MTT 方法測試不同濃度之 caprylic acid, caproic acid 處理 THP-1 cell

之細胞存活率
Figure 4.3 Effects of caprylic acid and caproic acid on viability of THP-1 cell by
MTT method. THP-1 cells were treated with test compounds for 24 hours. Values are
mean ± SD.
43
第二節評估中鏈脂肪酸的抗發炎能力
壹、In vitro 抗發炎活性評估
一、中鏈脂肪酸對於 P. acnes 誘導 THP-1 細胞 IL-8, TNF-, IL-1蛋
白質表現之影響
P. acnes 會刺激 THP-1 cell 產生促發炎細胞激素，造成發炎而惡化痤瘡，因
此試驗三種中鏈脂肪酸抑制促發炎細胞激素 IL-8、TNF-與 IL-1的能力。
將不同濃度的三種中鏈脂肪酸與 live P. acnes 200 g/mL 與 THP-1 cell 共同
培養 24 小時，收取上清液，以 ELISA 方法分析促發炎細胞激素 IL-8、TNF-與
IL-1的蛋白質表現量。實驗結果顯示，與 live P. acnes 共同培養會增加 IL-8、
TNF-與 IL-1的蛋白質表現量(圖 4-4、圖 4-5 和圖 4-6)。加入 capric acid, caprylic

acid，於高濃度 100 µM 達顯著抑制效果；另外加入 caproic acid 則在 25, 50, 100 µM
的濃度下，皆可以顯著抑制由 live P. acnes 誘導的 IL-8 的蛋白質表現量 (圖 4-4)。
capric acid, caprylic acid, caproic acid 在高濃度 50, 100 µM 下具有降低 P.
acnes 誘導 THP-1 產生 TNF-的效果，其中以 caproic acid 具最佳抑制效果，抑
制程度達 92%；三種中鏈脂肪酸的皆可降低 IL-1的產生，其中 capric acid 抑制
程度達 51%，具最佳抑制 IL-1產生效果(圖 4-5 與圖 4-6)。
44
圖 4-4 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 抑制 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞
之 IL-8 cytokines 生成
Figure 4. 4 Capric acid, caprylic acid and caproic acid inhibits live P. acnes-induced
IL-8 protein production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with
live P. acnes suspension (200 μg/mL) in the presence of three concentrations of fatty
acids from 25-100 μM. Control experiments were run without P. acnes suspension.
Values are means ± SD, n=3. The data were evaluated for statistical significance with
one-way ANOVA followed by Duncan’s multiple range test. Means with the same
letter are not significantly different. Differences were considered significant for p <
0.05.
45
之 TNF- cytokines 生成
Figure 4. 5 Capric acid, caprylic acid and caproic acid inhibits live P.acnes-induced
TNF-α protein production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with
0.05.
46
之 IL1- cytokines 生成
IL-1β protein production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 24 hr with
0.05.
47
二、中鏈脂肪酸對於 P. acnes 誘導 THP-1 細胞 IL-8, TNF-,
IL-1mRNA 表現量之影響
將不同濃度的三種中鏈脂肪酸、live P. acnes 與 THP-1cells 共同培養 16 小時
後，抽取 RNA 以 quantitative-polymerase chain reaction 分析 IL-8, TNF-, IL-1
mRNA 的表現量。結果顯示，THP-1cells 與 live P. acnes 共同培養 16 小時後，其
IL-8, TNF-, IL-1mRNA 表現量顯著提高(圖 4-7、圖 4-8 和圖 4-9)。
capric acid, caprylic acid, caproic acid 於濃度 25, 50, 100 µM 的情況下，皆可
以顯著抑制 P. acnes 誘導 THP-1cells 產生的 IL-8 , TNF-, IL-1mRNA(圖 4-7、
圖 4-8 和圖 4-9)。
由三種中鏈脂肪酸抑制 P. acnes 誘導 IL-8 產生的實驗結果，capric acid,
caprylic acid, caproic acid 的 IC50 分別為 22.9 M, 29.9 M, 43.74 M，發現 capric
acid 的 IC50 最小，表示 capric acid 在濃度 22.9 M 已擁有抑制半數 IL-8 產生的效
果。所以後續將選擇 capric acid 為樣品，繼續探討其影響促發炎細胞激素產生的
作用機制(圖 4-10)。
48
圖 4-7 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 P.acnes 刺激 THP-1 產生 IL-8
mRNA 的影響
IL-8 mRNA production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 16 hr with
0.05.
49
圖 4-8 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 P.acnes 刺激 THP-1 產生 TNF-
mRNA 的影響
TNF- mRNA production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 16 hr with
0.05.
50
IL-1mRNA 的影響
IL-1 mRNA production by THP-1 cells. THP-1 cells were incubated for 16 hr with
0.05.
51
(A) capric acid
(B) caprylic acid
(C) caproic acid
圖 4-10 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 live P. acnes 誘導 THP-1 細胞
之 IL-8 生成效果
Figure 4-10 Capric acid, caprylic acid and caproic acid inhibits live P. acnes-induced
IL-8 protein production by THP-1 cell. The paraments IC50 coefficient along with the
SD are shown on the respective graphs.
52
貳、In vivo anti-inflammatory effect
本實驗先前實驗結果顯示，capric acid 能夠減少 P. acnes 引起的發炎反應，
也能減少小鼠耳朵腫脹的程度。因此我們試驗並比較同為中鏈脂肪酸的 capric
acid, caprylic acid 和 caproic acid 在 in vivo 的抗發炎效果。
一、 In vivo 抗發炎實驗結果
參考 Nakatsuji 等人(2009)的研究，先單純注射三種中鏈脂肪酸至小鼠耳朵，
根據小鼠耳朵外觀目測與組織切片選擇不造成刺激的劑量(外觀無紅腫等現
象)，選定 8 μg/10 μL 進行實驗。
從外觀與組織切片結果顯示注射 live P. acnes 會引起小鼠耳朵明顯的紅腫，
而測量耳朵厚度的結果顯示與 PBS control 組相比，小鼠耳朵腫脹程度約為 2 倍，
而 capric acid 能夠降低腫脹厚度約 7-23%、caprylic acid 能夠降低 20.4-41.3%和
caproic acid 能夠降低 37.5-49.6%。以 4mm biopsy punch 取等面積耳朵組織秤重，
結果顯示注射 P. acnes 會造成小鼠耳朵重量約增加 2 倍，而 capric acid 能夠減少
重量約 9.1-30.5%、caprylic acid 能夠降低 28.4-44.7%和 caproic acid 能夠降低
34.3-54.8% (圖 4-11)。
53
(A)
PBS- control P. acnes P. acnes + capric acid - 8 μg
P. acnes + caprylic acid - 8 μg P. acnes + caproic acid - 8 μg
(B) (C)
圖 4-11 Capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 P. acnes 引起小鼠耳朵腫脹與重

量變化之影響
Figure 4.11 Evaluation in vivo anti-inflammatory activity of capric acid, caprylic acid
and caproic acid on P. acnes-induced inflammation. Ears of ICR mice were injected
intradermally with P. acnes (6×107 CFU per 10 μl in PBS) with PBS alone or with
capric acid, caprylic acid and caproic acid (8 μg per 10 μL in 5% DMSO in PBS).
After 24 hours, observed by hematoxylin and eosin (H&E) staining (A). The increase
in ear thickness was measured using a micro caliper after bacterial injection (B). The
ear was punched with a 4 mm biopsy punch after injection and weighed the increase
of swelling weight (C). Data are representative of six separate experiments with
similar results.Scale bar = 100 μm.
54
參、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced MAPK pathway and
NF-B 磷酸化之影響
在過去 in vitro 的實驗中 lauric acid(C12:0)具有抗菌較果且也具有抑制 P.
acnes 生長的能力，並且在 in vivo 實驗中對於 P. acnes 誘發的發炎反應也具有抑
制的效果(Nakatsuji, et al., 2009)。本實驗此次實驗結果顯示，capric acid, caprylic
acid, caproic acid 能夠減少 P. acnes 引起的發炎反應，也能減少小鼠耳朵腫脹的程
度；capric acid IC50 最小，所以後續選擇 capric acid 為樣品，lauric acid 為對照
組，探討 capric acid 和 lauric acid 對 P. acnes-induced MAPK pathway and NF-B
磷酸化之影響。
此部分路徑實驗由本實驗室黃文程進行分析，實驗方法參考(連, 2010)。
一、mitogen-activated protein kinases (MAPK) pathway活化分析

MAPK pathway 為真核細胞中參與調控免疫反應的訊息傳遞路徑，可將細胞
外的訊息傳遞至細胞核內，調控 DNA 的表現或是蛋白質的轉譯作用，使細胞產
生各種不同的反應，在發炎反應時更是扮演了相當重要的角色。為探討 capric acid
和 lauric acid 抑制發炎反應是否經由抑制 MAPK pathway 活化的途徑，利用
western blot 分析 pathway 蛋白質磷酸化的表現。
將人類巨噬細胞 THP-1 與中鏈脂肪酸、P. acnes 共培養 2 小時後，p38, ERK,
JNK 蛋白質磷酸化的表現顯著增加。將 lauric acid 和 capric acid 與 P. acnes 和細
胞共培養 2 小時，抽取蛋白質以 western blot 分析 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化
的表現。
結果顯示，lauric acid(C12:0)在高濃度 100 M 下可以抑制 P. acnes 誘發後 p38,

ERK 磷酸化的表現(圖 4-12 與圖 4-13)，但對於 P. acnes 誘發後 JNK 蛋白質磷酸
化的表現並無顯著影響。capric acid(C10:0)則是在 25、50、100 M 三個濃度下，

皆可以顯著降低 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現。
55
Lauric acid (M) Capric acid(M)
25 50 100 25 50 100
P. acnes (200 g/mL)
- + + + + + + +
phospho –p38
total -p38
-actin
10
6
p-p38/p-38
* *
*
4
2
*
0
control DMSO 25 50 100 25 50 100
lauric acid (M) capric acid (M)
圖 4-12 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 p38 蛋白質磷酸化表現量之影響
Figure 4.12 Inhibitory effects of capric acid and lauric acid on P. acnes-induced
phospho-p38 protein levels in THP-1 cells. Capric acid treatment with P. acnes and
THP-1 cells for 2 h. Amounts of phospho-p38 protein were quantified using total-p38
as a loading control and are expressed relative to those control. Data are expressed as
the means ± SD of indepent three tests asterisks indicate a significant difference
compared with the P. acnes-treated control group, *p<0.05. DMSO: Positive control
(P. acnes (+)), Control: Native control (P. acnes (-) ).
56
25 50 100 25 50 100
P. acnes (200 g/mL) - + + + + + + +
phospho -ERK
total -ERK
-actin
5
p-E R K / E R K
*
3
*
* *
2 *
*
1
0
c o n t r oDl M S O 25 50 100 25 50 100
圖 4-13 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 ERK 蛋白質磷酸化表現量之影響
phospho-ERK protein levels in THP-1 cells. Capric acid treatment with P. acnes and
THP-1 cells for 2 h. Amounts of phospho-ERK protein were quantified using
total-ERK as a loading control and are expressed relative to those control. Data are
expressed as the means ± SD of indepent three tests asterisks indicate a significant
difference compared with the P. acnes-treated control group, *p<0.05. DMSO:
Positive control (P. acnes (+)), Control: Native control (P. acnes (-) ).
57
25 50 100 25 50 100
- + + + + + + +
phospho-JNK
total-JNK
-actin
4 *
p-JNK/JNK
* *
3
*
1
0
control DMSO 25 50 100 25 50 100
圖 4-14 Capric acid, lauric acid 對 P. acnes 誘導 JNK 蛋白質磷酸化表現量之影響
phospho-JNK protein levels in THP-1 cells. Capric acid treatment with P. acnes and
THP-1 cells for 2 h. Amounts of phospho-JNK protein were quantified using
total-JNK as a loading control and are expressed relative to those control. Data are
expressed as the means ± SD of indepent three tests asterisks indicate a significant
difference compared with the P. acnes-treated control group, *p<0.05. DMSO:
Positive control (P. acnes (+)), Control: Native control (P. acnes (-) ).
58
二、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NF-κB)活化分析
NF-κB 為轉錄因子，調控多種發炎和免疫相關基因的表現。細胞未受刺激
時，NF-κB dimers 因與抑制蛋白 IκB 結合所以呈現去活化狀態，但若細胞受到外
界壓力刺激，抑制蛋白 IκB 受磷酸化而與 NF-κB 分開，使得 NF-κB 活化進入細
胞核內，調控下游促發炎細胞激素的基因表現。
本實驗室先前的研究發現，將 P. acnes (200 μg/mL)與 THP-1 細胞共同培養
16 小時，會顯著增加 THP-1 細胞核內的 NF-κB/p65 含量(連, 2010)，確定了 NF-κB
參與 P. acnes 啟動宿主細胞的免疫反應。為探討 capric acid, lauric acid 抑制發炎
反應是否經由抑制 NF-κB 活化的途徑，利用 NF-κB/p65 ActivELISA kit 測定細胞
核內 NF-κB (p65)蛋白質含量，以反應細胞核內 NF-κB 活化情形。
將 P. acnes (200 μg/mL)與不同濃度的樣品和 THP-1 細胞共同培養 16 小時，
之後收集細胞萃取核蛋白，再利用 NF-κB/p65 ActivELISA kit 測定核蛋白
NF-κB/p65 含量。結果顯示 capric acid 在三個濃度皆能夠降低 P. acnes 誘導 THP-1
細胞中 NF-κB 的活化 (圖 4-15)。
59
圖 4-15 capric acid 和 lauric acid NFκB 分析結果
Figure 4.15 Effects of capric acid and lauric acid on P. acnes-induced nuclear NFκB
protein level in THP-1 cells. THP-1 cells stimulated with live P. acnes (200 μg/mL)
for 16 hr in the presence of different concentrations of capric acid and lauric acid from
25-100 μM. Control experiments were run without P. acnes suspension. NF-κB
protein concentration was analyzed using NF-κB/p65 ActivELISA kit to detect the
active form of the p65 subunit. Data are presented as the means ± SD. Significantly
difference is indicated by *p＜.05.
60
第三節 capric acid 對 pretreated AA 刺激 P. acnes- induced
IL-8 之影響
AA 可藉由磷脂質酶 A2 （ phospholipase A2）作用，而由細胞膜磷脂產生。
在 AA 代謝路徑中，經由 5-lipoxygenase 而生成 LTB4 除了會增加白血球、巨噬細
胞趨化聚積外，目前更有研究發現 LTB4 在痤瘡發炎過程著實扮演重要的角色
(Zouboulis, 2009a)。另有研究發現，在病人痤瘡病灶 5-LOX, COX-2 活性上升，
此外，也發現皮脂腺的 IL-6 和 IL-8 的表現量也提高(Alestas, et al., 2006)。
一、建立 pretreated AA 刺激 P. acnes 誘導 IL-8 產生的模式

為探討 AA 在發炎痤瘡所扮演的角色，首先建立並觀察 pretreated AA 對刺激
P. acnes 誘導 IL-8 的影響。將 AA（100 M）先與 THP-1 cells 共培養 16 小時後，
分別加入 AA（100 M）

、P. acnes（200 g/mL）後再培養 24 小時，收取上清液，
以 ELISA 方法分析促發炎細胞激素 IL-8 的蛋白質表現量，並與未 pretreated AA
組別比較。結果顯示，單獨的 AA 不會增加 THP-1 cell IL-8 的產生，單獨的 P.acnes
會誘使 IL-8 增加生成；pretreated AA 後的組別比未 pretreated AA 的組別顯著增
加 IL-8 生成。而會對 P.acnes 所誘使 IL-8 的產生具有加成作用，在 pretreated AA
後 IL-8 比未 pretreated AA 明顯增加(圖 4-16)。
61
*
*
圖 4-16 pretreated AA 對 P. acnes 刺激 THP-1 產生 IL-8 的影響
Figure 4.16 Effects of pretreatment with AA on live P.acnes-induced IL-8 protein

production by THP-1 cell. THP-1 cell pretreatment with AA for 16 hr and stimulated
with live P. acnes (200 μg/mL), AA , AA/ P. acnes for 24 hr. Control experiments
were run without P. acnes suspension. Data are presented as the means ± SD.
Significant difference compared with AA-treated group*p＜.05.
62
二、capric acid 對於 pretreated AA 刺激 P. acnes 誘導 IL-8 產生之
影響
痤瘡的致病機制相當複雜，可能與毛囊過度角質化、皮脂分泌和 P.acnes(痤
瘡桿菌)聚積刺激產生促發炎細胞激素引起發炎反應相關。於前面的結果發現，
pretreated AA 會使得 IL-8 分泌增加，顯示 AA 可能會經由刺激 THP-1cells 提高
促發炎細胞激素 IL-8 的生成，這樣可能加重痤瘡的發炎情況。所以另外也觀察
AA 對於人類皮脂腺細胞 SZ95 在 IL-8 分泌之影響和 capric acid 對於 pretreated AA
刺激 P. acnes 誘導 IL-8 產生之影響。
將 AA（100 M）先分別與 THP-1、SZ95 cell 共培養 16 小時後，分別加入

capric acid（100 M）、 AA、P. acnes（200 g/mL）後再培養 24 小時，收取上
清液，以 ELISA 方法分析促發炎細胞激素 IL-8 的蛋白質表現量，並與未 pretreated
AA 組別比較。
結果顯示，THP-1 預處理 AA 後，AA+P.acnes 組產生的 IL-8 高於單獨 P.acnes
組別，capric acid 會降低單獨 P.acnes 和 AA+P.acnes 產生的 IL-8(圖 4-17)。SZ95
預處理 AA 後，單獨 P.acnes 和單獨 AA 會顯著提高 IL-8 產生； AA+P.acnes
組產生的 IL-8 高於單獨 AA 組別；capric acid 會降低單獨 P.acnes 和 AA+P.acnes
產生的 IL-8(圖 4-18)。
63
P. acnes (200 g/mL) - + + - + +
AA - - + + - +
capric acid - - - - + +
圖 4-17 capric acid 對 AA 預處理的 THP-1 受 P.acnes、AA 刺激產生 IL-8 的影

響
Figure 4.17 Effects of capric acid on P.acnes-induced IL-8 produced by AA
preatreated THP-1 cell. THP-1 cell pretreatment with AA for 16 hr and stimulated
with live P. acnes (200 μg/mL), AA , AA/ P. acnes, capric acid for 24 hr. Control
experiments were run without P. acnes suspension. Data are presented as the means ±
SD. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA
followed by Duncan’s multiple range test. Means with the same letter are not
significantly different. Differences were considered significant for p < 0.05.
64
P. acnes (200 g/mL) - + + - + - +
AA - - + + - + +
capric acid - - - - + + +
圖 4-18 capric acid 對 AA 預處理的 SZ95 受 P.acnes、AA 刺激產生 IL-8 的影

響
Figure 4.18 Effects of capric acid on P.acnes-induced IL-8 produced by AA
preatreated SZ95 cell.SZ95 cell pretreatment with AA for 16 hr and stimulated with
live P. acnes (200 μg/mL), AA , AA/ P. acnes, capric acid for 24 hr. Control
experiments were run without P. acnes suspension. Data are presented as the means ±
SD. The data were evaluated for statistical significance with one-way ANOVA
followed by Duncan’s multiple range test. Means with the same letter are not
significantly different. Differences were considered significant for p < 0.05.
65
第四節脂質堆積
壹、細胞存活率測定(MTT)
脂質過度堆積會加重 P. acnes 引起的發炎反應而惡化痤瘡。因此測試三種中

鏈脂肪酸對於 SZ95 脂質堆積的影響。
首先確定所使用的三種濃度對於 SZ95 cell 不會有毒殺作用，避免影響細胞
生長進而造成細胞數目不同而成為實驗的干擾因素 (圖 4-19)。
圖 4-19 以 MTT 方法測試不同濃度之 capric acid, caprylic acid, caproic acid 處

理 SZ95 cell 之細胞存活率
Figure 4.19 Effects of capric acid, caprylic acid and caproic acid on viability of SZ95
cells by MTT method. SZ95 cell were treated with test compounds for 24 hours.
Values are mean ± SD.
66
貳、中鏈脂肪酸之 SZ95 脂質堆積的影響
將不同濃度的三種中鏈脂肪酸與 SZ95 cell 共同培養 48 小時，以 Oil Red 方
法分析細胞內脂質堆積的影響，並使用 WY14643（200 M）為 postive control
(PC)，比較 LA(linoleic acid, 100 M )與三種中鏈脂肪酸對 SZ95 脂質堆積影響。

實驗結果顯示，PC 會促進皮脂腺細胞內脂質堆積作用，而三種脂肪酸則無明顯
影響 SZ95 脂質堆積作用(圖 4-20)。
圖 4-20 比較 LA 與 capric acid, caprylic acid, caproic acid 對 SZ95 脂質堆積影響
Figure 4.20 Effects of LA, capric acid, caprylic acid and caproic acid on lipid content
of SZ95 cells. Lipid droplets in cells were stained by oil red. The data were evaluated
for statistical significance with one-way ANOVA followed by Duncan’s multiple
range test. Means with the same letter are not significantly different. Differences were
considered significant for p < 0.05.
67
參、AA 之脂質堆積的影響
將 SZ95 cell treated AA(arachidonic acid, 100 M)共培養 24 小時後，以 Oil Red
方法分析細胞內脂質堆積的影響。結果顯示，AA 會促進皮脂腺細胞內脂質堆積
作用(圖 4-21)。
圖 4-21 AA 對 sz95 脂質合成的影響。
Figure 4.21 Effects of AA on lipid content of SZ95 cells.

Lipid droplets in cells were stained by oil red. Cells were treated with AA in 10% FBS
SBM for 24hr. Data are presented as the means ± SD. Significant difference compared
with AA-treated group*p＜.05.
68
第五章討論
一、抗發炎活性與作用機制
(一)中鏈脂肪酸對 P.acnes 誘導 THP-1 促發炎細胞激素生成
的影響
本實驗測定中鏈脂肪酸（capric acid, caprylic acid, caproic acid）對於 P.acnes.
誘導 THP-1 細胞產生的促發炎介質的影響，結果顯示三種中鏈脂肪酸皆能顯著
降低 IL-8, TNF-and IL-1的產生，但不管是在蛋白質或是 mRNA 的表現，capric
acid 具有較好抑制促發炎細胞激素產生的能力，IC50 為 22.9 M 低於其他兩種脂

肪酸，所以選擇 capric acid 為樣品，繼續探討 capric acid 抗發炎作用機制。
從過去文獻中發現 linoleic acid (LA)與 α-linolenic acid(ALA)能夠抑制 LPS 經
由 TLR4 誘導 THP-1 細胞產生的促發炎細胞激素 IL-6, IL-1β and TNF-α，且能夠
抑制這三種 cytokine 的 mRNA 表現(Yasui et al., 2005)。另外，研究指出 LPS 會
誘使 RAW264.7 產生 ROS 並活化 MAPKs, p38 and NF-B，進而促使 TNF-, IL-1,

IL-6, IL-8 的生成，顯示經由刺激而產生的促發炎細胞激素與發炎可能在痤瘡病
灶中具有重要影響。
綜合上述文獻與實驗結果，推測中鏈脂肪酸抑制 P.acnes 誘導 THP-1 細胞之
促發炎細胞激素的產生可能藉由減少 ROS 所活化的 MAPKs 和 NF-B 的活化，

而達到抗發炎的功效。
69
LPS
LBP
TLR4
ROS
PI3K
MAPKs
(ERK, JNK, p38) IKK
Akt
- NF-
-
degradation
NF-
TNF-IL
IL
圖 5-1 LPS-induced RAW264.7 細胞的發炎現象

Figure. 5-1. Schematic diagram illustrating the signaling pathways involved in
LPS-induced inflammation associated proteins in RAW264.7 cells.
70
(二) 中鏈脂肪酸對 P.acnes 誘導 NF-磷酸化之影響
實驗結果不論是在蛋白質或是 mRNA 的表現，capric acid 具有較好抑制促
發炎細胞激素產生的能力，IC50 為 22.9 M 低於其他兩種脂肪酸。所以選擇 capric

acid 為樣品，繼續探討 capric acid 抗發炎作用機制。結果顯示 capric acid 在 25, 50
and 100 M 三個濃度下，皆可以顯著降低 p65 蛋白質磷酸化的表現。

研究指出 P.acnes 是藉由活化 Toll-like receptor（TLRs）pathway 而活化
MyD88-dependent pathway，進一步活化下游 NF-，誘導單核球細胞產生促發

炎細胞激素，進而引起發炎反應(Grange, et al., 2009)。Ligand 活化對應的 TLRs
後，會吸引 Myeloid differentiation factor-88（MyD88），MyD88 會吸引其他傳訊
蛋白包括 IL-1Rassociated kinase-1（IRAK-1）/ IRAK-4 與 adaptor protein 的 tumor
，接著一連串磷酸化
necrosis factor（TNF）, receptor associated factor 6（TRAF6）
(phosphorylation)與泛素化(ubiquitylation)的步驟，會使 IKK complex (inhibitor of
NF---kinase complex )受磷酸化，緊接著-上特定的 serine 區域受磷酸
化後會降解proteasome-mediated degradation)而與 NF-分離，使得 NF-能夠
移入細胞核內誘使免疫反應相關基因的轉錄作用，合成細胞激素（cytokin）、
一些研究指出NF-pathway 與表皮恆定（epidermal homeostasis）狀態相關
(Fuchs & Raghavan, 2002)。關於抑制表皮角質細胞（epidermal keratinocytes）中
NF-活化實驗，像是藉由控制mutant non-degradable IB的過度表現或是以基
因剔除（knockout）的方式剃除 NF-的 p65 subunit，都會造成表皮細胞增生，
顯示表皮細胞中的NF-與調控生長有關(Nenci et al., 2006)。NF-signaling是

調控細胞反應多種外來壓力因子的關鍵路徑，在調控表皮生理扮演重要角色
(Wullaert et al., 2011)。NF-的活化會引起發炎性疾病，所以目前針對減少發炎
為主的研究實驗，多數會以減少NF-的活化為主要研究方向，在Hubert-Buron
等人的研究中指出glutamine能夠減少人類小腸上皮細胞釋出IL-8，其作用機制就
是藉由減少-的泛素化(ubiquitylation)而降低NF-活化，減少促發炎細胞激
素IL-8釋出，降低發炎性腸道疾病發生(Hubert-Buron et al., 2006)，另外也會確定
NF-與MAPK路徑之間是否存在相互作用。
綜合上述文獻與實驗結果，推測中鏈脂肪酸抑制P.acnes誘導THP-1細胞之促
發炎細胞激素的產生應該是藉由降低-的磷酸化作用，使的p65蛋白質的活化
71
減少，而達到抗發炎的功效。

圖 5-2 模式識別受體和先天性免疫訊息調控
Figure. 5-2. Pattern recognition receptors and innate immune signaling.(Li et al.,
2012)










72
(三)中鏈脂肪酸對P.acnes誘導 MAPK pathway 磷酸化之影
響
本實驗探討 capric acid 抗發炎作用機制，結果顯示 capric acid 在 25, 50, 100
M 三個濃度下，皆可以顯著降低 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現。

MAPK pathway 也是參與調控免疫反應中一條相當重要的途徑。MAPKs 家
族主要可以分為三類，extracellular signal-regulated kinase(ERK)、p38
mitogen-activated protein kinases(p38 MAPK)及 c-Jun N-terminal kinase(JNK)，這
些 kinase 當細胞外界刺激由細胞膜傳入時，會經由上游一連串 MAPK kinase
kinase（MAPKKK）、MAPK kinase（MAPKK）的磷酸化作用而活化，進一步
活化更下游的蛋白質激酶、核蛋白或轉錄因子等，而將訊息由細胞膜傳遞到細胞
核內造成一些生理反應。
p38 主要與發炎反應有關，它會受到一些生理壓力、LPS、滲透壓力等因素
的刺激而活化，啟動基因調控機轉，在免疫細胞則是與發炎物質的產生相關，包
括 TNF, IL-1, IL-6, IL-8 等。ERK 和 JNK 也會被 LPS、TNF、IL-1、滲透壓力或
紫外光所活化。自由基的生成，超氧陰離子會活化 MAPK pathway，促使 MAPK

路徑中的 JNK, ERK 表現增加，活化下游 c-jun and c-fos，誘發 c-fos 主要是透過
ERK 傳導路徑，而 c-jun 的誘發主要則是透過 JNK 傳導路徑。AP-1 為一轉錄因
子，主要由 c-fos 蛋白與 c-jun 蛋白結合成異二聚體(heterodimer)或 c-jun 蛋白本身
形成同型二聚體(homodimer)所構成，能夠與 DNA 上的 AP-1 接合區結合，調節
細胞的基因表現。研究指出，P.acnes 會刺激活化 IL-8 promoter，增加表現 AP-1
和 NF-responsive elements，而 nicotinamide 則會抑制此轉錄階層來向下調節

IL-8 的產生(Grange, et al., 2009)。另外，在同一研究也證實 P.acnes 藉由活化
HaCaT cells 的 TLR-2 使得-degradation 和刺激 MAPK pathway；若在 P.acnes
刺激前先將 HaCaT cells 以 nicotinamide 處理，則可預防-degradation 和 ERK,

JNK 的磷酸化，並且也發現抑制 IL-8 mRNA 產生。
73
Figure. 5-3. Proposed mechanisms of velutin in inhibiting TNF-α and IL-6
production in macrophages.(Xie et al., 2011)
另外，P.acnes 所刺激產生的 TNF-、IL會增加 MMP-的表現，當 MMPs
表現會造成毛囊基質分解增加，而 TNF-不僅會抑制嗜中性白血球凋亡，並促使
嗜中性白血球聚集、沉積而促進毛囊發炎的情況Dessinioti & Katsambas；

在一個有關呼吸疾病的研究中發現，carbon monoxide (CO)具有抗發炎的效果，
藉由調控 MKK3/p38 MAPK pathway 可以抑制 LPS-induced RAW 264.7 cells 產生
TNF-, IL-6Wang et al 。

因為在 Nakatsuji 等人 in vitro and in vivo 的實驗結果發現 lauric acid 具有抑
制 P. acnes 生長的能力，並且具有抑制 P.acnes 所誘發的發炎反應之效果
(Nakatsuji, et al., 2009)。另外，lauric acid 與 capric acid (10:0)在文獻中發現亦能
夠抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生的 PGE2，顯示也具有抗發炎的能
力(Wu, et al., 2009)。所以本實驗使用 lauric acid 當作對照組，結果顯示 capric acid
降低 p38, ERK, JNK, p65 蛋白質磷酸化的表現效果優於 lauric acid，推測 capric
74
acid 可能有比 lauric acid 更佳的抗發炎能力。
綜合上述文獻，推論中鏈脂肪酸應該是藉由減少 MAPKs, NF-B 的活化，

進而抑制 P.acnes 誘導 THP-1 細胞之促發炎細胞激素的產生，而達到抗發炎的功
效。
75
(四) capric acid 對於 pretreated AA 刺激 P. acnes 誘導 IL-8
產生之影響
於本實驗結果發現在 P.acnes-induced THP-1 模式中，預先處理的組別會
比沒有預先處理的組別有較高 IL的產生，但若與 capric acid 共同培養則會

降低 AA 所刺激產生的 IL-8。
文獻指出於病人檢體發現 LTB4，顯示痤瘡發炎可能不單是 P. acnes 引起，
而可能與 AA 代謝產物一起，對於 cytokines 分泌有加乘或促進作用。AA 經由
5-LOX 代謝生成與發炎相關的 LTB4，另外 Serhan 研究證實 5-LOX 參與的內生
性合成作用不僅生成 leukotrienes 等促發炎物質，也會產生具神經保護作用酵素
像是 lipoxins A4（LXA4）的物質，雖皆是由 AA 代謝生成的產物，但在生理活性
上卻有極大差別(Serhan, 2007)， Sobrado 等人也證實了 LXA4 為轉錄因子 PPAR
的促效劑agonistSobrado et al。PPAR負責調節配體依賴
ligand-dependent的轉錄抑制和活化，在急性發炎中扮演重要角色，實驗證實
PPAR能減少 cytokines(如:IL-6, IL-1, TNF- )的釋出，能抑制單核球細胞發炎細
胞激素的產生。PPAR活化使得 5-LOX 表現，而使 LXA4 合成，更增強了 PPAR
的活化，PPAR抑制基因的表現可能藉由拮抗 NF-和 AP-1 的活化，增加表現

抑制細胞激素的訊號（suppressor of cytokine signaling, SOCS-2）(Machado et al.,
2006)，抑制 ERK and JNK(Svensson et al., 2007)和引發 TRAF6 的
degradation(Machado et al., 2008)。
在 AA 代謝路徑中，經由 5-LOX 而生成 LTB4 除了會增加白血球、巨噬細
胞趨化聚積外，也會使增加促發炎細胞激素 IL-6, IL-8 產生。APKs 家族中，p38
MAPK 調節 mitogen-activated protein kinases-activated protein kinases（MKs）和
ERK 會分別使 5-LOX 上的 ser271, ser663 磷酸化，間接使得細胞內 5-LOX 活化
(Werz et al., 2002)。於 in vitro 研究顯示 p38 MAPK 可以調節 MKs 並磷酸化
5-LOX，且 MK motif 會出現在 5-LOX 序列中(Werz et al., 2000)。
4-hydroxynonenal（HNE）會經由 p38 MAPK pathway 誘使巨噬細胞內 5-LOX
活化，而 ERK 的影響較小，另外若給予 p38 抑制劑 SB203580 則會抑制
HNE-induced 的 5-LOX 合成(Yun et al., 2009)。
本實驗機制的結果部分，顯示 capric acid 在 25, 50, 100 M 三個濃度下，皆

76
可以顯著降低 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現，藉由上述文獻結果，可以推
測 capric acid 可能藉由調控細胞中 p38, ERK, JNK 蛋白質磷酸化的表現，來達到
抑制 5-LOX 活化的效果，降低 AA signal pathway 活化產生的 IL-8。
5-LOX
5-LOX
圖 5-4 細胞內 5-LOX 活化與 AA 代謝

Figure 5-4. Schematic illustration of cellular 5-LOX activation and AA metabolism.
(Werz, et al., 2002)
77
(五) capric acid 對於 AA 刺激 SZ95 sebocyte 脂質生成之影
響
SZ95 皮脂腺具有脂質生成能力，細胞體積變大，脂肪油滴聚集在細胞質以
及細胞核的衰退皆為皮脂腺細胞終端分化的現象，接著細胞會進行全泌作用
（holocrine secretion），然後死亡(Zouboulis et al., 1994)。本實驗使用 WY14643
（PPARligands）為正對照組，與皮脂細胞共培養 48 小時顯著促進細胞脂質生
成，確立 SZ95 皮脂細胞的脂質生成能力。結果顯示，三種中鏈脂肪酸不會影響
SZ95 脂質堆積作用；與 AA 共培養則會增加皮脂腺細胞脂質堆積現象。
過去的研究中提到， AA 及其代謝物不僅在上皮細胞分化的生理機制扮演
重要角色(Keeney et al., 1998)，在人類皮脂腺細胞內也相當重要(Zouboulis,
2000)。將 AA 與 SZ95 共培養會增加皮脂腺細胞質內脂質堆積，並且會觀察到細
胞凋亡的現象(Wrobel et al., 2003)。AA 可能會使痤瘡病灶的發炎情況更嚴重。
AA 代謝會影響 PPAR活化，這樣可能會使皮脂腺細胞脂質堆積增加，另外也會
增加促發炎細胞激素 IL-8, IL-6 的產生，皮脂的過度堆積和促發炎細胞激素所導
致的發炎反應都可能會造成痤瘡惡化。但 AA 與痤瘡的形成是否有關係仍須進一
步研究釐清。PPAR 可以調控皮脂的生成，以 PPARagonist-GW7647,
PPARagonist-GW0742, PPARagonist-GW2433, PPARagonist rosiglitazone 處理

不同於本實驗的另一株細胞株 SEB-1，發現皆會促進脂質合成，且服用 fibrates
（PPARligands）之高血脂病患以及服用 thiazolidinediones（PPARligands）之
糖尿病患皮脂生成較一般人增加了 77%(Trivedi et al., 2006)。
PPAR可能也受到pathway 上游分子所調控，當 cPLA2α作用在細胞膜
上，使得 AA 釋出，由 5-LOX 作用後經 PPARresponse elements 而活化 PPAR

與調控 COX-2, IL-6 的產生(Hazra et al., 2007)。另外在 Werz 等人的實驗中顯示
5-LOX 的活化與 p38 和 ERK 的活化相關(Werz et al., 2000)。
由上述文獻與實驗結果可以推測，capric acid 對於 AA 刺激 SZ95 脂質堆積
的影響，可能是藉由降低 p38 和 ERK 的磷酸化作用，而影響 5-LOX 的活化，使
得 AA pathway 活化受阻，最後影響脂質堆積與促發炎細胞激素的產生。
78
二、 In vivo 抗發炎活性評估
在本實驗室之前研究 capric acid 對於 P.acnes.引起的小鼠耳朵腫脹與發炎的
影響結果顯示，capric acid 具有 in vivo 的抗發炎效果(李, 2012)。因此我們也評估
並比較 capric acid, caprylic acid 和 caproic acid 對於 P.acnes.引起的小鼠耳朵腫脹
與發炎的影響，結果顯示三種中鏈脂肪酸皆能夠減少 P.acnes.引起的發炎反應。
Nakatsuji 等人（2009）研究也證實 lauric acid in vivo（2g per 10 L in 5% DMSO

in PBS）的抗發炎效果。Nakatsuji 等人（2008）
，為了說明 P.acnes 引起發炎的反
應，將 P.acnes(1x107CFU/mL)注射至 ICR 小鼠腹部皮膚安裝的 tissue chamber，
結果發現注射後 neutrophils 和 macrophages 會滲入 chamber，證實 P.acnes 會引起
發炎反應。
在臨床上長期使用抗生素治療痤瘡的病人，也面臨 P.acnes 具多種藥物抗性
的危機，而在全身性非特異性治療中會殺死大多數皮膚上的固有菌叢，影響皮膚
常駐菌叢的恆定；另外，若中斷痤瘡治療，會增加再次痤瘡發炎的情況。儘管治
療嚴重痤瘡所使用的 isotretinoin, 13-cis-retinoic acids 具有效抑制痤瘡病灶的發
展，但對於使用者會有一些像會增加出生缺陷率和憂鬱的風險，需謹慎使用。因
此新型痤瘡治療藥物的開發有其必要性，而為了評估目前痤瘡藥物或疫苗，痤瘡
動物模式的發展是必須的。部分阻塞的毛囊會形成一個理想的厭氧環境，使
P.acnes 增生而造成痤瘡損傷(lesions)。然而增加的 P.acnes 和其所產生的細胞外
酵素，毒力因素(virulence factors)，模式辦別受體(pattern recognition ligands)皆會
刺激皮膚造成發炎和痤瘡損傷。(Bojar & Holland, 2004)。
為評估樣品 In vivo 的抗發炎能力，本實驗室參考並改進 Nakatsuji 等人(2009)
建立的實驗動物模式(李，2011)進行動物實驗，使用相同品系小鼠，並使用重新
解凍培養活化之 P.acnes，將 P.acnes 濃度提高至 Nakatsuji 等人(2008, 2009)所使
用菌數的 6 倍劑量，則由病理組織切片的結果可以確定 P.acnes 已誘發小鼠耳朵
發炎。
雖然注射大量的 P.acnes 到老鼠耳朵可能造成組織壞死，但還是值得觀察
TLR2 耐受性是否受到重複注射 P.acnes 改變宿主對於注射菌液的敏感性的影響
(Medvedev et al., 2006)。在 Webster 等人測試治療痤瘡的動物實驗中，已經使用
79
P.acnes 來引起耳朵發炎腫脹的模式，在實驗中利用兔、小鼠、天竺鼠等動物的
皮膚組織研究 P.acnes 與 triglycerides 的相關性，發現小鼠、兔子僅能測到低濃度，
所以較不恰當作為研究痤瘡損傷脂質合成方面的動物模式(Webster et al.,
1981)。而兔子耳朵模式缺乏細菌的增殖和發炎現象，且因面積的關係要進行廣
泛藥物篩選與疫苗接種也不方便(Mirshahpanah & Maibach, 2007)。Rhino mice 因
具有較大毛囊(follicle)所以經常被用來篩選抗痤瘡的藥物；然而，因為 Rhino mice
的免疫系統有缺陷，所以無法產生針對胸腺依賴型抗原(thymus-dependent
antigens)的抗體(Takaoki & Kawaji, 1980)。因此使用了 ICR 小鼠建立動物的發炎
模式評估注射 P.acnes 引起的發炎情況。痤瘡的致病因素複雜，所以使用 ICR 小
鼠耳朵的動物模式並無法完全代表人類痤瘡的發生情況，除了動物耳朵細胞型態
與人類毛囊不同外，多數動物無法產生足夠的 triglycerides 來供給 P.acnes 生長，
儘管如此，仿效痤瘡形成的模式目前還是以將 P.acne 注射入老鼠耳朵的方式引
起發炎的實驗模式為較能夠模擬痤瘡發炎情況的動物模式。
研究顯示，不同碳鏈的脂肪酸顯示具有’抗菌能力，像是 lauric acid(C12 :0 )
在 in vitro 的抑菌實驗結果顯示不管是在痤瘡桿菌、金黃葡萄球菌或表皮葡萄球
菌都顯示 lauric Acid 的抑菌效果較 BPO(臨床用藥)來的好；在 in vivo 的實驗也證
實皮下注射 lauric acid 能夠降低 P.acnes 誘發的發炎反應，並顯著減少 P.acnes 的
生長數目(Nakatsuji, et al., 2009)。Lauric acid 為正常皮脂游離脂肪酸，僅管於皮
脂中含量稀少，但卻具有效抗菌作用(Wille & Kydonieus, 2003)；另外也發現
lauric acid 與 capric acid (10:0)抑制 LPS 誘發 RAW264.7 macrophages 產生
PGE2，具有抗發炎的能力 (Wu et al., 2009) 。
本實驗的結果發現，In vitro 抗發炎試驗中，capric acid 具有較好減少促發炎
細胞激素產生與抑制 P.acnes 生長的能力；而在 In vivo 抗發炎試驗中，抑制小鼠
耳朵腫脹的效果則是 caproic acid 最好；這樣的差異，應與脂肪酸的碳鏈長短不
同有關，需要更進一步的研究證實。
80
三、總結
(一) 抑菌實驗
在抑菌實驗方面，結果顯示三種中鏈脂肪酸以 capric acid 最具抑制 P. acnes
生長較果。
(二) In vitro 抗發炎實驗

三種中鏈脂肪酸皆能夠減少 P. acnes 刺激 THP-1 cells 所產生的促發炎細胞
激素 TNF-, IL-8,IL-1蛋白質和 mR。capric acid 在三個濃度下，皆可以顯

著降低 P. acnes 刺激 THP-1 cells 的 p38, ERK, JNK, p65 蛋白質磷酸化的表現。
(三) In vivo 抗發炎實驗

於 in vivo 抗發炎實驗中評估三種中鏈脂肪酸在體內減緩 P. acnes 誘發的發炎
反應與耳朵腫脹能力。結果顯示，三種中鏈脂肪酸能夠降低 P. acnes 誘發的小鼠
耳朵發炎與腫脹。
(四) AA-induced 發炎模式

AA 使 P. acnes 刺激 THP-1 產生的 IL-8 增加。Capric acid 則會降低單獨 P.acnes
和 AA+P.acnes 產生的 IL-8；另外在 SZ95 預處理 AA 後，AA+P.acnes 組產生的
IL-8 高於單獨 AA 組別；capric acid 會降低單獨 P.acnes 和 AA+P.acnes 產生的
IL-8。
(五) 脂質堆積
以 Oil Red 方法分析三種中鏈脂肪酸對細胞內脂質堆積的影響，並使用
WY14643(200M)為 Postive control，比較 LA(linoleic acid, 100M )與三種中鏈脂

肪酸對 SZ95 脂質堆積影響。實驗結果顯示，LA 會促進皮脂腺細胞內脂質堆積
作用，而三種脂肪酸則無明顯影響 SZ95 脂質堆積作用。
中鏈脂肪酸尤其是 capric acid 在 in vitro and in vivo 實驗中顯示可能經由抑
制 NF-和 MAPK pathway 來降低 P.acnes 誘發的促發炎細胞介質與巨噬細胞的

趨化，降低小鼠耳朵發炎反應與腫脹情形；且不會影響 SZ95 皮脂細胞脂質堆積。
因此推測 capric acid 應該具有痤瘡治療的潛力。
81
第六章參考文獻
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88
第七章附錄(動物實驗同意書)
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國立臺灣師範大學人類發展與家庭學系

acid and Propionibacterium acnes-induced

指導教授：蔡帛蓉 博士 ( Po-Jung Tsai, Ph.D.)

研究生：黃鈺涵 ( Yu-Han Huang )

TNF-IL-1，而將 P. acnes 與 capric acid 注射進 ICR 小鼠耳朵的 in vivo 實驗結

發炎細胞激素 TNF-, IL-8,IL-1蛋白質和 mR。capric acid IC50 為 22.9 M，

以 capric acid 作為後續機制探討的樣品，結果顯示 capric acid 在 25, 50, 100 M，

第二章 文獻探討 ..................................................................................................................... 3

第一節 皮膚結構 ..................................................................................................................... 3

第二節 痤瘡的致病機制 ....................................................................................................... 6

一、 Toll-like receptors (TLRs) ..................................................................................... 11

三、 Arachidonic acid signaling pathway ...................................................................... 13

第三節 痤瘡的治療 ............................................................................................................... 16

第四節 實驗材料 ................................................................................................................... 17

第三章 材料與方法 ............................................................................................................... 19

第一節 研究材料 .................................................................................................................... 19

第二節 實驗方法 .................................................................................................................... 28

二、 細胞存活率測定 (MTT) ...................................................................................... 28

五、 中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced p-38, ERK, JNK 磷酸化之影響 .................. 33

六、 轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NF-κB)活化分析 ........................................... 35

七、 動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估) ................................................................... 36

第二節 評估中鏈脂肪酸的抗發炎能力 ............................................................................... 44

壹、In vitro 抗發炎活性評估 ........................................................................................ 44

貳、In vivo anti-inflammatory effect .............................................................................. 53

參、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced MAPK pathway and NF- B 磷酸化之影響 55

第三節 capric acid 對 pretreated AA 刺激 P. acnes- induced IL-8 之影響 .......................... 61

第四節 脂質堆積 ................................................................................................................. 66

貳、中鏈脂肪酸之 SZ95 脂質堆積的影響................................................................... 67

參、AA 之脂質堆積的影響 .......................................................................................... 68

二、 In vivo 抗發炎活性評估 ................................................................................................ 79

第六章 參考文獻 ................................................................................................................... 82

第七章 附錄(動物實驗同意書) ............................................................................................ 89

本研究欲探討中鏈脂肪酸capric acid, caprylic acid, hexanoic acid是否具有抑制

圖 2-1 皮膚構造解剖圖(TORTORA, 2005)

三、皮下組織 (subcutaneous layer)

尋常性痤瘡的發生被認為是毛囊皮脂腺（pilosebaceous follicles, PSU）慢性

(Gollnick, 2003)，其中IL-1的增加會更加促使毛囊角質化，使得P. acnes更快速

圖2-2 P. acnes藉由活化IGF-1/IGF-1R system而促使角質增生和皮脂分泌。(Isard,

一些研究為了檢視P. acnes與痤瘡之間的關係，將P. acnes 注射入皮膚中，

圖2-3 P. acnes誘使痤瘡發炎機制(CM Tahir, 2010)

 P.acnes 會產生 lipases, proteases, hyaluronidases 和嗜酸性白血球趨化因子。

表2-2 痤瘡的重要發展及其治療(Williams, et al., 2012)

包括interleukin (IL)-1β, IL-8, IL-12 and tumor necrosis factor- (TNF-)(Kim,

一、 Toll-like receptors (TLRs)

將訊息放大並傳遞下去(Pitha, 2004)，接著活化IB kinase (IKK) complex，導致IB

圖 2-4 Toll-like receptor signaling.

三、 Arachidonic acid signaling pathway

花生四烯酸（Arachidonic acid; AA） 是屬於ω-6必需脂肪酸。當組織暴露

LTB4 LTC4 PGE2 TXA2 PGI2

圖2-5 Arachidonic acid代謝產生eicosanoids的途徑和eicosanoid的活化(摘自

核球和neutrophils的cytokines （TNF, IL-8）分泌量增加 (圖2-6) (Gaudreault &

由上述研究中，推測P. acnes可能與AA pathway產物- LTB4，有加乘作用共

圖 2-6 LTB4 藉由 CpG signaling 誘使單核球釋出 cytokine 的可能機制。(Gaudreault

Medium-chain triglycerides （MCTs）是 MCFA 甘油酯化產物。MCT 獨特的

(六) 西方墨點法(western blot)

1. 10 X cell lysis buffer (Cell Signaling, Beverly, MA,USA)

10 x lysis buffer 100 μL

PMSF (1M) (Sigma) 10 μL

1. DC Protein Assay 套組(Bio Rad)

A 液：30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) solution (Bio-Rad)

Tris (Tris Base, 1.5 M) (Sigma) 90.8 mg

TEMED (Sigma) 1.8 mL

溶於300 mL純水中，調整pH至8.8，加水定量至500 mL。

指導教授：蔡帛蓉博士 ( Po-Jung Tsai, Ph.D.)

第二章文獻探討 ..................................................................................................................... 3

第一節皮膚結構 ..................................................................................................................... 3

第二節痤瘡的致病機制 ....................................................................................................... 6

第三節痤瘡的治療 ............................................................................................................... 16

第四節實驗材料 ................................................................................................................... 17

第三章材料與方法 ............................................................................................................... 19

第一節研究材料 .................................................................................................................... 19

第二節實驗方法 .................................................................................................................... 28

二、細胞存活率測定 (MTT) ...................................................................................... 28

五、中鏈脂肪酸對於 P. acnes-induced p-38, ERK, JNK 磷酸化之影響 .................. 33

六、轉錄因子 nuclear factor-kappa B (NF-κB)活化分析 ........................................... 35

七、動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估) ................................................................... 36

第二節評估中鏈脂肪酸的抗發炎能力 ............................................................................... 44

第四節脂質堆積 ................................................................................................................. 66

第六章參考文獻 ................................................................................................................... 82

第七章附錄(動物實驗同意書) ............................................................................................ 89

花生四烯酸（Arachidonic acid; AA）是屬於ω-6必需脂肪酸。當組織暴露

七、動物實驗 (in vivo 抗發炎能力評估)