氣膠生醫科學期末報告

學號: M102020036

姓名: 李盈瑩

題目:Efficient measurement of airborne viable viruses using the growth-based

virus aerosol concentrator with high flow velocities

1. Introduction

1.1 病毒氣膠

是一種特殊的生物氣膠，透過受到病毒感染的個體產生的呼氣動作所產生

的病毒氣膠，根據氣膠粒子所在空氣中懸浮的時間可從數秒到達數小時，將小

於 100 微米所帶有病毒的氣膠都稱為病毒氣膠。病毒氣膠的組成有病毒，水，

表面活性劑，蛋白質，電解質等，而病毒氣膠中病毒的含量取決於氣動力學和

環境等因素有關。

Figure 1. 病毒氣膠產生方式以及病毒氣膠的特性 1, 2
 1.2 病毒氣膠傳播三階段

第一階段生成及釋出:受病毒感染的患者透過呼氣動作產生，不同部位(如

支氣管和喉部)會產生不同大小的氣膠。第二階段傳播: 病毒氣膠於環境中傳播

會受到環境因素(紫外光、溫度、相對溼度、氣流、通風)和病毒氣膠本身特性

(粒徑、病毒含量、pH 值、介面特性)影響。第三階段沉降及感染: 病毒氣膠沉

降機制會根據粒子大小影響其沉降部位，且不同部位的沉降機制不同。

Figure 2. 病毒氣膠傳播三階段

1.3 透過空氣傳播的病毒會引起呼吸道感染

2022 年 3 月 13 日，全球已經超過 4.5 億人口被通報感染 covid19，超過

600 萬人死亡，Sun et al., Science 371, eabe2424 (2021) 研究指出超級傳播事件是

導致 covid19 大流行的原因，因為飛沫和接觸傳染無法解釋這些超級傳播事件

發生的原因，因此很多研究也指出這些超級傳播事件的原因可能來自於病毒氣
溶膠的傳播，WHO 之後也承認 covid19 病毒透過氣膠傳播潛在的重要性，氣膠

可以長距離和短距離的傳播病毒，因此為了有效並且及時地預防會造成呼吸道

感染病毒的傳播，勢必需要開發一種能夠及時辨別和/或測量病毒氣膠中病毒含

量的系統。

1.4 如何收集氣膠樣品?

常用的收集氣膠樣品的儀器有很多種，第一種是 gelatin 吉利丁過濾器，此

種過濾器的收集效率在各種大小的氣膠尺寸中都很高，但因為收集時會對病毒

進行採樣或萃取導致對活病毒的回收率受到限制，因此建議在採樣時使用

gelatin 過濾器時應該使用低流速，讓收集的時候可以順利從固相溶解到液相。

Inertia-based sampler 基於慣性的採樣器，如 impactors、impingers 和旋風分離

器，此種採樣器只能收集慣性較大的粒子。Electrostatic sampler 靜電採樣器利

用靜電引力採集預先充電的病毒氣溶膠顆粒，可採集各種大小的生物顆粒，採

集效率高 3。Laminar flow water condensation based sampler 也稱作 Growth tube

collector (GTC)生長管收集器，或是活病毒氣溶膠採樣器，透過使用水凝結

(condensation)增加粒徑大小，使其慣性變大來捕捉粒子。GTC 通常有

conditioner 調節器、initiator 引發器、collector 收集器組成。

在 conditioner 中的管壁是冷和濕（相對濕度 100%)，initiator 中的濕熱管壁

將冷濕的氣流的溫度迅速升高，導致過飽和，隨後形成水滴，增大粒子尺寸，

讓收集器收集。水凝結增加粒徑大小，可以提高氣溶膠病毒的物理收集效率，
顆粒周圍的水可以減少因為收集對粒子的影響，確保可以收集到大量的活病

毒，因此可以進行現場快速測定病毒氣溶膠。

傳統的 GTC 收集亞微米等級的病毒，將其生長至 2-3 微米的物理收集效率

超過 90%，但是傳統的 GTC 使用的流速相對較低。隨著生長管中的流速增加，

流動顆粒的停留時間減少，導致凝結速度變慢，但是如果要直接從空氣中收集

病毒氣溶膠，通常空氣中的病毒濃度極低，因此為了收集具有活性的病毒和保

持良好的物理收集效率，流量需要盡可能維持最大，以確保可以對現場的氣溶

膠病毒進行快速的測定。常用的 GTC 由八根管柱組成，每個管徑直徑為

9mm，Flow rate 為 0.875 LPM(order of liter per minute, LPM) ，平均流速為

0.23m/s。4

作者考慮到剛剛提到的因素，在本篇研究中使用 GTC 在一定大小的管柱中

使用高流速的層流水，對會利用氣膠傳播的 MS2 和 T3 病毒有效的進行測量，

這個方式被稱作 Growth-based virus aerosol concentrator 基於生長的病毒氣溶膠

濃縮器。研究中增加每管管柱的流量來提高整體的 flow velocity，透過較高流量

的水凝結過程中，使用截面積尺寸小於粒子增加大小的噴嘴，在不損壞物理收

集效率和病毒存活率的情況下將流速達到最大化，這項研究也可以提供病毒氣

溶膠利用水凝結增加粒子尺寸時需要最小的尺寸才能進行採集。
 Figure 3. 不同種空氣樣品採樣器

1.4 過去利用層流水凝結採樣器來收集和偵測不同病毒氣膠

過去有相當多的研究利用層流水凝結收集不同的病毒氣溶膠的研究，實驗

過程中測試不同的流量參數、以及生長器的管柱大小和溫度和濕度的控制、採

樣時間等都會影響到偵測的結果，下表為作者統整過去有研究利用層流水凝結

採樣器來收集含有不同病毒氣溶膠採樣器的採樣情形，並且比較其採樣效率。
 Table 1 過去利用層流水凝結進行採樣病毒氣膠的研究圖表

1.5 如何分析收集到的氣膠樣品

研究中會測量在不同流量中 GVC 的入口處和出口處的病毒濃度來定義物

理收集效率，接著會利用斑點測定法(Plaque assays)和 qPCR(Real-time

Quantitative Polymerase Chain Reaction，Q-PCR)來測量初始病毒懸浮液和 GVC

收集到的氣膠樣品中相對總病毒含量，和相對具有活性的總病毒含量。

斑點測定法(plaque assay)，是使用固態培養基培養細菌菌落與噬菌體，藉

由計算噬菌斑總數(plaque counts)的方法較準確的計算樣品中噬菌體的數量。此

方法的理論基礎是:每一個噬菌體在宿主細菌的菌落上都能形成一個清晰容易區

別的噬菌斑，噬菌斑的數目與加入的噬菌體稀釋度成反比，因此噬菌體的數量

可以根據斑點形成單位(plaque forming units, pfu) 來推算。此方法所測到的病毒

為具有感染細菌能力的活病毒。
 Figure 4.斑點測定法用來測量樣品中具有感染力病毒含量

即時定量聚合酶連鎖反應(Real-time Quantitative Polymerase Chain

Reaction，Q-PCR ) Q-PCR 技術利用專一的 Primer probe(引子探針)會在 PCR(聚

合酶連鎖反應)過程中產生螢光，再利用螢光偵測系統來偵測釋放出的螢光量，

進而推算出每個循環所產生的產物含量，達到即時定量的目的。

Figure 5. Q-PCR 的分析步驟

2. Materials and methods

2.1 GVC 的設計

GVC 大致上跟傳統的 GTCs 結構很像，主要的差別是傳統的 GTCs 會使用

尼龍過濾器和使用熱電元件來控制溫度。GVC 的 conditioner 和 initiator 是包含

具有多孔的氧化鋁陶瓷芯來提高結構內部結構的穩定性，內徑分別為 5mm，

conditioner 的長度分別為 165mm 和 initiator 的長度為 85mm。為了確保內壁的

陶瓷芯保持恆定的溫度和接近 100%的相對濕度，會利用兩個恆溫浴在兩個管柱

外循環。收集器的部分會有三個 0.7mm 的噴嘴。

首先，透過 3-jet nebulizer:產生氣膠粒子，再經過 diffusion dryer 中烘乾氣

膠粒子，用 charge neutralizer 進行電和中和，並通過三向閥門，以不同的流速

流到 GVC 和 BioSampler，在 GVC 的入口處有 clean 和 dry air 來調節 flow rate

和 RH，並利用 SMPC 或是 CPC 來測量氣溶膠生長前後的大小。

Figure 6 .GVC 和 BioSampler 實驗架設流程圖，MFC:質量流量控制器 ，

SMPS:掃描粒子大小遷移率，CPC:凝結粒子計數器，OPC 光學粒子計數器

2.2 GVC 的收集器

在利用 GVC 收集氣膠時，會將 conditioner 的內壁溫度設定為 5 ◦C，

initiator 的內壁溫度設定為 30~45 ◦C，在 collector 的地方會有三個噴嘴孔內徑

0.7mm、直徑 23mm 的玻璃罐子，收集 Size-increased particle。 Collector 會以

兩種模式收集，分別是 Impingement 和 impaction，impingement 方法又分為

non- immersion 和 immersion 的方式，他們三種的差異是: impaction method 是

噴嘴噴出氣膠粒子並利用距離噴嘴 1mm 玻璃平台收集，non-immersion

impingement method 是噴嘴噴出的氣膠粒子會被距離 1mm 含有採樣介質的液體

玻璃器皿收集，immersion impingement method 是噴嘴會浸入採樣介質收集氣膠

樣品。在不同的流量下噴嘴的截斷大小為：在 3LPM 是 0.72μm、4LPM 是

0.61μm、5LPM 是 0.54μm、6LPM 是 0.48μm。作者在本篇研究中會比較這三種

模式收集到的病毒氣膠的物理收集效率、氣溶膠中相對總病毒濃度，相對具有

感染力的病毒濃度。

Figure 7. 本研究中使用 GVC 的結構

 Figure 8. 不同收集器的收集方式

2.3 實驗流程

在不同流量的大小下，比較聚苯乙烯乳膠粒子(PSL)做為模擬粒子和兩種含

有病毒的氣溶膠粒子，經過 GVC 之後粒子凝結的顆粒大小和利用三種收集方

法的收集效率。

透過 qPCR 和斑塊測定法計算在不同流量時，比較 GVC 和 BioSampler 收

集到的氣膠樣品中相對總病毒數、和相對具有感染力病毒的含量。

2.4 物理收集效率

病毒氣膠物理收集效率是利用測量 GVC 入口和出口的粒子濃度來計算，

並且會比較 collector 不同收集方法所收集到的粒子濃度。

收集效率的計算公式如下：

2.5 病毒氣膠實驗

首先，會進行病毒氣膠的採樣，會進行兩種不同初始病毒濃度的懸浮液的
氣膠採樣，會使用不同流量大小進行收集，分別是 1-6LPM，流速 1LPM 代表

是傳統的 GTCs 的流速。利用 impingement method 收集樣品之前會先在玻璃器

皿中先加入 1.5mL 1xPBS，用 impaction method 會在採樣後加 0.5mL 1xPBS 到

玻璃器皿中。BioSampler 採樣流速為 12.5LPM。進行低初始病毒實驗時，會將

原始的懸浮液稀釋 10 倍，再進行採樣。

利用 qPCR 分析採集到的樣品和初始懸浮液中基因含量，並利用此結果計

算相對總病毒含量(RTVC)，計算公式如下：

利用噬菌斑測定法來計算採集到的樣品和初始懸浮液中相對具有感染力病毒的

含量(RIVC)，計算公式如下：

並且利用計算出的 RIVC 和 RTVC 的比值換算出採樣前後具有感染力的病毒和

病毒總數的比例得到具有感染力的病毒百分比，計算公式如下：

因爲在空氣中病毒濃度相對低，需要確保樣品介質中的氣膠病毒的粒子具

有良好的富集率(Enrichment Ratio)。樣品的富集率代表在採集介質中含有多少

程度多寡的氣膠粒子，計算公式如下：
 Q 為 GVC 的流量，η 為物理收集效率，t 為採樣時間，V 為樣品介質的體

積，impaction 收集器的樣品介質體積為 0.5mL，impingement 收集器的樣品介

質體積為 1.5mL。

3. Results and discussion

3.1 粒子成長大小

首先是粒子在固定流量下，改變 initiator 的溫度觀察粒子凝結的大小。圖 a

中是在 3LPM 的流量下，GVC 的 initiator 在不同的內壁溫度實驗值和模擬的粒

子的 partical size distribution 的作圖，Initiator 的內壁溫度從 30 度上升到 45 度

後離開 initiator 的粒子大小變大（計算中位數直徑增加），而且實驗組病毒氣溶

膠粒子增長的結果和模擬的粒子增長的 CMD 結果相似。當改變流量大小，維

持固定的 initiator 內壁溫度，觀察到隨著流量變大，大流量粒子增加的大小，

小於流量較小的粒子增加的幅度，但大多數的粒子在流量範圍為 3LPM-6LPM

時，粒子增加的大小都大於收集器的噴嘴的截斷尺寸。
 Figure 9. (A)當溫度從 30 度上升到 45 度後離開 initiator 的粒子大小從 1.12

微米變成 1.86 微米，當溫度增加粒子的直徑變大。(B)當 initiator 溫度固定為 45

度時粒子的流量從 3LPM 為 1.86um 在 6LPM 時變為 1.44um。

3.2 粒子的物理收集效率

兩種病毒氣溶膠的收集效率有相似的情形，在設定的流速範圍內兩種病毒

氣溶膠透過 impaction 收集的氣溶膠的物理效率相對差異小於 1.3%。當流量從

3LPM 增加到 6LPM 後，收集效率從 99.3%下降到 70.2%，利用 Immersion

impingement method 的收集效率從 97.8%下降到 75.0%，Non-immersion

impingement 的收集效率從 99.4%下降到 91.2%。總體而言，impaction 在流量為

6LPM 的情況下表現出更好的收集效率，但流量到 7LPM 時收集效率下降到

76.5%。作者認為 impaction method 收集效率較好的原因可能是由於

impingement method 中液面上的凹坑造成噴嘴和水面的距離變長，而 impaction

method 則是固定的距離不會改變。而且在 impingement method 中可能會出現

reaerosolization 的情形和反彈的效應而造成收集效率地降低。

收集效率隨著流量增加而降低可能是因為流量大造成粒子在管住中停留時
間較短，因此粒子增長的情形不顯著，此外 immersion impingement method 比

non immersion impingement method 表現出更好的收集效率，但是在統計學上流

量在 5-7LPM 之間兩者並沒有顯著差異(p>0.11)，因此在之後的病毒氣溶膠實驗

中會比較收集器為 impaction 和 non-immersion impingement method 來測量在

6LPM 以下的病毒氣溶膠實驗數據。

Figure 10. 兩種病毒利用 GVC 收集的物理收集效率

3.3 透過 qPCR 來測量病毒粒子

作者透過 qPCR 比較利用 GVC 中兩種不同收集器 Impaction method 和 non

immersion impingement method 和 biosample 所收集到的病毒氣膠中的總病毒含

量。可以從圖中看到兩種病毒的 RTVC value 會隨著流量從 1LPM 增加到 6LPM

而增加，圖表中括號代表 impaction 和 impingement method 收集到的數據和

BioSampler 收集的數據的相對數值。雖然 GVC 中 impaction method 測試的流量

(6 LPM)是 BioSampler 流量(12.5 LPM)的一半，但收集到的病毒氣膠中 MS2 和

T3 噬菌體的 RTVC 值分別比 Biosampler 高出 59 倍和 7 倍。Biosampler 的收集

效率和收集介質濃度取決於收集體積和 BioSampler 的標準條件（12.5 L/min, 20

mL）收集效率從 82.7%(20mL)下降至 24.8%(5ml)當以 12.5L/min 採樣時，使用

20mL 會導致細胞濃度會是 5mL 的五倍高。在較大的體積中有較高的收集濃

度，impingement method 中採樣介質為 1.5mL，Impaction method 中是以 0.5mL

進行 elution。由 GVC 和 biosampler 收集到的 T3 噬菌體的 RTVC 的比例高於

MS2 的原因是因為 T3 病毒體積是 MS2 的病毒體積的兩倍大，因此 biosampler

收集到較多的 T3 噬菌體。同時我們也可以看到利用 impaction method 的 GVC

在相同的流速中收集到的兩種噬菌體的 RTVC value 也高於 impingement 收集到

的，可以知道是因為 impaction method 的採樣介質較少的關係。

Figure 11. GVC 和 BioSampler 收集到的病毒氣膠粒子中所收集到的相對病

毒總含量(RTVC)

因爲在空氣中病毒濃度相對低，需要確保樣品介質中的氣膠病毒的粒子具

有良好的富集率(Enrichment Ratio)。在流速範圍中兩種病毒氣溶膠粒子的 ER 相

對差異小於 1.3%。ER 在流量從 3LPM 增加到 6LPM 時 ER 增加 83%，而收集

效率在 3~6LPM 範圍中下降 9%。最大的 ER 在單管流量為 6LPM 中被測到，和

在 electrostastic sampler 流量為 10LPM ，medium flow rate 0.1mL/min 還高

(67000)5; 也比使用八個 growth tubes 中流量為 7LPM 的管柱中的 ER(44707)還

高 4。Condensation-based samplers 中有一些重要的參數，像是入口濕度、流

速、管住溫度、病毒種類、採樣時間都會影響採樣的表現。

Table2 GVC 樣品收集到兩種病毒的富集率(ER)

3.4 具有活性的病毒在樣品中的含量

從兩張圖中可以看到當 flow rate 上升，RIVC 會上升，有跟 RTVC 有相同

的趨勢，T3 噬菌體在流量 6LPM 時使用 GVC 進行採樣的收集器用 impaction

和 impingement method 都比 BioSample 收集到的 RIVC 高出 727 倍和 145 倍，

作者認為 T3virus 的 RIVC 特別小是因為 T3 病毒結構脆弱，使用 BioSampler

收集時，因為高度加速情形下，受到介質衝擊導致病毒的結構被破壞而失去活

性。(BioSampler 採樣時的參數: average flow velocity=313m/s, 12.5LPM)

Impaction method(0.5mL) 比 impingement method(1.5mL)有更多具有活性的

病毒，因為兩者樣品介質體積的不同。使用 GVC 採樣時收集器為 Impingement

時，存在比 impaction 有更高的生物恢復性，因為在收集時會產生 water

envelope 來保護脆弱的病毒避免在採樣時受到損壞。使用 GVC 收集時，在流量

為 1-6LPM 時，兩種病毒都有大於 90%的活性病毒，活性病毒在不同流速下的

存活比例沒有顯著差異(p>0.05)。以上的結果代表採樣的過程中，具有傳染病毒

在採樣前和經過收集之後的數量維持一樣，因此有利於評估空氣中病毒的特

性。

和傳統的採樣器不同，使用 GVC 可以確保採樣時不破壞偵測到氣膠中活

病毒的數量，傳統的採樣器使用的流量(1LPM)因為流量較小，粒子無法增長到

一定的大小，採樣過程中病毒受到破懷而導致收集到的樣品中，存活病毒比例

較低。

Figure 12. GVC 和 BioSampler 中收集到的病毒氣膠粒子中具有活性感染力

的病毒含量。

3.5 具有活性病毒的百分比

儘管 biosampler 捕捉到的 MS2 病毒的 RTVC 數量很低，但 BioSampler 收

集到的氣膠粒子中 MS2 病毒的具有感染力的百分比超過 90%。

和 GVC 所有測試的流量相比之下，代表脆弱病毒的 T3 病毒在 biosampler

收集後氣膠粒子中存活病毒百分比極低 (p < 0.0043)。儘管它們的 RIVC 非常

小，但 BioSampler 中收集到的 T3 病毒的 RTVC 比 MS2 病毒的 RTVC 大得多

（471%），因為 T3 的尺寸更大。在使用 GVC 收集病毒氣膠時，病毒氣膠通過

growth tube 時，水凝結會形成 water envelops 在病毒上，可以保護病毒不受到破

壞。

Table 3. MS2 和 T3 噬菌體透過 GVC 和 BioSampler 收集到的病毒氣膠粒子

中具有感染力的病毒百分比。

3.6 在低病毒濃度時具有感染力病毒含量

使用 biosampler 採樣時可以發現兩種病毒收集到的存活病毒下降許多，因

為在低濃度的病毒時會有高度的 reaerosolization 的現象發生，但在高濃度時這

種情形會減少。MS2 濃度在 impingement or biosampler 的介質中是 102–106

PFU/mL 時一定會發生 reaerosolization 的現象，但是高濃度時因爲病毒會在樣

品介質中聚集，而減少 reaerosolization 發生的情形。利用 GVC 進行採集則不

會有這種效應是因為 GVC 的噴嘴部分的流速比 biosampler 小很多。

GVC 採樣時收集，collector 為 Impaction method 時在兩種高低不同濃度收集到

的氣膠樣品中的 RIVC value 只有 13%不同(p>0.13)，在統計學上兩者並無顯著

差異，而且使用 GVC 收集兩種病毒在流量 6 LPM 時都高於 biosampler。

以上的原因可以歸因於 GVC 的高收集效率和高濃縮能力，表示即使在空

氣中病毒濃度較低的情況下，它也能夠有效收集病毒氣溶膠。

Figure 13. 在低初始病毒懸浮液中，利用 GVC 和 BioSampler 收集兩種病毒

氣膠時具有感染力病毒的比例

4. Conclusion

作者利用 GVC 來採樣加上 qPCR 和斑塊測定技術來有效地測量 MS2 和 T3

的病毒氣膠，並且使用比傳統的採樣的流量還高。當流量範圍為 3 LPM (2.55

m/s) 至 6 LPM (5.09 m/s) 時，GVC 透過 impaction 法對兩種病毒氣溶膠顆粒的

收集效率為 99.4-91.2%，平均採樣流速為 5.09 m/s，是傳統 GTC 中使用的流速

的 22 倍。在 7 LPM 的較高流量下，病毒氣溶膠的收集效率降至 80%以下，

在 ER 中也有所下降。在使用 MS2 和 T3 噬菌體的病毒氣溶膠實驗中，RTVC

和 RIVC 值隨著 3-6 LPM 流量的增加而增加，並且在這些流量下，GVC 的

RTVC 和 RIVC 值明顯高於 BioSampler 的值。

目前要達到大流量採樣，並且收集到的樣品中的病毒具有活性的百分比要

高，在測定的流量中具有高富集比(ER 值要高)，這種高收集效率的方便攜帶型

的採樣儀器是目前具挑戰性的研究。在上述的條件下，GVC 是具有病毒氣溶膠

有效測量系統的潛力，GVC 實現了高濃度的傳入空氣傳播病毒（測試流量中的

最高的 ER 為 109,458）以及高存活病毒百分比（>90%），在管柱中流量為

6LPM 的管住中物理收集效率（>90%）。

因爲在採樣的過程中可以保留大量的活病毒再加上免疫測定，以上的特性

可以用來快速的了解和靈敏的診斷現場的病毒氣溶膠，特別是冠狀病毒等敏感

病毒或可以透過直接沉積在生物傳感器的傳感部分來進行測定。

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