Exp7. 脂肪酸的分離與鑑定 2020.11.

02
生二乙 第九組 杜紫瑄 40843234S

一、實驗結果與討論

Figure 1：薄層層析實驗裝置圖

展層條件：
展開液成分：石油醚：乙醚：冰醋酸 = 80：20：1 (體積比)
TLC 片大小：7x7 平方公分
展開時間：展開液從底部開始展層直到展開液跑到距離 TLC 片頂部的地方

Figure 2：紫外光照射下的 TLC 片

左到右順序：cholesterol，olive oil，stearic acid，oleic acid，palmitic acid ，展開液

在紫外缐照射下的TLC片，每一個點都有產生熒光物質，除了展開液。助教在上課有提到會被照
射出來表示有雙鍵。
Figure 3：噴灑濃硫酸後的 TLC 片

左到右順序：cholesterol，olive oil，stearic acid，oleic acid，palmitic acid ，展開液

Rf 值計算：
展開液從起點到終點的距離=5.5cm
各脂質展開的距離：
1. cholesterol=0.6cm
2. olive oil=3.1cm
3. stearic acid（無法觀察）
4. oleic acid=1.6cm
5. palmitic acid（無法觀察）
呈上，
Cholesterol Rf 值=0.6/5.5
=0.11
Olive oil Rf 值=3.1/5.5
=0.56
Oleic acid Rf 值=1.6/5.5
= 0.29
由三者排序，olive oil>oleic acid>cholesterol
二、問題討論
1. TLC片上的各點可能是什麼? 為什麼? (會發螢光、會有UV吸收、會燒焦對應到什麼化學特性?)
TLC各點可能會是不同的脂肪酸成分，可以藉由Rf值大小來判斷。Rf值比較：olive oil＞oleic
acid＞cholesterol，其中Rf值越小，和固定相TLC片的親和力越高。因為膽固醇的溶解度略大於
其他脂肪酸，所以非極性性質較不顯著，使其移動距離短。

會有UV光吸收：有雙鍵或芳香族的化合物會吸收UV光產生黑點。

螢光：可能為該物質本來就帶有螢光的發色團，或者是加入螢光劑或顯色劑後，可以產生化學變
化而造成不同的結構，而生顏色。一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發射出比照射光波長
更長的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的螢光斑點。

碘薰顯色：把碘的結晶放在廣口瓶內，放入 TLC 片，蓋上瓶 蓋，直至暗棕色的斑點明顯出現後取

出，用筆畫下記號。這種方法是 利用有機化合物與碘形成分子錯合物（烷及鹵化烷除外）而帶有
顏色。

2.結果符合預期嗎? 若不，可能是什麼原因?
不完全符合，但順序是對的。由於我們有兩個點分別是stearic acid和palmitic acid沒有跑出來，
所以無法界定他們的Rf值，也無法與其他脂肪酸Rf值作比較。
而預期結果是olive oil＞stearic acid＞oleic acid＞cholesterol＞palmitic acid；
我們的實驗結果是olive oil＞oleic acid＞cholesterol。
那兩個點沒有跑出來的可能原因是：噴灑濃硫酸時不夠均匀，或是噴得太少了，脂質濃度太低，
混合各樣點溶液時沒有均勻混合，導致樣品點沒有很純。

3.如何證明TLC上的物質是那個物質? 如何使用Rf值鑑定TLC上的物質?
正常情況下，用相同展開條件所進行的薄層層析下，相同的物質會具有相同的Rf值，所以可經由
比對標準品來確認。Rf值的大小與該物質的極性和親和力有很大的關係，也可從而推測其主要組
成物質和結構等等。

4.承上題，除了Rf值以外，還有什麼方法可以證明TLC片上的物質是什麼?
（一）使用不同的顯色劑，使不同性質樣點可以產生不同顏色來判斷。比如說，通常有苯環結構
因為有共振的電子，通常容易有顏色或是呈現螢光或是吸收UV光等。

（二）薄層掃描：用一定波長的光照射在經薄層層析後的層析板上，對具有吸收或能產生螢光的
層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。
（三）Far-Eastern blotting：鑒定脂類（by high-performance thin layer
chromatography HPTLC），色譜圖可能會被轉移到PVDF膜上，然後受到進一步的分析。
Example：enzymatic or ligand binding assays and mass spectrometry.

5.比較管柱分離法與薄層分析法的不同?
管柱層析 薄層分析
靜相 stationary phase 固體吸附劑-將矽膠以及礬土填 固體薄層-將吸附劑如矽膠或礬
充進管柱內。 土均勻塗佈在鋁片、膠片或玻璃
板上形成薄層。
流動相 mobile phase 作爲液態沖提劑（eluent）
，量 作爲液體展開劑，量較少
較多

樣品添加方式 倒入管柱內 用細毛細管或者 tip 在 TLC 片上

進行點樣
Rf 值 無 有

判斷分離出樣品方法 必須通過顔色或是加入其他化學 利用 Rf 值，可以判斷兩化合物

試劑觀察反應 是否為相同的化合物。
分離樣品的單位 克 毫克
層析效率 可快可慢，可以藉由管柱的栓塞 較慢，不能用物理方式加速
條整流速，或者是藉由氣汞增加
氣壓以增加流速

6.比較 GC、HPLC 與 TLC 之差異?(列出三點)

GC HPLC TLC
流動相 -氣態 -液態 -液態
對樣品沒有親和力，即不 對樣品可產生一定親和 藉由毛細作用緩慢從 TLC
產生相互作用力，僅起運 力，並參與固定相對樣品 片上的底部爬升到頂部，
載作用。 作用的 劇烈競爭。因此， 極性越大，Rf 值越小。沒
正確選擇流動相直接 影響 有加速的方法。
組分的分離度。
分離後 熱導率偵測器 (thermal 藉由離開色譜柱的順序先 藉由 Rf 值來推斷，
樣點確認 conductivity detector, 後，通過檢測器時得到不 同樣成分的物質應該會有
TCD) 與火焰離子化偵測器 同的訊號來判斷。 相近的 Rf 值。
(flame Ionization
 detector, FID)。
缺點 只限於氣體和沸點較低的 儀器設備費用昂貴，操作 不精準，無法大量分離混
化合物，它們僅占有機物 嚴格，耗時。 合物。
總數的 20%。

參考資料：
1. 層析法-東海大學實驗室網。網址: http://orglab.thu.edu.tw/Exp1-22/exp05.pdf
2. How is the RF value used to identify the components in a mixture? (2020.02.17) –
FINDANYANSWER, retrieved from https://findanyanswer.com/how-is-the-rf-value-used-to-identify-
the-components-in-a-mixture
3.Far-eastern blot-Wikipedia(2020.10.20), retrieved from https://en.wikipedia.org/wiki/Far-
eastern_blot
4. 黃仲楷 (2016.06.05) 。氣相層析-科學 online。網址：
https://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=71841
5. 高效液相層析法。網址：file:///C:/Users/user/Downloads/Microsoft_PowerPoint_-_99-09-
29%C2%BCh%C2%AAR%C2%AAk_%C3%AC%C2%B2z-1.pdf
6.薄層層析法-yamol.tw。網址：
https://yamol.tw/item_essay-%E8%96%84%E5%B1%A4%E5%B1%A4%E6%9E%90%E6%B3%95%EF
%BC%88TLC%EF%BC%89%E7%82%BA%E7%9B%AE%E5%89%8D%E8%97%A5%E5%BB%A0%E6%8
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