公開日期：109 年 12 月 10 日

RA05I001.001

新冠病毒抗體中和力價檢驗方法
SARS-CoV-2 Neutralization Assay
1. 適用範圍：本方法適用於新冠病毒(SARS-CoV-2)感染患者或經新冠肺炎疫苗
免疫受試者血清中新冠病毒抗體之中和力價檢驗。
2. 檢驗方法：檢體與定量新冠病毒相互作用後，感染Vero E6細胞，並在3～5天
後以位相差顯微鏡(phase contrast microscope)觀察細胞是否出現
病變狀態(cytopathic effect, CPE)，紀錄與計算新冠病毒抗體100%
與50%之中和力價。
2.1. 工作環境(註1)：需在生物安全第三等級(BSL-3)實驗室中進行，新冠病毒感
染與稀釋等相關操作應在符合Class II，Type B2之生物安全
操作櫃中進行，並依衛生福利部疾病管制署相關規範(註2)操
作。
註1：本試驗會使用到第三級危險群(risk group 3, RG3)病原體，操作時應遵
守生物安全相關規範。
註2：感染性生物材料管理辦法、感染性生物材料管理作業要點、實驗室
生物風險管理、新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)定點照護檢驗(POCT)之
使用安全指引及新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)之實驗室生物安全指
引。
2.2. 裝置
2.2.1. 生物安全操作櫃(Biological safety cabinet, BSC)，Class II, Type B2者。
2.2.2. 高壓滅菌釜：可達121℃以上者。
2.2.3. 冰箱：可維持5 ± 3℃者。
2.2.4. 冷凍櫃：可維持-30 ± 3℃者。
2.2.5. 超低溫冷凍櫃：可維持-80 ± 5℃者。
2.2.6. 恆溫二氧化碳細胞培養箱：可設定35℃或37℃，並維持5% CO2者。
2.2.7. 細胞計數器：Beckman Coulter cell counter Z2，或同級品。
2.2.8. 位相差顯微鏡：可達400倍放大倍率。
2.2.9. 冷凍離心機：可供15 mL及50 mL離心管使用，可達2000 ×g以上，具有
低溫(4℃)溫控效果者。
2.3. 試藥
2.3.1. 磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline, PBS)。
2.3.2. 胰蛋白酶(Trypsin)。
2.3.3. 達爾柏克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle’s Medium,
DMEM)：Sigma-Aldrich D5796，或同級品。

1
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

2.3.4. 胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)。

2.3.5. 抗生素：含盤尼西林(penicillin) 10,000 units/mL及鏈黴素(streptomycin)
10,000 units/mL。
2.3.6. 細胞株：Vero E6細胞株(ATCC® CRL-1586™)，使用代數不超過15代，
且經細菌、黴菌及黴漿菌檢測陰性。
2.3.7. 病毒株：SARS-CoV-2 clade L。
2.4. 器具及材料
2.4.1. 可調式微量分注器：2 μL、10 μL、20 μL、200 μL及1000 μL。
2.4.2. 濾膜吸管尖頭(Filter pipette tips)：10 µL、20 µL、200 µL及1000 µL。
2.4.3. 刻度吸管/血清移液管：5 mL、10 mL及25 mL。
2.4.4. 血清瓶：100 mL、250 mL、500 mL及1000 mL。
2.4.5. 微量離心管：1.5 mL。
2.4.6. 離心管：15 mL及50 mL，PP材質。
2.4.7. 細胞冷凍小管：2.0 mL。
2.4.8. 細胞培養盤：T75 flask、T150 flask及96孔細胞培養盤(96-well plate)。
2.4.9. 稀釋盤：96深孔盤(96 deep well plate)。
2.5. 試劑之調製
2.5.1. DMEM-10%FBS：取DMEM 890 mL、FBS 100 mL及抗生素10 mL，混合
均勻。
2.5.2. DMEM-2%FBS：取DMEM 970 mL、FBS 20 mL及抗生素10 mL，混合均
勻。
2.6. 細胞培養
2.6.1. Vero E6細胞以DMEM-10%FBS進行培養，並於37℃，5% CO2之細胞培
養箱培養，供2.7.、2.8.、2.9.及2.10.節使用。
2.6.2. 計算Vero E6細胞數量並以DMEM-10%FBS配製為1 × 105 cells/mL，之後
接種於96孔細胞培養盤，每孔100 μL，置於37℃，5% CO2細胞培養箱
培養16-18小時後，供2.8.、2.9.及2.10.節使用。
2.7. 病毒製備
2.7.1. 取2.6.1.節培養之細胞並計數細胞數量，以DMEM-10%FBS配製為1 ×
106 cells/mL，取5 mL接種於T75 flask中，加入DMEM-10%FBS 5 mL，
搖勻後，置於37℃，5% CO2之細胞培養箱培養16-18小時後，供2.7.2.
節使用。
2.7.2. 自細胞培養箱取出Vero E6細胞，去除舊有細胞培養液後，以PBS 5 mL
清洗一次，去除PBS，接著加入病毒液3 mL (MOI=0.01)，置於35℃，

2
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

5% CO2 之細胞培養箱培養1小時，加入DMEM-2%FBS 9 mL，置於

35℃，5% CO2之細胞培養箱3-5天。
2.7.3. 以位相差顯微鏡觀察細胞產生病變狀態(cytopathic effect, CPE)，約70%
細胞產生細胞病變時，將細胞培養液移至15 mL離心管中，於4℃、2000
×g離心10分鐘，取上清液至另一管15 mL離心管中，將病毒小量分裝，
每管500 μL～1 mL，保存於-80℃冰箱，供2.8.、2.9.及2.10.節使用。
2.8. 病毒感染力價測定
2.8.1. 病毒感染前1小時，將2.6.2.節舊有細胞培養液完全移除後，以PBS 5 mL
清洗一次，去除PBS，加入新鮮配製之DMEM-2%FBS細胞培養液，每
孔100 μL。
2.8.2. 將病毒液進行10倍序列稀釋。取病毒原液100 μL，加入DMEM-2%FBS
細胞培養液900 μL中，共稀釋10階，將稀釋病毒液加入2.8.1節之Vero E6
細胞中，每孔100 μL，每階8重複，並置於35℃，5% CO2細胞培養箱中
培養3-5天，以位相差顯微鏡觀察細胞病變，並利用Reed-Muench方法計
算病毒之50%細胞感染力價(fifty-percent cell culture infective dose/mL,
CCID50/mL)。
參考範例

1. 計算50%細胞死亡之比例距離(proportionate distance)：
[(大於50%死亡) - 50%] / (大於50%死亡) - (小於50%死亡)
= (5/8 × 100% - 50%) / (5/8 × 100% - 0%)
= (62.5% - 50%) / (62.5% - 0%) = 0.2
2. 計算50%細胞死亡最終稀釋倍率之對數值(超過50%的細胞死亡的
稀釋組) = log10-5
3. 計算比例距離與稀釋倍率的總和：CCID50的對數計算= 10-5-0.2

3
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

4. 原始添加之病毒液體積：100 μL = 0.1 mL
每mL病毒之50%細胞感染力價：
CCID50 / mL = (1 / 10-5.2) / 0.1 = 1.6 × 106
2.9. 病毒中和試驗(註3)
2.9.1. 用於抗體中和試驗感染之病毒應先經2.8.節病毒的50%細胞感染力價測
試確認CCID50/mL。
2.9.1.1. 自2.6.2.節取出Vero E6細胞，於病毒感染前1小時，將舊有細胞培養
液完全移除，以PBS 5 mL清洗一次，去除PBS，加入新鮮配製之
DMEM-2%FBS細胞培養液，每孔100 μL。
2.9.1.2. 取血清檢體100 μL，於56℃加熱30分鐘使補體成分不活化。
2.9.1.3. 取不含FBS之DMEM 60 μL加入全新的96孔盤(A盤)中。參考下述盤
孔配置或其他適當配置方式，A1-10～D1-10之盤孔用於血清檢體，
A11～D11之盤孔用於血清對照組(serum control, SC)以進行監控，標
記A12～D12之盤孔用於細胞稀釋液陰性對照組(cell control, CC)。
取2.9.1.2.節處理之血清檢體100 μL及不含FBS之DMEM 400 μL進行
5倍稀釋，混勻後，在A1～D1分別加入5倍稀釋之血清檢體 60 μL，
於A列～D列共4列使用多爪微量吸管分注器進行2倍連續稀釋，由第
1行各孔吸取混合液60 μL，轉移至第2行，以此類推，一直向右到第
10行，並丟棄自第10行吸取之60 μL，使各孔體積皆含60 μL血清檢
體。(註4)

4
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

2.9.2. 配製100 CCID50/50μL之病毒液共10 mL(註5)，以每孔60 μL的體積分別將

病毒液加入2.9.1.2節已序列稀釋好之血清檢體，每孔60 μL。另加入5倍
稀釋之血清檢體於A11～D11 (SC)，每孔60 μL，以及加入不含FBS之
DMEM於A12～D12 (CC)，每孔60 μL，置於37℃、5% CO2細胞培養箱
作用2小時進行中和作用。
2.9.3. 自2.9.2.節抽取混合液100 μL，加入2.9.1.1.節細胞中，於35℃，5% CO2
細胞培養箱作用3-5天，供2.11.節計算與分析檢驗結果。
註3：病毒一經取出解凍後，應於當日使用。
註4：1個血清檢體進行4重複，可以在96孔盤中A列～D列與E列～H列同時
進行2個血清檢體試驗。
註5：同時供2.10.1.1.節使用。
2.10. 病毒液校正(Back titration)
2.10.1. 以下列方式配製病毒液，每個感染濃度8重複。
2.10.1.1. 利用分注器取不含FBS之DMEM加至全新的96深孔盤A2～A4中，每
孔900 μL，於A1加入2.9.2.節配製之病毒液1000 μL。
2.10.1.2. 將病毒液進行10倍序列稀釋。於A1吸取病毒液100 μL移至A2，以此
類推，一直向右到A4，並丟棄自A4吸取之100 μL。

2.10.2. 取不含FBS之DMEM 60 μL，加入全新96孔盤(B盤)之A1-H1～A5-H5，

取2.10.1.2.節的病毒液A1加入A1-H1 (共8重複)，每孔60 μL，取2.10.1.2.
節的病毒液A2加入B盤A2-H2，並以此類推取A3～A4並加入A3-H3～
A4-H4，另加入不含FBS之DMEM於A5～H5，每孔60 μL，置於37℃、
5% CO2細胞培養箱作用2小時。

5
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

2.10.3. 自2.6.2.節取出Vero E6細胞，去除舊有細胞培養液，以PBS 5 mL清洗

一次，去除PBS，加入含DMEM-2%FBS細胞培養液，每孔100 μL，再
依序取2.10.2.節所準備之混合液100 μL，加入A1～H1、A2～H2、A3
～H3、A4～H4及A5～H5，A5～H5做為病毒液校正之陰性細胞對照
組，置於35℃，5% CO2細胞培養箱中培養3-5天，以位相差顯微鏡觀察
CPE，並利用Reed-Muench方法計算病毒之50%細胞感染力價(註6)。
註6：每次試驗均需進行病毒量校正，病毒原液之50%細胞感染力價應
介於50-150 CCID50，以確保每次所使用病毒量合乎規定。
2.11. 中和抗體檢驗結果分析
2.11.1. 接續2.9.2.節，以位相差顯微鏡觀察細胞病變狀態並記錄新冠病毒抗體
之100%中和力價(neutralization titer 100, NT100)，以血清檢體之最高稀
釋倍率表示。
2.11.2. 另以Reed-Muench方法計算對數50%終點(logarithm 50% end point)，再
以對數50%終點之反對數(antilogarithm of logarithm 50% end point)，作
為新冠病毒抗體之50%中和力價(neutralization titer 50, NT50)。
參考文獻
1. Manenti, A., Maggetti, M., Casa, E., Martinuzzi, D., Torelli, A., Trombetta, C.,

6
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

Serena, M. and Montomoli, E. 2020. Evaluation of SARS‐CoV‐2 neutralizing

antibodies using a CPE‐based colorimetric live virus micro‐neutralization assay
in human serum samples. J. Med. Virol. 92: 2096-2104.
2. Loeffen, W., Quak, S., de Boer-Luijtze, E., Hulst, M., van der Poel., W.,
Bouwstra, R. and Maas, R. 2012. Development of a virus neutralisation test to
detect antibodies against Schmallenberg virus and serological results in suspect
and infected herds. Acta Vet. Scand. 54: 44-51.

7
 公開日期：109 年 12 月 10 日
RA05I001.001

檢驗流程圖