32(2)282-286 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2016 年 4 月

椰子织蛾幼虫致病Bt菌的鉴定与杀虫活性测定

孙晓东 1,2，阎 伟 1，李朝绪 1，吕朝军 1，覃伟权 1*

（1. 中国热带农业科学院椰子研究所，文昌 571339；2. 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

摘要：从海南省五指山采集的椰子织蛾僵虫上分离得到一株对椰子织蛾幼虫具有毒杀作用的菌株 WZS171
并对其生物防治潜力进行评测。通过形态学、cry 基因的鉴定明确了该菌株为苏云金芽胞杆菌（Bt）。基因
鉴定结果表明该菌株含有 cry1Aa13、cry1Gb1、cry1D、cry1Ia、cry2Af 共 5 种新型 cry 基因，NCBI Blast
与 GenBank 中已知基因序列最大相似性分别为 98%、99%、90%、92%、99%；生测结果表明 72 h 后该菌
株菌悬液对椰子织蛾幼虫的 LC50 为 9.08 μg/mL，95%置信区间 6.72～12.26 μg/mL。该菌株含有 5 种新型的
杀虫编码基因，并且对椰子织蛾幼虫具有较高毒力，生物防治潜力大。

关 键 词：Bt；椰子织蛾；鉴定；杀虫活性
中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2016)02-0282-05

Identification of Bacillus thuringiensis from Opisina arenosella and Determination of

Its Insecticidal Bioactivity

SUN Xiaodong1,2, YAN Wei1, LI Chaoxu1, LÜ Chaojun1, TAN Weiquan1*

(1. Coconut Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Wenchang 571339, China; 2. College of
Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract: A virulent strain WZS171 with high infectivity was isolated from naturally infected and dead larvae
of Opisina arenosella Walker collected from Hainan Wuzhishan. The strain was evaluated for its insecticidal
bioactivities. The strain was identified as Bacillus thuringiensis by morphological tests and analysis of cry
genes. The new genes of cry1Aa13, cry1Gb1, cry1D, cry1Ia, cry2Af were found in this isolate. NCBI BLAST
revealed that the nucleotide fragments of these genes showed homology of 98%, 99%, 90%, 92% and 99%,
respectively, with the known genes at the GeneBank. Bioactivity of WZS171 against the larvae of Opisina
arenosella Walker was assayed in laboratory. WZS171 showed high insecticidal activity at 72 h post-treatment,
with a LC50 of 9.08 μg/mL and a confidence interval of 6.72－12.26 μg/mL at the 95% confidence level. These
results show that WZS171 is host specific in virulence and highly virulent against larvae of Opisina arenosella
Walker.
Key words: Bacillus thuringiensis; Opisina arenosella Walker; identification of cry gene; insecticidal activity

椰子织蛾 Opisina arenosella Walker（又称椰子木蛾、黑头履带虫、椰柱蛾、食叶履带虫[1]），属鳞翅

目 Lepidoptera 织蛾科 Qecophoridae，主要分布于印度、泰国、印度尼西亚、马来西亚、斯里兰卡、孟加拉、
缅甸、巴基斯坦等地[2]，是一种严重为害椰子、槟榔、蒲葵、中东海枣、大王棕等棕榈作物的外来入侵害
虫[3]，2014 年 3 月被列为全国林业危险性有害生物。椰子织蛾幼虫取食叶片，严重时整个树冠被入侵啃食
从而导致植株发育缓慢、果实产量大幅减少甚至绝产，严重影响作物的品质和产量[4]。近年来棕榈作物作
为经济作物和园林景观植物在我国南方大面积种植并从国外大量引入，导致椰子织蛾在我国暴发的威胁越

收稿日期：2015-06-30
基金项目：海南省重大项目（ZDZX2013008）；海南省重点项目（ZDXM20130049）
作者简介：孙晓东（1983-），男，博士，助理研究员，E-mail：sxd1949@163.com；通信作者，硕士，研究员，E-mail：qwq268@163.com。

DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2016.02.022
第2期 孙晓东等：椰子织蛾幼虫致病 Bt 菌的鉴定与杀虫活性测定 283

来越大[5]，目前海南、广西、广东已有大面积为害的报道[6]。
目前针对椰子织蛾的防治除了利用寄生蜂防控外[2]，主要还是以化学防治为主[1,4]，化学防治虽然在一
定程度上可以快速的防治该虫，但是化学防治引起的残留、抗性与再增猖獗等问题严重影响到自然环境与
人类的健康；虽然利用寄生蜂防控椰子织蛾在印度、斯里兰卡等地取得了一定的防治效果，但是国内的优
质寄生蜂品种引进与大面积饲养、释放等技术仍然没有有效开展[7]，因此如何结合国内现有研究基础寻找
一种更加科学有效的控制椰子织蛾为害的生物防治手段显得尤为重要。苏云金芽胞杆菌（Bacillus
thuringiensis，简称 Bt）是一种具有杀虫活性并且寄主广泛、便于培养、对人畜无害、环境友好的革兰氏
阳性菌[8]，是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂，对鳞翅目 Lepidoptera[9]、双翅目 Diptera[10]、鞘翅
目 Coleoptera [11]等多种昆虫，以及对线虫[12]、螨类[13]和原生动物等具有特异性的杀虫活性。在利用苏云金
芽胞杆菌防治椰子织蛾方面目前世界上未见相关详细报道。本文发现了一株对椰子织蛾幼虫具有较强毒力
的 Bt 菌株 WZS171，并对该菌株进行了形态学与 cry 基因的鉴定，为下一步 Bt 野生菌制剂研发提供理论
与应用参考。

1 材料与方法
1.1供试材料
LB 固体与液体培养基、1/2 LB 固体与液体培养基配制方法参照文献[14]。菌株 WZS171 分离自海南省
五指山椰子织蛾幼虫的僵虫。引物序列见表 1。椰子织蛾为本实验室人工饲养，饲料为新鲜椰子叶片，恒
温气候箱中饲养条件：温度为（28±1）℃，RH 为饱和湿度，光周期为 12L:12D。Taq 酶、限制性内切酶、
pMD19-T 载体、JM109 感受态细胞、凝胶回收试剂盒均购自 TaKaRa 公司；BAC 蛋白浓度定量试剂盒（增
强型）为 Byeotime 公司产品。
表1 鉴定引物及序列
Table 1 Primer sequences
引物 序列 来源
Primer Sequences Source
cry1 5′-AGGACCAGGATTTACAGGAGG-3′ 5′-GCTGTGACACGAAGGATATAGCCAC-3′ 苏旭东[15]

cry1i 5′-GCTGTCTACCATGATTCGCTTG-3′ 5′-CAGTGCAGTAACCTTCTCTTGC-3′ 宋福平等[16]

cry2 5′-GGAAGAACTACTATTTGTGATGC-3′ 5′-AATAGTTTGAATTACCGCGAGC-3′ 宋福平等[16]

cry3 5′-CGAACAATCGAAGTGAACATGATAC-3′ 5′-CATCTGTTGTTTCTGGAGGCAAT-3′ 苏旭东[15]

cry4 5′-GTGTCAAGAGAACCAACAGTATG-3′ 5′-ACTAAGTCTCCTCCTGTATGACCAG-3′ 本实验

cry5 5′-ATTGGAGGTGGTATTGCTGATAC-3′ 5′-ATAAGATGAAGACAGTGCTGGTGGTGG-3′ 本实验

cry6 5′-CAACAAATCCTAGCAATGGTC-3′ 5′-TAGAGAGTGGAACGACTTTACC-3′ 本实验

cry7 5′-GGATATGAAGATAGTAATAGAAC-3′ 5′-GCTGTAGCATGACATAATCGATG-3′ 本实验

cry8 5′-CGGCAAACTTAGTAGAATGC-3′ 5′-CTGACTGATTTCCACCATCACG-3′ 束长龙等[9]

cry9 5′-AGGACCAGGATTTACAGGAGG-3′ 5′-CCCAATGCGAAAGAACTAAG-3′ 本实验

cry10 5′-CGATGGATAACAATCCGAAAATCCA-3′ 5′-TACGACTTATTCCTCCATAAGGAGTA-3′ 本实验

1.2 菌株的分离纯化
将从野外采集的椰子织蛾僵虫用 0.1%的升汞表面消毒 30 s，然后用无菌水清洗 3 次，超净工作台晾干
后切成 0.5 cm 左右的小块接种到 LB 培养基上，30 ℃恒温培养 48 h，长出细菌后划线纯培养，将生长的单
菌落接种到 1/2 LB 培养基上，石蜡膜密封 4 ℃保存。
1.3 回复感染试验及室内杀虫活性测定
采用浸叶法[11]，将纯化的菌株在 1/2 LB 固体培养基平板上划线 30 ℃培养 48 h 后，无菌操作刮取菌体，
然后使用灭菌去离子水制备成菌悬浮液（含 0.1%吐温-80），将椰子叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致
的椰子叶片切成 15 cm 的段状，在各浓度的混合均匀的菌悬液（含 0.1%吐温-80）中浸泡 5 min，晾干，放
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入生测瓶中，每瓶接 4 龄幼虫 30 头，每个处理重复 3 次，28 ℃生化培养箱中保温，培养 72 h 后调查死、

活虫数，并观察幼虫取食情况。
1.4 Bt 扫描电镜样品的制备
分离纯化的 Bt 菌株在 1/2 LB 固体培养基平板上划线，置 30 ℃培养 48 h，在无菌工作台上刮取少许
菌苔，纯水清洗后再加入适当纯水充分悬浮，将砸碎的细小碎片浸润在悬浮液中 2 min 后取出，低温冷冻
干燥后备用。
1.5 Bt 质粒的提取与鉴定
分离纯化后的 Bt 菌株在液体 LB 中（230 r/min、30 ℃）培养 12 h，采用 Narva 等[17]的方法提取质粒。
采用 PCR-RFLP 方法对杀虫晶体蛋白基因进行鉴定，提取 Bt 菌株的质粒 DNA 进行 cry1、cry2、cry3、cry4、
cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10 类基因的 PCR-RFLP 鉴定引物参见表 1，鉴定方法参见宋福平等[16]
及苏旭东[15]。菌株 WZS171 的 cry1 类鉴定引物为 K5un2/K3un2 与 K5un3/K3un3，cry1I 类鉴定引物为
S5uni/S3uni，cry2 类鉴定引物为 S5un2/S3un2，其他基因类型的鉴定引物以此类推。分别进行各类 cry 基因
鉴定引物的 PCR 鉴定，PCR 扩增产物经凝胶回收试剂盒（TaKaRa 公司）纯化后连接 T 载体（TaKaRa 公
司）进行克隆，挑取阳性单克隆送样上海生工进行测序。
1.6 Bt 菌悬液所含蛋白的定量
首先接种 1/2 LB 固体培养基至菌体裂解（30 ℃恒温，48 h）；无菌操作刮取菌体，然后使用灭菌
去离子水制备成菌悬浮液，使用 Byeotime BAC 蛋白浓度定量试剂盒（增强型）进行菌悬浮液的蛋白浓
度定量。
1.7 cry 基因的克隆
使用凝胶回收试剂盒将 PCR 产物进行回收并纯化，纯化后的产物按照目的片段与 pMD19-T 载体 1:3
的比例 16 ℃连接 3 h，取 10 μL 连接产物加入到 100 μL JM109 感受态细胞中进行热激转化，具体转化方
法参见束长龙等[9]。转化完成后挑取阳性克隆在上海生工公司进行核酸测序。

2 结果与分析
2.1 菌株 WZS171 的回复感染鉴定
回复感染试验表明，菌株对椰子织蛾幼虫具有较高致病性，染病的椰子织蛾 4 龄幼虫在 24 h 后部分试
虫开始变黑并死亡，72 h 后染病的幼虫全部死亡并与之前采集的僵虫死亡症状相似。
2.2 菌株 WZS171 的形态学鉴定
将菌株 WZS171 在 1/2LB 培养基上培养 48 h 后形成单菌落，菌落乳白色，圆形或近圆形，边缘整齐，
菌落中间较厚，向四周逐渐变薄，一般 38 h 左右可观察到晶体。扫描电镜下观察到菌株 Bt 芽胞为长圆棒
状，晶体为菱形（图 1），初步鉴定该菌株为苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis。该菌株已于 2015 年 1
月 8 日保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉大学）；保藏编号：CCTCC M 2014679，保藏中心鉴定后分
类命名苏云金芽胞杆菌。
2.3 分子水平的鉴定
序列经 NCBI Blast 比对后与 GeneBank 已知序列 Sequence ID: gb|AF510713.1、gb|U70725.1、
gb|910166.1、gb|KF980886.1、gb|EF439818.1 的最大相似性分别为 98%、99%、90%、92%、99%，在苏云
金芽胞杆菌 Toxin Nomenclature 数据库中明确其最相似基因型[18]，最终确定该菌株含有 cry1Aa13、cry1Gb1、
cry1D、cry1Ia、cry2Af 5 种新型杀虫编码基因（表 2）。
2.4 菌株 WZS171 的伴孢晶体蛋白定量及对椰子织蛾的毒力
菌株 WZS171 菌悬液经定量蛋白浓度为 45.52 μg/mL。生物测定结果显示菌株 WZS171 蛋白对椰子织
蛾幼虫具有高杀虫活性，中毒的椰子织蛾明显的变黑死亡，整个虫体呈黑色，腐烂；而对照供试虫表现食
量较大，虫活跃，发育正常。
利用 IBM-SPSS 21.0 软件对椰子织蛾 4 龄期幼虫进行半致死浓度分析，结果表明，菌株 WZS171 对椰
子织蛾幼虫具有致死作用，其半致死浓度为 9.08 μg/mL（表 3）。
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A：4000 倍下的菌株 WZS171 The strain of WZS171 (4000×)；B：10000 倍下正在分离的晶体与芽胞 Separation of crystal and spore (10000×)；S：芽
胞 Spore；C：伴胞晶体 Crystal
图1 扫描电镜下 WZS171 的菌体与晶体
Fig. 1 The SEM photo of WZS171

表2 序列比对结果
Table 2 The result of sequence blast
克隆编号 Clone 片段大小 Fragment of gene (bp) 基因型 Gene type 序列号 Sequence ID 最大相似性 Indentity (%)

K2-3 1777 cry1Aa13 gb|AF510713.1 98

K2-1 1778 cry1Gb1 gb|U70725.1 99

K3-1 1579 cry1D gb|910166.1 90

SI-1 1337 cry1Ia gb|KF980886.1 92

S2-1 1370 cry2Af gb|EF439818.1 99

表3 菌株 WZS171 对椰子织蛾幼虫的杀虫活性（72 h）
Table 3 Activity of crystal protein WZS171 against O. arenosella (72 h)
浓度 Concentration (μg/mL) 校正死亡率 Mortality rate (%) 标准差 Standard devation LC50 (μg/mL)

45.52 87.77 8.39

22.76 76.67 3.33

11.38 53.33 12.02 9.08（6.72～12.26）

5.69 52.23 11.70

2.85 12.23 1.92

CK 0.00 0.00

3 讨论
采用 PCR-RFLP 方法对杀虫晶体蛋白基因进行鉴定，Bt 菌株 WZS171 含有与已知基因序列最大相似
性分别为 98%、99%、90%、92%、99% 的 cry1Aa13、cry1Gb1、cry1D、cry1Ia、cry2Af 5 种新型杀虫编码
基因。由于长期处于 Bt 选择压力之下的害虫会对其产生抗性，因此筛选到新的 Bt 基因资源解决害虫抗性
问题显得尤为重要[19]。本试验鉴定到的 5 种新型 cry 基因可以为延缓害虫对 Bt 作物与 Bt 制剂产生的抗性
提供理论支持，下一步将进行 5 种新基因全长序列的克隆与表达试验，为该菌株的进一步研发与应用奠定
基础。
本试验发现了一株可以杀鳞翅目害虫椰子织蛾幼虫的 Bt 菌株 WZS171，也是首次报道 Bt 菌对棕榈科
作物重要虫害椰子织蛾幼虫有生物活性，表明其具有巨大的生防潜力。但是本文并未报道该菌株对椰子织
蛾成虫的生物活性，实际上作者已经采用浸液法、虫体喷雾法[20]对椰子织蛾成虫进行了室内生物学活性测
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定，但是效果并不理想。推测因为椰子织蛾成虫不取食而 Bt 菌产生的蛋白又是作用于试虫中肠的肠毒素[21]，
所以导致菌株 WZS171 无法起作用。下一步将改进与优化试验方案来进一步验证菌株 WZS171 对椰子织蛾
成虫的活性。

参 考 文 献
[1] Shivashankar T, Annadurai R S, Srinivas M. Control of coconut black-headed caterpillar (Opisina arenosella Walker) by systemic application of

‘Soluneem’-A new water-soluble neem insecticide formulation[J]. Current Science, 2000, 78(2): 25.

[2] Venkatesan T, Jalali S K, Srlnivasa M K, et al. A novel method of field release of Goniozus nephantidis (Muesebeck), an important primary parasitoid of

Opisina arenosella Walker on coconut[J]. Journal of Biological Control, 2003, 17(1): 79-80.

[3] Venkatesan T, Jalali S K, Srinivasa M K. Competitive interactions between Goniozus nephantidis and Bracon brevicornis，parasitoids of the coconut pest

Opisina arenosella[J]. International Journal of Pest Management, 2009, 55(3): 257-263.

[4] 刘向蕊, 吕宝乾, 金启安, 等. 5 种杀虫剂对入侵害虫椰子织蛾的室内毒力测定[J]. 生物安全学报, 2014, 23(1): 13-17.

[5] 阎伟, 吕宝乾, 李洪, 等. 椰子织蛾传入中国及其海南省的风险性分析[J]. 生物安全学报, 2013, 22(3): 163-168.

[6] 李洪, 阎伟, 刘丽. 新入侵害虫椰子织蛾的发生及防治[J]. 中国森林病虫, 2015, 34(4): 10-13.

[7] 吕宝乾, 严珍, 金启安, 等. 警惕椰子织蛾 Opisina arenosella Walker (鳞翅目:织蛾科)传入中国[J]. 生物安全学报, 2013, 22(1): 17-22.

[8] Aaron J G, Jennifer L P, Eric H C. Field-evolved resistance by western corn rootworm to multiple Bacillus thuringiensis toxins in transgenic maize[J].

PNAS, 2014, 111(14): 5141-5146.

[9] 束长龙, 谷少华, 窦黎明, 等. 对小地老虎具有杀虫毒力的苏云金芽胞杆菌菌株的分离及鉴定[J]. 植物保护, 2007, 33(5): 41-44.

[10] Eitan B D. Bacillus thuringiensirs subsp. israelensis and its dipteran-specific toxins[J]. Toxins, 2014, 6(4): 1222-1243.

[11] 刘楠, 王少丽, 宋福平, 等. Cry1Ba3、Cry1Ia8 蛋白对 Cry1Ac 抗性小菜蛾的杀虫活性研究[J]. 植物保护, 2010, 36(2): 66-70.

[12] Sareh B R, Esmat M M. Efficacy of Bacillus thuringiensis cry14 toxin against root knot nematode, Meloidogyne javanica[J]. Plant Protect Science, 2015,

51(1): 46-51.

[13] Eva V A R, José R P G, Víctor M H V, et al. In vitro susceptibility of Varroa destructor and Apis mellifera to native strains of Bacillus thuringiensis[J].

Apidologie, 2014, 45(6): 707-718.

[14] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T, et al. Molecular cloning//A Laboratory Manual[M]. NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

[15] 苏旭东. 苏云金芽胞杆菌菌株的分离和 cry 基因的鉴定[D]. 保定: 河北农业大学, 2005.

[16] 宋福平, 张杰, 黄大昉, 等. 苏云金芽胞杆菌 cry 基因 PCR-RFLP 鉴定体系的建立[J]. 中国农业科学, 1998, 31(3): 13-18.

[17] Narva K E, Payne J M, Schwab G E, et al. Novel Bacillus thuringiensis microbes active against nemotodes and genes encoding novel nemotodes active

toxins cloned from Bt isolates[P]. Patent for an Invention, 1991, EP 19910305047.

[18] http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ [DB].

[19] 秦悦. 小菜蛾对 Bt 杀虫蛋白 Cry1Ac 抗性的分子机制研究[D]. 北京: 中国农业科学院, 2011.

[20] 曹雪艳, 王会利, 张杰, 等. 9 种杀虫剂对中华大刀螂幼虫的毒性[J]. 生态毒理学报, 2013, 8(3): 435-441.

[21] 靳婷婷, 王振营, 何康来. 亚洲玉米螟中肠类钙粘蛋白 Cry1A 毒素结合区对 Cry1Ac 毒素杀虫活性的影响[J]. 中国生物防治学报, 2015, 31(1):

41-47.