GP46-CAR 的设计与构建

成人 T 细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)是一种与人 T 细胞白血病病毒Ⅰ

(HTLV-Ⅰ)感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，HTLV-1
i
侵染 CD4+T 细胞，通过各种途径诱发细胞癌变，导致 ATL 的发生 ，该病预后不佳，传统疗
法诸如化疗放疗效果较差，CAR-T 疗法仍待开发。
ii
近年，有国外学者尝试以 CD7 为靶点设计并制备了 CAR-T，其结果并不理想 ，关键原
因在于 CAR-T 本身作为 T 细胞，其表面也存在 CD7 的表达，由此在实际治疗中 CAR-T 细胞
间会不可避免地发生自相残杀现象，因此，新的靶点亟待被发现。
考虑到 ATL 与 HTLV-1 的相关性，作者推测 ATL 细胞表面会表达 HTLV-1 的病毒抗原，并
iii
开始搜寻 HTLV-1 的外包膜糖蛋白（因其经常在受感染细胞表面表达 ），由此发现了靶点
gp46, The HTLV-1 env gene encodes a 488 amino acid precursor protein, which
generates a 62 kDa protein (gp62) after addition of five N-glycan chains, four
of which are in the SU .The gp62 is cleaved at a trypsin-like proteolytic site
spanning residues 309–312 into the mature SU (gp46) and TM (gp21) subunits.The
SU is entirely extracellular and remains linked to the virus through binding to
iv
the TM, which is embedded in the viral envelope .于 ncbi 查询资料得到其序列如
下：
1 mgkflatlil ffqfcplilg dyspscctlt vgvssyhskp cnpaqpvcsw
tldllalsad
61 qalqppcpnl vsyssyhaty slylfphwik kpnrngggyy sasysdpcsl
kcpylgcqsw
121 tcpytgavss pywkfqqdvn ftqevshlni nlhfskcgfs fsllvdapgy
dpiwflntep
181 sqlpptappl lshsnldhil epsipwkskl ltlvqltlqs tnytcivcid
raslstwhvl
241 yspnvsvpsp sstpllypsl alpaphltlp fnwthcfdpq iqaivsspch
nslilppfsl
301 spvptlgsrs rravpvavwl vsalamgagv agritgsmsl asgksllhev
dkdisqltqa
361 ivknhknllk iaqyaaqnrr gldllfweqg glckalqeqc cflnitnshv
silqerpple
421 nrvltgwgln wdlglsqwar ealqtgitlv allllvilag pcilrqlrhl
psrvryphys
481 linpessl
在确定了靶点之后，作者通过 ncbi 寻找其对应的 scfv 序列，并以此为基础构建了第二
代 CAR 序列，scfv 序列如下：
1 qvqlvqsgae vkkpgasvkv scrtsgytfs synihwvrqa pgqglewmgv
inpygrsttl
61 yarrfrdrvt mtrdtststv ymelsslrse dtavyfcgrl ysgapygldv
wgqgstvtvs
121 sgtggsgggg sggggsggga sdivmtqspl slpvtpgepa siscrssqsl
lhsngynyvd
181 wylqkpgqsp qlliylgssr asgvpdrfsg sgsgtdftlk isrvetedvg
iyycmqglqt
241 pltfgggtkv eik
 图一：antigp46 scfv 与 gp46 的结合模式图（来源于 ncbi）
CAR 序列自 5‘端至 3’端全长 1548bp，依次为 EcoR I 酶切位点序列、Kozak 序列、信号
肽序列（GM-CSF 受体α链的信号肽，NCBI ID HM852952. 1）;gp46 单克隆抗体（克隆号：
1c11） 的 scFv ;CD8a 的铰链区和跨膜区（aa135-205,NCBI ID BC025715. 1）、CD28 分子的
胞内信号区序列（aa180-220,NCBI ID BC112085. 1） 、CD3𝜁链序列（aa52-163,NCBI
ID:J04132. 1）、终止密码子，SpeI 酶切位点序列，由上海海吉浩格生物科技有限公司合成序
列并克隆至慢病毒载体质粒 pLVX-EF1α-gp46CART-IRES-mCherry 上

图二：构建完成的 pLVX-EF1α-gp46CART-IRES-mCherry 质粒
详细序列如下：
GAATTCGCCACCATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAG
GTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTT
CACCGACTACAACATGTGCTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCGACCCCTACAACGGCC
TGACCAGCTACAACCCCAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTTCATGCACCTGAAC
AGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAACTACTACGGCAGGAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCA
GGGCACCAGCGTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCG
GCGACATCGTGATGACCCAGGCCGCCAGCAGCCTGGCCGTGAGCGTGGGCGAGAAGGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAG
AGCCTGCTGTACAGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCCAAGCTGCTGATCTA
CTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCA
GCGTGAAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTACAGCTTCCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTG
GAGATCAAGGGCGGCTGGAGCCACCCCCAGTTCGAGAAGGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGC
GCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGC
TGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTT
TACTGCAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCA
TTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGAGCCCCCCGCGT
ACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGC
CGGGCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGA
GGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCA
CCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAACTAGT
由此成功构建了 CAR 结构，接下来进行 CAR-T 合成
（一）制备感受态细菌和质粒转化操作：
感受态细菌制备：
1)接种一个单菌落置于装有 4mL LB 培养基的无菌试管中，37℃恒温摇床培养过夜；
2)按照 1:100 的比例取适量的细菌菌液放到 100mL 的 LB 培养基中，选择在 OD600 是
0. 3 到 0. 4 的时候取出，随后将含有菌液的 LB 培养基分装到预冷
无菌的 50mL 离心管里；
3)50ml 离心管放置于冰上 5 到 10 分钟，然后于温度 4℃、转速 1100rpm,离心 5min,细
菌沉淀用 10mL 0. 1M 预冷的 CaC12 溶液重悬，再次于 4℃、1100rpm,离心 5min,弃沉淀；
4)再用 10mLCaC12 重悬菌体，于冰上放置 30min,然后于 4℃、转速 1100rpm,离心
5min;
5)用 2mL 预冷的 0. 1M CaC12 溶液重悬各管里的细菌，然后进行分装，选择预冷的
1. 5mLEppendorf 试管，每管取 200μL 菌液，并且分装管中加入适量的无菌甘油，甘油量
大概达到总体积的 15%,随后立即放到－80℃冰箱里面冻存。

图三：psPAX2 包装质粒
 图四：pMD2.G 包装质粒
质粒的转化：
1)取适量的质粒（CD7 质粒，两个包装质粒 PMD2G，PSPAX2） ，一般 lug 即可，加到
200μL 感受态细菌中，细心混匀；
2)将混匀好的质粒－感受态细菌混合物置于冰中 30min,然后立即进行 42℃的热休克处
理，90s,随后立即置于冰浴中 5min;
3)加到 800mLLB 培养基中，于 37℃、250rpm 振荡培养 45min,然后于常温
4) 离心，3000rpm、3min,小心弃去上清废液，大概留 100μL 左右液体重新悬浮感受
态细菌，在超净工作台上，将其均匀涂布于无菌的含氨苄抗生素的 LB 平板上，37℃恒温箱
中培养过夜，大约 16-20h.
质粒小提大提：按说明书操作，质粒经琼脂糖凝胶电泳酶切鉴定无误，可供下游实
验。
（二）慢病毒包装与制备
细胞培养：取出-80 度冻存的 293T 细胞，放入 37 度水浴锅，使其全部溶解，接着将
细胞液体加入装有 3mlDMEM 完全培养基中，温和混匀，离心细胞 4 度 1200rpm 5min,最后
去除上清液，用完全培养基悬浮后转入培养瓶，置入 37 度 5%CO2 培养箱中培养
细胞传代：本实验中，在 37℃、5%CO2 的恒温培养箱中培养 293T 细胞，使用含 10%胎
牛血清／FBS 以及双抗（100U/mL 青霉素＋100U/mL 链霉素）DMEM 培养基中。当细胞长到
大约 90%程度时，可认为处于对数生长期，倒掉旧的培养基，先用 PBS 或不含血清的 DMEM
培养基清洗细胞；吸净废液，再加入 1mL 左右胰酶用于消化细胞，可将将培养瓶置入 37℃
培养箱中，增强胰酶活性，放置 2 分钟左右，在普通显微镜下观察消化程度，直至细胞消
化完全；随后培养瓶中加入 3mL 的含血清的完全 DMEM 培养基，用于终止胰酶的消化，消化
时间不宜过长，以免损伤细胞活性；然后将细胞悬浮液移入无菌 15nl 离心管，4℃、1000-
1200rpm、5min,离心细胞；离心结束后小心弃掉上清，再用适量（1-2ml）完全 DMEM 培养
基重新悬浮细胞沉淀，按照 1:2 至 1:3 的比例将 293T 细胞传代到新的培养瓶中，或者 1:1
到 1:2 的比例传到 100mm dish 中备用包装病毒。
磷酸钙法共转染质粒：
day0：取对数生长期的 293T 细胞（当细胞长到 90%程度时），大约 5*106cells/100mm
dish 的标准铺细胞
day1：重新更换新鲜含 10%血清的 DMEM 培养基，约 15ml/100mmdish;
新的离心管中制备质粒与钙离子混合物如下：

pLVX-EFla-CD7-CART 21ug;
pMD2.G 8ug、psPAX2 11ug;
2M CaC12 94ul;
H2O up to 750ul.

悬空逐滴将 Ca2+DNA 混合物加入 750ul2xHBS 中，并且同时进行剧烈吹泡；静置 5 分

钟，同时可以用 10mM chloroquine 处理 293T 细胞，（10ul/10ml 培养基）；随后将
Ca2+DNA/HBSS 混合物均匀滴加至 293T 细胞培养皿中，继续培养 6-8 小时。
day2： 6-8 小时后去掉旧培养基，并用预先室温处理的 PBS 清洗，更换新鲜培养基。
day3：共转染 24 小时后，通过荧光显微镜观察到报告基因红色荧光，证明转染及基因
表达成功,48 小时后收集病毒上清液，并通过 0. 22um 滤器过滤，4℃冰箱封口保存，一周
内使用。

图五：转染后 24h 293t 细胞的荧光显微镜观察图像

（三）离心法感染 T 细胞（未进行）
细胞培养：T 细胞培养于 1640 培养基，10%FBS,为贴壁生长，分为两组，一组感染用
于建立 CART 细胞系，一组作为对照不感染；细胞置于 37℃，5%CO2 的恒温培养箱，取对数
生长期的 T 细胞并进行计数，备用病毒感染。
离心法感染：24 孔板中每孔铺 10~6 个 T 细胞，平角离心机，1000r/min,5min,4℃,
使细胞平铺于板底；吸去大部分上清液，每孔各加 1ml 病毒上清（用 0. 22um 过滤），平角
离心机，2500r/min,90min,25℃;吸去大部分上清液，每孔加 10%血清的 1640 培养基 1ml,
恒温箱培养至感染后 24h;感染后 24h,重复感染一次。感染后 48h,观察报告基因表达情
况，将 T 细胞转移至 T25 培养瓶继续培养，密度达 80%时，进行流式细胞检测及传代保
存。

创新：在 CAR 分子的筛选过程中，选择病毒外包膜糖蛋白 gp46 作为靶抗原，而非传

统的组织特异性抗原（CD7） ，巧妙地避免了 CAR-T 细胞的自相残杀现象，在保证 CAR-T 特
异性杀伤 ATL 细胞的同时，有望对抗 HTLV-1 感染，起到双重功效，具有较高的临床应用价
值
此设计思想的本质是借助外来抗原以增强体内靶细胞的识别特异性，从而增强 CAR-T
（亦或是其他经基因工程改造的免疫细胞）的靶向作用。
当今癌症治疗已全面踏上免疫疗法领域，实践过程中由肿瘤细胞抗原表达下调诱发的
免疫逃逸成为免疫治疗中一大棘手难题，导致了许多治疗后复发或治疗无效的案例发生。
上面所提及的增强肿瘤细胞识别特异性的思路，即可能为这方面的攻坚研发指明一条新途
径。
 展望：在此项研究中，由于资料有限，我们仅了解到 gp46 会在 ATL 细胞表面表达，
而在实际的人体治疗中，gp46 在 ATL 细胞上的表达率，平均表达量等等数据，均对于实际
疗效有着重要意义，对此，我们希望在将来的研究中，对这方面有所知悉。
在 scfv 序列的获取中，我们并未着力考虑 1c11 抗体对于 gp46 的亲和力水平，以及
其异源水平（在治疗中与抗 scfv 抗体的产生有关） 。对于抗体亲和力，我们愿通过杂交瘤
技术，噬菌体展示技术，筛选出高亲和力的抗体，而对于抗体异源性，我们则将利用信息
生物学技术对 scfv 序列进行人源化处理，尽可能降低其异源水平。
启发于近几年的各位大佬的研究成果，我们期待对 CAR 分子结构进行改良与创新，如
改造 CD3ζ的 ITAM 部分，在 ITAM2 和 ITAM3 点位上进行突变，从而提高 CAR-T 细胞的活化
v
水平 ；沉默或剔除 CAR-T cell 中 TCR，PD-1，Fas 基因，增强其在肿瘤微环境中的杀伤活
vi
性；引入第三代，第四代等新型 CAR 系统，增强其细胞因子的分泌水平 ；添加开关，在治
疗中实现对 CAR-T 的可控，提升安全性等等——优化方式无穷无尽，时刻鼓动着我们充满
探索热的心灵。
受限于时间与疫情，我们无以进一步开展 CAR-T 的慢病毒感染制备杀伤性验证，这也
是本试验中的不尽意之处（试验方案已悉数完成，却终落不到实际），期待在今后得以进
行。

i [1]陶玲,杨丽,王辉.人 T 细胞白血病病毒 1 型/人嗜 T 细胞病毒 1 型(HTLV-1)及其与相关疾病关系的研究进展[J].细

胞与分子免疫学杂志,2019,35(01):89-94.DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.008749.
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iii [1]李玉,熊伟,王三斌等.HTLV-1 感染 T 细胞克隆扩增和转化在成人 T 细胞白血病表达分析[J].现代生物医学进

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