一、 实验室目前需要改变的习惯

实验室目前需要改变的习惯：
1. 在克隆检测的时候测序要测通
没有必要测通，一个测序反应就足以说明插入片段是否为目的片段；测通需要时
间和经费，应该没有两个测序反应或测通结果不一致的情况，这种方式只是浪费
了时间和经费。有时确实构建需要测通，但这是研究可变剪切或构建特殊的表达
载体，保证插入序列的位置精确，我们很少涉及。一般进行巢式 PCR 检测即可
，没必要测序。
2. 插入克隆后测通检测，一定和目的序列完全一样
这个可能永远也做不到，除拟南芥和毛果杨外 ( 毛果杨序列也不完全准
确 ) ，我们用的序列都是二代、三代拼接而成，本身拼接就不能保证完全正确，
一般认为 Sanger 测序是最准确的，因为其不需要拼接或拼接简单。
另外，不同个体有 SNP 存在，不能保证我们所研究的个体和测序株的序
列完全一致，所以，很多实验是要求用测序株进行基因克隆的，这是基本常识。
如果非测序株的基因序列非要和测序序列完全一致的话，基本做不到，只是浪费
了实验的宝贵时间。
 一、 实验室目前需要改变的习惯

3. 枪头、离心管甚至是 PCR 管都要灭菌后才用

如果不是无菌操作，千万不要灭菌，尤其是进行 PCR 相关的实验，因
为 PCR 的耗材上可能带有少量微生物，灭菌后微生物死了，其 DNA 会释放出来
，并附着在耗材上，会引起污染。尤其是进行反转录反应，微生物死后其 RNase
会释放出来，对 RNA 提取及反转录很不利。其次，灭菌锅的水不干净，其蒸汽
中含有一些杂质，在灭菌后会附着在耗材上，会对酶反应产生干扰。虽然这种干
扰可能我们检测不到，但其质量会有一定影响，因此，没必要画蛇添足。
再一个就是进口 PCR 管灭菌后会可能会减少其硅化程度，并导致管变
形，盖不严，质量类同国产管了。
一般而言，不论国产还是进口的耗材出厂都很干净，完全可以直接做
RNA 等提取，而且 RNA 的提取不是怕有菌，而是怕死菌在高温释放的 RNase 。
而有些写书作者不做实验，只是在理论上做推测，更有甚者，还让实验者用
DEPC 水洗涤提 RNA 的耗材。
RNA 的提取不需要低温，如果要降解的话，什么温度都会降解， 4 度降解的
也不比室温少多少，所以控制 RNA 的降解关键是提取溶液，温度影响甚微，但
所有教科书都不敢把 RNA 提取过程中的 4 度离心这一要求去掉。
 一、 实验室目前需要改变的习惯

4. 茎段外植体垂直放在培养基上
外植体是通过与培养基接触来吸收营养，平铺与培养基接触面积大，有
利于吸收营养快速生长，而且芽或不定芽都会对重力有感应，平铺不会影响其向
上生长。
因此，不论是组培还是微扦插都不需要茎段垂直插入培养基。唯一可能
需要茎段垂直插入培养基的情况是在转基因过程中难以除菌，将茎段一端切出伤
口后沾上菌，然后让与菌无接触的一端接触培养基，进行筛选培养，有成功转化
的个例。
5. 仪器摆放过于靠近和贴近墙壁
仪器要散热，都有自己的通风口，通风口处要让开一定距离，让其呼吸
。
实验室的灰尘是造成仪器毁坏的主要问题，在打扫卫生时候很少擦仪器
下面的桌面，导致灰尘过多，开窗会造成大量灰尘涌入，也要注意。
 二、酶学基本知识

酶的本质：蛋白质 ( 少数特例除外 ) ，酶反应要遵循蛋白质的特点。

酶反应的过程：酶与底物互作 ( 靠近 )—— 酶反应

因此，提高酶反应速度的话，主要从这两个环节入手。

酶与底物互作的力：离子键，亦称静电引力 ( 主要 ) 、氢键 ( 次要 ) 、范德华力 (

只有足够靠近才能产生，力不大 ) 、疏水力 ( 在靠近过程中基本不起作用 ) 、布
朗运动 ( 增加互作频率，对互作的维持不起作用，但很重要，与温度和溶液的介
质相关 )

维持酶与底物的互作主要是静电引力，而静电引力的大小主要取决于溶
液的离子强度和介电常数。

介电常数：指溶液对两个电荷引力的屏蔽作用，屏蔽作用越大，介电常数越高。
因此，酶需要低的溶液介电常数，但也不能溶液中无离子，因为适当的离子浓度
才能维持蛋白的高级结构。
 二、酶学基本知识

介电常数大小：
取决于离子浓度，浓度越高，介电常数越高，相同离子浓
度下价数越大，介电常数越高。
水为偶极子，即在分子中正负电荷分布不均匀，因此，纯
水也有一定的介电常数。
有机溶液存在偶极子，介电常数最低。但有些有机溶液会
使蛋白变性，如酚、仿等，而甘油、甲酰胺、 DMSO 、酒
精等则可增加酶的反应活性。
 二、酶学基本知识

理论上有机溶剂是作为酶反应的最好溶剂，因为其
介电常数很低，但酶无法溶解在纯有机溶剂中，或在有机溶
剂中变性，所以，最佳的酶反应溶液就是水。
蛋白质需要一定的盐离子浓度才能维持其高级结构，
因此，需要适当的离子浓度才能有活性，但离子浓度过高时
会有两个因素影响酶活性，一是盐析作用导致蛋白质聚集或
沉淀，二是介电常数过高，导致酶与底物互作力变小。
所以，调节反应溶液的离子强度也是一种重要的酶活
性调节方式。
 二、酶学基本知识

酶 Km 值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的底物浓度
，是酶的特征常数之一。不同的酶 Km 值不同，同一种酶与不同底物反应
Km 值也不同， Km 值可近似的反映酶与底物的亲和力大小： Km 值大，表
明亲和力小； Km 值小，表明亲合力大。米氏方程： V=Vmax[S]/(Km+[S])
[S] 表示底物浓度， Vmax 表示最大酶促反应速度。

Km 值的用途
1. 鉴别酶
2. 确定最适底物
3. 确定的最佳底物
4. 调节酶反应速度
例如，在反转录反应中， dNTP 的 Km 值很大，所以， dNTP 通常需要
1mM ，我们可以通过进一步提高 dNTP 浓度来提高反应速度。
 二、酶学基本知识

酶反应速度的主要决定因素

1. 酶和底物的互作能力，互作能力越强，酶反应速度越快。

2. 酶的活性，而酶的活性取决于温度、和酶的构象；

3. 酶量

4. 底物量

5. 热运动速度，酶和底物的结合可以看做通过热运动来相互碰撞，因此，
热运动越快，速度越快；

6. 反应体系的均一性，反应体系均一了，才能发挥最大效能。
 二、酶学基本知识

酶反应速度的主要决定因素

1. 反应体积

酶速度与反应体积趋势相反，即小体积对反应最有效，大体积效果
差，故在做酶反应时要做多个小体积反应，但不能做一个大体积。对
于酶反应体系，大的体系可以用于小体积的反应，但小体积反应体系
放大后不一定能有效。
2. 加样顺序
在进行酶反应的时候，要注意加样顺序，一般是先加水，最后加
酶，蛋白质类物质一定要在 buffer 和水加入后再加。
目的是最大程度保护酶活性，减少非特异反应，做多个反应的时候
，要一起加样，再进行分装。
 二、酶学基本知识

3. 混匀

至关重要，酶和底物等要在均一的溶液中才能反应，否则不起反
应或反应速度很慢。仅仅依靠热扩散的布朗运动是不足够的。以 PCR
反应为例，如果不对反应物进行混匀的话，仅仅依靠高温进行热扩散
也会使反应质量大大降低。而实验操作者水平差异也主要体现于此。

4. 酶量

酶量要适中，酶过多会有有过度或非特异性反应，产生一些非特
异性产物，而少量的酶会导致酶反应不完全，产物可能没有反应完全
，以聚合酶为例，过多可能产生非特异性扩增，过少则聚合不完全，
片段短。
 二、酶学基本知识
5. 温度
温度对酶促反应速度具有双重影响。升高温度一方面可加
快酶促反应速度，同时也增加酶的变性。因此，如果想获得优质的反
应，可以在高温下补加酶来维持高反应速度。
此外，高温有利于布朗运动，使得酶和底物碰撞几率加大，
增加了反应速度。
反应温度有时并非合适的温度，以连接酶为例，其最高活
性 37 度，但在 37 度时两个 DNA 片段因为热运动会不能有效对接，
反而减少酶反应速度；
另外，在完成正常酶反应后，有的方法推荐高温灭活酶，
但没有必要，可以适当提高反应温度，使酶利用自己剩余的活性完成
高质量反应。
 二、酶学基本知识

6. 酶稳定剂
蛋白只有在低温、甘油存在、蛋白浓度高的
时候才能稳定。在酶反应过程中，为保证酶不变性，加入
其它蛋白来提高蛋白浓度来保持其活性。因此，有些反应
要加入 BSA 等，即可维持酶的稳定性。也可以加入甘油，
但其粘滞，影响酶和底物的运动和互作。
7. 底物
可以通过增加底物的量来提高反应速度，但
这常会导致反应不完全；另一种方式是通过将底物进行纯
化，提高反应速度，如我们的 DNA 、 RNA 、蛋白等在不
同纯度下反应的速度不同。
 二、酶学基本知识

8. 减少介电常数
加入可以与水完全互溶的有机溶剂来减少介电常数，增加电荷间
的互作，如甘油、甲酰胺、 DMSO 等。同理，少量的乙醇、甲醇、
异丙醇等也可以起到促进酶活作用。改变 buffer 的浓度也可能改变酶
活性，但具有不确定性，需要试验。
9. 酶反应的万能增速剂 PEG
其空间排阻作用可以有效增加酶和底物的浓度，不仅可以
促进酶反应，还可以促进核酸的复性，蛋白间的互作，但在蛋白互作
中高浓度的 PEG 会将蛋白沉淀。一般用 PEG6000 或 PEG8000 ，其
工作浓度为 5-15% 。
 二、酶学基本知识

10. 运动增速剂
酶和底物的互作可以在一定范围内看做热运动自由扩散，通过随
机碰撞来提高互作率和互作速度。因此，减少物质的运动阻力可以提
高酶和底物间的互作。一些中性去污剂它们不仅可以维持酶的活性，
还能减少酶和底物在溶液中的运动阻力，提高其互作，但不能用高浓
度，否则会影响酶活。一般为 0.05 － 0.1 ％的 Tritonx-100 或
Tween20 等。很多公司只是认为其有稳定酶的活性，而它们主要的作
用是减少酶底物在碰撞中的阻力则很少有人认识到。
11. 反应时间
越长越好，不要按说明书进行设定反应时间，按它们的时间做出
来的仅仅是合格，不能达到优秀，因为涉及到同类产品的竞争，反应
时间长的话会认为它们的酶活低，所以它们会写上最基本反应所需要
的时间。
 二、酶学基本知识

12. 酶的反应规律

酶量过多会导致酶的反应出现一些非特异反应，具体表现为内

切酶的星号活性， PCR 的不严谨延伸等等，酶过多的话就要做一

些负功。

酶量过少的话，会导致酶的反应不完全，表现为酶在没有进行

完一个反应的时候，又开始了另一个反应。具体表现为 Taq 酶的

延伸不完全，导致 PCR 产物弥散；逆转录酶的反应不完全，导致

反转录过短。
 三、 PCR 技术

扩增的公式为 Y=(1+X)n
式中 Y ：产量 ; X ：扩增效率 ; n: 循环次数。
X 在整个 PCR 过程中是不断变化的 (0-1) ，大致可以分成三个阶段，第
一阶段是 PCR 的是 PCR 的起步阶段，这一阶段： PCR 产物量积累很慢，
X 趋近于 0 ；第二阶段：为指数扩增阶段， PCR 产物迅速积累，此时
X 趋近于 1 ；第三阶段：平台期，此时， X 逐步趋近于 0 ， PCR 产物
积累速度逐渐下降，最后不在积累。
 三、 PCR 技术

PCR 产物的积累速度取决于扩增模板的浓度， PCR 的扩增曲线是 S 型，即开头的几个循环

目的基因序列增加量很少，但也在增加（增加的速度取决于模板的浓度，浓度越高，增加
越快），只有目的基因增加到一定浓度时，才能产生线性扩增，当浓度达到一定程度时，
其扩增效率又将下降，并逐渐到达平台期。

产生这种现象的主要原因是引物与模板的结合效率，模板浓度低时，引物与模板配对的几
率越低。因此，虽然在理论上只要有 1 个模板存在，就能扩增出产物，但实际上，如果模
板很少的话，则配对的几率很低，可能无扩增产物，因此，在低模板浓度下， PCR 结果又
不确定性，即可能有时会扩增出产物，有时扩不出来，模板浓度越低， PCR 的重现性越差
。

因此，第一期为 PCR 扩增效率的限制区，如果模板浓度低的话，则可能需要很多个循环才

能到达第二期，反之，如果模板浓度高到一定程度，则可能没有第一期，直接进入第二期
。
 三、 PCR 技术
退火温度：

一般而言，认为引物的最佳退火温度为 Tm-5 度，但实际上，这种理论是

无效的，有时退火温度比引物的 Tm 值高 10℃ 以上， PCR 反应亦能良
好进行。因为引物的 Tm 值高低也取决于溶液性质， DNA 在纯水中很容
易变性，在 Mg2+ 浓度高的溶液中则不容易变性。另外，引物的 3 端对
PCR 扩增至关重要，因此，设计引物主要是考虑其 3’ 端最后 5-7 个碱基
的组成与排列。

所以，各种引物的设计软件如果仅仅考虑 Tm 值的话是失败的，而梯度
PCR 仪的出现的原因也正是因为 Tm 值无法预测真正的退火温度。
 三、 PCR 技术
引物二聚体：
是一个接近 100bp 的条带，带型可能有些弥散，是引物聚合数
目不同导致的。
理论上引物二聚体是引物间能够形成配对区，而产生配对，但这
并非主要原因。其产生的主要原因是当靶序列不能有效扩增时，就会产
生大量的引物二聚体。因此，引物二聚体的多少也反应了 PCR 体系中靶
序列的多少，它与靶序列的浓度成反比。在没有目的带扩增的时候，引
物二聚体是否有是判断 PCR 扩增是否工作的金标准，有二聚体则说明
PCR 已经扩增，就是没有目的产物，否则就是 PCR 没有扩增，需要重
新进行 PCR 。
引物二聚体与靶序列浓度相关，注意不是模板浓度 ( 相同模板中
可能含有靶序列浓度高，也可能低 ) 。靶序列浓度过低时，容易产生扩增
失败或二聚体大量产生，靶序列的浓度过高时，容易导致 PCR 产物的弥
散。
 三、 PCR 技术
PCR 的局限性
1. 过短的序列 (<60bp) 不能进行 PCR ，因为在变性后的复性过程中，短的序列
可以竞争性地复性，导致引物无法与模板结合引发 PCR.
2. 过长的序列也不能进行 PCR 扩增，因为 Taq 的合成能力有限，太长的话，合
成不到全长，无法进行 PCR
3. 链内配对要优于链间配对，所以，当单链自己能形成高级结构，如锅柄结构，
会阻碍引物的配对，导致 PCR 无法进行。
4. 短引物的扩增效率要高于长引物
短引物与模板的复性效率更高，一般而言，为保持引物的特异性，其长度不要少
于 17nt 。
5. 引物的 3’ 末端不能用 A
一般而言， 3’ 端严谨配对才能引发 Taq 酶的扩增，但 A 在 3’ 末端不严谨配对情
况下也可以引发 Taq 的聚合反应，导致扩增不严谨或不特异。
 三、 PCR 技术
如何提高 PCR 的效率

1 梯度 PCR 摸索最佳退火温度；

2 减少介电常数，加 DMSO 、二甲基亚砜、甲酰胺等

3 减少反应体积，提高反应的灵敏性

4 增加底物浓度及酶浓度，如 dNTP 、模板等；

5 调整 Mg2+ ，但 Mg2+ 容易和 dNTP 结合，减少两者的游离的量，对 PCR 产生不利影响

；

6. 加 PEG6000 或 8000 至浓度 5-15% 。

7. 纯化模板

8. 加入 Taq 稳定剂， BSA 、明胶等

9. 加入微量 Triton X-100 等

 三、 PCR 技术

如何提高 PCR 的特异性

PCR 的非特异性主要来自两个方面，一个方面是模板浓度过低，导致非
特异性扩增，另一个方面是在非严谨条件下 PCR 启动。

对一种情况要增加模板浓度，或用 Touch down PCR ； PCR 的特异性取

决于模板的浓度，与浓度成正比，所以有 touch down PCR ，该方法的原
理是先在高退火温度下进行几轮的 PCR ，以增加 PCR 产物，然后再降
低一些退火温度，扩增几个循环，继续积累模板，当模板量积累足够时
，将退火温度降低很多，保证 PCR 的效率，进而扩增出大量 PCR 产物
。
 三、 PCR 技术
如何提高 PCR 的特异性

另一个方面是在非严谨条件下 PCR 启动，如在配制 PCR 反应过程中 PCR 已经

启动，由于退火温度很低，导致非特异扩增，这要求在冰上配制 PCR 体系，在
到 PCR 仪之前都在冰上，避免 Taq 酶工作，即冷启动技术。另一种是使用特殊
的 Taq 酶，大致有两种 Taq 酶，一种是用石蜡微球包裹的 Taq ，其在常温下被
包裹在石蜡中不工作，在 DNA 变性时被释放出来，进行 PCR 反应，另一种方法
是将 Taq 酶与其抗体结合，在常温下其不工作，在 DNA 变性的环节中，抗体被
高温变性，不再与 Taq 结合，使其工作。

我们在扩增单一产物时常看到一个很亮的主带旁有其他杂带，原因就是非特异扩
增导致。
 三、 PCR 技术
常用的 PCR 技术

PCR 的种类有很多，包括原位 PCR ， Tail-PCR ，不对称 PCR ，标记 PCR ，

巢式 PCR 、多重 PCR 、降落 PCR 等，可多达 30 种。我们常用的有如下：

1. 标记 PCR ，就是通过 PCR 技术将某些标记物 ( 如生物素、地高辛、荧光染料

等 ) 标记在扩增序列上，而扩增序列作为探针进行实验。

标记 PCR 的方式有两种，一种是在引物上加上标记，其优点是不会影响扩增序
列与蛋白等大分子物质的结合，保持扩增序列的原有生物学性质；缺点是标记上
的标记物较少；
另一种是将标记物偶联在 dNTP 上，然后进行 PCR 扩增，其优点是标记效率高，可以控制
标记 dNTP 的浓度，实现标记效率可控制。缺点是修饰后的 DNA 只能用作杂交的探针，即
只能进行复性，不能进行其他的研究，如蛋白 DNA 的互作研究，因为标记物会产生阻碍作
用。
 三、 PCR 技术

常用的 PCR 技术

2. 巢式 PCR ，就是设计两对引物，进行两次 PCR ，其中，第二次 PCR 的引物

的扩增区完全在第一对引物扩增区之内，还可以分为巢式和半巢式，其中，半巢
式是第二次 PCR 引物与第一次的有一个是相同的。

应用：

(1). 减少非特异性扩增，我们在扩增基因，尤其是文库的时候，因为用通用引物
，很容易引起一些非特异扩增，影响文库质量，因此，多设计巢式 PCR ，这样
可以保证扩增产物的专一性。

(2). 用于检测，如果巢式 PCR 能出结果的话，所检测的 DNA 序列一定是目的序

列。
 三、 PCR 技术

常用的 PCR 技术

3. 不对称 PCR ，就是两个引物的浓度不同，一般相差 50 至 100 倍，其中，一个

引物的浓度接近正常浓度，另一个则稀释 50-100 倍，然后进行 PCR 。这
时， PCR 的反应为开始几个循环是正常 PCR 扩增，产生一定数量的双链 DNA
，但随着另一侧引物的用尽，则只是产生一端扩增，这样，就是产生大量的单链
DNA 。该方法主要用于探针的标记，尤其是 Northern 探针的标记，通常，不对
称 PCR 要和标记 PCR 联合使用，进行探针标定。
敬请批评指正！
谢 谢 大 家！
谢 谢！